WO2013190029A1 - Méthode de pronostic d'un lymphome et kit pour sa mise en œuvre - Google Patents

Méthode de pronostic d'un lymphome et kit pour sa mise en œuvre Download PDF

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WO2013190029A1
WO2013190029A1 PCT/EP2013/062850 EP2013062850W WO2013190029A1 WO 2013190029 A1 WO2013190029 A1 WO 2013190029A1 EP 2013062850 W EP2013062850 W EP 2013062850W WO 2013190029 A1 WO2013190029 A1 WO 2013190029A1
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WO
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cd25s
beads
protein
patient
detection kit
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PCT/EP2013/062850
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Grégory LAZARIAN
Hélène MERLE-BERAL
Bahram BODAGHI
Magali LE GARFF-TAVERNIER
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Assistance Publique - Hopitaux De Paris
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/16—Ophthalmology

Definitions

  • the invention relates to a new soluble CD25 assay kit, usable in a method of diagnosis and prognosis of progression of lymphoma including intraocular.
  • intraocular lymphoma includes a heterogeneous set of tumor pathologies affecting the eye and manifested in most cases by posterior uveitis resistant to corticosteroid treatment. In all cases, it is a monoclonal lymphoid proliferation with an invasion of a targeted structure of the eye and according to the starting point of lymphoproliferation, there are primitive or secondary intraocular lymphomas.
  • IOL Primary Intraocular Lymphoma
  • PCNSL central nervous system
  • Ocular involvement occurs with or without concomitant brain involvement and lymphoma cells preferentially invade the retina or vitreous. In the majority of cases, it is non-Hodgkin's lymphoma, diffuse large B-cell, high grade malignancy.
  • PIOL is a rare lymphoma associating ocular and cerebral forms, of difficult diagnosis and putting at risk the patient's vital prognosis. In approximately 80% of cases it is chronic bilateral ocular involvement with subretinal or vitreous infiltration, but unilateral initial presentations are possible. A complication by a cerebral lymphoma is found in about 80% of the cases in the absence of treatment, and when the invasion is bifocal (eye and brain), one retains the term of oculo-cerebral lymphoma (LOC) (Peterson et al , Cancer, 1993 Aug 1, 72 (3): 843-9).
  • LOC oculo-cerebral lymphoma
  • PIOL chronic posterior uveitis
  • the diagnosis is therefore difficult, often late, and requires a high degree of clinical suspicion on the part of the clinician who will have to be alerted in case of uveitis resistant to treatment with corticosteroids.
  • the treatment of ocular lymphomas should have two goals: to eradicate the intraocular tumor and prevent relapses and brain complications.
  • No optimal therapeutic management has been identified for the moment, the treatments being radiotherapy (irradiation ocular, the tumor being sensitive to treatment, but not curing: relapses are frequent and subsequent brain invasion is possible) or chemotherapy (the main difficulty resides in the lack of penetration of anti-cancer molecules across the blood-brain barrier. ocular), in particular local chemotherapy (intravitreous administration of methotrexate). which allows a long-term remission and can be repeated many times.
  • the anterior chamber puncture is minimally invasive and performed first-line when a PIOL is suspected.
  • the yield is low, the volume of the sample being about 10 ⁇ . It is mainly performed as part of the monitoring of treated PIOLs and for the detection of relapses because the sampling can be done at short time intervals.
  • Vitrectomy is a surgical procedure performed under anesthesia, intended to partially or totally remove the vitreous body for diagnostic purposes. In practice, it is performed when the results of the PCA examination evoke a PIOL and must be done at a distance from a corticosteroid therapy in order to avoid a false negative result by lysis of the tumor cells.
  • the vitreous is fragmented thanks to a vitreotome placed inside the eye, and the suction is compensated by a fluid intake (hypertonic saline solution, Borate Buffer Saline) to avoid the risk of ocular hypotonia.
  • the first aspiration is considered to be “pure” vitreous, which should be preferred for the diagnostic cytokine assay.
  • the following aspirations report "diluted” vitreous, which can be used for cytological examination.
  • Retinal biopsy is performed when vitrectomy is not contributive.
  • the T or B monoclonal character of the tumor cells can also be demonstrated by molecular analysis (polymerase chain reaction, PCR) making it possible to identify rearrangements in the majority of intraocular lymphoma cases (translocation between chromosomes 14 and 18 or [t (14; 18)], involving IGH and BCL-2 genes, reported in more than 67% of cases).
  • PCR polymerase chain reaction
  • Interleukin-10 (IL-10) and interleukin-6 (IL-6) assays in aqueous vitreous and aqueous samples are now part of the systematically performed examinations and provide an almost indispensable argument for a diagnosis when intraocular lymphoma is suspected.
  • tumor B cells secrete relatively high levels of IL-10 whereas inflammatory reaction cells produce IL-6.
  • the determination of these two cytokines and the determination of their ratio therefore give a good idea of the tumor and inflammatory component involved in the pathological process (Merle-Béral et al., Br. J. Haematol, 2004 Feb; 124 (4): 469-73).
  • IL-10 acts as a factor in tumor growth by promoting proliferation of B cell lymphomas (Beatty et al., J. Immunol 1997 May 1, 158 (9): 4045-51), and is produced by lymphoma cells at very high levels.
  • Intraocular levels of IL-6 are elevated in uveitis and may be very important in progressive eye infections (toxoplasmic chorioretinitis, acute retinal necrosis related to varicella zoster virus) (Ongkosuwito et al., Invest. Ophthalmol, Vis, Sci 1998 Dec, 39 (13): 2659-65).
  • IL-6 is an important mediator of intraocular inflammation (Hoekzema et al., Curr Eye Eye 1990, 9 Suppl: 207-1 1) because of its active role in the amplification of leukocyte recruitment, and its dosing in the ocular fluids makes it possible to make the differential diagnosis between a panuvéite of infectious, inflammatory or autoimmune origin and a pseudo-uveitis due to a PIOL (Cassoux et al., Invest Ophthalmol, Sci., 2007 Jul ; 48 (7): 3253-9).
  • NL-10 and IL-6 are based on a sandwich-type ELISA test.
  • Assays can be performed on aqueous humor or vitreous.
  • the threshold of IL-10 in the aqueous humor for which the probability of PIOL is probable is 50 ng / mL, with a sensitivity of 89% and a specificity of 93% (assay by ELISA test, Quantikine® kit, R & D System).
  • the cutoff is 400 ⁇ g / mL with a sensitivity of 80% and a specificity of 99% (Cassoux et al, op.cit.).
  • the dilution of the vitreous humor taking place during the vitrectomy is a parameter to be taken into account for the interpretation of the results.
  • the determination of the ratio between IL-10 and IL-6 makes it possible to overcome the effect of the dilution, each cytokine being diluted in the same proportions.
  • An IL-10 / IL-6 ratio of greater than 1 suggests a lymphomatous process (Whitcup et al., Ophthalmol Arch., 1997 Sep; 1 (15): 1,157-60).
  • the value of the ratio greater than 1 confirmed the diagnosis of PIOL in 74% of cases, with a sensitivity of 74.3% and a specificity of 74.7%.
  • Cytometric Bead Array TM marketed by BD Biosciences.
  • CBA TM Cytometric Bead Array TM
  • This technique brings a real progress in the diagnosis of PIOL, because it offers the possibility of simultaneously detecting and quantifying several cytokines in a single, low volume sample, unlike the ELISA technique that is usually used as a sample-consuming device.
  • the beads are homogeneous in size and structure but have a specific fluorescence intensity, defined by the manufacturer, easily identifiable with the cytometer by a point cloud well individualized on a dot plot representing the fluorescence in APC (Allophycocyanine) / APCCy7 (Allophycocyanin bound with cyanin-7 (Cy7), emitting by FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer).
  • APC Allophycocyanine
  • APCCy7 Allophycocyanin bound with cyanin-7 (Cy7), emitting by FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • the APC is excited at 633nm. It emits, alone at 665nm, and works as a donor for the Cy7 when linked to it.
  • the Cy7 emits at a wavelength of 767nm.
  • each point cloud corresponding to a type of ball is associated with an alphanumeric position.
  • Each type of ball is coupled to a cytokine-specific primary antibody, so that at each given position corresponds to a cytokine.
  • the beads coupled to primary antibodies to capture IL-10 are positioned at B7.
  • the complex After binding between the ball and the cytokine, the complex is revealed by the secondary antibody coupled to PE, whose fluorescence intensity allows the quantification of the cytokine of interest. This quantification requires the parallel production of a standard range established with a recombinant cytokine.
  • the Applicant has thus evaluated the prognostic value of several intraocular soluble factors.
  • the assay of these biomarkers was combined with those of IL-10 and IL-6 using the same flow cytometry (CBA TM) analysis technique, so that all these analytes could be assayed simultaneously.
  • CBA TM flow cytometry
  • CD25s or soluble IL-2 receptor
  • MIP-1a Macrophage Inflammatory Protein 1 alpha
  • RANTES RANTES
  • the interleukin-2 receptor exists in two forms: a membrane form, located on the activated T, B and NK (Natural Killer) lymphocytes, and a free, detectable form in the serum.
  • the membrane form is a heterotrimer consisting of three protein subunits: an IL-2Ra subunit (also called Ag Tac or CD25 or p55), an IL-2R3 subunit (p75) and an IL-2Ry subunit (p64).
  • the ⁇ chain is a 55 kDa glycoprotein composed of 251 amino acids, 219 of which are extra cellular, and constitutes the specific recognition site for IL-2.
  • This ⁇ chain is the result of an open reading phase leading to the production of a protein of 272 amino acids (SEQ ID No. 1), whose signal peptide of 21 amino acids is cleaved (Kuziel and Greene, J Invest Dermatol 1990 Jun; 94 (6 Suppl): 27S-32S).
  • the free form of the receiver consists only of the chain a.
  • This soluble part called ll-2Ras or CD25s, is a 45kDa protein, detectable in biological fluids and able to bind specifically to IL-2.
  • This protein has three epitopic regions A, B and C.
  • the Applicant has shown that the amount of CD25s in a patient's eye sample was a factor in anticipating the likelihood of a clinical course of the disease, and could also be used to refine the diagnosis in some cases. Moreover, the Applicant has also shown that certain other factors (IFNy, MIP-1a, RANTES) can also be used for diagnostic purposes and prognosis of PIOLs.
  • IFNy IFNy, MIP-1a, RANTES
  • the Applicant has therefore developed a kit for detecting CD25s, which is particularly useful by flow cytometry.
  • this detection kit can be used in parallel with the detection of other analytes, including IL-10 and IL-6. It is indeed important that the detection of many factors can be performed simultaneously, because of the low volume present in the samples taken from patients.
  • the Applicant has, for the first time, and without the results reported in the present application have been expected or predictable, demonstrated that CD25s was an important analyte to be assayed to make a prognosis of evolution of PIOL. The Applicant was therefore the first to ask the question of the interest of developing a test for the detection of this compound, which can be used for small sample volumes, and simultaneously with the detection of other compounds.
  • the Applicant has, in particular, developed a detection system that can be used with the CBA TM system developed by BD Bioscience.
  • the invention thus relates to a detection kit for CD25s comprising a set of beads emitting fluorescence under excitation at an excitation wavelength, said fluorescence emitted by said beads being at a wavelength of emission different from the excitation wavelength, each of the beads comprising, coupled to its surface, a plurality of antibodies directed against the CD25s protein.
  • This kit is ideal for detecting CD25s in very small volumes, such as anterior chamber puncture (PCA) or pure vitreous specimen, and can also be used for simultaneous detection of other cytokines. Indeed, if the dosage is performed on the vitreous, it must be pure and undiluted so that the dosages are right but also must be used as little as possible for cytokines because it is necessary to keep equipment for other techniques diagnosis (cytology, immunolabeling, PCR clonality search).
  • WO 2005/031001 describes the use of beads on which antibodies recognizing a CA protein are bound.
  • this document provides no indication of the role of CD25s in PIOL, nor of the fact that beads fluorescing under excitation should be used.
  • the wavelength of the fluorescence emitted, after excitation, by each of the balls of the assembly present in the kit is identical.
  • the antibodies of the plurality of antibodies directed to the CD25s protein are all identical: this means that each of the beads present in the set of beads contains, on its surface, a plurality of copies of the same antibody directed against CD25s (ie having the same sequence).
  • the plurality of antibodies directed against the CD25s protein is a plurality of monoclonal antibodies, i.e., the same monoclonal antibody recognizing CD25s is present, in many instances, at the surface of each of the balls.
  • the antibodies of the plurality of antibodies directed to the CD25s protein are not all identical, but all recognize the same epitope (or domain) of the CD25s protein: this means that each of the beads present in the Bead set contains, on its surface, several identical antibodies against CD25s (that is, having the same sequence).
  • the excitation wavelength is less than or equal to 650 nm. Preferably, this excitation wavelength is equal to 633 nm.
  • the emission wavelength (which is detected after excitation) is greater than 655 nm. In particular, it can be equal to 660-665nm or 767-773nm.
  • the 633nm wavelength corresponds to a wavelength permitting the excitation of allophycocyanin. This emits at a wavelength around 660nm, detectable with a 665nm filter.
