WO2013147232A1 - 樹状細胞表面タンパク質に対する抗体を有するバイオナノカプセル - Google Patents

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bio
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antibody
liposome
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秀典 松尾
伸男 良元
益巳 飯嶋
新川　武
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University of the Ryukyus NUC
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Nagoya University NUC
University of the Ryukyus NUC
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    • C12N2810/859—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from immunoglobulins

Definitions

  • the present invention relates to a bio-nanocapsule having an antibody against dendritic cell surface protein.
  • DDS nanocarrier for delivery of drugs, genes, etc. to specific tissues by virus-like particles obtained by expressing hepatitis B virus surface antigen protein or a variant thereof in eukaryotes such as yeast cells It has already been reported as useful.
  • virus-like particles themselves are particularly useful as DDS nanocarriers for cancer tissues and liver tissues, but molecules that specifically bind to biomolecules such as proteins and sugar chains expressed in tissues where delivery is desired. It is also known that a virus-like particle carrying a drug exerts an effect as a DDS nanocarrier for specifically delivering a drug, gene or the like to such tissue (Patent Documents 1 to 13).
  • Non-Patent Documents 1 and 2 DDS technology that efficiently delivers antigenic substances, nucleic acids, etc. to antigen-recognizing cells that play an important role in the immune system, especially dendritic cells, and dendritic cells actively deliver antigenic substances Technologies that can be presented have been developed (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • DDS technology that delivers antigenic substances, nucleic acids, etc. to dendritic cells to some extent efficiently, and techniques that allow dendritic cells to actively present antigenic substances have not been developed at the research level. However, it has not reached a level that can be used as a high-quality vaccine, and further improvements are needed.
  • a vaccine prepared on the basis of the above-described technique requires simultaneous administration of an immunostimulant (so-called adjuvant) that requires a large amount of administration or may adversely affect the living body. It may be necessary. In such a vaccine, it cannot be said that the market needs are sufficiently met, and the development of a higher quality vaccine is required.
  • the subject of this invention is providing the vaccine which can fully respond to the above market needs.
  • the present inventor administered a bio-nanocapsule having an antibody against the surface protein of dendritic cells, or if necessary, a bio-nanocapsule further containing liposomes to the spleen.
  • the present inventors have found that the bio-nanocapsule is taken into dendritic cells present in the tissue.
  • Item 1 A bio-nanocapsule having virus-like particles containing an antibody against a dendritic cell surface protein and a virus surface antigen protein.
  • Item 2 The bio-nanocapsule according to Item 1, wherein the virus-like particle comprises an antibody binding domain.
  • Item 3 The bio-nanocapsule according to Item 2, wherein the antibody binding domain is contained in a virus surface antigen protein.
  • Item 4 The bio-nanocapsule according to any one of Items 1 to 3, wherein the virus surface antigen protein is a hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) L protein.
  • HBsAg hepatitis B virus surface antigen
  • Item 5 The bio-nanocapsule according to any one of Items 1 to 4, wherein the antibody is an antibody that recognizes a CD11c protein or an ortholog thereof.
  • Item 6 The bio-nanocapsule according to any one of Items 1 to 5, further comprising a liposome.
  • Item 7 The bio-nanocapsule according to any one of Items 1 to 6, wherein the liposome is cationic.
  • Item 8 The bio-nanocapsule according to any one of Items 1 to 6, wherein the liposome is anionic.
  • Item 9 The bio-nanocapsule according to any one of Items 1 to 8, further comprising an antigenic substance and / or a nucleic acid.
  • Item 10 An agent for introducing an antigenic substance and / or nucleic acid into dendritic cells, comprising the bio-nanocapsule according to any one of Items 1 to 8.
  • a vaccine comprising the bio-nanocapsule according to any one of Items 1 to 8, and an antigenic substance and / or nucleic acid.
  • Item 12 A method for introducing an antigenic substance and / or nucleic acid into a dendritic cell of an animal, comprising the step of administering the bio-nanocapsule according to Item 9 to the animal.
  • Item 13 The method according to Item 12, wherein the administration is intravenous administration, transdermal administration, or intramuscular administration.
  • the bio-nanocapsule of the present invention can efficiently reach dendritic cells when administered into an animal individual. Furthermore, the bio-nanocapsule of the present invention also exerts an action of entering the dendritic cell after reaching the dendritic cell.
  • a dendritic cell is a cell that plays a very important role as a cell presenting an antigen in the immune system in a living body. Therefore, when the bio-nanocapsule of the present invention contains an antigenic substance, the dendritic cell is used. The antigenic substance is presented very efficiently, and an immune system related to cellular immunity and / or humoral immunity is induced against the antigenic substance.
  • a nucleic acid having a specific sequence is delivered to a dendritic cell or the like, the immune system in mammals can be easily sensitized, and a peptide or the like serving as an antigen substance is encoded in the dendritic cell.
  • the nucleic acid to be introduced is introduced, the peptide serving as the antigen substance is expressed in such dendritic cells, thereby making it easier to present the peptide serving as the antigen substance outside such dendritic cells.
  • the bio-nanocapsule of the present invention containing an antigenic substance and / or nucleic acid is administered in vivo, a significant amount of antibody against such antigenic substance can be produced in vivo. And since it is natural that such an antibody includes an antibody having a function of neutralizing the antigen substance, the bio-nanocapsule of the present invention containing the antigen substance and / or nucleic acid is a vaccine. As an excellent function.
  • bio-nanocapsule containing the antigenic substance and / or nucleic acid of the present invention not only elicits a humoral immune system that produces an antibody against the antigenic substance as described above after entering a dendritic cell, but also cellular immunity.
  • the system also has the effect of inducing. Therefore, the bio-nanocapsule of the present invention containing an antigenic substance and / or a nucleic acid has an excellent function as a vaccine.
  • bio-nanocapsule of the present invention containing an antigenic substance and / or a nucleic acid is administered to an animal to exert a preventive effect against any disease. Also from this, the bio-nanocapsule of the present invention containing an antigenic substance and / or a nucleic acid exhibits an excellent function as a vaccine.
  • a is a bio-nanocapsule
  • b is a lipid membrane
  • c is a virus surface antigen protein
  • d is an antibody recognizing a dendritic cell surface protein
  • e is a liposome.
  • ZZ-BNC indicates the affinity between mere ZZ-BNC to which no antibody is bound and CD11c-positive dendritic cells.
  • Bright Field indicates a bright field image
  • Ht indicates a heart
  • Lg indicates a lung
  • Kd indicates a kidney
  • Lv indicates a liver
  • and Sp indicates a spleen.
  • Intensity indicates the fluorescence intensity at 780 nm emitted from the CF-750 dye used for labeling BNC.
  • solid In the figure, DIC indicates a differential interference image, and Fluorescence indicates a fluorescent image.
  • XZ and YZ are images after performing the three-dimensional reconstruction image processing, and 15 slice images of 0.25 ⁇ m were subjected to the reconstruction processing.
  • FIG. 1 shows the results of confirming the transition of various BNCs to dendritic cells in the lymph nodes, and (B) analyzes the transition of various BNCs into dendritic cells in the lymph nodes over time. It is a result.
  • DC-BNC represents ⁇ -CD11c-ZZ-BNC (CF750 Labeled), and ZZ-BNC is a BNC having no anti-CD11c antibody.
  • ⁇ -DC-BNC in the figure represents ⁇ -CD11c-ZZ-BNC.
  • FIG. DC-targeted BNC in the figure represents ⁇ -CD11c-ZZ-BNC.
  • mouth in the examination 1 of the antigen loading method to the dendritic cell target BNC of Experimental example 8 is shown.
  • the vertical axis indicates the survival rate, and the horizontal axis indicates the number of days. Further, regarding the notation (X / Y), X indicates the number of individuals that survived to the 16th day, and Y indicates the number of individuals in each administration group.
  • mouth in the examination 2 of the antigen mounting method to the dendritic cell target BNC of Experimental example 10 is shown.
  • the vertical axis indicates the titer (Log 10 ) of the anti-JEV IgG antibody.
  • A is intravenously administered (IV) with ZZ-BNC-D3
  • B is intravenously administered with ⁇ -CD11c-ZZ-BNC-D3
  • C is subcutaneously administered with ⁇ -CD11c-ZZ-BNC-D3.
  • Administration (SC) shows intramuscular administration (IM) of ⁇ -CD11c-ZZ-BNC-D3.
  • IM intramuscular administration
  • the infection protection experiment result using dendritic cell targeting BNC which has the antigen of Experimental example 11 is shown.
  • the vertical axis indicates the survival rate
  • the horizontal axis indicates the number of days.
  • X indicates the number of individuals that survived to the 16th day
  • Y indicates the number of individuals in each administration group.
  • the experimental result which confirmed manufacture of the dendritic cell target BNC which has the nucleic acid of Experimental example 12 as an antigen is shown.
  • IgG-zzBNC represents ⁇ -CD11c-ZZ-BNC
  • IgG-zzBNC-LPX represents ⁇ -CD11c-ZZ-BNC—cationic liposome-DNA.
  • the experimental result using the in vivo imaging apparatus in the dendritic cell target BNC which has the nucleic acid of Experimental example 12 as an antigen is shown.
  • (A) in the figure shows a photographic image
  • (B) is a graph showing the fluorescence intensity of each organ.
  • DC-targeted BNC-LPX and ⁇ -CD11c-ZZ-BNC-LPX in the figure indicate ⁇ -CD11c-ZZ-BNC-cationic liposome-DNA.
  • the vertical axis of the graph in (B) indicates the fluorescence intensity per region.
  • DIC indicates a differential interference image
  • Fluorescence indicates a fluorescent image.
  • XZ and YZ are images after the three-dimensional reconstruction image processing, and 15 slice images of 0.25 ⁇ m are subjected to the reconstruction processing.
  • the bio-nanocapsule of the present invention has virus-like particles containing a virus surface antigen protein.
  • a virus surface antigen protein is a membrane protein having a self-organizing ability and constituting a capsid, an envelope and the like.
  • bio-nanocapsule according to the present invention shown in the schematic diagram of FIG. 1A will be described as appropriate.
  • the bio-nanocapsule of the present invention is not limited to those derived from the drawings alone.
  • the virus-like particle (a) carries an antibody (c) that recognizes the surface protein of dendritic cells, and the virus surface antigen protein (c) is a lipid constituting the virus-like particle. It exists in a state of piercing the film (b).
  • virus-like particles examples include a spherical shape, an elliptical spherical shape, a rugby ball shape, a substantially spherical shape, and a filament shape.
  • the inside may be filled with a liquid.
  • the virus surface antigen proteins include hepatitis B virus, coronavirus, adenovirus, hepatitis C virus (Hepatitis C virus), type I herpes simplex virus II type II simple Herpesvirus (Herpes simplex virus-2) human immunodeficiency virus (Human immunodefectiveness virus-1: HIV), norovirus (Norovirus), papilloma virus (Sendai virus, Sendai virus, Sendai virus, Sendai virus) Spherical choroid meningitis virus choriomeningitis virus), it includes virus surface antigen proteins, such as Sindbis virus (Sindbis virus).
  • Sindbis virus Sindbis virus
  • surface antigen proteins such as hepatitis B virus, type I herpes simplex virus, type II herpes simplex virus, human immunodeficiency virus and the like are preferable because they have a membrane-permeable domain responsible for their own entry into cells.
  • the hepatitis B virus surface antigen protein includes L protein, M protein, S protein and the like, and is not particularly limited, but is preferably L protein.
  • hepatitis B surface antigen protein for example, the N-terminal PreS region of the L protein and the subsequent 77 amino acid residues may be deleted, and the C-terminal side of about 50 amino acids may be deleted ( Patent Document 14).
  • Such hepatitis B virus surface antigen protein is preferable in that it can be easily produced using Escherichia coli.
  • hepatitis B virus surface antigen protein As a hepatitis B virus surface antigen protein, the 292nd glutamine residue and the 308th glycine residue exposed on the surface of the virus-like particle containing such a protein as a main component are arginine. It is good also as a variant substituted by. Such hepatitis B virus surface antigen protein exerts an effect that it itself is difficult to be recognized as an antigen when administered to a living body.
  • the ratio of the virus surface antigen protein contained in the bio-nanocapsule of the present invention is usually about 70 to 95% by weight per bio-nanocapsule. Preferably, it is about 80% to 90% by weight. Therefore, the bio-nanocapsule contains a virus surface antigen protein as a main component. Bionanocapsules contain lipids in addition to viral surface antigen proteins. The ratio is usually about 5 to 10% by weight per bio-nanocapsule. In addition, the bio-nanocapsule includes components such as sugar chains.
  • the dendritic cells are not particularly limited, but are not limited to, for example, dendritic cells present in spleen tissue, and may be skin Langerhans cells. Specifically, myeloid dendritic cells and plasmacytoid dendritic cells distributed throughout the body; Langerhans cells distributed in the epidermis; finger-inserted cells distributed in lymph nodes, spleen, thymus, etc .; distributed in lymphatic vessels Vale cells; intradermal dendritic cells distributed in the dermis; germinal center dendritic cells and follicular dendritic cells distributed in lymphoid follicles (embryonic centers) in lymphoid tissues; antigen-carrying cells distributed in lymphatic vessels or sinuses Etc.
  • Examples of surface proteins of dendritic cells include CD11c, MHC class II, CD80, CD86, Fc receptor, CD205, CD209, etc.
  • dendritic cells they are prominent on the surface of dendritic cells with excellent antigen-presenting ability. From the viewpoint that the amount is expressed, CD11c, MHC class II, CD205 and the like can be mentioned. Moreover, these orthologs may be sufficient as the surface protein of this invention.
  • the antibody structure only needs to have a variable region including a site that binds to the surface protein of dendritic cells as described above, and is limited to an immunoglobulin composed of two heavy chains and two light chains, respectively. It is not a thing.
  • Specific antibody structures include F (ab ′) 2 that does not contain an Fc region, CH1 region and CL region obtained by digesting immunoglobulin with papain, a heavy chain variable region, and a light chain variable region. Examples include molecular structures such as Fab and the like; Fv and the like that do not contain an immunoglobulin constant region; and scFv that is a single-chain antibody of Fv.
  • a multivalent structure combining these molecular structures may be used.
  • an scFv structure such as an scFv-Fc structure combining an Fc region and two of the above scFv structures, or a structure called minibody combining a CH3 domain of the constant region and the above two scFv structures, etc.
  • Multiplying is achieved by employing a stacking approach. Multivalentization means arranging a plurality of binding sites with dendritic cell surface proteins.
  • the above-mentioned antibody includes Affibody (registered trademark).
  • An Affibody is a protein molecule having a structure in which three helix domains are bound using a specific domain of Protein A as a scaffold, and has a function of binding to an antigen. That is, when the antibody is an affibody, the affibody is a molecule that recognizes the surface protein of dendritic cells.
  • the subtype is not particularly limited, and may be any subtype such as IgG, IgA, IgY, IgM, and IgE. Also, the subclass is not particularly limited.
  • binding means that the surface protein of the dendritic cell and the antibody are “bound”. More preferred is specific or selective binding. Such “binding” can be determined by the affinity between the surface protein of the dendritic cell and the antibody, or the affinity between the dendritic cell expressing the surface protein and the antibody.
  • the specific determination method is not particularly limited, but can be determined by a known method such as measurement of binding constant, fluorescent immunostaining method such as flow cytometry analysis, Western blotting or the like.
  • the determination criteria may be limited to the presence or absence of affinity, and may be determined by relatively comparing the affinity.
  • the antibody (d) only needs to have its antigen recognition site exposed to the outside of the bio-nanocapsule. Specifically, for example, as shown in FIG. 1, it may be carried on the virus surface antigen protein (c) contained in the bio-nanocapsule, or may be carried on the lipid membrane (b) contained in the bio-nanocapsule. Good.
  • the antibody (d) When the antibody (d) is supported on the virus surface antigen protein (c), the antibody (d) may be supported via a chemical bond such as a covalent bond or by binding via an antibody binding domain. It may be. Among these, it is preferable that the antibody is bound to the antibody binding domain. In particular, it is preferable that the virus surface antigen protein (c) contained in the bio-nanocapsule of the present invention has an antibody binding domain, and the antibody (d) is bound through such a domain.
  • the state in which the virus surface antigen protein and the antibody are supported may be further subjected to a crosslinking treatment using a crosslinking agent or the like.
  • a crosslinking agent or the like.
  • Specific cross-linking agents are not particularly limited. For example, bis [sulfosuccinimidyl] suberate (BS 3 ) dimethyl melimidate dihydrochloride (DMP), dimethyl subericidate dimethyl dihydrochloride (DMS) disuberate And succinimidyl (DSS).
  • the antibody-binding domain is not particularly limited.
  • the Z domain containing E, D, A, B, and C domains possessed by protein A derived from Staphylococcus aureus and the like, C1 possessed by protein G derived from streptococci, and the like examples thereof include an antibody binding domain containing D1, C2, D2, and C3 domains, an antibody binding domain containing B1, B2, B3, B4, and B5 domains of protein L derived from Peptostreptococcus magnus and the like.
  • the domain containing at least the C2 domain is preferably used as the above-mentioned antibody binding domain, and among the antibody binding domains possessed by protein L, the domain containing at least the B1 domain is used as the above-described antibody.
  • a binding domain is preferred.
  • amino acid sequences of these seed antibody binding domains include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the case of the Z domain of protein A. If it is an antibody binding domain which protein G has, the amino acid sequence shown to sequence number 2 will be mentioned. If it is an antibody binding domain which protein L has, the amino acid sequence shown to sequence number 3 will be mentioned.
  • amino acid sequences may be amino acid sequences mutated as long as antibody binding ability is not attenuated.
  • the specific number of mutations is not particularly limited, but usually the amino acid sequence before mutation is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 99% or more. What is necessary is just to set it as the number of mutation introduction
  • mutagenesis here refers to substitution, deletion, insertion, and the like.
  • a known method can be employed, and is not particularly limited.
  • a conservative substitution technique may be employed for substitution.
  • the term “conservative substitution technique” means that an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain.
  • amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine, and histidine
  • amino acid residues having acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid
  • amino acid residues having uncharged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and cysteine
  • Amino acid residues with non-polar side chains such as proline, phenylalanine, methionine, and tryptophan
  • amino acid residues with ⁇ -branched side chains such as threonine, valine, and isoleucine
  • aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan, and histidine
  • substitutions between amino acid residues are conservative substitutions.
  • identity refers to the degree of amino acid sequences of two or more comparable amino acid sequences with respect to each other. Therefore, the higher the identity of two amino acid sequences, the higher the similarity between those sequences.
  • degree of amino acid sequence identity or similarity is determined, for example, using FASTA, a sequence analysis tool, and using default parameters. Specific methods of these analysis methods are publicly known, and the website of the National Center of Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) may be referred to.
  • the virus surface antigen protein (c) When the above-mentioned antibody binding domain is contained in the virus surface antigen protein (c), it is preferably contained in the surface of the bio-nanocapsule of the present invention or a site exposed to the outside thereof.
  • it when it is a virus surface antigen protein, it is preferably contained in the PreS region present at its N-terminus.
  • the virus surface antigen protein contained in the bio-nanocapsule is a hepatitis B virus surface antigen protein and its N-terminal and C-terminal are deleted, the C of the protein It is preferable that the above-mentioned antibody binding domain is contained on the terminal side (Patent Document 14).
  • a plurality of the antibody binding domains described above may be included in the bio-nanocapsule.
  • the above-described various antibody binding domains may be of one type or two or more types.
  • the antibody (d) when the antibody (d) is supported on the lipid membrane (b), it may be supported via a chemical bond as in the case of being supported on the lipid. It may be supported by binding of the antibody via That is, the virus-like particle (a) constituting the bio-nanocapsule of the present invention does not contain the antibody binding domain in the virus surface antigen protein (c), and is in a state of being bound or pierced to the lipid membrane (b). Good.
  • the average particle size of the bio-nanocapsule of the present invention is usually about 20 nm to 150 nm as the Z-average particle size from the viewpoint of efficient delivery to dendritic cells, efficient entry into dendritic cells, and the like. It is. Preferably, it is usually about 45 nm to 55 nm.
  • the charge of the bio-nanocapsule of the present invention is usually about ⁇ 30 mV to ⁇ 10 mV as the ⁇ potential. From the viewpoints of efficient delivery to spleen tissue, efficient delivery to dendritic cells, efficient entry into dendritic cells, delivery of proteins and nucleic acids, etc., toxicity in vivo From the viewpoint and the like, about ⁇ 10 mV to ⁇ 5 mV is preferable.
  • the ⁇ potential may be measured by the method described in detail in the following examples.
  • the bio-nanocapsule of the present invention tends to easily induce a humoral immune system by stopping for a long period of time after being taken up by acting on dendritic cells. On the other hand, when it moves to the cytosol and stays for a relatively long time, it tends to easily induce the cellular immune system.
  • bio-nanocapsules can be appropriately selected by adjusting the charge. Therefore, when the bio-nanocapsule of the present invention further contains a liposome, it is possible to appropriately select the immune system to be raised by adjusting the overall charge including the liposome.
  • bio-nanocapsules induces lipids that are easy to form their charge and lipid type (reverse hexagonal phase (also referred to as hexagonal II phase) that destabilizes the endosomal membrane) and the proton sponge effect. It is possible to select appropriately by adjusting the lipid that destroys the endosome. Therefore, by adjusting the charge and lipid type of the bio-nanocapsule of the present invention, it is possible to appropriately select the immune system to be raised.
  • the bio-nanocapsule of the present invention tends to have a negative charge in general, the bio-nanocapsule of the present invention as described later has a mode in which the liposome is bound, and the charge of the liposome is adjusted.
  • the charge of the entire bio-nanocapsule of the present invention can be easily set as appropriate.
  • the charge of the liposome can generally be easily set by adjusting the blending ratio of the lipid composition.
  • the setting of the surface charge of the bio-nanocapsule of the present invention is not limited to setting the charge of the liposome.
  • the host cell may be a prokaryotic cell or a eukaryotic cell, but a yeast cell is preferable from the viewpoint of introduction of nucleic acid, culture, gene expression level, and the like.
  • a yeast cell is preferable from the viewpoint of introduction of nucleic acid, culture, gene expression level, and the like.
  • E. coli is used as a host cell. It is preferable to use as.
  • the recovered virus-like particles may be purified by subjecting them to a column chromatography method using an ultracentrifugation method, an affinity gel, a size exclusion gel or the like.
  • the bio-like capsule of the present invention may be prepared by mixing the thus obtained virus-like particle and the above-mentioned antibody.
  • the mixing conditions and the like are not particularly limited, and a known method may be appropriately selected.
  • bio-nanocapsule and the antigenic substance and / or nucleic acid are combined in advance as a production method when the bio-nanocapsule of the present invention further contains an antigenic substance and / or nucleic acid.
  • a known method such as an electroporation method may be adopted for the bio-nanocapsule produced as described above.
  • a liposome may be further bound to the above-mentioned bio-nanocapsule.
  • the structure of the bio-nanocapsule of such an embodiment (hereinafter sometimes referred to as a liposome-bound bionanocapsule) will be described as appropriate based on one embodiment of the liposome-bound bionanocapsule shown in the schematic diagram of FIG. .
  • liposome-binding bio-nanocapsules are not limited to those derived only from the drawings.
  • the above-mentioned liposome-binding bio-nanocapsule has a structure in which the bio-nanocapsule (a) and the liposome (e) are combined and inseparable. More specifically, for example, as shown in Patent Document 8, the bio-nanocapsule has a lipid membrane (b), and the liposome (e) and the bio-nanocapsule (a) are passed through the respective lipid membranes. And membrane fusion.
  • the liposome (e) and the bio-nanocapsule (a) do not need to be encapsulated in either one, and may simply be in a state where one of them is stuck into the other.
  • the liposome is usually about 2 to 12 parts by mass, more preferably about 6 to 10 parts by mass with respect to 1 part by mass of the bio-nanocapsule.
  • the average particle size of the above-mentioned liposome-binding bio-nanocapsule is usually 100 nm to 600 nm as the Z-average particle size from the viewpoint of efficient delivery to dendritic cells, efficient entry into dendritic cells, and the like. Degree.
  • the charge of the above-mentioned liposome-bound bio-nanocapsule is usually about ⁇ 30 mV to 20 mV as the ⁇ potential. From the viewpoints of efficient delivery to spleen tissue, efficient delivery to dendritic cells, efficient entry into dendritic cells, delivery of proteins and nucleic acids, etc., toxicity in vivo From the viewpoint and the like, about ⁇ 20 mV to 0 mV is preferable.
  • the ⁇ potential may be measured by the method described in detail in the following examples.
  • the above-mentioned liposome-binding bio-nanocapsule tends to easily induce a humoral immune system by stopping for a long period of time after being allowed to act on dendritic cells and then taken up by endosomes. On the other hand, when it moves to the cytosol and stays for a relatively long time, it tends to easily induce the cellular immune system.
  • the localization of these liposome-binding bio-nanocapsules can also be appropriately selected by adjusting the charge, as in the case of the bio-nanocapsules described above. Therefore, if the charge of the liposome-binding bio-nanocapsule of the present invention is adjusted, it is possible to appropriately select the immune system to be raised.
  • the liposome in the above-described liposome-binding bio-nanocapsule may have a single lamellar structure (single film) or a multilamella structure (multiple film). It may be an anionic liposome or a cationic liposome.
  • the specific charge of the liposome is usually about ⁇ 60 mV to 60 mV as the ⁇ potential.
  • the average particle size of such liposomes is usually about 100 nm to 400 nm as the Z-average particle size. From the viewpoint of complexing with a bio-nanocapsule and then administering to a living body, the thickness is preferably about 100 nm to 300 nm, more preferably about 100 nm to 200 nm.
  • the measurement of the ⁇ potential and the Z-average particle diameter of the liposome may be performed by the methods shown in the following examples.
  • the method for producing the liposome is not particularly limited, and may be prepared by a known method after mixing the lipids exemplified as the composition as described above at an appropriate composition ratio. Examples include the bangham method, ultrasonic method, reverse phase evaporation method, polyhydric alcohol method, heating method, spray drying method, mechanochemical method, freeze-thaw method, film loading method, supercritical carbon dioxide method and the like. .
  • the bio-nanocapsule of the present invention further contains a liposome and an antigenic substance and / or nucleic acid
  • a liposome and an antigenic substance and / or nucleic acid are bound in advance.
  • an antigenic substance and / or a nucleic acid may be mixed at the same time when the lipid constituting the liposome is mixed.
  • the mixing amount of the antigen substance and / or nucleic acid is not particularly limited, and a desired amount may be appropriately set and mixed.
  • the prepared liposome can be adjusted to an average particle size using, for example, an extruder together with a filter having a pore size of an appropriate size.
  • virus-like particles created in the above-mentioned method for producing bio-nanocapsules are bound to the above-mentioned liposomes, and the liposome-binding bio-nanocapsules obtained thereby are bound to the antibodies that recognize the surface proteins of the above-mentioned dendritic cells. Also good.
  • the binding conditions between the bio-nanocapsule and the liposome may be appropriately selected from the below-described binding conditions between the bio-nanocapsule containing the antigenic substance and / or nucleic acid and the liposome.
  • the binding conditions for the antibody recognizing the antibody may be appropriately selected from the binding conditions for the virus-like particle described in the method for producing the bio-nanocapsule and the antibody recognizing the surface protein of the dendritic cell as appropriate. .
  • the mixing condition of the above-mentioned bio-nanocapsule and the above-mentioned liposome is not particularly limited, and it may be usually incubated for 30 to 120 minutes in an environment of about 20 to 60 ° C.
  • the liposome-binding bio-nanocapsule prepared according to the case may be purified.
  • a specific purification method may be a known method and is not particularly limited. Examples thereof include ultracentrifugation, column chromatography using affinity gel, size exclusion gel, and the like.
  • the method for binding the above-mentioned liposome-binding bio-nanocapsule and the above-mentioned antibody that recognizes the surface protein of the dendritic cell is not particularly limited, and the antibody that recognizes the surface protein of the dendritic cell and the above-mentioned bio-nanocapsule or After mixing with the liposome-binding bio-nanocapsule of the present invention, it is usually incubated for 30 minutes to 120 minutes in an environment of about 20 ° C. to room temperature.
  • a bio-nanocapsule carrying an antibody that recognizes a dendritic cell prepared according to circumstances may be purified.
  • a specific purification method a known method may be adopted as in the above-described purification of the bio-nanocapsule of the present invention.
  • the antibody binding method to the bio-nanocapsule to which the liposome is not bound may be the same as this.
  • Bio-nanocapsule containing the antigenic substance and / or nucleic acid of the present invention The bio-nanocapsule containing the antigenic substance and / or nucleic acid of the present invention further comprises an antigenic substance and / or nucleic acid in the above-described bio-nanocapsule of the present invention. Specifically, what is necessary is just to be contained in the virus-like particle
  • bio-nanocapsule When the bio-nanocapsule is a liposome-bound bionanocapsule as described above, it may be contained in the virus-like particle (a) or may be contained in the liposome (e).
  • virus-like particle (a) may include an antigenic substance and / or a nucleic acid, or may be in a state of being pierced into the lipid membrane (b).
  • liposome (e) may include an antigenic substance and / or a nucleic acid, or may be stuck into the liposome.
  • the antigenic substance is not particularly limited, the bio-nanocapsule of the present invention is positively delivered to dendritic cells and taken into the dendritic cells when administered in vivo, and thus has an excellent function as a vaccine. Demonstrate. Therefore, the antigenic substance may be a surface protein such as a bacterium or virus that causes an infection or the like, a sugar chain, a lipid, or the like, or a part thereof.
  • the nucleic acid is not particularly limited and includes DNA, RNA, peptide nucleic acid and the like.
  • a nucleic acid base sequence is preferably a base sequence encoding the antigenic substance described above. Further, it may be a base sequence having a CpG motif, a PATRE sequence, a C3d sequence, or the like. Since the CpG motif or the like exhibits a function as an adjuvant that elicits the immune system, it is effective to use it together with the above-mentioned antigenic substance and nucleic acid having a base sequence encoding the antigenic substance.
  • the bio-nanocapsule of the present invention containing an antigenic substance and / or nucleic acid can efficiently reach dendritic cells when administered into an individual. Furthermore, after reaching the dendritic cell, it also exerts an action of entering the dendritic cell.
  • a dendritic cell is a cell that plays a very important role as a cell presenting an antigen in the immune system in a living body. Therefore, when the bio-nanocapsule of the present invention contains an antigenic substance, the dendritic cell is used. The antigenic substance is presented very efficiently, and an immune system related to cellular immunity and / or humoral immunity is induced against the antigenic substance.
  • nucleic acids that encode peptides that serve as antigenic substances can be introduced into dendritic cells.
  • the expression of a peptide serving as an antigen substance in such dendritic cells facilitates the presentation of the peptide as an antigen substance outside such dendritic cells.
  • the bio-nanocapsule of the present invention containing an antigenic substance and / or nucleic acid is administered into a living body, a significant amount of an antibody against the antigenic substance can be produced in the living body. And since it is natural that such an antibody includes an antibody having a function of neutralizing the antigen substance, the bio-nanocapsule containing the antigen substance and / or nucleic acid of the present invention is a vaccine. As an excellent function.
  • bio-nanocapsule containing the antigenic substance and / or nucleic acid of the present invention not only elicits a humoral immune system that produces an antibody against the antigenic substance as described above after entering a dendritic cell, but also cellular immunity.
  • the system also has the effect of inducing. Therefore, it has a function as an excellent vaccine.
  • the administration target of the bio-nanocapsule containing the antigenic substance and / or nucleic acid of the present invention is not particularly limited, and is not particularly limited as long as it is an animal that desires a function as a vaccine. , Chicken, horse, sheep, human, goat, chimpanzee, gorilla and the like.
  • the specific dose is not particularly limited, for example, when a bio-nanocapsule containing an antigenic substance is administered, it may be usually administered in an amount of about 2 mg to 50 mg / kg in terms of the amount of the antigenic substance.
  • When administering a bio-nanocapsule containing a nucleic acid it is usually sufficient to administer about 1 mg to 20 mg / kg in terms of the amount of nucleic acid.
  • When administering a bio-nanocapsule containing an antigenic substance and a nucleic acid it is usually sufficient to administer about 3 mg to 70 mg / kg in terms of the total amount of the antigenic substance and nucleic acid.
  • bio-nanocapsule containing antigenic substance and / or nucleic acid of the present invention The production method of bio-nanocapsule containing the antigenic substance and / or nucleic acid of the present invention is not particularly limited, and the above-mentioned antigenic substance and / or nucleic acid is described above. And the above-described bio-nanocapsule or liposome-bound bio-nanocapsule, and then incubated for 30 minutes to 120 minutes, usually in an environment of about 20 ° C. to room temperature.
  • bio-nanocapsules When antigenic substances and / or nucleic acids are directly contained in the above-mentioned bio-nanocapsules, these may be chemically bound using, for example, a known crosslinking agent. Moreover, you may introduce
  • the antigenic substance and / or the nucleic acid may couple
  • the antigenic substance and / or nucleic acid and the bio-nanocapsule or the liposome may be mixed and bonded before the bio-nanocapsule and the liposome are bonded in advance.
  • the bio-nanocapsule and the liposome may be combined and further mixed and combined. The specific method is as described in detail in [Manufacturing method] of the above (Bio-nanocapsule) and (Liposome).
  • Bio nanocapsules to the present invention the method described above antigenic substance and / or nucleic acid transfer of the present invention, when further comprising an antigenic substance and / or nucleic acids, such antigenic substances and / or nucleic acids by administering them to animals It can be introduced into animal dendritic cells.
