WO2013147398A1 - 세포 활성도 측정 장치 및 세포 활성도 분석 방법 - Google Patents

세포 활성도 측정 장치 및 세포 활성도 분석 방법 Download PDF

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cell activity
image sensor
shadow
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서성규
진건수
하운환
백세환
백승필
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Korea University Research and Business Foundation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability

Definitions

  • the present invention relates to a cell activity measuring device and a cell activity analysis method, and more particularly, to analyze the cell activity using a shadow image of the cell continuous and high throughput cell activity measuring device and measured cell activity
  • the present invention relates to a method of assaying cell activity.
  • Cell death or activity monitoring is an important step in the development of modern drugs and foods. Observation of cell reactivity or the death of a particular drug or sample is essential during the study. Techniques traditionally developed for cell proliferation or activity monitoring are:
  • ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
  • Western blots are methods of detecting proteins by electrophoresis. First, a protein is fractionated by polyacrylamide gel electrophoresis, and then a specific protein is detected by radioimmunoassay by transferring the location of the purified fraction to a filter paper as it is.
  • Immunohistochemistry is a method in which a specific antigen present in a tissue or cell is visualized using a label antibody and manipulated so that it can be observed by an optical microscope or an electron microscope.
  • An object of the present invention is to provide a cell activity measuring device based on shadow imaging technology that can observe the cells without destroying the sample continuously without a separate reagent treatment.
  • An object of the present invention is to provide a cell activity analysis method for analyzing the activity of the cell by extracting a specific parameter from the shadow image of the cell taken by the image sensor.
  • a fluidic channel into which a culture solution and cells are injected;
  • a light emitting device positioned above the fluidic channel to emit light toward the fluidic channel;
  • an image sensor positioned below the fluidic channel to capture a shadow image of the cell.
  • a well plate into which the culture solution and cells are injected;
  • a light emitting device positioned above the well plate and emitting light toward the well plate;
  • an image sensor positioned under the well plate to capture a shadow image of the cell.
  • a culture chip and a cell chip is injected;
  • a light emitting device positioned above the cell chip to emit light toward the cell chip;
  • an image sensor positioned under the cell chip to capture a shadow image of the cell.
  • a light emitting device for emitting light
  • a cell storage means positioned below the light emitting device and including a space into which cells and cultures can be injected, and an image sensor for capturing a shadow image of the cells.
  • a cell activity analysis method includes displaying an activation state of a cell using the calculated parameters.
  • Cell activity measuring apparatus can be used to observe a large amount of cells continuously without a separate reagent while using a simple and low-cost device.
  • the cell activity analysis method uses the pixel value of the shadow image of the cell, so that the activity of the cell can be easily analyzed without an expensive microscope or an apparatus such as an ELISA reader.
  • FIG. 1 is a cell activity measurement apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a form in which the fluidic channel illustrated in FIG. 1 is surrounded by a temperature controller.
  • 3 to 5 is a cell activity measurement apparatus according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a block diagram of an analysis module associated with an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating a shadow image of cells photographed through the cell activity measuring apparatus of FIG. 1 and an image of cells photographed through a microscope.
  • FIG. 8 is a flowchart illustrating a method of analyzing activity of cells related to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a diagram illustrating a nuclear differentiation state of cells photographed through the cell activity measuring apparatus of FIG. 1.
  • FIG. 10 is a diagram illustrating a shadow image of living and dead cells taken by the cell activity measuring apparatus of FIG. 1.
  • FIG. 11 is a diagram illustrating the shadow image of FIG. 10 through an image processing technique.
  • FIG. 12 is a view for explaining a method of counting the number of cells in the activity analysis method of the cells according to an embodiment of the present invention.
  • the cell storage means means a means containing a space in which cells are injected, cultured or measured.
  • the cell storage means may include fluidic channels, well plates, cell chips, and the like.
  • the cell activity measuring apparatus 100 is a form in which a fluidic channel is used as a cell storage means.
  • the cell activity measuring device 100 includes a light emitting device 110, a pinhole 120, a fluidic channel 130, an image sensor 140, a distance controller 150, and an analysis module 160. It may include.
  • the light emitting device 110 emits light to capture a shadow image of the cell.
  • the light emitting device may be positioned in the fluidic channel 130 into which cells and culture medium (medium or media) are injected.
  • the light emitting device 110 may include an RGB light-emitting diode (LED) for clear shadow image capturing.
  • LED RGB light-emitting diode
  • the pinhole 120 may be coupled to the bottom of the light emitting device 110 to sharpen the shadow image of the cell. That is, the pinhole 120 may be used to increase the coherence and illuminance of light.
  • the pinhole 120 may be manufactured in the form of a film mask made of plastic.
  • the plastic film mask pinhole can be attached to the front of the light emitting device 110 after being output to an OHP film using a high resolution laser printer, so that the manufacturing cost is much cheaper than that of a general plastic or metal material and can be easily manufactured. have.
  • three pinholes should be positioned at intervals of several tens of micrometers. Using the output method, it is easy to design multiple pinholes on a computer.
  • the fluidic channel 130 may be configured to have a width of several mm or less, so as to reduce the volume of the culture solution containing the injected cells. This is because, when the concentration of cells used for activity measurement is high, the noise may be large when analyzing the shadow image.
  • At least a part of the sidewall of the fluidic channel 130 may be implemented with a polydimethylsiloxane (PDMS) material.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the reason for this implementation is the supply of oxygen for cell culture, because polydimethylsiloxane (polydimethylsiloxane, PDMS) is permeable to oxygen due to the properties of the material. Therefore, when at least a part of the sidewall is implemented with a polydimethylsiloxane (PDMS) material, a separate oxygen supply device is not required.
  • the fluidic channel 130 may include a flow cell 131, a wall 132, and a cover glass 133.
  • the flow cell 131 is a place where cells and culture fluid are injected and discharged, and may serve as a cover of the fluidic channel 130.
  • the flow cell 131 may be manufactured using a material such as glass, plastic, or crystal.
  • the wall 132 is made of polydimethylsiloxane (PDMS) material to secure a space for the cells to grow between the upper flow cell 131 and the lower cover glass 133, and the middle portion is drilled to prevent the culture medium from counting. It can be produced in the form.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • oxygen which is essential for cell culture, may be permeated due to the nature of the PDMS material. Therefore, there is no need for a separate oxygen supply device in the fluidic channel 130.
  • the wall 132 may be manufactured to a thickness of about 1 mm for miniaturization of the cell activity measuring apparatus 100.
  • the cover glass 133 may be located at the bottom of the wall 132 and serve as a bottom of the fluidic channel 130.
  • the image sensor 140 may capture a shadow image of the cell under the fluidic channel 130.
  • the image sensor 140 may be implemented as a complementary metal-oxide semiconductor (CMOS) image sensor.
  • CMOS image sensor is a low power consumption type imaging device having a complementary metal oxide semiconductor (CMOS) structure.
  • CMOS complementary metal oxide semiconductor
  • the image sensor 140 may be implemented without a lens.
  • the CMOS image sensor is inexpensive and has a high processing speed because it can be mass-produced through a semiconductor process. In addition, the range of observation is wider than that of an image sensor based microscope using a lens, and the analysis can be quantified and automated.
  • the distance controller 150 may be combined with the image sensor 140 to adjust the distance between the image sensor 140 and the fluidic channel 130. That is, the distance adjusting unit 150 narrows the distance between the cover glass 133 and the image sensor 140 sensor as much as possible to finely position the position of the image sensor 140 to capture a shadow image of high contrast. To make adjustments.
  • the analysis module 160 analyzes the shadow image photographed by the image sensor 140 through an image processing technique. Detailed functions of the analysis module 160 will be described later.
  • the cell activity measuring device 100 may further include a temperature control unit for maintaining the cultured cells at a constant temperature.
  • FIG. 2 is a view illustrating a form in which the fluidic channel illustrated in FIG. 1 is surrounded by a temperature controller.
  • the temperature controller 170 may serve as an incubator to surround the fluidic channel 130 so that cells can be cultured at a constant temperature (eg, 37′C).
  • the temperature controller 170 may control the temperature and may include a temperature sensor 171.
  • the shadow image of the cell photographed by the image sensor 140 is transmitted to the analysis module 160 to analyze the activation state of the cell.
  • the cell activity measuring device 300 is a form in which a well plate is used as a cell storage means.
  • the cell activity measuring apparatus 300 may include the light emitting device 310, the pinhole 320, the well plate 330, the image sensor 340, the distance controller 350, and the analysis module 360. It may include.
  • the light emitting device 310, the pinhole 320, the image sensor 340, the distance controller 350, and the analysis module 360 may have the same configuration as shown in FIG. 1, and thus, detailed descriptions thereof will be omitted. I'll do it.
  • the well plate 330 is positioned under the light emitting device 310 to form a plurality of wells.
  • Well means a space into which a sample can be injected.
  • a 96 well plate or a 24 well plate may be used as the well plate 330.
  • a 96 or 24 well plate is a well plate in which 96 or 24 wells are formed.
  • the well plate 330 may use a black well plate having a thin bottom of the well and low optical interference to obtain a shadow image with minimal light loss.
  • the well plate 330 may be manufactured to be movable for a change of a point irradiated from the light emitting device 310 or a change of a point detected from the CMOS image sensor 340.
  • the well plate 330 may be manufactured to be rotatable.
  • the cell activity measuring device 300 may further include a temperature control unit for maintaining the cultured cells at a constant temperature.
  • the cell activity measuring apparatus 400 is a form in which a cell chip is used as a cell storage means.
  • the cell activity measuring apparatus 400 may include a light emitting device 410, a pinhole 420, a cell chip 430, an image sensor 440, a distance controller 450, and an analysis module 460. It may include.
  • the light emitting device 410, the pinhole 420, the image sensor 440, the distance controller 450, and the analysis module 460 may have the same configuration as shown in FIG. 1, and thus, detailed descriptions thereof will be omitted. I'll do it.
  • Cell chip 430 is a cell storage means implemented in the form of a chip provided with a space in which cells and culture medium can be injected.
  • the cell chip 430 is a biochip capable of detecting the activity of a living cell or a complex physiological signal by the cell and may be used for counting cells.
  • a general cell chip is used by bonding or assembling a substrate made of two upper, lower optically transparent sheets of glass, plastic, or a polymer material with a space for storing cells therebetween.
  • the cell chip for cell shadow imaging to be used in the present invention In the case of 430, the lower plate has a thickness of about 0.1 mm to about 1.0 mm.
  • the thickness of the bottom plate is as thin as 0.1mm ⁇ 1.0mm.
  • FIG. 5 is a cell activity measurement apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • the cell activity measuring apparatus 400 may include a light emitting device 510, a pinhole 520, an image sensor 530, a distance controller 540, and an analysis module 550.
  • the light emitting device 510, the pinhole 520, the image sensor 530, the distance controller 540, and the analysis module 560 may have the same configuration as shown in FIG. 1, and thus, detailed description thereof will be omitted. I'll do it.
  • the image sensor 530 may be implemented to allow the cell storage means to be stably seated.
  • the cell activity measuring apparatus 500 is a form in which a cell storage means is not included as a component and a space for accommodating the cell storage means is provided. That is, the cell activity measuring device 500 is not configured as a set together with the cell storage means, but is provided with a space in which the cell storage means can be seated or accommodated, so that the cell storage means can be replaced in various forms as necessary. Can be implemented. For example, when the cell activity measuring device 500 requires a well plate as a cell storage means, the cell plate is mounted on the image sensor 530 to measure the activity of the cell by mounting the well plate on the image sensor 530. If a chip is required, the activity of the cell may be measured by mounting the cell chip on the image sensor 530.
  • the cell activity measuring device 500 may be used for a specific cell storage means dedicated seating or receiving purposes.
  • the cell activity measuring device 500 may be manufactured in a form in which the cell chip may be seated exclusively.
  • the cell activity measuring apparatuses 100, 300, 400, and 500 described above may include the same assay module.
  • FIG. 6 is a block diagram of the analysis module shown in FIG. 1.
  • the illustrated analysis module 160 may be implemented as one component of the cell activity measuring device 100, but may also be implemented as a device separate from the cell activity measuring device 100.
  • the analysis module 160 may include a receiver 161, an extractor 162, a pixel filter 163, a display 164, and a controller 165.
  • the receiver 161 may receive a shadow image from the image sensor 140.
  • the shadow image reception may be received through various communication methods (for example, wireless communication) when the analysis module 160 exists separately from the cell activity measuring apparatus 100.
  • the extractor 162 may calculate a specific parameter for analyzing cell activity from the shadow image. For example, the signal-to-noise ratio (SNR) value, the shadow diameter (SD) value, the maximum pixel value, the position of the pixel with the maximum value, the minimum pixel value, the position of the pixel with the minimum value, the first bright ring
  • SNR signal-to-noise ratio
  • SD shadow diameter
  • the diameter, the diameter of the first dark ring, the width between the bright and dark rings, the area occupied by the shadow image, and the circularity of the shadow image can be parameters for cell activity analysis.
  • SNR Signal-to-Noise Ratio
  • the SNR may be represented by Equation 1.
  • SD Shadow Diameter
  • a diameter of a cell shadow image extracted from a brightness value of a pixel designated to include a cell is expressed as a root mean square.
  • the SD may be expressed as Equation 2.
  • n, x, and f (x) represent the maximum number of pixels, the designated pixel, and the brightness value of the specified pixel, respectively.
  • the shadow image of the cell may be a circular image in which bright and dark rings alternately appear in a donut shape.
  • the first bright ring in the center is called the first bright ring
  • the first dark ring in the center is called the first dark ring.
  • the circularity of the shadow image may be a measure of how much the shadow image is similar to the circle.
  • the pixel filtering unit 163 may designate only a specific pixel in the shadow image by using the specific parameter, the similarity with the specific shape, and the like. Detailed description thereof will be described later.
  • the display unit 164 may display an activation state of the cells by using an item for cell activity analysis extracted by the extractor 162.
  • the controller 165 controls overall functions performed by the receiver 161, the extractor 162, the pixel filter 163, and the display 164.
  • Human Aveolar Epithelial Cell (A549), which is a human lung epithelial cell, was used.
  • the initial concentration is 250,000 cells / ml.
  • the oxygen demand of the cells cultured in the fluidic channel 130 is 5.795 x 10 -7 mol / day, but the oxygen permeation rate of the wall 132 made of PDMS material is 1.771 x 10 -6 mol / day. It is not necessary.
  • the culture drug injected for cell culture was CO 2 independent media (18045, GIBCO), which does not require a separate CO 2 supply.
  • the medicine was injected into the fluidic channel 130 at a rate of 5-10 ⁇ l / min using a separate syringe pump (M200, KD Scientific).
  • an RGB light emitting diode was used as the light emitting device 110
  • a CMOS image sensor was used as the image sensor 140.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating a shadow image of cells photographed through the cell activity measuring apparatus of FIG. 1 and an image of cells photographed through a microscope.
  • the nuclear differentiation of cells can be easily observed without a microscope.
  • nuclear differentiation of cells observed under a microscope (yellow photo) as shown in FIG. was also observed in the cell shadow image.
  • This change in shadow image is graphed in three dimensions (Fig. 7 (b)) and two dimensions (Fig. 7 (c)) using image processing techniques. It can be seen that the shadow pattern changes rapidly between.
  • FIG. 8 is a flowchart illustrating a method of analyzing cell activity using an assay module.
  • the receiver 161 may receive the shadow image of the cell photographed through the image sensor 140 (S810).
  • the extractor 162 may calculate a specific parameter from the received shadow image of the cell (S820).
  • SNR values and SDs were extracted from specific parameters.
  • the pixel filtering unit 163 may designate only a specific pixel in the shadow image by using the similarity with the specific shape (S830).
  • the pixel filtering unit 163 may select and specify only pixels whose circularity of pixels forming a shadow pattern of the cell corresponds to a specific range.
  • the display unit 164 may graph and display the extracted SNR value and the SD value according to time (S840).
  • FIG. 9 is a graph showing the SNR value and the SD value with time from the shadow image of the cells used in the experimental example.
  • FIG. 9 (a) shows the change in SNR
  • FIG. 9 (b) shows the change in SD. Both results show a large change in the time of nuclear differentiation between 4 and 10 hours after the start of the experiment. .
