WO2013170994A1 - Markersequenzen für rheumatoide arthritis - Google Patents

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WO2013170994A1
WO2013170994A1 PCT/EP2013/056627 EP2013056627W WO2013170994A1 WO 2013170994 A1 WO2013170994 A1 WO 2013170994A1 EP 2013056627 W EP2013056627 W EP 2013056627W WO 2013170994 A1 WO2013170994 A1 WO 2013170994A1
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marker
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rheumatoid arthritis
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PCT/EP2013/056627
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Angelika LÜKING
Peter Schulz-Knappe
Heike GÖHLER
Martin GAMER
Carmen THEEK
Daniel Chamrad
Anna TELAAR
Matthias VON DARL
Matthias Schneider
Jessica SCHWERMANN
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for the identification of marker sequences for rheumatoid arthritis, the novel marker sequences found by means of the method and their diagnostic use. Furthermore, the present invention relates to a novel method for the identification of marker sequences for rheumatoid arthritis, the novel marker sequences found by means of the method and their diagnostic use. Furthermore, the present invention relates to a novel method for the identification of marker sequences for rheumatoid arthritis, the novel marker sequences found by means of the method and their diagnostic use. Furthermore, the
  • Marker sequences for rheumatoid arthritis in particular a protein biochip or beads and their use.
  • Protein biochips are gaining an increasing industrial
  • Protein biochips require the necessary proteins to be available. In particular,
  • the cDNA of a particular tissue in a bacterial or a eukaryotic expression vector, such as yeast, is cloned.
  • the vectors used for the expression are generally characterized by the fact that they carry inducible promoters, with which the timing of protein expression can be controlled.
  • expression vectors have sequences for so-called
  • Affinity epitopes or proteins on the one hand for the specific detection of the recombinant fusion proteins by means of a directed against the affinity epitope
  • Antibody on the other hand becomes the specific one
  • Expression libraries could also be expressed and purified at high throughput (Braun P., Hu, Y., Shen,
  • antibody-presenting arrangements are also described (Lal et al (2002) Antibody arrays: An embryonic but growing technology, DDT, 7, 143-149, Kusnezow et al., (2003) Antibody microarrays: An evaluation of production parameters, Proteomics, 3, 254-264).
  • RA Arthritis
  • the arrays are incubated with the serum samples and conjugated to anti-human IgG via Alexa Fluor 647
  • EP 1 731 608 A1 discloses a method to identify "RA susceptible genes" by gene mapping using microsatellite markers and PCR technique The genes were TNXB, NOTCH4 (chromosomes 6), RAB6A, MPRL48, FLJ11848, UCP2 and UCP3 (chromosome 11) in human genomic DNA
  • EP 1 731 608 A1 claims a marker gene for an RA assay consisting of a partial DNA sequence of one of the marker genes found and comprising at least one SNP in the human genomic DNA of RA comprising recovering partial DNA sequences corresponding to one of the marker genes from a subject to be examined, determining the nucleotide sequence of the partial DNA sequence and comparing the nucleotide sequence with the corresponding nucleotide sequence derived from a
  • test kit for RA comprising one of the marker genes or one of them
  • derived primer a polypeptide encoded by one of the marker genes and a screening method.
  • WO 2009/138408 A2 claims a diagnostic method in which an autoantigen marker comprising the catalytic domain of BRAF or an antibody fragment thereof, for
  • Detection of RA is used and optionally also anti-PAD4 antibodies are detected in the biological sample of the subject to be examined.
  • WO 2009/138408 A2 discloses a detection kit for the detection of anti-BRAF
  • WO 2007/039280 AI claims a method for
  • WO 2007/039280 A1 further claims the use of a panel comprising anti-CCP and ANA for the diagnosis of RA and a test kit.
  • WO 2005/032328 A2 claims a method for the detection of RA in a sample of a patient wherein the amount of one or more markers selected from Table 1 (679 markers are mentioned there) or Table 2 (some of the markers from Table 1) compared to a check with normal
  • 2005/032328 A2 also discloses to distinguish with certain markers between progressive and non-progressive RA.
  • WO 2005/032328 A2 the markers for RA in the serum of patients are identified by means of MS.
  • WO 2005/061692 AI claims a protein microarray
  • WO 2005/061692 A1 also mentions a method for screening RA using said proteins, a drug containing one of the proteins, and a kit for screening RA. In order to identify the above-mentioned proteins, WO 2005/061692 A1 proposes to compare serum of patients with that of healthy control persons (page 6, paragraph 3).
  • Antibodies for the diagnosis of RA in CCP-negative patients and use for monitoring during therapy with infliximab There are groups of patients with RA and CCP and with RA and without CCP, patients with other rheumatic diseases (Psoriatic Rheumatism, Primary Sjögren Syndrome, Ankylosis Spondylitis) and healthy controls
  • Microarray which includes this protein complex and a
  • WO 2009/030226 discloses marker sequences for rheumatoid arthritis and their diagnostic use together with a
  • Marker sequences for rheumatoid arthritis in particular a protein biochip and its use.
  • Marker sequences for diagnosis of RA methods for diagnosing RA using these marker sequences, methods for stratifying, an array of marker sequences, an assay / protein biochip, the use of the assembly, Diagnostics comprising the marker sequences, a target for treatment and therapy, and the use of the marker sequences to perform apheresis.
  • the RA-specific expression clones were obtained in DE 10 2007 041 656 AI in that 10 or more patient samples were individually screened against a cDNA expression library and identified by comparison with 10 or more healthy samples.
  • Fig. 1 the differential
  • the object of the present invention is therefore the
  • the invention provides a method for identifying marker sequences for rheumatoid arthritis (RA), comprising the steps of: a) selecting marker sequence candidates by screening protein biochips representing a cDNA expression library with at least 10 patient samples and at least 10 samples of healthy subjects and wherein each sample is measured individually and
  • Partial proteins are coupled, d) validation of the coupled to the beads
  • Marker sequence candidates by means of samples of patients with RA and samples of healthy persons by using marker sequences for RA with the samples of
  • marker sequences to be examined or the sequences binding to these marker sequences are immobilized on a solid, planar support.
  • beads which therefore differ, among other things, in terms of their sensitivity and specificity of conventional microarrays.
  • bead arrays are either impregnated with beads at different concentrations
  • Fluorescent dye or e.g. created by barcode technology.
  • the beads are addressable and can be used to detect specific binding events occurring on their own
  • Bead technology is based on microscopically small spherical beads or platelets called microspheres or beads. These beads can be used analogously to ELISA and Western Blot as
  • Solid phase for biochemical detection reactions serve.
  • bead types which differ for example in their fluorescent color and each of which carries its own specific detection reagent on the surface. In this way, a corresponding number of different detection reactions can be carried out simultaneously in a very small sample volume.
  • bead arrays specific interactions of two defined biochemical compounds are detectable.
  • the bead-based validation is characterized by a
  • marker sequences with particular specificity can be obtained. For example, marker sequences with which subgroups of patients can be diagnosed within the indication RA.
  • steps c) and d) are carried out in the presence of CPP (cytochrome c peroxidase)
  • Marker sequences are more sensitive to the diagnosis of rheumatoid arthritis than CCP. Using the marker sequences validated in the presence of CCP, a subgroup of RA patients can be diagnosed. In carrying out the
  • the invention relates to a method for identifying marker sequences for rheumatoid arthritis (RA) comprising the steps of: a) selecting marker sequence candidates by screening protein biochips representing a cDNA expression library with at least 10 patient samples and at least 10 samples from healthy subjects, and each sample being measured individually and Marker sequence candidates for RA by a
  • Partial proteins are coupled and wherein the beads also CCP (cytochrome c peroxidase)
  • Marker sequence candidates from c) by means of samples from patients with RA and samples from healthy persons by using marker sequences for RA with the samples from
  • Patients with RA show an interaction and show a lesser or no interaction with the samples of healthy persons and the marker sequences SEQ ID No. 29 to 79, SEQ ID No. 120 to 170, SEQ ID No. 211 to 261, SEQ ID No. 274, SEQ ID NO. 276, SEQ ID No. 278, SEQ ID No. 285 to 288, SEQ ID No. 291, SEQ ID No. 294, SEQ ID No. 296, SEQ ID NO. 298, SEQ ID No. 305 to 308, SEQ ID No. 311, SEQ ID no. 314, SEQ ID No. 316, SEQ ID No. 318, SEQ ID no. 325 to 328, SEQ ID No. 331 are obtained.
  • An embodiment of the method according to the invention is characterized in that an interaction between marker sequence candidate and the samples in step d) is detected by means of a fluorescence signal and wherein the intensity of the fluorescence signal with the strength of the
  • the invention also relates to a marker sequence for
  • Rheumatoid arthritis obtainable by a method according to the invention and wherein the marker sequence is selected from the group of the sequences SEQ ID No. 1 to 182 and SEQ ID. No. 274 to 313, one of the sequences SEQ ID No. 1 to 182 and SEQ ID No. 274 to 313 homologous sequence or a partial sequence of SEQ ID No. 1 to 182 and SEQ ID. No. 274 to 313 or a SEQ ID No. 1 to 182 or SEQ ID. No. 274 to 313 encoded protein or by a partial sequence of SEQ ID NO. 1 to 182 or SEQ ID. No. 274 to 313 encoded protein or by a homologous sequence of SEQ ID NO. 1 to 182 or SEQ ID. No. 274 to 313 encoded protein and a genomic sequences having one of the sequences SEQ ID NO. 1 to 182 or SEQ ID. No. 274 to 313.
  • the invention also relates to a marker sequence for
  • Marker sequence is selected from the group of the sequences SEQ ID NO. 29 to 79, SEQ ID No. 274, SEQ ID No. 276, SEQ ID No. 278, SEQ ID No. 285 to 288, SEQ ID No. 291 and SEQ ID. No. 120 to 170, SEQ ID No. 294, SEQ ID No. 296, SEQ ID No. 298, SEQ ID no. 305 to 308, SEQ ID No. 311, one of the sequences SEQ ID no. 29 to 79, SEQ ID No. 274, SEQ ID No. 276, SEQ ID NO. 278, SEQ ID No. 285 to 288, SEQ ID No. 291 or SEQ ID NO. 120 to 170, SEQ ID No. 294, SEQ ID No.
  • SEQ ID No. 120 to 170 SEQ ID No. 294, SEQ ID NO. 296, SEQ ID No. 298, SEQ ID No. 305 to 308, SEQ ID No. 311 encoded protein or by a partial sequence of SEQ ID NO. 29 to 79, SEQ ID No. 274, SEQ ID No. 276, SEQ ID NO. 278, SEQ ID No. 285 to 288, SEQ ID No. 291 or SEQ ID. No. 120 to 170, SEQ ID No. 294, SEQ ID No. 296, SEQ ID No. 298, SEQ ID No. 305 to 308, SEQ ID No. 311 encoded protein or by a homologous sequence of SEQ ID No. 29 to
  • SEQ ID No. 311 encoded protein or a genomic sequences, one of the sequences SEQ ID No. 29 to 79, SEQ ID NO. 274, SEQ ID No. 276, SEQ ID No. 278, SEQ ID No. 285 to 288, SEQ ID No. 291 or SEQ ID. No. 120 to 170, SEQ ID NO. 294, SEQ ID No. 296, SEQ ID No. 298, SEQ ID No. 305 to 308, SEQ ID No. 311 encoded protein or a genomic sequences, one of the sequences SEQ ID No. 29 to 79, SEQ ID NO. 274, SEQ ID No. 276, SEQ ID No. 278, SEQ ID No. 285 to 288, SEQ ID No. 291 or SEQ ID. No. 120 to 170, SEQ ID No. 294, SEQ ID No. 296, SEQ ID No. 298, SEQ ID No. 305 to 308, SEQ ID NO. 311 includes.
  • the invention also relates to a marker sequences for
  • Rheumatoid arthritis obtainable by a method according to the invention and wherein the marker sequence is selected from the group of the sequences SEQ ID No. 183 to 273, SEQ ID No. 314 to 333, in particular SEQ ID No. 211 to 261, SEQ ID No. 314, SEQ ID no. 316, SEQ ID No. 318, SEQ ID No. 325 to 328, SEQ ID NO. 331st
  • the invention also provides the use of one or more marker sequence (s) according to the invention for the diagnosis of rheumatoid arthritis.
  • One embodiment relates to the use according to the invention, wherein the marker sequence (s) on or from one to
  • One embodiment relates to the use according to the invention, characterized in that 2 or 3, preferably 4 or 5, more preferably 6, 7 or 8 or more different
  • Marker sequences for example 10 to 20 or 30 or more different marker sequences on or from one to
  • One embodiment relates to the use according to the invention, characterized in that the marker sequence (s) is / are applied to a solid support, the solid support being selected from filters, membranes, wafers, for example silicon wafers, glass, metal, plastic, chips,
  • mass spectrometric targets for example magnetic, coated or labeled beads, such as
  • Fluorophore-labeled beads or Luminex beads Fluorophore-labeled beads or Luminex beads.
  • the invention also provides a method for the diagnosis of rheumatoid arthritis, wherein a.) At least one marker sequence according to the invention is applied to a solid support, preferably to a bead and b.) Is brought into contact with body fluid or tissue extract of a patient and
  • the detection of such an interaction can, for example, by a probe, in particular by an antibody
  • the invention also provides a method for
  • Marker sequence is used to examine a sample of the patient.
  • One embodiment relates to a method according to the invention for the diagnosis of rheumatoid arthritis, wherein the
  • the invention also provides an arrangement comprising or consisting of one or more inventive
  • the invention also provides an assay or protein array comprising an arrangement according to the invention.
  • the invention also provides the use of an inventive arrangement or an assay or protein array according to the invention for the identification and / or
  • Characterization of a substance for rheumatoid arthritis containing means for detecting a binding success characterized in that an arrangement or an assay or Protein array with a.
  • Substance is brought into contact and b.) A binding success is detected.
  • the invention also provides a diagnostic agent for
  • Diagnosis of rheumatoid arthritis containing at least one marker sequence according to the invention and optionally further excipients and additives.
  • the invention also provides a target for the treatment or therapy of rheumatoid arthritis, wherein the target is selected from the marker sequences according to the invention.
  • the invention also provides the use of one or more marker sequence (s) according to the invention as
  • an arrangement comprising one or more marker sequences according to the invention is preferably used as affinity material for carrying out the apheresis or blood washing, wherein substances from body fluids of a patient with
  • Rheumatoid arthritis such as blood or plasma
  • Corresponding devices are known in the art, e.g. chromatographic devices containing beads, spheres or chromatographic material, e.g. in a column having the marker sequences of the invention and therefore e.g. (Auto) can selectively withdraw antibodies.
  • the invention also provides the use of at least one marker sequence according to the invention for identifying a subgroup of patients within the group of
  • Marker sequences for the diagnosis of rheumatoid arthritis wherein at least one marker sequence selected from the group of marker sequences SEQ ID No. 1 to 91 or SEQ ID No. 274 to 293 and / or SEQ ID No. 92 to 182 or SEQ ID No. 294 to 313 and / or the genomic sequences that one of the
  • Marker sequence (s) can be identified by a method according to the invention.
  • Method comprises the steps of a) identification of marker sequence candidates by
  • Partial proteins are coupled to the amino acids
  • Biomarkers for Rheumatoid Arthritis for example CCP
  • Biomarker for rheumatoid arthritis such as CCP is performed.
  • a preferred embodiment of the invention relates to the use of marker sequences according to the invention for the diagnosis of rheumatoid arthritis in patients who are CCP-negative, wherein at least one marker sequence selected from the group of marker sequences SEQ ID No. 29 to 79 and / or SEQ ID No. 120 to 170 and / or the genomic sequences which have one of the sequences SEQ ID No. 29 to 79 or 120 to 170 and / or one by the sequences SEQ ID No. 29 to 79 or 120 to 170 coded protein or a partial sequence or a homologue of the sequences SEQ ID No. 29 to 79 or SEQ ID No. 120 to 170 or a protein encoded by the partial sequence or the homologous sequence to or from a to be examined
  • the marker sequences validated in the presence of CCP are more sensitive to the diagnosis of rheumatoid
  • Another particular embodiment of the invention relates to the use of marker sequences according to the invention for the diagnosis of rheumatoid arthritis at an early stage of RA, wherein RA can not yet be detected by means of CCP at this early stage and at least one
  • Marker sequence selected from the group of marker sequences SEQ ID no. 29 to 79 and / or SEQ ID No. 120 to 170 and / or the genomic sequences which have one of the sequences SEQ ID No. 29 to 79 or 120 to 170 and / or one by the sequences SEQ ID No. 29 to 79 or 120 to 170 encoded protein or a partial sequence or a homologue of the sequences SEQ ID NO. 29 to 79 or SEQ ID No. 120 to 170 or a protein encoded by the partial sequence or the homologous sequence to or from a patient to be examined
  • marker sequence (s) for the diagnosis of rheumatoid arthritis, characterized in that the determination is carried out by means of in-vitro diagnosis.
