WO2013115508A1 - 인간 ｄｙｒｋ１ａ 유전자 형질전환 초파리를 이용한 치료제 스크리닝 방법 - Google Patents

인간 ｄｙｒｋ１ａ 유전자 형질전환 초파리를 이용한 치료제 스크리닝 방법 Download PDF

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    • A01K2267/0318—Animal model for neurodegenerative disease, e.g. non- Alzheimer's

Definitions

  • the present invention utilizes a human brain syndrome gene DYRKlA (Dual-specific tyrosine (Y) Regulated Kinase 1A) or a mini brain gene transgenic fruit fly, which is a homologous gene of DYRKIA, a preparation method thereof, and the transformed fruit fly.
  • DYRKlA Dual-specific tyrosine (Y) Regulated Kinase 1A
  • mini brain gene transgenic fruit fly which is a homologous gene of DYRKIA, a preparation method thereof, and the transformed fruit fly.
  • Down Syndrome is a chromosomal abnormality caused by the trisomy of human chromosome 21. Symptoms such as mental retardation, learning and memory loss, early onset of Alzheimer's disease, and cranial facial disorder Appears. In particular, changes in the expression level of genes in a specific region designated as 'Down syndrome critical region DSCR' of human chromosome 21 are estimated to cause Down syndrome.
  • DYRKlA Dual_specific tyrosine (Y) Regulated Kinase 1A
  • DYRKlA Dual_specific tyrosine (Y) Regulated Kinase 1A
  • Down syndrome is the most frequent chromosomal aberration syndrome occurring in about 1 in 700 newborns.
  • Racial, environmental and socioeconomic differences It occurs at a constant rate regardless of the age of mothers over 35 years of age, the frequency of occurrence increases, and if the mother is over 40 years old, one child per 100 people has a birth frequency. There is no way to prevent these genetic abnormalities in modern medicine.
  • the existing DYRK1A transgenic mice were presented in two models, the first of which was constructed by introducing a YACXYeast Artificial Chromosome vector containing DYRK1A into adjacent sites (Smith, DJ et al. (1997). "Functional screening of 2 Mb of human chromosome 21q22.2 in transgenic mice implicates minibrain in learning defects associated with Down syndrome.” Nat Genet 16 (1): 28-36), second is DYRJUA A transgenic mouse in which only cDNA was introduced and expressed using a foreign promoter (Altafaj, X. et al. (2001).
  • transgenic mice incorporating the YAC vector have a number of genes other than DYRK1A in the YAC vector. Contains gene-specific effects and There is a problem that screening of other genes cannot be ruled out in the screening of the drug, and in the transgenic mice that induce the expression of DYRK1A cDNA using a foreign promoter, the expression pattern is not the same as that of the original gene.
  • transgenic mice using the YAC vector of human hDYRKIA have recently been developed and suggested as a screening model for the development of therapeutic agents for Down syndrome (Ahn, KJ., Et al. (2006). "DYRK1A BAC transgenic mice show altered synaptic plasticity with learning and memory defects.” Neurobiol Dis. 22 (3): 463-72).
  • the drug It is believed that there are cost and time limitations of the mouse model used for screening. More than 80% of human disease genes are well conserved, and many previous studies have also found that fruit flies have the same symptoms for human disease and have the advantage of being able to screen large quantities of new drugs at low cost. Has been reported to be of high value (Giacomotto J et al. (2010) Br J Pharmacol. 160 (2): 204-16).
  • the Drosophila minibrain ' gene is a Drosophila homologous gene of DYRK1A. It is a gene of the DYRK1A group that was first reported to be involved in neurodevelopment. It is known to express a large amount in the adult nervous system from the embryonic stage. It has been shown to be expressed in various nervous tissues, including the responsible mushroom body. In addition, minibrain mutant Drosophila has significantly reduced brain tissue size compared to normal Drosophila, and has been shown to exhibit behavioral disorders. It has been reported that the minibrain gene, DYRK1A in Drosophila, has important functions in the nervous system function. (Tejedor, F., et al. (1995).
  • An object of the present invention is to prepare a vector comprising a human DYRKlA (Dual-specific tyrosine (Y) Regulated Kinase 1A) or a minibrain gene;
  • Another object of the present invention is to provide a Down's syndrome gene transformed Drosophila prepared by the method of the present invention.
  • Technical Solution In order to achieve the above object, the present invention
  • step 2) transforming the vector of step 1) to Drosophila
  • Drosophila Provided is a method for producing Down syndrome gene transformed Drosophila.
  • step 3 provides a composition screening method for improving memory and learning function degradation comprising the step of selecting a test substance to reduce the hDYRKIA or minibrain gene expression of step 2) compared to the untreated control.
  • step 3 provides a screening method of the composition for improving the memory and learning function comprising the step of selecting a test substance to increase the memory and learning function of the fruit flies measured in step 2) compared to the untreated control.
  • step 3 provides a screening method for improving a short-lived herb comprising the step of selecting a test substance to reduce the hDYRKIA or minibrain gene expression of step 2) compared to the untreated control.
  • the present invention 1) treating the test substance in the Down syndrome gene transformed Drosophila according to the present invention as an experimental group;
  • step 3 provides a method for screening a composition for preventing and improving lifespan reduction, comprising selecting a test substance which extends the lifespan of fruit flies measured in step 2) as compared to the untreated control group.
  • step 3 provides a method for screening a composition for preventing and improving motor function lowering comprising the step of selecting a test substance to reduce hDYRKIA or minibrain gene expression of step 2) compared to the untreated control.
  • step 3 provides a method for screening a composition for preventing and improving exercise ability lowering, comprising selecting a test substance to increase the exercise ability of fruit flies measured in step 2) as compared to the untreated control group.
  • step 3 provides a method for screening a composition for preventing and improving neurodevelopmental disorders, comprising selecting a test substance that reduces hDYRKlA or minibrain gene expression in step 2) compared to an untreated control group.
  • Neurodevelopment comprising the step of selecting a test substance to increase the neurodevelopment level of Drosophila measured in step 2) compared to the untreated control . It provides a method for screening a composition for preventing and improving disorders.
  • the present invention provides a Down Syndrome Gene Transgenic Drosophila prepared by the production method of the present invention for use as an animal model animal with reduced memory and learning function, reduced lifespan, decreased motor performance, and nervous system development disorder.
  • the present invention provides a Down's syndrome gene transgenic fruit flies prepared by the method of the present invention for use in the screening of compositions for reducing memory and learning functions, shortening life span, reducing motor skills, and preventing and improving neurological developmental disorders. .
  • Drosophila transformed with the human Down syndrome gene (DYRK1A) or minibrain gene of the present invention exhibits an overexpression of hDYRKlA specifically in the nervous system, resulting in a decrease in lifespan and a decrease in motor capacity, and is easier to manipulate compared to a mouse model. It is economical and shows a phenotype that can easily observe symptoms of Down syndrome, so it is useful for screening phenotype treatments related to Down syndrome. Can be.
  • FIG. 1 shows a method for constructing a DYRKlACDual-specific tyrosine (Y) Regulated Kinase 1A) expression vector.
  • FIG. 2 is a view showing a method for producing a minibrain E expression vector.
  • Figure 3 is a diagram showing a method for producing a minibrain H expression vector.
  • 4 is a diagram confirming the gene overexpression effect of hDYRKlA and minibrain transgenic Drosophila:
  • E lav-Gal 4 control fruit flies
  • Figure 6 is a diagram confirming the change in fruit fly motor capacity by hDYRKl and minibrain gene:
  • FIG. 7 is a diagram analyzing the development of Drosophila nervous system by minibrain gene expression:
  • step 2) provides a method for producing Down's syndrome gene transformed Drosophila comprising transforming the vector of step 1) into Drosophila.
  • the DYRK1A gene of step 1) is SEQ ID NO:
  • nucleotide sequence of 1, but is not limited thereto.
  • It may consist of a sequence in which one or more bases in the sequence are deleted, added or substituted.
  • the minibrain gene of step 1) preferably has a nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto. It may be composed of sequences in which one or more bases in the sequence are deleted, added or substituted.
  • the vector of step 1) preferably includes a human DYRK1A gene or a minibrain gene, but may also include a DYRK1B, DYRK2 or DYRK4 gene, which is a subtype of the DYRK gene.
  • the vector of step 2) is a UAS vector
  • a UAS vector containing a human DY K1A or minibrain gene uses a P-factor mediated germ line transform method (P—element—mediated germ line transformat k> n). It is preferably introduced into the fruit flies, but is not limited thereto.
  • Drosophila of step 2) is preferably no second ⁇ drosophi la me Ianogaster) 0, but is not limited thereto.
  • the present inventors produce an expression vector comprising the DYRK1A and minibrain genes to produce a transgenic Drosophila comprising a human DYRK1A gene known as Down syndrome syndrome gene or a minibrain gene thereof.
  • Drosophila transformed with UAS-hDYRKlA and UAS-minibrain expression vector was prepared through P-element-mediated germ line transformat ion (see FIGS. 1 to 3).