  • FIG. 10 is a diagram illustrating a shadow image of living and dead cells taken by the cell activity measuring apparatus of FIG. 1.
  • the cell activity measuring apparatus 100 After culturing the cells for a long time to measure the activity of the cells, some cell groups were heated to induce death. Experiments were performed such that thousands of normal cell groups (left) and dead cell groups (right) were mixed on one shadow image captured by the image sensor 140 as shown in FIG. As a result, as shown in Fig. 10 (b) and 10 (c) it was possible to clearly distinguish between the life and death of the cell under the microscope.
  • the cell activity measuring device 100 may observe cell activity beyond that taken by a microscope.
  • FIG. 11 is a diagram illustrating the shadow image of FIG. 10 through an image processing technique.
  • FIG. 11 shows the change in values for live and dead cell populations using previously defined SNR and SD values to quantify the life and death of the cell population using shadow images.
  • FIGs. 11 (a) and 11 (b) when the cells were alive and dead, it was possible to observe larger SNR and SD changes than those observed during cell nuclear differentiation.
  • Figure 11 (c) shows how the shadow pattern of a particular cell changes for 60 hours.
  • FIG. 12 is a view for explaining a method of counting the number of cells in the activity analysis method of the cells according to an embodiment of the present invention.
  • the method may include selecting specific pixels using the similarity between the pixel and the specific shape of the shadow image of the cell.
  • the circularity of the pixels forming the shadow pattern of the cell may be selected and specified only for the pixels corresponding to a specific range. Through this, it is possible to effectively select and remove the linear dust particles and the like that are different from the shadow pattern of the cells near the circle.
  • the circularity of the pixels can be calculated by dividing the smaller of the width or length of the shadow pattern by the larger value.
  • a perfectly circular shadow image may have a circularity value of 1 and may have a value between 0 and 1 as the circularity decreases.
  • FIG. 12 (a) performs first-order discrimination (live cells of dotted lines or more areas of FIG. 11 (a)) by using SNR values extracted from shadow images of cells, and uses an image processing technique.
  • the embodiment shown in red pixels is shown.
  • pixels having a specific SNR value (about 18 dB) or more in the entire shadow image are selected by selecting red.
  • FIG. 12B is an image in which a specific portion of FIG. 12A is enlarged by digital zoom.
  • the second determination living region below the dashed line in FIG. 11 (b) is a living cell
  • the living normal cells are displayed in silhouette form as shown in FIG. 12 (c). do.
  • a pixel cluster having a circular circularity of 0.3 to 1.0 while the SD of pixels of the selected red region among the selected red pixel clusters is less than a specific value (approximately 24 um or less) through the primary discrimination and has a value of 0.3 to 1.0.
  • a specific value approximately 24 um or less
  • the cell activity is quantified by counting only the shadow images that are considered to be alive.
  • FIG. 12 (d) shows that the silhouette image of the cell which has been discriminated twice using SNR and SD is digitized by using an image processing technique. This can finally quantify the activity of the cells.
  • the cell activity measuring apparatus 100 can continuously observe a large amount of cells without a separate reagent.
  • the cell activity measuring apparatus 100 makes it possible to easily distinguish between nuclear differentiation and life and death of cells, which were previously observed only with an expensive microscope using a separate staining reagent or the like.
  • a device for measuring cell activity according to an embodiment of the present invention in particular, the cytotoxicity test required during the development of a new drug, or to measure or determine the activity of microorganisms related to the environment and food, can be made more quickly and at low cost.
  • the above-described method for analyzing cell activity may be implemented in the form of program instructions that can be executed by various computer means and recorded on a computer-readable recording medium.
  • the computer-readable recording medium may include program instructions, data files, data structures, and the like, alone or in combination.
  • the program instructions recorded on the recording medium may be those specially designed and configured for the present invention, or may be known and available to those skilled in computer software.
  • Computer-readable recording media include magnetic media such as hard disks, floppy disks, and magnetic tape, optical media such as CD-ROMs, DVDs, and magnetic disks such as floppy disks. Magnetic-Optical Media, and hardware devices specifically configured to store and execute program instructions, such as ROM, RAM, flash memory, and the like.
  • the recording medium may be a transmission medium such as an optical or metal wire, a waveguide, or the like including a carrier wave for transmitting a signal specifying a program command, a data structure, or the like.
  • program instructions include not only machine code generated by a compiler, but also high-level language code that can be executed by a computer using an interpreter or the like.
  • the hardware device described above may be configured to operate as one or more software modules to perform the operations of the present invention, and vice versa.
  • the apparatus for measuring cell activity and the method for assaying cell activity described above are not limited to the configuration and method of the embodiments described above, but the embodiments may be all or part of each embodiment so that various modifications may be made. May be optionally combined.

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Description

세포 활성도 측정 장치 및 세포 활성도 분석 방법
본 발명은 세포 활성도 측정 장치 및 세포 활성도 분석 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포의 그림자 이미지를 이용하여 세포의 활성도를 연속적이며, 고 처리량으로 측정하는 세포 활성도 측정 장치 및 측정된 세포 활성도를 분석할 수 있는 세포 활성도 분석 방법에 관한 것이다.
세포의 생사유무나 활동성 관찰은 현대 신약이나 식품의 개발과정에서 중요한 단계이다. 특정 약품이나 시료에 대한 세포의 반응성이나 생사 유무 관찰은 연구 과정에서 필수적이다. 전통적으로 세포의 증식이나 활동성 관찰을 위해서 개발 된 기술들은 다음과 같다.
ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)란 특이성이 좋고 민감도가 높은 항체와 신호발생원이 되는 효소를 이용하여 특정 상태의 세포만을 선택 반응시켜 흡광도를 측정하는 기술이다.
Western blots이란 단백질을 전기영동으로 검출하는 방법이다. 우선 단백질을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Polyacrylamide Gel Electrophoresis)법에 의하여 분획한 다음 영동된 분획의 위치를 그대로 여과지에 옮겨 방사선 면역검정법(Radioimmunoassay)에 의해 특정 단백질을 검출하는 방법이다.
Immunohistochemistry란 조직이나 세포에 존재하는 특정 항원을 표지항체를 이용하여 가시화 하여 광학현미경 또는 전자현미경으로 관찰할 수 있게 조작하는 방법이다.
상기 열거된 방법은 세포의 생사유뮤 및 활성도 측정을 위해 고가의 큰 장비를 사용하거나 세포염색 후 현미경을 통한 관찰이나 흡광도를 측정하는 등의 방법으로 이루어지기 때문에, 많은 비용과 복잡한 시스템, 그리고 큰 공간을 요구한다. 또한, 분석을 위해서는 반드시 시료를 파괴하여야 하므로 특정세포의 연속적인 관찰이 불가능하다.
따라서 보다 간단하면서도 신속 대량화가 가능하고 별도의 시약을 필요로 하지 않으며 시료를 파괴하지 않는 세포 활성도 측정 기술에 대한 연구가 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 별도의 시약 처리를 하지 않으면서도 연속적으로 시료를 파괴하지 않고 세포를 관찰할 수 있는 그림자 이미징 기술 기반의 세포 활성도 측정 장치를 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 이미지 센서를 통해 촬영된 세포의 그림자 이미지에서 특정 파라미터를 추출하여 세포의 활성도를 분석하는 세포 활성도 분석 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명의 일실시예에 의하면, 배양액 및 세포가 주입되는 플루이딕 채널; 상기 플루이딕 채널 상부에 위치하여 상기 플루이딕 채널 방향으로 빛을 발광하는 발광 소자; 및 상기 플루이딕 채널 하부에 위치하여 상기 세포의 그림자 이미지를 촬영하는 이미지 센서를 포함하는 세포 활성도 측정 장치가 제공된다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명의 일실시예에 의하면, 배양액 및 세포가 주입되는 웰 플레이트; 상기 웰 플레이트 상부에 위치하여 상기 웰 플레이트 방향으로 빛을 발광하는 발광 소자; 및 상기 웰 플레이트 하부에 위치하여 상기 세포의 그림자 이미지를 촬영하는 이미지 센서를 포함하는 세포 활성도 측정 장치가 제공된다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명의 일실시예에 의하면, 배양액 및 세포가 주입되는 세포 칩; 상기 세포 칩 상부에 위치하여 상기 세포 칩 방향으로 빛을 발광하는 발광 소자; 및 상기 세포 칩 하부에 위치하여 상기 세포의 그림자 이미지를 촬영하는 이미지 센서를 포함하는 세포 활성도 측정 장치가 제공된다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명의 일실시예에 의하면, 빛을 발광하는 발광 소자; 및 상기 발광 소자 하부에 위치하여 세포 및 배양액이 주입될 수 있는 공간이 포함된 세포 저장 수단이 안착될 수 있고, 상기 세포의 그림자 이미지를 촬영하는 이미지 센서를 포함하는 세포 활성도 측정 장치가 제공된다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명의 일실시예에 의하면, 이미지 센서로부터 촬영된 그림자 이미지를 수신하는 단계; 상기 수신된 그림자 이미지에서 특정 파라미터를 산출하는 단계; 상기 산출된 파라미터를 이용하여 세포의 활성화 상태를 디스플레이 하는 단계를 포함하는 세포 활성도 분석 방법이 제공된다.