  • Diagnostics for the diagnosis of rheumatoid arthritis containing at least one marker sequence selected from the group of marker sequences SEQ ID No. 1 to 91 or SEQ ID No. 274 to 293 and / or SEQ ID No. 92 to 182 or SEQ ID No. 294 to 313 and / or the genomic sequences that one of the marker sequences.
  • Marker sequence candidates for RA by comparing the results of the screens selected with the RA patient samples and the results of the screens obtained with the samples from healthy subjects, b) preparing the proteins encoded by the marker sequence candidates and / or or partial proteins (peptides) by expression of the cDNA of the marker sequence candidates, c) production of beads on the one or more of the proteins produced in step b) and / or
  • Partial proteins (peptides) and optionally CCP are coupled, d) validation of the coupled to the beads
  • Marker sequence candidates by means of samples of patients with RA and samples of healthy persons by using marker sequences for RA with the samples of
  • Patients with RA show an interaction and show a lesser or no interaction with the samples of healthy individuals and where the marker sequences SEQ ID No. 1 to 182, SEQ ID. No. 183 to 273, SEQ ID No. 274 to 313 and SEQ ID No. 314 to SEQ ID No. 333, or in the presence of CCP, the marker sequences SEQ ID No. 29 to 79, SEQ ID NO. 120 to 170, SEQ ID No. 211 to 261, SEQ ID No.
  • the marker sequences according to the invention were then expressed and validated after coupling of the expressed marker sequence candidates to Luminex beads with the aid of the Luminex beads, z. comparative against known biomarkers for rheumatoid arthritis and as described in the embodiments. As a result, highly specific marker sequences for rheumatoid arthritis could be identified.
  • Beads (beads, globules, originally also called latex particles) denote so-called microspheres or
  • Microparticles used as carriers for biomolecules in tests and assays are required, which are produced by special chemical processes. These methods are known to the person skilled in the art. Beads for different applications are also commercially available (for example from Progen Biotechnik GmbH). Beads can be made of different materials
  • Beads can be labeled with different dyes or dye mixtures and provided with coatings.
  • Biomolecules can be coupled to their surface. For this purpose, different coupling methods are available, which are known to the person skilled in the art, for example adsorption or
  • the surface of the beads may be modified such that directional coupling of the biomolecules on the bead surface, e.g. in connection with spacers, tags or special modifications is possible and whereby the
  • rheumatoid arthritis is for example after
  • At least 2 to 5 or 10, preferably 30 to 50, marker sequences or 50 to 100 or more marker sequences are added to or from one
  • the marker sequences according to the invention can also be combined, supplemented, fused or extended with known biomarkers for this indication.
  • the determination of the marker sequences takes place outside the human body and the determination takes place in an ex vivo / in vitro diagnosis.
  • the invention also has the object of providing a diagnostic device or an assay, in particular a protein biochip, which is useful for the rheumatoid
  • Diagnosis in the sense of this invention means the positive detection of rheumatoid arthritis by means of
  • Marker sequences of the invention and the assignment of patients to the indication rheumatoid arthritis.
  • diagnosis includes medical diagnostics and
  • diagnosis also includes the
  • the invention relates to a method for
  • At least one Marker sequence according to the invention is determined on a patient to be examined. Also included is the
  • therapy control also includes the classification of patients into responders and non-responders with regard to a therapy or its course of therapy.
  • the term "stratification" includes in particular the
  • patient is understood to mean any subject - human or mammal - with the proviso that the subject is being examined for rheumatoid arthritis.
  • marker sequences in the sense of this invention means that the nucleic acid sequence, for example the mRNA, cDNA or the respectively obtainable polypeptide or Protein are significant for rheumatoid arthritis.
  • the mRNA or cDNA or the particular polypeptide or protein obtainable therefrom may interact with substances from the body fluid or tissue extract of a rheumatoid arthritis patient (e.g., antigen (epitope) / antibody (paratope) interaction).
  • substances from the body fluid or tissue extract of a rheumatoid arthritis patient e.g., antigen (epitope) / antibody (paratope) interaction.
  • Marker sequence selected from the group of marker sequences SEQ ID o. 1 to 182 or SEQ ID No. 274 to 313, the
  • An interaction between the body fluid or the tissue extract of a patient and the marker sequences according to the invention is detected, for example a binding, in particular a binding substance to at least one of the marker sequences according to the invention or, in the case of a cDNA, hybridization with a suitable substance under selected conditions, in particular stringent conditions (eg as defined in J. Sambrook, EF Fritsch, T. Maniatis
  • Hybridization conditions is hybridization in 4 x SSC at 37 ° C followed by several washing steps in 1 x SSC
  • Body fluid in particular blood, whole blood, blood plasma, blood serum, patient serum, urine, cerebrospinal fluid, synovial fluid or a tissue extract of the patient.
  • the marker sequences according to the invention can be present in a significantly higher or lower expression rate or concentration in the test subject compared to
  • Marker sequence in a healthy or a subject without RA is an indication of rheumatoid arthritis and the diagnosis of RA.
  • Marker sequences according to the invention can be determined, for example, by means of proteomics or nucleic acid blots.
  • the protein is preferred for a protein
  • the marker sequences according to the invention recognize autoantibodies which are responsible for RA are specific or that are formed in the formation and progression of RA disease and / or are formed increased or decreased. Two or more marker sequences according to the invention can be used to detect autoantibody profiles or changes in
  • SEQ ID o. 1 to 91 and 274 to 293 are the subject of Table 7 and can be clearly identified by the respective cited database entry (also by means of the Internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ( see RefSeq Accession or Gl Accession).
  • the invention also relates to the full-length sequences of the marker sequences according to the invention and the marker sequences as defined in the tables on the known database entries as well as those in the attached sequence listing
  • Protein sequences SEQ ID No. 183 to 273 and SEQ ID No. 314 to 333 in particular the nucleic acid sequences SEQ ID No. 29 to 79 and SEQ ID No. 120 to 170, SEQ ID No. 274, SEQ ID No. 276, SEQ ID NO. 278, SEQ ID No. 285 to 288, SEQ ID No. 291, SEQ ID NO. 294, SEQ ID No. 296, SEQ ID No. 298, SEQ ID No. 305 to 308, SEQ ID NO. 311, and the protein sequences SEQ ID No. 211 to 261, SEQ ID No. 314, SEQ ID No. 316, SEQ ID No. 318, SEQ ID no. 325 to 328, SEQ ID No.
  • the clone sequences according to the invention SEQ ID no. 1 to 91 and SEQ ID No. 274 to 293 are partial sequences, at least with high homology, the marker sequences according to the invention SEQ ID No. 92 to 182 and SEQ ID No. 294 to 313 dar. Particularly preferred are the marker sequences SEQ ID NO. 29 to 79, SEQ ID No. 274, SEQ ID No. 276, SEQ ID No. 278, SEQ ID NO. 285 to 288, SEQ ID No. 291 and the proteins encoded by these marker sequences.
  • marker sequences having P values less than or equal to 0.006, preferably less than or equal to 0.001 or less than or equal to 0.0001, more preferably less than or equal to 0.00001 (see FIG 1, Tables 8 and 8a).
  • the marker sequences SEQ ID No. SEQ ID no. 4 to 15, partial sequences and homologues of SEQ ID no. 4 to 15, as well as the coded thereby peptides / proteins preferred because these marker sequences have
  • homologs of the marker sequences according to the invention are included.
  • homologues homologues
  • Homologues can be protein or
  • Nucleic acid sequences are those sequences which are 50 to 100 nucleotides or amino acids, preferably 70-120 nucleotides or
  • Amino acids particularly preferably 100 to 200 nucleotides or amino acids of one of the marker sequences SEQ ID no. 1 to 333.
  • the marker sequences also include such
  • nucleotide sequence for example the cDNA sequence and the corresponding amino acid sequence, such as
  • Marker sequence may be represented in different amounts in one or more areas on a solid support, for example a bead. This allows a variation of the sensitivity.
  • the regions may each comprise a total of marker sequences, i. a sufficient number
  • marker sequences in particular 2 to 5 or 10 or more marker sequences and, if appropriate, further nucleic acids and / or proteins, in particular biomarkers. However, at least 96 to 25,000 (numerically) or more of different or identical marker sequences and more are preferred
  • Nucleic acids and / or proteins in particular biomarkers. Further preferred are more than 2,500, particularly preferred
  • Another object of the invention relates to an array of marker sequences containing at least one marker sequence a cDNA selected from the group SEQ ID No. 92 to 182 and 294 to 313 or each protein encoded thereby.
  • the array contains at least 2 to 5 or 10, preferably 30 to 50 marker sequences or 50 to 100 or more marker sequences.
  • array means synonymously “array” and insofar as this "array” is used to identify substances to be bound to marker sequences, this is to be understood as an “assay” or a diagnostic device.
  • array means synonymously “array” and insofar as this "array” is used to identify substances to be bound to marker sequences, this is to be understood as an “assay” or a diagnostic device.
  • marker sequences in the form of a grid on a solid support. Furthermore, such arrangements are preferred which allow a high density array of marker sequences and spotting the marker sequences. Such high density spotted assemblies are
  • the term "assay" or diagnostic device also includes such embodiments of a device, such as ELISA (e.g., individual wells
  • Examples are diagnostic ELISA kits from the company Phadia or multiplex ELISA kits
  • Marker sequences according to the invention or combinations of marker sequences are robot-supported on membranes
  • Example "Euroline” from Euroimmun AG Western blot
  • example “Euroline-WB” from Euroimmun AG immunochromatographic methods (for example lateral flow immunoassays, marker sequences or combinations of marker sequences are applied to test strips (Membranen, US Pat
  • Marker sequences are present and available in different quantities based on a spot. Furthermore, the
  • Marker sequences on the solid support e.g., by serial dilution series of e.g.
  • the invention relates to an assay or protein biochip or bead (s) (bead-based assay) from an arrangement containing inventive
  • the marker sequences are present as clones.
  • Such clones can be obtained, for example, by means of a cDNA expression library according to the invention (Büssow et al., 1998 (supra)).
  • such expression libraries become
  • These expression vectors preferably contain inducible promoters. The induction of
  • Expression can e.g. by means of an inductor, such as IPTG.
  • IPTG inductor
  • Suitable expression vectors are described in Terpe et al. (Terpe T Appl Microbiol Biotechnol 2003 Jan; 60 (5): 523-33).
  • Expression libraries are known to the person skilled in the art, these can be prepared according to standard works, such as Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Laboratory, 2nd edition (1989), CSH press, Cold Spring Harbor, New York Further preferred are such expression libraries
  • tissue specific e.g., human tissue, especially human organs.
  • expression libraries are also included according to the invention, which can be obtained by exon trapping. Instead of expression library can be spoken synonymously from an expression bank.
  • protein biochips or beads or corresponding expression libraries which have no redundancy (so-called: Uniclone® library) and according to the teachings of WO 99/57311 and WO 99/57312, for example
  • the clones may not be such as transformed bacteria, recombinant phage or transformed cells of mammals, insects, fungi, yeasts or plants.
  • the clones are fixed on a solid support, spotted or immobilized. Therefore, the invention relates to an arrangement, wherein the
  • Marker sequences are present as clones.
  • marker sequences may be in the form of a fusion protein in the particular form
  • the tag may be one such as c-myc, His tag, Arg tag, FLAG, alkaline phosphatase, V5 tag, T7 tag or strep tag, HAT tag, NusA, S-tag, SBP tag , Thioredoxin, DsbA, a fusion protein, preferably a cellulose-binding one
  • Protein Protein, calmodulin-binding protein, glutathione S-transferase or lacZ.
  • a marker sequence can also be made up of several individual ones
  • marker sequences This may involve cloning individual fragments into a large common fragment and expressing this combined fragment.
  • solid support includes embodiments such as a filter, a membrane, a magnetic or fluorophore-labeled bead
  • Silicon wafer, glass, metal, plastic, a chip, a Mass spectrometric target or a matrix Silicon wafer, glass, metal, plastic, a chip, a Mass spectrometric target or a matrix.
  • a filter and beads are preferred according to the invention.
  • the filter is PVDF, nitrocellulose or nylon (e.g., Immobilon P Millipore, Protran Whatman, Hybond N + Amersham).
  • this corresponds to a grid having the order of a microtiter plate (8-12 wells strips, 96 wells, 384 wells or more), a silicon wafer, a chip, a mass spectrometric target or a matrix.
  • beads are used as beads.
  • bead-based multiplex assays are used.
  • the analysis and evaluation of the bead-based assays can be carried out, for example, with a Luminex analysis system, which is carried out on the method of flow cytometry using two different lasers.
  • CVs coefficients of variation
  • Luminex ie bead-based protein arrays
  • Luminex ie bead-based protein arrays
  • several devices can be additionally saved, i. E. Protein printer, hybridizer and array reader, and be replaced by a device.
  • the UNIarray concept is not bound to Luminex, but can also be used on other platforms such as Luminex. Randox, VBC Genomics etc are used.
  • the high measurement accuracy and the low VKs of the individual measurements allow the use of better and new statistical
  • the invention relates to an assay or protein biochip for identifying and
  • Characterizing a substance for rheumatoid arthritis characterized in that an arrangement or assay according to the invention is brought into contact with a.) At least one substance to be investigated, and b.) A binding success
  • the substance to be tested may be any native or non-native biomolecule
  • the binding success is carried out, for example, using commercially available image analysis software (GenePix Pro (Axon Laboratories), Aida (Raytest), ScanArray (Packard Bioscience).
  • protein to marker sequence e.g., protein to marker sequence
  • Antigen / antibody or corresponding "means for detecting the binding success" can, for example, by means of
  • reporter enzymes such as alkaline
  • a readout is e.g. by means of a microarray laser scanner, a CCD camera or visually.
  • the invention relates to a drug / drug or prodrug for rheumatoid
  • the invention also relates to the use of a device according to the invention or an assay for the screening of drugs for rheumatoid arthritis.
  • Figure 2 Volcano plot rheumatoid arthritis vs. control
  • Figure 3 Volcano plot CCP negative in the RA group vs.
  • Protein biochips each performed from a cDNA expression library of a patient and a healthy subject and the differential clones are detected by fluorescence labeling and bioinformatorisch evaluated.
  • Aquaporin 4 for Neuromyolitis Optica various cytokines, typical autoimmune markers etc. produced and measured together with the 3,500 proteins. The inclusion of known
  • Example 2 Selection of Patients and Subjects for the Validation of the marker sequence candidates.
  • RA rheumatoid arthritis
  • control subjects without rheumatoid arthritis
  • Group N N Mean Median SD Min. Max .
  • Table 7 summarizes the clone sequences SEQ ID No. 1 to 91 and 274 to 293 which are specific for rheumatoid arthritis and which are used to identify the sequences specific for rheumatoid arthritis SEQ ID No. 92 to 273 and 294 to 333 were used. The details of the sequence data are shown in the attached sequence listing.
  • vs RA 9322 interactor 10 TRIP10 ref NM. _004240 gi 11342676 lipopolysaccharide
  • Control 54522 ankyrin repeat ANKRD16 ref NM. _019046 gi 58331111 vs RA domain 16
  • Control poly (ADP vs. RA ribose) ref NM. , 0010426
  • Control 3303 heat shock HSPA1A ref NM. _005345 gi 194248072 vs RA 70kDa protein

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Identifizierung von Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis, die mit Hilfe des Verfahrens gefundenen neuen Markersequenzen und deren diagnostische Verwendung. Ferner betrifft die Erfindung diagnostische Vorrichtungen enthaltend solche Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis, insbesondere einen Proteinbiochip oder Beads (Kügelchen) und deren Verwendung.

Description

Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis
Besehreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Identifizierung von Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis, die mit Hilfe des Verfahrens gefundenen neuen Markersequenzen und deren diagnostische Verwendung. Ferner betrifft die
Erfindung diagnostische Vorrichtungen enthaltend solche
Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis, insbesondere einen Proteinbiochip oder Beads und deren Verwendung.