  • the present inventors overexpressed the DYRK1A and minibrain genes using the Gal4 / UAS system to confirm whether hDYRKlA transgenic Drosophila and minibrain transgenic Drosophila can induce the expression of hDYRKlA and minibrain genes, respectively, DYRK1A and Drosophila transformed with the minibrain gene confirmed that the expression of the hDYRKlA gene (see FIG. 4A) and the minibrain gene (see FIG. 4B) was significantly increased by about 4-5 times or more compared to the control group (see FIG. 4).
  • the present inventors overexpressed the DYRK1A and minibrain genes using the Gal4 / UAS system to confirm the fruit fly shortening effect by the hDYRKl and minibrain genes, respectively. It was confirmed that there is a life-span shortening effect as compared with the human Down syndrome patient (see Fig. 5).
  • the present inventors overexpressed the DYRK1A and minibrain genes using the Gal4 / UAS system, respectively, in order to confirm the change of Drosophila motility caused by the hDYRKl and minibrain genes. Compared with the control group, it was confirmed that the decrease in exercise ability was significantly increased (see FIG. 6).
  • the present inventors measured the fruit fly nervous system development by minibrain gene expression, as a result of using the GFP fluorescent substance, when the minibrain gene is overexpressed, various neurological abnormalities are confirmed, and the brain nervous system abnormalities of human Down syndrome Nervous system abnormalities caused by minibrain gene overexpression were confirmed to be related (see FIG. 7).
  • the Down syndrome gene (DYRK1A or minibrain) of the present invention was transformed. Drosophila overexpresses hDYRKIA or minibrain specifically in the nervous system, resulting in shortened life span and decreased motor performance, and are easier to manipulate compared to conventional mouse models, and are more economical and phenotypes that can easily observe symptoms of Down syndrome. It can be useful for screening phenotype therapeutics related to Down syndrome effectively.
  • the present invention Drosophila overexpresses hDYRKIA or minibrain specifically in the nervous system, resulting in shortened life span and decreased motor performance, and are easier to manipulate compared to conventional mouse models, and are more economical and phenotypes that can easily observe symptoms of Down syndrome. It can be useful for screening phenotype therapeutics related to Down syndrome effectively.
  • 3) provides a composition screening method for improving memory and learning function lowering comprising the step of selecting a test substance to reduce the hDYRKlA or minibrain gene expression of step 2) compared to the untreated control.
  • step 3 provides a screening method of the composition for improving the memory and learning function comprising the step of selecting a test substance to increase the memory and learning function of the fruit flies measured in step 2) compared to the untreated control.
  • hDYRKlA or minibrain gene expression changes are DNA chip, Western blot, immunohistochemistry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioisotope immunoassay (RIA) polymerase amplification (PCR, Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PC), and protein chips are preferably measured by any one method selected from the group consisting of, but not limited to.
  • the inventors hDYRKlA transgenic Drosophila and minibrain transgenic Drosophila, respectively to ensure that can induce hDYRKlA and expression of minibrain gene "to, DYRK1A and minibrain gene using the Gal4 / UAS system
  • the fruit fly transformed with the DYRK1A and minibrain genes showed that the expression of the hDYRKlA gene (see FIG. 4A) and the minibrain gene (see FIG. 4B) was significantly increased by about 4-5 times more than the control group. (See FIG. 4).
  • the present invention the present invention,
  • 3) provides a screening method for improving the lifespan improvement composition comprising the step of selecting a test substance to reduce the hDYRKIA or minibrain gene expression of step 2) compared to the untreated control.
  • step 3 provides a method for screening a composition for preventing and improving lifespan reduction, comprising selecting a test substance which extends the lifespan of fruit flies measured in step 2) as compared to the untreated control group.
  • hDYRKIA or minibrain gene expression changes were DNA chips, Western blot, immunohistochemistry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioisotope immunoassay (RIA), polymerase amplification (PCR), Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), and Protein Chips are preferably measured by any one method selected from the group consisting of, but not limited to.
  • the inventors of the present invention hDYRKl and minibrain
  • DYRK1A and minibrain genes were overexpressed using Gal4 / UAS system, respectively. It was confirmed that the life-saving effect such as (see Figure 5).
  • the present invention the present invention,
  • a method for screening a composition for preventing and improving exercise capacity lowering comprising the step of selecting a test substance to increase the exercise ability of fruit flies measured in step 2) compared to the non-treated control group.
  • hDYRKIA or minibrain gene expression changes are DNA chip, Western blot, immunohistochemistry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioisotope immunoassay (RIA), polymerase amplification (PCR), Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), and the protein chip is preferably measured by any one method selected from the group consisting of, but not limited thereto.
  • the inventors overexpressed the DYRK1A and minibrain genes using the Gal4 / UAS system to confirm the change of Drosophila motility caused by the hDYRKl and minibrain genes, respectively, the expression of the DYRK1A and minibrain genes Induced transgenic fruit flies were found to significantly increase the motor capacity reduction compared to the control (see Figure 6).
  • the present invention overexpressed the DYRK1A and minibrain genes using the Gal4 / UAS system to confirm the change of Drosophila motility caused by the hDYRKl and minibrain genes, respectively, the expression of the DYRK1A and minibrain genes Induced transgenic fruit flies were found to significantly increase the motor capacity reduction compared to the control (see Figure 6).
  • the present invention the present invention,
  • step 3 provides a method for screening a composition for preventing and improving neurodevelopmental disorders, comprising selecting a test substance that reduces hDYRKIA or minibrain gene expression in step 2) compared to an untreated control group.
  • 3) provides a method for screening a composition for preventing and improving a neurodevelopmental disorder comprising the step of selecting a test substance to increase the neurodevelopment level of the fruit fly measured in step 2) compared to the untreated control.
  • hDYRKIA or minibrain gene expression changes are DNA chip, Western blot, immunohistochemistry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioisotope immunoassay (RIA), It is preferable to measure by any one method selected from the group consisting of polymerase amplification (PCR), reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), and protein chips.
  • PCR polymerase amplification
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • the inventors overexpressed the DYRK1A and minibrain genes using the Gai4 / UAS system, respectively, in order to identify the fruit fly neuron development pattern by the hDYRKl and minibrain genes, the expression of the DYRK1A and minibrain genes was induced. The transformed fruit flies were confirmed to develop abnormalities in neurodevelopment compared to the control group (see FIG. 7).
  • Drosophila transformed with Down syndrome gene (DYRK1A or minibrain) of the present invention exhibits a phenomenon of shortening of life span and reduction of motor ability by overexpressing hDYRKIA or minibrain specifically in the nervous system, and is easier to manipulate compared to a conventional mouse model. and the economy is excellent and i exhibits a phenotype that can be easily observed with down syndrome symptoms can be useful in screening for down syndrome phenotypes related drugs effectively.
  • the present invention provides a Down syndrome syndrome transgenic Drosophila prepared by the method of the present invention for use as an animal model of memory and learning deterioration.
  • the present invention provides a Down syndrome syndrome transgenic Drosophila prepared by the production method of the present invention for use as a shortened model animal.
  • the present invention provides a Down's syndrome gene transformed Drosophila prepared by the production method of the present invention for use as a model of reduced exercise ability.
  • the present invention provides a Down's syndrome gene transformed Drosophila prepared by the method of the present invention for use as a model of nervous system development disorder.
  • the present invention is a composition for preventing and improving the reduction of memory and learning function
  • a Down syndrome gene transformed Drosophila prepared by the method of the present invention for use in screening.
  • the present invention provides a Down's syndrome gene transformed Drosophila prepared by the production method of the present invention for use in screening a composition for preventing and improving lifespan shortening.
  • the present invention provides a Down's syndrome gene transformed Drosophila prepared by the production method of the present invention for use in the screening of a composition for preventing and improving motor function deterioration.
  • the present invention provides a Down's syndrome gene transformed Drosophila prepared by the method of the present invention for use in screening a composition for preventing and improving neurodevelopmental disorders.
  • Drosophila were bred at 25 ° C, and E lav-Gal 4 and Elav-GeneSw itch-Gal 4 transgenic Drosophila were used as Lee, ks. , et al, et al. (Lee, KS., et al., (2009), J. Biol. Chem 284 (43): 29454-61).
  • UAS-hDYRKlA and UAS-minibrain transgenic Drosophila were prepared and used according to the method described in ⁇ Example 2>.
  • Example 2 Preparation of UAS-hDYRKlA and UAS-minibrain Transforming Drosophila ⁇ 2-l> Cloning of DYRK1A Expression Vector
  • DYRKlA Human Down Syndrome DYRKlA (Dual-specific tyrosine (Y) Regulated Kinase 1A).
  • the human DYRK1A gene (Genebank number: BC156309; SEQ ID NO: After purchasing cDNA cloneCOpenbiosystem (1) containing 1), cloning was performed using the gateway system (Gateway system) as follows.
  • UAS-DYRK1A vector was produced by (Fig. 1).
  • a Drosophila homology gene of the DYRK1A gene was prepared based on the base sequence of mnb E (Genebank number: NM_167581.2; SEQ ID NO: 2). .
  • an easy-BLUE RNA extraction kit (iNtR0N) from Drosophila
  • the reaction was carried out using a First-Strand Synthesis System (Invitrogen, USA). 5 minutes from then, 65 ° C, 2 minutes at 4 ° C, 60 minutes at 50 ° C, the cDNA was synthesized for 15 minutes banung at 70 ° C.