  • cyanine-7 When coupled to cyanine-7, cyanine 7 is indeed excited by the fluorescence emitted by allophycocyanin and then emits at 767nm or 773nm, detected at 767nm with a suitable filter.
  • This radiation is based on fluorescence resonance energy transfer (FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer).
  • said beads emit fluorescence at two different wavelengths. This is the case when the beads contain two fluorophores emitting at these two wavelengths.
  • said emission wavelengths are 660-665 nm and 767-773 nm, which corresponds to beads containing both allophycocyanin and allophycocyanin coupled to cyanine-7.
  • said beads contain both allophycocyanin and allophycocyanin coupled to cyanine-7, the amount and the ratio being identical for each of the beads.
  • the passage of the beads in a flow cytometer, the excitation at a wavelength of 633 nm, and the collection of the amount of fluorescence emitted by the beads at 655 nm and 767 nm, makes it possible to observe, on a 2D diagram. (abscissa amount of APC fluorescence, ordered amount of fluorescence APCCy7), the beads at a specific position of this diagram.
  • said beads are polystyrene microbeads. They preferably have a diameter of between 5 and 10 ⁇ , more preferably 7.5 ⁇ .
  • said beads are silica beads (see US 20090068639).
  • said detection kit also contains secondary antibodies capable of binding to CD25s.
  • these secondary antibodies should be capable of binding to CD25 after binding of this protein to an antibody present on the surface of said beads. It is preferred that these secondary antibodies are bound to a fluorescent compound.
  • the selected fluorochrome preferably has excitation and emission wavelengths different from those of the fluorochromes present in the beads.
  • a fluorochrome having excitation and emission wavelengths of less than 600 nm is preferably chosen.
  • PE phycoerythrin
  • Those skilled in the art know other usable fluorochromes (listed in particular on wikipedia).
  • the antibodies present on the surface of the beads all recognize the same epitope of the CD25s protein. In particular, it is preferred that they recognize the B epitope of the CD25s protein.
  • secondary antibodies all recognize the same epitope or domain of CD25s. In particular, it is preferred that they recognize the epitope (domain) A of the CD25s protein.
  • kit according to the invention also contains a recombinant human CD25s solution, which makes it possible to carry out more precise controls and quantifications.
  • the detection kit comprises a) polystyrene microspheres, having in particular a diameter of about 7.5 ⁇ , containing a mixture of fluorophores Allophycocyanin -
  • a cyanine-7-linked allophycocyanin said beads comprising, coupled to their surface, a plurality of murine monoclonal antibodies directed against the human CD25s B epitope
  • This kit also optionally includes a recombinant human CD25s solution.
  • the beads appear in A4 after passing through a BD FACSCanto TM II flow cytometer (BD Bioscience), and analysis by appropriate software such as FACSDiva (BD Bioscience). This means that the fluorescence emitted by the beads is similar or identical to the fluorescence emitted by the reference beads 558578 sold by BD Bioscience.
  • any other beads can be chosen, in particular the balls A5, B4, B5, E5, E8, C8, D8 (BD Bioscience classification). All these beads are available from BD Bioscience. They differ only in the amount and ratio of APC and APCCY7 fluorochromes.
  • the detection kit is used in flow cytometry to assay CD25s in a sample obtained from a patient.
  • this sample is a vitreous or other intraocular sample, and at the same time other cytokines are measured.
  • the detection kit may also contain at least one other set of beads, said beads comprising, coupled to their surface, a plurality of antibodies recognizing another protein than the CD25s protein, said beads emitting fluorescence under excitation at the same excitation wavelength than that exciting the beads for assaying CD25s, said fluorescence emitted by said beads being
  • said other protein as the CD25s protein is selected from the group consisting of interleukin 6 (IL-6) and interleukin 10 (IL-10).
  • beads containing the same fluorochromes are chosen as the beads intended for the detection of CD25s, but in different proportions and / or quantities.
  • these beads of the second set will be localized, on the 2D diagram (abscissa APC fluorescence quantity, ordered amount of APCCy7 fluorescence), the beads at a specific position of this diagram which is different from that of the beads covered with anti- CD25s.
  • the kit can thus contain several sets of beads, each intended for detecting and assaying a different protein, the beads of each set having a clean fluorescence profile and different from that of the beads of another set.
  • kit allows simultaneous assay of IL-6 and IL-10 (in addition to CD25s).
  • Bioscience for example under the reference 560484 (Human Th1 / Th2 / Th17 CBA Kit which includes beads for the simultaneous detection of IL-2, IL-4, IL-6, IL-2 10, IL-17A, IFN- ⁇ , and TNF), or cytokine by cytokine.
  • reference 558274 IL-10, beads B7) or 558276 (IL-6, beads A7) from BD Bioscience.
  • the kit thus described although it can be used in other applications, has been specifically designed for the implementation of the in vitro measurement (assay) of the amount (concentration) of CD25s in an eye sample in a patient . Indeed, as seen above, the Applicant has specifically developed this kit, in order to perform simultaneous assays of several cytokines in a very small sample, because of the interest of CD25s in the prognosis of primary intraocular lymphoma.
  • the invention also relates to a prognostic method for intraocular lymphoma in a patient, comprising the step of measuring (in vitro) the amount of CD25s in an eye sample in said patient, a concentration of CD25s greater than 200 pg / ml in said sample being indicative of an unfavorable prognosis of progression of the disease in said patient.
  • this eye sample is a vitreous sample.
  • the concentration measured in vitro is then that actually present in vivo.
  • the sample is not pure vitreous, it is then necessary to know the dilution to recalculate the effective concentration present in vivo.
  • the concentration measured in vitro should be multiplied by two to be able to conclude.
  • This measurement is especially carried out using the kit described above, which is particularly well suited to such use, having been developed for this purpose.
  • this assay is preferably carried out by flow cytometry.
  • Commercially available apparatuses such as two-laser cytometers developed by BD Bioscience can be used.
  • “Adverse disease prognosis” means a high probability (greater than 50%) that the patient's disease presents at least one of the following changes:
  • CD25 concentration greater than 200 ⁇ g / ml.
  • an amount of CD25s greater than 500 ⁇ g / ml in the ocular sample is indicative of a high probability of having a relapse within one year of stopping treatment.
  • a CD25 concentration of less than 125 ⁇ g / ml, or even 150 ⁇ g / ml in the ocular sample is indicative of a high probability of complete remission.
  • an amount of IL-6 greater than 50 ⁇ g / ml is indicative of an unfavorable prognosis of disease progression.
  • an amount of IL-6 greater than 100 ⁇ g / ml in the ocular sample is indicative of a high probability of having a relapse within one year of stopping treatment.
  • the in vitro measurement step of the amount of CD25s is preferably carried out using a kit as described above.
  • Figure 1 Representation of the alphanumeric position of the beads carrying the antibodies intended to detect cytokines according to the standard developed by BD Bioscience for the CBA TM technique, in APC / APC-Cy7 representation
  • Figure 2 Summary of clinical information obtained for 25 IOL patients.
  • Figure 3 Intravitreal concentration of CD25s measured in patients in complete or refractory treatment-refractory (A.) who relapsed within one year after discontinuation (relapse ⁇ 1 year) or more than one year after discontinuation of treatment (relapse> 1 year) (B.), figure C. synthesizing figures A. and B. CR: complete remission
  • the assay of CD25s in CBA TM can be performed by coupling beads with specific antibodies.
  • the beads were chosen such that they have a position on the APC / APCCy7 dot plot far away from the other beads that can be used in parallel for the determination of the other cytokines.
  • the choice of balls in position A4 was chosen because this position is far from that of IL-6, IL-10, ⁇ - ⁇ , RANTES and IFN-v positioned respectively at A7, B7, B9, D4 and El.
  • the cytokine predictive position is shown in Figure 1.
  • the primary antibody chosen is a purified monoclonal mouse antibody
  • the anti-human CD25 (clone M-251) directed against the domain (epitope) B of the protein.
  • the secondary antibody is a human anti-CD25 mouse monoclonal antibody (clone 2A3), directed against the protein domain (epitope) A, coupled to phycoerythrin (excited at a wavelength of 488nm, and emitting a flourescence at a wavelength of 580nm).
  • Both antibodies can be purchased from BD Biosciences (San Jose, California) as 555429 and 34101 1 respectively. These antibodies or other antibodies are also available from other suppliers (eg Stemcell, or Miltenyi Biotec).
  • the primary NA LE anti-CD25 antibody was coupled to the A4 beads according to the manufacturer's recommendations.
  • the principle of the conjugation reaction is to reduce the disulfide bridges on the surface of the polystyrene beads by means of a reducing agent, dithiothreitol.
  • the primary amine functions of the antibodies react with a hetero-bifunctional conjugating agent, sulfo-SMCC, and form a highly reactive maleimide derivative. The latter can then form a stable thioether linkage with the thiol functions of the beads via a radical reaction, thus resulting in the covalent anchoring of the antibodies.
  • the beads coupled to the primary antibody were used for the detection of CD25s, according to the following labeling procedure: for each test, 50 ⁇ of sample were incubated for 1 hour in the dark with 1 ⁇ of conjugated A4 beads beforehand washed and diluted in washing buffer. The anti-CD25 secondary antibody coupled to PE diluted 1/20 was then added. After a 2 hour incubation and a final wash, the sample can be analyzed by cytometer. c) FACSCantoll cytometer analysis - Standard ranges - Linearity
  • FACSCantoll TM 8 colors (BD Bioscience, Becton Dickinson), in manual mode, by acquiring at least 300 events at a "medium” speed.
  • the data was analyzed using BD FACSDiva Software (Becton Dickinson) computer software.
  • the analysis strategy first includes conditioning all the beads in a size / structure analysis window. They are then fenestrated in APC and APC-Cy7 so as to identify the maximum A4 beads. This last selection makes it possible to eliminate from the analysis window all the impurities related to the conservation or the doublets of balls generated during the coupling step.
  • the PE fluorescence of the population surrounded by A4 can be visualized on a histogram representing the fluorescence intensity on the abscissa and the number of events on the ordinate.
  • the software renders an average fluorescence intensity (MIF) for each tube, corresponding to a concentration determined from a standard range made in parallel.
  • MIF average fluorescence intensity
  • the upper point of the calibration range of CD25s has been set at 8000 pg / ml: this point is in the range of linearity of the curve and makes it possible to scan a very wide concentration range.
  • the results of assaying CD25s greater than 8000 pg / ml were thus made "> 8000 pg / ml”.
  • CD25s ranging from 7.8 ⁇ g / ml to 8000 ⁇ g / ml. The results of this range show that the fluorescence intensity corresponding to the very low concentrations of between 0 and 30 ⁇ g / ml do not vary proportionally.
  • the detection threshold was thus set at 30 ⁇ g / ml.
  • a standard range was made from a mixture of recombinant CD25s, IL-10, IL-6, and IFN- ⁇ .
  • Each cytokine is initially at a concentration of 5000 ⁇ g / ml in the first tube which constitutes the upper point of the range. It was diluted cascade to obtain the different points of range, each cytokine then being diluted in the same proportions. Finally, the mixture of all the reagents allowing the detection of each cytokine was added to each tube corresponding to a point of range.
  • cytokine labeling technique This procedure describes the cytokine labeling technique that has been applied.
  • Ready-to-use kits (Flex Set BD TM CBA kits) were used for the determination of IL-10, IL-6, IFN- ⁇ , MIP-1 g and RANTES .
  • Each kit makes it possible to carry out 50 tests and contains the capture beads coupled to the primary antibody, the secondary antibody, and a standard recombinant in freeze-dried form to be reconstituted at the time of preparation of the standard range.
  • the CBA TM kits used were developed by BD Biosciences and are sold under the references 558274 (IL-10), 558276 (IL-6), 558324 (RANTES), 558449 (MIP-1 g) and 561515 (IFNv).
  • the beads are to be used at a rate of 1 ⁇ per test, ie 50 ⁇ of each ball for a series of 50 tests. They are first washed in 500 ⁇ of Wash Buffer BD wash buffer, centrifuged for 5 min at 1500 rpm. The supernatant is gently aspirated and the beads are resuspended in 2500 ⁇ of Capture Bead Diluent for Serum / Plasma dilution buffer, ie 50 ⁇ per test. The solution is incubated for 15 min at room temperature and in the dark to avoid exciting the fluorochromes present on the beads. b) Extemporaneous Preparation of the PE Secondary Antibody Solution
  • IL-10 For IL-10, IL-6, IFN- ⁇ , MIP-1a and RANTES, 1 ⁇ of secondary antibody is required for one test, ie 50 ⁇ of each antibody for a series of 50 tests. Since the minimum necessary amount for a test was not accurately evaluated for CD25s, the same amount of secondary antibody as that chosen for technical development, ie 5 ⁇ per test, was used. A total of 250 ⁇ of anti-CD25 antibodies are required for 50 tests.
  • the mixture of all the necessary antibodies for a series of 50 tests represents a volume of 500 ⁇ . This volume is diluted quarterly in 2ml of Diluent Detector buffer and 200 ⁇ of this dilution are necessary for each test. (c) Marking of samples
  • the marking is carried out on a volume of 50 ⁇ of sample.
