WO2013180240A1 - 全身麻酔薬と、水素とを組み合わせてなる、医薬 - Google Patents

全身麻酔薬と、水素とを組み合わせてなる、医薬 Download PDF

Info

Publication number
WO2013180240A1
WO2013180240A1 PCT/JP2013/065094 JP2013065094W WO2013180240A1 WO 2013180240 A1 WO2013180240 A1 WO 2013180240A1 JP 2013065094 W JP2013065094 W JP 2013065094W WO 2013180240 A1 WO2013180240 A1 WO 2013180240A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
anesthetic
hydrogen
general
hydrogen gas
medicine
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/065094
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
富栄 風間
佐藤　泰司
龍二 与那嶺
Original Assignee
丸石製薬株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to EP13796554.7A priority Critical patent/EP2857026A4/en
Priority to CA2874579A priority patent/CA2874579A1/en
Application filed by 丸石製薬株式会社 filed Critical 丸石製薬株式会社
Priority to IN2090MUN2014 priority patent/IN2014MN02090A/en
Priority to US14/397,229 priority patent/US20150079197A1/en
Priority to NZ701553A priority patent/NZ701553A/en
Priority to CN201380028933.5A priority patent/CN104394873A/zh
Priority to JP2014518736A priority patent/JP6168420B2/ja
Priority to BR112014029260A priority patent/BR112014029260A2/pt
Priority to KR20147035945A priority patent/KR20150018832A/ko
Priority to SG11201407489TA priority patent/SG11201407489TA/en
Priority to AU2013268366A priority patent/AU2013268366A1/en
Priority to RU2014152690A priority patent/RU2014152690A/ru
Priority to MX2014014543A priority patent/MX2014014543A/es
Publication of WO2013180240A1 publication Critical patent/WO2013180240A1/ja
Priority to IL235718A priority patent/IL235718A0/en
Priority to HK15103729.5A priority patent/HK1205450A1/xx