본 발명의 일실시예에 의한 세포 활성도 측정 장치는 간단하고 저비용의 장치를 이용하면서도 많은 양의 세포를 별도의 시약 없이 연속적으로 관찰할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 의하면, 현미경 등의 각종 세포 활성도 측정 장비를 이용할 수 있는 숙련된 검사자 혹은 기술자만이 할 수 있던 일을 간단한 이미지 프로세싱 기법과 결합한 컴퓨터 소프트웨어의 개발로 자동화 할 수 있어 비용이 감소하고 측정의 오차도 크게 줄일 수 있다.
또한, 본 발명의 일실시예에 의한 세포 활성도 분석 방법은 세포의 그림자 이미지의 픽셀 값을 이용하므로, 고가의 현미경이나 ELISA Reader와 같은 장치 없이도 세포의 활성도를 손쉽게 분석할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예와 관련된 세포 활성도 측정 장치이다.
도 2는 도 1에 도시된 플루이딕 채널이 온도 조절부로 둘러싸인 형태를 나타내는 도면이다.
도 3 내지 도 5는 본 발명의 다른 일실시예와 관련된 세포 활성도 측정 장치이다.
도 6은 본 발명의 일실시예와 관련된 분석 모듈의 블록도이다.
도 7은 도 1의 세포 활성도 측정 장치를 통해 촬영된 세포의 그림자 이미지와 현미경을 통해 촬영된 세포의 이미지를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일실시예와 관련된 세포의 활성도 분석 방법을 나타내는 흐름도이다.
도 9는 도 1의 세포 활성도 측정 장치를 통해 촬영된 세포의 핵 분화 상태를 나태내는 도면이다.
도 10은 도 1의 세포 활성도 측정 장치를 통해 촬영된 살아 있는 세포와 죽은 세포가 혼재된 그림자 이미지를 나타낸 도면이다.
도 11은 도 10의 그림자 이미지를 이미지 프로세싱 기법을 통해 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명의 일실시예와 관련된 세포의 활성도 분석 방법 중 세포의 숫자를 계수화하는 방법을 설명하기 위한 도면이다.
[부호의 설명]
100, 300, 400, 500: 세포 활성도 측정 장치
110: 발광 소자
120: 핀홀
130: 플루이딕 채널
131: 플로우 셀
132: 벽
133: 커버 글래스
140: 이미지 센서
150: 거리 조절부
160: 분석 모듈
170: 온도 조절부
이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명의 일실시예와 관련된 세포 활성도 측정 장치 및 세포 활성도 분석 방법에 대해 설명하기로 한다. 본 발명의 일실시예에 의한 세포 활성도 측정 장치는 세포 저장 수단의 형태에 따라 다양하게 구현될 수 있다. 상기 세포 저장 수단은 세포가 주입되어 배양되거나 측정되는 공간이 포함된 수단을 의미한다. 예를 들어, 상기 세포 저장 수단은 플루이딕 채널, 웰 플레이트, 세포 칩 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "구성된다" 또는 "포함한다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 여러 구성 요소들, 또는 여러 단계들을 반드시 모두 포함하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 그 중 일부 구성 요소들 또는 일부 단계들은 포함되지 않을 수도 있고, 또는 추가적인 구성 요소 또는 단계들을 더 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일실시예와 관련된 세포 활성도 측정 장치이다. 상기 세포 활성도 측정 장치(100)는 세포 저장 수단으로 플루이딕 채널이 사용된 형태이다.
도시된 바와 같이, 세포 활성도 측정 장치(100)는 발광 소자(110), 핀홀(120), 플루이딕 채널(130), 이미지 센서(140), 거리 조절부(150), 및 분석 모듈(160)을 포함할 수 있다.
발광 소자(110)는 세포의 그림자 이미지 촬영을 위해 빛을 발광한다. 상기 발광 소자는 세포 및 배양액(medium 또는 media)이 주입되는 플루이딕 채널(130)에 위치할 수 있다. 발광 소자(110)는 선명한 그림자 이미지 촬영을 위해 RGB 발광다이오드(LED, Light-Emitting Diode)를 포함할 수 있다.
핀홀(120)은 상기 발광 소자(110)의 하단에 결합되어 세포의 그림자 이미지를 선명하게 할 수 있다. 즉, 핀홀(120)은 빛의 가간섭성 및 조도 증대를 위해 사용될 수 있다.
상기 핀홀(120)은 플라스틱 재질의 필름 마스크 형태로 제작될 수 있다. 플라스틱 재질의 필름마스크 핀홀은 고해상도 레이져 프린터로 OHP 필름 등에 출력한 후 발광 소자(110) 앞에 부착할 수 있으므로, 일반 플라스틱이나 금속 재질의 핀홀 보다 제조에 소요되는 비용이 훨씬 저렴하고, 손쉽게 제작될 수 있다. 또한, RGB 발광다이오드처럼 하나의 발광다이오드에 3가지 색깔(적색, 녹색, 청색)의 개별 광원이 집적되어 있는 다중파장 광원의 경우 3개의 핀홀이 수십 마이크로미터 간격으로 위치하여야 하는데, 고해상도 레이져 프린터로 출력하는 방식을 이용하면, 컴퓨터상에서 손쉽게 다중 핀홀을 디자인할 수 있다.
플루이딕 채널(130) 내부에는 세포 및 배양액이 주입되어 세포가 배양될 수 있는 공간이 마련되어 있다. 상기 플루이딕 채널은 채널의 폭을 수 mm 이하로 구성하여, 주입되는 세포를 포함한 배양액의 부피를 줄일 수 있다. 활성도 측정에 사용되는 세포의 농도가 높으면, 그림자 이미지 분석시 노이즈가 커질 수 있기 때문이다.
또한, 플루이딕 채널(130)의 측벽의 적어도 일부는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 재질로 구현할 수 있다. 이렇게 구현하는 이유는 세포 배양을 위해서는 산소의 공급이 필요한데, 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS)은 재질의 특성상 산소를 투과할 수 있기 때문이다. 따라서 측벽의 적어도 일부는 폴리디메틸실록산 (polydimethylsiloxane, PDMS) 재질로 구현할 경우, 별도의 산소 공급 장치가 필요하지 않게 된다.
상기 플루이딕 채널(130)은 플로우 셀(Flow Cell)(131), 벽(132), 커버 글래스(133)를 포함할 수 있다.
상기 플로우 셀(131)은 세포 및 배양액이 주입과 배출되는 곳으로, 플루이딕 채널(130)의 덮개 역할을 수행할 수 있다. 상기 플로우 셀(131)은 유리, 플라스틱, 혹은 수정 등의 재료를 사용하여 제작될 수 있다.
벽(132)은 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 재질로 이루어져 상부의 플로우 셀(131)과 하부의 커버 글래스(133) 사이에 세포가 자랄 수 있는 공간을 확보하고 배양액이 세지 않도록 중간 부분이 뚫려 있는 형태로 제작될 수 있다. 상기 벽(132)을 PDMS 재료로 구현할 경우, PDMS 재료의 특성상 세포 배양에 반드시 필요한 산소를 투과시킬 수 있다. 따라서 플루이딕 채널(130)에 별도의 산소 공급 장치가 없어도 된다. 상기 벽(132)는 세포 활성도 측정 장치(100)의 소형화를 위해 1mm 정도의 두께로 제작될 수 있다.
커버 글래스(133)는 벽(132)의 하단에 위치하며 플루이딕 채널(130)의 바닥 역할을 할 수 있다.
이미지 센서(140)는 상기 플루이딕 채널(130) 하부에는 세포의 그림자 이미지를 촬영할 수 있다. 상기 이미지 센서(140)는 CMOS(Complementary Metal-Oxide Semiconductor) 이미지 센서로 구현될 수 있다. 상기 CMOS 이미지 센서는 상보성 금속 산화물 반도체(CMOS) 구조를 가진 저소비 전력형의 촬상 소자이다. 상기 이미지 센서(140)는 렌즈가 없는 형태로 구현될 수 있다. 상기 CMOS 이미지 센서는 반도체 공정을 통해 대량 생산이 가능하기에 가격이 저렴하고 처리 속도가 빠르다. 또한, 렌즈를 사용하는 이미지 센서 기반의 현미경에 비해 관찰 범위가 넓으며 분석을 정량화, 자동화 할 수 있다.
거리 조절부(150)는 상기 이미지 센서(140)와 결합되어 상기 이미지 센서(140)와 상기 플루이딕 채널(130) 사이의 거리를 조절할 수 있다. 즉, 거리 조절부(150)는 커버 글래스(133)와 이미지 센서(140) 센서와의 거리를 최대한으로 좁혀 고조도(High Contrast)의 그림자 이미지를 촬영할 수 있게 이미지 센서(140)의 위치를 미세하게 조정하는 역할을 수행할 수 있다.
분석 모듈(160)은 상기 이미지 센서(140)를 통해 촬영된 그림자 이미지를 이미지 프로세싱 기법을 통해 분석하는 역할을 수행한다. 분석 모듈(160)의 상세한 기능은 후술하도록 하겠다.
또한, 상기 세포 활성도 측정 장치(100)는 배양되는 세포들을 일정한 온도로 유지하기 위한 온도 조절부를 더 포함할 수 있다.
도 2는 도 1에 도시된 플루이딕 채널이 온도 조절부로 둘러 싸여진 형태를 나타내는 도면이다.
도시된 바와 같이, 온도 조절부(170)는 플루이딕 채널(130)을 둘러싸서 세포가 일정한 온도(예: 37'C)로 배양될 수 있도록 인큐베이터 역할을 수행할 수 있다. 상기 온도 조절부(170)는 온도 제어가 가능하고, 온도 센서(171)를 포함할 수 있다.
상기 이미지 센서(140)를 통해 촬영된 세포의 그림자 이미지는 분석 모듈(160)로 전달되어 세포의 활성화 상태가 분석될 있다.
도 3은 본 발명의 일실시예와 관련된 세포 활성도 측정 장치이다. 상기 세포 활성도 측정 장치(300)는 세포 저장 수단으로 웰 플레이트(well-plate)가 사용된 형태이다.
도시된 바와 같이, 세포 활성도 측정 장치(300)은 발광 소자(310), 핀홀(320), 웰 플레이트(330), 이미지 센서(340), 거리 조절부(350), 및 분석 모듈(360)을 포함할 수 있다.
상기 발광 소자(310), 핀홀(320), 이미지 센서(340), 거리 조절부(350), 및 분석 모듈(360)은 도 1에 도시된 구성이 동일하게 적용될 수 있으므로, 여기서는 상세한 설명은 생략하도록 하겠다.
웰 플레이트(330)는 상기 발광 소자(310) 하부에 위치하여 복수 개의 웰(well)이 형성되어 있다. 웰이라 함은 시료가 주입될 수 있는 공간을 의미한다.
예를 들어, 상기 웰 플레이트 (330)로는 96 웰 플레이트(96 well plate) 혹은 24 웰 플레이트(24 well plate)가 사용될 수 있다. 96 혹은 24 웰 플레이트란 96개 혹은 24개의 웰이 형성된 웰 플레이트를 말한다.
한편, 상기 웰 플레이트(330)는 광손실을 최소화한 그림자 이미지 획득을 위해 웰 바닥이 얇고 광간섭이 적은 블랙 웰 플레이트(black well plate)를 사용할 수 있다.
또한, 상기 웰 플레이트(330)는 발광 소자(310)로부터 조사되는 지점의 변화 또는 상기 CMOS 이미지 센서(340)로부터 감지되는 지점의 변화를 위해 움직임이 가능하도록 제작될 수 있다. 예를 들어, 웰 플레이트(330)는 회전이 가능하도록 제작될 수 있다.
또한, 상기 세포 활성도 측정 장치(300)는 배양되는 세포들을 일정한 온도로 유지하기 위한 온도 조절부를 더 포함할 수 있다.
도 4은 본 발명의 일실시예와 관련된 세포 활성도 측정 장치이다. 상기 세포 활성도 측정 장치(400)는 세포 저장 수단으로 세포 칩(cell chip)이 사용된 형태이다.
도시된 바와 같이, 세포 활성도 측정 장치(400)은 발광 소자(410), 핀홀(420), 세포 칩(430), 이미지 센서(440), 거리 조절부(450), 및 분석 모듈(460)을 포함할 수 있다.
상기 발광 소자(410), 핀홀(420), 이미지 센서(440), 거리 조절부(450), 및 분석 모듈(460)은 도 1에 도시된 구성이 동일하게 적용될 수 있으므로, 여기서는 상세한 설명은 생략하도록 하겠다.
세포 칩(430)은 세포 및 배양액이 주입될 수 있는 공간 마련되어 칩 형태로 구현된 세포 저장 수단이다. 상기 세포 칩(430)은 살아있는 세포의 활성도 또는 세포에 의한 복합적인 생리 신호를 검출할 수 있는 바이오 칩으로 세포의 계수를 위한 용도로 사용될 수 있다.
일반적인 세포 칩은은 상판, 하판 광학적으로 투명한 두 장의 유리, 플라스틱, 혹은 고분자 물질로 제조된 기판을 세포를 저장할 공간을 사이에 두고 접합하거나 조립하여 사용되는데, 본 발명에서 사용될 세포 그림자 이미징용 세포 칩(430)의 경우 하판의 두께가 0.1mm ~ 1.0mm 정도로 얇은 하판 두께를 가지는 것을 특징으로 한다. 또한, 세포를 저장할 공간을 사이에 두고 접합하거나 조립하지 않은 일체형으로 제조된 세포 칩의 경우에도 하판의 두께가 0.1mm ~ 1.0mm 정도로 얇은 것을 특징으로 한다.
도 5는 본 발명의 일실시예와 관련된 세포 활성도 측정 장치이다.
도시된 바와 같이, 세포 활성도 측정 장치(400)는 발광 소자(510), 핀홀(520), 이미지 센서(530), 거리 조절부(540), 및 분석 모듈(550)을 포함할 수 있다.
상기 발광 소자(510), 핀홀(520), 이미지 센서(530), 거리 조절부(540), 및 분석 모듈(560)은 도 1에 도시된 구성이 동일하게 적용될 수 있으므로, 여기서는 상세한 설명은 생략하도록 하겠다.
다만, 상기 이미지 센서(530)는 세포 저장 수단이 안정적으로 안착될 수 있게 구현될 수 있다.
상기 세포 활성도 측정 장치(500)는 세포 저장 수단이 구성요소로 포함되지 않고, 상기 세포 저장 수단을 수용할 수 있는 공간이 마련된 형태이다. 즉, 세포 활성도 측정 장치(500)는 세포 저장 수단과 함께 세트로 구성되는 것이 아니라, 세포 저장 수단이 안착 또는 수용될 수 있는 공간이 마련되어, 필요에 따라 세포 저장 수단을 다양한 형태로 교체할 수 있게 구현될 수 있다. 예를 들어, 세포 활성도 측정 장치(500)는, 세포 저장 수단으로 웰 플레이트가 필요한 경우, 웰 플레이트를 상기 이미지 센서(530) 위에 웰 플레이트를 안착시켜 세포의 활성도를 측정하고, 세포 저장 수단으로 세포 칩이 필요한 경우, 상기 이미지 센서(530) 위에 세포 칩을 안착시켜 세포의 활성도를 측정할 수 있다.
또한, 세포 활성도 측정 장치(500)는, 특정 세포 저장 수단이 전용으로 안착 또는 수용 용도로 사용될 수도 있다. 예를 들어, 세포 활성도 측정 장치(500)는 세포 칩이 전용으로 안착될 수 있는 형태로 제작될 수 있다.
전술한 세포 활성도 측정 장치(100, 300, 400, 500)는 동일한 분석 모듈을 포함할 수 있다.
도 6은 도 1에 도시된 분석 모듈의 블록도이다.
도시된 분석 모듈(160)은 상기 세포 활성도 측정 장치(100)의 일 구성요소로도 구현될 수 있지만, 세포 활성도 측정 장치(100)와 별도의 장치로도 구현될 수 있다.
분석 모듈(160)은 수신부(161), 추출부(162), 픽셀 필터링부(163), 디스플레이부(164) 및 제어부(165)를 포함할 수 있다.
수신부(161)는 상기 이미지 센서(140)로부터 그림자 이미지를 수신할 수 있다. 상기 그림자 이미지 수신은 상기 분석 모듈(160) 상기 세포 활성도 측정 장치(100)와 별도로 존재하는 경우, 다양한 통신 방식(예: 무선 통신)을 통해 수신할 수 있다.
추출부(162)는 그림자 이미지로부터 세포 활성도 분석을 위한 특정 파라미터를 산출할 수 있다. 예를 들어, SNR(Signal-to-Noise Ratio) 값, SD(Shadow Diameter) 값, 최대 픽셀 값, 최대값을 가지는 픽셀의 위치, 최소 픽셀 값, 최소값을 가지는 픽셀의 위치, 첫 번째 밝은 링의 지름, 첫 번째 어두운 링의 지름, 밝은 링과 어두 링 사이의 폭, 그림자 이미지가 차지하는 면적, 그림자 이미지의 원형도 등이 등이 세포 활성도 분석을 위한 파라미터가 될 수 있다.
SNR(Signal-to-Noise Ratio)은 세포를 포함하도록 지정된 픽셀의 최대 밝기(Intensity) 값과 세포를 포함하지 않는 백그라운드의 평균 밝기 값과의 차를 백그라운드의 표준편차 값으로 나누어 로그 값을 취한 값을 말한다.
상기 SNR은 수학식 1로 표현될 수 있다.
수학식 1
Figure PCTKR2012011555-appb-M000001
여기에서
Figure PCTKR2012011555-appb-I000001
와
Figure PCTKR2012011555-appb-I000002
는 각각 그림자 이미지의 배경 평균값과 표준편차를 가리킨다. max(I)는 최대 밝기 픽셀 값이다.
또한, SD(Shadow Diameter)는 세포를 포함하도록 지정된 픽셀의 밝기 값으로부터 추출한 세포 그림자 이미지의 지름(Diameter)을 실효값(Root Mean Square)으로 표시한 값이다. 상기 SD는 수학식 2와 같이 표현될 수 있다.
수학식 2
Figure PCTKR2012011555-appb-M000002
여기에서 n, x, f(x)는 각기 세포 그림자 영역의 최대 픽셀수, 지정 픽셀, 그리고 지정된 픽셀의 밝기 값을 나타낸다.
세포의 그림자 이미지는 밝은 링(bright ring)과 어두운 링(dark ring)이 도넛 형태로 교대로 나타나는 원형 이미지일 수 있다. 이 경우, 중심에서 첫 번째의 밝은 링을 첫 번째 밝은 링이라고 하고, 중심에서 첫 번째의 어두운 링을 첫 번째 어두운 링이라고 한다.
또한, 그림자 이미지의 원형도(Circularity)는 그림자 이미지가 얼마만큼 원형에 유사한지를 나타내는 척도라 할 수 있다.
픽셀 필터링부(163)는 상기 특정 파라미터, 특정 모양과의 유사도 등을 이용하여 그림자 이미지에서 특정 픽셀만은 지정할 수 있다. 이에 대한 자세한 설명은 후술하도록 하겠다.
디스플레이부(164)는 상기 추출부(162)에서 추출한 세포 활성도 분석을 위한 항목을 이용하여 세포의 활성화 상태를 디스플레이할 수 있다.
제어부(165)는 수신부(161), 추출부(162), 픽셀 필터링부(163), 디스플레이부(164)에서 수행하는 전반적인 기능을 제어한다.
이하에서는 실험예를 통해 세포의 활성도를 분석하는 방법에 대해 설명하도록 하겠다.
본 실험예에서는 인간의 폐 상피세포인 Human Aveolar Epithelial Cell(A549)을 이용하였다. 초기 농도는 250,000 cells/ml 이다. 플루이딕 채널(130) 내에 배양된 세포의 산소 요구량은 5.795 x 10 -7 mol/day이나 PDMS 재질로 제작된 벽(132)의 산소 투과량은 1.771 x 10 -6 mol/day으로 별도의 산소 공급이 필요하지 않다. 세포 배양을 위해 주입되는 배양약은 별도의 CO2 공급을 필요치 않는 CO2 Independent Media(18045, GIBCO)를 이용하였다. 상기 배약약은 별도의 실린지 펌프(M200, KD Scientific)를 이용하여 5~10 ㎕/min 속도로 플루이딕 채널(130)로 주입하였다. 본 실험예서는 발광 소자(110)로 RGB 발광다이오드를 사용하였고, 이미지 센서(140)로 CMOS 이미지 센서를 사용하였다.
도 7은 도 1의 세포 활성도 측정 장치를 통해 촬영된 세포의 그림자 이미지와 현미경을 통해 촬영된 세포의 이미지를 나타낸 도면이다.
상기 세포 활성도 측정 장치(100)를 이용하면 세포의 핵 분화도 현미경 없이 손쉽게 관찰할 수 있다. 세포 활성도 측정 장치(100)와 일반 광학 현미경을 동시에 이용하여 관심세포(Cell Of Interest)를 48시간 동안 관찰, 비교한 결과 도 7(a)와 같이 현미경(노란색 사진) 하에서 관찰된 세포의 핵 분화가 세포 그림자 이미지에서도 관찰되었다. 이러한 그림자 이미지의 변화를 이미지 프로세싱 기법을 이용하여 3차원(도 7(b)) 및 2차원(도 7(c))으로 픽셀 값을 그래프화 해 보면 핵 분화가 일어난 시점인 4시간에서 10시간 사이의 그림자 패턴변화가 급격하게 발생함을 확인할 수 있다.
도 8은 분석 모듈을 이용하여 세포의 활성도를 분석하는 방법을 나타내는 흐름도이다.
수신부(161)는 이미지 센서(140)를 통해 촬영된 세포의 그림자 이미지를 수신할 수 있다(S810).
추출부(162)는 상기 수신된 세포의 그림자 이미지로부터 특정 파라미터를 산출할 수 있다(S820). 본 실험예에서는 특정 파라미터 중 SNR 값 및 SD를 추출하였다.
그리고 픽셀 필터링부(163)는 특정 모양과의 유사도를 이용하여 그림자 이미지에서 특정 픽셀만은 지정할 수 있다(S830).
예를 들어, 픽셀 필터링부(163)는 세포의 그림자 패턴을 형성하는 픽셀들의 원형도(Circularity)가 특정 범위에 해당하는 픽셀들만을 선별하여 지정할 수 있다.
디스플레이부(164)는 상기 추출된 SNR 값 및 SD 값을 시간에 따라 그래프화하여 디스플레이할 수 있다(S840).
도 9는 상기 실험예에서 이용된 세포의 그림자 이미지에서 SNR 값 및 SD 값을 추출하여 시간에 따라 나타낸 그래프이다.
도시된 바와 같이, 두 가지 항목(SNR과 SD)을 48시간 동안 추적한 결과가 도 9에 나타나 있다.
도 9(a)는 SNR의 변화를 나타낸 것이고, 도 9(b)는 SD의 변화를 나타낸 것으로 두 결과 모두 실험시작 4시간에서 10시간 사이 핵 분화가 일어나는 시점에서 큰 폭의 변화를 보여주고 있다.
도 10은 도 1의 세포 활성도 측정 장치를 통해 촬영된 살아 있는 세포와 죽은 세포가 혼재된 그림자 이미지를 나타낸 도면이다.