  • Primer pair of SEQ ID NO: 4 (5'-CCATGTATAGATTAGAGGATACGMTAG-3 ') and SEQ ID NO: 5 (5'-ACCa: CTGTTTCCACTCCGAGGATG-3') for the separation of mnb E (N-term) using the cDNA 1 ⁇ as a template And mnb E (C- For the separation of the term), primer pairs of SEQ ID NO: 6 (5'-AGTATCTGCTCGACCAGGCGCACAAG-3 ') and SEQ ID NO: 7 (5'-GTGGAGGCGTTGGTTGGCGGTGCAAT-3') were respectively prepared at 95 ° C using PCR mastermix (iNtRON Biotechnology, Korea).
  • PCR was performed in the order of.
  • the pGEMEasy vector system (Promega, USA) was used to construct pGEMEasy-mnb E (N-term) and pGEMEasy-mnb E (C-term) vectors, respectively.
  • Hindi II restriction enzyme present at 1281bp position was used for vector construction.
  • pGEMEasy-mnb E (N-term) was cut with Hindi II restriction enzyme and pGEMEasy-mnb E (C-term) was cut with Hindlll and SpeI (Roche, USA) to prepare irrnb E (C_ term).
  • the prepared fragments were linked using DNA ligase (Bioneer, Korea) to prepare pGEMEasy-mnb E (ful 1-length) vector.
  • UAS-mnb E full l-length was produced by the following method to make a transgenic fruit flies having mnb E (full-length).
  • the pGEMEasy-mnb E (ful 1-length) vector and the UAS vector were cut with the restriction enzyme EcoRK ' Roche (USA), and the mnb E (ful 1-length) fragment and the linearized UAS vector were DNA ligase (Bioneer, Korea).
  • UAS-mnb E (ful 1-length) vector was produced (Fig. 2).
  • ACCGCCTGTTTCCACTCCGAGGATG-3 ' primer pair was denatured at 95 ° C for 5 min using PCR mastermix (iNtRON Biotechnology, Korea), 95 ° C 30 sec, 58 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min 30 sec. After turning 30 revolutions, stretched for 5 minutes at 72X, PCR was performed in the order of cooling at 4T :.
  • This PCR fragment was constructed using pGEMEasy vector system (Pr omega, USA) to construct a pGEMEasy-mnb H (N-term) vector.
  • mnb H full-length was prepared as follows using Hindi II restriction enzyme present in the 1717bp portion of mnb H.
  • pGEMEasy-mnb H N-term was cut with Hindi II restriction enzyme and pGEMEasy-mnb E (C-term) was cut with Hindi II and Spel (Roche, USA) to prepare mnb E (C-term).
  • each fragment was prepared with a pGEMEasy-mnb H (full-length) vector using DNA ligase (Bioneer, Korea).
  • UAS-mnb H full-length vector and UAS vector were cut with restriction enzyme EcoRI (Roche, USA) to produce mnb H (ful 1-length) transgenic fruit flies.
  • the Drosophila Gal4 / UAS system was used to determine the specific system of Elav-.
  • cDNA synthesis was performed by extracting the entire RNA using an easy-BLUE RNA extraction kit, filling the entire RNA 1 ⁇ and Oligo-dT 1 ⁇ (Invitrogen, USA) with distilled water up to 13, and then Superscript First-Strand Synthesis And reacted in SystemClnvitrogen, USA). 5 minutes at 65 ° C, 2 minutes at 4 ° C, 60 minutes at 50 ° C, 15 minutes at 70 ° C, was synthesized cDNA for 5 minutes banung at 4 ° C.
  • HDYRKIA primer pair of SEQ ID NO: 10 (5'-TGATTGCACCAACAGGTCCAGA— 3 ') and SEQ ID NO: ll (5'-TTCTCCCAATTCAACCGCTCA-3') and SEQ ID NO: 12 (5'-CGTGACTTCMTTGGATAAATAGCT-3 ') as a template )
  • SEQ ID NO: 13 (5 ' ⁇ GCTGAAATTGACCCTCAGGTCC-3') PCR using a minibrain primer pair and PCR Premix (Bioneer, Korea).
  • the hDYRKIA gene (FIG. 4A) and The minibrain gene (FIG. 4B) was found to significantly increase expression by about 4-5 times more than the control group (FIG. 4).
  • the Gal4 / UAS system and GeneSwitch an inducible gene expression system, were used to specifically identify hDYRKIA and minibrain genes in adults.
  • Drosophila life was measured using 100 transgenic Drosophila adults within 2 days of waking from the pupa after receiving eggs by crossing ElavGeneSwitch- Gal4 (ElavGS-Gal4) and UAS-hDYRKIA to induce expression. Lifespan measurement was performed using a medium to which RU486, which activates GeneSwitch, and a control medium, which were not added. The lifespan was measured by counting the dead bodies in the incubator every three days.
  • overexpression of hDYRKIA and minibrain was confirmed to have the same life-shortening effects as those with human Down syndrome.
  • pipette fruit flies was measured 1 rats' position in which after the unit time (30 seconds) to measure the moving distance of the fruit fly exercise capacity according to the over-expression of hDYRKIA and minibrain (locomotion activity) in a change in the.
  • UAS-minibrain-transformed Drosophila was developed using Elav-Gal4; UAS-GFP, which is a driver for expressing fluorescent proteins specifically using the Drosophila Gal4 / UAS system.
  • FIG. 7 the development of the central nervous system and the peripheral nerve system of the normal type (Elav> sytGFP) Drosophila and the neural network structure were well formed (FIG. 7A), minibrain
  • various neurodegenerative abnormalities such as developmental abnormalities of the optic lobe and ventral infarct (FIGs 7B and 7C), and abnormal neural network formation between the central and para-nerveal nervous systems (FIG. 7D)
  • FIG. 7 the phenotype of nervous system developmental abnormalities is related (FIG. 7).

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Description

【명세서】
【발명의 명칭】
인간 DYRK I A 유전자 형질전환 초파리를 이용한 치료제 스크리닝 방법
【기술분야】
본 발명은 인간 다운증후군 유전자 DYRKlA(Dual -specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A) 또는 DYRKIA 의 초파리 상동 유전자인 mini brain 유전자 형질전환 초파리， 이의 제조 방법 및 상기 형질전환초파리를 이용한 다.
【배경기술】 다운증후군 (Down Syndrome)이란 인간 21번 염색체의 삼배체 (trisomy)에 의해 발생하는 염색체 이상 질환으로 정신지체, 학습장애 및 기억감퇴， 알츠하이머 병의 조기 발병， 그리고 두개 안면 장애 등의 증상이 나타난다. 특히， 인간 염색체 21번의 '다운증후군 임계역 (Down syndrome critical region DSCR)'으로 명명된 특정부위에 존재하는 유전자들의 발현량 변화가 다운증후군 발병을 초래하는 것으로 추정된다. 이 가운데 DYRKlA(Dual_specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A)는 신경중추의 발달 및 기능에 중요한 역할을 수행하는 유전자로 다양한 단백질의 인산화에 관여하는 효소이다. 특히， 학습장애와 기억감퇴， 시냅스의 유연성 변화, 비정상적 세포주기 및 알츠하이머성 치매와 유사한 신경병리학적 증세에 관여하는 유전자로 이 단백질이 가진 생화학적 기능적， 분자생물학적 효과를 이해하는 것은 다운증후군에 관련된 질환와 병인을 규명하고 다운증후군에 관련된 신경 결함 치료제 개발에 필수적이다. 특히， 다운 증후군의 경우， 신생아 700명에 한 명 정도로 발생하는 가장 번번한 염색체 이상 증후군이다. 인종， 환경， 사회 경제적 차이에 관계없이 일정한 비율로 발생하며 산모의 나이가 35세 이상이 되면 그 발생빈도가 높아지며, 40세 이상의 산모가 출산을 할 경우， 100 명당 1명 출생 빈도를 갖는다. 현대의학으로 이러한 유전적 이상을 예방하는 방법은 존재하지 않으며 단지 출생 전에 유전자 검사를 통하여 태아의 다운증후군 여부를 확인할 수 있을 뿐이다. 다운증후군 환자의 질환 예후로 다음과 같은 공통된 신체적 특징을 가지고 있다. 모든 신체에 증상들이 나타나며 이로 인해 다운증후군 아동의 경우， 뇌기능 저하에 따른 행동 발달지체를 보인다. 환자의 30~40¾»는 심장판막 이상 같은 선천성 심장질환 (congenital heart disease) 병을 가지고 태어나며 면역력 저하에 따른 폐렴 및 백혈병， 장 폐쇄， 장염 등의 빈도도 높은 것으로 나타난다. 의료기술의 발달로 대부분의 증상이 치료 또는 예방이 가능하게 되어 다운증후군의 평균 수명이 50세까지 늘어나고 있는 추세이다. 그러나 현재까지 뇌신경계 기능저하 및 신경퇴행성 증상에 대한 치료제 개발 성과는 전무하며， 인지능력을 향상시킨다는 Piracetam의 효과도 다운증후군 아동에게서는 효과가 나타나지 않는 것으로 확인되었다 (Lobaugh, N. J. et al. (2001) . "Piracetam therapy does not enhance cognitive functioning in children with down syndrome. " Arch Pediatr Ado 1 esc Med 155: 442-448) . 따라서 다운증후군 환자의 뇌신경계 이상의 근본적인 원인 기작의 규명을 통해 치료제 개발이 시급한 것으로 사료된다. .
이를 위해서 다운증후군의 원인으로 생각되는 인간염색체 21번 전체가 아닌 21번 염색체 내의 주요 유전자에 각각에 대한 분자생물학적 병인학적 연구가 요구되며， 증상에 직접적으로 영향을 미칠 수 있는 부분을 연구한 결과 Down Syndrome Critical Region(DSCR)이라 불리는 4~5 Mb 영역에 위치한 유전자들이 뇌기능저하를 비롯한 여러 증상에 관여할 가능성이 높은 것으로 알려져 이곳에 위치한 유전자에 대한 연구가 요구된다. 다운증후군의 뇌기능저하에 대한 기존 연구를 살펴보면， 2000년 염색체 21번의 염기서열이 해독되어 적어도 225개의 유전자가 존재함을 밝혔다 (HaUori, M. ' et al . (2000). "The DNA sequence of human chromosome 21." Nature 405： 311-319). 특히， 과다 발현에 의해서 뇌기능저하의 원인으로 예상되는 후보 유전자가 시공간적인 발현양상 및 신경계 (뇌)에서의 역할 등을 근거로 다수 발굴 되었다 (Benavidesᅱ Piccione, R. et al . (2004) . "On dendrites in Down syndrome and DS murine models-' a spiny way to learn. " Prog Neurobiol 74: 111-126； Altafaj , X. et al . (2001). "Neurodevelopmental delay, motor abnormalities and cognitive deficits in transgenic mice overexpressing DyrklA (minibrain) , a murine model of Down's syndrome . " Hum Mol Genet 10: 1915-1923； Epstein, C.J. et al. (1987) . "Transgenic mice with increased Cu/Znᅳ super oxide dismutase activity: animal model of dosage effects in Down syndrome." Proc Natl Acad Sci U S A 84： 8044-8048； Lamb, B.T. et al. (1993) . "Introduction and expression of the 400 ki lobase amyloid precursor protein gene in transgenic mice. " Nat Genet 5: 22ᅳ 30.; Chrast , R. et al. (2000) . "Mice trisomic for a bacterial artificial chromosome with the single-minded 2 gene (Sim2) show phenotypes similar to some of those present in the partial trisomy 16 mouse mode 1 s of Down syndrome . " Hum Mol> Genet 9： 1853-1864). 이들 유전자들 가운데 DYRK1A의 경우 형질전환 생쥐가 다운증후군에서 보이는 학습과 기억능력 저.하를 보이는 주요 유전자의 하나로 알려져 있다 (Smith, D.J. et al . (1997). "Functional screening of 2 Mb of human chromosome 21q22.2 in transgenic mice implicates minibrain in learning defects associated with Down syndrome . " Nat Genet 16: 28-36； Altafaj , X. et al . (2001). "Neur odeve 1 opment a 1 delay, motor abnormal i ties and cognitive deficits in transgenic mice overexpressing DyrklA (minibrain) , a murine model of Down's syndrome . " Hum Mol Genet 10: 1915-1923) . 기존의 DYRK1A 형질전환 생쥐는 두 가지의 모델로 제시되었으며， 첫 번째로 DYRK1A를 인접 부위를 포함한 YACXYeast Artificial Chromosome) 백터를 도입하여 제작한 생쥐이며 (Smith, D. J. et al . (1997). "Functional screening of 2 Mb of human chromosome 21q22.2 in transgenic mice implicates minibrain in learning defects associated with Down syndrome. " Nat Genet 16(1): 28-36), 두 번째는 DYRJUA의 cDNA만 도입된 형질전환 생쥐로 외래의 프로모터 (promoter)를 이용하여 발현시킨 모델이다 (Altafaj , X. et al. (2001) . " Neur odeve 1 opment a 1 delay, motor abnormal it ies and cognitive deficits in transgenic mice overexpressing DyrklA (minibrain) , a murine model of Down's syndrome . " Hum Mol Genet 10: 1915-1923). 그러나, 상기 YAC 백터가 도입된 형질전환 생쥐는, YAC 백터에 DYRK1A 이외의 다수의 유전자가 포함되어 있어 유전자 특이적인 효과 및 치료제 스크리닝에 타 유전자의 방해현상을 배제할 수 없는 문제점이 있으며， 외래 프로모터를 이용하여 DYRK1A cDNA 발현을 유도하는 형질전환 생쥐에서는 발현양상이 원래의 유전자와 동일하지 못하며， 형질전환 생쥐의 질환 특이적인 표현형이 약하여 약물 스크리닝에 이용하기에는 한계가 있는 것으로 사료된다. 최근 인간의 hDYRKIA의 YAC 백터를 이용한 형질전환 생쥐가 개발되어 다운증후군 치료제 개발의 스크리닝 모델로 제시가 된바 있다 (Ahn, KJ., et al. (2006). "DYRK1A BAC transgenic mice show altered synaptic plasticity with learning and memory defects." Neurobiol Dis. 22(3) :463-72) . 그러나, 약물 스크리닝에 이용되는 생쥐 모델의 비용 및 시간상의 한계점이 있는 것으로 판단된다. 초파리 모델은 인간의 질병 유전자의 80% 이상이 잘 보존되어 있으며， 이전의 많은 연구결과들도 초파리가 인간의 질병에 대한 증상이 같고， 저렴한 비용으로 대량의 신약 스크리닝이 가능한 장점을 가지고 있어 신약개발에 대한 이용가치가 높음을 보고하고 있다 (Giacomotto J et al.(2010) Br J Pharmacol. 160(2) :204-16).
특히 초파리의 minibrain '유전자는 DYRK1A의 초파리 상동 유전자로 신경발달에 관계가 있음이 최초로 보고된 DYRK1A군의 유전자로 배아단계에서부터 성체의 신경계에 다량 발현하는 것으로 알려져 있으며， 특히, 초파리의 기억과 학습을 담당하는 버섯모양체 (mushroom body)를 포함하여 다양한 신경조직에 발현되는 것으로 확인되었다. 또한， minibrain 돌연변이 초파리의 경우 정상 초파리에 비해 뇌조직의 크기가 유의적으로 감소하며， 행동장애를 보이는 것으로 확인되어 초파리의 DYRK1A인 minibrain 유전자가 뇌신경계 기능에 중요한 기능을 보유하는 것을 보고한 바 있다 (Tejedor, F., et al . (1995) . "minibrain: a new protein kinase family involved in post embryonic neurogenesis in Drosophi la. " Neuron 14： 287-301) . 이에, 본 발명자들은 다운증후군 증상 조절에 관한 근본적인 치료제 개발을 위해 노력한 결과, 본 발명자들은 인간 다운증후군 유전자 DYRK1A (Dual-specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A) 또는 상기 DYRK1A의 초파리 상동 유전자인 minibrain 유전자가 형질전환된 초파리를 제조한 후， 상기 형질전환된 초파리가 신경계 특이적으로 hDYRKIA을 과다발현하여 수명 단축 및 운동능력 감소 현상을 나타내는 것을 확인함으로써， 상기 형질전환된 초파리를 다운증후군 관련 표현형을 치료하기 위한 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할수 있음을 밝힘으로써， 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】 본 발명의 목적은 1) 인간 DYRKlA(Dual -specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A) 또는 minibrain 유전자를 포함하는 백터를 제조하는 단계 ; 및
2) 상기 단계 1)의 백터를 초파리에 형질전환시키는 단계를 포함하는 다운증후군 유전자 형질전환 초파리 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 제조방법으로 제조된 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 다운증후군 유전자 형질전환 초파리흩 이용하여 다운증후군 관련 표현형을 치료하기 위한 조성물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 이용하여 다운증후군 관련 표현형 동물 모델을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 기억 및 학습기능 저하, 수명단축， 운동 능력 저하， 및 신경계 발달 장애 예방 '및 개선용 조성물의 스크리닝에 사용하기 위한 본 발명의 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 제공한는 것이다. 【기술적 해결방법】 상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은
1) 인간 DYRKlA(Dual -specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A) 또는 minibrain유전자를 포함하는 백터를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 백터를 초파리에 형질전환시키는 단계를 포함하는 다운증후군 유전자 형질전환 초파리 제조방법을 제공한다.
또한， 본 발명은,
1) 본 발명의 다운증후군 유전자 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 상기 형질전환 초파리에서 hDYRKIA또는 minibrain유전자 발현변화를 측정하는 단계; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 hDYRKIA 또는 minibrain 유전자 발현을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 기억 및 학습기능 저하 개선용 조성불 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 실험군으로 제 6항의 형질전환초파리에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 본 발명의 제조방법으로 제조된 형질전환 초파리에서 초파리의 기억 및 학습기능을 측정하는 단계; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)에서 측정한 초파리의 초파리의 기억 및 학습기능을 증가시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 기억 및 학습기능 개선용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은，
1) 실험군으로 제 6항의 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 본 발명의 제조방법으로 제조된 형질전환 초파리에서 hDYRKIA 또는 minibrain 유전자 발현변화를 측정하는 단계 ; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 hDYRKIA 또는 minibrain 유전자 발현을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 수명단축 개선용 초성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은， 1) 실험군으로 본 발명의 다운증후군 유전자 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 상기 형질전환 초파리에서 초파리의 수명을 측정하는 단계 ; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)에서 측정한 초파리의 수명을 연장시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 수명단축 예방 및 개선용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은，
1) 실험군으로 제 6항의 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 본 발명의 제조방법으로 제조된 형질전환 초파리에서 hDYRKIA 또는 minibrain 유전자 발현변화를 측정하는 단계 ; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단 2)의 hDYRKIA 또는 minibrain 유전자 발현을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 운동기능 저하 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한 본 발명은，
1) 실험군으로 본 발명의 다운증후군 유전자 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계 ;
2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 상기 형질전환 초파리에서 운동능력을 측정하는 단계; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)에서 측정한 초파리의 운동능력을 증가시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 운동능력 저하 예방 및 개선용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은,
1) 실험군으로 제 6항의 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 제 6항의 형질전환 초파리에서 hDYRKlA또는 minibrain유전자 발현변화를 측정하는 단계; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 hDYRKlA 또는 minibrain 유전자 발현을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 신경발달 장애 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은，
1) 실험군으로 제 6항의 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는' 단계;
2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 본 발명의 제조방법으로 제조된 형질전환 초파리에서 신경발달 수준을 측정하는 단계; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)에서 측정한 초파리의 신경발달 수준을 증가시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 신경발달 . 장애 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 기억 및 학습기능 저하, 수명단축， 운동 능력 저하, 및 신경계 발달 장애 동물 모델 동물로 사용하기 위한 본 발명의 제조방법으로 제조된 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 제공한다.
아울러， 본 발명은 기억 및 학습기능 저하， 수명단축， 운동 능력 저하, 및 신경계 발달 장애 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝에 사용하기 위한 본 발명의 제조방법으로 제조된 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 제공한다. 【유리한 효과】
본 발명의 인간 다운증후군 유전자 (DYRK1A) 또는 minibrain 유전자가 형질전환된 초파리는 신경계 특이적으로 hDYRKlA을 과다발현하여 수명 단축 및 운동능력 감소 현상을 나타내고， 기존의 생쥐모델과 비교하여 조작이 용이하고， 경제성이 우수하며 다운증후군 증상을 쉽게 관찰할 수 있는 표현형을 나타내므 로 효과적으로 다운증후군 관련 표현형치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용 될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
보 1은 DYRKlACDual-specif ic tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A) 발현 백터를 제작하는 방법을 나타낸 도이다.
도 2는 minibrain E 발현 백터를 제작하는 방법을 나타낸 도이다. 도 3은 minibrain H 발현 백터를 제작하는 방법을 나타낸 도이다. 도 4는 hDYRKlA 및 minibrain 형질전환 초파리의 유전자 과발현 효과 확인한 도이다:
E lav-Gal 4: 대조군초파리；
Elav>hDYRKW 인간다운증후군 hDYRKlA 형질전환 초파리 ;
Elav>mini brain. 초파리 minibrain 형질전환 초파리 ; 및
Elav>minibrain-H: 초파리 minibrain-H 형질전환 초파리 .
도 5는 hDYRKl 및 minibrain 유전자에 의한 초파리 수명 단축효과를 확인한 도이다:
ElvaGS>hDYRKlA-RU: hDYRKlA 유전자의 발현을 유도하지 않은 대조군 초파리;'
ElvaGS>hDYRKlA+RU: hDYRKlA 유전자 과발현 초파리；
ElvaGS>mnb-RU: minibrain 유전자의 발현을 유도하지 않은 대조군 초파리 ; 및
ElvaGS>mnb+RU: minibrain유전자 과발현 초파리 ;
도 6은 hDYRKl 및 minibrain 유전자에 의한 초파리 운동 능력 변화를 확인한 도이다:
ElvaGS>hDYRKlA-RU: hDYRKlA 유전자의 발현을 유도하지 않은 대조군 초파리； ElvaGS>hDYRKlA+RU: hDYRKlA유전자 과발현 초파리；
ElvaGS>mnb-RU: minibrain 유전자의 발현을 유도하지 않은 대조군 초파리； 및
ElvaGS>mnb+RU: minibrain유전자 과발현 초파리 ;
도 7은 minibrain 유전자 발현에 의한 초파리 신경계 발달양상을 분석한 도이다:
Elva>syt-GFP: 대조군 초파리；및
Elva>syt-GFP;minibrain: minibrain유전자 형질전환 초파리 . 【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 ·
1) 인간 DYRKlACDual-specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A) 또는 minibrain유전자를 포함하는 백터를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 백터를 초파리에 형질전환시키는 단계를 포함하는 다운증후군 유전자 형질전환 초파리 제조방법을 제공한다.
또한， 본 발명의 상기 제조방법으로 제조된 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 제공한다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 단계 1)의 DYRK1A 유전자는 서열번호
1로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 서열에서 하나 또는 둘 이상의 염기가 결실， 첨가 또는 치환된 서열로 구성될 수 있다.
상기 단계 1)의 minibrain 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 서열에서 하나 또는 둘 이상의 염기가 결실， 첨가 또는 치환된 서열로 구성될 수 있다.
상기 단계 1)의 백터는 인간 DYRK1A 유전자 또는 minibrain 유전자를 포함하는 것이 바람직하나， DYRK 유전자의 서브타입 (subtype)인 DYRK1B, DYRK2 또는 DYRK4 유전자를 포함할 수도 있다.
상기 단계 2)의 백터는 UAS 백터인 것이 바람직하고， 인간 DY K1A 또는 minibrain 유전자를 포함하는 UAS 백터는 P-인자 매개 생식세포 형질전환방법 (P—element— mediated germ line transformat k>n)을 이용하여 초파리에 도입되는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 2)의 초파리는 노 초 ^^ drosophi la meIanogaster)0 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 다운증후군 발병 유전자로 알려진 인간 DYRK1A 유전자 또는 이의 초파리 상동 유전자인 minibrain 유전자를 포함하는 형질전환 초파리를 제조하기 위하여， DYRK1A 및 minibrain유전자를 포함하는 발현 백터를 제조한 다음， P-인자 매개 생식세포 형질전환 (P—element—mediated germ line transformat ion)을 통해 UAS— hDYRKlA와 UAS-minibrain 발현 백터로 형질전환된 초파리를 제조하였다 (도 1 내지 도 3 참조).
또한, 본 발명자들은 hDYRKlA 형질전환 초파리 및 minibrain 형질전환 초파리가 각각 hDYRKlA 및 minibrain 유전자의 발현을 유도할 수 있는지 확인하기 위하여, Gal4/UAS 시스템을 이용하여 DYRK1A 및 minibrain 유전자를 각각 과발현시킨 결과， DYRK1A 및 minibrain 유전자가 형질전환된 초파리는 hDYRKlA 유전자 (도 4A 참조) 및 minibrain 유전자 (도 4b 참조)가 대조군에 비해 약 4-5배 이상 유의적으로 발현이 증가되는 것을 확인하였다 (도 4 참조).
' 또한， 본 발명자들은 hDYRKl 및 minibrain 유전자에 의한 초파리 수명 단축효과를 확인하기 위하여， Gal4/UAS 시스템을 이용하여 DYRK1A 및 minibrain 유전자를 각각 과발현시킨 결과 DYRK1A 및 minibrain 유전자의 발현이 유도된 형질전환초파리는 대조군과 비교하여 인간 다운 증후군 환자와 같은 수명 단축 효과가 있는 것이 확인하였다 (도 5 참조).
또한， 본 발명자들은 hDYRKl 및 minibrain 유전자에 의한 초파리 운동능력 변화를 확인하기 위하여， Gal4/UAS 시스템을 이용하여 DYRK1A 및 minibrain 유전자를 각각 과발현시킨 결과， DYRK1A 및 minibrain 유전자의 발현이 ᅳ유도된 형질전환초파리는 대조군과 비교하여 운동 능력 감소가 현저하게 증가되는 것을 확인하였다 (도 6 참조).
아울러, 본 발명자들은 minibrain 유전자 발현에 의한 초파리 신경계 발달을 측정하기 위하여, GFP 형광물질을 이용하여 측정한 결과， minibrain 유전자가 과발현된 경우， 다양한 신경 발생 이상이 확인되어 인간 다운증후군의 뇌신경계 이상과 minibrain 유전자 과발현에 의한 신경계 이상이 연관이 있음을 확인하였다 (도 7 참조).
따라서, 본 발명의 다운증후군 유전자 (DYRK1A 또는 minibrain)가 형질전환된. 초파리는 신경계 특이적으로 hDYRKIA 또는 minibrain을 과다발현하여 수명 단축 및 운동능력 감소 현상을 나타내고, 기존의 생쥐모델과 비교하여 조작이 용이하고， 경제성이 우수하며 다운증후군 증상을 쉽게 관찰할 수 있는 표현형을 나타내므로 효과적으로 다운증후군 관련 표현형 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은,
1) 본 발명의 다운증후군 유전자 형질전환 초파리에 피검물질을 ' 처리하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 상기 형질전환 초파리에서 hDYRKlA또는 minibrain 유전자 발현변화를 측정하는 단계; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 hDYRKlA 또는 minibrain 유전자 발현을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 기억 및 학습기능 저하 개선용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은
1) 실험군으로 제 6항의 형질전환 초파리에 피검물질을 처라하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 본 발명의 제조방법으로 제조된 형질전환 초파리에서 초파리의 기억 및 학습기능을 측정하는 단계; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)에서 측정한 초파리의 초파리의 기억 및 학습기능을 증가시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 기억 및 학습기능 개선용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법에 있어서， hDYRKlA 또는 minibrain 유전자 발현변화는 DNA 칩， 웨스턴 블랏 (western blot), 면역조직화학법, 효소결합면역흡착검사 (ELISA), 방사성 동위원소면역측정법 (RIA) 중합효소증폭법 (PCR), 역전사 중합효소 연쇄반웅 (Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction, RT-PC ) , 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느하나의 방법으로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
- 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 hDYRKlA 형질전환 초파리 및 minibrain 형질전환 초파리가 각각 hDYRKlA 및 minibrain 유전자의 발현을 유도할 수 있는지 확인하기' 위하여， Gal4/UAS 시스템을 이용하여 DYRK1A 및 minibrain 유전자를 각각 과발현시킨 결과， DYRK1A 및 minibrain 유전자가 형질전환된 초파리는 hDYRKlA 유전자 (도 4A 참조) 및 minibrain 유전자 (도 4b 참조)가 대조군에 비해 약 4-5배 이상 유의적으로 발현이 증가되는 것을 확인하였다 (도 4 참조). 또한， 본 발명은，
1) 실험군으로 제 6항의 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 본 발명의 제조방법으로 제조된 형질전환 초파리에서 hDYRKIA 또는 minibrain 유전자 발현변화를 측정하는 단계; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 hDYRKIA 또는 minibrain 유전자 발현을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 수명단축 개선용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은，
1) 실험군으로 본 발명의 다운증후군 유전자 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계 ;
2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 상기 형질전환 초파리에서 초파리의 수명을 측정하는 단계 ; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)에서 측정한 초파리의 수명을 연장시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 수명단축 예방 및 개선용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, hDYRKIA 또는 minibrain 유전자 발현변화는 DNA 칩， 웨스턴 블랏 (western blot), 면역조직화학법， 효소결합면역흡착검사 (ELISA), 방사성 동위원소면역측정법 (RIA), 중합효소증폭법 (PCR), 역전사 중합효소 연쇄반웅 (Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) , 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느하나의 방법으로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 hDYRKl 및 minibrain 유전자에 의한 초파리 수명 단축효과를 확인하기 위하여， Gal4/UAS 시스템을 이용하여 DYRK1A 및 minibrain 유전자를 각각 과발현시킨 결과， DYRK1A 및 minibrain 유전자의 발현이 유도된 형질전환초파리는 대조군과 비교하여 인간 다운 증후군 환자와 같은 수명 단축 효과가 있는 것이 확인하였다 (도 5 참조). 또한， 본 발명은，
1) 실험군으로 제 6항의 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계 ;
2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 본 발명의 제조방법으로 제조된 형질전환 초파리에서 hDYRKIA 또는 minibrain 유전자 발현변화를 측정하는 단계 ; 및 '
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 hDYRKIA 또는 minibrain 유전자 발현을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 운동기능 저하 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은，
1) 실험군으로 본 발명의 다운증후군 유전자 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계 ;
2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 상기 형질전환 초파리에서 운동능력을 측정하는 단계; 및
3) .무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)에서 측정한 초파리의 운동능력을 증가시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 운동능력 저하 예방 및 개선용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법에 있어서， hDYRKIA 또는 minibrain 유전자 발현변화는 DNA 칩, 웨스턴 블랏 (western blot), 면역조직화학법， 효소결합면역흡착검사 (ELISA), 방사성 동위원소면역측정법 (RIA), 중합효소증폭법 (PCR) , 역전사 중합효소 연쇄반웅 (Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) , 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느하나의 방법으로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 hDYRKl 및 minibrain 유전자에 의한 초파리 운동능력 변화를 확인하기 위하여， Gal4/UAS 시스템을 이용하여 DYRK1A 및 minibrain 유전자를 각각 과발현시킨 결과, DYRK1A 및 minibrain 유전자의 발현이 유도된 형질전환초파리는 대조군과 비교하여 운동 능력 감소가 현저하게 증가되는 것을 확인하였다 (도 6 참조). 또한， 본 발명은，
1) 실험군으로 제 6항의 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계 ;
2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 제 6항의 형질전환 초파리에서 hDYRKIA또는 minibrain유전자 발현변화를 측정하는 단계； 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 hDYRKIA 또는 minibrain 유전자 발현을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 신경발달 장애 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은，
1) 실험군으로 제 6항의 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계 ;
2) 상기 단계 1)의 쩌검물질이 처리된 본 발명의 제조방법으로 제조된 형질전환 초파리에서 신경발달 수준을 측정하는 단계; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)에서 측정한 초파리의 신경발달 수준을 증가시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 신경발달 장애 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법에 있어서， hDYRKIA 또는 minibrain 유전자 발현변화는 DNA 칩， 웨스턴 블랏 (western blot), 면역조직화학법， 효소결합면역흡착검사 (ELISA), 방사성 동위원소면역측정법 (RIA), 증합효소증폭법 (PCR)， 역전사 중합효소 연쇄반웅 (Reverse Transcr ipt ion- Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) , 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느하나의 방법으로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 hDYRKl 및 minibrain 유전자에 의한 초파리 신경 발달 양상를 확인하기 위하여， Gai4/UAS 시스템을 이용하여 DYRK1A 및 minibrain 유전자를 각각 과발현시킨 결과, DYRK1A 및 minibrain 유전자의 발현이 유도된 형질전환초파리는 대조군과 비교하여 신경발달에 발생이상이 생기는 것을 확인하였다 (도 7 참조).
따라서， 본 발명의 다운증후군 유전자 (DYRK1A 또는 minibrain)가 형질전환된 초파리는 신경계 특이적으로 hDYRKIA 또는 minibrain을 과다발현하여 수명 단축 및 운동능력 감소 현상을 나타내고， 기존의 생쥐모델과 비교하여 조작이 용이하고， 경제성이 우수하며 다운증후군 증상을 쉽게 관찰할 수 있는 표현형을ᅵ나타내므로 효과적으로 다운증후군 관련 표현형 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은 기억 및 학습기능 저하 동물 모델 동물로 사용하기 위한 본 발명의 제조방법으로 제조된 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 제공한다.
또한， 본 발명은 수명단축 모델 동물로 사용하기 위한 본 발명의 제조방법으로 제조된 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 제공한다 .
또한， 본 발명은 운동능력 저하 모델 동물로 사용하기 위한 본 발명의 제조방법으로 제조된 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 제공한다.
^한， 본 발명은 신경계 발달 장애 모델 동물로 사용하기 위한 본 발명의 제조방법으로 제조된 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 제공한다. 또한， 본 발명은 기억 및 학습기능 저하 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝에 사용하기 위한 본 발명의 제조방법으로 제조된 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 제공한다.
또한， 본 발명은 수명단축 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝에 사용하기 위한 본 발명의 제조방법으로 제조된 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 제공한다.
또한， 본 발명은 운동기능 저하 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝에 사용하기 위한 본 발명의 제조방법으로 제조된 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 제공한다.
아울러, 본 발명은 신경발달 장애 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝에 사용하기 위한 제 본 발명의 제조방법으로 제조된 다운증후군 유전자 형질전환 초파리를 제공한다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>초파리 준비 및 사육
초파리는 25°C를 유지한 상태쎄서 사육하였고， 대조군으로 사용한 E lav-Gal 4 및 Elav-GeneSw itch-Gal 4 형질전환 초파리는 Lee, ks. , et al 등이 발표한 '내용에 기재되어 있다 (Lee, KS. , et al. , (2009), J. Biol. Chem 284(43) :29454-61). 또한， UAS-hDYRKlA와 UAS-minibrain 형질전환 초파리는 하기 <실시예 2〉에 기재한 방법에 따라 제작하여 사용하였다. <실시예 2> UAS-hDYRKlA및 UAS-minibrain형질전환 초파리의 제조 <2-l> DYRK1A발현 백터의 클로닝
인간의 다운증후군 DYRKlA(Dual-specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A) .유전자를 가지는 형질전환 초파리를 제작하기 위하여 pENTR223.1 vector (Invitrogen, 미국)에 인간의 DYRK1A 유전자 (Genebank number： BC156309; 서열번호 1)가 들어있는 cDNA cloneCOpenbiosystem, 미국)을 구입한 후, 게이트웨이 시스템 (Gateway system)을 이용하여 하기와 같은 방법으로 클로닝을 수행하였다.
구체적으로， pENTR223.1-DYRKlA 백터 150 ng과 UAS 백터 150 ng을 섞어 TE 버퍼 (buffer)로 8 까지 채운 후， LR Clonase II 효소 (Invitrogen, 미국)를 2≠ 넣어 25°C에서 1시간 동안 반웅시킴으로써 UAS-DYRK1A 백터를 제작하였다 (도 1).
<2-2> minibrain E발현 백터의 클로닝
DYRK1A 유전자의 초파리 상동 유전자인 Drosophila minibrain E를 가지는 형질전환 초파리를 제작하기 위하여， mnb E (Genebank number :NM_167581.2； 서열번호 2) 염기서열을 토대로 하기와 같이 클로닝을 수행하였다. .