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/05—Phenols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/075—Ethers or acetals
    • A61K31/08—Ethers or acetals acyclic, e.g. paraformaldehyde
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A61K31/5513—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine
    • A61K31/5517—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine condensed with five-membered rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. imidazobenzodiazepines, triazolam
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P23/00—Anaesthetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a medicine comprising a combination of a general anesthetic and hydrogen.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3
  • drugs that can alter normal neurodevelopment in newborns eg alcohol, phencyclidine, ketamine, N 2 O, isoflurane, benzodiazepines, barbiturates and anticonvulsants that cause neurodegeneration by apoptosis (non-patented You should be careful when using literature 4)
  • Induction of neuropathy by drugs in neonates can occur sufficiently even with a single drug exposure, so even in the administration of anesthesia, it should be careful (Non-Patent Documents 5 and 6).
  • Non-patent Document 7 Normal neurodevelopment is a series of events including closely regulated proliferation, differentiation, migration and synapse formation.
  • Glutamic acid is considered to have a role in all these processes (Non-Patent Document 8).
  • NMDA receptor subtypes eg, NR2B and NR2D
  • NMDA receptor subtypes eg, NR2B and NR2D
  • studies from the same group reveal that different species use different mediators in migration control and use either GABA (rat study) or glutamate (mouse study) (non-patent literature) 11).
  • synapse formation is a period during which synapses are rapidly built and is characterized by high levels of programmed cell death (PCD) (maximum 1% (Non-patent Document 12)). This includes the formation of extensive cortical thalamus and thalamocortical projections (13). Interspecific embryology is infinitely complex, but each stage of neurodevelopment tends to occur in the same order and is known to be comparable (Non-Patent Document 14). Therefore, it is possible to estimate the peak timing of synapse formation from a 7-day-old rat pup (Non-Patent Document 15) to a human of 0 to 8 months (Non-Patent Document 16). However, according to NMDA receptor subtype analysis, in humans, the period of synapse formation is likely to extend from the beginning of late pregnancy (8-10 months of pregnancy) to several years (non- Patent Document 17).
  • Apoptosis (Non-patent Document 18) first proposed in 1972 is an essential feature of normal nerve development in processes such as cell number reduction, regulation, control, and cell disposal. Apoptosis has been characterized as “aggressive cell death” including induction, determination and execution by cellular proteins used only for that purpose (19).
  • PCD Programmed cell death
  • CNS central nervous system
  • target-derived neurotrophic factors neurotrophic hypothesis
  • a neuron that failed to reach the synapse of the target cell that promotes the survival of the neuron is specially treated by both neurotrophin and electrical stimulation as the nutritional support is stopped by the environment.
  • the cell suicide of a certain form is started (nonpatent literature 21, nonpatent literature 22).
  • Neurons have many ligands and mechanisms involved in maintaining survival because of the complex branching and convergence of their survival pathways.
  • Neuronal cytosol and mitochondria are either anti-apoptotic factors (eg, Bcl-2 and cAMP response binding proteins) and pro-apoptotic factors (eg, Bad, Bax, and caspase families) that determine cell fate. Is also compatible. Bcl-2 and its related peptides are considered to be particularly important in the development of CNS (Non-Patent Document 23), because high levels of expression in neonates and overexpression in Bcl-2 experiments are nutrients It is clear from the fact that the lack of support is overturned (Non-Patent Document 24) and PCD can be completely prevented (Non-Patent Document 25).
  • a variant of Bcl-2 (Bcl-X L ) may have a special role in maintaining neuronal development before reaching the synapse of the neuronal target cell (Non-patent Document 26).
  • Non-patent Document 27 data showing that the use of NMDA receptor antagonists in newborn rats resulted in a specific pattern of neurodegeneration different from glial cells was published.
  • this neurodegeneration was identical to apoptotic cell death and was most prominent in the dorsolateral thalamic nucleus.
  • the dorsolateral thalamic nucleus is one of the brain regions involved in learning and memory (Non-patent Document 28). This phenomenon is subsequently reproduced in other brain regions using other drugs (Non-patent Document 29).
  • Non-patent document 30 the GABAergic anesthetic isoflurane itself causes neurodegeneration in a dose-dependent manner, followed by continuous addition of midazolam (double GABAergic cocktail), followed by N 2 O.
  • Non-patent Document 30 Synergistic neurodegeneration was caused by continuous addition (triple cocktail) (Non-patent Document 30). This process has been shown to occur in rats with exposure to GABAergic drugs in areas other than anesthetics, such as anticonvulsant therapy and maternal drug abuse (Non-Patent Document 32, Non-Patent Document 33).
  • Non-patent Document 34 neurotoxicity induced by anesthetic administration in the developing brain
  • many factors are complexly involved in the mechanism of neurotoxicity induced by anesthetic administration in the developing brain, and most are unknown.
  • Subsequent studies suggest that (1) increased apoptosis, (2) effects on GABA neurons, (3) effects on the critical period of the cerebral cortex, and so on.
  • neuropathy has occurred due to the effect of (Non-patent Document 35).
  • Previous studies on the mechanism of action there has been an interest in apoptosis due to the ease of research techniques.
  • caspase The most important molecule in the intracellular signal transduction pathway that causes apoptosis is a proteolytic enzyme called caspase (Cysteine-ASPartic-acid-proteASE). When caspase-3 is activated in the cell, apoptosis occurs.
  • the main pathways of apoptosis-inducing signals are as follows.
  • Pathway through death receptor tumor necrosis factor receptor (TNFR1) and Fas / CD95 are well known
  • Pathway through mitochondria one of the components of electron transport system in respiration
  • Cytochrome c plays an important role in the execution of apoptosis
  • Pathways caused by endoplasmic reticulum stress apoptotic signals are generated when abnormal proteins are produced in the endoplasmic reticulum
  • Pathways that directly activate effectors stress inducers directly activate effectors without going through an initiator.
  • caspase-8 and caspase-10 are activated.
  • caspase-9 is activated by cytochrome c released from mitochondria.
  • caspase-12 is activated.
  • These initiator caspase groups activate downstream effector caspases (caspase-3, caspase-6, caspase-7).
  • the effector caspase is activated directly without going through the initiator caspase.
  • Apoptosis which is thought to be induced by anesthetics, may have a different mechanism of action from that of general apoptosis. A cure has not yet been established. Therefore, the development of new treatments that reduce the apoptosis of the developing brain with anesthetics and the subsequent cognitive impairment has been awaited.
  • An object of the present invention is to provide a medicament for general anesthesia capable of preventing and / or alleviating anesthetic-induced neuropathy in the brain (preferably during development).
  • the present inventors have prevented and / or prevented anesthesia-induced neuropathy in the brain (preferably during development) by combining a general anesthetic and hydrogen. Or found that it can be reduced.
  • the medicament according to any one of [1] to [7] which is intended for a fetus, a newborn, an infant, an infant, a child, or an elderly person.
  • [11] A method for preparing a medicine comprising a general anesthetic and hydrogen in combination in order to prevent and / or reduce anesthetic-induced neuropathy.
  • [12] The preparation method according to [11] above, wherein the anesthetic-induced neuropathy is associated with neuronal apoptosis.
  • the hydrogen gas concentration is 0.15 to 7% (v / v) in medicine.
  • the general anesthetic is one or more anesthetics selected from the group consisting of nitrous oxide, isoflurane, enflurane, methoxyflurane, sevoflurane, desflurane, diethyl ether, propofol and midazolam. the method of. [30] The method according to [25] above, wherein the anesthetic-induced neuropathy is neuromotor disorder, neurocognitive disorder, psychocognitive disorder or autism. [31] The method described in [25] above, wherein the anesthetic-induced neuropathy is associated with neuronal apoptosis.
  • the medicament of the present invention can prevent and / or reduce anesthetic-induced neuropathy in the brain (preferably during development).
  • the present invention since the present invention is simple, has no side effects, acts efficiently, and is inexpensive, it can provide a drug for general anesthesia that is effective in medical care such as obstetrics and pediatrics.
  • FIG. 2 shows an image of a mouse brain at the time of optical microscope observation
  • C shows an optical microscope image of a mouse brain after exposure to 3% sevoflurane and 1.3% hydrogen for 6 hours when the carrier gas is 30% oxygen.
  • the brown dots indicate the presence of degraded caspase-3 positive cells, that is, apoptosis.
  • Each image is one selected from 8-10 mice per group.
  • the scale bar is 1 mm.
  • FIG. 3 shows the result of counting the number of brown spots indicating degraded caspase-3 detected by immunochemical staining in Test Example 2.
  • A shows the result of a sample (control) in which the carrier gas was 30% oxygen and sevoflurane was not administered, and B was the carrier gas was 30% oxygen and exposed to 3% sevoflurane for 6 hours.
  • the image at the time of optical microscope observation of a mouse brain is shown.
  • the brown dots are TUNEL positive cells and indicate apoptotic cells. Each image is from one mouse selected from 8 mice per group.
  • the scale bar is 1 mm.
  • FIG. 5 shows that hydrogen gas relieves oxidative stress caused by sevoflurane exposure in the developing brain.
  • A shows the result of a sample (control) in which the carrier gas was 30% oxygen and sevoflurane was not administered, and B was the carrier gas was 30% oxygen and after exposure to 3% sevoflurane for 6 hours.
  • C Shows an optical microscopic image of the mouse brain
  • C is a fluorescence microscope observation of the mouse brain after exposure to 3% sevoflurane and 1.3% hydrogen (C) for 6 hours with a carrier gas of 30% oxygen.
  • An image is shown.
  • the red color indicates 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE) positive cells that have undergone oxidative stress.
  • the scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIG. 6 shows the results of Test Example 3.
  • A shows the result of the open field test
  • B shows the result of the Y-shaped maze test
  • C shows the result of the fear conditioning test situation test
  • D shows the result of the fear conditioning test sound test.
  • ## is a P ⁇ 0.01, ### denotes a P ⁇ 0.001.
  • FIG. 7 shows the results of Test Example 3.
  • A shows the result of the social test
  • B shows the result of the olfactory test
  • C shows the result of the novel test.
  • ** means P ⁇ 0.01 and # means P ⁇ 0.05 when compared with the control.
  • ⁇ means P ⁇ 0.001 when compared with the corresponding biological target.
  • the medicament of the present invention is a medicament for humans or non-human animals, which is a combination of a general anesthetic and hydrogen.
  • the medicament of the present invention is a medicament for general anesthesia of a human or non-human animal, which is administered in combination with a general anesthetic and hydrogen.
  • the medicament of the present invention can be used to prevent and / or reduce anesthetic-induced neuropathy.
  • the general anesthetic in the present invention is preferably used in combination with hydrogen.
  • the medicament of the present invention is a combination of a general anesthetic and hydrogen, and each dosage form is administered simultaneously from the same or different administration route, and the interval according to the same or different administration route is staggered. Any form of administration is included.
  • anesthetics Exposure to anesthetics increases apoptosis in several areas, such as glial cells other than neurons (Anesthesiology 2010; 112: 834-841), and that NMDA receptor upregulation causes apoptosis ( Int. J. Devl Neuroscience 27 (2009) 727-731), anesthetics are thought to induce apoptosis by a mechanism of action different from general apoptosis, and as a result, it is feared to induce neuropathy .
  • an anesthetic having an agonistic action of GABA receptor is said to affect GABA neurons and induce neuropathy by disrupting the balance of excitatory and inhibitory neurons (Anesthesiology 2009; 111: 1365). -1371).
  • the intrinsic pathway centered around the mitochondria is controlled by a combination of pro- and anti-apoptotic mediators in the cytosol of neurons.
  • Bcl-X L Bcl- 2 family members
  • Bax is a pro-apoptotic (Yuan and Yanker, 2000, Nature 407 : 802-809).
  • Bax if not suppressed by Bcl-X L to be in the cytosol become part of the active complex, which returns to the mitochondrial membrane can be destroyed mitochondrial membrane (Korsmeyer et al., 2002, Cell Death and Differentiation 7: 1166-1173). Subsequent transport of the mitochondrial contents (specifically, the normal part of cytochrome c-cell energy production) to the cytosol is believed to produce a very potent pro-apoptotic signal.
  • the general anesthetic in the present invention is not particularly limited as long as it is a drug capable of obtaining a general anesthetic effect, and examples thereof include an inhalation anesthetic and a venous anesthetic.
  • the inhalation anesthetic in the present invention is not particularly limited.
  • volatile inhalation anesthetics such as halothane, isoflurane, enflurane, methoxyflurane, sevoflurane, desflurane; ethylene, cyclopropane, diethyl ether, chloroform, nitrous oxide or
  • gas inhalation anesthetics such as xenon, and halogenated ether compounds such as isoflurane, enflurane, sevoflurane, desflurane, nitrous oxide, and the like are preferable.
  • Inhalation anesthetics may be used in combination with intravenous anesthetics administered by injection or intravenous infusion.
  • the intravenous anesthetic in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include propofol, midazolam, ketamine, tiretamine, thiopental, methexital, etomidate, and propofol, midazolam and the like are preferable.
  • anesthetic used in the present invention among the above specific examples, one or more anesthetics selected from the group consisting of nitrous oxide, isoflurane, enflurane, methoxyflurane, sevoflurane, desflurane, diethyl ether, propofol and midazolam Is more preferable.
  • anesthetics such as halothane, isoflurane, enflurane, methoxyflurane, sevoflurane, desflurane, etomidate, thiopental, propofol and midazolam are GABA A receptor agonists.
  • some of the anesthetics eg, N 2 O, ketamine, and isoflurane
  • NMDA receptor antagonism has not been elucidated for all anesthetics.
  • the dose of the general anesthetic differs depending on the age, health condition, interaction with other medicines and the type of operation performed, and is not particularly limited as long as the effect of the present invention can be achieved.
  • the concentration of a general anesthetic such as the inhalation anesthetic and intravenous anesthetic described above in the medicine may be 0.1 to 10% (v / v), or 0.2 to 8% (v / v) v) or 0.2 to 5% (v / v).
  • hydrogen refers to hydrogen molecules (H 2), if the hydrogen molecule (H 2), especially in the form is not limited, may be used hydrogen gas, and the hydrogen gas is dissolved in water Hydrogen water may be used.
  • the application target of the general anesthetic and hydrogen is not particularly limited, and examples thereof include animals such as humans, cows, horses, sheep, goats, dogs, monkeys, cats, bears, rats, and rabbits.
  • the age of the application target of the medicine of the present invention is not particularly limited, but is suitably applied to animals at a time when it is susceptible to anesthesia.
  • the subject is a human, preferably it is a fetus, newborn, infant, infant, child or elderly subject, more preferably the fetus, considering that the brain is in development and susceptible to anesthesia, Newborns, infants, infants, children and the like, more preferably fetuses, newborns, infants, and infants under 3 years old.
  • the fetus means a prenatal child after the 8th week of pregnancy.
  • the newborn means an infant less than 28 days after birth.
  • the infant means a child under 1 year old.
  • the said infant means 1 year old or more and less than 7 years old.
  • the above-mentioned child means 7 years old or older and less than 15 years old.
  • the elderly person means a person 65 years or older.
  • a general anesthetic and hydrogen may be used in combination, or a general anesthetic and hydrogen may be mixed in advance.
  • the form of the general anesthetic and the form of hydrogen are not particularly limited, but inhalation anesthetic or intravenous anesthetic from the standpoint of remarkably excellent anesthetic-induced neuropathy prevention and / or alleviation effects And a combination with hydrogen gas.
  • the timing of using the general anesthetic and hydrogen is not particularly limited, and hydrogen is used for any of the general anesthetic pre-administration, simultaneous administration, or post-administration. Any of these may be combined, but simultaneous administration of a general anesthetic and hydrogen is preferred because there is no burden of pretreatment on the subject.
  • pre-administration means that hydrogen is administered to a subject who has not been administered a general anesthetic for a certain period of time.
  • “simultaneous administration” means that hydrogen is administered to a subject for a certain period of time from the start of administration of a general anesthetic to the stop of administration or for a certain period of time between the start of administration of a general anesthetic and the stop of administration.
  • “Post-administration” means administration of hydrogen to a subject for a certain period of time after stopping administration of a general anesthetic.
  • the administration time of the general anesthetic and hydrogen is not particularly limited. For example, when sevoflurane is used in combination with oxygen and nitrous oxide at a concentration of 4.0% or less, it takes about 10 minutes to 8 hours. It may be.
  • the form of the general anesthetic and the form of hydrogen are not particularly limited. However, in a preferred embodiment of the present invention, remarkably superior prevention and / or alleviation of anesthetic-induced neuropathy is achieved. In view of the effect, it is preferable that the general anesthetic is an inhalation anesthetic or a intravenous anesthetic and hydrogen is hydrogen gas.
  • the mixing ratio is not particularly limited.
  • the hydrogen gas concentration in the medicament is usually 0. 0.01 to 7% (v / v), and the upper limit is preferably lower in consideration of safety.
  • it may be 0.15 to 4% (v / v), or 0.18 to 3 % (V / v), 0.2 to 1.5% (v / v), or more than 0.25% (v / v) and less than 1% (v / v) It may be 0.28 to 0.9% (v / v).
  • the dose of hydrogen used in the present invention varies depending on the patient according to age, health condition, interaction with other medicines, and the type of surgery performed, and is particularly limited as long as the effects of the present invention can be achieved.
  • the hydrogen concentration in the medicine is usually 0.01 to 7% (v / v), and the upper limit is preferably lower in consideration of safety. For example, 0.15 to 4% (v / v) ), 0.18 to 3% (v / v), 0.2 to 1.5% (v / v), 0.25% (v / v) v) or more and less than 1% (v / v), or 0.28 to 0.9% (v / v).
  • the hydrogen gas concentration in the drug is usually 0.01 to 7%.
  • V / v the hydrogen gas concentration in the drug is usually 0.01 to 7%.
  • the upper limit is preferably lower in consideration of safety. For example, it may be 0.15 to 4% (v / v) or 0.18 to 3% (v / v) ), 0.2 to 1.5% (v / v), 0.25% (v / v) or more and less than 1% (v / v), It may be 0.28 to 0.9% (v / v).
  • the hydrogen gas concentration of the gas in the medicine is usually 0. 01 to 7% (v / v), and the upper limit is preferably lower in consideration of safety. For example, it may be 0.15 to 4% (v / v), or 0.18 to 3%. (V / v), 0.2 to 1.5% (v / v), or more than 0.25% (v / v) and less than 1% (v / v) It may be 0.28 to 0.9% (v / v).
  • the concentration of hydrogen gas in the medicament is not particularly limited, but is usually 0.01 to 7% (v / v).
  • the upper limit value is low.
  • it may be 0.15 to 4% (v / v), or may be 0.18 to 3% (v / v) 0.2-1.5% (v / v), 0.25% (v / v) or more and less than 1% (v / v), 0.28-0. It may be 9% (v / v).
  • Oxygen, nitrogen, nitrous oxide and the like may be added to the medicament of the present invention as long as the effects of the present invention are not hindered.
  • the oxygen concentration contained in the medicament of the present invention is usually about 20 to 90% (v / v), preferably about 20 to 70% (v / v), and about 20 to 50% (v / v). preferable.
  • the concentration of nitrogen and nitrous oxide is not limited as long as the effects of the present invention are not hindered.
  • the remaining amount other than the above components may be all nitrogen gas, or may contain trace components contained in the air other than nitrogen gas.
  • a preferred embodiment when an inhalation anesthetic and hydrogen gas are used is not particularly limited.
  • iii) 0.1-5% (v / v) inhalation anesthetic examples thereof include pharmaceuticals containing 0.15 to 1.5 (v / v) hydrogen gas and 20 to 50% (v / v) oxygen.
  • a preferred embodiment when a liquid intravenous anesthetic and hydrogen gas are used is not particularly limited.
  • the concentration of hydrogen water in the drug is not particularly limited.
  • the concentration of hydrogen water in the medicament is not particularly limited.
  • the medicament of the present invention can prevent and / or reduce anesthetic-induced neuropathy.
  • Preventing and / or alleviating neuropathy refers to a subject to which the medicament of the present invention is applied (for example, a patient in the case of a human) and a subject to which a general anesthetic is applied in the absence of hydrogen. When compared, it means reducing the severity of one or more neurological disorders.
  • preventing and / or reducing nerve cell damage means that when a subject to which the medicament of the present invention is applied is compared with a subject to which a general anesthetic is applied in the absence of hydrogen, 1 It means reducing the severity of damage to more than one species of nerve cells.
  • the anesthetic-induced neuropathy in the present invention preferably includes an anesthetic-induced neuropathy of the brain, and the neuropathy of the present invention is not particularly limited, but includes neuromotor disorders, neurocognitive disorders, mental disorders Examples include cognitive impairment, intellectual disability, and autism.
  • the neuromotor disorders include strength, balance and mobility disorders.
  • the neurocognitive impairment includes learning impairment and memory impairment.
  • the above neuropathy is thought to be caused by factors such as neurodegeneration, neuronal apoptosis, neuronal necrosis, and may be caused by multiple factors as well as one specific factor. It has been. Among these, neuronal cell apoptosis is presumed to have some influence on any of the above-mentioned disorders.
  • the neurodegeneration means chromatin aggregation accompanied by cell contraction, marginal orientation and formation of apoptotic bodies encapsulated in the membrane.
  • Other suitable neuromotor and neurocognitive tests are Combs D, D'Alecy L: Motor performance in rats exposed to severe forebrain ischemia: Effect of fasting and 1,3-butanediol.Stroke 1987; 18: 503-511 and Gionet T, Thomas J, Warner D, Goodlett C, Wasserman E, West J: Forebrain ischemia induces selective behavioral impairments associated with hippocampal injury in rats. Stroke 1991; 22: 1040-1047.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for preparing a medicament for the prevention and / or alleviation of anesthetic-induced neuropathy, which uses a general anesthetic and hydrogen in combination.
  • General anesthetics, hydrogen, pharmaceutical application targets, anesthetic-induced neuropathies, and combinations thereof are as described above.
  • This preparation method may have the process of using a general anesthetic and hydrogen together, and may have the process of mixing a general anesthetic and hydrogen beforehand.
  • a preferred embodiment when an inhalation anesthetic and hydrogen gas are used is not particularly limited.
  • Process of using an inhalation anesthetic and hydrogen gas in combination so as to contain 15 to 1.5% (v / v) hydrogen gas and 20 to 90% (v / v) oxygen or inhalation anesthetic and hydrogen (Ii) 0.1 to 8% (v / v) inhalation anesthetic, 0.15 to 1.5% (v / v) hydrogen gas and
  • a method for preparing a medicament comprising a step of using an inhalation anesthetic and hydrogen gas in combination so as to contain 20 to 70% (v / v) oxygen, or a step of premixing an inhalation anesthetic and hydrogen gas, or ( iii) 0.1-5% (v / v) inhalation anesthetic, 0.15-1.5% (v / v) hydrogen
  • a preferred embodiment when a liquid intravenous anesthetic and hydrogen gas are used is not particularly limited.
  • (i) 0.1 to 10% (w / w) intravenous anesthesia A step of combining intravenous anesthetic and hydrogen gas so as to contain a medicine, 0.15-1.5% (v / v) hydrogen gas and 20-90% (v / v) oxygen, or intravenous anesthesia (Ii) 0.1-8% (w / w) intravenous anesthetic, 0.15-1.5% (v / v)
  • a method for preparing a pharmaceutical comprising a step of using a combination of intravenous anesthetic and hydrogen gas or a step of previously mixing intravenous anesthetic and hydrogen gas so as to contain hydrogen gas and 20 to 70% (v / v) oxygen Or (iii) 0.1-5% (w / w) intravenous anesthetic, 0.15-1.5% (v / v)
  • a method for preparing a medicament comprising
  • Another aspect of the present invention includes the use of general anesthetics for the production of general anesthetics used in combination with hydrogen.
  • known excipients and additives may be added for the purpose of stabilizing the medicinal component, hydrating the patient, and maintaining the balance of the electrolyte.
  • conventionally known excipients and additives can be used as long as the effects of the present invention are not hindered.
  • soybean oil, medium-chain fatty acid triglyceride, purified egg yolk lecithin, concentrated glycerin, sodium oleate and the like may be added to the anesthetic of propofol.
  • the application target of the general anesthetic, hydrogen, and medicine is as described above.
  • a preferred embodiment in the case of using an inhalation anesthetic and hydrogen gas is not particularly limited.
  • (i) 0.1 to 10% (v / v) inhalation anesthetic For the production of a general anesthetic containing 15 to 1.5% (v / v) hydrogen gas and 20 to 90% (v / v) oxygen, and optionally further containing additives
  • Use of general anesthetics (ii) 0.1-8% (v / v) inhalation anesthetic, 0.15-1.5% (v / v) hydrogen gas and 20-70% (v / v)
  • the use of general anesthetics for the production of general anesthetics containing oxygen and optionally containing additives, or (iii) 0.1-5% (v / v) inhalation Contains an anesthetic, 0.15-1.5% (v / v) hydrogen gas and 20-50% (v / v) oxygen, further as needed Using such a general ane
  • a preferred embodiment when a liquid intravenous anesthetic and hydrogen gas are used is not particularly limited.
  • (iii) 0.1-5% (w / w) Contains intravenous anesthetic, 0.15-1.5% (v / v) hydrogen gas and 20-50% (v / v) oxygen, optionally with additives There use, etc. of a general anesthetic for the good general ane
  • a preferred embodiment in the case of using an inhalation anesthetic and hydrogen gas is not particularly limited.
  • (i) 0.1 to 10% (v / v) inhalation anesthetic The use of general anesthetics and hydrogen for the manufacture of a medicament containing 15-1.5% (v / v) hydrogen gas and 20-90% (v / v) oxygen, (ii) 0.1- Whole body for the manufacture of a medicament containing 8% (v / v) inhalation anesthetic, 0.15-1.5% (v / v) hydrogen gas and 20-70% (v / v) oxygen
  • Use of anesthetics and hydrogen or
  • a preferred embodiment when a liquid intravenous anesthetic and hydrogen gas are used is not particularly limited.
  • Use of a general anesthetic and hydrogen for the manufacture of a medicament containing 0.15-1.5% (v / v) hydrogen gas and 20-90% (v / v) oxygen (ii) 0
  • the use of a general anesthetic and hydrogen for the manufacture of a medicament containing% (v / v) oxygen is not particularly limited.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of general anesthetics and hydrogen in the manufacture of a medicament for preventing and / or reducing anesthetic-induced neuropathy.
  • General anesthetics, hydrogen, pharmaceutical application targets, anesthetic-induced neuropathies and embodiments, and combinations thereof are as described above.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of a general anesthetic and hydrogen for the manufacture of a medicament for preventing and / or reducing anesthetic-induced neuropathy associated with neuronal apoptosis.
  • General anesthetics, hydrogen, pharmaceutical application targets, anesthetic-induced neuropathies and embodiments, and combinations thereof are as described above.
  • a preferred embodiment in the case of using an inhalation anesthetic and hydrogen gas is not particularly limited.
  • Use of general anesthetics and hydrogen for the manufacture of a medicament (ii) 0.1-8% (v / v) inhalation anesthetic, 0.15-1.5% (v / v) hydrogen
  • a preferred embodiment when a liquid intravenous anesthetic and hydrogen gas are used is not particularly limited.
  • Use of general anesthetics and hydrogen for the manufacture of medicaments to alleviate (ii) 0.1-8% (w / w) intravenous anesthetic, 0.15-1.5% (v / v)
  • General anesthesia for the manufacture of a medicament for the prevention and / or alleviation of anesthetic-induced neuropathy associated with neuronal apoptosis comprising 2) hydrogen gas and 20-70% (v / v) oxygen Drug and hydrogen use, or (iii) 0.1-5% (w / w) intravenous anesthetics;
  • Yet another aspect of the present invention relates to the use of general anesthetics and hydrogen in the manufacture of a medicament for preventing and / or reducing anesthetic-induced neuronal damage.
  • General anesthetics, hydrogen, pharmaceutical application targets, anesthetic-induced neuropathies and embodiments, and combinations thereof are as described above.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for preventing and / or reducing anesthetic-induced neuropathy, which comprises the step of administering to a subject a combination of a general anesthetic and hydrogen.
  • General anesthetics, hydrogen and anesthetic-induced neuropathy and combinations thereof are as described above.
  • This method may have the process of using a general anesthetic and hydrogen together, and may have the process of mixing a general anesthetic and hydrogen beforehand.
  • a preferred embodiment when an inhalation anesthetic and hydrogen gas are used is not particularly limited.
  • (i) 0.1 to 10% (v / v) inhalation anesthetic, Preventing and / or reducing anesthetic-induced neuropathy comprising the step of containing 15-1.5% (v / v) hydrogen gas and 20-90% (v / v) oxygen and administering to a subject
  • (iii) 0.1-5% (v / v) inhalation anesthetic, 0.15 comprising the steps of: Comprising -1.5% (v / v) hydrogen gas and 20-50% (v / v) oxygen and administering to the subject To process and the like to prevent and / or reduce the anesthetic induced neurological deficits.
  • Post-administration means administration of hydrogen to a subject for a certain period of time after stopping administration of a general anesthetic.
  • the administration time of the general anesthetic and hydrogen is not particularly limited.
  • the administration target of the general anesthetic and hydrogen is not particularly limited, and examples thereof include animals such as humans, cows, horses, sheep, goats, dogs, monkeys, cats, bears, rats, and rabbits.
  • the age and the like of the administration subject of the general anesthetic of the present invention and hydrogen are not particularly limited, but it is suitably administered to animals at a time that is susceptible to anesthesia.
  • the subject is a human, preferably it is a fetus, newborn, infant, infant, child or elderly subject, more preferably the fetus, considering that the brain is in development and susceptible to anesthesia, Newborns, infants, infants, children and the like, more preferably fetuses, newborns, infants, and infants under 3 years old.
  • fetus, newborn, infant, infant, child or elderly person is as described above.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for inhibiting anesthetic-induced apoptosis, which comprises a step of administering to a subject a medicine comprising a combination of a general anesthetic and hydrogen.
  • the application target of general anesthetics, hydrogen and pharmaceuticals, and combinations thereof are as described above.
  • This method may have the process of using a general anesthetic and hydrogen together, and may have the process of mixing a general anesthetic and hydrogen beforehand.
  • a preferred embodiment when an inhalation anesthetic and hydrogen gas are used is not particularly limited.
  • (ii) 0.1-8% (v / v) inhalation anesthesia comprising the steps of: premixing and administering the medicament obtained in said step to a subject, (ii) 0.1-8% (v / v) inhalation anesthesia Inhalation anesthesia and hydrogen anesthesia so that the medicine contains 0.15-1.5% (v / v) hydrogen gas and 20-70% (v / v) oxygen
  • the step of mixing the medicine and hydrogen gas in advance and the medicine obtained in the step are injected into the subject.
  • a preferred embodiment when a liquid intravenous anesthetic and hydrogen gas are used is not particularly limited.
  • a method of inhibiting anesthetic-induced apoptosis comprising a step of premixing and hydrogen gas and a step of administering the medicament obtained in the step to a subject, (ii) 0.1-8% (w / w) Of intravenous anesthetic and hydrogen gas so as to contain 0.1 to 1.5% (v / v) hydrogen gas and 20 to 70% (v / v) oxygen
  • the step of premixing the intravenous anesthetic and hydrogen gas and the medicament obtained in the above step A method of inhibiting anesthetic-induced apop
  • anesthetic-induced neuropathy was evaluated from apoptosis and behavioral tests.
  • Apoptosis was evaluated by (i) quantification of degraded PARP, (ii) active caspase-3 staining, or (iii) TUNEL method.
  • caspase-3 immunohistochemical method was used for the active caspase-3 staining.
  • caspase-9 activates caspase-3 (cysteine protease), so caspase-3 is a marker for cells downstream of the apoptotic point.
  • the immunohistochemical method which is performed while silver staining is widely paralleled, serves as a suitable marker for neuronal apoptosis and is excellent for both quantification and characterization of physiological cell death (Olney et al., 2002b, “Neurobiology” of “Disease” 9: 205-219). Since caspase-3 is a cytoplasmic enzyme, the whole cells stained with activated caspase-3 are stained and relatively easy to quantify.
  • Example 2 Other than mixing air, oxygen (apart from air), hydrogen and sevoflurane, and finally preparing an anesthetic mixed gas so that oxygen becomes 30%, hydrogen becomes 0.6%, and sevoflurane (3%) was carried out in the same manner as in Example 1.
  • Example 3 Other than mixing air, oxygen (apart from air), hydrogen and sevoflurane, and finally preparing an anesthetic gas mixture to make oxygen 30%, hydrogen 0.3% and sevoflurane (3%) was carried out in the same manner as in Example 1.
  • Example 5 Propofol (100 mg / kg ip) was intraperitoneally administered by mixing air, oxygen (apart from air) and hydrogen, and simultaneously inhaling a mixed gas of 30% oxygen and 1.3% hydrogen with an anesthetic. At the same time, the same procedure as in Example 1 was conducted except that inhalation administration was performed in combination.
  • Example 6 Other than mixing air, oxygen (apart from air), hydrogen and sevoflurane, and finally preparing an anesthetic gas mixture to make oxygen 30%, hydrogen 1.3% and sevoflurane (2%) was carried out in the same manner as in Example 1.
  • Example 1 Performed in the same manner as in Example 1 except that air, oxygen (apart from air) and sevoflurane were mixed and an anesthetic mixed gas was prepared so that the final oxygen was 30% and sevoflurane (3%). It was.
  • the forebrain extract was analyzed by Western blot using an antibody to degraded PARP (biomarker of apoptotic cell death). The analysis result is shown in FIG. 1A. The results of quantification of the resolved PARP band are shown in FIG. 1B. From FIGS. 1A and B, the immunoreactivity of degraded PARP in mouse brain exposed only to a gas containing 30% oxygen or a gas containing 30% oxygen and 1.3% hydrogen was below the lower detection limit. In mice exposed to a gas containing 3% sevoflurane for 6 hours (Comparative Example 1), a production reaction of degraded PARP was induced.
  • mice exposed to gas containing 30% oxygen 1.3% hydrogen and 3% sevoflurane (Example 1)
  • a marked decrease in immune activity against PARP was observed (ie, hydrogen gas suppressed PARP degradation), and 1.3% hydrogen gas could inhibit neuronal apoptosis caused by sevoflurane exposure in newborn mice. confirmed.
  • Example 4 and Comparative Example 2 were evaluated in the same manner as in [Test Example 1-A].
  • the quantitative value of decomposed PARP in Comparative Example 2 was taken as 100%, the relative quantitative value of decomposed PARP in Example 4 decreased by 47.7%, and the quantitative value of decomposed PARP decreased significantly. This indicates that the present invention inhibits neuronal apoptosis caused by desflurane exposure by more than 45%.
  • Fragments were stripped of paraffin in xylene according to established methods and hydrated using a graded ethanol series.
  • Antigen activation treatment was performed by using an antigen activation solution (Antigen Unmasking Solution; Vector Laboratories, Burlingame, Calif.) And heating in an autoclave for 5 minutes (121 ° C.). Thereafter, the fragments were treated with blocking reagent (Protein Block, Serum-Free; Dako, Glostrup, Denmark) for 30 minutes in order to diminish background staining. Subsequently, the fragments were incubated with the primary antibody overnight at 4 ° C. in a humid chamber.
  • FIG. 2 Histological analysis was performed using an antibody against active caspase-3 (another biomarker of apoptotic cell death) (FIG. 2). To examine the activity of caspase-3, the fragments were immunochemically stained. Analysis by Western blot showed that apoptosis of mice exposed to gas containing 30% oxygen and 1.3% hydrogen was at the same level as mice exposed to gas containing 30% oxygen, as described above.
  • mice subjected to behavioral studies were the same age and littermate males exposed to anesthesia under the same conditions as Example 1 and Comparative Example 1. Three week old mice were separated from their mothers and housed in cages with 3 or 4 mice. Behavioral tests on them at a given age (an open field test as a control for long-term memory impairment assessment to assess the effects of anesthetics, a spontaneous alternation behavior test in a Y-shaped maze for the assessment of short-term memory impairment, Fear conditioning tests and social tests were conducted to evaluate long-term memory impairment, and in addition to social interaction tests, novel tests and olfactory tests were conducted as controls. It was.
  • mice The movement of each mouse was observed and analyzed using a computer-operated video tracking system (SMART; Barcelona, Spain). In the test, a device having an arm was used, and the number of all four mouse feet in the arm was counted. The device was cleaned after each trial. All equipment used in this study was from O'Hara & Co., LTD (Tokyo, Japan). The same population of mice was subjected to all tests.
  • SMART computer-operated video tracking system
  • Open field test Emotional response to a new environment was measured by an open field test using the method described in Satoh Y. et al., “J Neurosci, 2011; 31: 11953-11967. The behavior was measured by the total distance traveled (meters) for 10 minutes. The test was performed on 12-week-old mice. The results are shown in FIG. 6A.
  • Y-shaped maze test was performed by the method described in Satoh.Y.et al., J Neurosci, 2011; 31: 11953-11967 .
  • the symmetrical acrylic Y-shaped maze consisted of three arms (25 ⁇ 5 cm) separated at 120 ° C. and was surrounded by a transparent wall with a height of 15 cm. Each mouse was placed in the center of the Y-shaped maze and allowed to search freely for 8 minutes, and the continuous or total number of times of entering the arm was recorded.
  • the rate of alternation is the number of times when three consecutive intrusions are intrusions into all three arms, the maximum possible number of alternation reactions (the total number of arm ingresses minus 2) ) And then multiplied by 100.
  • the test was performed on 12-week-old mice. The result is shown in FIG. 6B.
  • Fear conditioning test A fear conditioning test was performed by the method described in Satomoto M. et al., Anesthesiology 2009; 110: 628-637. The method is briefly described below. The mouse was placed in a special cage and allowed 80dB white noise for 20 seconds. At 20 seconds, 1 mA foot shock was applied for 1 second, and this stimulation was repeated 3 times in a 1 minute cycle. Mice that received a foot shock 24 hours after stimulation were returned to their cages, and the time for the mice to freeze (no movement of any part of the body for the duration of 1 second) was measured for 5 minutes (fear conditioning test status test). .
  • mice After 48 hours, the mouse was placed in a cage of a different shape in a completely different place, only white noise was heard, and the time for the mouse to freeze was measured for 3 minutes (fear conditioned test sound test). Freezing responses were recorded with a video tracking system and used as an index of fear memory. The test was performed on 13-week-old mice. The mice subjected to this test were not used for any subsequent tests (the same group of mice used for the open field test and the spontaneous alternation behavior test in the Y-shaped maze were used for the test). Twenty-four hours after conditioning, mice were placed in the conditioned chamber, and freezing was measured (fear response depending on the situation). The result is shown in FIG. 6C. Forty-eight hours after conditioning, the mouse was placed in a cage of a different shape in a completely different place, and only white noise was heard. The result of measuring the freezing is shown in FIG. 6D.
  • Olfactory test The olfactory test was carried out with some modifications to the method described in Satoh Y. et al., JJ Neurosci, 2011; 31: 11953-11967. The method is briefly described below. Mice were habituated to the scent of new food (blueberry cheese) on the first day. After 48 hours of food restriction, the time taken to find the buried food was measured: a piece of blueberry cheese was buried 2 cm below the litter in a clean cage. The test was carried out on 12-week-old mice (the same group of mice used for the social test were subjected to the test). The result is shown in FIG. 7B.
  • New product test A new product test was performed by the method described in Satoh Y. et al., JJ Neurosci, 2011; 31: 11953-11967. Mice were housed individually and the total time spent in an inanimate novel (small red tube) over a 10 minute period was measured. The test was performed on 12 week old mice (the same group of mice used for social and olfactory tests were subjected to the test). The result is shown in FIG. 7C.
  • Working memory is the ability to temporarily hold information to perform complex cognitive tasks (Saxe MD et al., Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103: 17501-17506, Jones MW, Curr Mol Med 2002; 2: 639-647).
  • a Y-maze test performed to assess spatial working memory FOG. 6B
  • mice exposed to sevoflurane + hydrogen have improved behavior compared to mice that received sevoflurane alone (Comparative Example 1) (comparison between sevoflurane and sevoflurane + hydrogen is -Cruise post-hoc test, P ⁇ 0.01), almost the same performance as the control (Comparison between control and sevoflurane + hydrogen is Newman-cruise post-hoc test, P ⁇ 0.05).
  • mice exposed to sevoflurane + hydrogen showed superior behavior compared to mice exposed to sevoflurane alone (Comparative Example 1) (in the comparison of sevoflurane and sevoflurane + hydrogen, Newman- Cruise post-hoc test, P ⁇ 0.001), almost the same performance as the control (Newman-Cruise post-hoc test, P ⁇ 0.05 in comparison of control and sevoflurane + hydrogen).
  • mice are sociable species and exhibit social interaction behavior (Kamsler A et al., Mol Neurobiol 2004; 29: 167-178). We have previously reported that mice exposed to sevoflurane as a newborn show social behavioral deficits when they become adults (Satomoto M.et al., Anesthesiology 2009; 110: 628-637) . In order to investigate whether the social behavioral deficits caused by sevoflurane exposure in newborns can be suppressed by hydrogen gas, we conducted a sociability test in mice (FIG. 7).
  • mice exposed to sevoflurane as a newborn have reduced time to interact with biological targets.
  • Mice co-administered with hydrogen behaved almost identically to controls, indicating that social behavioral deficits caused by sevoflurane can be prevented by co-administering hydrogen with sevoflurane (FIG. 7A). ).
  • the present invention it is possible to provide a medicine that can prevent and / or reduce anesthesia-induced neuropathy of the brain (for example, developmental stage) by using a general anesthetic and hydrogen in combination. It was. Furthermore, since the present invention is simple, has no side effects, works efficiently, and is inexpensive, for example, it can provide a pharmaceutical effective in obstetrics and pediatric medicine.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