세포 활성도 측정 장치(100)에서, 세포의 활성도 비교 측정을 위해 세포를 장시간 배양한 후 일부의 세포군을 열을 가하여 사멸을 유도하였다. 도 10(a)와 같이 이미지 센서(140)로 촬영된 한 장의 그림자 이미지 상에는 수 천개의 정상 세포군(좌)과 죽은 세포군(우)이 혼재되도록 실험을 수행하였다. 그 결과 도 10(b) 및 도 10(c)와 같이 현미경 하에서 명확하게 세포의 삶과 죽음을 구분할 수 있었다.
도 10에서도 확인할 수 있듯이 세포 활성도 측정 장치(100)는 현미경으로 촬영한 것 이상의 세포 활성도를 관찰할 수 있다.
도 11은 도 10의 그림자 이미지를 이미지 프로세싱 기법을 통해 나타낸 도면이다.
도 11은 그림자 이미지를 이용하여 상기 세포군의 삶과 죽음을 정량화하기 위해 앞서 정의된 SNR과 SD 값을 이용하여 살아있는 세포와 죽은 세포군에 대해 그 값의 변화를 나타낸다.
도 11(a)와 도 11(b)에 나타난 것과 같이 세포가 살아있을 때와 죽었다고 판단될 때에는 세포의 핵 분화 시 관찰되었던 것보다 더 큰 폭의 SNR과 SD 변화를 관찰할 수 있었다. 도 11(c)는 특정 세포의 그림자 패턴이 60시간 동안 어떻게 변화하는지 보여준다.
도 12는 본 발명의 일실시예와 관련된 세포의 활성도 분석 방법 중 세포의 숫자를 계수화하는 방법을 설명하기 위한 도면이다.
그림자 패턴의 SNR과 SD값의 변화를 관찰하면 세포의 생사 유무에 대한 정량화 된 기준을 확립할 수 있다. 도 9는 SNR과 SD의 변화를 세포의 생사를 정량화하고 이를 이용하여 살아있는 세포의 숫자를 계수한 실시 예이다. 또한, 본 발명의 일실시예에 의하면, 세포의 그림자 이미지에 대한 픽셀과 특정 모양과의 유사도를 이용하여 특정 픽셀들을 선별하는 단계를 포함할 수 있다. 세포의 그림자 패턴을 형성하는 픽셀들의 원형도(Circularity)가 특정 범위에 해당하는 픽셀들만을 선별하여 지정할 수 있다. 이를 통하여 원형에 가까운 세포의 그림자 패턴과 상이한 직선형 먼지 파티클 등을 효과적으로 선별하고, 제거할 수 있다. 픽셀들의 원형도의 측정은 그림자 패턴의 가로길이 혹은 세로길이 중 작은 값을 큰 값으로 나누어 계산할 수 있다. 완벽한 원형 형태의 그림자 이미지는 1의 원형도 값을 가지고, 원형도가 낮아짐에 따라 0 ~ 1 사이의 값을 가질 수 있다.
도 12(a)는 세포의 그림자 이미지에서 추출된 SNR 값을 이용하여 세포들의 생사 여부에 대한 1차 판별(도 11(a)의 점선 이상 영역이 살아있는 세포)을 실시하고, 이미지 프로세싱 기법을 이용하여 적색 픽셀들로 표시한 실시 예를 보여준다. 상기 1차 판별에서는 전체 그림자 이미지에서 특정 SNR 값(대략 18dB) 이상을 가지는 픽셀들을 붉은색으로 선별하여 지정한다.
도 12(b)는 도 12(a)의 특정 부분을 디지털 줌으로 확대한 이미지이다. 또한, SD 값을 이용하여 세포들의 생사 여부에 대한 2차 판별(도 11(b)의 점선 이하 영역이 살아있는 세포)이 이루어지면 도 12(c)와 같이 살아있는 정상 세포만이 실루엣 형태로 표시되게 된다.
2차 판별에서는 1차 판별을 거쳐서 선택된 붉은 픽셀 클러스터 중 선택된 붉은 영역의 픽셀들의 SD이 특정값 이하(대략 24um 이하) 이면서 픽셀들의 모임의 원형도(Circularity)가 0.3~1.0의 값을 가지는 픽셀 클러스터만을 선택적으로 지정한다.
이 후 1, 2차 판별을 거쳐 최종적으로 살아있다고 생각되는 그림자 이미지들만을 계수하여 세포의 활성도를 수치화 한다.
도 12(d)는 SNR과 SD를 이용한 세포의 2차례 판별이 끝난 실루엣 이미지를 이미지 프로세싱 기법을 이용하여 계수화한 것을 나타낸다. 이를 통해 최종적으로 세포의 활성도를 정량화할 수 있다. 도 12(d)는 세포의 활성도 정량화 과정을 명확하게 보이기 위해 T=36hr에서 배양액의 공급을 중단한 후 살아있는 세포의 계수 결과를 나타낸다.
전술한 실험예에서도 확인할 수 있듯이, 본 발명의 일실시예와 관련된 세포 활성도 측정 장치(100)는 많은 양의 세포를 별도의 시약 없이 연속적으로 관찰할 수 있다. 세포 활성도 측정 장치(100)는 기존에 별도의 염색 시약 등을 이용하여 고가의 현미경 등으로만 관찰할 수 있었던 세포의 핵 분화나 생사의 구분을 손쉽게 가능하게 한다.
본 발명의 일실시예에 의한 세포 활성도 측정 장치 특히 신약 개발과정에서 필요한 세포독성 시험이나, 환경 및 식품과 관련한 미생물의 활성도 측정이나 판별을 저비용으로 보다 빠르게 가능하게 할 수 있다.
또한, 기존에는 현미경 등의 각종 세포 활성도 측정 장비를 이용할 수 있는 숙련된 검사자 혹은 기술자만이 할 수 있던 일을 간단한 이미지 프로세싱 기법과 결합한 컴퓨터 소프트웨어의 개발로 자동화할 수 있어 비용이 감소하고 측정의 오차도 크게 줄일 수 있을 것이다.
상술한 세포 활성도 분석 방법은 다양한 컴퓨터 수단을 통하여 수행될 수 있는 프로그램 명령 형태로 구현되어 컴퓨터로 판독 가능한 기록 매체에 기록될 수 있다. 이때, 컴퓨터로 판독 가능한 기록매체는 프로그램 명령, 데이터 파일, 데이터 구조 등을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다. 한편, 기록매체에 기록되는 프로그램 명령은 본 발명을 위하여 특별히 설계되고 구성된 것들이거나 컴퓨터 소프트웨어 당업자에게 공지되어 사용 가능한 것일 수도 있다.
컴퓨터로 판독 가능한 기록매체에는 하드 디스크, 플로피 디스크 및 자기 테이프와 같은 자기 매체(Magnetic Media), CD-ROM, DVD와 같은 광기록 매체(Optical Media), 플롭티컬 디스크(Floptical Disk)와 같은 자기-광 매체(Magneto-Optical Media), 및 롬(ROM), 램(RAM), 플래시 메모리 등과 같은 프로그램 명령을 저장하고 수행하도록 특별히 구성된 하드웨어 장치가 포함된다.
한편, 이러한 기록매체는 프로그램 명령, 데이터 구조 등을 지정하는 신호를 전송하는 반송파를 포함하는 광 또는 금속선, 도파관 등의 전송 매체일 수도 있다.
또한, 프로그램 명령에는 컴파일러에 의해 만들어지는 것과 같은 기계어 코드뿐만 아니라 인터프리터 등을 사용해서 컴퓨터에 의해서 실행될 수 있는 고급 언어 코드를 포함한다. 상술한 하드웨어 장치는 본 발명의 동작을 수행하기 위해 하나 이상의 소프트웨어 모듈로서 작동하도록 구성될 수 있으며, 그 역도 마찬가지이다.
상기와 같이 설명된 세포 활성도 측정 장치 및 세포 활성도 분석 방법은 상기 설명된 실시예들의 구성과 방법이 한정되게 적용될 수 있는 것이 아니라, 상기 실시예들은 다양한 변형이 이루어질 수 있도록 각 실시예들의 전부 또는 일부가 선택적으로 조합되어 구성될 수도 있다.