  • the method for introducing an antigenic substance and / or nucleic acid of the present invention into an animal dendritic cell includes a step of administering to the animal a bio-nanocapsule that is a virus particle containing a viral antigen protein, and the bio-nanocapsule is dendritic.
  • An introduction method characterized by carrying an antibody that recognizes a cell surface protein and containing an antigenic substance and / or a nucleic acid.
  • the animal to be administered, the dose, the administration method, etc. may be as described in detail for the bio-nanocapsule containing the antigenic substance and / or nucleic acid of the present invention .
  • the bio-nanocapsule of the present invention exerts an action of invading into dendritic cells together with the antigenic substance and / or nucleic acid. It is useful as a nucleic acid introduction agent.
  • the antigenic substance and / or nucleic acid introduction agent of the present invention includes the above-described bio-nanocapsule of the present invention.
  • the blending amount of the bio-nanocapsule of the present invention in the antigen substance and / or nucleic acid introduction agent is not particularly limited, but it may be usually about 0.001% to 99.9% per such introduction agent.
  • the above-described bio-nanocapsule of the present invention itself may be used as the antigen substance and / or nucleic acid introduction agent of the present invention.
  • a bio-nanocapsule (hereinafter sometimes referred to as BNC) used in this example was produced by the following method. Specifically, yeast cells using a method for expressing a hepatitis B virus surface antigen L protein having a ZZ domain (hereinafter sometimes referred to as HBsAg L protein) using the method described in Non-Patent Document 5. The yeast cells were cultured, and bio-nanocapsules (hereinafter referred to as ZZ-BNC) mainly composed of HBsAg L protein having a ZZ domain were isolated and purified from within the yeast cells. .
  • BNC bio-nanocapsule
  • a bio-nanocapsule (hereinafter referred to as ST-BNC) that does not have a ZZ domain and is mainly composed of HBsAg L protein was isolated and purified by the same method.
  • the concentrations of the obtained ZZ-BNC and ST-BNC were measured in terms of the amount of protein as the main component of various BNCs.
  • the specific measurement method was measured using a commercially available protein amount measurement kit, BCA protein assay kit (Pierce (IL, USA)) (the same applies to the following experiments).
  • the obtained ZZ-BNC and ST-BNC are optionally supplied with Fluorolink Cy5 dye (GE Healthcare CA, USA) or CF750 dye (Biotium CA, USA) for its own detection.
  • Fluorolink Cy5 dye GE Healthcare CA, USA
  • CF750 dye Biotium CA, USA
  • Z-Average indicates the Z-average particle diameter
  • ⁇ -Potentials indicates the ⁇ potential.
  • the Z-average particle size and ⁇ potential were both measured using a dynamic light scattering photometer Zetasizer (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) in an aqueous solvent at 25 ° C. according to a conventional method (the following). The same applies to the experiment.
  • PDI indicates the polydispersity index of the Z-average particle size.
  • Binding Affinity indicates the amount of each antibody bound to ZZ-BNC, and was calculated as the amount per mole of HBsAg L protein containing the ZZ domain, which is the main component of ZZ-BNC. Specifically, the amount of each antibody bound to ZZ-BNC was measured using a Twin-Q apparatus (Osaka, Japan) based on the quartz crystal microbalance method at 25 ° C. It was carried out according to a conventional method.
  • ZZ-BNC to which various antibodies bind has no ZZ domain and has the same Z-average particle diameter (100 nm or less) and ⁇ potential (negative charge) as conventional ST-BNC. It became clear. Also, for ZZ-BNC, an anti-CD11c antibody having an isotype of an Armenian hamster-derived IgG is known to have a high affinity for the ZZ domain, which is as high as that of mouse-derived IgGs. It became clear that it combined with efficiency.
  • Dendritic cells were isolated from spleens of Balb / c mice (female: 6-8 weeks old; Japan SLC: JAPAN) according to a conventional method. Among dendritic cells, CD11c positive dendritic cells were further purified based on MACS (registered trademark) technology (Miltenyi Biotech Co., Ltd.).
  • CD11c-positive dendritic cells and ZZ-BNC (ZZ-BNC is labeled with a cy5 dye) bound to the above antibody were incubated at 4 ° C. for 30 minutes, and then Cy5 was released.
  • the amount of ZZ-BNC bound to various antibodies having affinity for CD11c-positive dendritic cells was measured based on 670 nm, which is the emission wavelength of Cy5 dye. The result is shown in FIG.
  • ZZ-BNC bound with anti-CD11c antibody and anti-MHC class II showed particularly high affinity for CD11c-positive dendritic cells derived from mouse spleen.
  • the anti-CD11c antibody described above may be used for ZZ-BNC that does not have an antibody that recognizes dendritic cell surface proteins, such as ZZ-BNC to which no antibody is bound or ZZ-BNC to which Mouse IgGs is bound.
  • ZZ-BNC to which no antibody is bound
  • ZZ-BNC to which Mouse IgGs is bound
  • affinity for spleen-derived CD11c-positive dendritic cells was observed.
  • HBsAg L protein having the ZZ domain which is the main component of ZZ-BNC used in this example, has a high mannose sugar chain, and the dendritic cells have a mannose receptor. This is thought to be because these two are involved in binding to dendritic cells. Therefore, ZZ-BNC bound with an antibody that recognizes BNC, ZZ-BNC containing the same and dendritic cell surface protein in this example is particularly effectively used for binding to dendritic cells.
  • Example 3 Administration of BNC to living body> Among ZZ-BNCs bound with antibodies recognizing surface proteins of dendritic cells prepared by the above-described method, ZZ-BNCs bound with anti-CD11c antibody and anti-MHC class II antibody are mouse individuals (female: 6-8). An experiment was conducted using a living body observation system (OV-100; Olympus: Japan), followed by observation of the localization of ZZ-BNC in a mouse individual. As a comparative experiment, ZZ-BNC bound to Mouse IgGs, mere ZZ-BNC bound to no antibody, and ST-BNC not having a ZZ domain were also administered. Each BNC was previously labeled with a CF-750 dye.
  • Various BNCs were administered to each mouse by tail vein injection at 10 ⁇ g in terms of the amount of the protein as the main component, and after euthanasia to the mouse individuals 40 minutes after the administration, The heart, lung, kidney, liver and spleen were removed.
  • Each of the extracted organs is detected by the above-described biological observation system based on the emission wavelength of CF-750 dye at 780 nm, and the various BNCs after administration to the individual mouse are localized in the individual mouse. The result of observation is shown in FIG.
  • ZZ-BNC bound with anti-CD11c antibody and ZZ-BNC bound with anti-MHC class II antibody show high affinity for CD11c-positive dendritic cells in spleen tissue Became clear.
  • ZZ-BNC bound with anti-CD11c antibody showed higher affinity such that it accumulates in 62% of CD11-positive dendritic cells.
  • Non-Patent Document 2 when an antigen to which F (ab ′) 2 of anti-CD11c is bound is administered subcutaneously, the antigen reaches only 1.5% of dendritic cells after 4 hours. Reaching 81.4% dendritic cells after 12 hours.
  • ZZ-BNC carrying an antibody recognizing the surface protein of dendritic cells in this Example accumulates as much as 62% of such ZZ-BNC in 4 hours after administration. .
  • an antibody that recognizes a surface protein of a dendritic cell that binds to ZZ-BNC is supported on the surface of ZZ-BNC so that an antigen-antibody reaction is more likely to occur. This is considered to be because the effect of recognizing the surface protein increases.
  • CD11 positive dendritic cells were purified from the incubated cells using an anti-CD11c antibody, and the purified cell population was observed with a confocal laser microscope (FV-1000; Olympus: Janan). The results are shown in FIG.
  • CD11c is displayed in green
  • BNC to which the anti-CD11c antibody is bound is displayed in red.
  • ZZ-BNC bound with anti-CD11c antibody is present inside CD11c-positive dendritic cells. Therefore, when ZZ-BNC bound with an antibody recognizing the surface protein of dendritic cells in this example was administered to a mouse individual, it reached CD11c-positive dendritic cells in spleen tissue, and such dendritic cells It was revealed that ZZ-BNC was taken into the inside.
  • the ZZ-BNC bound to the antibody recognizing the surface protein of the dendritic cell in this example has a function of invading into the dendritic cell because it has not only the membrane fusion domain but also a membrane permeation domain. It is thought that it is because it has.
  • the above-mentioned ZZ-BNC binds to CD11c present on the surface of dendritic cells, and then the ZZ-BNC is taken into the dendritic cells based on the phagocytosis by such CD11c.
  • ZZ-BNC bound with an antibody recognizing the surface protein of dendritic cells in this example can be suitably used for introducing a substance into CD11c-positive dendritic cells.
  • dendritic cells are important cells that exert an antigen-presenting function in the immune system of various mammals including humans, they recognize the surface proteins of the dendritic cells in this example.
  • Liposomes were produced according to a conventional method. Specifically, cholesterol (Chol), diethylphosphatidylethanolamine (DOPE), O, O′-ditetradecanol-N- ( ⁇ -trimethylammonioacetyl) diethanol hydrochloride (DC-6-14) at a molar ratio of 3 It was prepared by mixing with a composition of 3: 4. The obtained liposome was confirmed to be a cationic liposome. The resulting liposome had a ⁇ potential of 56.5 mV and a Z-average particle size of 121 nm.
  • Example 4 Preparation of BNC bound to liposome> Bio-nanocapsule in which ZZ-BNC containing 100 ⁇ g of HBsAg L protein having ZZ domain and 600 ⁇ g of the above-mentioned cationic liposome are mixed in pH 4 Briton-Robinson buffer and incubated at 37 ° C. for 30 minutes to bind the liposome Was made.
  • the liposome-bound BNC obtained here was purified by subjecting it to 0-40% cesium chloride density gradient centrifugation.
  • the purified bio-nanocapsule to which the liposome was bound (hereinafter referred to as ZZ-BNC-LP) was dialyzed against PBS.
  • the obtained ZZ-BNC-LP contains 19.5 ⁇ g of HBsAg L protein having a ZZ domain, which is the main component of ZZ-BNC, and 65.6 ⁇ g of cationic liposomes, and has a Z-average particle size of 455 nm (PDI; 0 331), the ⁇ potential was ⁇ 5.76 mV.
  • the liposome content was measured using a commercially available lipid measurement kit, Cholesterol E-Test (Wako Pure Chemical: Japan).
  • D3 antigen of Japanese encephalitis virus was bound to ZZ-BNC-LP as an antigen substance.
  • the D3 antigen is one of the envelope protein domains of Japanese encephalitis virus, and was prepared using an expression system using Escherichia coli as described in Non-Patent Document 1.
  • ZZ-BNC-LP-D3 The above-mentioned ZZ-BNC-LP containing 120 ⁇ g of ZZ-HBsAg L protein and 404 ⁇ g of cationic liposomes and 60 ⁇ g of the D3 antigen were mixed and incubated at room temperature for 1 hour (the one obtained in this step) Hereafter referred to as ZZ-BNC-LP-D3). Thereafter, 24 ⁇ g of the above anti-CD11c antibody was added and allowed to bind to ZZ-BNC in ZZ-BNC-LP. The final product is hereinafter referred to as ⁇ -CD11c-ZZ-BNC-LP-D3.
  • Example 5 Administration of BNC bound to liposome containing antigen to mouse individual> 20 ⁇ g of ⁇ -CD11c-ZZ-BNC-LP-D3 and ZZ-BNC-LP-D3 in terms of the amount of D3 antigen were administered to individual mice (female: 6-8 weeks old; Japan SLC: JAPAN), tail It was administered by the intravenous method.
  • a cationic liposome containing the same amount of D3 antigen and a complex of D3 antigen hereinafter referred to as LP-D3
  • Table 3 shows various physical properties of the administered sample.
  • Antibody titer was measured using a generally known indirect ELISA method. Specifically, the D3 antigen obtained by the above method was immobilized on a microplate, and an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody was used for detection. The results are shown in FIG.
  • the mouse individual is immunized using only the D3 antigen, the mouse individual is immunized using LP-D3, or 4 weeks after the initial immunization in the mouse individual After 6 weeks, almost no anti-D3 antibody was produced.
  • an antibody against D3 is 6 weeks after the first immunization, Although produced in mouse solids, the production amount is similar to that produced four weeks after immunization with ⁇ -CD11c-ZZ-BNC-LP-D3 having an antibody against anti-CD11c, and D3 The amount of antibody produced against the antigen was much inferior to that of ⁇ -CD11c-ZZ-BNC-LP-D3.
  • ⁇ Experimental Example 6 Administration route study of dendritic cell targeted BNC> Fluorescent dye CF750-labeled anti-CD11c antibody-presenting ZZ-BNC (hereinafter referred to as ⁇ -CD11c-ZZ-BNC (CF750 Labeled)) is prepared by the method described in Non-Patent Document 3, and the amount of the protein corresponding to 10 ⁇ g is prepared. It is administered to the ridge part (subcutaneous injection: SC) or thigh (intramuscular injection: IM) of mouse Balb / c, and it is sacrificed 12 hours later so that the axillary, inguinal, and popliteal lymph nodes can be directly viewed. After laparotomy, fluorescence observation was performed with an In Vivo imaging device manufactured by Olympus.
  • SC subcutaneous injection
  • IM intramuscular injection
  • Results are shown in FIG. Fluorescence was observed in the inguinal lymph nodes for the SC administration, and in the inguinal and popliteal lymph nodes for the IM administration. This indicates the possibility that ⁇ -CD11c-ZZ-BNC (CF750 Labeled) can infect regional lymph nodes not by conventional IV but by the usual route of administration as vaccines of SC and IM.
  • inguinal lymph nodes were removed from mice administered SC with ⁇ -CD11c-ZZ-BNC (CF750 Labeled), and popliteal lymph nodes were removed from mice administered IM with ⁇ -CD11c-ZZ-BNC (CF750 Labeled).
  • CD11c positive cells were isolated by the method described in Patent Document 3, and the degree of ZZ-BNC migration to dendritic cells in lymph nodes was examined using FACS.
  • Example 7 Experiment on Adjuvant Effect of Dendritic Cell Targeted BNC> ⁇ -CD11c-ZZ-BNC, ZZ-BNC, and 10 ⁇ g of LPS as a positive control were administered to mice with SC or IM, and the inguinal lymph nodes or popliteal lymph nodes were removed 2 days later. Dendritic cells were isolated, and the expression levels of CD86 and MHC class II, which are activation markers on the surface of dendritic cells (cell surface molecules that are expressed when dendritic cells present antigens to T cells), were measured using FACS. Quantified.
  • the liposome is aLP-D3.
  • the Z average particle size measured according to the above-mentioned method was about 110 nm, and the ⁇ potential was about ⁇ 53.1 mV.
  • ZZ-BNC was polymerized at pH 4, 37 ° C. for 1 hour, the anti-CD11c antibody was fixed with BS 3 crosslinker, and the excess crosslinker was masked with glycine.
  • This is designated anti-CD11c-ZZ-BNC-aLP-D3.
  • the Z average particle diameter of such BNC is about 100 to 600 nm, and the ⁇ potential is about ⁇ 20 to 0 mV.
  • ALP-D3, ST-BNC-aLP-D3 (ST-BNC is a BNC having no ZZ domain as described above and presents a yeast-derived high mannose sugar chain), ZZ-BNC-aLP-D3 , And ⁇ -CD11c-ZZ-BNC-aLP-D3 were administered to mice (6 mice per group) at 20 ⁇ g as the amount of D3 at IM every 3 weeks (0, 2, and 4 weeks). . At that time, blood was collected at 0, 4, and 6 weeks, and at 6 weeks, 50% of the lethal dose of half of the mice was inoculated. In addition, as a positive subject experiment, a JEV vaccination group (multivalent and 20 ⁇ g or more of administered antigen) of Kaketsuken was similarly administered.
  • FIG. A positive subject the KEV Institute JEV vaccination group (antigen administered is multivalent and greater than 20 micrograms) completely protected against infection by JEV
  • ⁇ CD11c-ZZ-BNC-aLP-D3 was similarly Completely protected against infection by JEV. Since ZZ-BNC-aLP-D3 was protected against infection by half of the mice and only one ST-BNC-aLP-D3 was protected, dendritic cells containing only yeast-derived high mannose-derived sugar chains Targeting was considered insufficient to prevent infection.
  • the ZZ domain itself recognizes the IgG domain that is presented to B cells and the like, and therefore, it was speculated that ZZ-BNC had higher ability to target dendritic cells than ST-BNC.
  • the anti-CD11c antibody directly bound with the D3 antigen could not completely prevent the infection by JEV.
  • "1) delivery of D3 antigen to dendritic cells via anionic liposomes is effective for antigen processing in dendritic cells, and D3 directly fed into dendritic cells is It suggests that it is not properly processed or simply degraded in dendritic cells.