  • a volume of 50 ⁇ of the mixture of beads, previously vortexed, is added to the sample and then incubated for 1 hour in the dark and at room temperature. After this incubation, 50 ⁇ l of the PE secondary antibody mixture solution is added to the sample. The mixture is incubated for 2 hours in the dark and at room temperature. At the end of this step, the samples are washed to remove excess secondary antibodies.
  • a volume of 1000 ⁇ of Wash buffer BD buffer is added, the sample is centrifuged for 5 min at 1500 rpm. The supernatant is gently removed and the bead pellet is resuspended in 300 ⁇ of BD Wash Buffer buffer. Samples are ready for cytometer analysis. d) Cytometer analysis
  • the sample Before each cytometer run, the sample must be vortexed to resuspend the beads. The analysis must be done at the end of the labeling step to avoid a decoupling between the beads and cytokines that can lead to loss of signal.
  • the samples are analyzed by hand in the cytometer by acquiring at least 300 events at a "medium" speed. The data is analyzed using the BD FACSDiva Software TM computer software and switched to the FCAP-Array TM results processing software. e) Technical validation of the test on intraocular samples
  • the multiplex cytokine assay of 15 intraocular samples from patients with PIOL (7 PCA and 8 vitreous) and 18 intraocular samples from patients with uveitis was performed on samples stored at -80 ° C for about 2 years.
  • IL-10 and IL-6 were measured initially and simultaneously with the CBA TM technique.
  • the multiplexed assay of the 6 cytokines was performed after thawing the samples, and the results of IL-10 and IL-6 obtained before and after freezing were compared to see if, on the one hand, the preservation impaired the quality sampling and on the other hand to see if the simultaneous assay of 6 cytokines has an impact on their respective results.
  • the multiplex assay of the 6 cytokines was performed on the vitreous humor samples corresponding to the diagnostic sample for each of the 36 patients. All samples were stored at -80 ° C and in sufficient quantity to perform a new assay, ie a sampling volume of at least 50 ⁇ . All these samples were taken between April 2004 and January 2012.
  • the cohort included 17 men and 19 women. The average age was 65, with extreme values ranging from 44 to 88 years. For 25 patients, clinical information was obtained from the medical records made available by the Ophthalmology Department.
  • a "non-PIOL" control cohort comprising 16 vitreous humor samples from patients with a cytokine profile of uveitis (raised intra-ocular IL-6 concentration, low IL-10) and two patients with which IL-10 and IL-6 were not detectable. Clinical information could not be collected for these 18 patients.
  • a cytokine profile of uveitis raised intra-ocular IL-6 concentration, low IL-10
  • Clinical information could not be collected for these 18 patients.
  • the threshold of 37 ⁇ g / ml in IL-10 was proposed. to carry the diagnosis of IOL.
  • the minimum IL-10 value detected in this IOL series is 80 ⁇ g / ml, which is consistent with this proposed diagnostic threshold.
  • the calculation of the IL-10 / IL-6 ratio is often considered relevant for providing diagnostic assistance when its value is greater than 1 (Whitcup et al, op.cit.). This ratio has been determined, and it has been observed that it is consistently greater than 1, with the exception of a patient for whom it is 0.9.
  • the average IFN-gamma concentration in the IOL group is 8 ⁇ g / ml whereas it is 3 ⁇ g / ml in the uveitis group. Medians are significantly different (P ⁇ 0.05). The dispersion of results is low in both groups, and only 3 patients in the IOL group have higher concentrations at 21, 37 and 124 pg / ml. However, given the significant overlap of concentration values between the two groups, IFN- ⁇ does not appear to be a relevant parameter for the diagnosis of IOL.
  • this makes it possible to establish a method for diagnosing intraocular lymphoma in which the amount (concentration) of CD25s in the vitreous or a PCA of a patient is measured, a concentration of greater than 840 ⁇ g / ml being strongly indicative of intraocular lymphoma.
  • This method is performed in vitro.
  • This method may also include the treatment step of this patient against this intraocular lymphoma, or a sampling step (PCA or vitreous sampling) prior to the measurement of the concentration of CD25s.
  • This method may also include measuring the amount of IL-10 and / or NL6, optionally simultaneously with the measurement of CD25s.
  • this method comprises the simultaneous measurement of the concentrations of CD25s, IL-10 and IL-6 in the sample.
  • RANTES, MIP-1a and INF- ⁇ do not appear to be more relevant than IL-10 and IL-6 for the diagnosis of IOLs. However, they could be used as second-line to refine a prognosis, but the dosage of IL-10 and IL-6 and calculation of the ratio remain a priori the best elements of the diagnosis.
  • the determination of CD25s at the time of the diagnostic step, especially in combination with ILI O and IL6, makes it possible to refine the diagnosis in case of doubt about the results. obtained with IL-6 and IL-10 alone.
  • 13 have PIOL (no brain damage at diagnosis)
  • 7 have oculo-cerebral lymphoma (LOC)
  • 2 have an ocular location of a relapse of primary brain lymphoma
  • 3 Ocular lymphomas secondary to systemic lymphoma (1 follicular lymphoma, 1 ethmoid lymphoma and 1 large cell B lymphoma).
  • a non-parametric Mann-Whitney comparison test was performed to determine whether a cytokine increase could be associated with a particular clinical situation.
  • concentrations of IL-10, IL-6, CD25s, RANTES, MIP-1a and IFNy were compared in the following groups:
  • IL-10, IL-6 and CD25s appear to tend to be increased in unilateral forms (Table 2).
  • Table 2 Comparison of median intravitreal concentrations in the different patient groups studied e) Comparison between patients in complete remission and patients refractory to treatment
  • cytokine concentrations must be taken into account in interpreting these results. Indeed, RANTES, MIP-1a and NFNy are globally always lower than 100 ⁇ g / ml whereas IL-10, IL-6 and CD25s can show a significant dispersion of the results with values that can often reach more 1000 ⁇ g / ml. Taking into account these elements and with all the reservation related to the limited number of patients studied, it is necessary to interpret the cytokine profiles as a whole, rather than each marker taken one by one.
  • IL-6, and CD25s vary in the same direction. They tend to be increased at patients with a delayed onset of relapse (1 ⁇ year) compared to those whose delay is later. In addition, these same cytokines also tend to be increased in patients responding less well to treatment, compared to those whose complete remission is obtained quickly and sustainably.
  • the cytokines RANTES, riFNy, MIP-1a and CD25s do not appear to be more relevant than IL-10 and IL-6 for the diagnosis of intraocular lymphomas, but may be useful in complex cases in which second intention, in particular the CD25s, to support a complex diagnosis.
  • IL-6 and CD25s tend to be increased in patients who relapse within one year after stopping treatment, compared to those with a relapse delay of more than one year. This difference is not statistically significant given the small size studied, but the difference between the medians is significant. RANTES and NFIMy are also increased but to a lesser extent. In addition, patients whose complete remission was achieved quickly and sustainably have similar concentrations of IL-6 and CD25 as those who relapse later.
  • IL-10, IL-6, CD25s and RANTES tend to be increased in PIOL compared to LOC. This trend is accentuated by removing the higher points of IL-10, IL-6 and CD25s in the LOC group, which correspond to the same patient whose cytokine profile is rather atypical. This upward trend is also reflected, but to a lesser extent measurement for IL-10 and IL-6 in unilateral ocular forms compared to bilateral lesions. Cytokine concentrations therefore tend to vary according to the unique ocular localization or bilateral or bifocal secondary localization.
  • CD25s were detected in vitreous patients of PIOL.
  • the origin and role of secretion of CD25s are not fully understood.
  • Some authors attribute a tumor origin while others consider that it reflects the activation of immune cells, including Treg lymphocytes (CD4 + / CD25 + / FOXP3 regulatory T cells) which strongly express the membrane CD25. It is therefore not impossible that the intraocular concentration of CD25s indirectly reflects infiltration by Tregs, which tend to favor tumor progression by inhibiting the immune response. If this hypothesis is true, one can easily understand that high concentrations of CD25s are associated with a poor prognosis for the patient.

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Abstract

Abrégé descriptif L'invention se rapporte à une méthode de diagnostic et pronostic d'évolution d'un lymphome notamment intraoculaire comprenant la mesure du CD25soluble, ainsi qu'à un kit conçu pour la mise en œuvre de cette méthode.

Description

MÉTHODE DE PRONOSTIC D'UN LYMPHOME ET KIT POUR SA MISE EN
ŒUVRE
L'invention se rapporte à un nouveau kit de dosage du CD25 soluble, utilisable dans une méthode de diagnostic et pronostic d'évolution d'un lymphome notamment intraoculaire.
Le terme de lymphome intraoculaire regroupe un ensemble hétérogène de pathologies tumorales affectant l'œil et se manifestant dans la plupart des cas par une uvéite postérieure résistante à un traitement par corticostéroïde. Dans tous les cas, il s'agit d'une prolifération lymphoïde monoclonale avec un envahissement d'une structure ciblée de l'œil et selon le point de départ de la lymphoprolifération, on distingue les lymphomes intraoculaires primitifs ou secondaires.
Les lymphomes intraoculaires (LIO) primitifs (ou PIOL pour Primary Intra Ocular Lymphoma) font partie des lymphomes primaires du système nerveux central (PCNSL). L'atteinte oculaire se présente avec ou sans atteinte cérébrale concomitante et les cellules lymphomateuses envahissent préférentiellement la rétine ou le corps vitré. Dans la majorité des cas, il s'agit de lymphomes non Hodgkiniens, diffus à grandes cellules B, de haut grade de malignité.
Le PIOL est un lymphome rare associant des formes oculaires et cérébrales, de diagnostic difficile et mettant en jeu le pronostic vital du patient. Dans approximativement 80% des cas, il s'agit d'une atteinte oculaire bilatérale chronique avec une infiltration sous-rétinienne ou vitréenne, mais des présentations initiales unilatérales sont possibles. Une complication par un lymphome cérébral est retrouvée dans environ 80% des cas en l'absence de traitement, et lorsque l'envahissement est bifocal (oeil et cerveau), on retient le terme de lymphome oculo-cérébral (LOC) (Peterson et al, Cancer. 1993 Aug 1 ;72(3):843-9).
Les symptômes cliniques du PIOL ne sont pas spécifiques, et peuvent orienter à tort le clinicien vers une uvéite postérieure chronique. Le diagnostic est donc difficile, souvent tardif, et requiert un haut degré de suspicion clinique de la part du clinicien qui devra être alerté en cas d'uvéite résistante à un traitement par corticoïdes.
Idéalement, le traitement des lymphomes oculaires devrait avoir deux objectifs : éradiquer la tumeur intra-oculaire et prévenir les rechutes et les complications cérébrales. Aucune prise en charge thérapeutique optimale n'a été identifiée pour le moment, les traitements étant la radiothérapie (irradiation oculaire, la tumeur étant sensible au traitement, mais ne guérissant pas : les rechutes sont fréquentes et un envahissement cérébral ultérieur reste possible) ou la chimiothérapie (la principale difficulté résidant dans le défaut de pénétration des molécules anti-cancéreuses à travers la barrière hémato-oculaire), en particulier la chimiothérapie locale (administration intra-vitréenne de méthotrexate). qui permet une rémission à long terme et peut être répétée de nombreuses fois.
Ainsi que vu plus haut, en raison de l'absence de signes cliniques spécifiques, le diagnostic de lymphome oculaire n'est pas aisé. L'examen ophtalmologique permettra de mettre en évidence des anomalies au niveau du segment antérieur ou postérieur de l'œil. Ces anomalies seront explorées par une ponction de chambre antérieure (PCA) et le diagnostic sera confirmé par la vitrectomie.
La ponction de chambre antérieure est peu invasive et réalisée en première intention lorsqu'on suspecte un PIOL. Le rendement est faible, le volume du prélèvement étant d'environ 10ΟμΙ. Elle est surtout réalisée dans le cadre des suivis des PIOL traités et pour la détection des rechutes car le prélèvement peut être réalisé à intervalle de temps court.
La vitrectomie est un acte chirurgical effectué sous anesthésie, et destiné à retirer partiellement ou totalement le corps vitré dans un but diagnostique. En pratique, elle est réalisée lorsque les résultats de l'examen de la PCA évoquent un PIOL et doit être faite à distance d'une corticothérapie afin d'éviter un résultat faussement négatif par lyse des cellules tumorales.
Le vitré est fragmenté grâce à un vitréotome mis en place à l'intérieur de l'oeil, et l'aspiration est compensée par un apport liquidien (solution saline hypertonique, de type Borate Buffer Saline) pour éviter le risque d'hypotonie oculaire. La première aspiration est considérée comme du vitré « pur » qui doit être privilégiée pour le dosage de cytokine à visée diagnostique. Les aspirations suivantes rapportent du vitré « dilué », qui pourra être utilisé pour l'examen cytologique.
La biopsie rétinienne est réalisée lorsque la vitrectomie n'est pas contributive.
Les échantillons ainsi prélevés sont alors examinés, notamment par analyse cytologique (effectuée sur le vitré, compte tenu du faible volume des PCA), ce qui permet de poser un diagnostic définitif de PIOL et de débuter rapidement un traitement.
