WO2013125932A1 - Метод определения структурных и функциональных свойств альбумина плазмы крови - Google Patents
Метод определения структурных и функциональных свойств альбумина плазмы крови Download PDFInfo
- Publication number
- WO2013125932A1 WO2013125932A1 PCT/LV2013/000003 LV2013000003W WO2013125932A1 WO 2013125932 A1 WO2013125932 A1 WO 2013125932A1 LV 2013000003 W LV2013000003 W LV 2013000003W WO 2013125932 A1 WO2013125932 A1 WO 2013125932A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- albumin
- blood plasma
- evaluating
- fluorescence
- structural
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/76—Assays involving albumins other than in routine use for blocking surfaces or for anchoring haptens during immunisation
- G01N2333/765—Serum albumin, e.g. HSA
Definitions
- the developed method relates to the field of molecular biophysics and molecular medicine, and can be used to determine the structural and functional properties of blood plasma albumin using a new fluorescence probe based on benzantrone dyes.
- Plasma albumin performs a variety of functions, the most important of which is the binding of toxins and metabolites and their transport to the liver.
- the transport function of albumin decreases with various pathologies, with impaired synthesis, when its amount decreases or its structure changes.
- Conformational transitions recorded by AVMs characterize both binding sites and are found in a wide spectral range and with significant changes in fluorescence intensity.
- a fluorescence method was developed for determining the binding ability of plasma albumin, including a minimum of operations — adding an ABM fluorescent probe to diluted blood plasma and recording the fluorescence of the resulting solutions.
- An alcoholic solution of an AVM probe is poured into a blood plasma diluted 200 times so that the concentration of the probe in the resulting solution is 19.6 nmol / ml. After stirring, the solution is incubated at room temperature (18-20 ° C) for 5 minutes. Spectral parameters are then measured (wavelength of maximum fluorescence and its intensity at an excitation light length of 470 nm in the emission range of 520-700 nm). For comparison, the fluorescence intensity of the initial blood plasma and the solution of the AVM probe in isotonic phosphate buffer is measured.
- the fluorescence intensity of the bound plasma albumin is calculated by the formula:
- Fi is the total fluorescence intensity of AVM in blood plasma
- the type and severity of the transformation (modification) of albumin is determined by the deviation of the wavelength of the maximum fluorescence from the norm (650 nm) and the intensity of fluorescence.
- the effective concentration of albumin in a blood plasma sample is calculated from the calibration curve: the dependence of the fluorescence intensity on the concentration of albumin in samples of healthy donors, which was determined by a unified (using bromcresol purple) method.
- a shift of the maximum fluorescence in the short-wave side by 20-30 nm (in the region of 620-630 nm) and a decrease in the fluorescence intensity compared with the control data (650 nm) indicate the unfolding of albumin globules, characteristic of an acidic environment.
- EA effective concentration
- a decrease in EA TA (0.66; in the control 0.81) during the NF transition indicates a decrease in the functional activity of albumin and structural changes in albumin globules.
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Разработанный способ относится к области молекулярной биофизики и молекулярной медицины, и может быть использован для определения структурных и функциональных свойств альбумина плазмы крови, используя новый флуоресцентный зонд на основе бензантроновых красителей, Альбумин плазмы крови выполняет разнообразные функции, важнейшая из которых - связывание токсинов и метаболитов и их транспорт в печень. Транспортная функция альбумина снижается при различных патологиях, при нарушениях синтеза, когда уменьшается его количество или изменяется структура. В работе разработан флуоресцентный метод для определения связывающей способности альбумина плазмы крови, включающий минимум операций - добавление флуоресцентного зонда АВМ к разбавленной плазме крови и регистрация флуоресценции подученных растворов.
Description
Описание
Метод определения структурных и функциональных свойств альбумина плазмы
крови
Разработанный способ относится к области молекулярной биофизики и молекулярной медицины, и может быть использован для определения структурных и функциональных свойств альбумина плазмы крови, используя новый флуоресцентный зонд на основе бензантроновых красителей.
Альбумин плазмы крови выполняет разнообразные функции, важнейшая из которых - связывание токсинов и метаболитов и их транспорт в печень. Транспортная функция альбумина снижается при различных патологиях, при нарушениях синтеза, когда уменьшается его количество или изменяется структура.
Преимущества зонда АВМ:
1. Незаряженный зонд, параметры связываня которого не зависят от заряда места связывания,
2. В плазме крови связывание происходит практически только с альбумином, нет необходимости в разделении (фракционировании) крови. Что является важным для определения эффективной концентрации альбумина.
3. Чувствителен к «информационным изменениям альбумина в диапазоне рН 2-12.
4. Максимум излучения в "красной" области спектра (λ=650 am) способствует высокой аналитической чувствительности.
5. Конформационные переходы, которые регистрирует АВМ, характеризуют оба места связывания и обнаруживаются в широком спектральном диапазоне и со значительными изменениями интенсивности флуоресценции.