구체적으로， 먼저 초파리로부터 easy-BLUE RNA extraction kit(iNtR0N
Biotechnology, 한국)를 이용하여 전체 RNA를 추출한 후， 전체 RNA 3 /g과 01igo-dT 1 /^(Invitrogen, 미국)에 증류수를 13 까지 채운 후， Superscript
First-Strand Synthesis System( Invitrogen, 미국)올 이용하여 반응시켰다. 그런 다음， 65°C에서 5분， 4°C에서 2분， 50°C에서 60 분， 70°C에서 15 분간 반웅하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA 1 ^을 주형으로 하여， mnb E (N- term)의 분리를 위해 서열번호 4(5'-CCATGTATAGATTAGAGGATACGMTAG-3' ) 및 서열번호 5(5'-ACCa:CTGTTTCCACTCCGAGGATG-3')의 프라이머 쌍과 mnb E (C- term)의 분리를 위하여 서열번호 6(5'-AGTATCTGCTCGACCAGGCGCACAAG-3' ) 및 서열번호 7(5'-GTGGAGGCGTTGGTTGGCGGTGCAAT-3')의 프라이머 쌍을 각각 PCR mastermix(iNtRON Biotechnology, 한국)를 이용하여 95°C에서 5 분 동안 변성해 주고， 95°C 30 초， 58 °C 30 초， 72°C 1 분 30 초의 조건으로 30 회전을 돌린 후, 72°C에서 5 분 동안 신장시켜준 뒤， 4°C에서 넁각의 순서로 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻어진 DNA 단편을 pGEMEasy vector system(Promega, 미국)을 이용하여 각각 pGEMEasy-mnb E(N-term)과 pGEMEasy-mnb E(C-term) 백터를 제작하였다ᅳ mnb E의 full-length 0RF를 가지는 백터 제작올 위하여 1281bp 위치에 존재하는 Hindi II 제한효소를 이용하였다. pGEMEasy-mnb E (N- term)을 Hindi II 제한효소로 잘라 준비하고， pGEMEasy-mnb E(C-term)을 Hindlll와 SpeI(Roche, 미국)으로 잘라 irrnb E(C_ term) 부분을 준비하였다. 각각 준비된 단편들은 DNA ligase(Bioneer, 한국)를 이용하여 연결함으로써 pGEMEasy-mnb E(ful 1-length) 백터를 제작하였다.
또한， mnb E(full-length)를 가지는 형질전환초파리를 만들기 위하여 하기와 같은 방법으로 UAS-mnb E(ful l-length)를 제작하였다.
구체적으로， pGEMEasy-mnb E(ful 1-length) 백터와 UAS 백터를 제한효소 EcoRK'Roche, 미국)으로 잘라 mnb E(ful 1-length) 단편과 선형화된 UAS 백터를 DNA ligase(Bioneer, 한국)를 사용하여 UAS-mnb E(ful 1-length) 백터를 제작하였다 (도 2).
<2-3> minibrain H발현 백터의 클로닝
DYRK1A 유전자의 초파리 상동 유전자인 Drosophila minibrain H를 가지는 형질전환 초파리를 제작하기 위하여， mnb HCGenebank number： NM_170659.2; 서열번호 3) 염기서열을 바탕으로 클로닝을 수행하였다. mnb H (N-term) 분리를 위하여 상기 초파리 cDNA 1 βΐ을 주형으로 하여， 서열번호 8(5 ' -GCGATTCCGATTGCCAGTGATATGT-3 ' ) 및 서열번호 9(5'-
ACCGCCTGTTTCCACTCCGAGGATG-3' ) 프라이머 쌍을 PCR mastermix(iNtRON Biotechnology, 한국)를 이용하여 95°C에서 5 분 동안 변성해 주고， 95 °C 30 초， 58°C 30 초， 72°C 1 분 30 초의 조건으로 30 회전을 돌린 후， 72X에서 5 분 동안 신장시켜준 뒤, 4T：에서 냉각의 순서로 PCR을 수행하였다. 이 PCR 단편을 pGEMEasy vector sys t em (Pr omega, 미국)을 사용하여 pGEMEasy-mnb H(N- term) 백터를 제작하였다. mnb H의 Oterm 부분은 mnb E(Oterm)과 같은 염기서열로 이루어져 있으므로 mnb H(C-term) 을 분리하는 대신 mnb E(C-term) 을 사용하였다. mnb H(full-length)는 mnb H의 1717bp 부분에 존재하는 Hindi II 제한효소를 이용하여 하기와 같이 제작하였다. pGEMEasy-mnb H (N- term)을 Hindi II 제한효소로 잘라 준비하고， pGEMEasy-mnb E (C—term)을 Hindi II와 Spel (Roche, 미국)으로 잘라 mnb E (C-term)부분을 준비한 후， 각각의 단편들을 DNA ligase (Bioneer, 한국)를 이용하여 pGEMEasy-mnb H (full-length) 백터를 제작하였다.
또한， mnb H (ful 1-length)를 가지는 형질전환 초파리를 제작하기 위하여 pGEMEasy-mnb H(ful 1— length) 백터와 UAS 백터를 제한효소 EcoRI (Roche, 미국)으로 잘라 mnb H(ful 1-length) 단편과 선형화된 UAS 백터를 DNA ligase (Bioneer, 한국)를 이용하여 연결함으로써 UAS-mnb H (full-length) 백터를 제작하였다 (도 3).
.
<2-4> hDYRKlA 및 minibrain 발현 백터의 초파리 형질 전환
상기 실시예 <2-2> 및 <2— 3>에서 제조된 hDYRKlA 및 minibrain 발현 백터를 초파리에 형질전환하기 위하여， 공지의 방법인 Pᅳ인자 매개 생식세포 형질전환 (P_element一 mediated germ line transforaat k>n)을 통해 UAS一 hDYRKlA와 UAS-minibrain 발현 백터로 형질전환된 초파리를 수득하였다 [Rubin GM et a/. (1982) Genetic transformation of Drosophi la with transposable element vectors. 357 Science 218: 348ᅳ 353] .
<2-5> hDYRKIA 및 minibrain 형질전환 초파리의 유전자 과발현 효과 확인
상기 실시예 <2-4>에서 제조된 hDYRKIA 형질전환 초파리 및 minibrain 형질전환 초파리가 각각 hDYRKIA 및 minibrain 유전자의 발현을 유도할 수 있는지 확인하기 위하여 초파리의 Gal4/UAS 시스템을 이용하여 신경계 특이적인 Elav-Gal4에 각각 UAS-hDYRKIA 형질전환 초파리와 UAS—minibrain 형질전환 초파리를 교배한 후 얻어진 Elav>hDYRKlA, Elav>minibrain과 대조군인 Elav-Gal4 초파리의 머리를 분리하여 cDNA를 합성한 후 hDYRKIA 프라이머 및 minibrain프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
구체적으로， cDNA의 합성은 easy-BLUE RNA extraction kit를 이용하여 전체 RNA를 추출한 뒤， 전체 RNA 1 ^과 Oligo-dT 1 ^(Invitrogen, 미국)에 증류수를 13 까지 채운 후， Superscript First-Strand Synthesis SystemClnvitrogen, 미국)에 넣어 반응시켰다. 65°C에서 5분， 4°C에서 2분， 50°C에서 60 분， 70°C에서 15 분, 4°C에서 5 분간 반웅하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA 1 βί을 주형으로 하여， 서열번호 10(5'-TGATTGCACCAACAGGTCCAGA— 3')과 서열번호 ll(5'-TTCTCCCAATTCAACCGCTCA-3')의 hDYRKIA 프라이머 쌍 및 서열번호 12(5'-CGTGACTTCMTTGGATAAATAGCT-3')와 서열번호 13(5 'ᅳ GCTGAAATTGACCCTCAGGTCC-3') minibrain 프라이머 쌍 및 PCR Premix(Bioneer , 한국)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 95°C에서 5 분 동안 변성해 주고, 95 °C 30 초， 60°C 30 초, T C 30 초의 조건으로 30 회전을 돌린 후, 72°C에서 5 분 동안 신장시켜준 뒤， 4°C에서 냉각의 순서로 수행하였다.
그 결과， 도 4에 나타낸 바와 같이， hDYRKIA 유전자 (도 4A) 및 minibrain 유전자 (도 4b)는 대조군에 비해 약 4-5배 이상 유의적으로 발현이 증가되는 것을 확인하였다 (도 4).
<실험예 1> hDYRKl 및 minibrain유전자에 의한초파리 수명 단축효과 확인
hDYRKl 및 minibrain 유전자에 의한 초파리 수명 단축효과를 확인하기 위하여, Gal4/UAS 시스템 및 유도성 유전자 발현 (inducible gene expression) 시스템인 유전자 스위치 (GeneSwitch)를 이용하여 성체의 신경계 특이적으로 hDYRKIA 및 minibrain 유전자의 발현을 유도하기 위해 ElavGeneSwitch- Gal4(ElavGS-Gal4)와 UAS-hDYRKIA를 교배하여 알을 받은 후 번데기에서 깨어난 2일 이내의 형질전환 초파리 성체 100마리를 이용하여 초파리 수명을 측정하였다. 수명 측정은 유전자 스위치 (GeneSwitch)를 활성화시키는 RU486이 첨가된 배지와 첨가되지 않은 대조군 배지를 이용하였으며 3일 단위로 배양기 내에 사체를 개수하여 수명 측정을 실시하였다.