  • Or“ 2) The anti-CD11c antibody displayed on the surface of ZZ-BNC is aligned on the surface of BNC. This indicates that the avidity of such an antibody has significantly increased compared to that of one antibody molecule, and thus targeting to dendritic cells has been performed efficiently.
  • Example 9 Examination of antigen loading method onto dendritic cell targeted BNC 2>
  • the anti-CD11c antibody is aligned and presented on the surface of the ZZ-BNC and simultaneously presents the D3 antigen without using a liposome.
  • a product was prepared and examined. Specifically, pyridyldithiolated ZZ-BNC was prepared using Sulfo-LC-SPDP (Pierce) for the Free amino group of the ZZ-BNC surface layer.
  • mice 40 ⁇ g of ⁇ -CD11c-ZZ-BNC-D3 and ZZ-BNC-D3 in terms of D3 antigen amount were administered to mice (5 mice per group), IV (intravenous), IM (intramuscular), respectively. ) And SC (subcutaneous) routes were inoculated at 0 and 2 weeks, and anti-D3-IgG antibody titers in serum were evaluated by ELISA at 4 weeks.
  • Example 11 Infection protection experiment using dendritic cell-targeted BNC with antigen> ⁇ -CD11c-ZZ-BNC-D3, ZZ-BNC-D3, and ST-BNC-D3 described above were converted to D3 antigen amount in mice (6 mice per group) at a dose of 40 ⁇ g twice every 2 weeks. Administered IM (week 0, 2). At that time, blood was collected at the 0th and 4th weeks, and 50% of the lethal dose of half of the mice were inoculated at the 4th week. This is an extreme challenge experiment with a shorter administration interval than the experiment shown in FIG.
  • the anti-CD11c antibody directly bound with the D3 antigen could not protect against JEV infection at all. This is because the anti-CD11c antibody presented on the surface layer of ZZ-BNC is aligned on the BNC surface layer, and the avidity of the antibody is markedly higher than that of one antibody molecule. This suggests that targeting was performed efficiently. Note that the possibility of 1) suggested in Experimental Example 8 was considered to be low from this experiment.
  • ⁇ Experimental Example 12 Experiment of Dendritic Cell Targeting BNC Having Antigen as Nucleic Acid> ⁇ -CD11c-ZZ-BNC (anti-CD11c antibody 1 ⁇ g and ZZ-BNC 5 ⁇ g) was prepared according to the method described in Non-patent Document 3, and cationic liposomes (composition was described in Non-Patent Document 3) , 30 ⁇ g) and 3 ⁇ g of lipoplex (LPX) complexed with fluorescent dye Cy5-labeled plasmid DNA were mixed and incubated at 37 ° C.
  • LPX lipoplex
  • ⁇ -CD11c antibody-presenting CF750 fluorescence-labeled ZZ-BNC-cationic liposome-DNA and “CF750 fluorescence-labeled ZZ-BNC-cationic liposome-DNA” were prepared, and ZZ— An amount corresponding to 10 ⁇ g in terms of BNC was administered, and 1 hour later, the concentration of ZZ-BNC in each major organ was quantified by fluorescence intensity using an in vivo imaging apparatus.
  • Z average particle diameter and zeta potential were 410 nm / 18.9 mV, 356 nm / 18.7 mV, 268 nm / 40.0 mV, and> 1000 nm / ⁇ 25.1 mV, respectively, in the order described above.

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Description

樹状細胞表面タンパク質に対する抗体を有するバイオナノカプセル
　本発明は、樹状細胞表面タンパク質に対する抗体を有するバイオナノカプセルに関するものである。
　主にＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質又はその改変体を、酵母細胞等の真核生物において発現させることによって得られるウイルス様粒子が、特定の組織に薬剤、遺伝子等を送達するためのＤＤＳナノキャリアとして有用であることが既に報告されている。
　この様なウイルス様粒子自体は、癌組織及び肝臓組織へのＤＤＳナノキャリアとして特に有用であるが、送達を所望する組織にて発現するタンパク質や糖鎖等といった生体分子へ特異的に結合する分子を担持するウイルス様粒子とすれば、薬剤、遺伝子等を、斯かる組織に特異的に送達するためのＤＤＳナノキャリアとしての効果を発揮することも知られている（特許文献１～１３）。
　有効なワクチンの開発は、感染症への対策において非常に有用である。また、ガンの治療においては、細胞性免疫を活性化させてガン細胞を攻撃するといった機序に基づいた新たな治療法も開発されている。この様な背景を基に、質の良いワクチンを得ることが、近年、益々求められている。
　この様な市場ニーズに反応し、免疫システムにおいて重要な役割を担う抗原認識細胞、中でも樹状細胞へ抗原物質、核酸等を効率的に送達するＤＤＳ技術、樹状細胞が積極的に抗原物質を提示できる様な技術等が開発されている（非特許文献１及び２）。
特開２００１－３１６２９８号公報 特開２００３－２８６１８９号公報 特開２００３－２８６１９８号公報 特開２００３－２８６１９９号公報 特開２００４－００２３１３号公報 特開２００４－０８１２１０号公報 特開２００４－２７７３５５号公報 特開２００７－１０６７５２号公報 特開２００７－２０９３０７号公報 特開２００８－０２９２４９号公報 特開２００８－１６２９８１号公報 特開２００９－１２０５３２号公報 特開２００９－１２０５３３号公報 特願２０１１－１６２５９６号公報
Ｓ．Ｔａｆｕｋｕ，Ｔ．Ｍｉｙａｔａ，Ｍ．Ｔａｄａｎｏ，Ｒ．Ｍｉｔｓｕｍａｔａ，Ｈ．Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｔ．Ｈａｒａｋｕｎｉ，Ｔ．Ｓｅｗａｋｉ，Ｔ．Ａｒａｋａｗａ，Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｉｎｄｕｃｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｉｎ　ｍｉｃｅ，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ　Ｉｎｆｅｃｔ．（２０１１）４－１１． Ｈ．Ｗｅｉ，Ｓ．Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｈｏｕ，Ｗ．Ｑｉａｎ，Ｂ．Ｌｉ，Ｈ．Ｇｕｏ，Ｇ．Ｋｏｕ，Ｊ．Ｈｅ，Ｈ．Ｗａｎｇ，Ｙ．　Ｇｕｏ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｔｏ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｖｉａ　ＣＤ１１ｃ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｐｏｔｅｎｔ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｉｎ　ｍｉｃｅ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．１５（２００９）４６１２－４６２１． Ｍａｔｓｕｏ　Ｈ，Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ　Ｎ，Ｉｉｊｉｍａ　Ｍ，Ｎｉｉｍｉ　Ｔ，Ｊｕｎｇ　Ｊ，Ｊｅｏｎｇ　ＳＹ，Ｃｈｏｉ　ＥＫ，Ｓｅｗａｋｉ　Ｔ，Ａｒａｋａｗａ　Ｔ，Ｋｕｒｏｄａ　Ｓ．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２；７：３３４１－５０．
　上述のように、抗原物質、核酸等を樹状細胞へある程度は効率的に送達するＤＤＳ技術、樹状細胞が積極的に抗原物質を提示できる様な技術等が、研究レベルでは開発されてはいるものの、質の良いワクチンとして使用できるレベルには到達しておらず、更なる改良が必要とされている。
　例えば、上述の様な技術を基に作製されるワクチンは、多量の投与が必要であったり、生体に対して悪影響を及ぼしかねない様な免疫賦活化剤（いわゆる、アジュバンド）の同時投与が必要であったりする場合がある。この様なワクチンでは、市場のニーズには十分に応えられるものとは言えず、より質の良いワクチンの開発が求められている。本発明の課題は、上述の様な市場ニーズに十分に応えることのできるワクチンを提供することである。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、樹状細胞の表面タンパク質に対する抗体を有するバイオナノカプセル、又は必要に応じて更にリポソームを含むバイオナノカプセルを個体へ投与したところ、脾臓組織に存在する樹状細胞内に、当該バイオナノカプセルが取り込まれることを見出した。
　また、抗原物質を含有する前記バイオナノカプセルを動物個体へ投与したところ、斯かる抗原物質に対する抗体が個体内で著量産生されることも見出した。
　さらに、マウスを用いた動物実験において、前記バイオナノカプセルを投与したところ、任意の疾患に対して顕著に優れた予防効果を発揮することも見出した。
　本発明は斯かる知見に基づいて完成されたものであり、下記に示す態様の発明を広く包含するものである。
　項１　樹状細胞の表面タンパク質に対する抗体及びウイルス表面抗原タンパク質を含むウイルス様粒子を有するバイオナノカプセル。
　項２　ウイルス様粒子が、抗体結合ドメインを含む上記項１に記載のバイオナノカプセル。
　項３　抗体結合ドメインが、ウイルス表面抗原タンパク質に含まれる上記項２に記載のバイオナノカプセル。
　項４　ウイルス表面抗原タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）Ｌタンパク質である、上記項１～３の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。
　項５　抗体が、ＣＤ１１ｃタンパク質又はそのオルソログを認識する抗体である上記項１～４の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。
　項６　更にリポソームを含む上記項１～５の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。
　項７　リポソームがカチオン性である、上記項１～６の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。
　項８　リポソームがアニオン性である、上記項１～６の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。
　項９　更に、抗原物質及び／又は核酸を含む上記項１～８の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。
　項１０　上記項１～８の何れか１項に記載のバイオナノカプセルを含む、樹状細胞への抗原物質及び／又は核酸導入剤。
　項１１　上記項１～８の何れか１項に記載のバイオナノカプセルと、抗原物質及び／又は核酸を含むワクチン。
　項１２　動物の樹状細胞への抗原物質及び／又は核酸導入方法であって、上記項９に記載のバイオナノカプセルを動物に投与する工程を含む方法。
　項１３　投与が経静脈投与、経皮下投与、又は経筋肉投与である上記項１２に記載の方法。
　本発明のバイオナノカプセルは、動物個体内へ投与することによって、樹状細胞に効率的に到達できるものである。さらに、本発明のバイオナノカプセルは、樹状細胞に到達した後に、樹状細胞内に侵入する作用も発揮する。樹状細胞とは生体における免疫システムにおいて、抗原を提示する細胞として非常に重要な役割を担う細胞であるために、本発明のバイオナノカプセルが抗原物質を含んでいる場合、樹状細胞が斯かる抗原物質を極めて効率的に提示することになり、抗原物質に対して細胞性免疫及び／又は液性免疫に関する免疫システムが惹起される。
　また、樹状細胞等に特定の配列を有する核酸を送達すれば、哺乳動物における免疫システムが感作し易くなることが知られており、更に樹状細胞内に抗原物質となるペプチド等をコードする核酸を導入すれば、斯かる樹状細胞内で抗原物質となるペプチドが発現することによって、斯かる樹状細胞外に抗原物質としてのペプチドを提示しやすくなることになる。
　以上のことから、抗原物質及び／又は核酸を含む本発明のバイオナノカプセルを生体内に投与すれば、斯かる抗原物質に対する抗体を生体内にて著量産生させることができる。そして、この様な抗体の中には、上記抗原物質を中和する機能を持った抗体が含まれることは当然であるために、抗原物質及び／又は核酸を含む本発明のバイオナノカプセルは、ワクチンとして優れた機能を発揮する。
　また、本発明の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセルは、樹状細胞に侵入した後、上述のような抗原物質に対する抗体を産生する液性免疫システムを惹起するのみならず、細胞性免疫システムも惹起する効果を発揮する。従って、抗原物質及び／又は核酸を含む本発明のバイオナノカプセルは優れたワクチンとしての機能を有する。
　そして、抗原物質及び／又は核酸を含む本発明のバイオナノカプセルを動物に投与することによって、任意の疾患に対する予防効果を発揮する。このことからも、抗原物質及び／又は核酸を含む本発明のバイオナノカプセルは、優れたワクチンとしての機能を発揮する。
本発明のバイオナノカプセル（Ａ）及びリポソームが結合したバイオナノカプセルの一態様を説明する模式図。図中の（Ａ）及び（Ｂ）において、ａはバイオナノカプセル、ｂは脂質膜、ｃはウイルス表面抗原タンパク質、ｄは樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体、ｅはリポソームを示している。 本発明のバイオナノカプセルとマウスの脾臓から単離したＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞との親和性を示す結果。なお、図中のＺＺ－ＢＮＣは、抗体が結合していない単なるＺＺ－ＢＮＣと、ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞との親和性を示している。 本発明の実施例３に示す、バイオナノカプセルをマウス個体へ投与した後の、マウス個体における局在を示す図。図中のＢｒｉｇｈｔ　Ｆｉｅｌｄは明視野像を示し、Ｈｔは心臓、Ｌｇは肺、Ｋｄは腎臓、Ｌｖは肝臓、そしてＳｐは脾臓を示す。ＩｎｔｅｎｓｉｔｙはＢＮＣを標識化する際に用いたＣＦ－７５０色素が発する７８０ｎｍの蛍光強度を示す。 本発明のバイオナノカプセルをマウス個体に投与した後に、感作された樹状細胞の頻度を示す図。 本発明のバイオナノカプセルをマウス個体に投与した後の、脾臓組織に存在するＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞の蛍光顕微鏡写真像。図中のＤＩＣは微分干渉像を示し、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅは蛍光像を示す。ＸＺは及びＹＺは三次元再構成画像処理を行った後の像であり、０．２５μｍずつ１５つのスライス画像を再構成処理に供した。 バイオナノカプセルと共にＤ３抗原をマウス個体に投与した後のマウス個体中のＤ３抗原に対する抗体の力価を測定した結果を示す図。 実験例６に示す樹状細胞標的化ＢＮＣの投与経路検討実験における、バイオナノカプセル、ＢＮＣ投与１２時間後の樹状細胞標的化ＢＮＣの動態解析結果を示す図。 実験例６に示す樹状細胞標的化ＢＮＣの投与経路検討実験における、リンパ節内の樹状細胞への移行能を検討した実験結果を示す図。図中（Ａ）はリンパ節内の樹状細胞への各種ＢＮＣの移行を確認した結果であり、（Ｂ）は各種ＢＮＣのリンパ節内の樹状細への移行を継時的に解析した結果である。なお、図中のＤＣ－ＢＮＣとはαーＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ（ＣＦ７５０Ｌａｂｅｌｅｄ）を示し、ＺＺ－ＢＮＣとはそれの抗ＣＤ１１ｃ抗体を有さないＢＮＣである。 本発明のＢＮＣのリンパ節の樹状細胞への取り込まれる様子を観察した顕微鏡像。図中のαーＤＣ－ＢＮＣはαーＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣを示す。 実験例７の樹状細胞標的化ＢＮＣのアジュバント効果の実験結果を示す図。図中のＤＣ標的化ＢＮＣは、αーＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣを示す。 実験例８の樹状細胞標的化ＢＮＣへの抗原搭載法の検討１における、マウスへの投与実験結果を示す。図中のグラフにおいて、縦軸は生存率を示し、横軸は日数を示す。また、（Ｘ／Ｙ）なる表記に関し、Ｘが１６日目まで生存した個体数を示し、Ｙが各投与群の個体数を示す。 実験例１０の樹状細胞標的化ＢＮＣへの抗原搭載法の検討２における、マウスへの投与実験結果を示す。図中のグラフにおいて、縦軸は抗ＪＥＶ　ＩｇＧ抗体の力価（Ｌｏｇ１０）を示す。また、ＡはＺＺ－ＢＮＣ－Ｄ３を経静脈投与（ＩＶ）したもの、ＢはαーＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ－Ｄ３を経静脈投与したもの、ＣはαーＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ－Ｄ３を皮下投与（ＳＣ）したもの、ＤはαーＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ－Ｄ３を筋肉内投与（ＩＭ）したものを示す。 実験例１１の抗原を有する樹状細胞標的化ＢＮＣを用いた感染防御実験結果を示す。図中のグラフにおいて、縦軸は生存率を示し、横軸は日数を示す。また、（Ｘ／Ｙ）なる表記に関し、Ｘが１６日目まで生存した個体数を示し、Ｙが各投与群の個体数を示す。 実験例１２の核酸を抗原として有する樹状細胞標的化ＢＮＣの製造を確認した実験結果を示す。図中のＩｇＧ－ｚｚＢＮＣはα－ＣＤ１１ｃーＺＺ－ＢＮＣを示し、ＩｇＧ－ｚｚＢＮＣ－ＬＰＸはα－ＣＤ１１ｃーＺＺ－ＢＮＣを示し－カチオン性リポソーム－ＤＮＡを示す。 実験例１２の核酸を抗原として有する有する樹状細胞標的化ＢＮＣにおける、インビボイメージング装置を用いた実験結果を示す。図中の（Ａ）は写真像を示し、（Ｂ）は、各臓器の蛍光強度をグラフ化したものである。また、図中のＤＣ標的化ＢＮＣ－ＬＰＸ及びαーＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ－ＬＰＸは、αーＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ－カチオン性リポソーム－ＤＮＡを示す。（Ｂ）のグラフの縦軸は、領域あたりの蛍光強度を示す。 実験例１２の核酸を抗原として有する樹状細胞標的化ＢＮＣにおける、脾臓の樹状細胞への送達実験の結果を示す。図中の（Ａ）はＦＡＣＳによる解析結果を示し、（Ｂ）はその結果を定量してグラフ化したものである。 実験例１２の核酸を抗原として有する樹状細胞標的化ＢＮＣ、をマウス個体に投与した後の、脾臓組織に存在するＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞の蛍光顕微鏡写真像。図中のＤＩＣは微分干渉像を示し、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅは蛍光像を示す。ＸＺは及びＹＺは三次元再構成画像処理を行った後の像であり、０．２５μｍずつ１５つのスライス画像を再構成処理に供したものである。
　以下に本発明について説明する。なお、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学及び分子生物学的技術であれば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ａｎｄ　Ｒｕｓｓｅｌｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ」，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　２００１；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　Ｎ．Ｙ等の文献を参照すればよい。
（本発明のバイオナノカプセル）
　本発明のバイオナノカプセルは、ウイルス表面抗原タンパク質を含むウイルス様粒子を有する。この様なタンパク質は、自己組織化能を有し、カプシド、エンベロープ等を構成する膜タンパク質である。
　図１の（Ａ）の模式図にて示す、本発明に係るバイオナノカプセルの１つの態様を基に、これの構造について適宜説明する。但し、本発明のバイオナノカプセルは、当該図面のみから導き出せされるものに限定はされない。
　本発明のバイオナノカプセルは、ウイルス様粒子（ａ）に樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体（ｃ）が担持されており、ウイルス表面抗原タンパク質（ｃ）は、当該ウイルス様粒子を構成する脂質膜（ｂ）に突き刺さった状態にて存在している。
　ウイルス様粒子は、球状、楕円球状、ラグビーボール状、略球状、フィラメント状等が挙げられる。また、これらの形状において、その内部は液体で満たされていてもよい。
　上記ウイルス表面抗原タンパク質としては、Ｂ型肝炎ウイルス、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ）、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ－１）ＩＩ型単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ－２）ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ－１：ＨＩＶ）、ノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）、パピロマウイルス（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ　ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（ｍｅａｓｌｅｓ　ｖｉｒｕｓ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ　ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ　ｖｉｒｕｓ）等のウイルス表面抗原タンパク質が挙げられる。
　中でも、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルス、ＩＩ型単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等の表面抗原タンパク質は、それ自身の細胞への侵入を担う膜透過ドメインを有しているので好ましい。
　なお、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質としては、Ｌタンパク質、Ｍタンパク質、Ｓタンパク質等が挙げられ、特に限定されるものではないが、Ｌタンパク質とすることが好ましい。
　Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質としては、例えばＬタンパク質のＮ末端のＰｒｅＳ領域及びそれに続く７７アミノ酸残基程度が欠失し、且つＣ末端側の５０アミノ酸程度が欠失したものであってもよい（特許文献１４）。この様なＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質は、大腸菌を用いて簡便に製造できる点で好ましい。
　さらに、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質としては、斯かるタンパク質を主成分とするウイルス様粒子とした際に、粒子表面に露出する２９２番目のグルタミン残基、及び３０８番目のグリシン残基が、アルギニンに置換された変異体としてもよい。この様なＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質は、生体に投与した場合に、それ自身が抗原として認識されにくいという効果を発揮する。
　本発明のバイオナノカプセルに含まれるウイルス表面抗原タンパク質の割合は、バイオナノカプセル当たり、通常は７０重量％～９５重量％程度である。好ましくは、８０重量％～９０重量％程度である。従って、バイオナノカプセルは、ウイルス表面抗原タンパク質を主成分として含むものである。バイオナノカプセルは、ウイルス表面抗原タンパク質の他に、脂質も含有する。その割合は、バイオナノカプセル当たり、通常は５重量％～１０重量％程度である。その他に、バイオナノカプセルには、糖鎖等の成分が含まれる。
　樹状細胞としては、特に限定はされないが、例えば脾臓組織に存在する樹状細胞に限定はされず、皮膚のランゲルハンス細胞であってもよい。具体的には、全身に分布する骨髄系樹状細胞、形質細胞様樹状細胞等；表皮に分布するランゲルハンス細胞；リンパ節、脾臓、胸腺等に分布する指状嵌入細胞；リンパ管内に分布するヴェール細胞；真皮に分布する真皮内樹状細胞；リンパ組織内のリンパ濾胞（胚中心）に分布する胚中心樹状細胞、濾胞樹状細胞等；リンパ管若しくはリンパ洞に分布する抗原担送細胞等が挙げられる。
　樹状細胞の表面タンパク質としては、ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｆｃ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＤ２０５、ＣＤ２０９等が挙げられ、樹状細胞の中でも、抗原提示能力に長けた樹状細胞の表面にて著量発現しているという観点から、ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩ、ＣＤ２０５等が挙げられる。また、本発明の表面タンパク質は、これらのオルソログであってもよい。
　上記抗体の構造は、上述のような樹状細胞の表面タンパク質と結合する部位を含む可変領域さえ有していればよく、それぞれ２つずつの重鎖及び軽鎖からなる免疫グロブリンに限定されるものではない。具体的な抗体の構造としては、Ｆｃ領域を含まないＦ（ａｂ′）２、イムノグロブリンをパパインで消化することによって得られるＣＨ１領域及びＣＬ領域と重鎖可変領域、並びに軽鎖可変領域からなるＦａｂ等；イムノグロブリンの定常領域を含まないＦｖ等；そしてＦｖの単鎖型の抗体であるｓｃＦｖ等の分子構造が挙げられる。
　また、これらの分子構造を組み合わせた多価化構造であってもよい。例えば、Ｆｃ領域と上記のｓｃＦｖ構造の２つとを組み合わせたｓｃＦｖ－Ｆｃ構造や定常領域のＣＨ３ドメインと上記のｓｃＦｖ構造の２つとを組み合わせたｍｉｎｉｂｏｄｙと称される構造等のように、ｓｃＦｖ構造を積み重ねる手法を採用することによって多価化が達成される。多価化とは、樹状細胞の表面タンパク質との結合部位を複数配置することである。
　上述の抗体には、アフィボディ（登録商標）も含まれる。アフィボディとはプロテインＡの特定のドメインを足場にして、３つのへリックスドメインが結束した構造を有するタンパク質分子であり、抗原に対して結合する機能を有する。すなわち、上記抗体がアフィボディであるときには、当該アフィボディが樹状細胞の表面タンパク質を認識する分子であることとなる。
　例えば、上記抗体がイムノグロブリンである場合、サブタイプは特に限定されることは無く、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＭ、ＩｇＥ等のいずれのサブタイプであってもよい。また、サブクラスも特に限定はされない。
　用語、「認識する」とは、樹状細胞の表面タンパク質と抗体が「結合している」ことを意味する。より好ましくは、特異的又は選択的な結合である。この様な「結合している」ことは、樹状細胞の表面タンパク質と抗体との親和性、若しくは表面タンパク質を発現している樹状細胞と抗体との親和性によって判断できる。
　親和性を有していれば、「結合している」と判断でき、親和性がより優れていれば、特異的又は選択的に「結合している」と判断できる。具体的な判断方法は、特に限定されないが、結合定数の測定、フローサイトメトリー解析等の蛍光免疫染色法、ウエスタンブロッティング等といった公知の方法によって判断できる。判断基準は単に親和性の有無に止まっていてもよく、親和性を相対的に比較して判断してもよい。
　上記抗体（ｄ）は、その抗原認識部位が、バイオナノカプセルの外側に露出さえしていればよい。具体的には、例えば、図１に示すように、バイオナノカプセルに含まれるウイルス表面抗原タンパク質（ｃ）に担持されていてもよく、バイオナノカプセルに含まれる脂質膜（ｂ）に担持されていてもよい。
　上記抗体（ｄ）がウイルス表面抗原タンパク質（ｃ）に担持されている場合は、共有結合等といった化学的な結合を介して担持されてもよく、抗体結合ドメインを介して結合することによって担持されていてもよい。これらの中でも、抗体結合ドメインに上記抗体が結合していることが好ましい。特に、本発明のバイオナノカプセルに含まれるウイルス表面抗原タンパク質（ｃ）が抗体結合ドメインを有しており、斯かるドメインを介して上記抗体（ｄ）が結合していることが好ましい。
　また、ウイルス表面抗原タンパク質と上記抗体が担持された状態に対して、さらに架橋剤等を用いた架橋処理が施されていてもよい。具体的な架橋剤は、特に限定はされないが、例えば、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート（ＢＳ３）ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩（ＤＭＰ）、スベリイミド酸ジメチル二塩酸塩（ＤＭＳ）スベリン酸ジサクシンイミジル（ＤＳＳ）等が挙げられる。
　抗体結合ドメインとしては、特に限定はされないが、例えば黄色ブドウ球菌等由来のプロテインＡが有するＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、及びＣドメインを含むＺドメイン、連鎖球菌等由来のプロテインＧが有するＣ１、Ｄ１、Ｃ２、Ｄ２、及びＣ３ドメインを含む抗体結合ドメイン、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍａｇｎｕｓ等由来のプロテインＬが有するＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、及びＢ５ドメインを含む抗体結合ドメイン等が挙げられる。
　なお、プロテインＧが有する抗体結合ドメインのうち、少なくともＣ２ドメインを含むドメインを上述の抗体結合ドメインとすることが好ましく、プロテインＬが有する抗体結合ドメインのうち、少なくともＢ１ドメインを含むドメインを上述の抗体結合ドメインとすることが好ましい。
　これらの種抗体結合ドメインのアミノ酸配列として、例えば、プロテインＡが有するＺドメインであれば配列番号１に示すアミノ酸配列が挙げられる。プロテインＧが有する抗体結合ドメインであれば配列番号２に示すアミノ酸配列が挙げられる。プロテインＬが有する抗体結合ドメインであれば配列番号３に示すアミノ酸配列が挙げられる。
　これらのアミノ酸配列は、抗体結合能を減衰させない範囲に限って、変異導入されたアミノ酸配列であってもよい。具体的な変異導入数は、共に特に限定はされないが、通常は変異前のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する変異体となるような変異導入数とすればよい。
　なお、ここでいう変異導入とは、置換、欠失、挿入等である。具体的な変異導入については、公知の方法を採用することができ、特に限定はされないが、例えば置換であれば保存的な置換技術を採用すればよい。用語「保存的な置換技術」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。
　例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
　なお、用語「同一性」とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列の、互いに対する同一のアミノ酸配列の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列の同一性が高いほど、それらの配列の類似性が高いとも表現できる。アミノ酸配列の同一性又は類似性の程度は、例えば、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を参照すればよい。
　上述の抗体結合ドメインがウイルス表面抗原タンパク質（ｃ）に含まれる場合、本発明のバイオナノカプセルの表面か、あるいはその外側に露出する部位に含まれていることが好ましい。例えば、ウイルス表面抗原タンパク質である場合、そのＮ末端に存在するＰｒｅＳ領域に含まれていることが好ましい。
　なお、上述のように、バイオナノカプセルに含まれるウイルス表面抗原タンパク質がＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質であって、そのＮ末端及びＣ末端が欠失したものである場合には、斯かるタンパク質のＣ末端側に上述の抗体結合ドメインが含まれていることが好ましい（特許文献１４）。
　上述した抗体結合ドメインは、バイオナノカプセル中に複数含まれていてもよい。また、上述した各種抗体結合ドメインは、１種類であってもよく、２種類以上含まれていてもよい。
　上記抗体（ｄ）が脂質膜（ｂ）に担持されている場合も、上述の脂質に担持されている場合と同様に化学的な結合を介して担持されていてもよく、上述の抗体結合ドメインを介して抗体が結合することによって担持されていてもよい。すなわち、本発明のバイオナノカプセルを構成するウイルス様粒子（ａ）には、抗体結合ドメインがウイルス表面抗原タンパク質（ｃ）に含まれず、脂質膜（ｂ）に結合又は突き刺さった状態となっていてもよい。
　本発明のバイオナノカプセルの平均粒子径は、Ｚ－平均粒子径として、樹状細胞に効率的に送達される観点、樹状細胞内に効率的に侵入する観点等から、通常は２０ｎｍ～１５０ｎｍ程度である。好ましくは、通常は４５ｎｍ～５５ｎｍ程度である。
　本発明のバイオナノカプセルの電荷は、ζ電位として、通常は－３０ｍＶ～－１０ｍＶ程度である。脾臓組織に効率的に送達される観点、樹状細胞に効率的に送達される観点、樹状細胞内に効率的に侵入する観点、タンパク質や核酸等を送達する観点、生体内での毒性の観点等から、－１０ｍＶ～－５ｍＶ程度が好ましい。なお、ζ電位は、下記の実施例にて詳述する方法にて測定すればよい。
　本発明のバイオナノカプセルは、樹状細胞に作用させて取り込まれた後に、エンドソームにより長い期間止まることによって液性免疫システムを惹起し易い傾向となる。逆に、サイトゾルに移行して比較的長く止まることによって、細胞性免疫システムを惹起し易い傾向となる。
　これらのバイオナノカプセルの局在は、その電荷を調整することによって適宜選択することが可能となる。従って、本発明のバイオナノカプセルが、リポソームを更に含む場合は、それを含めた全体の電荷を調整することで、惹起させたい免疫システムを適宜選択することも可能である。
　また、これらのバイオナノカプセルの局在は、その電荷および脂質の種類（エンドソーム膜を不安定化する逆ヘキサゴナル相（ヘキサゴナルＩＩ相ともいう。））を形成させやすい脂質、および、プロトンスポンジ効果を誘導しエンドソームを破壊する脂質を調整することによって適宜選択することが可能となる。従って、本発明のバイオナノカプセルの電荷と脂質の種類を調整すれば、惹起させたい免疫システムを適宜選択することも可能である。
　上述のように、本発明のバイオナノカプセルは一般的に負電荷を有する傾向であるために、後述するような本発明のバイオナノカプセルにリポソームが結合した態様とし、当該リポソームの電荷を調節することで、容易に本発明のバイオナノカプセル全体としての電荷を適宜設定することができる。そして、後述する様に、リポソームの電荷は、一般的に、その脂質組成の配合割合を調節することによって容易に設定することができる。なお、本発明のバイオナノカプセルの表面電荷の設定は、斯かるリポソームの電荷を設定することに限定されるものではない。
［製造方法］
　本発明のバイオナノカプセルの製造方法は、特許文献９に記載されるような、公知の方法を採用すればよい。具体的には、上記ウイルス様粒子を構成するウイルス表面抗原タンパク質をコードする核酸を宿主細胞に導入し、斯かる細胞を培養してウイルス表面抗原タンパク質を発現させ、培養後の細胞からウイルス様粒子を回収する方法が挙げられる。
　宿主細胞とは、原核細胞であっても真核細胞であってもよいが、核酸の導入、培養、遺伝子の発現量等といった観点から、酵母細胞が好ましい。なお、上述のように、ウイルス様粒子を構成するウイルス表面抗原タンパク質がＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質であって、そのＮ末端及びＣ末端が欠失したものである場合には、大腸菌を宿主細胞として用いることが好ましい。
　回収したウイルス様粒子は、超遠心分離法、アフィニティゲル、サイズ排除ゲル等を用いたカラムクロマトグラフィー法等に供して精製すればよい。
　このようにして得られたウイルス様粒子と、上述の抗体とを混合して、本発明のバイオナノカプセルとすればよい。混合の条件等は特に限定はされず、公知の方法を適宜選択すればよい。
　なお、後述する様に、本発明のバイオナノカプセルが、更に抗原物質及び／又は核酸を含む場合の製造方法として、予めバイオナノカプセルと抗原物質及び／又は核酸を結合させる態様が存在する。このようなバイオナノカプセルを作製する場合は、上述のようにして製造したバイオナノカプセルに対して、エレクトロポーレーション法等といった公知の方法を採用すればよい。
　本発明のバイオナノカプセルは、上述のバイオナノカプセルに対してさらにリポソームが結合していてもよい。この様な態様のバイオナノカプセル（以後、リポソーム結合バイオナノカプセルと呼ぶことがある。）の構造について、図１（Ｂ）の模式図にて示すリポソーム結合バイオナノカプセルの一つの態様を基に適宜説明する。但し、このようなリポソーム結合バイオナノカプセルは、当該図面のみから導き出されるものに限定はされない。
　上述のリポソーム結合バイオナノカプセルは、バイオナノカプセル（ａ）とリポソーム（ｅ）とが結合しており、一体不可分の構造である。より具体的には、例えば特許文献８に示されているように、バイオナノカプセルは脂質膜（ｂ）を有しており、リポソーム（ｅ）とバイオナノカプセル（ａ）は、それぞれの脂質膜を介して膜融合している。また、リポソーム（ｅ）とバイオナノカプセル（ａ）は、どちらか一方に内包される必要は無く、単に一方がもう片方に突き刺さった状態となっていてもよい。
　上述のリポソーム結合バイオナノカプセルは、通常バイオナノカプセル１質量部に対してリポソームが通常２～１２質量部程度であり、より好ましくは６～１０質量部程度である。
　上述のリポソーム結合バイオナノカプセルの平均粒子径は、Ｚ－平均粒子径として、樹状細胞に効率的に送達される観点、樹状細胞内に効率的に侵入する観点等から、通常は１００ｎｍ～６００ｎｍ程度である。
　上述のリポソーム結合バイオナノカプセルの電荷は、ζ電位として、通常は－３０ｍＶ～２０ｍＶ程度である。脾臓組織に効率的に送達される観点、樹状細胞に効率的に送達される観点、樹状細胞内に効率的に侵入する観点、タンパク質や核酸等を送達する観点、生体内での毒性の観点等から、－２０ｍＶ～０ｍＶ程度が好ましい。なお、ζ電位は、下記の実施例にて詳述する方法にて測定すればよい。
　上述のリポソーム結合バイオナノカプセルも、上述のバイオナノカプセルと同様に、樹状細胞に作用させて取り込まれた後に、エンドソームにより長い期間止まることによって液性免疫システムを惹起し易い傾向となる。逆に、サイトゾルに移行して比較的長く止まることによって、細胞性免疫システムを惹起し易い傾向となる。
　これらのリポソーム結合バイオナノカプセルの局在もまた、上述のバイオナノカプセルと同様に、その電荷を調整することによって適宜選択することが可能となる。従って、本発明のリポソーム結合バイオナノカプセルの電荷を調整すれば、惹起させたい免疫システムを適宜選択することも可能である。
　これらのリポソーム結合バイオナノカプセルの局在は、その電荷および脂質の種類（エンドソーム膜を不安定化する逆ヘキサゴナル相（ヘキサゴナルＩＩ相）を形成させやすい脂質、および、プロトンスポンジ効果を誘導しエンドソームを破壊する脂質）を調整することによって適宜選択することが可能となる。従って、上述のリポソーム結合バイオナノカプセルの電荷と、リポソームを構成する脂質の種類を調整すれば、惹起させたい免疫システムを適宜選択することも可能である。
（リポソーム）
　上述のリポソーム結合バイオナノカプセルにおけるリポソームは、シングルラメラ構造（一枚膜）であってもマルチラメラ構造（多重膜）であってもよい。アニオン性リポソームであっても、カチオン性リポソームであってもよい。具体的なリポソームの電荷は、ζ電位として、通常－６０ｍＶ～６０ｍＶ程度である。
　この様なリポソームの平均粒子径は、Ｚ－平均粒子径として、通常は１００ｎｍ～４００ｎｍ程度である。バイオナノカプセルと複合化し、その後、生体に投与することを考慮するとの観点から、１００ｎｍ～３００ｎｍ程度が好ましく、更に好ましくは１００ｎｍ～２００ｎｍ程度である。
　なお、上記リポソームのζ電位及びＺ－平均粒子径の測定は、下記の実施例にて示す方法を採用すればよい。
［製造方法］
　上記リポソームの製造方法は、特に限定されることは無く、上述の様に組成として例示した脂質を、適当な組成比で混合した後、公知の方法によって作製すればよい。例えば、例えば、バンガム法、超音波法、逆相蒸発法、多価アルコール法、加温法、噴霧乾燥法、メカノケミカル法、凍結融解法、フィルムローディング法、超臨界二酸化炭素法等が挙げられる。
　なお、後述する様に、本発明のバイオナノカプセルが更にリポソーム及び抗原物質及び／又は核酸を含む場合の製造方法として、予め上記リポソームと抗原物質及び／又は核酸を結合させる態様が存在する。このようなリポソームを作成する場合は、リポソームを構成する脂質を混合する際と同時に、抗原物質及び／又は核酸を混合しておけばよい。抗原物質及び／又は核酸の混合量は、特に限定されることは無く、所望の量を適宜設定して混合すればよい。
　作製したリポソームは、例えば適当なサイズの孔径を有するフィルターと共にエクストルーダーを用いて、平均粒子径に調整することができる。
［リポソーム結合バイオナノカプセルの製造方法］
　上述のリポソーム結合バイオナノカプセルは、上述のバイオナノカプセルと上述のリポソームを混合することによって作製すればよい。
　また、上述のバイオナノカプセルの製造方法において作成するウイルス様粒子と上述のリポソームとを結合させ、これによって得られたリポソーム結合バイオナノカプセルと上述の樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体を結合させてもよい。
　バイオナノカプセルとリポソームの結合条件等は、後述の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセルとリポソームの結合の条件等を適宜採用すればよく、上記リポソーム結合バイオナノカプセルと上述の樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体の結合の条件等は、上述のバイオナノカプセルの製造方法にて説明したウイルス様粒子と上述の樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体との結合の条件等を適宜採用すればよい。
　上述のバイオナノカプセルと上述のリポソームの混合条件は、特に限定されることは無く、通常は２０℃～６０℃程度の環境下で、３０分間～１２０分間インキュベートすればよい。
　また、インキュベート後は、場合に応じて作製したリポソーム結合バイオナノカプセルを精製すればよい。具体的な精製方法は公知の方法を採用すればよく、特に限定はされないが、例えば、超遠心分離法、アフィニティゲル、サイズ排除ゲル等を用いたカラムクロマトグラフィー法等が挙げられる。
　上述のリポソーム結合バイオナノカプセルと上述の樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体を結合させる方法は、特に限定されることは無く、樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体と、上述のバイオナノカプセル又は本発明のリポソーム結合バイオナノカプセルとを混合した後に、通常は２０℃～室温程度の環境下で、３０分間～１２０分間インキュベートすればよい。
　また、インキュベート後は、場合に応じて作製した樹状細胞を認識する抗体を担持するバイオナノカプセルを精製すればよい。具体的な精製方法は、上述した本発明のバイオナノカプセルの精製と同様に公知の方法を採用すればよい。なお、リポソームが結合しないバイオナノカプセルに対する抗体の結合方法も、これと同様にすればよい。
本発明の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセル
　本発明の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセルは、上述の本発明のバイオナノカプセルに、更に、抗原物質及び／又は核酸を含むものである。具体的には、上述の本発明のバイオナノカプセルにおけるウイルス様粒子（ａ）に含まれていればよい。
　また、バイオナノカプセルが上述のようなリポソーム結合バイオナノカプセルである場合は、上記ウイルス様粒子（ａ）に含まれていてもよく、上記リポソーム（ｅ）に含まれていてもよい。
　なお、「ウイルス様粒子（ａ）に含まれる」とは、抗原物質及び／又は核酸が、内包されていてもよく、脂質膜（ｂ）に突き刺さった状態であってもよい。同様に、「リポソーム（ｅ）に含まれる」も、抗原物質及び／又は核酸が内包されていてもよく、リポソームに突き刺さった状態であってもよい。
　抗原物質は、特に限定はされないが、本発明のバイオナノカプセルは、生体内に投与することによって、樹状細胞へ積極的に送達され、樹状細胞内に取り込まれることから、ワクチンとして優れた機能を発揮する。従って、抗原物質とは、感染症等の原因となる細菌、ウイルス等の表面タンパク質、糖鎖、脂質等、若しくはそれらの一部であればよい。
　核酸とは、特に限定はされず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸等が挙げられる。このような核酸の塩基配列とは、上述した抗原物質をコードする塩基配列が好ましい。また、ＣｐＧモチーフ、ＰＡＴＲＥ配列、Ｃ３ｄ配列等を有する塩基配列であってもよい。ＣｐＧモチーフ等は免疫システムを惹起するアジュバンドとしての機能を発揮するので、上述した抗原物質、抗原物質をコードする塩基配列を有する核酸とともに用いることが有効である。
　抗原物質及び／又は核酸を含む本発明のバイオナノカプセルは、個体内へ投与することによって、樹状細胞に効率的に到達できるものである。さらに、樹状細胞に到達した後に、樹状細胞内に侵入する作用も発揮する。樹状細胞とは生体における免疫システムにおいて、抗原を提示する細胞として非常に重要な役割を担う細胞であるために、本発明のバイオナノカプセルが抗原物質を含んでいる場合、樹状細胞が斯かる抗原物質を極めて効率的に提示することになり、抗原物質に対して細胞性免疫及び／又は液性免疫に関する免疫システムが惹起される。
　また、樹状細胞等に核酸を送達すれば、哺乳動物における免疫システムが感作し易くなることが知られており、更に樹状細胞内に抗原物質となるペプチド等をコードする核酸を導入すれば、斯かる樹状細胞内で抗原物質となるペプチドが発現することによって、斯かる樹状細胞外に抗原物質としてのペプチドを提示し易くなることになる。
　抗原物質及び／又は核酸を含む本発明のバイオナノカプセルを生体内に投与すれば、斯かる抗原物質に対する抗体を生体内にて著量産生させることができる。そして、この様な抗体の中には、上記抗原物質を中和する機能を持った抗体が含まれることは当然であるために、本発明の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセルは、ワクチンとして優れた機能を発揮する。
　また、本発明の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセルは、樹状細胞に侵入した後、上述のような抗原物質に対する抗体を産生する液性免疫システムを惹起するのみならず、細胞性免疫システムも惹起する効果を発揮する。従って、優れたワクチンとしての機能を有する。
　本発明の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセルの投与対象は、特に限定はされず、ワクチンとしての機能を所望する動物であれば、特に限定されることはないが、例えば、ウシ、ブタ、ニワトリ、ウマ、ヒツジ、ヒト、ヤギ、チンパンジー、ゴリラ等が挙げられる。
　具体的な投与量も特に限定はされないが、例えば抗原物質を含むバイオナノカプセルを投与する場合は、抗原物質の量に換算して、通常は２ｍｇ～５０ｍｇ／ｋｇ程度を投与すればよい。核酸を含むバイオナノカプセルを投与する場合は、核酸の量に換算して、通常１ｍｇ～２０ｍｇ／ｋｇ程度を投与すればよい。抗原物質及び核酸を含むバイオナノカプセルを投与する場合は、抗原物質と核酸の総量に換算して、通常３ｍｇ～７０ｍｇ／ｋｇ程度を投与すればよい。
本発明の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセルの製造方法
　本発明の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセルの製造方法は、特に限定されることは無く、上述の抗原物質及び／または核酸と、上述のバイオナノカプセル、又はリポソーム結合バイオナノカプセルとを混合した後に、通常は２０℃～室温程度の環境下で、３０分間～１２０分間インキュベートすればよい。
　抗原物質及び／又は核酸が、直接上述のバイオナノカプセルに含まれる場合、これらを例えば公知の架橋剤などを用いて化学的に結合してもよい。また、リポソーム融合法を用いてバイオナノカプセル内に導入又は結合してもよい。そして、エレクトロポ―レーション法等の公知の物理的手段を用いてバイオナノカプセル内に導入又は結合してもよい。
　なお、本発明のバイオナノカプセルがリポソームを有している場合、リポソームに抗原物質及び／又は核酸が結合していてもよい。具体的には、上述の本発明のバイオナノカプセルの製造時において、予め上記バイオナノカプセルと上記リポソームの結合前に、抗原物質及び／又は核酸と該バイオナノカプセル又は該リポソームと混合して結合させてもよく、バイオナノカプセルとリポソームを結合させた後にさらに混合して結合させてもよい。具体的な方法は、上記（バイオナノカプセル）及び（リポソーム）の［製造方法］にて詳述したとおりである。
　また、インキュベート後は、場合に応じて得られたものを精製すればよい。具体的な精製方法は、上述した本発明のバイオナノカプセル又はリポソーム結合バイオナノカプセルの精製と同様に公知の方法を採用すればよい。
本発明の抗原物質及び／又は核酸導入方法
　上述のように本発明のバイオナノカプセルが、更に抗原物質及び／又は核酸を含む場合、これを動物に投与することによって斯かる抗原物質及び／又は核酸を動物の樹状細胞に導入することができる。
　すなわち、本発明の抗原物質及び／又は核酸を動物の樹状細胞へ導入方法は、、ウイルス抗原タンパク質を含むウイルス用粒子であるバイオナノカプセルを動物に投与する工程を含み、当該バイオナノカプセルが樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体を担持し、且つ抗原物質及び／又は核酸を含むことを特徴とする導入方法である。
　投与対象の動物、投与量、投与方法等については、上記本発明の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセルにて詳述した通りとすればよい。
抗原物質及び／又は核酸導入剤
　上述の様に、本発明のバイオナノカプセルは、抗原物質及び／又は核酸と共に樹状細胞内に侵入する作用を発揮することから、樹状細胞への抗原及び／又は核酸導入剤として有用である。
　本発明の抗原物質及び／又は核酸導入剤は、上述した本発明のバイオナノカプセルを含むものである。抗原物質及び／又は核酸導入剤中の本発明のバイオナノカプセルの配合量は、特に限定はされないが、斯かる導入剤当たり、通常は、０．００１％～９９．９％程度とすればよい。また、上述した本発明のバイオナノカプセルそのものを本発明の抗原物質及び／又は核酸導入剤としてもよい。
　以下に本発明をさらに詳細に説明する。但し、本発明が以下に示す実施例に限定されないのは言うまでも無い。
＜実験例１：バイオナノカプセルの作製＞
　本実施例にて使用するバイオナノカプセル（以後ＢＮＣと称することがある。）を以下に示す方法にて作製した。具体的には、非特許文献５に記載の方法を用い、ＺＺドメインを有するＢ型肝炎ウイルス表面抗原Ｌタンパク質（以下、ＨＢｓＡｇ　Ｌタンパク質と称することがある。）を発現させるベクターを用いて酵母細胞を形質転換した後に、斯かる酵母細胞を培養し、ＺＺドメインを有するＨＢｓＡｇ　Ｌタンパク質を主成分とするバイオナノカプセル（以下、ＺＺ―ＢＮＣとする。）を酵母細胞内から単離及び精製を行った。なお、比較実験用に、ＺＺドメインを有さない、ＨＢｓＡｇ　Ｌタンパク質を主成分とするバイオナノカプセル（以下、ＳＴ－ＢＮＣとする。）を、同様の方法にて単離及び精製を行った。得られたＺＺ－ＢＮＣ及びＳＴ－ＢＮＣの濃度は、各種ＢＮＣの主成分となるタンパク質量に換算して測定した。
　具体的な測定方法は、市販のタンパク質量測定キットである、ＢＣＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社（ＩＬ，ＵＳＡ））を用いて測定した（以下の実験でも同様。）。
　また、得られたＺＺ－ＢＮＣ及びＳＴ－ＢＮＣには、場合に応じて、それ自身の検出のために、Ｆｌｕｏｒｏｌｉｎｋ　Ｃｙ５色素（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社　ＣＡ，ＵＳＡ）又はＣＦ７５０色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ社　ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて標識化処理を行った。斯かる処理はそれぞれの製品に添付されたプロトコルに従って行った。
　次いで、得られたＺＺ－ＢＮＣ、及びＳＴ－ＢＮＣに対して、樹状細胞の表面タンパク質を認識する各種抗体を結合させた。ここで使用した抗体は、以下の表１に示す抗原、種、クローン、及び製造業者のものである。また、対照実験用に下記の表１に示す抗体以外に、マウスＩｇＧｓ（Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ　ｒｅｇｅｎｔ　ｇｒａｄｅ：シグマアルドリッチ）も、上記ＺＺ－ＢＮＣ及び、ＺＺドメインを有さないＳＴ－ＢＮＣに結合させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記それぞれの抗体１μｇとＺＺ－ＢＮＣ（これが含有するタンパク質量に換算して５μｇ）を、５０μＭの架橋剤であるＢＳ３（Ｐｉｅｒｃｅ社）の存在下にて混合して、両者を結合させ、さらに架橋を行った。なお、余剰のＢＳ３は、グリシンを用いて不活化処理（マスキング処理）を施した。
　得られた各種抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣの物理的性質について、以下の表２に示す。なお、表中のＺ－Ａｖｅｒａｇｅ（ｎｍ）はＺ－平均粒子径を示し、ζ－Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ（ｍＶ）はζ電位を示す。Ｚ－平均粒子径及びζ電位の測定は、共に動的光散乱光度計であるＺｅｔａｓｉｚｅｒ（ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用い、２５℃の水系溶媒中にて、常法に従って行った（以下の実験でも同様。）。ＰＤＩは、Ｚ－平均粒子径の多分散指数を示す。
　そして、Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ（ｍｏｌ）は、ＺＺ－ＢＮＣへの各種抗体の結合量を示し、ＺＺ－ＢＮＣの主成分であるＺＺドメインを含むＨＢｓＡｇ　Ｌタンパク質１モル当たりの量にて算出した。具体的な各種抗体のＺＺ－ＢＮＣへの結合量の測定は、水晶発振子マイクロバランス法に基づいた、アズワン社（Ｏｓａｋａ，ＪＡＰＡＮ）のＴｗｉｎ－Ｑ装置を用い、２５℃の条件下にて、常法に従って行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、各種抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣは、ＺＺドメインを有さない、従来のＳＴ－ＢＮＣと同様のＺ－平均粒子径（１００ｎｍ以下）及びζ電位（陰性荷電）であることが明らかとなった。また、ＺＺ－ＢＮＣに対しては、アルメニアンハムスター由来のＩｇＧをアイソタイプとする抗ＣＤ１１ｃ抗体が、ＺＺドメインに対して高い親和性を示すことが知られている、マウス由来のＩｇＧｓと同じ程度の効率で結合することが明らかとなった。
＜実験例２：ＢＮＣの樹状細胞への親和性＞
　上述の各種抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣの樹状細胞への親和性を、フローサイトメトリーシステム（ＢＤ　ＦＡＣＳＣａｎ　Ｃａｎｔｏ　ＩＩ；ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社：ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて解析した。
　樹状細胞は、Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌：６～８週齢；日本ＳＬＣ社：ＪＡＰＡＮ）の脾臓より、常法に従って単離した。樹状細胞の中でも、ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞を、ＭＡＣＳ（登録商標）テクノロジー（ミルテニーバイオテク株式会社）に基いて更に精製した。
　得られたＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞と、上記の抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣ（ＺＺ－ＢＮＣは、ｃｙ５色素によって標識化されている。）を４℃で３０分間インキュベートを行った後、Ｃｙ５の放出する波長を基に、ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞に親和性を有する、各種抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣの量を、Ｃｙ５色素の放出波長である６７０ｎｍを基に測定した。その結果を図２にて示す。
　抗ＣＤ１１ｃ抗体及び抗ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩが結合したＺＺ－ＢＮＣが、マウス脾臓由来のＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞に対して特に高い親和性を示すことが明らかとなった。
　また、抗体が結合していないＺＺ－ＢＮＣや、Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧｓが結合したＺＺ－ＢＮＣといった、樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体を有さないＺＺ－ＢＮＣであっても、上述の抗ＣＤ１１ｃ抗体や、抗ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩ抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣには劣るものの、脾臓由来のＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞への親和性が認められた。
　これは、本実施例にて用いたＺＺ－ＢＮＣの主成分であるＺＺドメインを有するＨＢｓＡｇ　Ｌタンパク質が高マンノース糖鎖を有していることと、樹状細胞がマンノースレセプターを有しており、この二者が樹状細胞への結合に関与するからであると考えられる。
従って、本実施例におけるＢＮＣ及びそれを含むＺＺ－ＢＮＣ並びに樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣは、樹状細胞への結合に特に有効に用いられる。
＜実験例３：ＢＮＣの生体への投与＞
　上述の方法にて作製した樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣのうち、抗ＣＤ１１ｃ抗体及び抗ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩ抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣをマウス個体（雌：６～８週齢；日本ＳＬＣ社：ＪＡＰＡＮ）に投与し、その後のＺＺ－ＢＮＣのマウス個体内での局在を観察する実験を、生体観察システム（ＯＶ－１００；オリンパス：日本）を用いて行った。比較実験として、Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧｓが結合したＺＺ－ＢＮＣと、抗体が結合していない単なるＺＺ－ＢＮＣ、及びＺＺドメインを有さないＳＴ－ＢＮＣも投与した。なお、それぞれのＢＮＣは予めＣＦ－７５０色素にて標識化されているものを使用した。
　各種ＢＮＣを、それぞれの主成分となるタンパク質量に換算して１０μｇずつマウス個体に尾静脈注射によって投与し、投与後４０分でマウス個体に安楽死の処置を行った後、斯かるマウス個体から心臓、肺、腎臓、肝臓及び脾臓を摘出した。摘出したそれぞれの臓器を、ＣＦ－７５０色素の放出波長である７８０ｎｍを基に、上述の生体観察システムにて検出し、マウス個体への投与後の各種ＢＮＣの、斯かるマウス個体内での局在を観察した結果を図３に示す。
　マウス個体に投与した全てのＢＮＣは、肝臓に局在することが明らかとなった。そして、各種ＢＮＣの中でも、脾臓から摘出したＣＤ１１陽性樹状細胞に対して高い親和性を示した、抗ＣＤ１１ｃ抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣ及び抗ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩ抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣは、肝臓のみならず脾臓においても局在していることが明らかとなった。以上のことから、樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣをマウス個体に投与すれば、脾臓組織にも送達されることが明らかとなった。このことは、本実施例における樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣが脾臓細胞へのＤＤＳとして優れた効果を発揮することを示している。
　次いで、Ｃｙ５色素で標識された各種ＢＮＣを、上述の実験と同様の方法でマウス個体に投与し、投与後４０分でマウス個体に安楽死の処置を行った後、斯かるマウスの脾臓から、常法に従って脾臓細胞を単離した。斯かる細胞とＦＩＴＣ標識化抗ＣＤ１１ｃ抗体を混合し、インキュベートした後、フローサイトメトリーシステムを用いてＣＤ１１陽性樹状細胞に結合する各種ＢＮＣの量をＦＩＴＣ（５２０ｎｍ）とＣｙ５色素の放出波長を基に解析した。結果を図４に示す。
　マウス個体に投与した各種ＢＮＣのうち、抗ＣＤ１１ｃ抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣ及び抗ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩ抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣが脾臓組織中のＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞に対して高い親和性を示すことが明らかとなった。中でも、抗ＣＤ１１ｃ抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣが、ＣＤ１１陽性樹状細胞の６２％に集積するといった、より高い親和性を示すことも明らかとなった。
　非特許文献２に示すように、抗ＣＤ１１ｃのＦ（ａｂ´）２が結合した抗原を皮下に投与したところ、４時間後では１．５％の樹状細胞にしか斯かる抗原が到達せず、１２時間後に８１．４％の樹状細胞に到達することが開示されている。
　一方で、本実施例における樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体を担持するＺＺ－ＢＮＣは、投与後４時間で６２％もの樹状細胞に斯かるＺＺ－ＢＮＣが集積することが明らかである。これは、ＺＺ－ＢＮＣに結合する樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体が、ＺＺ－ＢＮＣ表面に整列化されて担持されることによって、抗原抗体反応がより起こり易くなるために、樹状細胞の表面タンパク質を認識する効果が増大するためであると考えられる。
　更に、インキュベートした後の細胞から、抗ＣＤ１１ｃ抗体を用いてＣＤ１１陽性樹状細胞を精製し、精製後の細胞集団を共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ－１０００；オリンパス社：Ｊａｎａｎ）にて観察した。結果を図５に示す。
　図中、ＣＤ１１ｃを緑色、抗ＣＤ１１ｃ抗体が結合したＢＮＣを赤色にて表示する。抗ＣＤ１１ｃ抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣは、ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞の内部に存在していることが明らかである。このことから、本実施例における樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣをマウス個体に投与すれば、脾臓組織におけるＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞に到達し、更に斯かる樹状細胞内にＺＺ－ＢＮＣが取り込まれることが明らかとなった。
　これは、本実施例における樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣが、膜融合ドメインに止まらず、膜透過ドメインを有しており、樹状細胞内に侵入する機能を有しているからであると考えられる。また、上記ＺＺ－ＢＮＣが樹状細胞表面に存在するＣＤ１１ｃに結合し、その後、斯かるＣＤ１１ｃによる貧食作用に基づいて、当該ＺＺ－ＢＮＣが樹状細胞内に取り込まれたものと考えられる。
　従って、本実施例における樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣは、ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞内への物質の導入に好適に用いることができる。また、斯かる樹状細胞は、ヒトをはじめとした種々の哺乳動物における免疫システムにおいて、抗原提示機能を発揮する重要な細胞であることから、本実施例における樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体が結合したＺＺ－ＢＮＣを抗原物質や核酸と共に用いることによって、斯かる抗原に対するワクチンとしての機能が発揮されることも期待される。
＜リポソームの作製＞
　リポソームの作製は、常法に従って行った。具体的には、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ジエチルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｏ，Ｏ’－ジテトラデカノル－Ｎ－（α－トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノール塩酸（ＤＣ－６－１４）をそれぞれモル比で３：３：４となる組成で混合して作製した。得られたリポソームは、カチオン性リポソームであることが確認された。得られたリポソームのζ電位は５６．５ｍＶであり、Ｚ－平均粒子径は１２１ｎｍであった。
＜実験例４：リポソームが結合したＢＮＣの作製＞
　ＺＺドメインを有するＨＢｓＡｇ　Ｌタンパク質量を１００μｇ含むＺＺ－ＢＮＣと、６００μｇの上述のカチオン性リポソームをｐＨ４のブリトン－ロビンソン緩衝液中で混合し、３７℃で３０分間インキュベートしてリポソームが結合したバイオナノカプセルを作製した。ここで得られたリポソーム結合ＢＮＣを、０～４０％塩化セシウム密度勾配遠心法に供して精製を行った。精製後のリポソームが結合したバイオナノカプセル（以後、ＺＺ－ＢＮＣ－ＬＰとする。）はＰＢＳにて透析を行った。
　得られたＺＺ－ＢＮＣ－ＬＰは、ＺＺ－ＢＮＣの主成分であるＺＺドメインを有するＨＢｓＡｇ　Ｌタンパク質を１９．５μｇ、カチオン性リポソームを６５．６μｇ含み、Ｚ－平均粒子径が４５５ｎｍ（ＰＤＩ；０．３３１）、ζ電位が－５．７６ｍＶであった。
　なお、リポソームの含有量の測定は、市販の脂質測定キットであるコレステロールＥ－テスト（和光純薬：Ｊａｐａｎ）を用いて行った。
　更に、上述のＺＺ－ＢＮＣ－ＬＰに対し、抗原物質として日本脳炎ウイルスのＤ３抗原を結合させた。Ｄ３抗原は、日本脳炎ウイルスのエンベロープタンパク質のドメインの１つであり、非特許文献１に記載のように、大腸菌による発現系を用いて作製した。
　１２０μｇのＺＺ－ＨＢｓＡｇ　Ｌタンパク質及び４０４μｇのカチオン性リポソームを含む上記のＺＺ－ＢＮＣ－ＬＰと、６０μｇの上記Ｄ３抗原を混合し、室温にて１時間インキュベートした（この工程にて得られたものを、以後ＺＺ－ＢＮＣ－ＬＰ－Ｄ３とする。）。その後、２４μｇの上記抗ＣＤ１１ｃ抗体を加え、ＺＺ－ＢＮＣ－ＬＰ中のＺＺ－ＢＮＣに結合させた。最終的に得られたものを以後、α－ＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ－ＬＰ－Ｄ３とする。
＜実験例５：マウス個体への抗原を含むリポソームが結合したＢＮＣの投与＞
　Ｄ３抗原の量に換算して２０μｇのα－ＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ－ＬＰ－Ｄ３及びＺＺ－ＢＮＣ－ＬＰ－Ｄ３を、マウス個体（雌：６～８週齢；日本ＳＬＣ社：ＪＡＰＡＮ）、尾静脈投与法によって投与した。また、同量のＤ３抗原を含むカチオン性リポソームとＤ３抗原の複合体（以下、ＬＰ－Ｄ３とする。）、及び同量のＤ３抗原のみも比較実験として投与した。投与したサンプルの各種物性について、表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　上記各種サンプルの投与から４週間後に、それぞれ同量の追加免疫を行った。初回の投与から４週後及び６週後に血液を回収し、Ｄ３抗原に対する抗体の力価の測定を行った。
　抗体の力価の測定は、一般的に知られる間接ＥＬＩＳＡ法を用いて行った。具体的には、上記方法によって得られたＤ３抗原をマイクロプレートに固相化し、検出にはＨＲＰ標識化抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。結果を図６に示す。
　Ｄ３抗原のみを用いてマウス個体に免疫付与した場合であっても、ＬＰ－Ｄ３を用いてマウス個体に免疫付与した場合であっても、マウス個体中において、初回免疫付与から４週間経っても、６週間経っても、抗Ｄ３抗体が殆ど産生されなかった。
　一方で、Ｄ３抗原量に換算して同量のα－ＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ－ＬＰ－Ｄ３を用いてマウス個体を免疫付与した場合、初回免疫から４週間後にＤ３に対する抗体がマウス個体中にて産生されることが明らかとなり、６週間後にはマウス個体中にて産生される、Ｄ３抗原に対する抗体量が、劇的に増加していることが明らかとなった。
　なお、抗ＣＤ１１ｃ抗体を有さないＺＺ－ＢＮＣ－ＬＰ－Ｄ３を上述の通りＤ３抗原量に換算した等量を用いてマウス個体を免疫付与した場合、初回免疫から６週後にＤ３に対する抗体が、マウス固体中にて産生されていたものの、その産生量は、抗ＣＤ１１ｃに対する抗体を有するα－ＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ－ＬＰ－Ｄ３による免疫付与から４週後における産生量と同程度であり、Ｄ３抗原に対する抗体産生量としては、α－ＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ－ＬＰ－Ｄ３と比べて大いに劣るものであった。
＜実験例６：樹状細胞標的化ＢＮＣの投与経路検討実験＞
非特許文献３に記載の方法で、蛍光色素ＣＦ７５０標識抗ＣＤ１１ｃ抗体提示ＺＺ－ＢＮＣ（以後、αーＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ（ＣＦ７５０Ｌａｂｅｌｅｄ）とする。）を用意し、これのタンパク質量１０μｇ相当を、マウスＢａｌｂ／ｃの尾根部（皮下注射：ＳＣ）または大腿部（筋肉内注射：ＩＭ）に投与し、１２時間後に屠殺し、腋窩リンパ節、鼠径リンパ節、膝窩リンパ節を直視できるように開腹した後、オリンパス社製Ｉｎ　Ｖｉｖｏイメージング装置で蛍光観察を行った。
　結果を図７に示す。ＳＣ投与分は鼠径リンパ節に、ＩＭ投与分は鼠径リンパ節及び膝窩リンパ節に蛍光が観察された。このことは、αーＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ（ＣＦ７５０Ｌａｂｅｌｅｄ）が、従来のＩＶではなく、ＳＣ及びＩＭというワクチンとして通常の投与経路でも所属リンパ節に感染できる可能性を示している。
　ついで、上記のαーＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ（ＣＦ７５０Ｌａｂｅｌｅｄ）をＳＣ投与したマウスから鼠径リンパ節、上記αーＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ（ＣＦ７５０Ｌａｂｅｌｅｄ）をＩＭ投与したマウスから膝窩リンパ節を摘出し、非特許文献３に記載の方法でＣＤ１１ｃ陽性細胞を単離し、ＦＡＣＳを用いて、リンパ節内の樹状細胞へのＺＺ－ＢＮＣの移行度合いを検討した。
　結果を図８に示す、所属リンパ節内樹状細胞の１２．５％～１５．６％にＺＺ－ＢＮＣが移行することが判明した。なお、陰性対照の蛍光色素ＣＦ７５０標識ＺＺ－ＢＮＣ（αーＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ（ＣＦ７５０Ｌａｂｅｌｅｄ）の抗ＣＤ１１ｃ抗体を含まないもの。以後、ＺＺ－ＢＮＣ（ＣＦ７５０Ｌａｂｅｌｅｄ））の３倍の集積度合いであった。この結果は、ＺＺ－ＢＮＣ表層に提示されている酵母由来高マンノース型糖鎖が樹状細胞の表層のマンノース受容体と相互作用して集積していることも示唆している。つまり、「αーＣＤ１１ｃーＺＺ－ＢＮＣ」は抗ＣＤ１１ｃ抗体と酵母由来高マンノース型糖鎖が共役的に樹状細胞を標的化していることが示唆された（図８（Ａ））。
　更に、上記マウスにおいて、投与後８、１２、及び２４時間における所属リンパ節内の樹状細胞の全てに対する、αーＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ（ＣＦ７５０Ｌａｂｅｌｅｄ）及びＺＺ－ＢＮＣ（ＣＦ７５０Ｌａｂｅｌｅｄ）の集積度合いを検討したところ、前者が後者よりも集積度合いは上昇していたが、両者とも全時点において有意にＺＺ－ＢＮＣは集積していた（図８（Ｂ））。なお、ＳＣ投与後１２時間における鼠径リンパ節内の樹状細胞を単離し、共焦点レーザー顕微鏡観察したところ、樹状細胞内にＺＺ－ＢＮＣが取り込まれていることも確認された（図９）。
＜実験例７：樹状細胞標的化ＢＮＣのアジュバント効果の実験＞
　上述のαーＣＤ１１ｃーＺＺ－ＢＮＣ、ＺＺ－ＢＮＣ、及び陽性対照としてＬＰＳの１０μｇを、ＳＣ又はＩＭでマウスに投与し、２日後に鼠径リンパ節又は膝窩リンパ節を摘出し、常法に従い樹状細胞を単離し、樹状細胞表面の活性化マーカー（樹状細胞がＴ細胞に抗原提示する際に発現する細胞表面分子）であるＣＤ８６及びＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩの発現量を、ＦＡＣＳを用いて定量した。
　結果を図１０に示す。α―ＣＤ１１ｃーＺＺ－ＢＮＣ、ＺＺ－ＢＮＣ、及びＬＰＳは同等の樹状細胞活性化能を有していた。以上から、α―ＣＤ１１ｃーＺＺ－ＢＮＣ及びＺＺ－ＢＮＣは、アジュバントとして樹状細胞への抗原認識を促進する活性があることが示された。
＜実験例８：樹状細胞標的化ＢＮＣへの抗原搭載法の検討１＞
　非特許文献３に記載の方法では、カチオン性リポソームにＪＥＶ由来のＤ３抗原を包含して、その後、抗ＣＤ１１ｃ抗体提示ＺＺ－ＢＮＣを重合させたものが、有意に抗Ｄ３抗原に対する抗体を誘導できることを示したが、今回は、アニオン性リポソーム（ＤＰＰＣ：ＤＰＰＥ：ＤＰＰＧ－Ｎａ：コレステロール＝３：３：６：８（モル比）の脂質組成にて調製したものである。）にＤ３抗原タンパク質を包含させ、口径２００ｎｍ及び１００ｎｍのエクストリューダーで処理、及び限外濾過したところ、得られたリポソームにおける対脂質Ｄ３抗原の含量が２３．７％と高効率であることを確認した（以後、このリポソームをａＬＰ－Ｄ３とする。）。また、上述の方法に従って測定したＺ平均粒子径は１１０ｎｍ程度であり、ζ電位はー５３．１ｍＶ程度であった。
　次に、常法にしたがって、ＺＺ－ＢＮＣをｐＨ４、３７℃、１時間で重合させ、抗ＣＤ１１ｃ抗体をＢＳ３クロスリンカーで固定し、過剰クロスリンカーをグリシンでマスキングした。これを、抗ＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ－ａＬＰ－Ｄ３とする。また、この様なＢＮＣのＺ平均粒子径は１００～６００ｎｍ程度であり、ζ電位はー２０～０ｍＶ程度である。
　上述のａＬＰ－Ｄ３、ＳＴ－ＢＮＣ－ａＬＰ－Ｄ３（ＳＴ－ＢＮＣは上述のようなＺＺドメインを有さないＢＮＣであり酵母由来高マンノース糖鎖を提示する。）、ＺＺ－ＢＮＣ－ａＬＰ－Ｄ３、及びαーＣＤ１１ｃーＺＺ－ＢＮＣ－ａＬＰ－Ｄ３を、マウス（１群６匹）にＤ３量として２０μｇずつ、２週おきに３回ＩＭ、で投与した（０、２、及び４週目）。その際、０、４、及び６週目に採血を行い、６週目に半数マウス致死量の５０倍のＪＥＶを接種した。なお、陽性対象実験として化血研のＪＥＶワクチン接種群（投与抗原は多価、かつ２０μｇ以上である。）を同様に投与した。
　結果を図１１に示す。陽性対象である化血研のＪＥＶワクチン接種群（投与抗原は多価かつ２０マイクログラム以上である）は完全にＪＥＶによる感染を防御した中で、αＣＤ１１ｃーＺＺ－ＢＮＣ－ａＬＰ－Ｄ３も同様に完全にＪＥＶによる感染も防御した。なお、ＺＺ－ＢＮＣ－ａＬＰ－Ｄ３は半数のマウスが感染防御され、ＳＴ－ＢＮＣ－ａＬＰ－Ｄ３は１匹しか防御されなかったことから、酵母由来の高マンノース由来糖鎖のみの樹状細胞への標的化は感染防御において不十分と判断された。また、ＺＺドメイン自身もＢ細胞等に提示されるＩｇＧドメインを認識していると考えられ、その為、ＺＺ－ＢＮＣはＳＴ－ＢＮＣよりも樹状細胞標的化能が高まったと推測された。
　さらに、抗ＣＤ１１ｃ抗体に直接Ｄ３抗原を結合させたもの（αーＣＤ１１ｃ－Ｄ３）は、全くＪＥＶによる感染を防御することが出来なかった。このことは、「１）アニオン性リポソームを介したＤ３抗原の樹状細胞への送達が、樹状細胞内での抗原プロセッシングに対して有効であり、直接樹状細胞内に送り込まれたＤ３は樹状細胞内で適切に抗原プロセッシングされないか或いは単純に分解していることを示唆している」又は「２）ＺＺ－ＢＮＣの表層に提示された抗ＣＤ１１ｃ抗体がＢＮＣの表層で整列化されており、斯かる抗体のアビディティが著しく抗体１分子と比較して高まったため、樹状細胞への標的化が効率よく行われたこと」の何れかを示唆している。
＜実験例９：樹状細胞標的化ＢＮＣへの抗原搭載法の検討２＞
　上述の実験例８において示唆された『２）』の可能性を検討するために、ＺＺ－ＢＮＣ表層に抗ＣＤ１１ｃ抗体を整列化して提示するとともに、リポソームを介さずにＤ３抗原を同時に提示する組成物を作製しこれについての検討を行った。具体的には、ＺＺ－ＢＮＣ表層のＦｒｅｅアミノ基にＳｕｌｆｏ－ＬＣ－ＳＰＤＰ（ピアス社）を用いてピリジルジチオール化ＺＺ－ＢＮＣを作製した。、一方で、Ｄ３のＦｒｅｅアミノ基にＳＰＤＰ（ピアス社）を用いてピリジルジチオール化し、その後ＤＴＴで還元してチオール基に変換し、チオール化Ｄ３抗原とした。その後、ピリジルジチオール化ＺＺ－ＢＮＣとチオール化Ｄ３抗原をそれぞれ１：０．５～１：４の重量比で混合し、４℃、１８時間反応させ、還元状態及び非還元状態でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、銀染色を行ったところ、ＺＺ－ＢＮＣ：Ｄ３抗原＝１：４でも十分にＤ３抗原がＺＺ－ＢＮＣに結合していることが判明した。得られたＢＮＣをＺＺ－ＢＮＣ－Ｄ３とする。また、下記表４は各条件で得られたＺＺ－ＢＮＣーＤ３のＺ－ａｖｅｒａｇｅ（ＰＤＩ）及びゼータ電位であり、上述の方法と同様にして測定したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜実験例１０：抗原を有する樹状細胞標的化ＢＮＣへの抗体誘導実験＞
　ＺＺ－ＢＮＣ：Ｄ３＝１：４で得られたＺＺ－ＢＮＣ－Ｄ３に対し、ＺＺ－ＢＮＣーＤ３に対して５分の１の重量となる抗ＣＤ１１ｃ抗体を加え、室温で１５分間静置し、クロスリンカーＢＳ３で室温１時間処理し、過剰クロスリンカーをグリシンで室温１５分処理してマスキングした。得られたものをα―ＣＤ１１ｃ－ＺＺーＢＮＣーＤ３とする。Ｄ３抗原量に換算して４０μｇののαーＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ－Ｄ３、及び及びＺＺ－ＢＮＣーＤ３を、マウス（１群５匹）に対しそれぞれ、ＩＶ（静脈内）、ＩＭ（筋肉内）、及びＳＣ（皮下）の経路で０、２週に接種し、４週目で血清中の抗Ｄ３－ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡで評価した。
　結果を、図１２に示す。αーＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ－Ｄ３は抗ＣＤ１１ｃ抗体提示していないＺＺ－ＢＮＣーＤ３と比較して高い効率で抗体が誘導されていた。以上から、今までのリポソーム（カチオン性またはアニオン性）を介して抗原を包含させなくても、化学的にＺＺ－ＢＮＣ表層に抗原提示させれば、同時に提示している抗ＣＤ１１ｃ抗体により樹状細胞への標的化が達成され、高い抗原性を発揮できるものと考えられた。また、αーＣＤ１１ｃ－ＺＺ－ＢＮＣ－Ｄ３はＩＶ、ＳＣ、及びＩＭのいずれの投与経路であっても、マウス個体において優れた抗体産生を誘導することが明らかとなった。
＜実験例１１：抗原を有する樹状細胞標的化ＢＮＣを用いた感染防御実験＞
　上述のαーＣＤ１１ｃーＺＺ－ＢＮＣーＤ３、ＺＺ－ＢＮＣーＤ３、ＳＴ－ＢＮＣーＤ３、を、マウス（１群６匹）にＤ３抗原量に換算して４０μｇずつ、２週おきに２回ＩＭで投与した（０，２週目）。その際、０，４週目に採血を行い、４週目に半数マウス致死量の５０倍のＪＥＶを接種した。これは、上述の図１１に示される実験よりも投与間隔が短く過激なチャレンジ実験である。
　結果を図１３に示す。化血研のＪＥＶワクチン接種群（投与抗原は多価かつ４０マイクログラム以上である）は完全にＪＥＶ感染を防御した中で、α－ＣＤ１１ｃーＺＺ－ＢＮＣーＤ３もほぼ同様（最終週で１匹死亡）にＪＥＶ感染を防御した。なお、ＺＺ－ＢＮＣーＤ３は半数のマウスが感染防御され、ＳＴ－ＢＮＣーＤ３は１匹しか防御されなかったことから、酵母由来の高マンノース由来糖鎖のみの樹状細胞への標的化は感染防御において不十分と判断された。また、ＺＺドメイン自身もＢ細胞等に提示されるＩｇＧドメインを認識していると考えられ、その為、ＳＴ－ＢＮＣよりも樹状細胞への標的化能が高まったと推測された。なお、抗ＣＤ１１ｃ抗体に直接Ｄ３抗原を結合させたもの（αーＣＤ１１ｃ－Ｄ３）は、全くＪＥＶ感染を防御することが出来なかった。このことは、ＺＺ－ＢＮＣの表層に提示された抗ＣＤ１１ｃ抗体はＢＮＣ表層で整列化されており、同抗体のアビディティ（ａｖｉｄｉｔｙ）が著しく抗体１分子と比較して高まったため、樹状細胞への標的化が効率よく行われたことを示唆している。なお、実験例８にて示唆される１）については、本実験から可能性はその低いと考えられた。
＜実験例１２：核酸として抗原を有する樹状細胞標的化ＢＮＣの実験＞
　非特許文献３に記載の方法に従ってα－ＣＤ１１ｃーＺＺ－ＢＮＣ（抗ＣＤ１１ｃ抗体が１μｇでＺＺ－ＢＮＣが５μｇ）を作製し、カチオン性リポソーム（組成は非特許文献３に記載されたものであり、３０μｇ）に３μｇの蛍光色素Ｃｙ５標識プラスミドＤＮＡを複合体化したリポプレックス（ＬＰＸ）を混合し、３７℃、１時間（ｐＨ３）でインキュベートしてα－ＣＤ１１ｃーＺＺ－ＢＮＣ－カチオン性リポソーム－ＤＮＡを作製し、塩化セシウム密度勾配超遠心法（ＳＷ４１ローター、２３６００回転、２５℃、１６時間）で分離した。各フラクションを採取し、そのタンパク質量、及びＣｙ５蛍光強度を測定した。
　この結果を図１４に示す。ＬＰＸ単独の場合は低密度画分に集積し、α－ＣＤ１１ｃーＺＺ－ＢＮＣ単独の場合は高密度画分に集積する条件で、上述のαーＣＤ１１ｃーＺＺ－ＢＮＣ－カチオン性リポソーム－ＤＮＡは両画分の中間に集積していた。特に、上述の混合比で作製したα－ＣＤ１１ｃーＺＺ－ＢＮＣ－カチオン性リポソーム－ＤＮＡは、遊離のＬＰＸ及び遊離のα－ＣＤ１１ｃーＺＺ－ＢＮＣは存在しなかった。これらの作製は煩雑な塩化セシウム密度勾配超遠心法を介さずに行うことができるので、各成分を上記量比で混合することにした。
　上述の方法に従って、「αーＣＤ１１ｃ抗体提示ＣＦ７５０蛍光標識ＺＺ－ＢＮＣ－カチオン性リポソーム－ＤＮＡ」及び「ＣＦ７５０蛍光標識ＺＺ－ＢＮＣ－カチオン性リポソーム－ＤＮＡ」を作製し、マウスに尾静脈からＺＺ－ＢＮＣに換算して１０μｇに相当する量を投与し、１時間後にインビボイメージング装置を用いて、各主要臓器におけるＺＺ－ＢＮＣの濃度を蛍光強度で定量した。
　結果を図１５に示す。上述の両ＢＮＣは、通常のナノメディシンと同様に肝臓、脾臓を中心に局在することが判明した。
　次いで、、上述の方法に従って、「抗ＣＤ１１ｃ抗体提示ＺＺ－ＢＮＣ－カチオン性リポソーム－Ｃｙ５蛍光標識ＤＮＡ」、「ＺＺ－ＢＮＣ－カチオン性リポソーム－Ｃｙ５蛍光標識ＤＮＡ」、「カチオン性リポソーム－Ｃｙ５蛍光標識ＤＮＡ」、及び「Ｃｙ５蛍光標識ＤＮＡ」を作製し、ＤＮＡ６マイクログラム相当をマウス尾静脈（１群３匹）に投与し、１時間後に脾臓を摘出し、ＣＤ１１ｃ陽性細胞（樹状細胞）に含まれるＣｙ５陽性細胞の割合をＦＡＣＳで測定した。なお、これらのＺ平均粒子径とゼータ電位は、それぞれ上述の順に、４１０ｎｍ／１８．９ｍＶ、３５６ｎｍ／１８．７ｍＶ、２６８ｎｍ／４０．０ｍＶ及び＞１０００ｎｍ／－２５．１ｍＶであった。
　結果を図１６に示す。「抗ＣＤ１１ｃ抗体提示ＺＺ－ＢＮＣ－カチオン性リポソーム－Ｃｙ５蛍光標識ＤＮＡ」、「ＺＺ－ＢＮＣ－カチオン性リポソーム－Ｃｙ５蛍光標識ＤＮＡ」、「カチオン性リポソーム－Ｃｙ５蛍光標識ＤＮＡ」及び「Ｃｙ５蛍光標識ＤＮＡ」は、ＣＤ１１ｃ陽性細胞（樹状細胞）のそれぞれ１１．２％、１４．４％、６．５％、及び０％にＤＮＡが集積していた。これは、ＢＮＣをＩＶ投与する場合、脾臓内の樹状細胞の標的化には抗ＣＤ１１ｃ抗体によりも、ＺＺ－ＢＮＣのＺＺドメインによるＩｇＧ　Ｆｃ領域標的化および酵母由来の高マンノース糖鎖による樹状細胞への標的化が有効であることが判明した。しかし、この各分子の樹状細胞への標的化能は、ＩＶ以外の投与経路、異なるリポソーム組成、異なる各成分の組成比においては変動する可能性はある。
図５（実験例３：ＢＮＣの生体への投与）と同様に、「αーＣＤ１１ｃーＺＺ－ＢＮＣ－カチオン性リポソーム－Ｃｙ５蛍光標識ＤＮＡ」を接種されたマウスから単離した脾臓内の樹状細胞を、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
　図１７に示すように、ＤＮＡ由来のＣｙ５蛍光が樹状細胞内に存在することが確認された。以上から、ＤＮＡワクチンを「αーＣＤ１１ｃーＺＺ－ＢＮＣ－カチオン性リポソーム」に搭載した場合、効率よくＤＮＡワクチンが樹状細胞に送達され、従来のＤＮＡワクチン単剤とくらべて高い免疫原性を示すことが期待された。

Claims (13)

  1. 樹状細胞の表面タンパク質に対する抗体及びウイルス表面抗原タンパク質を含むウイルス様粒子を有するバイオナノカプセル。
  2. ウイルス様粒子が、抗体結合ドメインを含む、請求項１に記載のバイオナノカプセル。
  3. 抗体結合ドメインが、ウイルス表面抗原タンパク質に含まれる、請求項２に記載のバイオナノカプセル。
  4. ウイルス表面抗原タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）Ｌタンパク質である、請求項１～３の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。
  5. 抗体が、ＣＤ１１ｃタンパク質又はそのオルソログを認識する抗体である、請求項１～４の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。
  6. 更にリポソームを含む、請求項１～５の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。
  7. リポソームがカチオン性である、請求項１～６の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。
  8. リポソームがアニオン性である、請求項１～６の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。
  9. 更に、抗原物質及び／又は核酸を含む請求項１～８の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。
  10. 請求項１～８の何れか１項に記載のバイオナノカプセルを含む、樹状細胞への抗原物質及び／又は核酸の導入剤。
  11. 請求項１～８の何れか１項に記載のバイオナノカプセルと、抗原物質及び／又は核酸を含むワクチン。
  12. 動物の樹状細胞への抗原物質及び／又は核酸導入方法であって、請求項９に記載のバイオナノカプセルを動物に投与する工程を含む方法。
  13. 投与が経静脈投与、経皮下投与、又は経筋肉投与である請求項１２に記載の方法。
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