Claims (26)

  1. 배양액 및 세포가 주입되는 플루이딕 채널;
    상기 플루이딕 채널 상부에 위치하여 상기 플루이딕 채널 방향으로 빛을 발광하는 발광 소자; 및
    상기 플루이딕 채널 하부에 위치하여 상기 세포의 그림자 이미지를 촬영하는 이미지 센서를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 플루이딕 채널은
    측벽의 적어도 일부가 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 재질로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 플루이딕 채널은
    상기 배약액 및 세포가 주입 및 배출되는 플로우 셀(Flow Cell);
    상기 플로우 셀 하부에 위치하여 상기 주입된 세포가 배양될 수 있도록 공간이 형성되고 상기 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 재질로 이루어진 벽; 및
    상기 벽 하단에 위치한 커버를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 발광 소자는
    RGB 발광다이오드(LED, Light-Emitting Diode)를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 세포도 활성 측정 장치는
    빛이 발광되는 상기 발광 소자의 하단부와 결합된 핀홀을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 세포도 활성 측정 장치는
    상기 플루이딕 채널을 둘러싸도록 배치된 온도 조절부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 세포도 활성 측정 장치는
    상기 이미지 센서와 결합되어 상기 이미지 센서와 상기 플루이딕 채널 사이의 거리를 조절하는 거리 조절부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 세포도 활성 측정 장치는
    상기 이미지 센서를 통해 촬영된 그림자 이미지에서 추출된 SNR(Signal-to-Noise Ratio) 값, SD(Shadow Diameter) 값, 최대 픽셀 값, 최대값을 가지는 픽셀의 위치, 최소 픽셀 값, 최소값을 가지는 픽셀의 위치, 첫 번째 밝은 링의 지름, 첫 번째 어두운 링의 지름, 밝은 링과 어두 링 사이의 폭, 그림자 이미지의 넓이, 그림자 이미지의 원형도 중 적어도 하나를 이용하여 세포의 활성 상태를 분석하는 분석 모듈이 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 분석 모듈은
    상기 이미지 센서를 통해 촬영된 그림자 이미지에 대한 픽셀과 특정 모양과의 유사도를 이용하여 세포의 활성 상태를 분석하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  10. 배양액 및 세포가 주입되는 웰 플레이트;
    상기 웰 플레이트 상부에 위치하여 상기 웰 플레이트 방향으로 빛을 발광하는 발광 소자; 및
    상기 웰 플레이트 하부에 위치하여 상기 세포의 그림자 이미지를 촬영하는 이미지 센서를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 웰 플레이트는
    상기 RGB 발광다이오드에서 발광되는 빛이 수직으로 조사되는 지점 또는 상기 CMOS 이미지 센서로부터 감지되는 지점이 변화될 수 있도록 움직임이 가능한 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 세포도 활성 측정 장치는
    상기 이미지 센서와 결합되어 상기 이미지 센서와 상기 웰 플레이트 사이의 거리를 조절하는 거리 조절부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 세포도 활성 측정 장치는
    상기 이미지 센서를 통해 촬영된 그림자 이미지에서 추출된 SNR(Signal-to-Noise Ratio) 값, SD(Shadow Diameter) 값, 최대 픽셀 값, 최대값을 가지는 픽셀의 위치, 최소 픽셀 값, 최소값을 가지는 픽셀의 위치, 첫 번째 밝은 링의 지름, 첫 번째 어두운 링의 지름, 밝은 링과 어두 링 사이의 폭, 그림자 이미지의 넓이, 그림자 이미지의 원형도 중 적어도 하나를 이용하여 세포의 활성 상태를 분석하는 분석 모듈이 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 분석 모듈은
    상기 이미지 센서를 통해 촬영된 그림자 이미지에 대한 픽셀과 특정 모양과의 유사도를 이용하여 세포의 활성 상태를 분석하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  15. 배양액 및 세포가 주입되는 세포의 저장 장소를 제공함과 동시에 바닥면이 0.1 mm ~ 1.0 mm 정도로 얇은 두께를 가지는 세포 칩;
    상기 세포 칩 상부에 위치하여 상기 세포 칩 방향으로 빛을 발광하는 발광 소자; 및
    상기 세포 칩 하부에 위치하여 상기 세포의 그림자 이미지를 촬영하는 이미지 센서를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 세포도 활성 측정 장치는
    상기 이미지 센서와 결합되어 상기 이미지 센서와 상기 세포 칩 사이의 거리를 조절하는 거리 조절부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  17. 제 15 항에 있어서, 상기 세포도 활성 측정 장치는
    상기 이미지 센서를 통해 촬영된 그림자 이미지에서 추출된 SNR(Signal-to-Noise Ratio) 값, SD(Shadow Diameter) 값, 최대 픽셀 값, 최대값을 가지는 픽셀의 위치, 최소 픽셀 값, 최소값을 가지는 픽셀의 위치, 첫 번째 밝은 링의 지름, 첫 번째 어두운 링의 지름, 밝은 링과 어두 링 사이의 폭, 그림자 이미지의 넓이, 그림자 이미지의 원형도 중 적어도 하나를 이용하여 세포의 활성 상태를 분석하는 분석 모듈이 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  18. 제 15 항에 있어서, 상기 분석 모듈은
    상기 이미지 센서를 통해 촬영된 그림자 이미지에 대한 픽셀과 특정 모양과의 유사도를 이용하여 세포의 활성 상태를 분석하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  19. 빛을 발광하는 발광 소자; 및
    상기 발광 소자 하부에 위치하여 세포 및 배양액이 주입될 수 있는 공간이 포함된 세포 저장 수단이 안착될 수 있고, 상기 세포의 그림자 이미지를 촬영하는 이미지 센서를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 세포도 활성 측정 장치는
    상기 이미지 센서와 결합되어 상기 이미지 센서의 높낮이를 조절하는 거리 조절부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  21. 제 19 항에 있어서, 상기 세포도 활성 측정 장치는
    상기 이미지 센서를 통해 촬영된 그림자 이미지에서 추출된 SNR(Signal-to-Noise Ratio) 값, SD(Shadow Diameter) 값, 최대 픽셀 값, 최대값을 가지는 픽셀의 위치, 최소 픽셀 값, 최소값을 가지는 픽셀의 위치, 첫 번째 밝은 링의 지름, 첫 번째 어두운 링의 지름, 밝은 링과 어두 링 사이의 폭, 그림자 이미지의 넓이, 그림자 이미지의 원형도 중 적어도 하나를 이용하여 세포의 활성 상태를 분석하는 분석 모듈이 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 분석 모듈은
    상기 이미지 센서를 통해 촬영된 그림자 이미지에 대한 픽셀과 특정 모양과의 유사도를 이용하여 세포의 활성 상태를 분석하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  23. 제 19 항에 있어서, 상기 세포도 활성 측정 장치는
    빛이 발광되는 상기 발광 소자의 하단부와 결합된 핀홀을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 측정 장치.
  24. 이미지 센서로부터 촬영된 그림자 이미지를 수신하는 단계;
    상기 수신된 그림자 이미지에서 특정 파라미터를 산출하는 단계;
    상기 산출된 파라미터를 이용하여 세포의 활성화 상태를 디스플레이 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 분석 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 특정 파라미터는
    SNR(Signal-to-Noise Ratio) 값, SD(Shadow Diameter) 값, 최대 픽셀 값, 최대값을 가지는 픽셀의 위치, 최소 픽셀 값, 최소값을 가지는 픽셀의 위치, 첫 번째 밝은 링의 지름, 첫 번째 어두운 링의 지름, 밝은 링과 어두 링 사이의 폭, 그림자 이미지의 넓이, 그림자 이미지의 원형도 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 분석 방법.
  26. 제 24 항에 있어서, 상기 세포의 활성화 상태 분석 방법은
    상기 촬영된 그림자 이미지에서 상기 특정 파라미터를 이용하여 1차 픽셀 그룹을 선별하는 단계;
    상기 선별된 1차 픽셀 그룹에서 세포 활성도와 관련하여 기 정의된 이미지 패턴과의 유사도를 이용하여 2차 픽셀 그룹을 선별하는 단계; 및
    상기 2차 픽셀 그룹을 이용하여 상기 세포의 활성화 상태를 디스플레이 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 활성도 분석 방법.
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