　本発明は、脳（好ましくは、発達期）の麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減することができる全身麻酔用医薬を提供することを目的とし、全身麻酔薬と水素とを組み合わせてなる、脳（好ましくは、発達期）の麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減することができる医薬に関する。

Description

全身麻酔薬と、水素とを組み合わせてなる、医薬
　本発明は、全身麻酔薬と水素とを組み合わせてなる、医薬に関する。
　新生児における神経障害が、長期間に渡って持続する効果を引き起こすことが危惧されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。そのため、新生児において、正常な神経発達を変化させる可能性がある薬物（例えば、アポトーシスによる神経変性を引き起こすアルコール、フェンシクリジン、ケタミン、Ｎ２Ｏ、イソフルラン、ベンゾジアゼピン、バルビツレート及び抗痙攣薬（非特許文献４））を用いる場合、慎重になるべきである。新生児における薬物による神経障害の誘発は、単回の薬物曝露でも十分に起こり得ることから、麻酔の投与においても、慎重になるべきである（非特許文献５、非特許文献６）。
　正常な神経発達は、綿密に調節された、増殖、分化、遊走及びシナプス形成をはじめとする、一連の事象である（非特許文献７）。グルタミン酸は、これらの全プロセスにおいて役割を有すると考えられており（非特許文献８）、例えば、遊走の標的領域において、高濃度のグルタミン酸は、検出に用いられるＮＭＤＡ受容体に加え（非特許文献９）、神経細胞の化学誘引物質としての役割を示唆する（非特許文献１０）。種々の解剖学的領域における特定のＮＭＤＡ受容体サブタイプ（例えば、ＮＲ２Ｂ及びＮＲ２Ｄ）の発見は、遊走制御の正確な性質の解明に役立ち得る（非特許文献１０）。同一グループによる研究から、種が異なると、遊走制御において異なるメディエーターが使用され、ＧＡＢＡ（ラットに関する研究）又はグルタミン酸（マウスに関する研究）のいずれかが用いられることが明らかとなっている（非特許文献１１）。
　シナプス形成（脳の急成長期）とは、シナプスが急速に構築される期間であり、高レベルのプログラム細胞死（ＰＣＤ）（最大１％(非特許文献１２)）を特徴とする。これには、広範な皮質視床及び視床皮質投射の形成が含まれる(非特許文献１３)。種間発生学は限りなく複雑であるが、神経発達の各段階は、同一順序で起こる傾向にあるため、比較できることがわかっている(非特許文献１４)。そのため、７日齢のラットの仔(非特許文献１５)から、０～８カ月のヒト(非特許文献１６)までのシナプス形成のピークの時期を推定することが可能である。しかしながら、ＮＭＤＡ受容体サブタイプの分析によれば、ヒトでは、シナプス形成の期間が、妊娠の後期（妊娠８～１０カ月）の始めから数歳までの長期に及んでいる可能性が高い（非特許文献１７）。
　１９７２年に初めて提唱されたアポトーシス(非特許文献１８)は、細胞数の削減、調整、制御及び細胞の廃棄等のプロセスにおける正常な神経発達の本質的特徴である。アポトーシスは、その目的のみに用いられる細胞タンパク質による誘導、決定及び実行を含む「積極的な細胞死」と特徴付けられている(非特許文献１９)。
　未成熟な中枢神経系（ＣＮＳ）におけるプログラム細胞死（ＰＣＤ）は、標的由来の神経栄養因子によってコントロールされていると思われる（神経栄養仮説）。それによれば、神経細胞の生存を促進する標的細胞のシナプスに到達できなかった神経細胞は(非特許文献２０)、環境による栄養支援の中止に伴って、ニューロトロフィン及び電気刺激の両方による特殊な形の細胞自殺を開始する(非特許文献２１、非特許文献２２)。神経細胞は、その生存経路の複雑な分岐性と収束性のために、多数のリガンド及び機構が生存の維持に関与している。神経細胞のサイトゾル及びミトコンドリアは、細胞の運命を決定する、抗アポトーシス性因子（例えば、Ｂｃｌ－２及びｃＡＭＰ応答結合タンパク質）及びアポトーシス促進性因子（例えば、Ｂａｄ、Ｂａｘ及びカスパーゼファミリー）のいずれにも対応している。Ｂｃｌ－２及びその関連ペプチドはＣＮＳの発達において特に重要であると考えられている(非特許文献２３)が、これは、新生児における高レベルの発現と、Ｂｃｌ－２の実験における過剰発現が栄養支援の欠乏を覆し(非特許文献２４)、さらにＰＣＤをも完全に防ぎ得る(非特許文献２５)という事実から明らかである。Ｂｃｌ－２の変異体（Ｂｃｌ－ＸＬ）は、神経細胞の標的細胞のシナプス到達前の神経細胞の発達の維持において特別な役割を有している可能性がある(非特許文献２６)。
　１９９９年、新生児ラットにおけるＮＭＤＡ受容体アンタゴニストの使用によって、特定のパターンの、グリア細胞とは異なる神経変性が生じることを示すデータが公開された(非特許文献２７)。電子顕微鏡では、この神経変性はアポトーシス性細胞死と同一であり、背外側視床核において最も顕著であった。背外側視床核は、学習及び記憶に関与している脳の領域のひとつである(非特許文献２８)。この現象は、その後、他の薬物を用いて他の脳領域において再現されている(非特許文献２９)。
　その後の研究によって、新生児ラットは、シナプス形成期間中、麻酔薬の有害な副作用に対して脆弱であるということが示された。前記ラットは、麻酔薬に曝露された後に、背外側及び前腹側視床核並びに頭頂葉皮質等の領域において、変質している神経細胞数が基準値の最大６８倍に増加することを示した(非特許文献３０)。後日、この増加の結果として、行動試験における機能的神経障害がみられた。具体的には、ＧＡＢＡ作動性麻酔薬イソフルラン(非特許文献３１)は、それ自体で、用量依存的に神経変性を生じさせ、ミダゾラムの連続添加（二重ＧＡＢＡ作動性カクテル）、次いでＮ２Ｏの連続添加（三重カクテル）で相乗作用的な神経変性が生じた(非特許文献３０)。このプロセスは、ラットでは、麻酔薬以外の領域のＧＡＢＡ作動性薬剤に対する曝露、例えば、抗痙攣薬治療及び母体の薬物乱用で起こることがわかっている(非特許文献３２、非特許文献３３)。
　上記のように、種間の複雑さはあるが、神経発達の各段階は、同一順序で起こるため、新生児ラットに対する麻酔薬投与の影響から、ヒトへの影響をある程度推定でき、ヒトの臨床研究でも発達期の脳における麻酔薬投与によって誘発される神経毒性について、多くの知見が得られている（非特許文献３４）。しかしながら、発達期の脳における麻酔薬投与によって誘発される神経毒性の作用機序については、多くの因子が複雑に関係しており、ほとんどが未知であった。その後の研究によって、前記作用機序として、（１）アポトーシスの増加、（２）ＧＡＢＡニューロンへの影響、（３）大脳皮質の臨界期（critical period）への影響等が考えられ、ＧＡＢＡニューロンへの影響によって神経障害が起きたとの報告もある（非特許文献３５）。前記作用機序に関するこれまでの研究では、研究手法の容易さから、アポトーシスに関心が集まっていた。
　アポトーシスを引き起こす細胞内シグナル伝達経路で最も重要な分子は、カスパーゼ（caspase：Cysteine-ASPartic-acid-proteASE）と呼ばれるタンパク質分解酵素である。細胞内でカスパーゼ－３が活性化すると、アポトーシスが起こる。アポトーシス誘導シグナルの伝達経路には、主として、次のものがある。（１）デスレセプタを介する経路（腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ１）やＦａｓ/ＣＤ９５がよく知られている。）、（２）ミトコンドリアを介する経路（呼吸における電子伝達系の構成因子の一つであるシトクロムｃが、アポトーシスの実行においても重要な役割を担っている）、（３）小胞体ストレスによる経路（小胞体に異常なタンパク質が生成した場合等にアポトーシスのシグナルが発生する。）、（４）エフェクターを直接活性化する経路（イニシエーターを経ずに、ストレス誘導因子が直接エフェクターを活性化する。）。
　デスレセプタを介する経路では、カスパーゼ－８、カスパーゼ－１０が活性化される。ミトコンドリアを介する経路では、ミトコンドリアから遊離したシトクロムｃによりカスパーゼ－９が活性化される。小胞体ストレスによる経路では、カスパーゼ－１２が活性化される。これらのイニシエーターカスパーゼ群が、下流のエフェクターカスパーゼ（カスパーゼ－３、カスパーゼ－６、カスパーゼ－７）を活性化する。エフェクターを直接活性化する経路では、イニシエーターカスパーゼを経ずに、直接、エフェクターカスパーゼ（カスパーゼ－３、カスパーゼ－６、カスパーゼ－７）を活性化する。これらのカスパーゼは、ポリ－ＡＤＰリボースポリメラーゼ（poly ADP-ribose polymerase, PARP）を基質として、その分解によってアポトーシスが実行される（非特許文献３６、非特許文献３７）。
　麻酔薬によって誘発されると考えられているアポトーシスについて、一般的なアポトーシスとは異なる作用機序を有する可能性もあると考えられており、その根本的なメカニズムは解明されておらず、有効な治療法も未だ確立されていない。そのため、麻酔薬による発達期の脳のアポトーシスや、その後の認知機能障害を軽減する新規治療法の開発が待たれていた。
Anand and Scalzo, 2000, Biol. Neonate 77(2):69-82 Balduini et al., 2000, Brain Research 859:318-325 Jevtovic-Todorovic et al., 2003, The Journal of Neuroscience 23(3):876-882 Olney et al., 2002d, Brain Pathol 12(4):488-498 Ikonomidou et al., 2001, Biochemical Pharmacology 62:401-405 Young et al., Cell Death and Differentiation (2003) 10, 1148-1155 Butler, 1999, TINS 22(8):332-334 Ikonomidou and Lechoslaw, 2002, Lancet Neurology 1:383-386 Komuro and Rakie, 1993, Science 260(5104):95-97 Behar et al., 1999, The Journal of Neuroscience 19(11):4449-4461 Behar et al., 2001, Cerebral Cortex 11:744-753 Olney et al., 2002b, Neurobiology of Disease 9:205-219 Molar and Blakemore, 1995, Trends Neurosci. 18(9):389-397 Clancy et al., 2001, Neuroscience 105:7-17 Olney et al., 2002a, Neurotoxicology 23(6):659-668 Ikonomidou et al., 1999, Science 238: 70-74 Dobbing and Sands, 1979, Early Hum Dev 3:79-84 Kerr et al., 1972, Br J Cancer 26(4):239-257 Sloviter, 2002, TRENDS in Pharmacological Science 23(1):19-24 Sherrard and Bower, 1998, Clin Exp Pharmacol Physiol 25(7-8):487-495 Young et al., 1999, Nature Med 5:448-453 Brenneman et al., 1990, Brain Res Dev Brain Res 51(1):63-68 Yuan and Yanker, 2000, Nature 407:802-809 Garcia et al., 1992, Science 258(5080):302-304 Martinou et al., 1994, Neuron 13(4):1017-1030 Motoyama et al., 1995, Science 267:1506-1510 Ikonomidou et al., 1999, Science 238: 70-74 Goen et al., 2002, Behavioural Brain Research 136:329-337 Monti and Contestabile, 2000, European Journal of Neuroscience 12:3117-3123 V.Jevtovic-Todorovic et.al 2003 Journal of Neuroscience 23:876-882 Gyulai et al., 2001, Anesthesiology 95:585-593 Bittigau et al., 2002, PNAS 99(23):15089-15094 Farber and Olney, 2003, Developmental Brain Research 147:37-45 Wilder RT, et al., Anesthesiology 100: 796-804, 2009 Anesthesiology 2009; 111:1365-1371 Salveen GS,Riedl　SJ　2008 Adv Exp Med Biol. 615:13-23 LA.Pradelli, M.Beneteau, JE,Ricci 2010 Cell.Mol.life Sci. 67:1589-1597
　本発明は、脳（好ましくは、発達期）の麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減することができる全身麻酔用医薬を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、全身麻酔薬と水素とを組み合わせることで、脳（好ましくは、発達期）の麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減させることが可能であることを見出した。
　すなわち、本発明は以下の発明に関する。
［１］全身麻酔薬と、水素を組み合わせてなる、ヒト又はヒト以外の動物用医薬。
［２］全身麻酔薬と、水素とを併用で投与されることを特徴とする、ヒト又はヒト以外の動物の全身麻酔のための医薬。
［３］麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するために使用される前記［１］又は［２］に記載の医薬。
［４］麻酔薬誘発性神経障害が、神経細胞アポトーシスに付随するものである前記［３］に記載の医薬。
［５］全身麻酔薬が、水素と併用されるように用いられることを特徴とする、全身麻酔薬を含有する麻酔薬誘発性神経障害の予防及び／又は軽減用医薬。
［６］全身麻酔薬が吸入麻酔薬又は液状の静脈麻酔薬であり、水素が水素ガスである前記［１］～［５］のいずれか１項に記載の医薬。
［７］水素ガス濃度が、医薬中０．１５～７％（ｖ／ｖ）である前記［６］に記載の医薬。
［８］胎児、新生児、乳児、幼児、小児又は高齢者を対象とする前記［１］～［７］のいずれか１項に記載の医薬。
［９］全身麻酔薬が、亜酸化窒素、イソフルラン、エンフルラン、メトキシフルラン、セボフルラン、デスフルラン、ジエチルエーテル、プロポフォール及びミダゾラムからなる群より選ばれた１種以上の麻酔薬である前記［１］～［８］のいずれか１項に記載の医薬。
［１０］麻酔薬誘発性神経障害が、神経運動障害、神経認知障害、精神認知障害又は自閉症である前記［３］、［５］～［９］のいずれか１項に記載の医薬。
［１１］麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するために、全身麻酔薬と水素とを併用する医薬の調製方法。
［１２］麻酔薬誘発性神経障害が、神経細胞アポトーシスに付随するものであることを特徴とする前記［１１］に記載の調製方法。
［１３］全身麻酔薬が吸入麻酔薬又は液状の静脈麻酔薬であり、水素が水素ガスである前記［１１］又は［１２］に記載の調製方法。
［１４］水素ガス濃度が、医薬中０．１５～７％（ｖ／ｖ）である前記［１３］に記載の調製方法。
［１５］医薬が、胎児、新生児、乳児、幼児、小児又は高齢者を対象とする前記［１１］～［１４］のいずれか１項に記載の調製方法。
［１６］水素と組み合わせて用いられる全身麻酔剤製造のための全身麻酔薬の使用。
［１７］全身麻酔薬と水素とを組み合わせてなる医薬の製造のための全身麻酔薬と水素の使用。
［１８］麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するための医薬の製造のための全身麻酔薬と水素の使用。
［１９］麻酔薬誘発性神経障害が、神経細胞アポトーシスに付随するものである前記［１８］に記載の使用。
［２０］全身麻酔薬が吸入麻酔薬又は液状の静脈麻酔薬であり、水素が水素ガスである前記［１６］～［１８］のいずれか１項に記載の使用。
［２１］水素ガス濃度が、医薬中０．１５～７％（ｖ／ｖ）である前記［２０］に記載の使用。
［２２］胎児、新生児、乳児、幼児、小児又は高齢者を対象とする前記［１６］～［１８］のいずれか１項に記載の使用。
［２３］全身麻酔薬が、亜酸化窒素、イソフルラン、エンフルラン、メトキシフルラン、セボフルラン、デスフルラン、ジエチルエーテル、プロポフォール及びミダゾラムからなる群より選ばれた１種以上の麻酔薬である前記［１６］～［１８］のいずれか１項に記載の使用。
［２４］麻酔薬誘発性神経障害が、神経運動障害、神経認知障害、精神認知障害又は自閉症である前記［１８］に記載の使用。
［２５］全身麻酔薬と水素とを併用して対象に投与する工程を有する、麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減する方法。
［２６］全身麻酔薬が吸入麻酔薬又は液状の静脈麻酔薬であり、水素が水素ガスである前記［２５］に記載の方法。
［２７］水素ガス濃度が、医薬中０．１５～７％（ｖ／ｖ）である前記［２６］に記載の方法。
［２８］投与対象が、胎児、新生児、乳児、幼児、小児又は高齢者である前記［２５］に記載の方法。
［２９］全身麻酔薬が、亜酸化窒素、イソフルラン、エンフルラン、メトキシフルラン、セボフルラン、デスフルラン、ジエチルエーテル、プロポフォール及びミダゾラムからなる群より選ばれた１種以上の麻酔薬である前記[２５]に記載の方法。
［３０］麻酔薬誘発性神経障害が、神経運動障害、神経認知障害、精神認知障害又は自閉症である前記[２５]に記載の方法。
［３１］麻酔薬誘発性神経障害が、神経細胞アポトーシスに付随するものである前記［２５］に記載の方法。
　本発明の医薬は、脳（好ましくは、発達期）の麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減することが可能である。また、本発明は、簡便で、副作用がなく、効率的に作用し、さらに安価であるため、例えば、産科及び小児科等の医療において有効な全身麻酔用医薬を提供することができる。
図１は、試験例１の結果を示す。Ａは、分解ＰＡＲＰ（アポトーシス細胞死のバイオマーカー）への抗体を使用したウェスタンブロットの結果を示す。β－アクチン反応をコントロールとして使用した。Ｂは、分解ＰＡＲＰバンドを定量化した結果を示す。図中、＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。図中、Ｓｅｖｏはセボフルランを意味する。 図２は、試験例２のマウス脳の光学顕微鏡画像を示す。図中、Ａは、キャリアガスが３０％酸素であり、セボフルラン未投与のサンプル（コントロール）の結果を示し、Ｂは、キャリアガスが３０％酸素であり、３％セボフルランに６時間曝露した後の、マウス脳の光学顕微鏡観察時の画像を示し、Ｃは、キャリアガスが３０％酸素であり、３％セボフルラン及び１．３％水素に６時間曝露した後の、マウス脳の光学顕微鏡画像を示す。図中、茶色の点が、分解カスパーゼ－３陽性の細胞の存在、すなわちアポトーシスを示す。各画像は、一つのグループにつき、８～１０匹のマウスから選んだ１匹のものである。図中、スケールバーは、１ｍｍである。 図３は、試験例２の免疫化学的染色により検出された分解カスパーゼ－３を示す茶色の点の数をカウントした結果を示す。コントロール、セボフルラン及びセボフルラン＋水素の各グループの平均値の比較は、一元配置分散分析とそれに続くニューマン-クルーズポストホックテスト（一つのグループにつき、ｎ＝８－１０のマウス）を用いて実施した。Ｆ値及びＰ値を、それぞれのパネルの下に示した。図中、コントロールと比較したとき、＊はＰ＜０．０５を、＊＊はＰ＜０．０１を、＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。また、＃はＰ＜０．０５を、＃＃はＰ＜０．０１を、＃＃＃はＰ＜０．００１を意味する。 図４は、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼを用いたニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）法の染色結果を示す。図中、Ａは、キャリアガスが３０％酸素であり、セボフルラン未投与のサンプル（コントロール）の結果を示し、Ｂは、キャリアガスが３０％酸素であり、３％セボフルランに６時間曝露した後、さらに６時間経過後の、マウス脳の光学顕微鏡画像を示し、Ｃは、キャリアガスが３０％酸素であり、３％セボフルラン及び１．３％水素に６時間曝露した後、さらに６時間経過後の、マウス脳の光学顕微鏡観察時の画像を示す。図中、茶色の点は、ＴＵＮＥＬ陽性の細胞であり、アポトーシスを起こした細胞を示す。各画像は、一つのグループにつき、８匹のマウスから選んだ１匹のマウスのものである。図中、スケールバーは、１ｍｍである。 図５は、発達期の脳において、セボフルランの曝露が引き起こす酸化ストレスを、水素ガスが緩和することを示す。図中、Ａは、キャリアガスが３０％酸素であり、セボフルラン未投与のサンプル（コントロール）の結果を示し、Ｂは、キャリアガスが３０％酸素であり、３％セボフルランに６時間曝露した後の、マウス脳の光学顕微鏡画像を示し、Ｃは、キャリアガスが３０％酸素であり、３％セボフルラン及び１．３％水素（Ｃ）に６時間曝露した後の、マウス脳の蛍光顕微鏡観察時の画像を示す。図中、赤色は、４－ヒドロキシ－２－ノネナール（４－ＨＮＥ）陽性の細胞であり、酸化ストレスを受けたことを示す。図中、スケールバーは、１００μｍである。各画像は、一つのグループにつき、８匹のマウスから選んだ１匹のマウスのものである。 図６は、試験例３の結果を示す。図中、Ａはオープンフィールドテストの結果を示し、ＢはＹ字型迷路試験の結果を示し、Ｃは恐怖条件付けテスト状況試験の結果を示し、Ｄは恐怖条件付けテスト音試験の結果を示す。図中、コントロールと比較したとき、＊＊はＰ＜０．０１を、＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。また、＃＃はＰ＜０．０１を、＃＃＃はＰ＜０．００１を意味する。 図７は、試験例３の結果を示す。図中、Ａは社会性試験の結果を示し、Ｂは嗅覚試験の結果を示し、Ｃは新規物試験の結果を示す。図中、コントロールと比較したとき＊＊はＰ＜０．０１を、＃はＰ＜０．０５を意味する。また、対応する生物ターゲットと比較したとき§§§はＰ＜０．００１を意味する。
　本発明の医薬は、全身麻酔薬と水素とを組み合わせてなる、ヒト又はヒト以外の動物用医薬である。また、本発明の医薬は、全身麻酔薬と、水素とを併用で投与される、ヒト又はヒト以外の動物の全身麻酔のための医薬である。本発明の医薬は、麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するために使用することができる。本発明における全身麻酔薬は、水素と併用されるように用いられるのが好適である。本発明の医薬とは、全身麻酔薬と水素とを組み合わせてなるものであり、それぞれ別個に同一又は異なる投与経路から同時投与する投与形態、及びそれぞれ別個に同一又は異なる投与経路による間隔をずらした投与のいずれの投与形態も含むものである。
　全身麻酔薬について、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストである全身麻酔薬に対する曝露が、脳発達のシナプス形成段階の間にアポトーシス性神経変性を誘発することが当技術分野において知られている。
　麻酔薬への曝露によって、ニューロン以外のグリア細胞等のいくつかの領域でアポトーシスが増加すること（Anesthesiology 2010; 112:834-841）、及び、ＮＭＤＡ受容体のアップレギュレーションによってアポトーシスが発生すること（Int. J. Devl Neuroscience 27(2009)727-731）から、麻酔薬は、一般的なアポトーシスとは異なる作用機序でアポトーシスを誘発すると考えられ、その結果、神経障害を誘発すると危惧されている。
　また、ＧＡＢＡ受容体の作動作用を有する麻酔薬は、ＧＡＢＡニューロンに影響を与え、興奮性ニューロン及び抑制性ニューロンのバランスを崩すことで神経障害を誘発するともいわれている（Anesthesiology 2009; 111:1365-1371）。