On peut aussi mettre en évidence le caractère monoclonal T ou B des cellules tumorales par analyse moléculaire (réaction de polymérisation en chaîne, PCR) permettant d'identifier des réarrangements dans la majorité des cas de lymphomes intraoculaires (translocation entre les chromosomes 14 et 18 ou [t(14; 18)], impliquant les gènes IGH et BCL-2, rapporté dans plus de 67% des cas).
Les dosages de l'interleukine-10 (IL-10) et de l'interleukine-6 (IL-6) dans les prélèvements de vitrés et d'humeurs aqueuses font désormais partie des examens systématiquement réalisés et fournissent un argument quasi indispensable pour poser un diagnostic lorsque le lymphome intra-oculaire est suspecté. En effet, les lymphocytes B tumoraux sécrètent des taux relativement élevés d'IL-10 alors que les cellules inflammatoires réactionnelles produisent de l'IL-6. Le dosage de ces deux cytokines et la détermination de leur ratio donnent donc une bonne idée de la composante tumorale et inflammatoire impliquées dans le processus pathologique (Merle-Béral et al., Br. J. Haematol. 2004 Feb;124(4):469-73).
L'IL-10 agit comme un facteur de la croissance tumorale en favorisant la prolifération des lymphomes à cellules B (Beatty et al., J. Immunol. 1997 May 1 ;158(9):4045-51 ), et est produite par les cellules lymphomateuses à des taux très élevés.
Les taux intra-oculaires d'IL-6 sont élevés dans les uvéites et peuvent être très importants dans les infections oculaires évolutives (choriorétinite toxoplasmique, nécrose rétinienne aigue liée au virus de la varicelle et du zona) (Ongkosuwito et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1998 Dec;39(13):2659-65). L'IL- 6 est un médiateur important de l'inflammation intraoculaire (Hoekzema et al., Curr. Eye Res. 1990;9 Suppl:207-1 1 ) à cause de son rôle actif dans l'amplification du recrutement leucocytaire, et son dosage dans les liquides oculaires permet de faire le diagnostic différentiel entre une panuvéite d'origine infectieuse, inflammatoire ou auto-immune et une pseudo-uvéite due à un PIOL (Cassoux et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007 Jul;48(7):3253-9).
Dans la plupart des études publiées, le dosage de NL-10 et de l'IL-6 repose sur un test de type ELISA « sandwich ». Plusieurs kits prêts à l'emploi sont commercialisés. Les dosages peuvent être effectués sur l'humeur aqueuse ou sur le vitré. Le seuil d'IL-10 dans l'humeur aqueuse pour lequel la probabilité de PIOL est probable est de 50 ng/mL, avec une sensibilité de 89% et une spécificité de 93% (dosage par test ELISA, kit Quantikine®, R&D System). Pour les prélèvements vitréens, le cutoff est de 400 pg/mL avec une sensibilité de 80% et une spécificité de 99% (Cassoux et al, op. cit.).
D'autre part, la dilution des prélèvements de l'humeur vitrée qui a lieu pendant la vitrectomie est un paramètre à prendre en compte pour l'interprétation des résultats. La détermination du ratio entre l'IL-10 et l'IL-6 permet de s'affranchir de l'effet de la dilution, chaque cytokine étant diluée dans les mêmes proportions. Un rapport IL-10/IL-6 supérieur à 1 suggère un processus lymphomateux (Whitcup et al., Arch. Ophthalmol. 1997 Sep; 1 15(9): 1 157-60). Ainsi, d'après une étude portant sur 35 cas de PIOL et 64 uvéites, la valeur du ratio supérieure à 1 a permis de confirmer le diagnostic de PIOL dans 74% des cas, avec une sensibilité de 74,3% et une spécificité de 74,7% .
L'inconvénient principal de cette technique est le volume important d'échantillon nécessaire pour chaque test.
Plus récemment, la détection de ces cytokines a été mise en place grâce à une technique de cytométrie en flux, appelée Cytometric Bead Array™ (CBA™ commercialisée par la société BD Biosciences). Cette technique apporte un réel progrès dans le diagnostic des PIOL, car elle offre la possibilité de détecter et de quantifier simultanément plusieurs cytokines dans un prélèvement unique et de faible volume, contrairement à la technique ELISA utilisée habituellement, consommatrice de prélèvement.
Il s'agit d'une détection de type « sandwich », mettant en œuvre des microbilles de polystyrène fluorescentes recouvertes d'un anticorps anti-cytokine (anticorps primaire), servant de réactif de capture, et d'un anticorps spécifique de détection (anticorps secondaire) couplé à un fluorochrome, la phycoérythrine (PE), pour révéler le complexe.
Les billes sont homogènes en taille et en structure mais possèdent une intensité de fluorescence spécifique, définie par le fabriquant, aisément repérable au cytomètre par un nuage de point bien individualisé sur un dot plot représentant la fluorescence en APC (Allophycocyanine) / APCCy7 (Allophycocyanine liée au à la cyanin-7 (Cy7), émettant par FRET, Fluorescence Résonance Energy Transfer). Pour l'APCCy7, l'APC est excitée à 633nm. Elle émet, seule à 665nm, et fonctionne comme un donneur d'énergie pour la Cy7 lorsqu'elle lui est liée. La Cy7 émet à une longueur d'onde de 767nm. Ainsi, en fonction de la quantité de fluorescence dans les billes et du ratio APC / APCCy7, chaque nuage de point correspondant à un type de bille est associé à une position alphanumérique.
Chaque type de bille est couplé à un anticorps primaire spécifique d'une cytokine, de telle sorte qu'à chaque position donnée corresponde une cytokine. Par exemple, dans le kit Human IL-10 Flex Set de BD Bioscience, les billes couplées à des anticorps primaires permettant de capturer de l'IL-10 sont positionnées en B7.
Après liaison entre la bille et la cytokine, le complexe est révélé par l'anticorps secondaire couplé à la PE, dont l'intensité de fluorescence permet la quantification de la cytokine d'intérêt. Cette quantification nécessite la réalisation en parallèle d'une gamme étalon établie avec une cytokine recombinante.
Ainsi, l'ajout dans un prélèvement de plusieurs billes de spécificités différentes permettra de doser simultanément plusieurs cytokines en une seule réaction à partir d'un volume de prélèvement très faible
Actuellement, il n'existe pas d'éléments clinico-biologiques auxquels on puisse accorder une valeur pronostique. Un tel outil pourrait s'avérer utile au clinicien, notamment pour anticiper la prise en charge thérapeutique des patients dont le pronostic serait d'emblée mauvais.
La Demanderesse a ainsi évalué la valeur pronostique de plusieurs facteurs solubles intraoculaires. Le dosage de ces biomarqueurs a été combiné à ceux de l'IL-10 et de l'IL-6 grâce à la même technique d'analyse en cytométrie en flux (CBA™), de manière à pouvoir doser simultanément tous ces analytes sur un volume de prélèvement constant et faible quel que soit le nombre d'analytes à doser, soit un volume de 50μΙ. Quatre cytokines ont été retenues : le CD25s (ou récepteur soluble de l'IL-2), MIP-1 a (Macrophage Inflammatory Protein 1 alpha), et RANTES (Regulated upon Activation, Normal T cell Expressed and Secreted, ainsi que l'IFN-γ. Chacune de ces cytokines semble pouvoir présenter un intérêt pour la diangostic et/ou le pronostic, ce qui est démontré pour la première fois, mais la cytokine CD25s est la plus intéressante.
Le récepteur de l'interleukine-2 (IL-2) existe sous deux formes : une forme membranaire, située sur les lymphocytes activés T, B et NK (Natural Killer), et une forme libre, détectable dans le sérum. La forme membranaire est un hétérotrimère constitué de trois sous-untités protéiques : une sous-unité IL-2Ra (encore appelée Ag Tac ou CD25 ou p55), une sous-unité IL-2R3 (p75) et une sous-unité IL-2Ry (p64). La chaîne a est une glycoprotéine de 55 kDa constituée de 251 acides aminés dont 219 sont extra cellulaires, et constitue le site de reconnaissance spécifique de l'IL-2. Cette chaîne a est issue d'une phase ouverte de lecture menant à la production d'une protéine de 272 acides aminés (SEQ ID N° 1 ), dont le peptide signal de 21 acides aminés est clivé (Kuziel et Greene, J Invest Dermatol. 1990 Jun;94(6 Suppl):27S-32S).
La forme libre du récepteur n'est constituée que de la chaîne a. Cette partie soluble, appelée ll-2Ras ou CD25s, est une protéine de 45kDa, détectable dans les liquides biologiques et capable se lier spécifiquement à l'IL-2. Cette protéine présente trois régions épitopiques A, B et C.
La Demanderesse a montré que la quantité de CD25s dans un prélèvement oculaire d'un patient était un facteur permettant d'anticiper la probabilité d'une évolution clinique de la maladie, et pouvant également être utilisé pour affiner le diagnostic dans certains cas. Par ailleurs, la Demanderesse a également montré que certains autres facteurs (IFNy, MIP-1 a, RANTES) peuvent également être utilisés dans une optique diagnostique et pronostic des PIOL.
À la vue des contraintes liées à la quantité de prélèvement disponible dans ces maladies, la Demanderesse a donc mis au point un kit de détection du CD25s, qui est notamment utilisable par cytométrie de flux. En particulier, la Demanderesse envisage que ce kit de détection puisse être utilisable en parallèle avec la détection d'autres analytes, et notamment de l'IL-10 et l'IL-6. Il est en effet important que la détection de nombreux facteurs puisse être réalisée simultanément, en raison du faible volume présent dans les échantillons prélevés sur les patients. La Demanderesse a, pour la première fois, et sans que les résultats rapportés dans la présente demande n'aient été attendus ou prévisibles, démontré que le CD25s était un analyte important à doser pour poser un pronostic d'évolution des PIOL. La Demanderesse a donc été la première à se poser la question de l'intérêt de développer un test de détection de ce composé, qui puisse être utilisé pour des petits volumes de prélèvement, et simultanément à la détection d'autres composés.
Ainsi, la Demanderesse a, en particulier, mis au point un système de détection qui puisse être utilisé avec le système CBA™ développé par la société BD Bioscience. L'invention se rapporte ainsi à un kit de détection du CD25s comprenant un ensemble de billes émettant une fluorescence sous excitation à une longueur d'onde d'excitation, ladite fluorescence émise par lesdites billes l'étant à une longueur d'onde d'émission différente de la longueur d'onde d'excitation, chacune des billes comprenant, couplée à sa surface, une pluralité d'anticorps dirigés contre la protéine CD25s.
Ce kit est parfaitement adapté à la détection de CD25s dans des très petits volumes, telle qu'une ponction de chambre antérieure (PCA) ou un prélèvement de vitré pur, et peut aussi être utilisé dans le cadre d'une détection simultanée d'autres cytokines. En effet, si le dosage est effectué sur le vitré, il faut qu'il soit pur et non dilué pour que les dosages soient juste mais aussi il faut en utiliser le moins possible pour les cytokines car il faut garder du matériel pour les autres techniques de diagnostic ( cytologie, immunomarquage, recherche de clonalité par PCR ).
Ainsi, si certains documents (US 5,292,636 ou WO 87/005912) décrivent le dosage de la protéine CD25s dans le sérum, le test utilisé dans ces documents est un test ELISA, dans lequel un volume (50 μΙ) d'échantillon est utilisé (voir colonne 24, ligne 29 de D2). Toutefois, dans la mesure où il est possible de prélever un volume important de sérum, il est possible de répéter cette méthode ELISA pour mesurer, de façon indépendante, la quantité de plusieurs cytokines. Toutefois, la méthode de US 5,292,636 ou WO 87/005912 n'est pas adaptée à la résolution du problème technique de la présente invention, qui est de pouvoir doser plusieurs cytokines dans un très petit volume d'échantillon (provenant du vitré). Il est donc nécessaire de pouvoir mettre au point un test permettant d'opérer en multiplex.
Les résultats rapportés dans la présente demande montrent, pour la première fois, la présence de CD25s dans le vitré et son rôle pour le diagnostic et le pronostic de PIOL. Une des contraintes de cette maladie est le petit volume de prélèvement qu'il est possible de faire, et le fait qu'il est nécessaire de pouvoir doser plusieurs métabolites. Sans information sur le rôle de CD25s dans cette maladie, il apparaît que l'homme du métier n'aurait pas eu de raison particulière de fabriquer et utiliser un tel kit.
Le document WO 2005/031001 décrit l'utilisation de billes sur lesquels sont liés des anticorps reconnaissant une protéine CA. Toutefois, ce document ne fournit aucune indication sur le rôle de CD25s dans le PIOL, ni sur le fait que l'on doive utiliser des billes émettant une fluorescence sous excitation. Dans un mode de réalisation particulier, la longueur d'onde de la fluorescence émise, après excitation, par chacune des billes de l'ensemble présent dans le kit est identique.
Dans un mode de réalisation particulier, les anticorps de la pluralité d'anticorps dirigés la protéine CD25s sont tous identiques : ceci signifie que chacune des billes présentes dans l'ensemble de billes contient, à sa surface, une pluralité d'exemplaires du même anticorps dirigé contre CD25s (c'est-à-dire ayant la même séquence). Ainsi, dans ce mode de réalisation, la pluralité d'anticorps dirigés contre la protéine CD25s est une pluralité d'anticorps monoclonaux, c'est-à- dire que le même anticorps monoclonal reconnaissant CD25s est présent, en de nombreux exemplaires, à la surface de chacune des billes.
Dans un autre mode de réalisation, les anticorps de la pluralité d'anticorps dirigés la protéine CD25s ne sont pas tous identiques, mais reconnaissent tous le même épitope (ou domaine) de la protéine CD25s : ceci signifie que chacune des billes présentes dans l'ensemble de billes contient, à sa surface, plusieurs anticorps identiques contre CD25s (c'est-à-dire ayant la même séquence).
Dans un mode de réalisation préféré, la longueur d'onde d'excitation est inférieure ou égale à 650nm. De préférence, cette longueur d'onde d'excitation est égale à 633nm.
Dans ce mode de réalisation, la longueur d'onde d'émission (que l'on détecte après excitation) est supérieure à 655nm. En particulier, elle peut être égale à 660-665nm ou 767-773nm.
La longueur d'onde de 633nm correspond à une longueur d'onde permettant l'excitation de l'allophycocyanine. Celle-ci émet à une longueur d'onde autour de 660nm, détectable avec un filtre à 665nm. Lorsqu'elle est couplée à la cyanine-7, la cyanine 7 est en effet excitée par la fluorescence émise par l'allophycocyanine et émet alors à 767nm ou 773nm, détectée à 767nm avec un filtre approprié. Ce rayonnement est basé sur la fluorescence par transfert d'énergie par résonnance (FRET, Fluorescence Résonance Energy Transfer).
Dans un mode de réalisation particulier, lesdites billes émettent une fluorescence à deux longueurs d'onde différentes. Ceci est le cas lorsque les billes contiennent deux fluorophores émettant à ces deux longueurs d'onde.
De telles billes sont notamment décrites dans les brevets US 7,445,844, US
6,929,859, US 6,632,526, US 6,599,331 , US 6,514,295. Dans un cas particulier, lesdites longueurs d'onde d'émission sont 660- 665nm et 767-773nm, ce qui correspond à des billes contenant à la fois de l'allophycocyanine et de l'allophycocyanine couplée à la cyanine-7.
Dans ce mode de réalisation, et ainsi que vue plus haut, lesdites billes contiennent à la fois de l'allophycocyanine et de l'allophycocyanine couplée à la cyanine-7, la quantité et le ratio étant identiques pour chacune des billes.
Ainsi, le passage des billes dans un cytomètre de flux, l'excitation à une longueur d'onde de 633nm, et la collecte de la quantité de fluorescence émise par les billes à 655nm et 767nm, permet d'observer, sur un diagramme 2D (abscisse quantité de fluorescence APC, ordonnée quantité de fluorescence APCCy7), les billes à une position spécifique de ce diagramme.
Dans un mode de réalisation préféré, lesdites billes sont des microbilles de polystyrène. Elles ont, de préférence, un diamètre compris entre 5 et 10 μηη, de façon plus préférée 7,5 μηι.
Dans un autre mode de réalisation, lesdites billes sont des billes de silice (voir US 20090068639). Dans un mode de réalisation particulier, ledit kit de détection contient également des anticorps secondaires susceptibles de se lier au CD25s. Dans le mode de réalisation préféré, ces anticorps secondaires doivent être susceptibles de se lier au CD25s après liaison de cette protéine à un anticorps présent à la surface desdites billes. On préfère que ces anticorps secondaires soient liés à un composé fluorescent. Le fluorochrome choisi présente de préférence des longueurs d'onde d'excitation et d'émission différentes de celles des fluorochromes présents dans les billes.
Ainsi, on choisit plutôt un fluorochrome ayant des longueurs d'onde d'excitation et d'émission inférieures à 600nm. On peut ainsi choisir la phycoérythrine (PE), ou tout autre fluorochrome. L'homme du métier connaît d'autres fluorochromes utilisables (listés notamment sur wikipedia).
Ainsi que vu plus haut, il est préférable que les anticorps présents à la surface des billes reconnaissent tous le même épitope de la protéine CD25s. En particulier, on préfère qu'ils reconnaissent l'épitope B de la protéine CD25s. De même, les anticorps secondaires reconnaissent tous un même épitope ou domaine de CD25s. En particulier, on préfère qu'ils reconnaissent l'épitope (domaine) A de la protéine CD25s.
Enfin, il est préféré que le kit selon l'invention contienne également une solution de CD25s humain recombinant, qui permet d'effectuer des contrôles et des quantifications plus précises.
Dans un mode de réalisation préféré, le kit de détection comprend a) des microbilles de polystyrène, ayant en particulier un diamètre d'environ 7,5 μηη, contenant un mélange de fluorophores Allophycocyanine -
Allophycocyanine liée à la cyanine-7, lesdites billes comprenant, couplée à leur surface, une pluralité d'anticorps monoclonaux murins dirigés contre l'épitope B du CD25s humain
b) une solution d'anticorps monoclonaux murins dirigés contre l'épitope A du CD25s humain, liés à la phycoérythrine
Ce kit comprend également éventuellement une solution de CD25s humain recombinant.
Dans un mode de réalisation particulier, les billes apparaissent en A4, après passage dans un cytomètre de flux BD FACSCanto™ Il (BD Bioscience), et analyse par un logiciel approprié tel que le FACSDiva (BD Bioscience). Ceci signifie que la fluorescence émise par les billes est similaire ou identique à la fluorescence émise par les billes de référence 558578 vendues par BD Bioscience.
On peut toutefois choisir n'importe quelles autres billes, en particulier les billes A5, B4, B5, E5, E8, C8, D8 (classification BD Bioscience). Toutes ces billes sont disponibles chez BD Bioscience. Elles ne diffèrent que dans la quantité et le ratio des fluorochromes APC et APCCY7.
Dans un mode de réalisation préféré, le kit de détection est utilisé en cytométrie de flux pour doser le CD25s dans un échantillon obtenu d'un patient. Dans un mode de réalisation particulier, cet échantillon est un vitré ou tout autre prélèvement intraoculaire, et l'on dose en même temps d'autres cytokines.
Ainsi, le kit de détection peut aussi contenir au moins un autre ensemble de billes, lesdites billes comprenant, couplés à leur surface, une pluralité d'anticorps reconnaissant une autre protéine que la protéine CD25s, lesdites billes émettant une fluorescence sous excitation à la même longueur d'onde d'excitation que celle excitant les billes destinées à doser CD25s, ladite fluorescence émise par lesdites billes l'étant
a) à une longueur d'onde d'émission différente de ladite longueur d'onde d'émission des billes couvertes de la pluralité d'anticorps dirigés contre la protéine CD25s, et/ou
b) à une intensité différente de l'intensité observée pour les billes couvertes de la pluralité d'anticorps dirigés contre la protéine CD25s.
En particulier, ladite autre protéine que la protéine CD25s est choisie dans le groupe constitué de l'interleukine 6 (IL-6) et l'interleukine 10 (IL-10).
On choisit notamment des billes contenant les mêmes fluorochromes (APC / APCCy7) que les billes destinées à la détection du CD25s, mais dans des proportions et/ou quantités différentes.
Ainsi, ces billes du second ensemble seront localisées, sur le diagramme 2D (abscisse quantité de fluorescence APC, ordonnée quantité de fluorescence APCCy7), les billes à une position spécifique de ce diagramme qui est différente de celle des billes couvertes d'anticorps anti-CD25s.
Le kit peut ainsi contenir plusieurs ensembles de billes, chacun destiné à la détection et au dosage d'une protéine différente, les billes de chaque ensemble ayant un profil de fluorescence propre et différent de celui des billes d'un autre ensemble.
On préfère lorsque le kit permet le dosage simultané de l'IL-6 et de l'IL-10 (en plus du CD25s).
On peut notamment se procurer d'autres ensembles de billes chez BD
Bioscience (San José, Californie, États-Unis), par exemple sous la référence 560484 (Human Th1/Th2/Th17 CBA Kit qui regroupe des billes pour la détection simultanée des IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IFN-γ, et TNF), ou cytokine par cytokine. Par exemple, on peut citer la référence 558274 (IL-10, billes B7) ou 558276 (IL-6, billes A7) de chez BD Bioscience.
Le kit ainsi décrit, même s'il peut être utilisé dans d'autres applications, a été spécialement conçu pour la mise en œuvre de la mesure (dosage) in vitro de la quantité (concentration) de CD25s dans un prélèvement oculaire chez un patient. En effet, ainsi que vu plus haut, la Demanderesse a du spécifiquement mettre au point ce kit, afin de pouvoir effectuer des dosages simultanés de plusieurs cytokines dans un échantillon de très faible volume, du fait de l'intérêt du CD25s dans le pronostic du lymphome intraoculaire primitif.
L'invention se rapporte également à une méthode de pronostic d'un lymphome intraoculaire chez un patient, comprenant l'étape de mesure (in vitro) de la quantité de CD25s dans un prélèvement oculaire chez ledit patient, une concentration de CD25s supérieure à 200 pg/ml dans ledit prélèvement étant indicatrice d'un pronostic défavorable d'évolution de la maladie chez ledit patient.
Dans un mode de réalisation préféré, cet échantillon oculaire est un prélèvement de vitré. La concentration mesurée in vitro est alors celle effectivement présente in vivo. Lorsque l'échantillon n'est pas du vitré pur, il convient alors de connaître la dilution pour recalculer la concentration effective présente in vivo. Ainsi, si le prélèvement est un vitré dilué à 50 %, il convient de multiplier la concentration mesurée in vitro par deux pour pouvoir conclure.
II est entendu que la méthode ainsi décrite est effectuée in vitro sur un échantillon qui a été obtenu après prélèvement sur un patient. Cette méthode n'inclut pas l'étape de prélèvement de l'échantillon oculaire.
Cette mesure (dosage) est notamment réalisée en utilisant le kit décrit plus haut, qui est particulièrement bien adapté à une telle utilisation, ayant été développé dans ce but.
Ainsi ce dosage est préférentiellement réalisé par cytométrie de flux. On peut utiliser des appareils disponibles dans le commerce, tels que les cytomètres à deux lasers développés par BD Bioscience.
Instrument Détection des anticorps Paramètres de détection secondaires des billes
BD FACSVerse™ flow PE CBA Red et CBA NIR cytometer
BD Accuri™ C6 flow FL2 FL4 (675/25) et FL3 cytometer* (780/60)
BD FACSArray™ Yellow Red et NIR
bioanalyzer
BD FACSCanto™ Il flow PE APC et APC-Cy™7 cytometer
BD LSRFortessa™ flow PE APC et APC-Cy7 cytometer BD FACSAria™ III cell PE APC et APC-Cy7 sorter
BD FACSCalibur™ flow FL2 FL4 et FL3
cytometer
Avec les logiciels tels que BD FACSDiva Software, il est possible d'isoler les billes correspondant à un couple APC / APCCy7 particulier, et de visualiser la fluorescence en PE de la population cernée sur un histogramme représentant l'intensité de fluorescence en abscisse et le nombre d'événement en ordonnée. Le logiciel rend une moyenne d'intensité de fluorescence (MIF) pour chaque tube, correspondant à une concentration déterminée à partir d'une gamme étalon réalisée en parallèle.
Par « pronostic défavorable d'évolution de la maladie », on entend une forte probabilité (supérieure à 50 %) que la maladie du patient présente au moins une évolution suivante :
rechute dans l'année suivant l'arrêt du traitement
non-réponse au traitement (réfractaire au traitement)
Ceci signifie en particulier que plus de 50 % des patients pour lesquels la concentration de CD25s est supérieure à 200 pg/ml présenteront l'évolution clinique mentionnée ci-dessus.
De même, parmi les patients présentant une telle évolution clinique, plus de 50 % présentent une concentration de CD25s supérieure à 200 pg/ml.
En particulier, une quantité de CD25s supérieure à 500 pg/ml dans l'échantillon oculaire est indicatrice d'une forte probabilité de présenter une rechute dans l'année suivant l'arrêt du traitement.
De même, une concentration de CD25s inférieure à 125 pg/ml, voire à 150 pgml dans l'échantillon oculaire est indicatrice d'une forte probabilité de rémission complète.
Afin d'affiner cet aspect pronostic, il peut être également intéressant de mesurer la quantité d'IL-6 dans ledit prélèvement. En effet, la présence de niveaux élevés de ces deux cytokines inflammatoires est indicatrice d'un mauvais pronostic d'évolution de la maladie.
Ainsi, une quantité d'IL-6 supérieure à 50 pg/ml est indicatrice d'un pronostic défavorable d'évolution de la maladie. En particulier, une quantité de'IL-6 supérieure à 100 pg/ml dans l'échantillon oculaire est indicatrice d'une forte probabilité de présenter une rechute dans l'année suivant l'arrêt du traitement. Enfin, il est possible et envisager de doser et mesurer la quantité de CD25s dans un échantillon de liquide céphalorachidien d'un patient, notamment par utilisation du kit ainsi décrit, dans des méthodes de diagnostic et/ou pronostic d'un lymphome du système nerveux central. Ce dosage est bien entendu effectué in vitro. Le CD25s peut en effet être trouvé dans les prélèvements de ce type (Kitai et al, Brain Tumor Pathol. 2013 Jan;30(1 ):34-9).