6. Количественные характеристики связывания альбумина строго коррелируют между собой,
В работе разработан флуоресцентный метод для определения связывающей способности альбумина плазмы крови, включающий минимум операций - добавление флуоресцентного зонда АВМ к разбавленной плазме крови и регистрация флуоресценции полученных растворов.
Метод реализуют следующим образом:
К разбавленной в 200 раз плазме крови приливают спиртовой раствор зонда АВМ так, чтобы концентрация зонда в полученном растворе составляла 19,6 нмоль/мл. После перемешивания раствор инкубируют при комнатной температуре (18-20 °С) 5 минут, Затем измеряют спектральные параметры (длину волны максимума флуоресценции и ее интенсивность при длине возбуждающего света 470 нм в диапазоне испускания 520-700 нм). Для сравнения измеряют интенсивность флуоресценции исходной плазмы крови и раствора зонда АВМ в изотоническом фосфатном буфере.
Интенсивность флуоресценции связанного альбумина плазмы крови рассчитывают по формуле:
F = (Fi - F2) - F3
где Fi - суммарная интенсивность флуоресценции АВМ в плазме крови,
F'2 - интенсивность флуоресценции исходной плазмы крови,
1;з - интенсивность флуоресценции зонда АВМ в изотоническом фосфатном буфере.
1. По отклонению длины волны максимума флуоресценции от нормы (650 нм) и интенсивности флуоресценции определяют вид и выраженность трансформации (модификации) альбумина.
2. Эффективную концентрацию альбумина в образце плазмы крови рассчитывают по калибровочной кривой: зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации альбумина в образцах здоровых доноров, которая была определена унифицированным (с помощью бромкрезолового пурпурного) методом.
3. Общую концентрацию альбумина (белка) - измеряют методом бромкрезолового пурпурного.
4. Резерв связывания альбумина рассчитывают как отношение эффективной концентрации альбумина к его общей концентрации
Предложенный метод рассмотрен на примере исследования плазмы крови ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС:
Пример 1,
К разбавленной в 200 раз плазме крови приливают спиртовой раствор флуоресцентного зонда АВМ так, чтобы концентрация зонда в полученном растворе составляла 19,6 нмоль/мл. После перемешивания раствор инкубируют при комнатной температуре (18-20 °С) 5 минут. 2 мл образца помещают в кварцевую кювету и снимают спектр флуоресценции в диапазоне 520 - 700 нм (при возбуждении 470 нм) на спектрофлуориметре Spectroflu 743 (ISA Jobin Ivon Instruments S.A., Longjumeau, France). Аналогичные измерения проводят с нативной плазмой и раствором зонда в изотоническом фосфатном буфере (рН=7,4).
После обработки (вычитания) спектров флуоресценции анализируют полученные результаты. Сдвиг максимума флуоресценции в коротковолновую сторону на 20-30 нм (в районе 620-630 нм) и уменьшение интенсивности флуоресценции по сравнению с данными контроля (650 нм) свидетельствуют о разворачивании глобул альбумина, характерном для кислой среды.
Пример 2.
Регистрацию спектров проводят как в Примере 1. Еще более значительный сдвиг максимума флуоресценции в коротковолновую сторону (в районе 600-620 нм) и увеличение интенсивности флуоресценции но сравнению с данными контроля (650 нм) свидетельствуют о так называемом N-F переходе (модификации) альбумина.
Пример 3.
1. Определяют общую концентрацию (ТА) альбумина в плазме с помощью бромкрезо л ового пурпурного .
2. Рассчитывают эффективную концентрацию (ЕА) альбумина по калибровочной кривой зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации альбумина в образцах плазмы крови здоровых доноров, которая была определена унифицированным (с помощью бромкрезолового пурпурного) методом.
3. Рассчитывают показатель резерва связывания альбумина как соотношение ЕА/ТА
Уменьшение показателя ЕА ТА (0,66; в контроле 0,81) при N-F переходе свидетельствует об уменьшении функциональной активности альбумина и структурных изменениях глобул альбумина.