Proteinbiochips gewinnen eine zunehmende industrielle
Bedeutung in der Analytik und Diagnostik sowie in der
Pharmaentwicklung . Proteinbiochips haben sich als
Screeninginstrumente etabliert.
Hierbei wird die schnelle und hochparallele Detektion einer Vielzahl spezifisch bindender Analysemoleküle in einem
einzigen Experiment ermöglicht. Zur Herstellung von
Proteinbiochips ist es erforderlich, die benötigten Proteine zur Verfügung zu haben. Hierzu haben sich insbesondere
Protein-Expressionsbibliotheken etabliert. Die Hochdurchsat z- Klonierung von definierten offenen Leserahmen ist eine
Möglichkeit (Heyman, J.A., Cornthwaite, J., Foncerrada, L., Gilmore, J.R., Gontang, E., Hartman, K.J., Hernandez, C.L., Hood, R., Hull, H.M., Lee, W.Y., Marcil, R., Marsh, E.J., Mudd, K.M., Patino, M.J., Purcell, T.J., Rowland, J.J.,
Sindici, M.L. and Hoeffler, J.P. (1999) Genome-scale cloning and expression of individual open reading frames using
topoisomerase I-mediated ligation. Genome Res, 9, 383-392; Kersten, B., Feilner, T . , Kramer, A., Wehrmeyer, S., Possling, A., Witt, I., Zanor, M.I., Stracke, R., Lueking, A.,
Kreut zberger, J., Lehrach, H. and Cahill, D.J. (2003)
Generation of Arabidopsis protein chip for antibody and serum Screening. Plant Molecular Biology, 52, 999-1010; Reboul, J., Vaglio, P., Rual, J.F., Lamesch, P., Martinez, M., Armstrong,
C. M., Li, S., Jacotot, L., Bertin, . , Janky, R., Moore, T., Hudson, J.R., Jr . , Hartley, J.L., Brasch, M.A., Vandenhaute, J., Boulton, S., Endress, G.A., Jenna, S., Chevet, E.,
Papasotiropoulos , V., Tolias, P.P., Ptacek, J., Snyder, M., Huang, R., Chance, M.R., Lee, H., Doucette-Stamm, L., Hill,
D. E. and Vidal, M. (2003) C. elegans ORFeome version 1.1:
experimental verification of the genome annotation and
resource for proteome-scale protein expression. Nat Genet, 34, 35-41.; Walhout, A.J., Temple, G.F., Brasch, M.A., Hartley, J.L., Lorson, M.A., van den Heuvel, S. and Vidal, M. (2000) GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol, 328, 575-592). Allerdings hängt ein solcher Ansatz stark mit dem Fortschritt der Genom-Sequenzierungspro ekte und der Annotierung dieser Gensequenzen zusammen. Darüber hinaus ist die Bestimmung der exprimierten Sequenz aufgrund
differenzieller Spleißvorgänge nicht immer eindeutig. Dieses Problem kann durch die Anwendung von cDNA- Expressionsbibliotheken umgangen werden (Büssow, K., Cahill, D., Nietfeld, W., Bancroft, D., Scherzinger, E., Lehrach, H. and Walter, G. (1998) A method for global protein expression and antibody Screening on high-density filters of an arrayed cDNA library. Nucleic Acids Research, 26, 5007-5008; Büssow, K., Nordhoff, E., Lübbert, C, Lehrach, H. and Walter, G.
(2000) A human cDNA library for high-throughput protein expression Screening. Genomics, 65, 1-8; Holz, C, Lueking, A. , Bovekamp, L., Gut ähr, C., Bolotina, N., Lehrach, H. and Cahill, D.J. (2001) A human cDNA expression library in yeast enriched for open reading frames. Genome Res, 11, 1730-1735; Lueking, A., Holz, C., Gotthold, C., Lehrach, H. and Cahill, D. (2000) A System for dual protein expression in Pichia pastoris and Escherichia coli, Protein Expr . Purif., 20, 372- 378) . Hierbei wird die cDNA eines bestimmten Gewebes in einen bakteriellen oder einen eukaryotischen Expressionsvektor, wie z.B. Hefe, einkloniert. Die für die Expression verwendeten Vektoren zeichnen sich im Allgemeinen dadurch aus, dass sie induzierbare Promotoren tragen, mit denen sich der Zeitpunkt der Proteinexpression steuern lässt. Darüber hinaus weisen Expressionsvektoren Sequenzen für so genannte
Affinitätsepitope oder -proteine auf, die zum einen den spezifischen Nachweis der rekombinanten Fusions-Proteine mittels eines gegen das Affinitätsepitop gerichteten
Antikörpers erlauben, zum anderen wird die spezifische
Aufreinigung über Affinitätschromatographie (IMAC) ermöglicht.
Beispielsweise wurden die Genprodukte einer cDNA- Expressionsbibliothek aus humanem fötalem Hirngewebe in dem bakteriellen Expressionssystem Escherichia coli im Hochdichte- Format auf einer Membran angeordnet und konnten erfolgreich mit unterschiedlichen Antikörpern gescreent werden. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil an Volllänge-Proteinen bei mindestens 66% liegt. Die rekombinanten Proteine aus
Expressionsbibliothek konnten darüber hinaus im Hochdurchsatz exprimiert und aufgereinigt werden (Braun P., Hu, Y., Shen,
B. , Halleck, A., Koundinya, M., Harlow, E. and LaBaer, J.
(2002) Proteome-scale purification of human proteins from bacteria. Proc Natl Acad Sei U S A, 99, 2654-2659; Büssow
(2000) supra; Lueking, A., Horn, M., Eickhoff, H., Büssow, K., Lehrach, H. and Walter, G. (1999) Protein microarrays for gene expression and antibody Screening. Analytical Biochemistry, 270, 103-111) . Solche Proteinbiochips auf der Basis von cDNA- Expressionsbibliotheken sind insbesondere Gegenstand der WO 99/57311 und WO 99/57312.
Ferner sind neben Antigen-präsentierenden Proteinbiochips ebenfalls Antikörper-präsentierende Anordnungen beschrieben (Lal et al (2002) Antibody arrays : An embryonic but rapidly growing technology, DDT, 7, 143-149; Kusnezow et al . (2003), Antibody microarrays: An evaluation of production parameters, Proteomics, 3, 254-264).
Auger et al . (2009) Annais of the Rheumatic Diseases, British Medical Association, London, GB, Bd. 68, Nr. 4, S. 591-594 offenbart ein Verfahren zur Identifizierung von IgG
Autoantikörpern in Seren von Patienten mit Rheumatoider
Arthritis (RA) . Dabei werden Serumproben von Patienten mit RA mit denen von gesunden Kontrollpersonen auf dem Invitrogen ProtoArray (8268 humane Proteine als GST Fusionsproteine, unter nativen Bedingungen gereinigt und gespottet auf eine Nitrocellulose beschichtete Glasplatte) vergleichend
untersucht. Die Arrays werden mit den Serumproben inkubiert und über Alexa Fluor 647 konjugiert an anti-human IgG
nachgewiesen. Die Auswertung eines Panels von Messwerten erfolgt über Z-Score, CIP (Chebyshev Inequality Precision) und CV (Coefficient of Variation) . In Auger et al . wurden mit diesem Verfahren die Antigene Peptidyl Arginin Deiminase 4 (PÄD4 ) , Protein Kinase Cßl (PKCßl), Phosphatidylinositol-4- Phosphate-5-Kinase Typ II γ (PIP4K2C) und v raf murine sarcoma viral oncogene homologue Bl catalytic domain (BRAF)
identifiziert. Auger et al . offenbart nicht die diagnostische Verwendung der identifizierten Antigene. EP 1 731 608 AI offenbart eine Methode, „RA anfällige Gene" durch Gene Mapping mit Hilfe von Mikrosatellit Markern und PCR Technik zu identifizieren. Mit Hilfe des Verfahrens wurden die Gene TNXB, NOTCH4 (Chromosome 6), RAB6A, MPRL48 , FLJ11848, UCP2 und UCP3 (Chromosom 11) in humaner genomischer DNA gefunden. EP 1 731 608 AI beansprucht ein Markergen für einen RA Test bestehend aus einer partiellen DNA Sequenz eines der gefunden Markergene und umfassend mindestens ein SNP in der humanen genomischen DNA. Außerdem ein Verfahren zum Nachweis von RA umfassend die Gewinnung von partiellen DNA Sequenzen, die zu einem der Markergene korrespondieren von einem zu untersuchenden Subjekt, Bestimmung der Nukleotidsequenz der partiellen DNA Sequenz und Vergleich der Nukleotidsequenz mit der korrespondierenden Nukleotidsequenz , die von einem
normalen Individuum erhalten wurde. Weiterhin einen Test Kit für RA umfassend eines der Markergene oder eines davon
abgeleiteten Primers, ein Polypeptid kodiert durch eines der Markergene und ein Screeningverfahren .
WO 2009/138408 A2 beansprucht ein diagnostisches Verfahren, bei dem ein Autoantigen-Marker, der die katalytische Domaine von BRAF oder ein Antikörper Fragment davon umfasst, zum
Nachweis von RA verwendet wird und wobei ggf. auch anti-PAD4 Antikörper in der biologischen Probe des zu untersuchenden Subjekts detektiert werden. Ferner offenbart WO 2009/138408 A2 einen Detektionskit zum Nachweis von anti-BRAF
Autoantikörpern, einen Array mit Autoantigenmarkern umfassend BRAF und PAD4 zur Diagnose von RA und die Verwendung eines Autoantigen Markers umfassend BRAF zur Diagnose von RA, vorzugsweise in Patienten, die CCP negativ sind (S. 3, Abs. 1) . In WO 2009/138408 A2 wurden die Biomarker dadurch
identifiziert, dass Serum von RA Patienten und Kontrollen (Patienten mit Spondylarthropathy (AS)), Systemic lupus erythematosus (SLE), Systemic sclerosis (SSC) und Gesunden) mit dem ProtoArray Human Protein Microarray (Invitrogen) gescreent wurden, wobei der Nachweis mittels anti-human IgG konjugiert an Alex Fluor 647 erfolgte. Ein Panel von
Messwerten wurde über Z-Score, CIP und CV ausgewertet.
WO 2007/039280 AI beansprucht ein Verfahren zur
differentiellen Diagnose von RA durch Bestimmung der
Konzentration von anti-CCP und antinuclear Antikörpern in einer Probe und Korrelation mit der Diagnose von RA. Dabei können zusätzlich die Marker CRP, SAA, IL-6, S100,
Osteopontin, RF, MMP-1, MMP-3, Haluronsäure , sCD14,
Angiogenese Marker und Produkte aus dem Metabolismus von
Knochen, Knorpel oder Synovial Membran verwendet werden. WO 2007/039280 AI beansprucht ferner die Verwendung eines Panels umfassend anti-CCP und ANA zur Diagnose von RA und einen Test- Kit . WO 2005/032328 A2 beansprucht ein Verfahren zum Nachweis von RA in einer Probe eines Patienten wobei die Menge von einem oder mehreren Markern ausgewählt aus Tabelle 1 (679 Marker sind dort genannt) oder Tabelle 2 (einige der Marker aus Tabelle 1) im Vergleich zu einer Kontrolle mit normalem
Expressionslevel des jeweiligen Markers bestimmt wird. WO
2005/032328 A2 offenbart auch, mit bestimmten Markern zwischen progressivem und nicht progressivem RA zu unterscheiden.
In WO 2005/032328 A2 werden die Marker für RA im Serum von Patienten mittels MS identifiziert. WO 2005/061692 AI beansprucht einen Protein Mikroarray
umfassend mindestens zwei der Proteine ausgewählt aus L35 Protein, Eukaryotic Translation Elongation Faktor 1 CC-2, NADH Dehydrogenase 3 (Komplex I), 24-kDa Untereinheit von Komplex I, Mitotic Kinesin-like Protein-1, Thromboxane Synthase und uncoupling protein homolog und wobei die Proteine HIS-getaggt und auf eine Ni 2+ -beschichtete Glasplatte gedruckt sind. WO 2005/061692 AI nennt auch ein Verfahren zum Screenen von RA unter Verwendung der genannten Proteine, ein Arzneimittel enthaltend eines der Proteine und einen Kit zum Screenen von RA. Um die oben genannten Proteine zu identifizieren, wird in WO 2005/061692 AI vorgeschlagen, Serum von Erkrankten mit dem von gesunden Kontrollpersonen zu vergleichen (S. 6, Abs. 3) .
Nicaise et al . (2008) Arthritis Research Therapy, Biomed
Central LTD, GB, Bd. 10, Nr. 6, S. R142-R142.7 untersucht die Eignung von anti-MCV (mutated citrullinated vimentin)
Antikörpern für die Diagnose von RA in CCP-negat iven Patienten und die Verwendung zur Überwachung während einer Therapie mit Infliximab. Dabei werden Gruppen von Patienten mit RA und CCP und mit RA und ohne CCP, Patienten mit anderen rheumatischen Erkrankungen (Psoriatic Rheumatism, Primary Sjögren Syndrom, Ankylosis Spondylitis) und gesunde Kontrollpersonen
verglichen. Die Verwendung eines Arrays/einer Anordnung wird nicht beschrieben. Vossenaar et al . (2004) Clinical and Applied Immunology
Reviews 4, 239-262 betrifft die Verwendung von citrullinierten Autoantigenen und von anti-CCP Antikörpern und deren Antigenen als serologische Marker zum Nachweis von RA. Vossenaar et al . schlägt vor, die Mikroarray Technologie anzuwenden, um
Autoant ikörper Profile von RA Patienten zu analysieren (S. 254, Abs . 2) . US 2007/0254300 AI verwendet ein Yeast Two-Hybrid System, um anti-inflammatorische Verbindungen zu identifizieren ([0504] bis [0506]) und beansprucht einen Proteinkomplex, wobei das erste Protein PAK, ein Fragment davon oder ein Fusionsprotein enthaltend dieses ist und das zweite Protein ERK3, PRKAR1A, KRT23(209), PN7098, AL117237, PCNT2, PROX1, HOOK1, IGHG1, GOLGA2, KIAA0555, LRPPRC oder ein Fragment von diesen
Proteinen ist. US 2007/0254300 AI offenbart auch einen
Mikroarray, der diesen Proteinkomplex umfasst und ein
Verfahren, um damit „Modulatoren" des Proteinkomplexes zu finden. Es wird auch ein Verfahren zum Nachweis einer
Veränderung in einer entzündlichen Erkrankung, beispielsweise RA, beansprucht und wobei die Probe eines Patienten
dahingehend untersucht wird, ob eine Veränderung in dem
Expressionslevel eines der Proteine in den Tabellen 1 bis 82 (82 verschiedene Proteine sind hier genannt) oder in der Nukleotidsequenz eines Gen, das für die 82 Proteine kodiert, im Vergleich zu Patienten ohne diese entzündliche Erkrankung, festgestellt wird. WO 2009/030226 offenbart Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis und deren diagnostische Verwendung samt einem
Verfahren zum Screenen von potentiellen Wirkstoffen für
Rheumatoide Arthritis mittels dieser Markersequenzen. Ferner eine diagnostische Vorrichtung enthaltend solche
Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis, insbesondere einen Proteinbiochip und dessen Verwendung.
DE 10 2007 041 656 AI offenbart die Verwendung von
Markersequenzen zur Diagnose von RA, Verfahren zur Diagnose von RA unter Verwendung dieser Markersequenzen, Verfahren zum Stratifizieren, eine Anordnung von Markersequenzen, einen Assay/Proteinbiochip, die Verwendung der Anordnung, Diagnostika umfassend die Markersequenzen, ein Target zur Behandlung und Therapie und die Verwendung der Markersequenzen zur Durchführung einer Apherese.
Die RA-spezifischen Expressionsklone wurden in DE 10 2007 041 656 AI dadurch erhalten, dass 10 oder mehr Patientenproben individuell gegen eine cDNA Expressionsbibliothek gescreent und durch einen Vergleich mit 10 oder mehr gesunden Proben identifiziert wurden. In Fig. 1 wird das differentielle
Screenen zwischen zwei Proteinbiochips aus jeweils einer cDNA- Expressionsbank eines Patienten und einem gesunden Probanden gezeigt. Die differentiellen Klone werden mittels
Fluoresenzmarkierung nachgewiesen und bioinformatisch
ausgewertet .
Es besteht weiterhin ein hohes Bedürfnis an
indikationsspezifischen diagnostischen Vorrichtungen für
Rheumatoide Arthritis.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die
Auffindung von verbesserten Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis und deren diagnostische Verwendung. Die Bereitstellung von spezifischen Markersequenzen erlaubt eine sichere Diagnose und Stratifizierung von Patienten mit Rheumatoider Arthritis.
In einem zweistufigen Verfahren umfassend zunächst die Auswahl von Markersequenz-Kandidaten mit Hilfe von Proteinbiochips und deren anschließende Validierung mittels Beads werden
hochspezifische Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis gefunden . Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis (RA) , umfassend die Schritte: a) Auswahl von Markersequenz-Kandidaten dadurch, dass Proteinbiochips, die eine cDNA Expressionsbibliothek repräsentieren mit mindestens 10 Patientenproben und mindestens 10 Proben von Gesunden gescreent werden und wobei jede Probe einzeln gemessen wird und
Markersequenz-Kandidaten für RA durch einen Vergleich der Ergebnisse der Screens, die mit den
RA-Patientenproben und der Ergebnisse der Screens, die mit den Proben von Gesunden erhalten werden, ausgewählt werden, b) Herstellung der durch die Markersequenz-Kandidaten kodierten Proteine und / oder Teilproteine (Peptide) durch Expression der cDNA der Markersequenz- Kandidaten, c) Herstellung von Beads an die ein oder mehrere der in Schritt b) hergestellten Proteine und / oder
Teilproteine (Peptide) gekoppelt sind, d) Validierung der an die Beads gekoppelten
Markersequenz-Kandidaten mittels Proben von Patienten mit RA und Proben von Gesunden dadurch, dass Markersequenzen für RA mit den Proben von
Patienten mit RA eine Wechselwirkung zeigen und mit den Proben von Gesunden eine im Vergleich dazu geringere oder keine Wechselwirkung zeigen und wobei die Markersequenzen SEQ ID No . 1 bis 182, SEQ ID. No. 183 bis 273, SEQ ID No . 274 bis 313 und SEQ ID No. 314 bis SEQ ID No . 333 erhalten werden. Im Bereich der Mikroarrays werden ebene Substrate verwendet, an die Markersequenzen oder zu untersuchende Sequenzen
gebunden sind. In Proteinbiochips sind die zu untersuchenden Markersequenzen oder die an diese Markersequenzen bindenden Sequenzen auf einem festen, ebenen Träger immobilisiert. Eine alternative Anordnung von Markersequenzen oder zu
untersuchenden Sequenzen ist auf Beads möglich, die sich deshalb unter anderem hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität von herkömmlichen Mikroarrays unterscheiden. Bead Arrays werden beispielsweise durch Imprägnieren von Kügelchen entweder mit unterschiedlichen Konzentrationen an
Fluoreszenzfarbstoff oder z.B. durch Strichcode-Technologie erstellt. Die Kügelchen sind adressierbar und können verwendet werden, um spezifische Bindungsereignisse, die auf ihrer
Oberfläche auftreten, zu identifizieren. Grundlage der Bead- Technologie sind mikroskopisch kleine sphärische Kügelchen oder Plättchen, die Mikrosphären oder Beads genannt werden. Diese Beads können analog zu ELISA und Western Blot als
Festphase für biochemische Nachweisreaktionen dienen. Es sind verschiedenste Bead-Typen verfügbar, die sich beispielsweise in ihrem Fluoreszenzfarbton unterscheiden und von denen jeder ein eigenes spezifisches Nachweisreagenz auf der Oberfläche trägt. Auf diese Weise können entsprechend viele verschiedene Nachweisreaktionen in einem sehr geringen Probenvolumen simultan durchgeführt werden. Mit Bead Arrays sind spezifische Interaktion zweier definierter biochemischer Verbindungen nachweisbar. Im Vergleich zu herkömmlichen Mikroarrays zeichnet sich die Bead-basierte Validierung durch eine
besonders hohe Sensitivität und Spezifität aus. Mit dem erfindungsgemäßen zweistufigen Verfahren und der Verwendung von Beads zur Validierung können Markersequenzen für RA identifiziert werden, die sich hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität von den bisher bekannten Markersequenzen unterscheiden. Das erfindungsgemäße zweistufige Verfahren ist im Stand der Technik bisher nicht beschrieben.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können an die Beads
zusätzlich andere Biomarker gekoppelt sein. Dadurch können Markersequenzen mit besonderer Spezifität erhalten werden. Beispielsweise Markersequenzen, mit denen sich Subgruppen von Patienten innerhalb der Indikation RA diagnostizieren lassen.
In einer Ausführungsform des Verfahrens werden die Schritte c) und d) in Gegenwart von CPP (Cytochrom c Peroxidase)
durchgeführt. Die in Gegenwart von CCP validierten
MarkerSequenzen sind sensitiver im Bezug auf die Diagnose von Rheumatoider Arthritis als CCP. Mit Hilfe der in Gegenwart von CCP validierten Markersequenzen kann eine Subgruppe von RA Patienten diagnostiziert werden. Bei der Durchführung der
Validierung in Gegenwart von CCP werden die Markersequenzen SEQ ID No. 29 bis 79, SEQ ID No . 120 bis 170, SEQ ID No . 211 bis 261, SEQ ID No . 274, SEQ ID No . 276, SEQ ID No . 278, SEQ ID No. 285 bis 288, SEQ ID No . 291, SEQ ID No . 294, SEQ ID No . 296, SEQ ID No . 298, SEQ ID No . 305 bis 308, SEQ ID No . 311,
SEQ ID No. 314, SEQ ID No . 316, SEQ ID No . 318, SEQ ID No . 325 bis 328, SEQ ID No . 331 erhalten.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis (RA) umfassend die Schritte: a) Auswahl von Markersequenz-Kandidaten dadurch, dass Proteinbiochips, die eine cDNA Expressionsbibliothek repräsentieren mit mindestens 10 Patientenproben und mindestens 10 Proben von Gesunden gescreent werden und wobei jede Probe einzeln gemessen wird und Markersequenz-Kandidaten für RA durch einen
Vergleich der Ergebnisse der Screens, die mit den RA-Patientenproben und der Ergebnisse der Screens, die mit den Proben von Gesunden erhalten werden, ausgewählt werden, b) Herstellung der durch die Markersequenz-Kandidaten kodierten Proteine und / oder Teilproteine (Peptide) durch Expression der cDNA der Markersequenz- Kandidaten, c) Herstellung von Beads an die ein oder mehrere der in Schritt b) hergestellten Proteine und / oder
Teilproteine (Peptide) gekoppelt sind und wobei an die Beads auch CCP (Cytochrom c Peroxidase)
gekoppelt ist, d) Validierung der an die Beads gekoppelten
Markersequenz-Kandidaten aus c) mittels Proben von Patienten mit RA und Proben von Gesunden dadurch, dass Markersequenzen für RA mit den Proben von
Patienten mit RA eine Wechselwirkung zeigen und mit den Proben von Gesunden eine im Vergleich dazu geringere oder keine Wechselwirkung zeigen und wobei die Markersequenzen SEQ ID No . 29 bis 79, SEQ ID No . 120 bis 170, SEQ ID No . 211 bis 261, SEQ ID No . 274, SEQ ID No. 276, SEQ ID No . 278, SEQ ID No . 285 bis 288, SEQ ID No . 291, SEQ ID No . 294, SEQ ID No . 296, SEQ ID No. 298, SEQ ID No . 305 bis 308, SEQ ID No . 311, SEQ ID No. 314, SEQ ID No . 316, SEQ ID No . 318, SEQ ID No. 325 bis 328, SEQ ID No . 331 erhalten werden . Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass eine Wechselwirkung zwischen Markersequenz-Kandidat und den Proben in Verfahrensschritt d) mittels eines Fluoreszenzsignals nachgewiesen wird und wobei die Intensität des Fluoreszenzsignals mit der Stärke der
Wechselwirkung korreliert.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Markersequenz für
Rheumatoide Arthritis erhältlich durch ein erfindungsgemäßes Verfahren und wobei die Markersequenz ausgewählt wird aus der Gruppe der Sequenzen SEQ ID No . 1 bis 182 und SEQ ID. No . 274 bis 313, einer zu den Sequenzen SEQ ID No . 1 bis 182 und SEQ ID No . 274 bis 313 homologen Sequenz oder einer Teilsequenz von SEQ ID No . 1 bis 182 und SEQ ID. No . 274 bis 313 oder einem durch SEQ ID No . 1 bis 182 oder SEQ ID. No . 274 bis 313 kodierten Protein oder einem durch eine Teilsequenz von SEQ ID No. 1 bis 182 oder SEQ ID. No . 274 bis 313 kodierten Protein oder einem durch eine homologe Sequenz von SEQ ID No. 1 bis 182 oder SEQ ID. No . 274 bis 313 kodierten Protein und einer genomischen Sequenzen, die eine der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 182 oder SEQ ID. No . 274 bis 313 umfasst.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Markersequenz für
Rheumatoide Arthritis in CCP negativen Patienten erhältlich durch ein erfindungsgemäßes Verfahren und wobei die
Markersequenz ausgewählt wird aus der Gruppe der Sequenzen SEQ ID No. 29 bis 79, SEQ ID No . 274, SEQ ID No . 276, SEQ ID No . 278, SEQ ID No . 285 bis 288, SEQ ID No . 291 und SEQ ID. No . 120 bis 170, SEQ ID No . 294, SEQ ID No . 296, SEQ ID No . 298, SEQ ID No. 305 bis 308, SEQ ID No . 311, einer zu den Sequenzen SEQ ID No. 29 bis 79, SEQ ID No . 274, SEQ ID No . 276, SEQ ID No. 278, SEQ ID No . 285 bis 288, SEQ ID No . 291 oder SEQ ID No. 120 bis 170, SEQ ID No . 294, SEQ ID No . 296, SEQ ID No . 298, SEQ ID No . 305 bis 308, SEQ ID No . 311 homologen Sequenz oder einer Teilsequenz von SEQ ID No . 29 bis 79, SEQ ID No . 274, SEQ ID No . 276, SEQ ID No . 278, SEQ ID No . 285 bis 288, SEQ ID No. 291 oder SEQ ID. No . 120 bis 170, SEQ ID No . 294, SEQ ID No. 296, SEQ ID No . 298, SEQ ID No . 305 bis 308, SEQ ID No. 311 oder einem durch SEQ ID No . 29 bis 79, SEQ ID No . 274, SEQ ID No. 276, SEQ ID No . 278, SEQ ID No . 285 bis 288, SEQ ID No. 291 oder SEQ ID. No . 120 bis 170, SEQ ID No . 294, SEQ ID No. 296, SEQ ID No . 298, SEQ ID No . 305 bis 308, SEQ ID No . 311 kodierten Protein oder einem durch eine Teilsequenz von SEQ ID No. 29 bis 79, SEQ ID No . 274, SEQ ID No . 276, SEQ ID No. 278, SEQ ID No . 285 bis 288, SEQ ID No . 291 oder SEQ ID. No. 120 bis 170, SEQ ID No . 294, SEQ ID No . 296, SEQ ID No . 298, SEQ ID No . 305 bis 308, SEQ ID No . 311 kodierten Protein oder einem durch eine homologe Sequenz von SEQ ID No . 29 bis
79, SEQ ID No. 274, SEQ ID No . 276, SEQ ID No . 278, SEQ ID No . 285 bis 288, SEQ ID No . 291 oder SEQ ID. No . 120 bis 170, SEQ ID No. 294, SEQ ID No . 296, SEQ ID No . 298, SEQ ID No . 305 bis 308, SEQ ID No . 311 kodierten Protein oder einer genomischen Sequenzen, die eine der Sequenzen SEQ ID No . 29 bis 79, SEQ ID No. 274, SEQ ID No . 276, SEQ ID No . 278, SEQ ID No . 285 bis 288, SEQ ID No . 291 oder SEQ ID. No . 120 bis 170, SEQ ID No . 294, SEQ ID No . 296, SEQ ID No . 298, SEQ ID No . 305 bis 308, SEQ ID No. 311 umfasst. Gegenstand der Erfindung ist auch eine Markersequenzen für
Rheumatoide Arthritis erhältlich durch ein erfindungsgemäßes Verfahren und wobei die Markersequenz ausgewählt wird aus der Gruppe der Sequenzen SEQ ID No . 183 bis 273, SEQ ID No . 314 bis 333, insbesondere SEQ ID No . 211 bis 261, SEQ ID No . 314, SEQ ID No. 316, SEQ ID No . 318, SEQ ID No . 325 bis 328, SEQ ID No. 331. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von einer oder mehreren erfindungsgemäßen Markersequenz (en) zur Diagnose von Rheumatoider Arthritis.
Eine Ausführungsform betrifft die erfindungsgemäße Verwendung, wobei die Markersequenz (en) an oder von einem zu
untersuchenden Patienten bestimmt wird/werden.
Eine Ausführungsform betrifft die erfindungsgemäße Verwendung dadurch gekennzeichnet, dass 2 oder 3, vorzugsweise 4 oder 5, besonders bevorzugt 6, 7 oder 8 oder mehr verschiedene
Markersequenzen, beispielsweise 10 bis 20 oder 30 oder mehr verschiedene Markersequenzen an oder von einem zu
untersuchenden Patienten bestimmt werden.
Eine Ausführungsform betrifft die erfindungsgemäße Verwendung dadurch gekennzeichnet, dass die Markersequenz (en) auf einen festen Träger aufgebracht wird/werden, wobei der feste Träger ausgewählt wird aus Filter, Membranen, Wafer, beispielsweise Silizium-Wafer , Glas, Metall, Kunststoff, Chips,
massenspektrometrische Targets, Matrix, Beads, beispielsweise magnetische, beschichtete oder markierte Beads, wie
Fluorophor-markierte Beads oder Luminex-Beads .
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Diagnose von Rheumatoider Arthritis, wobei a.) mindestens eine erfindungsgemäße Markersequenz auf einen festen Träger, vorzugsweise auf ein Bead aufgebracht wird und b.) mit Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug eines Patienten in Kontakt gebracht wird und
c.) der Nachweis einer Wechselwirkung der Körperflüssigkeit oder des Gewebeauszugs mit der Markersequenz aus a.) erfolgt. Der Nachweis einer solchen Wechselwirkung kann beispielsweise durch eine Sonde, insbesondere durch einen Antikörper
erfolgen .
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zum
Stratifizieren, insbesondere zur Risikostratifizierung, oder zur Therapiesteuerung eines Patienten mit Rheumatoider
Arthritis, wobei mindestens eine erfindungsgemäße
Markersequenz verwendet wird, um eine Probe des Patienten zu untersuchen . Eine Ausführungsform betrifft ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Diagnose von Rheumatoider Arthritis, wobei das
Stratifizieren oder die Therapiesteuerung Entscheidungen zur Behandlung und Therapie des Patienten, insbesondere
Hospitalisierung des Patienten, Einsatz, Wirkung und / oder Dosierung eines oder mehrerer Arzneimittel, eine
therapeutische Maßnahme oder die Überwachung eines
Krankheitsverlaufes sowie Therapieverlaufs, Ätiologie oder Klassifizierung einer Erkrankung samt Prognose umfasst.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Anordnung umfassend oder bestehend aus ein oder mehreren erfindungsgemäße
Markersequenz (en) .
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Assay oder Proteinarray umfassend eine erfindungsgemäße Anordnung.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen Anordnung oder eines erfindungsgemäßen Assays oder Proteinarrays zur Identifizierung und/oder
Charakterisierung einer Substanz für Rheumatoide Arthritis enthaltend Mittel zum Nachweis eines Bindungserfolges, dadurch gekennzeichnet, dass eine Anordnung oder ein Assay oder Proteinarray mit a.) mindestens einer zu untersuchenden
Substanz in Kontakt gebracht wird und b.) ein Bindungserfolg nachgewiesen wird.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Diagnostikum zur
Diagnose von Rheumatoider Arthritis enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Markersequenz und gegebenenfalls weitere Hilfs- und Zusatzstoffe.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Target zur Behandlung oder Therapie von Rheumatoider Arthritis, wobei das Target aus den erfindungsgemäßen Markersequenzen ausgewählt wird.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Markersequenz (en) als
Affinitätsmaterial zur Durchführung einer Apherese oder
Blutwäsche für Patienten mit Rheumatoider Arthritis. Dabei wird vorzugsweise eine Anordnung umfassend ein oder mehrere erfindungsgemäße Markersequenzen als Affinitätsmaterial zur Durchführung der Apherese bzw. Blutwäsche verwendet, wobei Substanzen aus Körperflüssigkeiten eines Patienten mit
Rheumatoide Arthritis, wie Blut oder Plasma, an die
erfindungsgemäßen Markersequenzen binden und folglich der Körperflüssigkeit selektiv entzogen werden können.
Entsprechende Vorrichtungen sind einschlägig bekannt, wie z.B. chromatographische Vorrichtungen enthaltend Beads, Kugeln oder chromatographisches Material, z.B. in einer Säule, die die erfindungsgemäßen Markersequenzen aufweisen und daher z.B. (Auto ) Antikörper selektiv entziehen können.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung mindestens einer erfindungsgemäßen Markersequenz zur Identifizierung einer Subgruppe von Patienten innerhalb der Gruppe der
Patienten mit Rheumatoider Arthritis, wobei die Patienten der Subgruppe nicht mittels des Markers CCP und/oder nicht mit den im Stand der Technik bekannten Markern beziehungsweise
Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis identifiziert werden können . Daher betrifft die Erfindung die Verwendung von
Markersequenzen zur Diagnose von Rheumatoider Arthritis, wobei mindestens eine Markersequenz ausgewählt aus der Gruppe der Markersequenzen SEQ ID No . 1 bis 91 oder SEQ ID No . 274 bis 293 und / oder SEQ ID No . 92 bis 182 oder SEQ ID No . 294 bis 313 und / oder der genomischen Sequenzen, die eine der
Sequenzen SEQ ID No . 1 bis 182 oder SEQ ID No . 274 bis 313 umfassen und / oder ein durch die Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 182 oder SEQ ID. No . 274 bis 313 kodiertes Protein oder eine Teilsequenz oder ein Homologes der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 182 oder SEQ ID No . 274 bis 313 oder ein durch die Teilsequenz oder die Homologe Sequenz kodiertes Protein an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird und wobei die
Markersequenz (en) durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifiziert werden. Eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens umfasst die Schritte a) Identifizierung von Markersequenz-Kandidaten durch
differentielles Screening mit Proteinbiochips aus jeweils einer cDNA-Expressionsbank eines Patienten mit
Rheumatoider Arthritis und einem Probanden ohne
Rheumatoide Arthritis, b) Expression der Markersequenz-Kandidaten zur Herstellung der kodierten Proteine und / oder Teilproteine (Peptide) , c) Herstellung von Luminex-Beads , an die ein oder mehrere der in Schritt b) hergestellten Proteine und / oder
Teilproteine (Peptide) gekoppelt sind wobei an die
Luminex-Beads gegebenenfalls auch bereits bekannte
Biomarker für Rheumatoide Arthritis, beispielsweise CCP
(Cytochrom c Peroxidase) , gekoppelt sind, d) Validierung der Markersequenz-Kandidaten mittels Proben von Patienten mit Rheumatoider Arthritis und Probanden ohne Rheumatoide Arthritis und wobei die Validierung gegebenenfalls in Gegenwart der bereits bekannten
Biomarker für Rheumatoide Arthritis, beispielsweise CCP, durchgeführt wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung erfindungsgemäßer Markersequenzen zur Diagnose von Rheumatoider Arthritis in Patienten, die CCP negativ sind, wobei mindestens eine Markersequenz ausgewählt aus der Gruppe der Markersequenzen SEQ ID No . 29 bis 79 und / oder SEQ ID No . 120 bis 170 und / oder der genomischen Sequenzen, die eine der Sequenzen SEQ ID No . 29 bis 79 oder 120 bis 170 umfasst und / oder ein durch die Sequenzen SEQ ID No . 29 bis 79 oder 120 bis 170 kodiertes Protein oder eine Teilsequenz oder ein Homologes der Sequenzen SEQ ID No . 29 bis 79 oder SEQ ID No . 120 bis 170 oder ein durch die Teilsequenz oder die homologe Sequenz kodiertes Protein an oder von einem zu untersuchenden
Patienten bestimmt wird.
Die in Gegenwart von CCP validierten Markersequenzen sind sensitiver im Bezug auf die Diagnose von Rheumatoider
Arthritis als CCP. Auf diese Weise kann eine Subgruppe von Patienten identifiziert und/oder überwacht werden, die mit Hilfe des bereits bekannten Markers CCP für Rheumatoide Arthritis nicht identifiziert werden kann. Mit Hilfe dieser Markersequenzen kann auch Rheumatoide Arthritis in einem früheren Stadium diagnostiziert werden, als mit CCP .
Eine weitere besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung erfindungsgemäßer Markersequenzen zur Diagnose von Rheumatoider Arthritis in einem frühen Stadium von RA, wobei in diesem frühen Stadium RA noch nicht mittels CCP nachgewiesen werden kann und wobei mindestens eine
Markersequenz ausgewählt aus der Gruppe der Markersequenzen SEQ ID No. 29 bis 79 und / oder SEQ ID No . 120 bis 170 und / oder der genomischen Sequenzen, die eine der Sequenzen SEQ ID No . 29 bis 79 oder 120 bis 170 umfasst und / oder ein durch die Sequenzen SEQ ID No . 29 bis 79 oder 120 bis 170 kodiertes Protein oder eine Teilsequenz oder ein Homologes der Sequenzen SEQ ID No. 29 bis 79 oder SEQ ID No . 120 bis 170 oder ein durch die Teilsequenz oder die homologe Sequenz kodiertes Protein an oder von einem zu untersuchenden Patienten
bestimmt .
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die
Verwendung der erfindungsgemäßen Markersequenz (en) zur Diagnose von Rheumatoider Arthritis, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung mittels in-vitro Diagnose erfolgt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft
Diagnostika zur Diagnose von Rheumatoider Arthritis enthaltend mindestens eine Markersequenz ausgewählt aus der Gruppe der Markersequenzen SEQ ID No . 1 bis 91 oder SEQ ID No . 274 bis 293 und / oder SEQ ID No . 92 bis 182 oder SEQ ID No . 294 bis 313 und / oder der genomischen Sequenzen, die eine der
Sequenzen SEQ ID No . 1 bis 182 oder SEQ ID No . 274 bis 313 umfassen und / oder ein durch die Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 182 oder SEQ ID. No . 274 bis 313 kodiertes Protein oder eine Teilsequenz oder ein Homologes der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 182 oder SEQ ID No . 274 bis 313 oder ein durch die Teilsequenz oder die Homologe Sequenz kodiertes Protein und wobei die Markersequenz (en) mit einem Verfahren identifiziert wurde (n), umfassend die Schritte a) Auswahl von Markersequenz-Kandidaten dadurch, dass Proteinbiochips, die eine cDNA Expressionsbibliothek repräsentieren mit mindestens 10 Patientenproben und mindestens 10 Proben von Gesunden gescreent werden und wobei jede Probe einzeln gemessen wird und
Markersequenz-Kandidaten für RA durch einen Vergleich der Ergebnisse der Screens, die mit den RA-Patientenproben und der Ergebnisse der Screens, die mit den Proben von Gesunden erhalten werden, ausgewählt werden, b) Herstellung der durch die Markersequenz-Kandidaten kodierten Proteine und / oder Teilproteine (Peptide) durch Expression der cDNA der Markersequenz- Kandidaten, c) Herstellung von Beads an die ein oder mehrere der in Schritt b) hergestellten Proteine und / oder
Teilproteine (Peptide) und ggf. CCP gekoppelt sind, d) Validierung der an die Beads gekoppelten
Markersequenz-Kandidaten mittels Proben von Patienten mit RA und Proben von Gesunden dadurch, dass Markersequenzen für RA mit den Proben von
Patienten mit RA eine Wechselwirkung zeigen und mit den Proben von Gesunden eine im Vergleich dazu geringere oder keine Wechselwirkung zeigen und wobei die Markersequenzen SEQ ID No . 1 bis 182, SEQ ID. No. 183 bis 273, SEQ ID No . 274 bis 313 und SEQ ID No . 314 bis SEQ ID No . 333, oder in Gegenwart von CCP die Markersequenzen SEQ ID No . 29 bis 79, SEQ ID No. 120 bis 170, SEQ ID No . 211 bis 261, SEQ ID No .
274, SEQ ID No . 276, SEQ ID No . 278, SEQ ID No . 285 bis 288, SEQ ID No . 291, SEQ ID No . 294, SEQ ID No . 296, SEQ ID No . 298, SEQ ID No . 305 bis 308, SEQ ID No. 311, SEQ ID No . 314, SEQ ID No . 316, SEQ ID No . 318, SEQ ID No . 325 bis 328, SEQ ID No . 331 erhalten werden .
Die erfindungsgemäßen Markersequenzen konnten mittels
differentiellem Screening von Proben von gesunden Probanden mit Patientenproben mit Rheumatoider Arthritis identifiziert werden. Die erfindungsgemäßen Markersequenzen wurden dann exprimiert und nach Kopplung der exprimierten Markersequenz- Kandidaten an Luminex-Beads mit Hilfe der Luminex-Beads validiert, z.T. vergleichend gegen bekannte Biomarker für Rheumatoide Arthritis und wie in den Ausführungsbeispielen beschrieben. Dadurch konnten hochspezifische Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis identifiziert werden.
„Beads" (Perlen, Kügelchen, ursprünglich auch Latex-Partikel genannt) bezeichnen sogenannte Mikrosphären oder
Mikropartikel , die als Träger für Biomoleküle in Tests und Assays eingesetzt werden. Für Tests und Assays werden uniforme (etwa gleichgroße) Mikropartikel benötigt, die über spezielle chemische Verfahren hergestellt werden. Diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Beads für unterschiedliche Anwendungen sind auch kommerziell erhältlich (z.B. Fa. Progen Biotechnik GmbH) . Beads können aus unterschiedlichen Materialien
bestehen, beispielsweise Glas, Polystyrol, PMMA und verschiedenen anderen, zum Teil auch Kopolymeren. Beads können mit unterschiedlichen Farbstoffen oder Farbstoffgemischen markiert werden und mit Coatings versehen werden. An ihre Oberfläche können Biomoleküle gekoppelt werden. Dafür stehen unterschiedliche Kopplungsmethoden zur Verfügung, die dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise Adsorption oder
kovalente Kopplung. Die Oberfläche der Beads kann modifiziert sein, so dass eine gerichtet Kopplung der Biomoleküle auf der Bead-Oberfläche, z.B. in Verbindung mit Spacern, Tags oder speziellen Modifikationen möglich ist und wodurch die
analytische Sensitivität weiter erhöht werden kann.
Der Begriff „Rheumatoide Arthritis (RA)" ist z.B. nach
Pschyrembel, de Gruyter, 261. Auflage (2007), Berlin
definiert. Erfindungsgemäß umfasst ist ebenfalls die „juvenile idiopathische Arthritis " (ICD-10: M08.-. Abk.: JIA. Ältere
Synonyme: Juvenile rheumatoide Arthritis, Juvenile chronische Arthritis, Morbus Still oder volkstümlicher: kindliches
Rheuma) , die eine Sammelbezeichnung für eine Reihe von
vorwiegend gelenkbefallenden Erkrankungen (Arthritis) des rheumatischen Formenkreises im Kindesalter (juvenil)
(Definition z.B. nach Pschyrembel, de Gruyter, 261. Auflage (2007), Berlin). Es handelt sich hierbei um eine polygene Erkrankung, die mittels der erfindungsgemäßen Markersequenzen, vorzugsweise SEQ ID No . 1 bis 333 besonders vorteilhaft diagnostiziert werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform werden mindestens 2 bis 5 oder 10, vorzugsweise 30 bis 50 Markersequenzen oder 50 bis 100 oder mehr Markersequenzen an oder von einem zu
untersuchenden Patienten bestimmt. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die erfindungsgemäßen Markersequenzen ebenfalls mit bekannten Biomarker für diese Indikation kombiniert, ergänzt, fusioniert oder erweitert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bestimmung der Markersequenzen außerhalb des menschlichen Körpers und die Bestimmung erfolgt in einer ex vivo / in vitro Diagnose.
Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Aufgabe eine diagnostische Vorrichtung oder einen Assay, insbesondere einen Proteinbiochip, bereitzustellen, der für die Rheumatoide
Arthritis eine Diagnose oder Untersuchung erlaubt.
„Diagnose" im Sinne dieser Erfindung bedeutet die positive Feststellung von Rheumatoider Arthritis mittels der
erfindungsgemäßen Markersequenzen sowie die Zuordnung der Patienten zur Indikation Rheumatoide Arthritis. Der Begriff der Diagnose umfasst die medizinische Diagnostik und
diesbezügliche Untersuchungen, insbesondere die in-vitro Diagnostik und Labordiagnostik, ebenfalls Proteomics und
Nukleinsäureblots . Weitere Untersuchungen können zur
Absicherung und zum Ausschluss anderen Krankheiten vonnöten sein. Daher umfasst der Begriff Diagnose ebenfalls die
Differentialdiagnose von Rheumatoider Arthritis mittels der erfindungsgemäßen Markersequenzen sowie die Prognose bei festgestellter Rheumatoider Arthritis. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum
Stratifizieren, insbesondere zur Risikostratifizierung und / oder Therapiesteuerung eines Patienten mit Rheumatoider
Arthritis, beispielsweise bei einem Patienten mit einem sehr frühen Stadium von RA oder RA, dass nicht mittels des Markers CCP nachgewiesen werden kann, wobei mindestens eine erfindungsgemäße Markersequenz an einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird. Umfasst ist ebenfalls die
Stratifizierung der Patienten mit Rheumatoider Arthritis in neue oder etablierte Subgruppen innerhalb der Erkrankung
Rheumatoide Arthritis, sowie die sinnvolle Auswahl von
Patientengruppen für die klinische Entwicklung von neuen
Therapeutika oder die Auswahl für die Therapie mit bestimmten Wirkstoffen. Der Begriff Therapiesteuerung umfasst ebenfalls die Einteilung von Patienten in Responder und Nicht-Responder bezüglich einer Therapie oder dessen Therapieverlauf.
„Stratifizieren (auch: Stratifikation) oder Therapiesteuerung" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, dass das erfindungsgemäße Verfahren Entscheidungen zur Behandlung und Therapie des
Patienten erlaubt, sei es Hospitalisierung des Patienten, Einsatz, Wirkung und / oder Dosierung eines oder mehrerer Arzneimittel, eine therapeutische Maßnahme oder die
Überwachung eines Krankheitsverlaufes sowie des
Therapieverlaufs bzw. Ätiologie oder Klassifizierung von RA, z.B. in einen neuen oder bestehenden Subtyp oder die
Differenzierung von RA und den betreffenden Patienten.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst der Begriff „Stratifizierung" insbesondere die
Risikostratifizierung mit der Prognose eines „outcome" eines nachteiligen gesundheitlichen Ereignisses. Im Rahmen dieser Erfindung wird unter „Patient" ein beliebiger Proband - Mensch oder Säugetier - verstanden, mit der Maßgabe, dass der Proband auf Rheumatoide Arthritis untersucht wird.
Der Begriff „Markersequenzen" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, dass die Nukeinsäuresequenz , beispielsweise die mRNA, cDNA oder das jeweils daraus erhältliche Polypeptid oder Protein signifikant für Rheumatoide Arthritis sind.
Beispielsweise können die mRNA oder cDNA oder das jeweils daraus erhältliche Polypeptid oder Protein eine Wechselwirkung mit Substanzen aus der Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug eines Patienten mit Rheumatoider Arthritis aufweisen (z.B. Antigen (Epitop) / Antikörper (Paratop) Wechselwirkung) .