　小児麻酔とアポトーシスレベルの上昇との後記する明確な関わりを前提として、このプロセスのバックグラウンドの機構を特定するために多数の研究が進行中である。ＧＡＢＡ受容体とＮＭＤＡ受容体両方の活性化は、神経細胞の生存シグナル伝達に影響を及ぼすことが知られている(Brunet et al., 2001, Current Opinion in Neurobiology 11:297-305; Bittigau et al., 2002, PNAS 99(23):15089-15094)。この点を考慮して、エタノール中毒にしたマウスが、このプロセスの研究のための動物モデルの基礎を形成してきた。カスパーゼ－３はアポトーシス細胞の優れたマーカーであるが、高度に分岐したデスシグナル伝達カスケードの最終エフェクターであるため、その位置からは、アポトーシスの機構への洞察がほとんど得られない。カスパーゼ－３活性化は、アポトーシスの外因性のデス受容体媒介経路と内因性のミトコンドリア媒介経路両方に共通のステップである(Green, 2000, Cell 102:1-4)。
　ヤング（Young）らは、一連の適格な実験を用いて、アポトーシスの機構のうち、調査対象を単一経路に絞り込むことを考えた。二重免疫組織化学－免疫蛍光、ウェスタンブロット解析及びノックアウトマウスの組合せを用いて経路特異的成分、中でも、Ｂａｘ及びシトクロムｃ（内因性）及びカスパーゼ－８（外因性）を明らかにした(Young et al., Cell Death and Differentiation (2003) 10, 1148-1155)。エタノールで処理した野生型マウスは、エタノール誘発性アポトーシスの特徴的なパターンを示すのに対し、同様の処理を施したホモ接合体Ｂａｘ－ノックアウトマウスはアポトーシスの徴候を実質的に全く示さないことがわかった。実際、アポトーシスレベルは対照の生理学的細胞死において見られるものよりも低かった。さらに、Ｂａｘ－ノックアウトマウスは、カスパーゼ－８活性化が起こらないことを実証した。これにより、麻酔誘発性アポトーシスにおいて内因性アポトーシス経路が関与していることが明らかとなった。
　ミトコンドリア周辺が中心となる内因性経路は、神経細胞のサイトゾル中のアポトーシス促進性及び抗アポトーシス性メディエーターの組合せによって制御されている。発生中の神経細胞との関連では、Ｂｃｌ－ＸＬ（Ｂｃｌ－２ファミリーのメンバー）は主に抗アポトーシス性であるのに対し、Ｂａｘはアポトーシス促進性である(Yuan and Yanker, 2000, Nature 407:802-809)。ヤングらは、エタノール、二重ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト２種類の同時投与）及びＧＡＢＡ作動性麻酔剤は、通常不活性状態でミトコンドリア膜に保存されているＢａｘを、サイトゾルに放出する能力を有するという仮説を立てた。
　Ｂａｘは、サイトゾル中にあると（Ｂｃｌ－ＸＬによって抑制されない場合）活性な複合体の一部となり、これがミトコンドリア膜に戻り、ミトコンドリア膜を破壊することができる(Korsmeyer et al., 2002, Cell Death and Differentiation 7:1166-1173)。その後のミトコンドリア内容物（具体的には、シトクロムｃ－細胞エネルギー産生の通常の部分）のサイトゾルへの輸送が、極めて強力なアポトーシス促進シグナルを生じさせると考えられている。サイトゾルのシトクロムｃはＡｐａｆ－１及びカスパーゼ－８と複合体を形成し、次いで、これがカスパーゼ－３を活性化し、さらなるカスケードの開始をもたらし、最終的に、細胞骨格タンパク質及びＤＮＡ両方の特徴的な切断を引き起こす(Dikranian et al., 2001, Neurobiology of Disease 8:359-379)。
　もちろん、上記分析から、麻酔薬がこの経路と相互作用する正確な点を同定することは不可能である。また、個々の種類の薬剤は、アポトーシスを誘発できる（例えば、イソフルラン単独(Jevtovic-Todorovic et al., 2003)及びケタミン単独(Ikonomidou et al., 1999,Science 238:70-74)）。したがって、続いて起こる細胞内カスケードは下流に収束するが(Brunet et al., 2001, Current Opinion in Neurobiology 11:297-305; Bittigau et al., 2002, PNAS 99(23):15089-15094)、二重ＧＡＢＡ作動性薬剤及びＮＭＤＡ受容体アンタゴニストの使用は、２種の受容体相互作用間の潜在的な相違を区別しない。イソフルラン及び／又は亜酸化窒素が、おそらくは細胞内カルシウム輸送を混乱させることによって、細胞内Ｂａｘ／Ｂｃｌ－２比を調節不全にできるということは十分にあり得ることである。
　細胞内カルシウムイオン濃度が上昇すると、カルシウムイオン依存性の酵素の活性化（ＮＯＳ、ＰＬＡ２、ＣａＭ kinase等）を介したカスケード系が賦活化し、膜構成成分の脂質の障害、フリーラジカル（ＲＯＳ）の産生、ミトコンドリア呼吸鎖の障害とＡＴＰ産生不全が引き起こされ、これらが引き金となって急性又は遅発性のアポトーシスが誘発されると考えるグルタミン酸―カルシウムイオン説が支持されてきた。しかしながら、この説のカスケードでは、アポトーシスの真の原因因子は不明である（麻酔、“虚血性神経細胞死の分子生物学的機序と薬物療法による脳保護”、2007，56：248-270）。
　本発明における全身麻酔薬としては、全身性の麻酔効果が得られる薬であれば、特に限定されないが、例えば、吸入麻酔薬及び静脈麻酔薬等が好適に挙げられる。
　本発明における吸入麻酔薬としては、特に限定されないが、例えば、ハロタン、イソフルラン、エンフルラン、メトキシフルラン、セボフルラン、デスフルラン等の揮発性吸入麻酔薬；エチレン、シクロプロパン、ジエチルエーテル、クロロホルム、亜酸化窒素又はキセノン等のガス性吸入麻酔薬が挙げられ、イソフルラン、エンフルラン、セボフルラン、デスフルラン等のハロゲン化エーテル系化合物又は亜酸化窒素等が好ましい。吸入麻酔薬は、注射又は静脈内注入により投与される静脈麻酔薬と組合せて使用されてもよい。
　本発明における静脈麻酔薬としては、特に限定されないが、例えば、プロポフォール、ミダゾラム、ケタミン、チレタミン、チオペンタール、メトヘキシタール又はエトミデート等が挙げられ、プロポフォール、ミダゾラム等が好ましい。
　本発明に用いる全身麻酔薬としては、上記具体例のうち、亜酸化窒素、イソフルラン、エンフルラン、メトキシフルラン、セボフルラン、デスフルラン、ジエチルエーテル、プロポフォール及びミダゾラムからなる群より選ばれた１種以上の麻酔薬がより好ましい。
上記具体例のうち、ハロタン、イソフルラン、エンフルラン、メトキシフルラン、セボフルラン、デスフルラン、エトミデート、チオペンタール、プロポフォール及びミダゾラム等の麻酔薬は、ＧＡＢＡＡ受容体作用薬である。さらに、前記麻酔薬のうちのいくつか（例えば、Ｎ２Ｏ、ケタミン及びイソフルラン等）はＮＭＤＡ受容体アンタゴニストであるが、麻酔薬全てについてＮＭＤＡ受容体拮抗作用が解明されているわけではない。
　全身麻酔薬の用量は、年齢、健康状態、その他の医薬との相互作用及び実施される手術の種類に応じ、患者毎に異なり、本発明の効果を達成できる範囲であれば、特に限定されないが、例えば、上記の吸入麻酔薬及び静脈麻酔薬等の全身麻酔薬の医薬中の濃度は、０．１～１０％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．２～８％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．２～５％（ｖ／ｖ）であってもよい。また、麻酔の導入時と麻酔状態維持時の濃度を変えてもよい。
　本発明において、水素は、水素分子（Ｈ２）を意味し、水素分子（Ｈ２）であれば、特に形態は限定されず、水素ガスを用いてもよく、水素ガスを水に溶解させた水素水を用いてもよい。
　前記全身麻酔薬及び水素の適用対象としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラット、ウサギ等の動物が挙げられる。
　本発明の医薬の適用対象の年齢等は、特に限定されないが、麻酔の影響を受けやすい時期の動物に好適に適用される。例えば、対象がヒトの場合、好ましくは胎児、新生児、乳児、幼児、小児又は高齢者を対象とし、脳が発達期にあり、麻酔の影響を受けやすい点を考慮して、より好ましくは胎児、新生児、乳児、幼児、小児等であり、さらに好ましくは胎児、新生児、乳児又は３歳以下の幼児である。前記胎児とは、妊娠８週目以降出生前の子を意味する。前記新生児とは、生後２８日未満の乳児を意味する。前記乳児とは、１歳未満の子供を意味する。前記幼児とは、１歳以上７歳未満を意味する。前記小児とは、７歳以上１５歳未満を意味する。前記高齢者とは、６５歳以上の人を意味する。
　本発明の医薬の実施態様としては、全身麻酔薬と水素とを併用していてもよく、全身麻酔薬と水素とを予め混合しておいてもよい。
　本発明の医薬において、全身麻酔薬の形態及び水素の形態は特に限定されないが、顕著に優れた麻酔薬誘発性神経障害の予防及び／又は軽減効果を示す点から、吸入麻酔薬又は静脈麻酔薬と、水素ガスとの組み合わせとすることが好ましい。
　本発明の医薬において、全身麻酔薬と水素を併用する場合、全身麻酔薬と水素を使用するタイミングは特に限定されず、全身麻酔薬の前投与、同時投与又は後投与のいずれに水素を用いてよく、またいずれかを組み合わせてもよいが、対象への前処理の負担がない点から、全身麻酔薬と水素の同時投与が好ましい。ここで、「前投与」とは、全身麻酔薬を未投与状態の対象へ水素を一定時間投与することを意味する。また、「同時投与」とは、全身麻酔薬の投与開始時から投与停止時まで継続して、又は全身麻酔薬の投与開始時から投与停止時までの間に一定時間、対象へ水素を投与することを意味する。「後投与」とは、全身麻酔薬の投与停止後から、対象へ水素を一定時間投与することを意味する。なお、全身麻酔薬及び水素の投与時間は、特に限定されないが、例えば、セボフルランを、４．０％以下の濃度で、酸素及び亜酸化窒素と組み合わせて使用した場合、１０分～８時間程度であってよい。
　全身麻酔薬と水素との併用において、全身麻酔薬の形態及び水素の形態は特に限定されないが、本発明の好適な一態様では、顕著に優れた麻酔薬誘発性神経障害の予防及び／又は軽減効果を示す点から、全身麻酔薬が吸入麻酔薬又は静脈麻酔薬であり、水素が水素ガスである併用とすることが好ましい。
　本発明の医薬において、全身麻酔薬と水素を予め混合しておく場合、混合比率は特に限定されないが、例えば、吸入麻酔薬と水素ガスとを用いる場合、医薬中の水素ガス濃度は、通常０．０１～７％（ｖ／ｖ）であり、安全性を考慮して上限値は低いほうが好ましく、例えば、０．１５～４％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．１８～３％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．２～１．５％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．２５％（ｖ／ｖ）以上１％（ｖ／ｖ）未満であってもよく、０．２８～０．９％（ｖ／ｖ）であってもよい。
　本発明に用いる水素の用量は、年齢、健康状態、その他の医薬との相互作用及び実施される手術の種類に応じ、患者毎に異なり、本発明の効果を達成できる範囲であれば、特に限定されないが、医薬中の水素濃度は、通常０．０１～７％（ｖ／ｖ）であり、安全性を考慮して上限値は低いほうが好ましく、例えば、０．１５～４％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．１８～３％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．２～１．５％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．２５％（ｖ／ｖ）以上１％（ｖ／ｖ）未満であってもよく、０．２８～０．９％（ｖ／ｖ）であってもよい。
　本発明の好適な一態様として、吸入麻酔薬と水素ガスとを組み合わせてなる、ヒト又はヒト以外の動物用医薬において、特に限定されないが、医薬中の水素ガス濃度は通常０．０１～７％（ｖ／ｖ）であり、安全性を考慮して上限値は低いほうが好ましく、例えば、０．１５～４％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．１８～３％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．２～１．５％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．２５％（ｖ／ｖ）以上１％（ｖ／ｖ）未満であってもよく、０．２８～０．９％（ｖ／ｖ）であってもよい。
　本発明の好適な一態様として、液状の静脈麻酔薬と水素ガスとを組み合わせてなる、ヒト又はヒト以外の動物用医薬において、特に限定されないが、医薬中のガスの水素ガス濃度は通常０．０１～７％（ｖ／ｖ）であり、安全性を考慮して上限値は低いほうが好ましく、例えば、０．１５～４％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．１８～３％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．２～１．５％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．２５％（ｖ／ｖ）以上１％（ｖ／ｖ）未満であってもよく、０．２８～０．９％（ｖ／ｖ）であってもよい。
　本発明の好適な一態様として、吸入麻酔薬と水素ガスとを併用して使用する場合、医薬中の水素ガス濃度は、特に限定されないが、通常０．０１～７％（ｖ／ｖ）であり、安全性を考慮して上限値は低いほうが好ましく、例えば、０．１５～４％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．１８～３％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．２～１．５％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．２５％（ｖ／ｖ）以上１％（ｖ／ｖ）未満であってもよく、０．２８～０．９％（ｖ／ｖ）であってもよい。
　本発明の好適な一態様として、液状の静脈麻酔薬と水素ガスとを併用して使用する場合、医薬中のガスの水素ガス濃度は、特に限定されないが、通常０．０１～７％（ｖ／ｖ）であり、安全性を考慮して上限値は低いほうが好ましく、例えば、０．１５～４％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．１８～３％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．２～１．５％（ｖ／ｖ）であってもよく、０．２５％（ｖ／ｖ）以上１％（ｖ／ｖ）未満であってもよく、０．２８～０．９％（ｖ／ｖ）であってもよい。
　本発明の医薬には、本発明の効果を妨げない限り、酸素、窒素、亜酸化窒素等を加えていてもよい。本発明の医薬に含まれる酸素濃度は、通常、２０～９０％（ｖ／ｖ）程度であり、２０～７０％（ｖ／ｖ）程度が好ましく、２０～５０％（ｖ／ｖ）程度が好ましい。窒素及び亜酸化窒素は、本発明の効果を妨げない限り、濃度は限定されない。
　本発明において、医薬のガス成分の構成成分について、上記した成分以外の残量は、全て窒素ガスであってもよく、窒素ガス以外に空気に含まれる微量成分を含有していてもよい。
　吸入麻酔薬と水素ガスとを用いた場合の好適な実施態様としては、特に限定されないが、例えば、（ｉ）０．１～１０％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～９０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する医薬、（ｉｉ）０．１～８％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～７０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する医薬、又は（ｉｉｉ）０．１～５％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～５０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する医薬等が挙げられる。
　液状の静脈麻酔薬と水素ガスとを用いた場合の好適な実施態様としては、特に限定されないが、例えば、（ｉ）０．１～１０％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～９０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する医薬、（ｉｉ）０．１～８％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～７０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する医薬、又は（ｉｉｉ）０．１～５％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～５０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する医薬等が挙げられる。
　本発明の別の好適な一態様として、静脈麻酔薬と水素水とを組み合わせてなる、ヒト又はヒト以外の動物用医薬において、医薬中の水素水濃度は、特に限定されない。
　本発明の別の好適な一態様では、静脈麻酔薬と水素水とを併用して使用する場合、医薬中の水素水濃度は、特に限定されない。
　本発明の医薬は、麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減できる。「神経障害を予防及び／又は軽減する」とは、本発明の医薬を適用された対象（例えば、ヒトの場合、患者）と、水素の非存在下において全身麻酔薬を適用された対象とを比較した場合に、１種以上の神経障害の重篤度を低下させることを意味する。また、「神経細胞損傷を予防及び／又は軽減する」とは、本発明の医薬を適用された対象と、水素の不存在下において全身麻酔薬を適用された対象とを比較した場合に、１種以上の神経細胞の損傷の重篤度を低下させることを意味する。
　既存のデータから、発達中のヒトの脳は、子宮内及び人生の最初の１年の両方で胎児表現型から成人表現型に類似するものへと、極めて動的な変換を受けるということが推定できる。このプロセスは、シナプスの極めて早いターンオーバー（１日に２０％もの高さ(Okabe et al., 1999, Nat. Neuroscience 2:804-811)）及び高レベルのバックグラウンドアポトーシス(Hua and Smith, 2004, Nature Neuroscience 7(4):327-332)という特徴を有する。これは、標的細胞のシナプスに到達できない神経細胞が、おそらくはエネルギー効率を維持するために排除されるためである。この研究は、神経発生（シナプス形成）のこの決定的な段階の間の麻酔剤への曝露が、発達中の脳においてアポトーシスを引き起こすことを確認するものである。実験により、ＧＡＢＡ作動性吸入剤（例えば、イソフルラン等）への曝露が、皮質においてアポトーシスレベルの４倍の上昇を誘発することが実証された。また、亜酸化窒素（単一の薬剤としては神経変性を示さない）は、イソフルラン誘発性アポトーシスを対照に見られるものの１２倍に大幅に増強することによってその神経変性潜在力を示す。同様の結果が海馬から得られ、この結果では、イソフルラン及びイソフルラン－亜酸化窒素混合物がアポトーシスレベルを上昇させた（それぞれ、４倍及び７倍）。
　海馬、すなわち辺縁系の一部を形成する皮質組織の特殊化した層は、記憶形成において重要な機能を有する(Aggleton and Brown, 1999, Behav Brain Sci 22(3):425-44)。海馬の神経細胞は、シナプスの効力が、特定のパターンの神経活性によって徐々に増強される、「長期増強」（ＬＴＰ）として知られる現象を示す能力を有する。このプロセスが細胞レベルでの記憶の基礎であると考えられている。一般的には、海馬の処理は、海馬と海馬傍回（海馬台）の両方で起こり、その後、脳弓に投影される。海馬及び海馬台における神経細胞損傷の広がりを考えると、高レベルの麻酔薬に曝露された新生児ラットが、成人として学習障害の徴候を示すこと(Jevtovic-Todorovic et al., 2003)は驚くことではなく、同じ研究においてＬＴＰ抑制の発見によって裏付けられている。
　本発明における麻酔薬誘発性神経障害としては、好適には、脳の麻酔薬誘発性神経障害が挙げられ、本発明の神経障害には、特に限定されないが、神経運動障害、神経認知障害、精神認知障害、知的障害、自閉症等が挙げられる。前記神経運動障害は、強度、平衡及び移動性の障害を含む。前記神経認知障害は、学習障害及び記憶障害を含む。上記の神経障害は、神経変性、神経細胞アポトーシス、神経細胞壊死等の要因によって引き起こされると考えられており、特定の一つの要因だけでなく、複合的な要因によって引き起こされている可能性が考えられている。中でも、神経細胞アポトーシスは、前記のいずれの障害においても何らかの影響を与えているものと推察される。前記神経変性とは、細胞収縮、辺縁趨向及び膜に封入されたアポトーシス小体の形成を伴うクロマチン凝集を意味する。
　このような神経認知障害は、通常、ランド(Randt)記憶検査のショートストーリーモジュール(short-story module)[Randt C, Brown E. Administration manual: Randt Memory Test. New York: Life Sciences, 1983]、改訂ウェクスラー成人知能検査(Wechsler Adult Intelligence Scale Revised)の数唱下位検査(Digit Span subtest)と符合作業下位検査(Digit Symbol subtest)[Wechsler D. The Wechsler Adult Intelligence Scale-Revised (WAIS-R). San Antonio, Tex.: Psychological Corporation, 1981.]、改訂ベントン視覚記銘検査(Benton Revised Visual Retention Test)[Benton AL, Hansher K. Multilingual aphasia examination. Iowa City: University of Iowa Press, 1978]及びトレイルメイキングテスト(Trail Making Test)（パートＢ）[Reitan RM. Validity of the Trail Making Test as an indicator of organic brain damage. Percept Mot Skills 1958;8:271-6]等の十分に確立された基準によって評価できる。その他の適した神経運動及び神経認知検査は、Combs D, D'Alecy L:Motor performance in rats exposed to severe forebrain ischemia:Effect of fasting and 1,3-butanediol.Stroke 1987; 18: 503-511及びGionet T, Thomas J, Warner D, Goodlett C, Wasserman E, West J: Forebrain ischemia induces selective behavioral impairments associated with hippocampal injury in rats. Stroke 1991;22:1040-1047に記載されている。
　本発明の別の態様は、全身麻酔薬と水素とを併用する、麻酔薬誘発性神経障害の予防及び／又は軽減用医薬の調製方法に関する。全身麻酔薬、水素、医薬の適用対象及び麻酔薬誘発性神経障害並びにこれらの組み合わせは、上述のとおりである。本調製方法は、全身麻酔薬と水素とを併用する工程を有してもよく、全身麻酔薬と水素とを予め混合する工程を有してもよい。
　本調製方法において、吸入麻酔薬と水素ガスとを用いる場合の好適な実施態様としては、特に限定されないが、例えば、（ｉ）０．１～１０％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～９０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有するように、吸入麻酔薬と水素ガスとを併用する工程又は吸入麻酔薬と水素ガスとを予め混合する工程を有する医薬の調製方法、（ｉｉ）０．１～８％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～７０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有するように、吸入麻酔薬と水素ガスとを併用する工程又は吸入麻酔薬と水素ガスとを予め混合する工程を有する医薬の調製方法、又は（ｉｉｉ）０．１～５％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～５０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有するように、吸入麻酔薬と水素ガスとを併用する工程又は吸入麻酔薬と水素ガスとを予め混合する工程を有する医薬の調製方法等が挙げられる。
　本調製方法において、液状の静脈麻酔薬と水素ガスとを用いた場合の好適な実施態様としては、特に限定されないが、例えば、（ｉ）０．１～１０％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～９０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有するように、静脈麻酔薬と水素ガスとを併用する工程又は静脈麻酔薬と水素ガスとを予め混合する工程を有する医薬の調製方法、（ｉｉ）０．１～８％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～７０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有するように、静脈麻酔薬と水素ガスとを併用する工程又は静脈麻酔薬と水素ガスとを予め混合する工程を有する医薬の調製方法、又は（ｉｉｉ）０．１～５％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～５０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有するように、静脈麻酔薬と水素ガスとを併用する工程又は静脈麻酔薬と水素ガスとを予め混合する工程を有する医薬の調製方法等が挙げられる。
　本発明の別の態様としては、水素と組み合わせて用いられる全身麻酔剤製造のための全身麻酔薬の使用が挙げられる。前記麻酔剤には、薬効成分の安定、患者の水分補給及び電解質のバランス維持を目的として、公知の賦形剤、添加剤を加えてもよい。前記賦形剤、添加剤としては、本発明の効果を妨げない限り、従来公知の賦形剤、添加剤を使用することができる。例えば、プロポフォールの麻酔剤の中には、ダイズ油、中鎖脂肪酸トリグリセリド、精製卵黄レシチン、濃グリセリン、オレイン酸ナトリウム等を添加してもよい。全身麻酔薬、水素及び医薬の適用対象は、上述のとおりである。
　本使用において、吸入麻酔薬と水素ガスとを用いる場合の好適な実施態様としては、特に限定されないが、例えば、（ｉ）０．１～１０％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～９０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有し、さらに必要に応じて添加剤を含んでいてもよい全身麻酔剤製造のための全身麻酔薬の使用、（ｉｉ）０．１～８％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～７０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有し、さらに必要に応じて添加剤を含んでいてもよい全身麻酔剤製造のための全身麻酔薬の使用、又は（ｉｉｉ）０．１～５％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～５０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有し、さらに必要に応じて添加剤を含んでいてもよい全身麻酔剤製造のための全身麻酔薬の使用等が挙げられる。
　本使用において、液状の静脈麻酔薬と水素ガスとを用いた場合の好適な実施態様としては、特に限定されないが、例えば、（ｉ）０．１～１０％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～９０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有し、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい全身麻酔剤製造のための全身麻酔薬の使用、（ｉｉ）０．１～８％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～７０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有し、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい全身麻酔剤製造のための全身麻酔薬の使用、又は（ｉｉｉ）０．１～５％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～５０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有し、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい全身麻酔剤製造のための全身麻酔薬の使用等が挙げられる。
　本発明の別の態様は、全身麻酔薬と水素とを組み合わせてなる医薬の製造のための全身麻酔薬と水素の使用に関する。全身麻酔薬、水素及び医薬の適用対象並びにこれらの組み合わせは、上述のとおりである。本使用の実施態様としては、全身麻酔薬と水素とを併用していてもよく、全身麻酔薬と水素とを予め混合しておいてもよい。
　本使用において、吸入麻酔薬と水素ガスとを用いる場合の好適な実施態様としては、特に限定されないが、例えば、（ｉ）０．１～１０％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～９０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する医薬の製造のための全身麻酔薬と水素の使用、（ｉｉ）０．１～８％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～７０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する医薬の製造のための全身麻酔薬と水素の使用、又は（ｉｉｉ）０．１～５％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～５０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する医薬の製造のための全身麻酔薬と水素の使用等が挙げられる。
　本使用において、液状の静脈麻酔薬と水素ガスとを用いた場合の好適な実施態様としては、特に限定されないが、例えば、（ｉ）０．１～１０％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～９０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する医薬の製造のための全身麻酔薬と水素の使用、（ｉｉ）０．１～８％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～７０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する医薬の製造のための全身麻酔薬と水素の使用、又は（ｉｉｉ）０．１～５％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～５０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する医薬の製造のための全身麻酔薬と水素の使用等が挙げられる。
　本発明の別の態様は、麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するための医薬の製造における、全身麻酔薬と水素の使用に関する。全身麻酔薬、水素、医薬の適用対象、麻酔薬誘発性神経障害及び実施態様並びにこれらの組み合わせは、上述のとおりである。
　本使用において、吸入麻酔薬と水素ガスとを用いる場合の好適な実施態様としては、特に限定されないが、例えば、（ｉ）０．１～１０％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～９０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する、麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するための、医薬の製造ための、全身麻酔薬と水素の使用、（ｉｉ）０．１～８％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～７０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する、麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するための、医薬の製造ための、全身麻酔薬と水素の使用、又は（ｉｉｉ）０．１～５％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～５０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する、麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するための、医薬の製造ための、全身麻酔薬と水素の使用等が挙げられる。
　本使用において、液状の静脈麻酔薬と水素ガスとを用いた場合の好適な実施態様としては、特に限定されないが、例えば、（ｉ）０．１～１０％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～９０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する、麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するための、医薬の製造ための、全身麻酔薬と水素の使用、（ｉｉ）０．１～８％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～７０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する、麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するための、医薬の製造ための、全身麻酔薬と水素の使用、又は（ｉｉｉ）０．１～５％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～５０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する、麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するための、医薬の製造ための、全身麻酔薬と水素の使用等が挙げられる。
　本発明の別の態様は、神経細胞アポトーシスに付随する麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するための医薬の製造ための全身麻酔薬と水素の使用に関する。全身麻酔薬、水素、医薬の適用対象、麻酔薬誘発性神経障害及び実施態様並びにこれらの組み合わせは、上述のとおりである。
　本使用において、吸入麻酔薬と水素ガスとを用いる場合の好適な実施態様としては、特に限定されないが、例えば、（ｉ）０．１～１０％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～９０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する、神経細胞アポトーシスに付随する麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するための、医薬の製造のための全身麻酔薬と水素の使用、（ｉｉ）０．１～８％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～７０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する、神経細胞アポトーシスに付随する麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するための、医薬の製造のための全身麻酔薬と水素の使用、又は（ｉｉｉ）０．１～５％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～５０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する、神経細胞アポトーシスに付随する麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するための、医薬の製造のための全身麻酔薬と水素の使用等が挙げられる。
　本使用において、液状の静脈麻酔薬と水素ガスとを用いた場合の好適な実施態様としては、特に限定されないが、例えば、（ｉ）０．１～１０％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～９０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する、神経細胞アポトーシスに付随する麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するための、医薬の製造のための全身麻酔薬と水素の使用、（ｉｉ）０．１～８％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～７０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する、神経細胞アポトーシスに付随する麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するための、医薬の製造のための全身麻酔薬と水素の使用、又は（ｉｉｉ）０．１～５％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～５０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有する、神経細胞アポトーシスに付随する麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するための、医薬の製造のための全身麻酔薬と水素の使用等が挙げられる。
　本発明のさらなる別の態様は、麻酔誘発性神経細胞損傷を予防及び／又は軽減するための医薬の製造における全身麻酔薬と水素の使用に関する。全身麻酔薬、水素、医薬の適用対象、麻酔薬誘発性神経障害及び実施態様並びにこれらの組み合わせは、上述のとおりである。
　本発明の別の態様は、全身麻酔薬と水素とを併用して対象に投与する工程を有する、麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減する方法に関する。全身麻酔薬、水素及び麻酔薬誘発性神経障害並びにこれらの組み合わせは、上述のとおりである。本方法は、全身麻酔薬と水素とを併用する工程を有してもよく、全身麻酔薬と水素とを予め混合する工程を有してもよい。
　本方法において、吸入麻酔薬と水素ガスとを用いる場合の好適な実施態様としては、特に限定されないが、例えば、（ｉ）０．１～１０％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～９０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有させ、対象に投与する工程を有する、麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減する方法、（ｉｉ）０．１～８％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～７０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有させ、対象に投与する工程を有する、麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減する方法、又は（ｉｉｉ）０．１～５％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～５０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有させ、対象に投与する工程を有する、麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減する方法等が挙げられる。
　本方法において、液状の静脈麻酔薬と水素ガスとを用いた場合の好適な実施態様としては、特に限定されないが、例えば、（ｉ）０．１～１０％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～９０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有させ、対象に投与する工程を有する、麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減する方法等、（ｉｉ）０．１～８％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～７０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有させ、対象に投与する工程を有する、麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減する方法等、又は（ｉｉｉ）０．１～５％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～５０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有させ、対象に投与する工程を有する、麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減する方法等が挙げられる。
　本態様において、全身麻酔薬と水素を併用するタイミングは特に限定されず、全身麻酔薬の前投与、同時投与又は後投与のいずれに水素を用いてよく、またいずれかを組み合わせてもよいが、対象への前処理の負担がない点から、全身麻酔薬と水素の同時投与が好ましい。ここで、「前投与」とは、全身麻酔薬を未投与状態の対象へ水素を一定時間投与することを意味する。また、「同時投与」とは、全身麻酔薬の投与開始時から投与停止時まで継続して、又は全身麻酔薬の投与開始時から投与停止時までの間に一定時間、対象へ水素を投与することを意味する。「後投与」とは、全身麻酔薬の投与停止後から、対象へ水素を一定時間投与することを意味する。なお、全身麻酔薬及び水素の投与時間は、特に限定されない。前記全身麻酔薬及び水素の投与対象としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラット、ウサギ等の動物が挙げられる。
　本発明の全身麻酔薬及び水素の投与対象の年齢等は特に限定されないが、麻酔の影響を受けやすい時期の動物に好適に投与される。例えば、対象がヒトの場合、好ましくは胎児、新生児、乳児、幼児、小児又は高齢者を対象とし、脳が発達期にあり、麻酔の影響を受けやすい点を考慮して、より好ましくは胎児、新生児、乳児、幼児、小児等であり、さらに好ましくは胎児、新生児、乳児又は３歳以下の幼児である。胎児、新生児、乳児、幼児、小児又は高齢者の各定義は上述のとおりである。
　本発明の別の態様は、全身麻酔薬と水素とを組み合わせてなる医薬を、対象に投与する工程を有する、麻酔薬誘発性アポトーシスを阻害する方法に関する。全身麻酔薬、水素及び医薬の適用対象並びにこれらの組み合わせは、上述のとおりである。本方法は、全身麻酔薬と水素とを併用する工程を有してもよく、全身麻酔薬と水素とを予め混合する工程を有してもよい。
　本方法において、吸入麻酔薬と水素ガスとを用いる場合の好適な実施態様としては、特に限定されないが、例えば、（ｉ）０．１～１０％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～９０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有するように、吸入麻酔薬と水素ガスとを併用する工程又は吸入麻酔薬と水素ガスとを予め混合する工程及び前記工程で得られる医薬を、対象に投与する工程を有する、麻酔薬誘発性アポトーシスを阻害する方法、（ｉｉ）０．１～８％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～７０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有するように、吸入麻酔薬と水素ガスとを併用する工程又は吸入麻酔薬と水素ガスとを予め混合する工程及び前記工程で得られる医薬を、対象に投与する工程を有する、麻酔薬誘発性アポトーシスを阻害する方法、又は（ｉｉｉ）０．１～５％（ｖ／ｖ）の吸入麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～５０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有するように、吸入麻酔薬と水素ガスとを併用する工程又は吸入麻酔薬と水素ガスとを予め混合する工程及び前記工程で得られる医薬を、対象に投与する工程を有する、麻酔薬誘発性アポトーシスを阻害する方法等が挙げられる。
　本方法において、液状の静脈麻酔薬と水素ガスとを用いた場合の好適な実施態様としては、特に限定されないが、例えば、（ｉ）０．１～１０％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～９０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有するように、静脈麻酔薬と水素ガスとを併用する工程又は静脈麻酔薬と水素ガスとを予め混合する工程及び前記工程で得られる医薬を、対象に投与する工程を有する、麻酔薬誘発性アポトーシスを阻害する方法、（ｉｉ）０．１～８％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～７０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有するように、静脈麻酔薬と水素ガスとを併用する工程又は静脈麻酔薬と水素ガスとを予め混合する工程及び前記工程で得られる医薬を、対象に投与する工程を有する、麻酔薬誘発性アポトーシスを阻害する方法、又は（ｉｉｉ）０．１～５％（ｗ／ｗ）の静脈麻酔薬、０．１５～１．５％（ｖ／ｖ）の水素ガス及び２０～５０％（ｖ／ｖ）の酸素を含有するように、静脈麻酔薬と水素ガスとを併用する工程又は静脈麻酔薬と水素ガスとを予め混合する工程及び前記工程で得られる医薬を、対象に投与する工程を有する、麻酔薬誘発性アポトーシスを阻害する方法等が挙げられる。
　本発明において、麻酔薬誘発性神経障害をアポトーシス及び行動試験から評価した。アポトーシスについては、(i)分解ＰＡＲＰの定量、(ii)活性カスパーゼ－３染色、又は(iii)ＴＵＮＥＬ法によって評価した。
　本発明では、分解ＰＡＲＰの検出及び定量にウェスタンブロット分析を用いた。アポトーシスカスケードの主要な開始因子の一つは、カスパーゼの活性化と、それによるポリ（アデノシン二リン酸－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の分解である。正常時はＤＮＡ修復やＤＮＡの安定化及び他の細胞内のイベントに関与する核内酵素であるＰＡＲＰは、アポトーシスカスケードにおいては、カスパーゼ－３の最終ターゲットである。アポトーシスの間に分解していく活性型カスパーゼの測定に対して、分解ＰＡＲＰの測定は、アポトーシスの後期ステージにおいても持続するシグナルの検出を可能とする。
　本発明では、活性カスパーゼ－３染色に、カスパーゼ－３免疫組織化学法を用いた。アポトーシスシグナル伝達カスケードの最後で、カスパーゼ－９がカスパーゼ－３（システインプロテアーゼ）を活性化するため、カスパーゼ－３はアポトーシス関与点の下流にある細胞のマーカーである。銀染色を広く平行させながら行う前記免疫組織化学法は、神経細胞アポトーシスの適したマーカーとして働き、生理学的細胞死の定量化目的と特性決定の両方にとって優れたものである(Olney et al., 2002b, Neurobiology of Disease 9:205-219)。カスパーゼ－３は細胞質酵素であるため、活性化カスパーゼ－３で染色された細胞はその全体が染色され、定量化が比較的容易である。
　本発明では、アポトーシスの初期におけるＤＮＡの断片化を、ＴＵＮＥＬ法によって可視化させた。ＤＮＡの断片化は、二本鎖の切断及び一本鎖の切断によって構成されている。いずれの切断タイプも、その断片のフリーの３’－ＯＨ末端を、標識ヌクレオチドを使用した酵素反応によって標識し検出することが可能である。ＴＵＮＥＬ法は、高感度なアポトーシス検出法として用いられている。
　次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではなく、多くの変形が本発明の技術的思想内で当分野において通常の知識を有する者により可能である。
　以下の実施例における統計分析は、グラフパッドプリズム５（GraphPad Software Inc., La Jolla, CA）を用いて行った。それぞれのグループの平均値の比較は、一元及び二元配置分散分析によって実施し、その後それぞれについてニューマン-クルーズとボンフェローニのポストホックテストを実行した。Ｙ字型迷路試験において、グループ間のランダムパフォーマンスに関する行動の比較は、両側の１サンプルｔ検定を用いて行った。Ｐ＜０．０５を統計的有意差ありとした。値は平均値の標準誤差で示した。
　全ての実験は、防衛医科大学校の動物実験のための倫理指針に従って実行し、防衛医科大学校動物実験委員会（所沢市、埼玉県、日本）によって認定された。
［実施例１］
　動物：この研究で使用したC57BL/6マウスは、１２時間の明暗周期（照明の点灯時間は７時～１９時）と２２±２℃の室温の条件下で管理した。マウスは自由摂餌及び自由摂水下で飼育した。この研究で使用した全てのマウスは、同齢の同腹仔であった。
　麻酔薬及び水素処理：脳の発達期にある６日齢（Ｐ６）のマウスを、母親のいるケージから移動した直後に、操作グローブの付いた多湿なチャンバーにマウスを置いた。空気、酸素（空気とは別に）、水素、セボフルランを混合して、最終的に酸素３０％、水素１．３％、セボフルラン３％となるように調製した麻酔薬混合ガスを前記マウスに吸入投与した。ガスの総流量は２Ｌ／分、麻酔薬の投与時間は６時間であった。酸素及び麻酔薬の分率は、ガス分析システム（Capnomac Ultima, GE Healthcare, 東京都、日本）を用いて測定した。水素ガス濃度は、企業（Breath Lab CO., 奈良県、日本）でガスクロマトグラフィーを使用して測定した。麻酔薬に曝露中、マウスを３８±１℃に加温したマットの上で保温した。
［実施例２］
　空気、酸素（空気とは別に）、水素及びセボフルランを混合して、最終的に酸素が３０％、水素が０．６％、セボフルラン（３％）となるように麻酔薬混合ガスを調製した以外は実施例１と同様に行った。
［実施例３］
　空気、酸素（空気とは別に）、水素及びセボフルランを混合して、最終的に酸素が３０％、水素が０．３％、セボフルラン（３％）となるように麻酔薬混合ガスを調製した以外は実施例１と同様に行った。
［実施例４］
　空気、酸素（空気とは別に）、水素及びデスフルランを混合して、最終的に酸素が３０％、水素が１．３％、デスフルラン（５．７％）となるように麻酔薬混合ガスを調製した以外は実施例１と同様に行った。
［実施例５］
　空気、酸素（空気とは別に）及び水素を混合して、酸素が３０％、水素が１．３％の混合ガスを麻酔薬と同時吸入させながら、プロポフォール（１００ｍｇ／ｋｇ　ｉｐ）の腹腔内投与と同時に、併用して吸入投与した以外は実施例１と同様に行った。
［実施例６］
　空気、酸素（空気とは別に）、水素及びセボフルランを混合して、最終的に酸素が３０％、水素が１．３％、セボフルラン（２％）となるように麻酔薬混合ガスを調製した以外は実施例１と同様に行った。
［比較例１］
　空気、酸素（空気とは別に）及びセボフルランを混合して、最終的に酸素が３０％、セボフルラン（３％）となるように麻酔薬混合ガスを調製した以外は、実施例１と同様に行った。
［比較例２］
　空気、酸素（空気とは別に）及びデスフルランを混合して、最終的に酸素が３０％、デスフルラン（５．７％）となるように麻酔薬混合ガスを調製した以外は、実施例１と同様に行った。
［比較例３］
　空気及び酸素（空気とは別に）を混合して、酸素が３０％の混合ガスを麻酔薬と同時吸入させながら、プロポフォール（１００ｍｇ／ｋｇ　ｉｐ）の腹腔内投与と同時に、併用して吸入投与した以外は実施例１と同様に行った。
［試験例１－Ａ］
　タンパク質抽出物の精製：タンパク質抽出物の調製は、Kodama M.et al., Anesthesiology,2011；115：979-991に記載したように、ウェスタンブロット法により実施した。以下に方法を簡単に記載する。マウスの前脳を速やかに取り出し、５０ｍＭのトリスHCl、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのNaCl、１％のNP-40、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、プロテアーゼ阻害薬混合物（Complete; Roche Diagnostics, ペンツベルク, ドイツ）及び脱リン酸化酵素阻害薬（２０ｍＭのグリセロリン酸、１ｍＭのNa3VO4、２ｍＭのNaF）を含んだ、４倍量のホモゲナイゼーションバッファ中で均質化した。続いて、ホモジネートを１５，０００ｇ、３０分間、４℃の条件で遠心分離した。上澄み溶液を分離し、使用時まで－８０℃で保管した。各試料のタンパク質濃度は、ビシンコニン酸タンパク質定量キット（Pierce, Rockford, IL）を用いて測定した。
　ウェスタンブロット分析：ウェスタンブロット法は、Kodama M.et al., Anesthesiology,2011；115：979-991に記載した方法で実施した。以下に方法を簡単に記載する。ホモジネートをドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動に供した。その後、タンパク質をポリフッ化ビニリデン膜（Immobilon-P; Millipore, Bedford, MA）に転写した。ブロットは、抗－ポリ－（アデノシン二リン酸リボース）－ポリメラーゼ(抗－ＰＡＲＰ)（ウサギポリクローナル; Cell Signaling Technology）又は抗－β－アクチン(マウスモノクローナル; Sigma, St. Louis, MO)抗体と免疫反応した。続いて、ペルオキシダーゼ複合型二次抗体を加えて、ブロットをインキュベートした。タンパク質バンドは、化学発光検出器（SuperSignal West Pico; Pierce）を用いて可視化した。分解ＰＡＲＰバンドの定量は、β－アクチンで標準化した。二元配置分散分析とそれに続くボンフェローニのポストホックテスト（一つのグループにつき、ｎ＝３－６のマウス）を使用して、比較を実施した。
　前記前脳の抽出物について、分解ＰＡＲＰ（アポトーシス細胞死のバイオマーカー）への抗体を使用して、ウェスタンブロットによる分析を実施した。分析結果を図１Ａに示す。分解ＰＡＲＰバンドの定量化の結果を図１Ｂに示す。図１Ａ及びＢから、酸素３０％含有ガス又は酸素３０％及び水素１．３％を含有するガスのみに曝露したマウス脳の分解ＰＡＲＰの免疫活性は検出下限以下であったが、酸素３０％及びセボフルラン３％を含有するガスに６時間曝露したマウス（比較例１）では、分解ＰＡＲＰの生成反応が誘導された。一方、酸素３０％、水素１．３％及びセボフルラン３％を含有するガスに曝露したマウス（実施例１）では、酸素３０％を含有するガス中のセボフルランに曝露したマウスと比較して、分解ＰＡＲＰに対する免疫活性の著しい低下が観察され（すなわち、水素ガスがＰＡＲＰの分解を抑制した。）、１．３％の水素ガスが新生仔マウスのセボフルラン曝露によって引き起こされる神経細胞アポトーシスを阻害することが確認された。二元配置分散分析（two-way ANOVA）によって、これらの有意差が確認され、水素吸入の主要な効果（Ｆ＝１２．１７、Ｐ＜０．０１）、セボフルラン投与の主要な影響（Ｆ＝４５．６６、Ｐ＜０．０００１）、及び相互作用（水素投与×セボフルラン投与；Ｆ＝１５．２８、Ｐ＜０．０１）を示した。
　比較例１の分解ＰＡＲＰの定量値を１００％としたとき、実施例１～３の分解ＰＡＲＰの相対的な定量値は、それぞれ、実施例１は約４５％、実施例２は約５０％、実施例３は約５５％減少し、分解ＰＡＲＰの定量値は有位に減少した。実施例６においても、実施例１と同様に、神経細胞アポトーシスが有意に減少した。これらのことから、本発明が、セボフルランの曝露によって引き起こされる神経細胞アポトーシスを、水素を用いない場合に比べて、４０％以上も阻害できることが示された。
［試験例１－Ｂ］
　［試験例１－Ａ］と同様にして、実施例４と比較例２について評価を行った。比較例２の分解ＰＡＲＰの定量値を１００％としたとき、実施例４の分解ＰＡＲＰの相対的な定量値は、４７．７％減少し、分解ＰＡＲＰの定量値は有位に減少した。このことから、本発明が、デスフルランの曝露によって引き起こされる神経細胞アポトーシスを４５％以上も阻害することが示された。
［試験例１－Ｃ］
　［試験例１－Ａ］と同様にして、実施例４と比較例３について評価を行った。比較例３の分解ＰＡＲＰの定量値を１００％としたとき、実施例５の分解ＰＡＲＰの相対的な定量値は、５５．１％減少し、分解ＰＡＲＰの定量値は有位に減少した。このことから、本発明が、プロポフォールの曝露によって引き起こされる神経細胞アポトーシスを５０％以上も阻害することが示された。
［試験例２］
　病理組織学的な研究：免疫組織化学的染色は、Kodama M.et al., Anesthesiology,2011；115：979-991及びSatoh Y.et al., J Neurosci,2011；31：11953-11967に記載した方法で実施した。以下にその方法を簡単に記載する。４％のパラホルムアルデヒドを含有する０．１Ｍリン酸バッファーで、マウスを経心臓的に灌流した。頭蓋骨を開け、頭部を少なくとも２時間、同じバッファーに浸した。その後、脳を頭蓋骨から取り出し、パラフィン包埋した断片（５μｍ厚）を使って病理組織学的に分析した。断片は、確立された方法に従ってキシレン中でパラフィンを剥離し、グレードエタノールシリーズ（graded ethanol series）を使って水和させた。抗原賦活化処理は、抗原賦活化溶液（Antigen Unmasking Solution; Vector Laboratories, Burlingame, CA）を用い、オートクレーブで５分間加熱（１２１℃）することにより実施した。その後、バックグラウンドの染色を薄くするため、断片をブロッキング試薬（Protein Block, Serum-Free; Dako, Glostrup, デンマーク）で３０分間処理した。続いて、断片を一次抗体と共に、多湿のチャンバーの中で、一晩４℃でインキュベートした。この研究で使用した一次抗体は、抗－活性カスパーゼ－３（ウサギポリクローナル;Cell Signaling Technology, Beverly, MA）及び抗－４－ヒドロキシ－２－ノネナール（anti-4-HNE）（マウスモノクローナル;日本老化制御研究所、静岡県、日本）抗体であった。
　明視野染色のために、ペルオキシダーゼ複合型二次抗体（Dako EnVision+ system; Dako）を加えて断片を恒温処理した。免疫反応性は、製造元のプロトコルに従い、３，３－ジアミノベンジン四塩化物（ＤＡＢ, Vector Laboratories）を使って検出した。最後に、断片をヘマトキシリンで対比染色した。蛍光染色では、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ　５４６－複合型-抗マウスＩｇＧ抗体（Life Technologies, Eugene, OR）を加えて断片をインキュベートした。
　Kodama M.et al., Anesthesiology,2011；115：979-991に記載したように、製造元のプロトコルに従い、in situのアポトーシス検出キット（ApopTag; Chemicon, Temecula, CA）を用いて、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼを用いたニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）法を実施した。活性を検出するためにＤＡＢを使用した。断片はヘマトキシリンで対比染色した。
　一つのグループにつき、実施例１及び比較例１と同じ条件で麻酔に暴露した８から１０匹のマウスから採取したサンプルを、それぞれの試験に供した。活性カスパーゼ３陽性又はＴＵＮＥＬ陽性の細胞の数のカウントは、処理条件を知らない試験者が実施した。
　活性カスパーゼ－３（アポトーシス細胞死の別のバイオマーカー）に対する抗体を用いて組織学的分析を実施した（図２）。カスパーゼ－３の活性を調べるため、断片を免疫化学的に染色した。ウェスタンブロットによる分析で、上記で記載したように、酸素３０％及び水素１．３％を含有するガスに曝露されたマウスのアポトーシスが、酸素３０％を含有するガスに曝露したマウスと同じレベルであったことが示されたことから、３つのグループに対してのみ、組織学的定量を実施した：(i)酸素３０％を含有するガス（以降、コントロールと示す）、(ii)酸素３０％及びセボフルラン３％を含有するガス（以降、セボフルランと示す）（比較例１）及び(iii)酸素３０％、水素１．３％及びセボフルラン３％を含有するガス（以降、セボフルラン＋水素と示す）（実施例１）。麻酔を６時間掛けた直後の脳のある領域を模擬コントロールとして比較した時、６時間のセボフルラン曝露（比較例１）によって、活性カスパーゼ－３陽性の細胞数の著しい増加が誘発された（図２Ｂ）。一方で、セボフルランのみの曝露と比較して、セボフルラン＋水素の曝露（実施例１）では、マウスの活性カスパーゼ－３陽性の細胞の数は顕著に少なかった（図２及び図３）。図２及び図３から、セボフルランによって引き起こされる、発達期の脳における神経細胞アポトーシスを、水素ガスが緩和することが明らかである。我々はまた、ＴＵＮＥＬ法を細胞レベルでのアポトーシス細胞死の測定法として実施した（図４）。麻酔６時間後のＴＵＮＥＬ染色のパターンは、活性カスパーゼ－３の染色パターンと似ていた。これらの結果から、１．３％水素は新生仔のセボフルラン曝露によって引き起こされる神経細胞アポトーシスを著しく低下させることが示された。
　ヒドロキシラジカルが脂質に作用すると、脂質過酸化物となって４－ＨＮＥを産生する。そのため、４－ＨＮＥは、脂質の過酸化及び酸化ストレスのマーカーとして広く利用されている。図５は、ニューロンをセボフルランに６時間暴露した時（図５Ｂ、比較例１）、模擬コントロール（図５Ａ）と比較して、より多くの脂質過酸化が誘発されたことを示す。一方で、セボフルラン＋水素に暴露したマウス（実施例１）の脳の４－ＨＮＥの染色は（図５Ｃ）、セボフルランのみを暴露した場合（図５Ｂ）と比較して著しく減少した。これらの結果から、新生仔マウスの３％セボフルラン暴露は脳内の酸化ストレスを誘発するが、水素が酸化ストレスを減少させることが確認された。
［試験例３］
　行動試験：行動研究に供したマウスは全て、実施例１及び比較例１と同じ条件で麻酔に暴露した同齢・同腹仔のオスであった。３週齢のマウスを母親から離し、３又は４匹のマウスがいるケージに収容した。所定の年齢で、それらに行動試験（麻酔薬の影響を評価するため、長期記憶障害評価のコントロールとしてのオープンフィールド試験、短期記憶障害の評価のためのＹ字型迷路における自発的交替行動試験、長期記憶障害の評価のための恐怖条件付け試験、社会性試験を行った。社会性試験については、社会的相互作用試験の他、そのコントロールとして新規性試験及び嗅覚試験を行った。）を受けさせた。それぞれのマウスの動きを観察し、コンピュータ作動ビデオ追跡システム（SMART; バルセロナ、スペイン）を用いて解析した。試験では、アームを持った装置を使用し、マウスの足がアームに４本全て入った数をカウントした。装置はトライアル毎に掃除した。この研究で用いた装置は全て、O’Hara & Co.,LTD（東京都,日本）製のものであった。同じマウスの集団を、全ての試験に供した。
　オープンフィールド試験：新しい環境に対する情動反応を、Satoh Y.et al., J Neurosci,2011；31：11953-11967に記載した方法を用いて、オープンフィールド試験によって測定した。行動は１０分間の総移動距離（メートル）で測定した。試験は１２週齢のマウスに対して実施した。結果を図６Ａに示す。
　Ｙ字型迷路における自発的交替行動試験：空間作業記憶を評価するため、Satoh Y.et al., J Neurosci,2011；31：11953-11967に記載した方法で、Ｙ字型迷路試験を実施した。左右対称のアクリル製のＹ字型迷路は、１２０℃で分かれている３つのアーム（２５×５ｃｍ）からなり、高さ１５ｃｍの透明な壁で囲われていた。マウスをそれぞれ、Ｙ字型迷路の中央に置き自由に８分間の探索をさせ、アームへ侵入した連続回数又は総回数を記録した。交替反応（alternation）の割合は、連続する３回の進入が３つの全アームへの進入であった時の回数を、交替反応の最大可能数（アームへの総進入回数から２を引いた値）で除した後、１００を乗じた数である。試験は１２週齢のマウスに対して実施した。結果を図６Ｂに示す。
　恐怖条件付け試験：恐怖条件付け試験を、Satomoto M.et al.,Anesthesiology 2009;110:628-637に記載した方法で実施した。以下に方法を簡単に記載する。マウスを特殊なケージに入れ、２０秒間８０ｄＢの白色雑音を聞かせた。２０秒目に１秒間１ｍＡのフットショック（foot shock）を与え、この刺激を１分サイクルで３回繰り返した。刺激した２４時間後にフットショックを与えたマウスをケージに戻し、マウスがフリージング（１秒間の持続時間中に体のどの部分も動かさない状態）する時間を５分間計測した（恐怖条件付けテスト状況試験）。４８時間後に全く違う場所の違う形状のケージにマウスを入れ、白色雑音のみを聞かせて、マウスがフリージングする時間を３分間計測した（恐怖条件付けテスト音試験）。フリージング反応は、ビデオ追跡システムで記録し、恐怖記憶の指数とした。試験は１３週齢のマウスに対して実施した。この試験に供したマウスは、その後のいずれの試験にも使用しなかった（オープンフィールド試験及びＹ字型迷路における自発的交替行動試験に使用したのと同じマウスのグループを試験に供した）。条件付けをしてから２４時間後に、条件付けを行ったチャンバーの中にマウスを入れて、フリージングを測定した（状況による恐怖反応）結果を図６Ｃに示す。条件付けをしてから４８時間後に、全く違う場所の違う形状のケージにマウスを入れ、白色雑音のみを聞かせて、フリージングを測定した結果を図６Ｄに示す。
　社会性試験：社会性を確認するテストは、社会的相互作用試験、新規性試験、嗅覚試験の３つの試験を行った。
　社会的相互作用に対する能力を試験するために、Satoh Y.et al., J Neurosci,2011；31：11953-11967に記載した方法で、社交性試験を実施した。相互作用の標的として、生物ターゲット（ケージに入れられた成体マウス）と無生物ターゲット（ケージに入れられたダミーマウス）のどちらを優先的に選択するかについて、オープンフィールドチャンバーで試験を実施した。生物又は無生物のターゲットを円柱型のケージの中に置き、臭いを嗅ぐことはできるが最小限の接触しかできないようにした。円柱型のケージは、高さ１０ｃｍ、直径は９ｃｍであり、柵の間隔は７ｍｍであった。直接ケージの臭いを嗅ぐ動作を、７０ｌｕｘの照明条件下で１０分間観察し点数化した。試験は１２週齢のマウスに対して実施した（コントロール：ｎ＝１８；　セボフルラン：ｎ＝２０；　セボフルラン＋水素：ｎ＝１９）。全ての生物ターゲットは野生型の雄性マウスを用いた。結果を図７Ａに示す。
　嗅覚試験：嗅覚試験を、Satoh Y.et al., J Neurosci,2011；31：11953-11967に記載した方法に、多少の変更を加えて実施した。以下に方法を簡単に記載する。マウスを、初日に新しい食べ物（ブルーベリーチーズ）の香りに慣らした。４８時間の摂食制限の後、埋められた食べ物を見つけ出すまでに要した時間を測定した：ブルーベリーチーズのかけらを、清潔なケージの中の敷藁の２ｃｍ下に埋めた。試験は１２週齢のマウスに対して実施した（社会性試験に使用したのと同じマウスのグループを試験に供した）。結果を図７Ｂに示す。
　新規物試験：新規物試験を、Satoh Y.et al., J Neurosci,2011；31：11953-11967に記載した方法で実施した。マウスを個別に収容し、１０分間の間に無生物の新規物（小さな赤いチューブ）に関わっていた時間の合計を測定した。試験は１２週齢のマウスに対して実施した（社会性試験及び嗅覚試験に使用したのと同じマウスのグループを試験に供した）。結果を図７Ｃに示す。
　新しい環境に対する情動反応を評価するために実施したオープンフィールドテストにおける１０分間の総移動距離については、グループ間に、統計学的な有意差は無かった（コントロール：ｎ＝１８；　セボフルラン：ｎ＝２０；　セボフルラン＋水素：ｎ＝１９）（図６Ａ）。よって、全身麻酔薬は情動反応に関して影響を与えないことが示された。
　作業記憶は、複雑な認知的作業を遂行するための、情報を一時的に保持する能力である（Saxe MD et al., Proc Natl Acad Sci USA 2006;103:17501-17506、Jones MW, Curr Mol Med 2002;2:639-647）。空間作業記憶を評価するために実施したＹ字型迷路試験において（図６Ｂ）、グループ間に統計学的な有意差は観察されなかった（オープンフィールドテストに使用したのと同じマウスのグループを試験に供した）。よって、全身麻酔薬は短期記憶に影響しないことが示された。
　新生仔のセボフルラン曝露により引き起こされる長期記憶損傷に及ぼす、水素の影響を評価するため、水素の同時投与あり（実施例１）又はなし（比較例１）のセボフルランに曝露したマウスに、成体となった段階で、恐怖条件付け試験を受けさせた（図６Ｃ及びＤ）。恐怖条件付け状況試験において（図６Ｃ）、セボフルランに曝露したマウス（比較例１）の、刺激を与えてから２４時間後のフリージング（すくみ行動）は、コントロールの動物と比較して、状況学習において著しく低下し（一元配置分散分析、Ｆ＝７．２２、Ｐ＝０．００１７；コントロールとセボフルランの比較において、ニューマン-クルーズポストホックテスト、Ｐ＜０．０１）、新生仔のセボフルラン曝露が、成体における長期記憶に損傷を与えることが示された。それとは対照的に、セボフルラン＋水素に曝露したマウスは（実施例１）、セボフルランのみを投与したマウス（比較例１）と比較して行動が改善し（セボフルランとセボフルラン＋水素の比較は、ニューマン-クルーズポストホックテスト、Ｐ＜０．０１）、コントロールとほぼ同等のパフォーマンスを示した（コントロールとセボフルラン＋水素の比較は、ニューマン－クルーズポストホックテスト、Ｐ＜０．０５）。また、恐怖条件付け音試験において（図６Ｄ）、コントロールと比較して、セボフルラン曝露のマウス（比較例１）は、条件付けしてから４８時間後の音試験におけるフリージングも、著しく低下した（一元配置分散分析、Ｆ＝１２．０８、Ｐ＝０．０００１；コントロールとセボフルランの比較において、ニューマン-クルーズポストホックテスト、Ｐ＜０．００１）。一方で、セボフルラン＋水素に曝露したマウス（実施例１）は、セボフルランのみに曝露したマウス（比較例１）と比較してより優秀な行動を示し（セボフルランとセボフルラン＋水素の比較において、ニューマン－クルーズポストホックテスト、Ｐ＜０．００１）、コントロールとほぼ同等のパフォーマンスをした（コントロールとセボフルラン＋水素の比較において、ニューマン－クルーズポストホックテスト、Ｐ＜０．０５）。
　これらの結果から、新生仔の全身麻酔薬曝露によって引き起こされる記憶障害の種類は長期記憶障害であり、かかる記憶障害を、水素が予防及び／又は軽減することが示された。
　マウスは社交性を持った生物種であり、社会的相互作用挙動を示す（Kamsler A et al.,Mol Neurobiol 2004;29:167-178）。我々はこれまでに、新生仔の時にセボフルランに曝露されたマウスが、成体になった時に社会的行動欠陥を示すことを報告した（Satomoto M.et al.,Anesthesiology 2009;110:628-637）。今回、新生児のセボフルラン曝露によって引き起こされる社会的行動欠陥が、水素ガスによって抑制可能か否かを調査するため、マウスの社交性試験を実施した（図７）。
　生物又は無生物をターゲットとした相互作用試験において、全てのグループは、無生物に関わるよりも相当に多くの時間を、生物との交流に費やした（ｔ検定、全てＰ＜０．００１）。しかしながら、コントロールと比較し、新生仔の時にセボフルランに曝露したマウスは（比較例１）、生物ターゲットと交流する時間が減少した。水素を同時投与されたマウスは（実施例１）、コントロールとほぼ同等の行動をし、セボフルランによって引き起こされる社会的行動欠陥が水素をセボフルランと同時投与することより予防できることが示された（図７Ａ）。一元配置分散分析によって、これらの結果が裏付けられた（Ｆ＝６．１２、Ｐ＝０．００４、ニューマン-クルーズポストホックテスト、コントロールとセボフルランの比較ではＰ＜０．０１、コントロールとセボフルラン＋水素の比較ではＰ＜０．０５）。嗅覚試験（一元配置分散分析、Ｆ＝０．５０、Ｐ＝０．７１、図７Ｂ）及び新規物試験（一元配置分散分析、Ｆ＝０．０４、Ｐ＝０．９６、図７Ｃ）において、セボフルランのみの投与（比較例１）とセボフルラン＋水素投与（実施例１）のグループ間で、顕著な違いを検出できなかったことから、上記の社会的相互作用の違いが、嗅覚の損傷、又は新規物に対する興味の喪失に起因していたとは言えない。そのため、水素は新生仔のセボフルラン曝露によって引き起こされる社会的行動欠陥を抑制し得るといえる。
　本発明により、全身麻酔薬と水素とを組み合わせて使用することにより、脳（例えば、発達期）の麻酔誘発性神経障害を予防及び／又は軽減することができる医薬を提供することが可能となった。さらに、本発明は、簡便で、副作用がなく、効率に作用し、さらに安価であることから、例えば、産科及び小児科医療において有効な医薬を提供することができる。

Claims (31)

  1. 　全身麻酔薬と、水素を組み合わせてなる、ヒト又はヒト以外の動物用医薬。
  2. 　全身麻酔薬と、水素とを併用で投与されることを特徴とする、ヒト又はヒト以外の動物の全身麻酔のための医薬。
  3. 　麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するために使用される請求項１又は２に記載の医薬。
  4. 　麻酔薬誘発性神経障害が、神経細胞アポトーシスに付随するものである請求項３に記載の医薬。
  5. 　全身麻酔薬が、水素と併用されるように用いられることを特徴とする、全身麻酔薬を含有する麻酔薬誘発性神経障害の予防及び／又は軽減用医薬。
  6. 　全身麻酔薬が吸入麻酔薬又は液状の静脈麻酔薬であり、水素が水素ガスである請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬。
  7. 　水素ガス濃度が、医薬中０．１５～７％（ｖ／ｖ）である請求項６に記載の医薬。
  8. 　胎児、新生児、乳児、幼児、小児又は高齢者を対象とする請求項１～７のいずれか１項に記載の医薬。
  9. 　全身麻酔薬が、亜酸化窒素、イソフルラン、エンフルラン、メトキシフルラン、セボフルラン、デスフルラン、ジエチルエーテル、プロポフォール及びミダゾラムからなる群より選ばれた１種以上の麻酔薬である請求項１～８のいずれか１項に記載の医薬。
  10. 　麻酔薬誘発性神経障害が、神経運動障害、神経認知障害、精神認知障害又は自閉症である請求項３、５～９のいずれか１項に記載の医薬。
  11. 　麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するために、全身麻酔薬と水素とを併用する医薬の調製方法。
  12. 　麻酔薬誘発性神経障害が、神経細胞アポトーシスに付随するものであることを特徴とする請求項１１に記載の調製方法。
  13. 　全身麻酔薬が吸入麻酔薬又は液状の静脈麻酔薬であり、水素が水素ガスである請求項１１又は１２に記載の調製方法。
  14. 　水素ガス濃度が、医薬中０．１５～７％（ｖ／ｖ）である請求項１３に記載の調製方法。
  15. 　医薬が、胎児、新生児、乳児、幼児、小児又は高齢者を対象とする請求項１１～１４のいずれか１項に記載の調製方法。
  16. 　水素と組み合わせて用いられる全身麻酔剤製造のための全身麻酔薬の使用。
  17. 　全身麻酔薬と水素とを組み合わせてなる医薬の製造のための全身麻酔薬と水素の使用。
  18. 　麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減するための医薬の製造のための全身麻酔薬と水素の使用。
  19. 　麻酔薬誘発性神経障害が、神経細胞アポトーシスに付随するものである請求項１８に記載の使用。
  20. 　全身麻酔薬が吸入麻酔薬又は液状の静脈麻酔薬であり、水素が水素ガスである請求項１６～１８のいずれか１項に記載の使用。
  21. 　水素ガス濃度が、医薬中０．１５～７％（ｖ／ｖ）である請求項２０に記載の使用。
  22. 　胎児、新生児、乳児、幼児、小児又は高齢者を対象とする請求項１６～１８のいずれか１項に記載の使用。
  23. 　全身麻酔薬が、亜酸化窒素、イソフルラン、エンフルラン、メトキシフルラン、セボフルラン、デスフルラン、ジエチルエーテル、プロポフォール及びミダゾラムからなる群より選ばれた１種以上の麻酔薬である請求項１６～１８のいずれか１項に記載の使用。
  24. 　麻酔薬誘発性神経障害が、神経運動障害、神経認知障害、精神認知障害又は自閉症である請求項１８に記載の使用。
  25. 　全身麻酔薬と水素とを併用して対象に投与する工程を有する、麻酔薬誘発性神経障害を予防及び／又は軽減する方法。
  26. 　全身麻酔薬が吸入麻酔薬又は液状の静脈麻酔薬であり、水素が水素ガスである請求項２５に記載の方法。
  27. 　水素ガス濃度が、医薬中０．１５～７％（ｖ／ｖ）である請求項２６に記載の方法。
  28. 　投与対象が、胎児、新生児、乳児、幼児、小児又は高齢者である請求項２５に記載の方法。
  29. 　全身麻酔薬が、亜酸化窒素、イソフルラン、エンフルラン、メトキシフルラン、セボフルラン、デスフルラン、ジエチルエーテル、プロポフォール及びミダゾラムからなる群より選ばれた１種以上の麻酔薬である請求項２５に記載の方法。
  30. 　麻酔薬誘発性神経障害が、神経運動障害、神経認知障害、精神認知障害又は自閉症である請求項２５に記載の方法。
  31. 　麻酔薬誘発性神経障害が、神経細胞アポトーシスに付随するものである請求項２５に記載の方法。
PCT/JP2013/065094 2012-05-31 2013-05-30 全身麻酔薬と、水素とを組み合わせてなる、医薬 WO2013180240A1 (ja)