D'une façon générale, dans les méthodes décrites ci-dessus, l'étape de mesure in vitro de la quantité de CD25s (dosage de CD25s) est préférentiellement effectuée à l'aide d'un kit tel que décrit ci-dessus.
Description des Figures
Figure 1 : Représentation de la position alphanumérique des billes portant les anticorps destinés à détecter des cytokines selon le standard développé par BD Bioscience pour la technique CBA™, en représentation APC/APC-Cy7
Figure 2 : Résumé des renseignements cliniques obtenus pour 25 patients atteints de LIO.
Figure 3 : concentration intravitréenne de CD25s mesurés chez des patients en rémission complète ou réfractaire au traitement (A.), ayant présenté une rechute dans l'année suivant l'arrêt du traitement (rechute <1 an) ou plus d'un an après l'arrêt du traitement (rechute >1 an) (B.), la figure C. synthétisant les figures A. et B. RC : rémission complète
Exemples
Exemple 1. Préparation d'un kit pour la détection de CD25s par CBA™
a) Préparation des billes couplées à des anticorps anti CD25
Le dosage du CD25s en CBA™ peut être effectué en réalisant un couplage de billes avec des anticorps spécifiques.
Pour cela, ont été choisis des billes non couplées, un couple d'anticorps monoclonaux reconnaissant chacun un épitope différent du CD25s, l'un purifié, destiné à être conjugué aux billes, et l'autre marqué à la PE. Un recombinant standard de CD25s permet de réaliser la gamme étalon.
Les billes ont été choisies de telle sorte qu'elles possèdent une position sur le dot plot en APC/APCCy7 assez éloignée des autres billes susceptibles d'être utilisées en parallèle pour le dosage des autres cytokines. Le choix des billes en position A4 (BD Biosciences, ref 558578) a été retenu, car cette position se trouve assez éloignée de celle de l'IL-6, de l'IL-10, de ΜΙΡΙ -α, de RANTES et de l'IFN-v positionnées respectivement en A7, B7, B9, D4 et El. La position prévisionnelle des cytokines est représentée sur la Figure 1 . L'anticorps primaire choisi est un anticorps monoclonal purifié de souris
NA LE anti-CD25 humain (clone M-251 ) dirigé contre le domaine (épitope) B de la protéine. L'anticorps secondaire est un anticorps monoclonal de souris anti-CD25 humain (clone 2A3), dirigé contre le domaine (épitope) A de la protéine, couplé à la phycoérythrine (excitée à une longueur d'onde de 488nm, et émettant une flourescence à une longueur d'onde de 580nm).
Les deux anticorps peuvent être achetés auprès de BD Biosciences (San José, Californie) sous les références 555429 et 34101 1 respectivement. Ces anticorps ou d'autres anticorps sont également disponibles auprès d'autres fournisseurs (par exemple Stemcell, ou Miltenyi Biotec).
L'anticorps primaire NA LE anti-CD25 a été couplé aux billes A4 selon les préconisations du fabriquant. Le principe de la réaction de conjugaison consiste à réduire les ponts disulfures situés à la surface des billes de polystyrène grâce à un agent réducteur, le dithiothreitol. Parallèlement, les fonctions aminées primaires des anticorps réagissent avec un agent de conjugaison hétéro-bifonctionnel, le sulfo-SMCC, et forment un dérivé de maléimide très réactif. Ce dernier peut alors former une liaison de thioether stable avec les fonctions thiol des billes via une réaction radicalaire, aboutissant ainsi à l'ancrage covalent des anticorps. b) Procédure de marquage
Les billes couplées à l'anticorps primaire ont été utilisées pour la détection du CD25s, suivant la procédure de marquage suivante : pour chaque test, 50μΙ d'échantillon ont été incubés pendant 1 h à l'obscurité avec 1 μΙ de billes A4 conjuguées préalablement lavées et diluées dans un tampon de lavage. L'anticorps secondaire anti-CD25 couplé à la PE dilué au 1/20ème a ensuite été ajouté. Après une incubation de 2h et un dernier lavage, l'échantillon peut être analysé au cytomètre. c) Analyse sur cytomètre FACSCantoll - Gammes étalons - Linéarité
Chaque tube contenant le milieu réactionnel a été analysé sur un cytomètre
FACSCantoll™ 8 couleurs (BD Bioscience ; Becton Dickinson), en mode manuel, en acquérant au minimum 300 événements à une vitesse « médium ». Les données ont été analysées à l'aide du logiciel informatique BD FACSDiva Software (Becton Dickinson).
La stratégie d'analyse comprend tout d'abord un conditionnement de l'ensemble des billes dans une fenêtre d'analyse taille/structure. Elles sont ensuite fenêtrées en APC et APC-Cy7 de manière à cerner au maximum les billes A4. Cette dernière sélection permet d'éliminer de la fenêtre d'analyse toutes les impuretés liées à la conservation ou les doublets de billes générés pendant l'étape de couplage. La fluorescence en PE de la population cernée en A4 peut être visualisée sur un histogramme représentant l'intensité de fluorescence en abscisse et le nombre d'événement en ordonnée. Le logiciel rend une moyenne d'intensité de fluorescence (MIF) pour chaque tube, correspondant à une concentration déterminée à partir d'une gamme étalon réalisée en parallèle. Sur la base des mesures effectuées sur la gamme étalon, on a observé qu'il existe une bonne linéarité pour les valeurs comprises entre 0 et 10000 pg/ml. Ainsi, lors des dosages ultérieurs, le point extrême de la gamme ne devrait pas dépasser 10000 pg/ml. Le dosage du CD25s n'ayant jamais été testé sur des prélèvements intraoculaires, il n'était pas possible de prédire avec certitude quelle serait la gamme de concentration attendue avant de tester des échantillons de patients. Toutefois, il a été considéré que les résultats devraient être du même ordre de grandeur que ceux de l'IL-10 et de l'IL-6, pour lesquels la valeur maximale détectée en CBA est de 5000 pg/ml. Ainsi, le point supérieur de la gamme de calibration du CD25s a été fixé à 8000 pg/ml : ce point se trouve dans le domaine de linéarité de la courbe et permet de balayer un intervalle de concentration très large. Les résultats de dosage de CD25s supérieurs à 8000 pg/ml ont donc été rendus « >8000 pg/ml ».
Une gamme étalon en 12 point avec des concentrations plus diluées de
CD25s, allant de 7,8 pg/ml à 8000 pg/ml, a été réalisée. Les résultats de cette gamme montrent que l'intensité de fluorescence correspondant aux très faibles concentrations comprises entre 0 et 30 pg/ml ne varient pas de manière proportionnelle. Le seuil de détection a ainsi été fixé à 30 pg/ml. d) Test de dosage multiplex Afin de tester la compatibilité des billes ainsi conçues avec d'autres billes commerciales, pour démontrer la possibilité d'effectuer une détection de l'ensemble des cytokines via une seule expérience, les réactifs permettant la détection du CD25s, de l'IL-10, de l'IL-6, et de l'IFN-γ ont été combinés pour voir s'il était possible de doser simultanément toutes ces cytokines, sans qu'il n'y ait d'interférences pour leur détection.
Pour cela, une gamme étalon a été réalisée à partir d'un mélange de CD25s, d'IL-10, d'IL-6, et d'IFN-γ recombinants. Chaque cytokine se trouve initialement à une concentration de 5000 pg/ml dans le premier tube qui constitue le point supérieur de la gamme. Il a été dilué en cascade pour obtenir les différents points de gamme, chaque cytokine se trouvant alors diluées dans les mêmes proportions. Enfin, le mélange de tous les réactifs permettant la détection de chaque cytokine a été ajouté dans chaque tube correspondant à un point de gamme.
On a observé que les billes n'interfèrent donc pas entre elles pour leur détection puisque la linéarité est bonne pour chaque droite d'étalonnage. On peut cependant noter que l'intensité du signal est plus faible pour le CD25s, même si la linéarité reste tout à fait acceptable.
Exemple 2. Marquage pour le dosage multiplex du CD25s, de IL-10, de IL-6, de MIP1 -g, de RANTES et de IFN-y en CBA™ dans des prélèvements oculaires
Ce mode opératoire décrit la technique de marquage des cytokines qui a été appliquée. Les kits prêts à l'emploi (kits Flex Set BD™ CBA) ont été utilisés pour le dosage de l'IL-10, de l'IL-6, de l'IFN-γ, de MIP-1 g et de RANTES. Chaque kit permet de réaliser 50 tests et contient les billes de captures couplées à l'anticorps primaire, l'anticorps secondaire, et un recombinant standard sous forme lyophilisée à reconstituer au moment de la préparation de la gamme étalon. Les kits CBA™ utilisés ont été développés par BD Biosciences ey sont commercialisés sous les références 558274 (IL- 10), 558276 (IL-6), 558324 (RANTES), 558449 (MIP-1 g) et 561515 (IFNv).
Pour le CD25s, ont été utilisées les billes A4 fonctionnelles décrites plus haut, l'anticorps secondaire anti-CD25 et le recombinant standard sous forme liquide. Les tampons nécessaires à la réalisation du dosage recommandés par le fabriquant sont fournis dans le kit CBA™ Human Soluble Protein Master Buffer Kit, BD Bioscience. a) Préparation de la solution de billes de capture
Les billes sont à utiliser à raison de 1 μί par test, soit 50μί de chaque bille pour une série de 50 tests. Elles sont d'abord lavées dans 500μί de tampon de lavage Wash Buffer BD, centrifugées 5 min à 1500tr/min. Le surnageant est délicatement aspiré et les billes sont remises en suspension dans 2500μΙ de tampon de dilution Capture Bead Diluent for Serum/Plasma, soit 50μΙ par test. La solution est incubée 15min à température ambiante et à l'obscurité pour éviter d'exciter les fluorochromes présents sur les billes. b) Préparation extemporanée de la solution d'anticorps secondaires PE
Pour l'IL-10, l'IL-6, l'IFN-γ, MIP-1 a et RANTES, 1 μΙ d'anticorps secondaire est nécessaire pour un test, soit 50μί de chaque anticorps pour une série de 50 tests. La quantité minimale nécessaire utile pour un test n'ayant pas été évaluée avec précision pour le CD25s, la même quantité d'anticorps secondaire que celle choisie pour les mises au point techniques, soit 5 μΙ par test, a été utilisée. Au total 250μΙ d'anticorps anti-CD25s sont nécessaires pour 50 tests.
Le mélange de l'ensemble des anticorps nécessaires pour une série de 50 tests représente un volume de 500μΙ. Ce volume est dilué au quart dans 2ml de tampon Diluent Detector et 200μΙ de cette dilution sont nécessaires pour chaque test. c) Marquage des échantillons
Le marquage s'effectue sur un volume de 50μΙ d'échantillon. Un volume de 50μΙ du mélange de billes, préalablement vortexés est ajouté à l'échantillon puis incubé 1 h à l'obscurité et à température ambiante. Après cette incubation, 50μΙ de la solution de mélange d'anticorps secondaires PE est ajouté à l'échantillon. Le mélange est incubé 2h à l'obscurité et à température ambiante. À l'issue de cette étape, les échantillons sont lavés pour éliminer l'excès d'anticorps secondaires. Un volume de 1000μΙ de tampon Wash Buffer BD est ajouté, l'échantillon est centrifugé pendant 5 min à 1500tr/min. Le surnageant est retiré délicatement et le culot de billes est remis en suspension dans 300μΙ de tampon Wash Buffer BD. Les échantillons sont prêts pour être analysés au cytomètre. d) Analyse au cytomètre
Avant chaque passage au cytomètre, l'échantillon doit être vortexé pour remettre en suspension les billes. L'analyse doit être faite dès la fin de l'étape de marquage pour éviter un découplage entre les billes et les cytokines pouvant entraîner une perte de signal. Les échantillons sont analysés au cytomètre en mode manuel en acquérant au minimum 300 événements à une vitesse « médium ». Les données sont analysées à l'aide du logiciel informatique BD FACSDiva Software™ et basculées sur le logiciel de traitement des résultats FCAP-Array™. e) Validation technique du test sur des prélèvements intraoculaires
Le dosage multiplex des cytokines sur 15 échantillons intraoculaires de patients atteints de PIOL (7 PCA et 8 vitrés) et 18 prélèvements intraoculaires de patients atteints d'uvéite a été réalisé, sur des prélèvements conservés à -80°C depuis environ 2 ans. L'IL-10 et l'IL-6 avaient été mesurés initialement et simultanément avec la technique CBA™. Le dosage multiplexe des 6 cytokines a été réalisé après avoir décongelé les prélèvements, et les résultats d'IL-10 et d'IL-6 obtenus avant et après congélation ont été comparés pour voir si d'une part, la conservation altère la qualité du prélèvement et d'autre part pour voir si le dosage simultané de 6 cytokines a un impact sur leurs résultats respectifs.
Les résultats sont bien corrélés pour l'IL-10 (R2=0,951 1 ) ainsi que pour l'IL- 6 (R2=0,9873) ce qui a permis de conclure d'une part, que la congélation n'a pas entraîné de dégradation du matériel et d'autre part, que le dosage simultané de 6 cytokines n'interfère pas sur les résultats de chaque cytokine. Le test ainsi mis au point est donc valide sur le plan technique et fournit des résultats fiables.
Exemple 3. Dosage de différentes cytokines chez des patients
En dehors de l'IL-10, l'IL-6 et de l'IFN-γ qui sont régulièrement dosés en routine dans des prélèvements intraoculaires, le dosage du CD25s, RANTES et MIP1 -a n'avait jamais été pratiqué dans ce type de prélèvement. Après avoir mis au point le dosage combiné de ces 6 cytokines en technique CBA™, il a été appliqué à une cohorte de patients atteints de lymphome intraoculaire (LIO) pour voir d'une part, si ces cytokines sont détectables dans des prélèvements intraoculaires, et d'autre part, pour étudier la signification clinique des résultats. a) Patients et prélèvements
L'étude a porté sur une cohorte rétrospective de 36 patients atteints de LIO, tous issus du service d'ophtalmologie de la Pitié-Salpêtrière et pour lesquels le diagnostic initial a été posé grâce à l'examen cytologique sur un prélèvement d'humeur vitrée et/ou grâce au dosage de l'IL-10 et de l'IL-6 (dosés en technique CBA™, sauf pour les prélèvements antérieurs à janvier 2009 pour lesquels le dosage a été réalisé en ELISA).
Le dosage multiplex des 6 cytokines a été réalisé sur les prélèvements d'humeur vitrée correspondant au prélèvement au diagnostic pour chacun des 36 patients. Tous les prélèvements étaient conservés à -80°C et en quantité suffisante pour effectuer un nouveau dosage, soit un volume de prélèvement d'au moins 50μΙ. Tous ces prélèvements ont été effectués entre le mois d'avril 2004 et de janvier 2012.
La cohorte comprenait 17 hommes et 19 femmes. La moyenne d'âge était de 65 ans avec des valeurs extrêmes allant de 44 à 88 ans. Pour 25 patients, des renseignements cliniques ont été obtenus à partir des dossiers médicaux mis à disposition par le service d'Ophtalmologie.
En parallèle, une cohorte de contrôle « non-PIOL » a été constitutée, comportant 16 prélèvements d'humeur vitrée de patients avec un profil cytokinique d'uvéite (concentration intraoculaire en IL-6 augmentée, IL-10 basse) et deux patients pour lesquels l'IL-10 et l'IL-6 n'étaient pas détectables. Les renseignements cliniques n'ont pas pu être recueillis pour ces 18 patients. b) Résultats d'IL-10 et d'IL-6
Les concentrations d'IL-10 dans les vitrés des patients atteints de LIO sont en moyenne de 1787 pg/ml alors qu'elles sont de 5 pg/ml dans les prélèvements des patients du groupe témoin.
Les médianes des concentrations de chaque cytokine ont été comparées entre les deux groupes avec un test non paramétrique de Mann-Whitney, adapté aux petites séries. La médiane des concentrations en IL-10 est significativement supérieure dans le groupe des LIO (P<0,05). A l'inverse, la médiane des concentrations en IL-6 est supérieure dans le groupe des uvéites (P<0,05). Les résultats récapitulatifs des dosages sont représentés dans le tableau 1 . IL-10 (pg/ml) IL-6 (pg/ml) Ratio IL-10/1 L-6
LIO Uvéite PIOL Uvéite LIO Uvéite
Médiane 1 1 10 2 52 207 17,7 0,003
Moyenne 1787 5 265 1406 37 0,008
Ecart 1774 4,7 824 2092 44 0,2 type
Minimum 80 1 6 2 0,9 0
Maximum 5000 14 5000 5000 21 1 0,5
Tableau 1 : Résultats c 'IL-10 et d'l _-6 dans le groupe de lymphomes intraoculaires
(n= 36) et les uvéites (n=16)
D'après une étude réalisée dans les laboratoires de la Demanderesse, portant sur 56 vitrés dans lesquels l'IL-10 et l'IL-6 ont été mesurés en CBA, le seuil de 37 pg/ml en IL-10 a été proposé pour porter le diagnostic de LIO. La valeur minimale en IL-10 détectée dans cette série de LIO est de 80 pg/ml, ce qui est en accord avec ce seuil diagnostique proposé. De plus, le calcul du ratio IL-10/IL-6 est souvent considéré comme pertinent pour apporter une aide au diagnostic lorsque sa valeur est supérieure à 1 (Whitcup et al, op. cit.). Ce ratio a été déterminé, et il a été observé qu'il est systématiquement supérieur à 1 , à l'exception d'un patient pour lequel il est de 0,9.
Ces résultats ont donc confirmé le diagnostic de LIO ou d'uvéite initialement posé dans chaque groupe et ont permis de conforter la validité technique du test que nous avons mis au point, puisque les diagnostics initiaux restent inchangés.
La moyenne des concentrations en IFN-γ dans le groupe des LIO est de 8 pg/ml alors qu'elle est de 3 pg/ml dans le groupe des uvéites. Les médianes sont significativement différentes (P<0,05). La dispersion des résultats est faible dans les deux groupes, et seuls 3 patients du groupe de LIO ont des concentrations plus élevées à 21 , 37 et 124 pg/ml. Toutefois, compte tenu du chevauchement important des valeurs des concentrations entre les deux groupes, l'IFN-γ ne semble pas être un paramètre pertinent pour le diagnostic de LIO. c) Résultats de CD25s, RANTES et MIP-1 a Les concentrations de RANTES et MIP-1 a sont supérieures dans les LIO (P<0,05 pour RANTES et pour MIP-1 a) mais il existe un chevauchement important des valeurs entre les deux groupes sur un intervalle de valeur compris entre 0 et 50 pg/ml pour RANTES et entre 0 et 40 pg/ml pour MIP-1 a. Les quelques patients pour lesquels les valeurs de RANTES et de MIP-1 a sont élevées correspondent à des valeurs en IL-10 déjà très fortes. Ces marqueurs n'apportent donc pas une aide diagnostique supplémentaire.
Les concentrations en CD25s ne sont pas significativement différentes dans les deux groupes d'études, mais on peut observer une importante hétérogénéité des résultats dans le groupe de LIO. Les valeurs vont de 30 à 8000 pg/ml dans le groupe des LIO alors qu'elles vont de 30 à 837pg/ml dans le groupe des uvéites. Les concentrations élevées en CD25s ont tendance à être associées aux concentrations élevées en IL-10 sans qu'il n'existe toutefois de corrélation entre les deux paramètres (R2=0,4265). Il est à noter que les concentrations de CD25s comprises entre 840 et 8000 pg/ml ne sont observées que dans le cadre de LIO. Ainsi, ceci permet de poser une méthode de diagnostic d'un lymphome intraoculaire dans laquelle on mesure la quantité (concentration) de CD25s dans le vitré ou une PCA d'un patient, une concentration supérieure à 840 pg/ml étant fortement indicative d'un lymphome intraoculaire. Cette méthode est effectuée in vitro. Cette méthode peut également comprendre l'étape de traitement de ce patient contre ce lymphome intraoculaire, ou une étape de prélèvement (PCA ou prélèvement du vitré) préalable à la mesure de la concentration de CD25s. Cette méthode peut également comprendre la mesure de la quantité de l'IL-10 et/ou de NL6, éventuellement de façon simultanée à la mesure de CD25s. De façon préféré, cette méthode comprend la mesure simultanée des concentrations de CD25s, IL-10 et IL-6 dans le prélèvement. On peut aussi évaluer le rapport IL- 10/1 L-6 dans le cadre de la mise en œuvre de cette méthode. Conclusion
RANTES, MIP-1 a et l'INF-γ n'apparaissent pas réellement plus pertinents que l'IL-10 et l'IL-6 pour le diagnostic des LIO. Toutefois, ils pourraient être utilisés en seconde intention pour affiner un pronostic, mais le dosage des IL-10 et IL-6 et le calcul du ratio restent a priori les meilleurs éléments du diagnostic. En revanche, le dosage du CD25s au moment de l'étape diagnostique notamment en association avec l'ILI O et l'IL6 permet d'affiner le diagnostic en cas de doute sur les résultats obtenus avec l'IL-6 et l'IL-10 seules. Ainsi, le fait de pouvoir tester une nouvelle cytokine (CD25s) dans un échantillon obtenu par ponction de chambre antérieure pourrait aussi éventuellement permettre de diminuer le nombre de vitrectomies, car permettant de lever certains doutes si les résultats obtenus avec l'IL-6 et l'IL-10 ne permettent pas de conclure avec certitude.
Exemple 4. Interprétation des résultats : versant pronostique
Pour chaque patient, un nombre limité de paramètres (lorsqu'ils étaient disponibles) ont été étudiés : le diagnostic, la présentation oculaire unilatérale ou bilatérale, la présence d'une atteinte cérébrale concomitante au diagnostic, le délai d'apparition d'une atteinte cérébrale secondaire, le type de réponse au traitement de première ligne (réponse complète supérieure à un an, réponse partielle ou absence de réponse), le délai de rechute et le décès après l'annonce du diagnostic. a) Description clinique de 25 patients issus de la cohorte de LIO
Les renseignements cliniques n'ont pu être obtenus que pour 25 patients issus de la cohorte de LIO. L'ensemble des renseignements cliniques obtenus est résumés dans la Figure 2.
Parmi ces 25 patients, 13 sont atteints de PIOL (pas d'atteinte cérébrale au diagnostic), 7 sont atteints de lymphome oculo-cérébral (LOC), 2 présentent une localisation oculaire d'une rechute d'un lymphome cérébral primitif, et 3 sont des lymphomes oculaires secondaires à un lymphome systémique (1 lymphome folliculaire, 1 lymphome ethmoïdal et 1 lymphome B à grandes cellules).
Parmi les 12 patients atteints de PIOL, 8 ont une présentation oculaire unilatérale, et 5 bilatérale. Trois patients ont développé un envahissement cérébral dans un délai de 10 mois, 23 mois et 24 mois après l'annonce du diagnostic. Cinq patients ont développé une rechute oculaire de leur lymphome dans un délai inférieur à 1 an alors qu'une seule patiente a rechuté dans un délai supérieur à 1 an. Trois patients sont en rémission complète depuis plus d'un an et cela, dès la première ligne de traitement, et 5 patients sont réfractaires au traitement initial (réponse partielle nécessitant un traitement de deuxième ligne ou absence de réponse).
Parmi les 7 LOC, 2 ont une atteinte oculaire unilatérale et 4 bilatérale. Un patient est en rémission complète depuis plus d'un an dès la première ligne de traitement, et 2 patients ont développé une rechute oculaire de leur lymphome cérébral traité dans un délai supérieur à un an.
Deux patients ont présenté une rechute oculaire d'un lymphome cérébral en rémission depuis 7 ans pour l'un et 1 an pour l'autre. Ce dernier est décédé 4 mois après le début de la rechute oculaire.
Enfin 3 patients sont atteints de lymphome intraoculaire secondaire à un lymphome systémique (un lymphome ethmoïdal, un lymphome folliculaire et un lymphome B à grandes cellules). Pour ces 3 patients, les lymphomes systémiques étaient en rémission au moment de la rechute oculaire. Parmi eux, un patient présente une atteinte cérébrale concomitante. De manière générale, il a été difficile de savoir si les patients étaient toujours en vie au moment de l'étude. 4 patients étaient décédés, mais les informations cliniques permettant d'établir un lien entre le décès et le lymphome n'ont pas été retrouvées, sauf pour un patient. b) Analyse univariée des résultats
Compte tenu de la faible proportion de renseignements cliniques obtenus pour effectuer une analyse multivariée significative, un test de comparaison non paramétrique de Mann-Whitney a été réalisé, afin de voir si l'augmentation d'une cytokine pouvait être associée à une situation clinique particulière. Les concentrations en IL-10, IL-6, CD25s, RANTES, MIP-1 a et IFNy ont été comparées dans les groupes suivants :
- les PIOL par rapport aux LOC : les 3 patients atteints de lymphome oculaire secondaire ont été exclus pour effectuer cette comparaison, qui a donc été réalisée sur 13 patients atteints de PIOL et 7 patients atteints de LOC.
- les atteintes oculaires unilatérales par rapport aux atteintes bilatérales, sans distinction au niveau du diagnostic de PIOL, LOC ou lymphome oculaire secondaire, ce qui représente 12 atteintes oculaires unilatérales et 1 1 atteintes bilatérales.
- les patients en rémission complète dès la première ligne de traitement depuis au moins un an (7 patients) par rapport aux patients réfractaires au traitement, c'est-à-dire répondant partiellement au traitement ou nécessitant plusieurs lignes de traitement (12 patients).