그 결과， 도 5에 나타낸 바와 같이 유전자 발현을 유도하지 않은 대조군 (ElavGS>hDYRKlA-RU, Max i am lifespan=57, Midian Li fespan=34)에 비해서 hDYRKIA 유전자 과발현 (ElavGS>hDYRKlA+RU, Max i am lifespan=45, Midian Li fespan=22)에 의해 유의적으로 수명이 단축되는 것을 확인하였다 (도 5A) . 또한， minibrain 과발현 (ElavGS>minibrain+RU, Max i am 1 i fespan=36, Midian Lifespan=19)에 의해서도 유의적으로 수명이 단축되는 것으로 확인되어 (도 5B),. 초파리에서 hDYRKIA 및 minibrain의 과발현에 의해서 인간 다운 증후군 환자와 같은 수명 단축 효과가 있는 것이 확인하였다.
<실험예 2> hDYRKl 및 minibrain유전자에 의한 초파리 운동 능력 변화 확인 hDYRKl 및 minibrain 유전자에 의한 초파리 운동 능력 변화 확인하기 위하여， Gal4/UAS 시스템 및 유도성 유전자 발현 (inducible gene expression) 시스템인 유전자 스위치 (GeneSwitch)를 이용하여 성체의 신경계 특이적으로 hDYRKIA 및 minibrain 유전자의 발현을 유도하기 위해 ElavGeneSw itch-Gal 4 (ElavGS-Gal4)와 UAS-hDYRKIA를 교배하여 알을 받은 후 번데기에서 깨어난 2일 이내의 형질전환 초파리 성체를 유전자 스위치 (GeneSwitch)를 활성화시키는 RU486이 첨가된 배지와 첨가되지 않은 대조군 배지를 이용하여 30일까지 배양한 후 30일이 된 성체를 이용하여 입구가 막힌 10ml 피펫에 초파리를 1마리씩' 위치시킨 후 단위시간 (30초) 내의 초파리의 이동거리를 측정하여 hDYRKIA 및 minibrain의 과발현에 따른 운동 능력 (locomotion activity) 변화를 측정하였다.
그 결과， 도 6에 나타낸 바와 같이 hDYRKIA 및 minibrain 과발현에 따라 노화에 따른 운동 능력 감소가 현저하게 증가되는 것올 확인하였다 (도 6).
<실험예 3> minibrain유전자 발현에 의한초파리 신경계 발달분석
minibrain 유전자 발현에 의한 초파리 신경계 발달을 분석하기 위하여, 초파리의 Gal4/UAS 시스템을 이용하여 신경계 특이적으로 형광단백질이 발현되는 driver인 Elav-Gal4;UAS-GFP를 이용하여 UAS-minibrain 형질전환 초파리를 교배한후 얻어진 Elav>GFP:minibrain과 대조군인 Elav>GFP 초파리의 배아를 24시간 동안 수집한 후 난각을 탈각시킨 후 고정액에 고정하여 GFP 발현을 통해 신경계 발달 양상을 분석하였다.
결과， 도 7에 나타낸 바와 같이 정상형 (Elav>sytGFP)의 초파리의 중주신경계 (Central nerve system)와 부신경계 (per ipheral nerve system)의 발달 및 신경계 망구조 형성이 잘 이루어진 반면 (도 7A), minibrain 과발현의 경우， 시엽 (Optic lobe) 및 복식경색 (ventral： nerve cord)의 발달 이상 (도 7B 및 도 7C), 중추 -부신경계간 신경망 형성 이상 (도 7D) 등 다양한 신경 발생 이상이 확인되어 인간 다운증후군의 뇌신경계 이상과 minibrain 과발현에 의한 신경계 발생이상의 표현형이 연관이 있음을 확인하였다 (도 7)

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1]
1) 인간 DYRKlA(Dual -specific tyrosine(Y) Regulated Kinase 1A) 또는 minibrain유전자를 포함하는 백터를 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 백터를 초파리에 형질전환시키는 단계를 포함하는 다운증후군 유전자 형질전환초파리 제조방법.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 단계 1)의 DYRK1A 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 다운증후군 유전자 형질전환 초파리 제조방법 .
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 단계 1)의 minibrain 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 다운증후군 유전자 형질전환 초파리 제조방법 .
【청구항 4】
제 1항에 있어서， 상기 단계 2)의 백터는 UAS 백터인 것을 특징으로 하는 다운증후군 유전자 형질전환 초파리 제조방법 .
【청구항 5]
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 백터는 P-인자 매개 생식세포 형질전환방법 (P— element— mediated germ line transformation)^- 이용하여 도입되는 것을 특징으로 하는 다운증후군 유전자 형질전환 초파리 제조방법.
【청구항 6】 .
제 1항의 제조방법으로 제조된 다운증후군 유전자 형질전환 초파리 .
【청구항 7】
1) 실험군으로 제 6항의 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 게 6항의 형질전환 초파리에서 hDYRKIA또는 minibrain유전자 발현변화를 측정하는 단계; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 hDYRKIA 또는 minibrain 유전자 발현을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 기억 및 학습기능 저하 개선용 조성물의 스크리닝 방법.
【청구항 8]
1) 실험군으로 제 6항의 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계 ; 2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 계 6항의 형질전환 초파리에서 초파리의 기억 및 학습기능을 측정하는 단계; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)에서 측정한 초파리의 초파리의 기억 및 학습기능을 증가시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 기억 및 학습기능 개선용 조성물의 스크리닝 방법.
【청구항 9】
제 7항에 있어서， 상기 단계 2)의 hDYRKIA 또는 minibrain 유전자 발현변화는 DNA 칩, 웨스턴 블랏 (western blot), 면역조직화학법, 효소결합면역흡착검사 (ELISA), 방사성 동위원소면역측정법 (RIA), 중합효소증폭법 (PCR), 역전사 중합효소 연쇄반웅 (Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) , 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 기억 및 학습기능 저하 개선용 조성물의 스크리닝 방법 .
【청구항 10】
1) 실험군으로 제 6항의 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 제 6항의 형질전환 초파리에서 hDYRKIA또는 minibrain유전자 발현변화를 측정하는 단계 ; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 hDYRKIA 또는 minibrain 유전자 ,발현을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 수명단축 개선용 조성물의 스크리닝 방법 .
【청구항 11】
1) 실험군으로 제 6항의 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계 ; 2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 거 1 6항의 형질전환 초파리에서 초파리의 수명을 측정하는 단계 ; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)에서 측정한 초파리의 수명을 연장시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 수명단축 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝 방법.
【청구항 12】
1) 실험군으로 제 6항의 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계 ;
2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 제 6항의 형질전환 초파리에서 hDYRKIA 또는 minibrain유전자 발현변화를 측정하는 단계; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 hDYRKIA 또는 minibrain 유전자 발현을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 운동기능 저하 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝 방법.
【청구항 13】
1) 실험군으로 제 6항의 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계 ;
2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 제 6항의 형질전환 초파리에서 운동능력 수준을 측정하는 단계 ; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)에서 측정한 초파리의 운동능력 수준을 증가시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 운동능력 저하 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝 방법 .
【청구항 14]
1) 실험군으로 제 6항의 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계 ;
2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 제 6항의 형질전환 초파리에서 hDYRKIA또는 minibrain유전자 발현변화를 측정하는 단계; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)의 hDYRKIA 또는 minibrain 유전자 발현을 감소시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 신경발달 장애 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝 방법.
【청구항 15】
Ϊ) 실험군으로 제 6항의 형질전환 초파리에 피검물질을 처리하는 단계 ;
2) 상기 단계 1)의 피검물질이 처리된 제 6항의 형질전환 초파리에서 신경발달 수준을 측정하는 단계 ; 및
3) 무처리 대조군과 비교하여 상기 단계 2)에서 측정한 초파리의 신경발달 수준을 증가시키는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 신경발달 장애 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝 방법
【청구항 16】
기억 및 학습기능 저하 동물 모델로 사용하기 위한 제 6항의 다운증후군 유전자 형질전환초파리 .
【청구항 17】
수명단축 모델 동물로 사용하기 위한 제 6항의 다운증후군 유전자 형질전환 초파리 .
【청구항 18]
운동능력 저하 모델 동물로 사용하기 위한 제 6항의 다운증후군 유전자 형질전환 초파리 . ᅳ
【청구항 19】
신경계 발달 장애 모델 동물로 사용하기 위한 제 6항의 다운증후군 유전자 형질전환초파리 .
【청구항 20】
기억 및 학습기능 저하 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝에 사용하기 위한 제 6항의 다운증후군 유전자 형질전환초파리 .
【청구항 21】
수명단축 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝에 사용하기 위한 제 6항의 다운증후군 유전자 형질전환 초파리 .
【청구항 22】
동기능 저하 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝에 사용하기 위한 제 항의 다운증후군 유전자 형질전환 초파리 .
【청구항 23】
신경발달 장애 예방 및 개선용 조성물의 스크리닝에 사용하기 위한 제 항의 다운증후군 유전자 형질전환 초파리 .
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