Priority Applications (15)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20147035945A KR20150018832A (ko) 2012-05-31 2013-05-30 전신 마취약과 수소를 조합하여 이루어지는, 의약
BR112014029260A BR112014029260A2 (pt) 2012-05-31 2013-05-30 medicamento para um ser humano ou um animal não humano, medicamento para anestesia geral, medicamento para a prevenção e/ou alívio de um déficit neurológico induzido por anestésico, método para parar o mesmo, uso de um anestésico geral, uso de uma anestésico geral e hidrogênio para a produção de um medicamento e método para prevenir e/ou aliviar um déficit neurológico induzido por anestésico
IN2090MUN2014 IN2014MN02090A (ja) 2012-05-31 2013-05-30
CA2874579A CA2874579A1 (en) 2012-05-31 2013-05-30 Medicine comprising combination of general anesthetic and hydrogen
NZ701553A NZ701553A (en) 2012-05-31 2013-05-30 Medicine comprising combination of general anesthetic drug and hydrogen
CN201380028933.5A CN104394873A (zh) 2012-05-31 2013-05-30 全身麻醉药与氢组合而成的药品
SG11201407489TA SG11201407489TA (en) 2012-05-31 2013-05-30 Medicine comprising combination of general anesthetic drug and hydrogen
EP13796554.7A EP2857026A4 (en) 2012-05-31 2013-05-30 MEDICAMENT COMPRISING A COMBINATION OF A GENERAL ANESTHETIC DRUG AND HYDROGEN
US14/397,229 US20150079197A1 (en) 2012-05-31 2013-05-30 Medicine comprising combination of general anesthetic and hydrogen
JP2014518736A JP6168420B2 (ja) 2012-05-31 2013-05-30 全身麻酔薬と、水素とを組み合わせてなる、医薬
AU2013268366A AU2013268366A1 (en) 2012-05-31 2013-05-30 Medicine comprising combination of general anesthetic drug and hydrogen
RU2014152690A RU2014152690A (ru) 2012-05-31 2013-05-30 Лекарственный препарат, содержащий сочетание анестетика общего действия и водорода
MX2014014543A MX2014014543A (es) 2012-05-31 2013-05-30 Medicina que comprende la combinacion de un anestesico general e hidrogeno.
IL235718A IL235718A0 (en) 2012-05-31 2014-11-16 A drug was included a combination of general anesthetic and hydrogen
HK15103729.5A HK1205450A1 (en) 2012-05-31 2015-04-16 Medicine comprising combination of general anesthetic drug and hydrogen

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012-125535 2012-05-31
JP2012125535 2012-05-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013180240A1 true WO2013180240A1 (ja) 2013-12-05

Family

ID=49673427

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/065094 WO2013180240A1 (ja) 2012-05-31 2013-05-30 全身麻酔薬と、水素とを組み合わせてなる、医薬

Country Status (16)

Country Link
US (1) US20150079197A1 (ja)
EP (1) EP2857026A4 (ja)
JP (1) JP6168420B2 (ja)
KR (1) KR20150018832A (ja)
CN (1) CN104394873A (ja)
AU (1) AU2013268366A1 (ja)
BR (1) BR112014029260A2 (ja)
CA (1) CA2874579A1 (ja)
HK (1) HK1205450A1 (ja)
IL (1) IL235718A0 (ja)
IN (1) IN2014MN02090A (ja)
MX (1) MX2014014543A (ja)
NZ (1) NZ701553A (ja)
RU (1) RU2014152690A (ja)
SG (1) SG11201407489TA (ja)
WO (1) WO2013180240A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016131778A (ja) * 2015-01-21 2016-07-25 大陽日酸株式会社 麻酔装置及び水素含有麻酔ガス中の水素濃度制御方法
JP2021529758A (ja) * 2018-06-29 2021-11-04 マンセル、ジョン 麻酔誘発性神経毒性の処置のための組成物及び方法
JP2022021279A (ja) * 2020-07-21 2022-02-02 ＭｉＺ株式会社 薬の副作用、薬の副作用に関連する症状、および／または、治療に伴う副作用を予防および／または改善するための組成物

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180338995A1 (en) * 2017-05-23 2018-11-29 Perricone Hydrogen Water Company, Llc Systems and methods for treatments using hydrogen and/or noble gases
US11129848B2 (en) * 2017-08-08 2021-09-28 Perricone Hydrogen Water Company, Llc Medication enhancement using hydrogen
US11123365B2 (en) 2019-11-18 2021-09-21 Perricone Hydrogen Water Company, Llc Compositions comprising palmitoylethanolamide and hydrogen water, and methods thereof
CN117861037A (zh) * 2022-10-11 2024-04-12 上海氢医医疗科技有限公司 氢气吸入治疗自闭症

Non-Patent Citations (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AGGLETON; BROWN, BEHAV BRAIN SCI, vol. 22, no. 3, 1999, pages 425 - 44
ANAND; SCALZO, BIOL. NEONATE, vol. 77, no. 2, 2000, pages 69 - 82
ANESTHESIOLOGY, vol. 111, 2009, pages 1365 - 1371
ANESTHESIOLOGY, vol. 112, 2010, pages 834 - 841
BALDUINI ET AL., BRAIN RESEARCH, vol. 859, 2000, pages 318 - 325
BEHAR ET AL., CEREBRAL CORTEX, vol. 11, 2001, pages 744 - 753
BEHAR ET AL., THE JOURNAL OF NEUROSCIENCE, vol. 19, no. 11, 1999, pages 4449 - 4461
BENTON AL; HANSHER K.: "Multilingual aphasia examination", 1978, UNIVERSITY OF IOWA PRESS
BITTIGAU ET AL., PNAS, vol. 99, no. 23, 2002, pages 15089 - 15094
BRENNEMAN ET AL., BRAIN RES DEV BRAIN RES, vol. 51, no. 1, 1990, pages 63 - 68
BRUNET ET AL., CURRENT OPINION IN NEUROBIOLOGY, vol. 11, 2001, pages 297 - 305
BUTLER, TINS, vol. 22, no. 8, 1999, pages 332 - 334
CLANCY ET AL., NEUROSCIENCE, vol. 105, 2001, pages 7 - 17
COMBS D; D'ALECY L: "Motor performance in rats exposed to severe forebrain ischemia: Effect of fasting and 1,3-butanediol.", STROKE, vol. 18, 1987, pages 503 - 511
DIKRANIAN ET AL., NEUROBIOLOGY OF DISEASE, vol. 8, 2001, pages 359 - 379
DOBBING; SANDS, EARLY HUM DEV, vol. 3, 1979, pages 79 - 84
FARBER; OLNEY, DEVELOPMENTAL BRAIN RESEARCH, vol. 147, 2003, pages 37 - 45
GARCIA ET AL., SCIENCE, vol. 258, no. 5080, 1992, pages 302 - 304
GIONET T; THOMAS J; WARNER D; GOODLETT C; WASSERMAN E; WEST J: "Forebrain ischemia induces selective behavioral impairments associated with hippocampal injury in rats", STROKE, vol. 22, 1991, pages 1040 - 1047
GOEN ET AL., BEHAVIOURAL BRAIN RESEARCH, vol. 136, 2002, pages 329 - 337
GREEN, CELL, vol. 102, 2000, pages 1 - 4
GYULAI ET AL., ANESTHESIOLOGY, vol. 95, 2001, pages 585 - 593
HUA; SMITH, NATURE NEUROSCIENCE, vol. 7, no. 4, 2004, pages 327 - 332
HUANG, Y. ET AL.: "Beneficial effects of hydrogen gas against spinal cord ischemia- reperfusion injury in rabbits", BRAIN RES, vol. 1378, 2011, pages 125 - 36, XP028145848 *
IKONOMIDOU ET AL., BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY, vol. 62, 2001, pages 401 - 405
IKONOMIDOU ET AL., SCIENCE, vol. 238, 1999, pages 70 - 74
IKONOMIDOU; LECHOSLAW, LANCET NEUROLOGY, vol. 1, 2002, pages 383 - 386
INT. J. DEVL NEUROSCIENCE, vol. 27, 2009, pages 727 - 731
JEVTOVIC-TODOROVIC ET AL., THE JOURNAL OF NEUROSCIENCE, vol. 23, no. 3, 2003, pages 876 - 882
JEVTOVIC-TODOROVIC, V. ET AL.: "Early exposure to common anesthetic agents causes widespread neurodegeneration in the developing rat brain and persistent learning deficits", J NEUROSCI, vol. 23, no. 3, 2003, pages 876 - 82, XP002353922 *
JONES MW, CURR MOL MED, vol. 2, 2002, pages 639 - 647
KAGAKU DAIJITEN 3, 1993, pages 11, XP008175927 *
KAMSLER A ET AL., MOL NEUROBIOL, vol. 29, 2004, pages 167 - 178
KERR ET AL., BR J CANCER, vol. 26, no. 4, 1972, pages 239 - 257
KOBAYASHI, H. ET AL.: "Effects of hydrogen gas in a mouse cold induced brain injury model", JOURNAL OF NEUROTRAUMA, vol. 28, no. 5, 2011, pages A64, XP055178874 *
KODAMA M. ET AL., ANESTHESIOLOGY, vol. 115, 2011, pages 979 - 991
KOMURO; RAKIE, SCIENCE, vol. 260, no. 5104, 1993, pages 95 - 97
KORSMEYER ET AL., CELL DEATH AND DIFFERENTIATION, vol. 7, 2002, pages 1166 - 1173
LA. PRADELLI; M. BENETEAU; JE. RICCI, CELL. MOL. LIFE SCI., vol. 67, 2010, pages 1589 - 1597
LIU, Y. ET AL.: "Hydrogen saline offers neuroprotection by reducing oxidative stress in a focal cerebral ischemia-reperfusion rat model", MEDICAL GAS RESEARCH, 2011, XP021106488, Retrieved from the Internet <URL:http://www.medicalgasresearch.com/content/pdf/2045-9912-1-15.pdf> *
MARTINOU ET AL., NEURON, vol. 13, no. 4, 1994, pages 1017 - 1030
MASUI: "Molecular Biological Mechanism of Ischemic Neuronal Death and Brain Protection by Medication", THE JAPANESE JOURNAL OF ANESTHESIOLOGY, vol. 56, 2007, pages 248 - 270
MOLAR; BLAKEMORE, TRENDS NEUROSCI., vol. 18, no. 9, 1995, pages 389 - 397
MONTI; CONTESTABILE, EUROPEAN JOURNAL OF NEUROSCIENCE, vol. 12, 2000, pages 3117 - 3123
MOTOYAMA ET AL., SCIENCE, vol. 267, 1995, pages 1506 - 1510
NAOKO KURITA ET AL.: "Teinodo Sevoflurane o Mochiita 3 Saiji no Nanjisei Tenkan ni Taisuru Tenkan Shoten Setsujojutsu no Masui Keiken", CLINICAL PEDIATRIC ANESTHESIA: OFFICIAL JOURNAL OF THE JAPANESE SOCIETY OF PEDIATRIC ANESTHESIOLOGY, vol. 9, no. L, 2003, pages 87, XP008175668 *
NORIKO TODA ET AL.: "Kyodai Kojukaku Shinkeiga Saiboshu ni Taishite Katagawa Tsuikyu Setsujojutsu o Okonatta Nyuji 2 Shorei no Masui Keiken", THE JAPANESE JOURNAL OF ANESTHESIOLOGY, vol. 56, no. 2, 2007, pages 158 - 162, XP008175671 *
OKABE ET AL., NAT. NEUROSCIENCE, vol. 2, 1999, pages 804 - 811
OLNEY ET AL., BRAIN PATHOL, vol. 12, no. 4, 2002, pages 488 - 498
OLNEY ET AL., NEUROBIOLOGY OF DISEASE, vol. 9, 2002, pages 205 - 219
OLNEY ET AL., NEUROTOXICOLOGY, vol. 23, no. 6, 2002, pages 659 - 668
RANDT C; BROWN E.: "Administration manual: Randt Memory Test", 1983, NEW YORK: LIFE SCIENCES
REITAN RM.: "Validity of the Trail Making Test as an indicator of organic brain damage", PERCEPT MOT SKILLS, vol. 8, 1958, pages 271 - 6
SALVEEN GS; RIEDL SJ, ADV EXP MED BIOL., vol. 615, 2008, pages 13 - 23
SATOH Y. ET AL., J NEUROSCI, vol. 31, 2011, pages 11953 - 11967
SATOMOTO M. ET AL., ANESTHESIOLOGY, vol. 110, 2009, pages 628 - 637
SAXE MD ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 103, 2006, pages 17501 - 17506
See also references of EP2857026A4
SHERRARD; BOWER, CLIN EXP PHARMACOL PHYSIOL, vol. 25, no. 7-8, 1998, pages 487 - 495
SHUJI DOHI: "PGI2 Yudotai (OP-41483) no No Sekizui Ketsuryuryo to No Sekizui Ekiatsu ni Oyobosu Eikyo", THE JAPANESE JOURNAL OF ANESTHESIOLOGY, vol. 36, no. 11, 1987, pages 1790 - 1795, XP008175672 *
SLOVITER, TRENDS IN PHARMACOLOGICAL SCIENCE, vol. 23, no. 1, 2002, pages 19 - 24
V. JEVTOVIC-TODOROVIC ET AL., JOURNAL OF NEUROSCIENCE, vol. 23, 2003, pages 876 - 882
WECHSLER D.: "The Wechsler Adult Intelligence Scale-Revised (WAIS-R", 1981, PSYCHOLOGICAL CORPORATION
WILDER RT ET AL., ANESTHESIOLOGY, vol. 100, 2009, pages 796 - 804
XIANG, L. ET AL.: "Inhalation of hydrogen gas reduces liver injury during major hepatotectomy in swine", WORLD J GASTROENTEROL, vol. 18, no. 37, October 2012 (2012-10-01), pages 5197 - 204, XP055178867 *
YONAMINE, R. ET AL.: "Coadministration of hydrogen gas as part of the carrier gas mixture suppresses neuronal apoptosis and subsequent behavioral deficits caused by neonatal exposure to sevoflurane in mice", ANESTHESIOLOGY, vol. 118, no. 1, January 2013 (2013-01-01), pages 105 - 13, XP055178856 *
YOUNG ET AL., CELL DEATH AND DIFFERENTIATION, vol. 10, 2003, pages 1148 - 1155
YOUNG ET AL., NATURE MED, vol. 5, 1999, pages 448 - 453
YUAN; YANKER, NATURE, vol. 407, 2000, pages 802 - 809
ZHAN, Y. ET AL.: "Hydrogen gas ameliorates oxidative stress in early brain injury after subarachnoid hemorrhage in rats", CRIT CARE MED, vol. 40, no. 4, April 2012 (2012-04-01), pages 1291 - 6, XP055178883 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016131778A (ja) * 2015-01-21 2016-07-25 大陽日酸株式会社 麻酔装置及び水素含有麻酔ガス中の水素濃度制御方法
WO2016117538A1 (ja) * 2015-01-21 2016-07-28 大陽日酸株式会社 麻酔装置及び水素含有麻酔ガス中の水素濃度制御方法
US10596344B2 (en) 2015-01-21 2020-03-24 Taiyo Nippon Sanso Corporation Anesthesia device and method of controlling hydrogen concentration in a hydrogen-containing anesthesia gas
JP2021529758A (ja) * 2018-06-29 2021-11-04 マンセル、ジョン 麻酔誘発性神経毒性の処置のための組成物及び方法
JP2022021279A (ja) * 2020-07-21 2022-02-02 ＭｉＺ株式会社 薬の副作用、薬の副作用に関連する症状、および／または、治療に伴う副作用を予防および／または改善するための組成物
JP7019910B2 (ja) 2020-07-21 2022-02-16 ＭｉＺ株式会社 薬の副作用、薬の副作用に関連する症状、および／または、治療に伴う副作用を予防および／または改善するための組成物

Also Published As

Publication number Publication date
EP2857026A1 (en) 2015-04-08
CA2874579A1 (en) 2013-12-05
SG11201407489TA (en) 2014-12-30
BR112014029260A2 (pt) 2017-06-27
HK1205450A1 (en) 2015-12-18
JP6168420B2 (ja) 2017-07-26
RU2014152690A (ru) 2016-07-20
AU2013268366A1 (en) 2015-03-19
JPWO2013180240A1 (ja) 2016-01-21
CN104394873A (zh) 2015-03-04
IN2014MN02090A (ja) 2015-09-04
NZ701553A (en) 2016-06-24
EP2857026A4 (en) 2015-11-04
MX2014014543A (es) 2015-06-05
IL235718A0 (en) 2015-01-29
US20150079197A1 (en) 2015-03-19
KR20150018832A (ko) 2015-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6168420B2 (ja) 全身麻酔薬と、水素とを組み合わせてなる、医薬
Perez-Zoghbi et al. Dexmedetomidine-mediated neuroprotection against sevoflurane-induced neurotoxicity extends to several brain regions in neonatal rats
Bertolino et al. Beneficial effects of co‐ultramicronized palmitoylethanolamide/luteolin in a mouse model of autism and in a case report of autism
Straiko et al. Lithium protects against anesthesia-induced developmental neuroapoptosis
Karen et al. Effect of propofol in the immature rat brain on short-and long-term neurodevelopmental outcome
Calderón-Garcidueñas et al. Early Alzheimer’s and Parkinson’s disease pathology in urban children: friend versus foe responses—it is time to face the evidence
Mathis et al. Management and therapeutic perspectives in amyotrophic lateral sclerosis
Fu et al. Inhibiting NLRP3 inflammasome with MCC950 ameliorates perioperative neurocognitive disorders, suppressing neuroinflammation in the hippocampus in aged mice
Keremi et al. Stress and salivary glands
Siopi et al. Etazolate, an α-secretase activator, reduces neuroinflammation and offers persistent neuroprotection following traumatic brain injury in mice
Adilijiang et al. The protective effects of Areca catechu extract on cognition and social interaction deficits in a cuprizone‐induced demyelination model
Zhong et al. Treatment with harmine ameliorates functional impairment and neuronal death following traumatic brain injury
ES2784240T3 (es) Composiciones farmacéuticas que comprenden DGLA y uso de las mismas
Bird et al. Neonatal ethanol exposure triggers apoptosis in the murine retrosplenial cortex: Role of inhibition of NMDA receptor-driven action potential firing
Guimarães et al. Nitrous oxide as an adjunctive therapy in major depressive disorder: a randomized controlled double-blind pilot trial
Flores et al. Neonatal olfactory bulbectomy enhances locomotor activity, exploratory behavior and binding of NMDA receptors in pre-pubertal rats
Shelton et al. The effects of a novel inhibitor of tumor necrosis factor (TNF) alpha on prepulse inhibition and microglial activation in two distinct rodent models of schizophrenia
Ju et al. Increasing the interval between repeated anesthetic exposures reduces long‐lasting synaptic changes in late post‐natal mice
Harding et al. Prenatal exposure to valproic acid and treatment with intranasal oxytocin have sex-specific effects on behavior in Long Evans rats
Wei et al. Bumetanide attenuates sevoflurane‐induced neuroapoptosis in the developing dentate gyrus and impaired behavior in the contextual fear discrimination learning test
Blaylock et al. New concepts in the development of schizophrenia, autism spectrum disorders, and degenerative brain diseases based on chronic inflammation: A working hypothesis from continued advances in neuroscience research
US20180318338A1 (en) Methods and compositions for the prevention of suicide, homicide and self-harming behaviors
Sant'Anna et al. Environmental factors and their impact on chronic pain development and maintenance
Chen et al. Serotoninergic projection from dorsal raphe nucleus to insular cortex is involved in acute itch sensation processing in mice
Qi et al. Depressive‐like history alters persistent pain behavior in rats: Opposite contribution of frontal cortex and amygdala implied

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13796554

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014518736

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14397229

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: P1199/2014

Country of ref document: AE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 235718

Country of ref document: IL

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2874579

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2014/014543

Country of ref document: MX

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013796554

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20147035945

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: IDP00201408245

Country of ref document: ID

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014152690

Country of ref document: RU

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013268366

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20130530

Kind code of ref document: A

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112014029260

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112014029260

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20141124