- les patients présentant un délai de rechute inférieur à 1 an (5 patients), par rapport aux patients avec un délai de rechute supérieur à 1 an (5 patients). c) Comparaison entre les PIOL et les LOC Les médianes des concentrations en IL-10, RANTES et IFNv sont significativement plus élevées dans les PIOL par rapport aux LOC. Cette différence est beaucoup plus marquée pour l'IL-10, puisque la médiane est de 1535 pg/ml dans les PIOL et de 428 pg/ml dans les LOC. Pour RANTES et l'IFNv, même si les concentrations sont significativements différentes, les valeurs restent très faibles dans les PIOL et les LOC. L'IL-6 et le CD25s montrent une légère tendance à être augmentés dans les PIOL mais de façon non significative. Enfin les concentrations en MIP-1 a sont équivalentes dans les deux groupes (Tableau 2). d) Comparaison entre les atteintes unilatérales et bilatérales
Il n'existe pas de différences significatives pour les différentes cytokines selon que l'atteinte oculaire est unilatérale ou bilatérale. L'IL-10, IL-6 et le CD25s semblent avoir tendance à être augmentés dans les formes unilatérales (Tableau 2).
Figure imgf000027_0001
NS: Non Significatif * : P< 0,05
Tableau 2 : Comparaison des médianes des concentrations intravitréennes dans les différents groupes de patients étudiés e) Comparaison entre les patients en rémission complète et les patients réfractaires au traitement
Il n'existe pas de différences statistiquement significatives entre les patients en rémission complète depuis plus d'un an dès la première ligne de traitement et les patients réfractaires au traitement. Toutefois, les concentrations en IL-10, IL-6 et CD25s ont tendance à être supérieures chez les patients réfractaires au traitement. RANTES semble également être augmenté mais dans une moindre mesure puisque les concentrations sont globalement assez faibles (Tableau 3). f) Comparaison entre les patients avec un délai de rechute inférieur à 1 an et un délai de rechute supérieur à 1 an
Là encore, il n'existe pas de différences significatives des concentrations en cytokine entre les patients qui rechutent dans un délai d'un an après l'arrêt du traitement et ceux qui rechutent plus tardivement, à l'exception de l'IFNy, pour lequel les concentrations sont cependant très basses. On observe toutefois une tendance à l'augmentation non significative en IL-6, CD25s, RANTES et IFNy chez les patients rechutant précocement alors que les patients en rémissions complètes depuis plus d'un an et les patients qui rechutent tardivement semblent avec des concentrations en cytokine comparables (Tableau 3, et figure 3).
Figure imgf000028_0001
Tableau 3 : Comparaison des médianes des concentrations intravitréennes dans les différents groupes de patients étudiés g) Synthèse des résultats
Compte tenu du faible effectif étudié à chaque fois, il est difficile d'observer des différences significatives entre les groupes que nous avons constitués. Cependant il faut tenir compte de l'ordre de grandeur des concentrations en cytokine pour l'interprétation de ces résultats. En effet, RANTES, MIP-1 a et NFNy sont globalement toujours inférieurs à 100 pg/ml alors que l'IL-10, l'IL-6 et le CD25s peuvent montrer une dispersion importante des résultats avec des valeurs pouvant souvent atteindre plus de 1000 pg/ml. En prenant en compte ces éléments et avec toute la réserve liée au nombre limité de patients étudiés, il convient d'interpréter les profils cytokiniques dans leur ensemble, plutôt que chaque marqueur pris un à un.
On remarque que l'IL-6, et le CD25s (NFNy et RANTES dans une moindre mesure) varient dans le même sens. Elles ont tendance à être augmentées chez les patients dont le délai de rechute est précoce (1 <an) par rapport à ceux dont le délai est plus tardif. De plus, ces même cytokines ont également tendance à être augmentées chez les patients répondant moins bien au traitement, par rapport à ceux dont la rémission complète est obtenue de façon rapide et durable.
Si on combine ces résultats, on constate également que les médianes des concentrations de ces cytokines chez les patients avec un délai de rechute tardif et chez les patients en rémission complète sont proches.
Ainsi, l'augmentation des cytokines inflammatoires au diagnostic semble donner une bonne indication sur la réponse au traitement. Un environnement tumoral avec une composante inflammatoire importante serait plutôt associé à une moins bonne réponse au traitement.
Ainsi, les cytokines RANTES, riFNy, MIP-1 a et le CD25s n'apparaissent pas réellement plus pertinentes que l'IL-10 et l'IL-6 pour le diagnostic des lymphomes intraoculaires, mais peuvent être utiles dans des cas complexes en deuxième intention, notamment le CD25s, pour conforter un diagnostic complexe.
Par ailleurs, l'IL-6 et le CD25s ont tendance à être augmentés chez les patients qui rechutent dans un délai inférieur à un an après l'arrêt du traitement, par rapport à ceux dont le délai de rechute est supérieur à un an. Cette différence n'est pas significative statistiquement compte tenu du faible effectif étudié mais l'écart entre les médianes est important. RANTES et NFIMy sont également augmentés mais dans une moindre mesure. De plus, les patients dont la rémission complète a été obtenue rapidement et de façon durable ont des concentrations d'IL-6 et de CD25s comparable à ceux dont la rechute est plus tardive.
Autrement dit, les patients qui rechutent précocement présenteraient une imprégnation augmentée en cytokiniques pro-inflammatoires, en particulier l'IL-6 et le CD25s. On peut donc se demander si une réponse inflammatoire augmentée au moment du diagnostic ne jouerait pas un rôle délétère chez l'hôte et conditionnerait une moins bonne réponse thérapeutique à long terme.
De plus, l'IL-10, l'IL-6, le CD25s et RANTES ont tendance à être augmentés dans les PIOL en comparaison aux LOC. Cette tendance s'accentue si on retire les points supérieurs d'IL-10, d'IL-6 et de CD25s dans le groupe des LOC, qui correspondent à un même patient dont le profil cytokinique est plutôt atypique. Cette tendance à l'augmentation se retrouve également mais dans une moindre mesure pour l'IL-10 et l'IL-6 dans les formes atteinte oculaire unilatérale comparées aux atteintes bilatérales. Les concentrations en cytokines semblent donc avoir tendance à varier en fonction de la localisation unique purement oculaire ou de la localisation secondaire bilatérale ou bifocale.
Ces résultats donnent l'impression que l'imprégnation en cytokines est plus importante lorsque l'atteinte tumorale est compartimentée à l'œil, voir même au niveau d'un seul œil, et qu'elle diminue lorsque l'atteinte s'étend à un autre site, comme si la réaction immune avait tendance à s'épuiser ou à se déplacer vers un autre compartiment. Pour confirmer cette hypothèse, il faudrait doser ces cytokines dans des vitrés et de LCR à différent moment de l'évolution de la maladie, au diagnostic et au moment de l'envahissement cérébral pour suivre la cinétique de ces marqueurs lorsque la maladie se déplace vers un autre compartiment.
De manière très intéressante, des concentrations très importantes de CD25s ont été détectées dans les vitrés de patients de PIOL. De manière générale, l'origine et le rôle de la sécrétion de CD25s ne sont pas totalement élucidés. Certains auteurs lui attribuent une origine tumorale alors que d'autres considèrent qu'elle reflète l'activation des cellules immunitaires, notamment, les lymphocytes Treg (lymphocytes T régulateurs CD4+/CD25+/FOXP3) qui expriment fortement le CD25 membranaire. Il n'est donc pas impossible que la concentration intraoculaire de CD25s reflète de manière indirecte l'infiltration par les Treg, qui ont plutôt tendance à favoriser la progression tumorale en inhibant la réponse immunitaire. Si cette hypothèse se vérifie, on peut facilement comprendre que des concentrations élevées en CD25s soient associées à un mauvais pronostic pour le patient.
Les patients qui rechutaient dans un délai inférieur à 1 an après l'arrêt du traitement ont tendance à avoir des concentrations en IL-6, CD25s, RANTES et IFNy plus élevées que les patients dont la rechute est tardive.
Sans être lié par cette théorie, on peut émettre l'hypothèse qu'une augmentation de ces cytokines traduirait une réponse inflammatoire importante et délétère s'opposant à une bonne réponse thérapeutique. Cette réponse inflammatoire s'accompagnerait d'un recrutement de lymphocytes T régulateurs qui favoriseraient la progression tumorale. Les concentrations d'IL-10, d'IL-6 et de CD25s ont également tendance à être augmentées dans les atteintes purement oculaires ce qui pourrait s'expliquer par une cible tumorale plus agressive et une concentration des mécanismes immunitaires au niveau de l'œil.

Claims

Revendications
1 . Méthode de pronostic d'un lymphome intraoculaire chez un patient, comprenant l'étape de mesure in vitro de la quantité de CD25s dans un prélèvement oculaire chez ledit patient, une concentration de CD25s supérieure à 200 pg/ml dans ledit prélèvement étant indicatrice d'un pronostic défavorable d'évolution de la maladie chez ledit patient.
2. Méthode selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le pronostic défavorable d'évolution de la maladie chez ledit patient est la probabilité de présenter une rechute dans l'année suivant l'arrêt du traitement (supérieure à 500 pg/ml).
3. Méthode selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le pronostic défavorable d'évolution de la maladie chez ledit patient est la probabilité d'être réfractaire au traitement.
4. Méthode selon l'une des revendication 1 à 3, caractérisée en ce que l'on mesure également la quantité d'IL-6 dans ledit prélèvement.
5. Méthode de diagnostic d'un lymphome intraoculaire chez un patient, comprenant l'étape de mesure in vitro de la quantité de CD25s dans un prélèvement oculaire chez ledit patient I, une concentration supérieure à 840 pg/ml étant indicative d'un lymphome intraoculaire.
6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'on mesure également la quantité d'IL-10 et/ou d'IL6 dans ledit prélèvement.
7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'on mesure la quantité de CD25s, et de l'IL-10 et/ou de l'IL-6 de façon simultanée dans ledit prélèvement.
8. Méthode de diagnostic d'un lymphome du système nerveux central d'un patient comprenant l'étape de mesure in vitro de la quantité de CD25s dans un échantillon de liquide céphalorachidien dudit patient.
9. Kit de détection de la protéine CD25s adapté à la mise en œuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 5, comprenant un ensemble de billes émettant une fluorescence sous excitation à une longueur d'onde d'excitation, ladite fluorescence émise par lesdites billes l'étant à une longueur d'onde d'émission différente de la longueur d'onde d'excitation, chacune des billes comprenant, couplée à sa surface, une pluralité d'anticorps dirigés contre la protéine CD25s.
10. Kit de détection selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite longueur d'onde d'excitation est inférieure à 650nm.
1 1 . Kit de détection selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que ladite longueur d'onde d'émission est supérieure à 655nm.
12. Kit de détection selon l'une des revendications 9 à 1 1 , caractérisé en ce que lesdites billes émettent une fluorescence à deux longueurs d'onde d'émission après excitation à la longueur d'onde d'excitation.
13. Kit de détection selon l'une des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que lesdites longueurs d'onde d'émission sont détectées à 665nm et 767nm.
14. Kit de détection selon l'un des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que lesdites billes sont des microbilles de polystyrène.
15. Kit de détection selon l'une des revendications 9 à 14, caractérisé en ce que le même anticorps monoclonal reconnaissant CD25s est présent, en de nombreux exemplaires, à la surface de chacune des billes.
16. Kit de détection selon l'une des revendications 9 à 15, caractérisé en ce qu'il contient également des anticorps secondaires susceptibles de se lier au
CD25s après liaison de cette protéine auxdits anticorps présents à la surface desdites billes.
17. Kit de détection selon l'une des revendications 9 à 16, caractérisé en ce que la les anticorps présents à la surface des billes reconnaissent l'épitope B de la protéine CD25s.
18. Kit de détection selon l'une des revendications 9 à 17, caractérisé en ce que lesdits anticorps secondaires reconnaissent l'épitope A de la protéine CD25s.
Kit de détection selon l'une des revendications 9 à 18, comprenant
a) des microbilles de polystyrène contenant un mélange de fluorophores Allophycocyanine - Allophycocyanine liée à la cyanine-7, lesdites billes comprenant, couplée à leur surface, une pluralité d'anticorps monoclonaux murins dirigés contre l'épitope B du CD25s humain b) une solution d'anticorps monoclonaux murins dirigés contre l'épitope A du CD25s humain, liés à la phycoérythrine
c) éventuellement une solution de CD25s humain recombinant
Kit de détection selon l'une des revendications 9 à 19, caractérisé en ce qu'il contient également au moins un autre ensemble de billes, lesdites billes comprenant, couplés à leur surface, une pluralité d'anticorps reconnaissant une autre protéine que la protéine CD25s, lesdites billes émettant une fluorescence sous excitation à ladite longueur d'onde d'excitation, ladite fluorescence émise par lesdites billes l'étant
a) à une longueur d'onde d'émission différente de ladite longueur d'onde d'émission des billes couvertes de la pluralité d'anticorps dirigés contre la protéine CD25s, et/ou
b) à une intensité différente de l'intensité observée pour les billes couvertes de la pluralité d'anticorps dirigés contre la protéine CD25s.
Kit de détection selon la revendication 20, caractérisé en ce que ladite autre protéine que la protéine CD25s est choisie dans le groupe constitué de l'interleukine 6 (IL-6) et l'interleukine 10 (IL-10).
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