Im Sinne der Erfindung bedeutet „wobei mindestens eine
Markersequenz ausgewählt aus der Gruppe der Markersequenzen SEQ ID o. 1 bis 182 oder SEQ ID No . 274 bis 313, der
genomischen Sequenzen, die eine der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 182 oder SEQ ID No . 274 bis 313 umfassen, oder ein durch die Sequenzen SEQ ID No . 1 bis 182 oder SEQ ID. No . 274 bis 313 kodiertes Protein oder eine Teilsequenz oder ein Homologes der Sequenzen SEQ ID No . 1 bis 182 oder SEQ ID No . 274 bis 313 oder ein durch die Teilsequenz oder die homologe Sequenz kodiertes Protein an oder von einem zu untersuchenden
Patienten bestimmt wird", dass eine Wechselwirkung zwischen der Körperflüssigkeit oder dem Gewebeauszug eines Patienten und der/den erfindungsgemäßen Markersequenzen nachgewiesen wird. Eine solche Wechselwirkung ist z.B. eine Bindung, insbesondere eine bindende Substanz an mindestens eine der erfindungsgemäßen Markersequenzen oder im Fall einer cDNA die Hybridisierung mit einer geeigneten Substanz unter gewählten Bedingungen, insbesondere stringenten Bedingungen (z.B. wie üblich definiert in J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis
(1989), Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, USA oder Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)). Ein Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist: Hybridisierung in 4 x SSC bei 65° C (alternativ in 50% Formamid und 4 X SSC bei 42° C) , gefolgt von mehreren Waschschritten in 0,1 x SSC bei 65°C für insgesamt etwa eine Stunde. Ein Beispiel für wenig stringente
Hybridisierungsbedingungen ist Hybridisierung in 4 x SSC bei 37° C, gefolgt von mehreren Waschritten in 1 x SSC bei
Raumtemperatur .
Solche Substanzen sind erfindungsgemäß Bestandteil einer
Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, Vollblut, Blutplasma, Blutserum, Patientenserum, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit , Synovialflüssigkeit oder eines Gewebeauszuges des Patienten.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die erfindungsgemäßen Markersequenzen in einer signifikant höheren oder niedrigeren Expressionsrate oder Konzentration in dem untersuchten Probanden vorliegen, im Vergleich zu der
Expressionsrate oder Konzentration der betreffenden
Markersequenz in einem Gesunden bzw. einem Probanden ohne RA. Die erhöhte bzw. erniedrigte Expressionsrat oder Konzentration ist ein Hinweis auf Rheumatoide Arthritis und die Diagnose RA. Die relativen Expressionsraten krank / gesund der
erfindungsgemäßen Markersequenzen können beispielsweise mittels Proteomics oder Nukleinsäureblots bestimmt werden.
Die erfindungsgemäßen Markersequenzen verfügen in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung über ein
Erkennungssignal, welches an die zu bindende Substanz
adressiert ist (z.B. Antikörper, Nukleinsäure).
Erfindungsgemäß bevorzugt ist für ein Protein das
Erkennungssignal Epitop und / oder Paratop und / oder Hapten und für eine cDNA eine Hybridisierungs- oder Bindungsregion. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung erkennen die erfindungsgemäßen Markersequenzen Autoantikörper , die für RA spezifisch sind bzw. die bei der Entstehung und dem Fortschreiten der RA Erkrankung gebildet werden und/oder verstärkt bzw. verringert gebildet werden. Zwei oder mehr erfindungsgemäße Markersequenzen können verwendet werden, um Autoantikörperprofile nachzuweisen bzw. Veränderungen in
Autoantikörperprofilen während einer Therapie oder des
Krankheitsverlaufs oder im Rahmen der Nachsorge zu überwachen.
Die erfindungsgemäßen Markersequenzen SEQ ID o. 1 bis 91 und 274 bis 293 sind Gegenstand der Tabelle 7 und können durch den jeweilig zitierten Datenbankeintrag (auch mittels Internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) eindeutig identifiziert werden (siehe RefSeq Accession bzw. Gl Accession) .
Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Volllängesequenzen der erfindungsgemäßen Markersequenzen und die Markersequenzen wie in den Tabellen über die bekannten Datenbankeinträge definiert sowie die im anliegenden Sequenzprotokoll
angegebenen Markersequenzen.
Weiterhin umfasst sind ebenfalls analoge Ausführungsformen der Markersequenzen, insbesondere der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID No. 1 bis 182 und SEQ ID No . 274 bis 313 und der
Proteinsequenzen SEQ ID No . 183 bis 273 und SEQ ID No . 314 bis 333, insbesondere der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID No . 29 bis 79 und SEQ ID No . 120 bis 170, SEQ ID No . 274, SEQ ID No . 276, SEQ ID No. 278, SEQ ID No . 285 bis 288, SEQ ID No . 291, SEQ ID No. 294, SEQ ID No . 296, SEQ ID No . 298, SEQ ID No . 305 bis 308, SEQ ID No. 311, und der Proteinsequenzen SEQ ID No . 211 bis 261, SEQ ID No . 314, SEQ ID No . 316, SEQ ID No . 318, SEQ ID No. 325 bis 328, SEQ ID No . 331 wie z.B. in den Ansprüchen dargelegt. Die erfindungsgemäßen Klonsequenzen SEQ ID No. 1 bis 91 und SEQ ID No . 274 bis 293 stellen Teilsequenzen, zumindest mit hoher Homologie, der erfindungsgemäßen Markersequenzen SEQ ID No . 92 bis 182 und SEQ ID No . 294 bis 313 dar. Besonders bevorzugt sind die Markersequenzen SEQ ID No. 29 bis 79, SEQ ID No . 274, SEQ ID No . 276, SEQ ID No . 278, SEQ ID No. 285 bis 288, SEQ ID No . 291 und die durch diese Markersequenzen kodierten Proteine.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind
Markersequenzen bevorzugt, die P-Werte kleiner oder gleich 0.006 aufweisen, vorzugsweise kleiner oder gleich 0.001 oder kleiner oder gleich 0.0001, besonders bevorzugt kleiner oder gleich 0.00001 (siehe FIG 1, Tabellen 8 und 8a). In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind die Markersequenzen SEQ ID No . SEQ ID No. 4 bis 15, Teilsequenzen und Homologe von SEQ ID No. 4 bis 15, sowie die dadurch kodierten Peptide / Proteine bevorzugt, denn diese Markersequenzen weisen
besonders geeignete P-Werte auf. Der P-Wert gibt die
Wahrscheinlichkeit an, mit der eine Übereinstimmung in der Datenbank gefunden wurde. Für die Definition des P-Werts siehe zum Beispiel http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK62051/. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind Homologe der erfindungsgemäßen Markersequenzen umfasst. Insbesondere solche Homologen, die eine Identität von 70 %, 80 % oder 85 %, vorzugsweise 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % oder 95% Identität, insbesondere 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr Identität mit den erfindungsgemäßen Markersequenzen aufweisen und für die erfindungsgemäße Verwendung - den Nachweis von Rheumatoider Arthritis geeignet sind. (sog. „Homologe", homologe
Markersequenzen) . Homologe können Protein- oder
Nukleinsäuresequenzen sein. Teilsequenzen sind solche Sequenzen, die 50 bis 100 Nukleotide oder Aminosäuren, vorzugsweise 70-120 Nukleotide oder
Aminosäuren, besonders bevorzugt 100 bis 200 Nukleotide oder Aminosäuren einer der Markersequenzen SEQ ID No. 1 bis 333 aufweisen.
Erfindungsgemäß umfassen die Markersequenzen auch solche
Modifikationen der Nukleotidsequenz , beispielsweise der cDNA- Sequenz und der entsprechenden Aminosäuresequenz, wie
chemische Modifikation, beispielsweise Citrullinierung,
Acetylierung, Phosphorylierung, Glykosilierung oder polyA- Strang und weiteren dem Fachmann einschlägig bekannte
Modifikationen .
In einer weiteren Ausführungsform kann die jeweilige
Markersequenz in unterschiedlichen Mengen in einem oder mehreren Bereichen auf einem festen Träger, beispielsweise einem Bead repräsentiert sein. Dies erlaubt eine Variation der Sensitivität . Die Bereiche können jeweils eine Gesamtheit von Markersequenzen aufweisen, d.h. eine genügende Zahl an
verschiedenen Markersequenzen, insbesondere 2 bis 5 oder 10 oder mehr Markersequenzen und ggfs. weitere Nukleinsäuren und/oder Proteine, insbesondere Biomarker. Bevorzugt sind jedoch mindestens 96 bis 25.000 (numerisch) oder mehr aus verschiedenen oder gleichen Markersequenzen und weiteren
Nukleinsäuren und/oder Proteinen, insbesondere Biomarkern. Weiterhin bevorzugt sind mehr als 2.500, besonders bevorzugt
10.000 oder mehr verschiedene oder gleiche Markersequenzen und ggfs. weitere Nukleinsäuren und/oder Proteine, insbesondere Biomarker . Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Anordnung von Markersequenzen enthaltend mindestens eine Markersequenz einer cDNA ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No . 92 bis 182 und 294 bis 313 oder jeweils ein dadurch kodiertes Protein.
Vorzugsweise enthält die Anordnung mindestens 2 bis 5 oder 10, vorzugsweise 30 bis 50 Markersequenzen oder 50 bis 100 oder mehr Markersequenzen.
Im Rahmen dieser Erfindung bedeutet „Anordnung" synonym „Array" und sofern dieser „Array" zur Identifizierung von zu bindenden Substanzen an Markersequenzen verwendet wird, ist hierunter ein „Assay" oder eine diagnostische Vorrichtung zu verstehen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die
Anordnung derart gestaltet, dass die auf der Anordnung
repräsentierten Markersequenzen in Form eines Gitters auf einem festen Träger vorliegen. Ferner sind solche Anordnungen bevorzugt, die eine hochdichte (high-density ) Anordnung von Markersequenzen erlauben und die Markersequenzen gespottet werden. Solche hochdichte gespotteten Anordnungen sind
beispielsweise in der WO 99/57311 und WO 99/57312 offenbart und können vorteilhaft in einem robotergestützten
automatisierten High-Throughput Verfahren zur Anwendung kommen .
Im Rahmen dieser Erfindung umfasst der Begriff „Assay" oder diagnostische Vorrichtung ebenfalls solche Ausführungsformen einer Vorrichtung, wie ELISA (z.B. einzelne Wells einer
Mikrotiterplatte werden mit den erfindungsgemäßen
Markersequenzen oder Kombinationen von Markersequenzen
beschichtet, ggfs. robotergestützt in die einzelnen Wells der Mikrotiterplatte aufgebracht; Beispiele sind diagnostische ELISA-Kits der Fa. Phadia oder Multiplex-ELISA-Kits
„Searchlight" der Fa. Pierce/Thermo Fisher Scientific), Bead- based Assay (spektral unterscheidbare bead-Populationen werden mit Markersequenzen/Kombinationen von Markersequenzen beschichtet. Die Patientenprobe wird mit dieser bead- Population inkubiert und gebundene (Auto- ) -Antikörper werden mittels eines weiteren Fluoreszenz-markierten
Sekundärantikörpers oder ein Detektionsreagenz über Messung der Fluoreszenz nachgewiesen; z. B. Borrelia IgG-Kit oder Athena-Multilyte der Fa. Multimetrix) , Line Assay
(erfindungsgemäßen Markersequenzen oder Kombinationen von Markersequenzen werden robotergestützt auf Membranen
immobilisiert, welche mit der Patientenprobe untersucht beziehungsweise inkubiert werden; Beispiel „Euroline" der Fa. Euroimmun AG), Western Blot (Beispiel „Euroline-WB" der Fa. Euroimmun AG), immunchromatographische Verfahren (z.B. Lateral Flow Immunoassays ; Markersequenzen bzw. Kombinationen von Markersequenzen werden auf Teststreifen (Membranen, US
5,714,389 u.v.a) immobilisiert; Beispiel „One Step HBsAg" Test Device von Acon Laboratories) oder ähnliche immunologische Single- oder Multiplex-Nachweisverfahren . Die Markersequenzen der Anordnung sind auf einen festen Träger fixiert, vorzugsweise jedoch gespottet oder immobilisiert oder aufgedruckt, d.h. reproduzierbar aufgebracht. Ein oder mehrere Markersequenzen können mehrfach in der Gesamtheit aller
Markersequenzen präsent sein und in unterschiedlichen Mengen bezogen auf einen Spot vorliegen. Ferner können die
Markersequenzen auf dem festen Träger standardisiert sein (z.B. mittels serieller Verdünnungsreihen von z.B.
Humanglobulinen als interne Kaiibratoren zur
Datennormalisierung und quantitativen Auswertung) . Daher betrifft die Erfindung einen Assay oder Proteinbiochip oder ein oder mehrere Beads (Bead-basierter Assay) bestehend aus einer Anordnung enthaltend erfindungsgemäße
MarkerSequenzen .
In einer weiteren Ausführungsform liegen die Markersequenzen als Klone vor. Solche Klone können beispielsweise mittels einer erfindungsgemäßen cDNA-Expressionsbibliothek erhalten werden (Büssow et al . 1998 ( supra ) ) . In einer bevorzugten Ausführungsform werden solche Expressionsbibliotheken
enthaltend Klone mittels Expressionsvektoren aus einer
exprimierenden cDNA Bibliothek bestehend aus den cDNA
Markersequenzen erhalten. Diese Expressionsvektoren enthalten vorzugsweise induzierbare Promotoren. Die Induktion der
Expression kann z.B. mittels eines Induktors, solche wie IPTG, erfolgen. Geeignete Expressionsvektoren sind beschrieben in Terpe et al . (Terpe T Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Jan ; 60(5): 523-33) .
Expressionsbibliotheken sind dem Fachmann bekannt, diese können nach Standardwerken, wie Sambrook et al, "Molecular Cloning, A laboratory handbook, 2nd edition (1989), CSH press, Cold Spring Harbor, New York hergestellt werden. Weiterhin bevorzugt sind solche Expressionsbibliotheken, die
gewebespezifisch sind (z.B. humanes Gewebe, insbesondere humane Organe) . Ferner sind erfindungsgemäß ebenfalls solche Expressionsbibliotheken mit eingeschlossen, die mittels exon- trapping erhalten werden können. Statt Expressionsbibliothek kann synonym von einer Expressionsbank gesprochen werden.
Weiterhin bevorzugt sind Proteinbiochips oder Beads oder entsprechende Expressionsbibliotheken, die keine Redundanz aufweisen (so genannte: Uniclone®-Bibliothek ) und nach den Lehren der WO 99/57311 und WO 99/57312 beispielsweise
hergestellt werden können. Diese bevorzugten Uniclone- Bibliotheken weisen einen hohen Anteil an nicht-fehlerhaften vollständig exprimierten Proteinen einer cDNA- Expressionsbibliothek auf.
Im Rahmen dieser Erfindung können die Klone ebenfalls nicht abschließend solche sein, wie transformierte Bakterien, rekombinante Phagen oder transformierte Zellen von Säugern, Insekten, Pilzen, Hefen oder Pflanzen.
Die Klone werden auf einen festen Träger fixiert, gespottet oder immobilisiert. Daher betrifft die Erfindung eine Anordnung, wobei die
Markersequenzen als Klone vorliegen.
Zusätzlich können die Markersequenzen in der jeweiligen Form in Form eines Fusionsproteins vorliegen, welches
beispielsweise mindestens ein Affinitätsepitop oder "Tag" enthält. Der Tag kann ein solcher sein wie wie c-myc, His-Tag, Arg-tag, FLAG, alkalische Phosphatase, V5-Tag, T7-Tag oder Strep-Tag, HAT-tag, NusA, S-tag, SBP-tag, Thioredoxin, DsbA, ein Fusionsprotein, vorzugsweise eine Cellulose-bindende
Domäne, grünfluoreszierendes Protein, Maltose bindendes
Protein, calmodulin-bindendes Protein, Glutathione S- transferase oder lacZ enthalten.
Eine Markersequenz kann sich auch aus mehreren einzelnen
Markersequenzen zusammensetzen. Dies kann die Klonierung einzelner Fragmente zu einem großen gemeinsamen Fragment und die Expression dieses kombinierten Fragmentes beinhalten.
In sämtlichen Ausführungsformen umfasst der Begriff "fester Träger" Ausführungen wie einen Filter, eine Membran, ein magnetisches oder Fluorophor-markiertes Kügelchen, ein
Silizium-Wafer , Glas, Metall, Kunststoff, ein Chip, ein massenspektrometrisches Target oder eine Matrix. Ein Filter und Beads sind jedoch erfindungsgemäß bevorzugt.
Als Filter ist weiterhin PVDF, Nitrocellulose oder Nylon bevorzugt (z.B. Immobilon P Millipore, Protran Whatman, Hybond N+ Amersham) .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der
erfindungsgemäßen Anordnung entspricht diese einem Gitter, dass die Größenordnung einer Mikrotiterplatte (8-12 Wells Streifen, 96 Wells, 384 Wells oder mehr) , eines Silizium- Wafers, eines Chips, eines massenspektrometrischen Targets oder einer Matrix besitzt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Kügelchen sogenannte Beads als Träger verwendet. Vorzugsweise werden dabei Bead-basierte multiplex Assays verwendet. Die Analyse und Auswertung der Bead-basierten Assays kann beispielsweise mit einem Luminex-Analysesystem erfolgen, welches auf der Methode der Durchflusszytometrie unter Verwendung zweier unterschiedlicher Laser durchgeführt wird.
Während die Messungen auf planaren Proteinarrays lediglich einen dynamischen Bereich von 1,5 - 2 Größenordnungen (10er
Potenzen) bieten, kann durch die Verwendung von Luminex-Beads ein dynamischer Bereich von 3,5-4 Größenordnungen abgedeckt werden. Wobei auch die Messungen in den niedrigen
Responsbereichen sehr gute Variationskoeffizienten (VKs), d.h. nicht mehr als 10 % liefern.
Während die Messungen auf planaren Proteinarrays lediglich Variationskoeffizienten (VKs) von 10 bis 25 % (intra-Array Vergleich) bzw. 10 bis 50 % (inter-Array Vergleich) liefern, befinden sich die VKs der Luminex-Messungen zwischen 3 bis 10 %. Dadurch ergibt sich eine Assayqualität , die kommerzielle ELISAS im Allgemeinen nicht erreichen. Die bekannten Nachteile (limitierte Plexing-Rate durch Interferenz unterschiedlicher Defektionsantikörper ) für Luminex-basierte Analyse- und
Diagnostikverfahren treffen auf das UNIarray-Konzept nicht zu, da als Defektionssonde lediglich ein einziges
fluoreszenzmarkiertes anti—human IgG aus Ziege, Schaf oder Maus eingesetzt wird. Durch den Transfer des UNIarray- Konzeptes auf Luminex (also Bead-basierte Protein-Arrays ) können zusätzlich mehrere Geräte eingespart, d.h. Protein- Drucker, Hybridisiermaschine und Array-Reader , und durch ein Gerät ersetzt werden. Dabei ist das UNIarray-Konzept nicht an Luminex gebunden, sondern kann auch auf anderen Plattformen wie z.B. Randox, VBC-Genomics etc eingesetzt werden. Die hohe Messgenauigkeit und die niedrigen VKs der Einzelmessungen erlauben den Einsatz besserer und neuer statistischer
Verfahren zur Identifizierung von potenten Einzelmarkern sowie zur schnellen Aussortierung von Falschpositiven.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Assay oder Proteinbiochip zum Identifizieren und
Charakterisieren einer Substanz für Rheumatoide Arthritis, dadurch gekennzeichnet, dass eine erfindungsgemäße Anordnung oder Assay mit a.) mindestens einer zu untersuchenden Substanz in Kontakt gebracht wird und b.) ein Bindungserfolg
nachgewiesen wird. Die zu untersuchende Substanz kann ein beliebiges natives oder nicht-natives Biomolekül, ein
synthetisches chemisches Molekül, eine Mischung oder eine Substanzbibliothek sein. Nachdem die zu untersuchende Substanz eine Markersequenz kontaktiert, erfolgt die Auswertung des Bindungserfolges, die beispielsweise unter Verwendung mit handelsüblicher Image-Analyse Software (GenePix Pro (Axon Laboratories), Aida (Raytest), ScanArray (Packard Bioscience) erfolgt .
Die Visualisierung erfindungsgemäßer Protein-Protein- Wechselwirkungen (z.B. Protein an Markersequenz, wie
Antigen/Antikörper ) oder entsprechende „Mittel zum Nachweis des Bindungserfolges" kann beispielsweise mittels
Fluoresenzmarkierung, Biotiniylierung, Radio-Isotopen- Markierung oder kolloidale Gold- oder Latex-Partikel- Markierung in üblicher Weise erfolgen. Ein Nachweis von gebundenen Antikörpern erfolgt mit Hilfe von sekundären
Antikörpern, die mit handelsüblichen Reportermolekülen
markiert sind (z.B. Cy-, Alexa-, Dyomics, FITC- oder ähnliche Fluoreszenzfarbstoffe, , kolloidale Gold- oder Latex- Partikel), oder mit Reporter-Enzymen wie alkalischer
Phosphatase, Meerrettichperoxidase, usw. und den
entsprechenden colorimetrischen, fluoreszenten oder
chemolumineszenten Substraten. Eine Auslesung erfolgt z.B. mittels eines Microarray-Laserscanners , einer CCD-Kamera oder visuell . In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Arzneimittel / Wirkstoff oder Prodrug für Rheumatoide
Arthritis entwickelt und erhältlich durch den Einsatz des erfindungsgemäßen Assays oder Proteinbiochip.
Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Verwendung einer erfindungsgemäßen Anordnung oder eines Assays zum Screenen von Wirkstoffen für Rheumatoide Arthritis.
Beispiele und Figuren:
Figur 1: Tabellen 8 und 8a
Figur 2: Volcano Plot Rheumatoide Arthritis vs . Kontrolle Figur 3: Volcano Plot CCP negativ in der RA Gruppe vs .
Kontrolle
Beispiel 1: Auswahl der Markersequenz-Kandidaten und
Herstellung der Luminex-Beads Zehn oder mehr Patientenproben wurden individuell gegen eine cDNA Expressionsbibliothek gescreent. Die Rheumatoide
Arthritis-spezifischen Expressionsklone wurden ermittelt durch einen Vergleich mit zehn oder mehr gesunden Proben. Die
Identität der Markersequenzen wurde durch DNA-Sequenzierung ermittelt.
Es wird ein differentielles Screenen zwischen zwei
Proteinbiochips aus jeweils einer cDNA-Expressionsbank eines Patienten und einem gesunden Probanden durchgeführt und die differentiellen Klone werden mittels Fluoresenzmarkierung nachgewiesen und bioinformatorisch ausgewertet.
Es wurden etwa ~ 3.500 Proteine, die in Untersuchungen mit Proteinbiochips einbezogen, die als Antigene für entzündlichen Erkrankungen aufgefallen waren.
Diese 3.500 Proteine wurden daraufhin in größeren Mengen (mehrere mg) hergestellt, gereinigt und auf Luminex-Beads gekoppelt. Zusätzlich wurden bereits bekannte Biomarker
(public domain) , wie z.B. CCP für Rheumatoide Arthritis,
Aquaporin 4 für Neuromyolitis Optica, diverse Zytokine, typische Autoimmunmarker etc. hergestellt und zusammen mit den 3.500 Proteinen gemessen. Die Inklusion von bekannten
Autoantigen in Screening und Validierung ist insofern von
Bedeutung als hierdurch sehr schnell die besten neuen
Kandidaten ausgewählt werden können.
Beispiel 2: Auswahl der Patienten und Probanden für die Validierung der Markersequenz-Kandidaten.
Auswahl der Gruppe der zu testenden Personen: Patienten mit Rheumatoider Artritis (RA) und Probanden ohne Rheumatoide Arthritis (Kontrolle) .
Figure imgf000042_0001
Figure imgf000042_0002
Figure imgf000042_0003
Tabelle 4: Statistische Daten für DAS28
Gruppe N N Mean Median SD Min . Max .
miss
1 Kontrolle 0 71
2 RA 55 20 3,28 3.00 1.14 1.60 5.70 Tabelle 5: Statistische Daten für DAS28 im Hinblick auf die
Kategorie
Gruppe DAS 28 Range Häufigkeit Anteil
1 Kontrolle Remission <2.6 0 0.00
2 Kontrolle Low 2.6 - 0 0.00
3.1
3 Kontrolle Moderate >3.2 - 0 0.00
5.1
4 Kontrolle High >5.1 0 0.00
5 RA Remission <2.6 17 30.91
6 RA Low 2.6 - 13 23.64
3.1
7 RA Moderate >3.2 - 19 34.55
5.1
8 RA High >5.1 6 10.91
Figure imgf000043_0002
Beispiel 3: Identifizierung der erfindungsgemäßen
Markersequenzen
Tabelle 7 fasst die Klon-Sequenzen SEQ ID No . 1 bis 91 und 274 bis 293 zusammen, die für Rheumatoide Arthritis spezifisch sind und die zur Identifizierung der für Rheumatoide Arthritis spezifischen Sequenzen SEQ ID No . 92 bis 273 und 294 bis 333 verwendet wurden. Die Details zu den Sequenzdaten ergeben sich aus dem anliegenden Sequenzprotokoll.
Tabelle 7:
Figure imgf000043_0001
Νο.
1 dynein, light
Control chain, LC8-type
vs RA 8655 1 DYNLL1 ref NM. _003746 gi 4505813
2 asparagine
synthetase
Control (glutamine- vs RA 440 hydrolyzing) ASNS ref NM. _133436 gi 168229248
3 chromosome 11
Control open reading
vs RA 79703 frame 80 Cllorf80 ref NM. _024650 gi 170932471
4 CD151 molecule
Control (Raph blood
vs RA 977 group) CD151 ref NM. _004357 gi 21237748
5 Control
vs RA 896 cyclin D3 CCND3 ref NM. _001760 gi 4502619
6 Control
vs RA 309 annexin A6 ANXA6 ref NM. _004033 gi 71773415
7 ΡΙ-3-kinase- related kinase
Control SMG-1
vs RA 440354 pseudogene LOC440354 gi 194385888
8 RAP1GAP RAP1
GTPase
activating
Control protein [ Homo
vs RA 5909 sapiens ] RAP1GAP ref NM. _002885 gi 4506415
9 ADAM
Control metallopeptidas
vs RA 8751 e domain 15 ADAM15 ref NM. _207196 gi 46909598
10 adaptor-related
protein complex
Control 2, sigma 1
vs RA 1175 subunit AP2S1 ref NM. _004069 gi 70906430
11 methylmalonic
aciduria
(cobalamin
Control deficiency) cblB
vs RA 326625 type MMAB ref NM. _052845 gi 16418349
12 PRP3 pre-mRNA
processing
factor 3
Control homolog (S.
vs RA 9129 cerevisiae) PRPF3 ref NM. _004698 gi 4758556
13 tubulin tyrosine
ligase-like
Control family, member
vs RA 23170 12 TTLL12 ref NM. _015140 gi 11056036 Control
vs RA 3098 hexokinase 1 HK1 ref NM. .033500 gi 188497750 chromatin
licensing and
Control DNA replication
vs RA 81620 factor 1 CDT1 ref NM. .030928 gi 188497689 solute carrier
family 7 (amino
acid transporter
light chain, L
Control System),
vs RA 8140 member 5 SLC7A5 ref NM. .003486 gi 71979932 proprotein
convertase
Control subtilisin/kexin
vs RA 27344 type 1 inhibitor PCSK1N ref NM. .013271 gi 7019519
Control TLC domain
vs RA 727910 containing 2 TLCD2 gi 205830928 poliovirus
receptor-related
2 (herpesvirus
Control entry mediator ref NM. .0010427
vs RA 5819 B) PVRL2 24 gi 112789532 ubiquitin
Control specific
vs RA 84196 peptidase 48 USP48 ref NM. .032236 gi 52630449
RNA binding
protein,
autoantigenic
(hnRNP- associated with
lethal yellow
Control homolog
vs RA 22913 (mouse)) RALY ref NM. .016732 gi 8051631 roundabout,
axon guidance
receptor,
Control homolog 3
vs RA 64221 (Drosophila) ROB03 ref NM. .022370 gi 48476182
D-2- hydroxyglutarat
Control e
vs RA 728294 dehydrogenase D2HGDH ref NM. .152783 gi 119964728 transcription
elongation
Control factor A (Sll)-Iike ref NM. .0010069
vs RA 79921 4 TCEAL4 35 gi 55749442
Control 147808 zinc finger ZNF784 ref NM. .203374 gi 42794622 vs RA protein 784
UBE2M
ubiquitin- conjugating
Control enzyme E2M [
vs RA 9040 Homo sapiens ] UBE2M ref NM. _003969 gi 150417997
ZNF839 zinc
finger protein
Control 839 [ Homo
vs RA 55778 sapiens ] ZNF839 ref NM. _018335 gi 153251839 proprotein
convertase
Control subtilisin/kexin
vs RA 27344 type 1 inhibitor PCSK1N ref NM. _013271 gi 7019519 nuclear
Control distribution
vs RA gene C homolog
ccp neg 10726 (A. nidulans) NUDC ref NM. _006600 gi 5729953 lipid phosphate
Control phosphatase- vs RA related protein
ccp neg 9890 type 4 LPPR4 ref NM. _014839 gi 33636722
Control
vs RA dedicator of
ccp neg 1794 cytokinesis 2 DOCK2 ref NM. _004946 gi 31377468
Control lecithin- vs RA cholesterol
ccp neg 3931 acyltransferase LCAT ref NM. _000229 gi 4557892 epidermal
growth facto r
receptor
Control pathway
vs RA Substrate 15- ccp neg 58513 like 1 EPS15L1 ref NM. _021235 gi 10864047
Control
vs RA
ccp neg 1513 cathepsin K CTSK ref NM. _000396 gi 4503151
Control nucleolar
vs RA protein with
ccp neg 64434 MIF4G domain 1 NOM1 ref NM. _138400 gi 61097912
Control
vs RA
ccp neg 203068 tubulin, beta TUBB ref NM. _178014 gi 29788785 anaphase
Control promoting
vs RA complex subunit
ccp neg 119504 16 ANAPC16 ref NM. _173473 gi 27735039
Control 59277 netrin 4 NTN4 ref NM. _021229 gi 93204871 vs RA
ccp neg
Control
vs RA ribosomal
ccp neg 6232 protein S27 RPS27 ref NM. _001030 gi 4506711
Control
vs RA GRAM domain
ccp neg 23151 containing 4 GRAMD4 ref NM. _015124 gi 67763814
Control
vs RA ribosomal
ccp neg 6189 protein S3A RPS3A ref NM. _001006 gi 4506723
Control serine/arginine- vs RA rich splicing ref NM. ,0010316
ccp neg 6432 factor 7 SRSF7 84 gi 72534660 ubiquitin
specific
Control peptidase 7
vs RA (herpes virus- ccp neg 7874 associated) USP7 ref NM. _003470 gi 150378533
Control
vs RA SET nuclear
ccp neg 6418 oncogene SET ref NM. _003011 gi 170763498
Control
vs RA
ccp neg 11258 dynactin 3 (p22) DCTN3 ref NM. _007234 gi 6005745 squamous cell
Carcinoma
Control antigen
vs RA recognized by T
ccp neg 9733 cells 3 SART3 ref NM. _014706 gi 7661952
Control
vs RA
ccp neg 5217 profilin 2 PFN2 ref NM. _053024 gi 16753215
Control
vs RA
ccp neg 302 annexin A2 ANXA2 ref NM. _004039 gi 4757756
Control glycosyltransfer
vs RA ase 8 domain
ccp neg 55830 containing 1 GLT8D1 ref NM. _018446 gi 8923855
Control interleukin 1
vs RA receptor
ccp neg 3557 antagonist IL1RN ref NM. _000577 gi 10835147
Control
vs RA transmembrane
ccp neg 90809 protein 55B TMEM55B ref NM. _144568 gi 154816184
Control
vs RA zinc finger
ccp neg 163033 protein 579 ZNF579 ref NM. _152600 gi 110681708 Control chromosome 16
vs RA open reading
ccp neg 9605 frame 7 C16orf7 ref NM. _004913 gi 108860690
Control
vs RA spectrin, beta, ref NM. ,0010248
ccp neg 6710 erythrocytic SPTB 58 gi 67782321
Control
vs RA
ccp neg 2934 gelsolin GSN ref NM. _198252 gi 38044288
Control
vs RA tripartite motif
ccp neg 4591 containing 37 TRIM37 ref NM. _015294 gi 15147333
Control
vs RA tubulin folding
ccp neg 6903 cofactor C TBCC ref NM. _003192 gi 4507373 cell division
Control cycle 37
vs RA homolog (S.
ccp neg 11140 cerevisiae) CDC37 ref NM. _007065 gi 5901922 eukaryotic
Control translation
vs RA initiation factor
ccp neg 7458 4H EIF4H ref NM. _031992 gi 14702180 spastic
paraplegia 7
(pure and
Control complicated
vs RA autosomal
ccp neg 6687 recessive) SPG7 ref NM. _003119 gi 4507173
Control RUN and FYVE
vs RA domain
ccp neg 22902 containing 3 RUFY3 ref NM. _014961 gi 7662352
Control
vs RA ribosomal
ccp neg 6144 protein L21 RPL21 ref NM. _000982 gi 18104948
Control
vs RA F-box protein,
ccp neg 84893 helicase, 18 FBX018 ref NM. _178150 gi 30795119 branched chain
Control ketoacid
vs RA dehydrogenase
ccp neg 10295 kinase BCKDK ref NM. _005881 gi 171906589
Control
vs RA ligase III, DNA,
ccp neg 3980 ATP-dependent LIG3 ref NM. _002311 gi 73747844
Control
vs RA laminin, beta 2
ccp neg 3913 (laminin S) LAMB2 ref NM. _002292 gi 119703755 family with
Control sequence
vs RA similarity 171, ref NM. ,0010109
ccp neg 221061 member AI FAM171A1 24 gi 63025206 carbamoyl- phosphate
synthetase 2,
aspartate
Control transcarbamylas
vs RA e, and
ccp neg 790 dihydroorotase CAD ref NM. _004341 gi 18105007 eukaryotic
translation
Control initiation factor
vs RA 2B, subunit 3
ccp neg 8891 gamma, 58kDa EIF2B3 ref NM. _020365 gi 9966779
La
ribonucleoprote
Control in domain
vs RA family, member
ccp neg 23367 1 LARP1 ref NM. _015315 gi 39725634
Control
vs RA laminin, beta 2
ccp neg 3913 (laminin S) LAMB2 ref NM. _002292 gi 119703755
Control
vs RA
ccp neg 4000 lamin A/C LMNA ref NM. _170707 gi 27436946 huntingtin
Control interacting
vs RA protein 1
ccp neg 9026 related HIP1R ref NM. _003959 gi 48762942
Control
vs RA makorin ring
ccp neg 23608 finger protein 1 MKRN1 gi 119604358
PCF11, cleavage
and
polyadenylation
Control factor subunit,
vs RA homolog (S.
ccp neg 51585 cerevisiae) PCF11 ref NM. _015885 gi 33620745
Control heat shock
vs RA 105kDa/110kDa
ccp neg 10808 protein 1 HSPH1 ref NM. _006644 gi 42544159 proteasome
(prosome,
Control macropain) 26S
vs RA subunit, nonccp neg 5716 ATPase, 10 PSMD10 ref NM. _002814 gi 4506217 calmodulin
regulated
spectrin-
Control associated
vs RA protein family,
ccp neg 57662 member 3 CAMSAP3 ref NM. _020902 gi 130502140
Control
vs RA makorin ring
ccp neg 23608 finger protein 1 MKRN1 ref NM. _013446 gi 223468619
ΡΙ-3-kinase- related kinase
Control SMG-1
vs RA 440354 pseudogene LOC440354 AK304513 gi 194385888
Control TLC domain ref NM. ,0011644
vs RA 727910 containing 2 TLCD2 07 gi 256542293 thyroid
hormone
Control receptor
vs RA 9322 interactor 10 TRIP10 ref NM. _004240 gi 11342676 lipopolysacchari
Control de-induced TNF
vs RA 9516 factor LITAF ref NM. _004862 gi 65787265
G protein- coupled
receptor kinase
Control interacting
vs RA 9815 ArfGAP 2 GIT2 ref NM. _057169 gi 17149830 chromatin
Control modifying
vs RA 79643 protein 6 CHMP6 ref NM. _024591 gi 31542673 single-stranded
Control DNA binding
vs RA 23635 protein 2 SSBP2 ref NM. _012446 gi 40787999 valyl-tRNA
synthetase 2,
Control mitochondrial
vs RA 57176 (putative) VARS2 ref NM. _020442 gi 55741845 heterogeneous
nuclear
Control ribonucleoprote
vs RA 3190 in K HNRNPK ref NM. _031263 gi 14165437
ADP-
Control ribosylation
vs RA 375 factor 1 ARF1 ref NM. _001658 gi 4502201 mannosidase,
Control alpha, class 2A,
vs RA 4122 member 2 MAN2A2 ref NM. _006122 gi 51477716
Control 54522 ankyrin repeat ANKRD16 ref NM. _019046 gi 58331111 vs RA domain 16
Control
vs RA
ccp
neg/Con
trol vs clathrin, light
RA 1211 chain A CLTA ref NM. _007096 gi 6005993 nardilysin (N-
Control arginine dibasic ref NM. ,0011016
vs RA 4898 convertase) NRD1 62 gi 156071452
Polymerase
(DNA directed),
Control delta 2,
vs RA accessory
ccp neg 5425 subunit POLD2 ref NM. _006230 gi 379056381
Control Rho family
vs RA 27289 GTPase 1 RND1 ref NM. _014470 gi 7657514
Control
vs RA
ccp fizzy/cell
neg/Con division cycle 20
trol vs related 1 ref NM. ,0011361
RA 51343 (Drosophila) FZR1 97 gi 209969678
Control tubulin, beta 3
vs RA 10381 class III TUBB3 ref NM. _006086 gi 50592996
Control kinesin family
vs RA 3799 member 5B KIF5B ref NM. _004521 gi 4758648
Control creatine kinase,
vs RA 1152 brain CKB ref NM. _001823 gi 21536286
Control zinc finger
vs RA 7552 protein 711 ZNF711 ref NM. _021998 gi 68348723 phosphoprotein
Control enriched in
vs RA 8682 astrocytes 15 PEA15 ref NM. _003768 gi 4505705 kinase D- interacting
Control Substrate,
vs RA 57498 220kDa KIDINS220 ref NM. _020738 gi 55741641
Control poly (ADP- vs RA ribose) ref NM. ,0010426
ccp neg 10038 Polymerase 2 PARP2 18 gi 110825963
Control ethylmalonic
vs RA encephalopathy
ccp neg 23474 1 ETHE1 ref NM. _014297 gi 41327741
Control
vs RA
ccp neg 1509 cathepsin D CTSD ref NM. _001909 gi 4503143
Control 3303 heat shock HSPA1A ref NM. _005345 gi 194248072 vs RA 70kDa protein
ccp neg 1A
289 coiled-coil
Control domain
vs RA 79140 containing 28B CCDC28B ref NM. _024296 gi 110349769
290 ribosomal
protein S6
Control kinase, 90kDa,
vs RA 6196 Polypeptide 2 RPS6KA2 ref NM. _021135 gi 19923570
291 Control 5'-nucleotidase
vs RA domain
ccp neg 64943 containing 2 NT5DC2 ref NM. _022908 gi 12597653
292 6-
Control phosphoglucon
vs RA 25796 olactonase PGLS ref NM. _012088 gi 6912586
293 RAB, member
Control RAS oncogene
vs RA 55684 family-like 6 RABL6 ref NM. _024718 gi 186700623
Die Statistischen Ergebnisse zu den validierten Markersequenz- Kandidaten (erfindungsgemäße Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis) sind in den Tabellen 8 und 8a (Figur 1) angegeben.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Identifizierung von Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis (RA) umfassend die Schritte: a) Auswahl von Markersequenz-Kandidaten dadurch, dass
Proteinbiochips, die eine cDNA Expressionsbibliothek repräsentieren mit mindestens 10 Patientenproben und mindestens 10 Proben von Gesunden gescreent werden und wobei jede Probe einzeln gemessen wird und Markersequenz- Kandidaten für RA durch einen Vergleich der Ergebnisse der Screens, die mit den RA-Patientenproben und der
Ergebnisse der Screens die mit den Proben von Gesunden erhalten werden, ausgewählt werden, b) Herstellung der durch die Markersequenz-Kandidaten
kodierten Proteine und / oder Teilproteine (Peptide) durch Expression der cDNA der Markersequenz-Kandidaten, c) Herstellung von Beads an die ein oder mehrere der in
Schritt b) hergestellten Proteine und / oder Teilproteine (Peptide) gekoppelt sind, d) Validierung der an die Beads gekoppelten Markersequenz- Kandidaten mittels Proben von Patienten mit RA und Proben von Gesunden dadurch, dass Markersequenzen für RA mit den Proben von Patienten mit RA eine Wechselwirkung zeigen und mit den Proben von Gesunden eine im Vergleich dazu geringere oder keine Wechselwirkung zeigen und wobei die Markersequenzen SEQ ID No . 1 bis 182, SEQ ID. No . 183 bis 273, SEQ ID No . 274 bis 313 und SEQ ID No . 314 bis SEQ ID No . 333 erhalten werden. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass eine Wechselwirkung zwischen Markersequenz-Kandidat und den Proben in Verfahrensschritt d) mittels eines
Fluoreszenzsignals nachgewiesen wird und wobei die Intensität des Fluoreszenzsignals mit der Stärke der Wechselwirkung korreliert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte c) und d) in
Gegenwart von CPP (Cytochrom c Peroxidase) durchgeführt werden und wobei die Markersequenzen SEQ ID No . 29 bis 79, SEQ ID No. 120 bis 170, SEQ ID No . 211 bis 261, SEQ ID No. 274, SEQ ID No . 276, SEQ ID No . 278, SEQ ID No . 285 bis 288, SEQ ID No . 291, SEQ ID No . 294, SEQ ID No . 296, SEQ ID No . 298, SEQ ID No . 305 bis 308, SEQ ID No . 311, SEQ ID No. 314, SEQ ID No . 316, SEQ ID No . 318, SEQ ID No. 325 bis 328, SEQ ID No . 331 erhalten werden.
Markersequenz für Rheumatoide Arthritis erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und wobei die Markersequenz ausgewählt wird aus der Gruppe der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 182 und SEQ ID. No . 274 bis 313, einer zu den Sequenzen SEQ ID No . 1 bis 182 oder SEQ ID No . 274 bis 313 homologen Sequenz oder einer Teilsequenz von SEQ ID No. 1 bis 182 oder SEQ ID. No. 274 bis 313 oder einem durch SEQ ID No . 1 bis 182 oder SEQ ID. No . 274 bis 313 kodierten Protein oder einem durch eine Teilsequenz von SEQ ID No. 1 bis 182 oder SEQ ID. No . 274 bis 313 kodierten Protein oder einem durch eine homologe Sequenz von SEQ ID No. 1 bis 182 oder SEQ ID. No . 274 bis 313 kodierten Protein oder einer genomischen Sequenzen, die eine der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 182 oder SEQ ID. No . 274 bis 313 umfasst. Markersequenz für Rheumatoide Arthritis erhältlich durch ein Verfahren nach Anspruch 3 und wobei die
Markersequenz ausgewählt wird aus der Gruppe der
Sequenzen SEQ ID No . 29 bis 79, SEQ ID No . 274, SEQ ID No. 276, SEQ ID No . 278, SEQ ID No . 285 bis 288, SEQ ID No. 291 oder SEQ ID. No . 120 bis 170, SEQ ID No . 294, SEQ ID No. 296, SEQ ID No . 298, SEQ ID No . 305 bis 308, SEQ ID No. 311, einer zu den Sequenzen SEQ ID No . 29 bis 79, SEQ ID No . 274, SEQ ID No . 276, SEQ ID No . 278, SEQ ID No. 285 bis 288, SEQ ID No . 291 oder SEQ ID No . 120 bis 170, SEQ ID No . 294, SEQ ID No . 296, SEQ ID No . 298, SEQ ID No . 305 bis 308, SEQ ID No . 311 homologen Sequenz oder einer Teilsequenz von SEQ ID No . 29 bis 79, SEQ ID No. 274, SEQ ID No . 276, SEQ ID No . 278, SEQ ID No. 285 bis 288, SEQ ID No . 291 oder SEQ ID. No . 120 bis 170, SEQ ID No . 294, SEQ ID No . 296, SEQ ID No . 298, SEQ ID No . 305 bis 308, SEQ ID No . 311 oder einem durch SEQ ID No . 29 bis 79, SEQ ID No . 274, SEQ ID No . 276, SEQ ID No . 278, SEQ ID No . 285 bis 288, SEQ ID No . 291 oder SEQ ID. No . 120 bis 170, SEQ ID No . 294, SEQ ID No. 296, SEQ ID No . 298, SEQ ID No . 305 bis 308, SEQ ID No . 311 kodierten Protein oder einem durch eine Teilsequenz von SEQ ID No . 29 bis 79, SEQ ID No . 274, SEQ ID No. 276, SEQ ID No . 278, SEQ ID No . 285 bis 288, SEQ ID No. 291 oder SEQ ID. No . 120 bis 170, SEQ ID No . 294, SEQ ID No . 296, SEQ ID No . 298, SEQ ID No . 305 bis 308, SEQ ID No . 311 kodierten Protein oder einem durch eine homologe Sequenz von SEQ ID No . 29 bis 79, SEQ ID No. 274, SEQ ID No . 276, SEQ ID No . 278, SEQ ID No . 285 bis 288, SEQ ID No . 291 oder SEQ ID. No . 120 bis 170, SEQ ID No. 294, SEQ ID No . 296, SEQ ID No . 298, SEQ ID No. 305 bis 308, SEQ ID No . 311 kodierten Protein oder einer genomischen Sequenzen, die eine der Sequenzen SEQ ID No. 29 bis 79, SEQ ID No . 274, SEQ ID No . 276, SEQ ID No. 278, SEQ ID No . 285 bis 288, SEQ ID No . 291 oder SEQ ID. No. 120 bis 170, SEQ ID No . 294, SEQ ID No . 296, SEQ ID No . 298, SEQ ID No . 305 bis 308, SEQ ID No . 311 umfasst .
6. Verwendung von einer oder mehreren Markersequenz (en) nach Anspruch 4 oder 5 zur Diagnose von Rheumatoider Arthritis und wobei die Markersequenz (en) an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt
wird/werden .
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
dass 2 oder 3, vorzugsweise 4 oder 5, besonders bevorzugt 6, 7 oder 8 oder mehr verschiedene
Markersequenzen, beispielsweise 10 bis 20 oder 30 oder mehr verschiedene Markersequenzen an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt werden.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Markersequenz (en) auf einem festen Träger aufgebracht wird/werden, wobei der feste Träger ausgewählt wird aus Filter, Membranen, Wafer, beispielsweise Silizium-Wafer , Glas, Metall,
Kunststoff, Chips, massenspektrometrische Targets, Matrix, Beads, beispielsweise magnetische,
beschichtete oder markierte Beads, wie Fluorophor- markierte Beads oder Luminex-Beads .
9. Verfahren zur Diagnose von Rheumatoider Arthritis,
wobei a. ) mindestens eine Markersequenz nach Anspruch 4 oder 5 auf einen festen Träger, vorzugsweise auf ein Bead aufgebracht wird und
b. ) mit Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug eines Patienten in Kontakt gebracht wird und
c. ) der Nachweis einer Wechselwirkung der
Körperflüssigkeit oder des Gewebeauszugs mit der Markersequenz aus a.) erfolgt.
10. Verfahren zum Stratifizieren, insbesondere zur
Risikostratifizierung, oder zur Therapiesteuerung eines Patienten mit Rheumatoider Arthritis, wobei mindestens eine Markersequenz nach Anspruch 4 oder 5 verwendet wird, um eine Probe des Patienten zu untersuchen.
11. Anordnung umfassend ein oder mehrere Markersequenz (en) nach Anspruch 4 oder 5.
12. Assay oder Proteinarray umfassend eine Anordnung nach Anspruch 11.
13. Verwendung einer Anordnung nach Anspruch 11 oder eines Assays oder Proteinarrays nach Anspruch 12 zur
Identifizierung und/oder Charakterisierung einer
Substanz für Rheumatoide Arthritis enthaltend Mittel zum Nachweis eines Bindungserfolges, dadurch gekennzeichnet, dass eine Anordnung oder ein Assay oder Proteinarray mit a.) mindestens einer zu untersuchenden Substanz in
Kontakt gebracht wird und b.) ein Bindungserfolg
nachgewiesen wird.
14. Diagnostikum zur Diagnose von Rheumatoider Arthritis
enthaltend mindestens eine Markersequenz nach Anspruch 4 oder 5 und gegebenenfalls weitere Hilfs- und Zusatzstoffe .
5. Verwendung mindestens einer Markersequenz ausgewählt aus den MarkerSequenzen nach Anspruch 5 zur Identifizierung einer Subgruppe von Patienten innerhalb der Gruppe der Patienten mit Rheumatoider Arthritis, wobei die
Patienten der Subgruppe nicht mittels des Markers CCP identifiziert werden können.
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