Оптические хара терисп IKS и парамет| >ы связывания с альбумин м н, гаазмм крови человека известных флуоресцеш'Н! ых зондов но ера идоению с зонде >м АВМ
Claims
фмула изобретения
1 , Флуоресцентный метод для определения связывающей способности альбумина плазмы крови, включающий минимум операций - добавление флуоресцентного зонда АВМ к разбавленной плазме крови и регистрация флуоресценции полученных растворов.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LVP-12-30 | 2012-02-22 | ||
| LV121230 | 2012-02-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2013125932A1 true WO2013125932A1 (ru) | 2013-08-29 |
Family
ID=49006025
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/LV2013/000003 WO2013125932A1 (ru) | 2012-02-22 | 2013-02-11 | Метод определения структурных и функциональных свойств альбумина плазмы крови |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2013125932A1 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2008144318A (ru) * | 2007-11-12 | 2010-05-20 | Грифольс, С.А. (Es) | Способ получения высокоэффективного человеческого альбумина для применения в детоксикационной терапии |
-
2013
- 2013-02-11 WO PCT/LV2013/000003 patent/WO2013125932A1/ru active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2008144318A (ru) * | 2007-11-12 | 2010-05-20 | Грифольс, С.А. (Es) | Способ получения высокоэффективного человеческого альбумина для применения в детоксикационной терапии |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| KALNINA . ET AL.: "A New Fluorescent Probe, ABM: Properties and Application in Clinical Diagnostics.", JOURNAL OF FLUORESCENCE, vol. 9, no. IS.1, 1999, pages 27 - 32 * |
| KALNINA . ET AL.: "Correlation of altered blood albumin characteristics and lymphocyte populations to tumor stage in gastrointestinal cancer patients", CANCER BIOMARK., vol. 7, no. 2, 2010, pages 91 - 99 * |
| MILLER IU.I.: "Razrabotka fluorestsentnykh metodov opredeleniya kontsentratsii i svyazyvaiushchei sposobnosti albumina.", AVTOREFERAT K.M.N., 1990, MOSCOW, pages 8 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dalirirad et al. | Aptamer-based lateral flow assay for point of care cortisol detection in sweat | |
| Hlaváček et al. | Competitive upconversion-linked immunosorbent assay for the sensitive detection of diclofenac | |
| Lee et al. | Time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based lateral flow immunoassay using a raspberry-type europium particle and a single membrane for the detection of cardiac troponin I | |
| Jokerst et al. | Nano-bio-chips for high performance multiplexed protein detection: determinations of cancer biomarkers in serum and saliva using quantum dot bioconjugate labels | |
| Luo et al. | An environment-sensitive fluorescent probe for quantification of human serum albumin: Design, sensing mechanism, and its application in clinical diagnosis of hypoalbuminemia | |
| Chan et al. | Highly sensitive quantification of Alzheimer's disease biomarkers by aptamer-assisted amplification | |
| Chan et al. | Ultra-sensitive detection of protein biomarkers for diagnosis of Alzheimer’s disease | |
| Serafín et al. | Disposable immunoplatforms for the simultaneous determination of biomarkers for neurodegenerative disorders using poly (amidoamine) dendrimer/gold nanoparticle nanocomposite | |
| Zhang et al. | Detection and quantification of 8‐hydroxy‐2′‐deoxyguanosine in Alzheimer's transgenic mouse urine using capillary electrophoresis | |
| Liu et al. | Methodological evaluation and comparison of five urinary albumin measurements | |
| Moscovitch-Lopatin et al. | Optimization of an HTRF assay for the detection of soluble mutant huntingtin in human buffy coats: a potential biomarker in blood for Huntington disease | |
| Ujlaky-Nagy et al. | Flow cytometric FRET analysis of protein interactions | |
| Chen et al. | Quantitative urinalysis using aggregation-induced emission bioprobes for monitoring chronic kidney disease | |
| Liu et al. | Homogeneous immunoassay based on two-photon excitation fluorescence resonance energy transfer | |
| Gopalkrishnapillai et al. | Evaluation of autofluorescent property of hemoglobin-advanced glycation end product as a long-term glycemic index of diabetes | |
| RáGonšales et al. | Ultrasensitive detection of programmed death-ligand 1 (PD-L1) in whole blood using dispersible electrodes | |
| Sarkar et al. | Rapid point-of-care quantification of human serum albumin in urine based on ratiometric fluorescence signaling driven by intramolecular H-bonding | |
| Vigneshwaran et al. | Autofluorescence characterization of advanced glycation end products of hemoglobin | |
| Fu et al. | Rapid and wash-free time-gated FRET histamine assays using antibodies and aptamers | |
| Chen et al. | A highly sensitive label-free resonance light scattering assay of carcinoembryonic antigen based on immune complexes | |
| Furtaw et al. | Near-infrared, surface-enhanced fluorescence using silver nanoparticle aggregates in solution | |
| Kokko et al. | Homogeneous noncompetitive immunoassay for 17β-estradiol based on fluorescence resonance energy transfer | |
| Huang et al. | Hue-Recognition Strategy-Based Immunoassay Using Functionalized Dendritic Silica Colloids and Gold Nanoclusters for Point-of-Care Testing of C-Reactive Proteins | |
| Ortega-Hernández et al. | Detection of biomarkers associated with acute kidney injury by a gold nanoparticle based colloidal nano-immunosensor by fourier-transform infrared spectroscopy with principal component analysis | |
| WO2013125932A1 (ru) | Метод определения структурных и функциональных свойств альбумина плазмы крови |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 13752277 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 13752277 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |