WO2013113132A2 - Microorganismos para procesos de biolixiviacion a bajas temperaturas - Google Patents

Microorganismos para procesos de biolixiviacion a bajas temperaturas Download PDF

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WO2013113132A2
WO2013113132A2 PCT/CL2013/000005 CL2013000005W WO2013113132A2 WO 2013113132 A2 WO2013113132 A2 WO 2013113132A2 CL 2013000005 W CL2013000005 W CL 2013000005W WO 2013113132 A2 WO2013113132 A2 WO 2013113132A2
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acidithiobacillus
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bacterial
strain
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Davor COTARAS TADIC
Pabla Leticia VIEDMA ELICER
Pia Macarena TOBAR GÓMEZ
Manuel GIDEKEL BLUFSTEIN
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Biotecnologias Del Agua Ltda.
Uxmal S.A.
Fundacion Copec-Universidad Catolica
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    • Y02P10/20—Recycling

Definitions

  • the present invention relates to microorganisms capable of participating in the bioleaching of mineral sulphides at low temperatures.
  • the present invention also relates to a process for the continuous generation of a bacterial inoculant for a bioleaching process of sulphide minerals in batteries or dumps at low temperature.
  • Bacterial leaching is the dissolution of sulfurized minerals by means of bacteria that require only very simple inorganic compounds to multiply, the same ones that are commonly found in the waters of hydrometallurgical processes (González and Cotoras, Chemical-biological bases of bacterial leaching , Chilean Journal of Chemical Education 3: 75-79 1978; Morel and Cotoras, Application of gas chromatography in the study of biohydrometallurgical processes In: "Mining and Metallurgical Research 1977" p. 322-326, A. Sutulov (editor ), CIMM, Santiago). Another of the special characteristics of these bacteria is their ability to grow in extremely acidic solutions.
  • US Patent 7,837,760 describes the increase in the rate of bioleaching of minerals and concentrates of metal sulphides by continuous inoculation of Acidithiobacillus thiooxidans, with or without the presence of native microorganisms or together with an isolated microorganism of Acidithiobacillus ferrooxidans.
  • US Patent Application 20070202584 discloses a bacterial strain of the genus Acidithiobacillus that has the ability to oxidize sulfide at high concentrations of chloride ions.
  • Other bacteria of genera other than Acidithiobacillus have also been described as inoculants of bioleaching processes.
  • isolated psychrotolerant strains (Acidithiobacillus ferrivorans) are able to bind to inert surfaces forming a biofilm. For this reason, these strains do not allow cultures in fixed-bed or fluidized bed bioreactors, which are very useful in industrial settings. These systems allow the growth of a high density of biomass in the form of adhered biofilms on different support materials and the continuous generation of an effluent as an inoculant for bioleaching batteries, at low ambient temperatures.
  • the present invention solves the problem of starting up the bioleaching processes of sulphide minerals at very low ambient temperatures, as occurs in mining activities that are carried out in high mountain ranges or in geographical areas of cold climates (for example sub-zones Arctic or sub-Antarctic).
  • this invention provides isolated bacterial strains useful for inoculating the bioleaching stacks.
  • These new strains of Acidithiobacillus have surprisingly the simultaneous ability to grow at low temperatures and form a biofilm in different support materials, both inert minerals and sulphured minerals. This capacity allows the colonization of a bioreactor that contains a support material and a solution of mineral salts.
  • a bacterial suspension is generated that is permanently released from the biofilm, which transmits bacterial cells generated in the bioreactor to a sulphide mineral cell or dump, for a bioleaching process in batteries or dumps at low ambient temperatures.
  • the present invention relates to ferro and sulfurooxidant psychrotolerant bacterial strains, useful for use in pure form or in a consortium design as a starting inoculant in the processes of bioleaching of sulphide minerals for metal recovery.
  • the main object of the present invention are bacterial strains isolated from Acidithiobacillus.
  • the isolated bacterial strains have the ability to grow at temperatures between 5 and 28 ° C. In another embodiment of the invention, the isolated bacterial strains have the ability to grow at temperatures between 5 and 15 ° C. In a further embodiment, the strains have the ability to grow at temperatures between 5 and 10 ° C.
  • the Puri BH20 strain is a biologically pure culture of Acidithiobacillus ferrivorans, deposited in the DSMZ collection with the accession number DSM 25319.
  • strain Yaku BH19 is a biologically pure culture of Acidithiobacillus ferrivorans, deposited in the DSMZ collection with accession number DSM 25318.
  • the Urna BH12 strain is a biologically pure culture of Acidithiobacillus sp., Deposited in the DSMZ collection with accession number DSM 25298.
  • the isolated bacterial strains form a consortium comprising at least two of the Acidithiobacillus strains deposited with access numbers DSM 25319, DSM 25318 and DSM 25298 or a combination of all of these.
  • the second main object of the present invention is a process for the continuous generation of an inoculant for a bioleaching process of sulphurated minerals using bacterial strains, comprising:
  • the d) conduct the bacterial cell suspension generated in the bioreactor to a sulphide mineral cell or dump at ambient temperatures between 0 and 20 ° C.
  • the ambient temperatures are between 0 and 15 ° C. In another particular embodiment of the invention, the ambient temperatures are between 5 and 10 ° C.
  • the mineral salt solution used in the process contains iron (II) salts.
  • the support material for biofilm formation is selected from glass, diatomaceous earth, diatomaceous earth in the form of pellets, sulfur, sulphide minerals and silicates.
  • the bioreactor used in the process is a fluidized bed bioreactor, a fixed bed bioreactor or a biofilter.
  • a bioreactor is used in the process, which is a fixed bed bioreactor, a fluidized bed bioreactor or a biofilter,
  • the third main object of the present invention is the use of isolated bacterial strains, wherein the strains are used as an inoculant for a bioleaching process of sulphured minerals.
  • the strain called Puri BH20 DSM 25319 is acidophilic (pH ⁇ 5.0), facultative aerobic, psychotolerant (5 to 28 ° C). It is a Gram-negative bacterium with bacillary morphology, mobile, non-forming endospores, with a size of 2.0 to 2.4 x 0.5 pm.
  • the strain grows chemilototrophically, using ferrous ion, elemental sulfur, thiosulfate or tetrathionate as an electron donor.
  • the strain is not able to grow using the following organic compounds as a carbon source and electron donor: glucose, glycerol, glutamic acid or citric acid. The microscopic observation of a fresh preparation shows that it quickly attaches to the glass surface of the slide.
  • the 16S rRNA gene of this strain was sequenced and is presented below as SEQ ID No. 1 ( Figure 1).
  • the strain was taxonomically identified by sequencing of the 16S rDNA as Acidithiobacillus fem ' vorans.
  • the strain called Puri BH20 was deposited on September 26, 2011 in the DSMZ collection (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany) with the accession number DSM 25319.
  • the strain called Yaku BH19 DSM 25318 is acidophilic (pH ⁇ 5.0), facultative aerobic, psychotolerant (5 to 35 ° C). It is a Gram-negative bacterium with bacillary morphology, mobile, non-forming endospores, with a size of 2.0 to 2.4 x 0.5 ⁇ .
  • the strain grows chemilototrophically, using ferrous ion, elemental sulfur, thiosulfate or tetrathionate as an electron donor.
  • the strain is not able to grow using the following organic compounds as a carbon source and electron donor: glucose, glycerol, glutamic acid or citric acid. The microscopic observation of a fresh preparation shows that it quickly attaches to the glass surface of the slide.
  • the 16S rRNA gene of this strain was sequenced and is presented below as SEQ ID No. 2 ( Figure 2).
  • the strain was taxonomically identified by sequencing of the 16S rDNA as Acidithiobacillus ferrivorans.
  • the strain called Yaku BH19 was deposited on September 26, 2011 in the DSMZ collection (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany) with the accession number DSM 25318.
  • Urn BH12 DSM 25298 is acidophilic (pH ⁇ 5.0), facultative aerobic, psychrotolerant (5 to 28 ° C). It is a Gram-negative bacterium with bacillary morphology, immobile, non-forming endospores, with a size of 1.0 x 0.5 pm.
  • the strain grows chemolithotrophically, using ferrous ion, metal sulphides, elemental sulfur, thiosulfate or tetrathionate as an electron donor.
  • the strain is not able to grow using the following organic compounds as a carbon source and electron donor: glucose, glycerol, glutamic acid or citric acid.
  • the microscopic observation of a fresh preparation shows that it quickly attaches to the glass surface of the slide.
  • the strain grows in columns filled with support materials such as glass beads or diatomaceous earth pellets, it adheres to the support material in the form of biofilms.
  • the 16S rRNA gene of this strain was sequenced and is presented below as SEQ ID No. 3 ( Figure 3).
  • the strain was taxonomically identified by sequencing of the 16S rDNA as Acidithiobacillus sp.
  • Urna BH12 The strain called Urna BH12 was deposited on October 10, 2011 in the DSMZ collection (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany) with the accession number DSM 25298.
  • FIGURE 1 is a diagrammatic representation of FIG. 1 :
  • the figure shows the 1% agarose gel electrophoresis of the digestions of the plasmids obtained with EcoRI.
  • Lane 1 Generuler 1kb Fermentas ® ;
  • lane 2 Yaku BH19:
  • lane 3 Puri BH20;
  • lane 4 Ballot box BH12.
  • FIGURE 2 is a diagrammatic representation of FIGURE 1
  • the figure shows a scheme of digestion with the EcoRI enzyme of the 16S rDNA sequence of the Puri BH20 strain.
  • the thick line corresponds to the cloned fragment of the 1494 bp 16S rDNA sequence, while the thin line corresponds to the included plasmid piece in digestion At 660 bp, the only cut-off site of the enzyme inside the cloned insert is indicated.
  • FIGURE 3 is a diagrammatic representation of FIGURE 3
  • FIGURE 4
  • FIGURE 5
  • the figure shows the phylogenetic tree based on 16D rDNA sequence data that illustrates the relationship of Puri BH20, Yaku BH19 and Urna BH12 strains with the described members of the Acidithiobacillus genus.
  • This phylogenetic tree has also included bacterial strains of the genus Acidithiobacillus described in the following patent documents: US 7,601,530, US 7,700,343 and JP 2007228960.
  • the phylogenetic tree was made using the maximum parsimony method
  • FIGURE 6 is a diagrammatic representation of FIGURE 6
  • the figure shows the effect of temperature on the growth rate in iron (expressed as generation times) of the Urna BH12 strain (empty squares) and the Puri BH20 strain (filled triangles).
  • FIGURE 7 is a diagrammatic representation of FIGURE 7
  • the figure shows a scheme of the system used to allow adhesion and the start of the formation of the biofilm of the bacterial consortium on the support material.
  • This system is constituted by a bionreactor 1, filled with a support material 2, a conduit 3 and a pump 4, which allows the recirculation of the inoculated liquid with the bacterial consortium. Liquid recirculation is performed until the formation of the bacterial consortium film on the support material is achieved. The system was incubated at 5 ° C.
  • FIGURE 8
  • the figure shows a scheme of the system used for the continuous production of an inoculant, consisting of a bacterial suspension of the consortium, from a fixed bed bionreactor containing a support material with the film of the bacterial consortium.
  • the bioreactor 1 filled with a support material 2 with the bacterial consortium film is fed with culture medium.
  • the system consists of a pond 5, which contains the culture medium 6, formed by a solution of salts and an air inlet 7, which allows the oxygenation of the culture medium.
  • the culture medium is fed to the bioreactor 1 through a conduit 8, by means of a pump 4.
  • a drop count 9 is inserted into the conduit 8.
  • the passage of the culture medium through the bioreactor 1 allows the continuous release of bacteria from the biofilm, which generates a bacterial suspension that constitutes the inoculant for a bioleaching process.
  • the system was incubated at 5 ° C.
  • FIGURE 9 is a diagrammatic representation of FIGURE 9
  • the figure shows the generation of the inoculant, from a bioreactor containing a biofilm of the Puri BH20, Yaku BH19 and Urna BH12 strains, for a period of 45 days.
  • the microbial concentration was determined by the analysis of cellular ATP by bioluminescence (filled triangles), using the LixKit ® method (according to the protocol of the bioluminescence assay of the company Biohidrica ® ) and the potential for oxidization reduction by means of an Eh electrode ( empty squares).
  • the strain Puri BH20 DSM 25319 was isolated from samples obtained from acid mine drains, using a strategy oriented to the selection of iron oxidizing microorganisms, capable of growing at low temperature and with the ability to form biofilms on solid supports.
  • the samples were enriched by successive cultures in static flasks at 5 ° C with 9K culture medium at pH 2.5.
  • the culture medium 9K is composed of a solution A and a solution B.
  • To prepare solution A the following salts are dissolved in 900 mL of distilled water: (NH 4 ) 2 S0 4 , 3.0 g; KCI, 0.1 g; K 2 HP0 4 , 0.5 g; MgS0 x 7H 2 0.5 g and Ca (Ü3) 2 0.01 g.
  • solution B 44.2 g of FeS0 4 x 7 H 2 0 is dissolved in 100 mL with distilled water adjusted to pH 1.5 with H 2 S0 1N. This solution is sterilized with 0.2 ⁇ membrane filters. Then, once solution A is cold, solution B is added sterile. Subsequently, the pure strain Puri BH20 was isolated from colonies obtained on membrane filters, using a simplified and modified method of floating filters. (from Bruyn, JC, Boogerd, F. C, Bos, P., & Kuenen, GJ 1990.
  • Floating filters a novel technique for isolation and enumeration of fastidious, acidophilic, iron-oxidizing, autotrophic bacteria. Appl. Environ. Microbiol ., vol. 56 (9), pp. 2891-2894). The analysis of the strain obtained showed its ability to oxidize ferrous to ferric ion, its ability to grow at low temperature and its ability to form biofilms on solid supports.
  • the molecular identification of the strain was made from the DNA obtained from a 50 mL culture in 9K pH 2.5 medium, incubated at 5 ° C and inoculated with 1 mL of a previous culture.
  • the genetic material was extracted with the MoBio Power Soil DNA isolation ® commercial kit according to the manufacturer's instructions.
  • the rRNA16S gene was amplified by PCR, for which the universal splitters 8F and 1492R (Table 1) were used, with the following protocol in the thermal cycler (Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler): hot start from 2 min to 94 ° C, 32 cycles of: 1 minutes at 94 ° C, 1 minutes at 61 ° C, 1.5 minutes at 72 ° C each and finally a 10 minute extension at 72 ° C.
  • the amplicon obtained, of 1494 bp was cloned into DH5a bacteria by linking it to the Promega pGem-T Easy ® plasmid according to the manufacturer's instructions.
  • a colony PCR was performed with the SP6 and T7 splitters (Table 1) that bind the plasmid pGem-T Easy ® according to the following protocol: 5-minute hot start at 95 ° C, 35 cycles of 30 seconds at 94 ° C, 50 seconds at 55 ° C and 1.5 minutes at 72 ° C and finally a 5 minute extension at 72 ° C.
  • the plasmid was removed from the positive clones using the AxyPrep Plasmid miniprep kit from Axygen ® , according to the manufacturer's instructions.
  • AxyPrep Plasmid miniprep kit from Axygen ® , according to the manufacturer's instructions.
  • a colony of each positive clone was incubated in 15 mL Falcon ® tubes with 3 mL of LB medium (5 g / L NaCI, 5 g / L yeast extract, 5 g / L casein peptone) supplemented with ampicillin (100 mg / mL) for 14 hours at 37 ° C at 100 rpm.
  • the samples were quantified in the Nanodrop ® ND-1000 Spectrophotometer, then digested with the Fermentas ® EcoRI restriction enzyme according to the instructions from the manufacturer, all this in order to verify that the fragment cloned in the plasmids was as expected.
  • the thick line corresponds to the cloned fragment of the 16S rDNA sequence of 1494 bp, while the thin line corresponds to the piece of plasmid included in the digestion.
  • the only cut-off site of the enzyme inside the cloned insert is indicated.
  • Plasmids from positive clones were sent to the Macrogen ® company in Korea for sequencing.
  • the sequence list includes the rDNA16S gene sequence of the Puri BH20 strain (Seq ID No. 1).
  • the rDNA16S sequence of the Puri BH20 strain was initially analyzed using BLAST from the NCBI database (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Alignment of this sequence with the NCBI database showed that the microorganism cultured with the highest percentage of identity (99%) is Acidithiobacillus ferr ⁇ vorans NO-37.
  • Figure 5 shows the phylogenetic position of the Puri BH20 strain with respect to the other members of the Acidithiobacillus genus. It can be seen that this strain is included in the group consisting of Acidithiobacillus ferr ⁇ vorans NO-37, Acidithiobacillus ferr ⁇ vorans Peru6, Acidithiobacillus ferr ⁇ vorans CF27, Acidithiobacillus ferr ⁇ vorans OP14 and Acidithiobacillus ferr ⁇ vorans SS3.
  • Figure 5 also shows that there is an important phylogenetic distance between the Puri BH20 strain and the microorganisms disclosed in patent documents US 7,601,530, US 7,700,343 and JP 2007228960.
  • the Puri BH20 bacteria deposited as DSM 25319, can be classified as a new strain, with the ability to form biofilms on solid supports, of Acidithiobacillus ferr ⁇ vorans.
  • Yaku BH19 DSM 25318 strain was isolated and phylogenetically characterized in the same manner as described in Example 1.
  • 3 fragments were obtained: one of 668 bp, one of 517 bp and finally one of 331 bp, which correspond to the internal digestion of the released insert.
  • Figure 3 shows a scheme of digestion with the EcoRI enzyme of the 16S rDNA sequence of Yaku BH19 strain.
  • the thick line corresponds to the cloned fragment of the 16S rDNA sequence of 1494 bp, while the thin line corresponds to the piece of plasmid included in the digestion.
  • the 2 enzyme cut sites inside the cloned insert are indicated at 660 bp and 991 bp. Plasmids from positive clones were sent to the Macrogen ® company in Korea for sequencing.
  • the sequence list of the rDNA16S gene of strain Yaku BH19 (Seq ID No. 2) is included in the sequence list.
  • the rDNA16S sequence of Yaku BH19 strain was initially analyzed using BLAST from the NCBI database (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Alignment of this sequence with the NCBI database showed that the microorganism cultured with the highest percentage of identity (99%) is Acidithiobacillus fem ' vorans SS3.
  • Figure 5 shows the phylogenetic position of the Yaku BH19 strain with respect to the other members of the Acidithiobacillus genus. It can be seen that this strain, unlike the Puri BH20 strain, is not included in the group consisting of Acidithiobacillus fenivorans NO-37, Acidithiobacillus fenivorans Peru6, Acidithiobacillus fenivorans CF27, Acidithiobacillus fem ' vorans OP14 and Acidithiobacillus fenivo. However, Yaku BH19 strain has a close phylogenetic relationship with this group.
  • Figure 5 also shows that there is an important phylogenetic distance between Yaku BH19 strain and the microorganisms disclosed in patent documents US 7,601,530, US 7,700,343 and JP 2007228960. Based on this phylogenetic study and the characteristics Phenotypic of this strain described above (especially its mobility and psychrotolerance), the Yaku BH19 bacteria, deposited as DSM 25318, can be classified as a new strain with the ability to form biofilms on solid supports of Acidithiobacillus fem ' vorans.
  • the Urn BH12 strain DSM 25298 was isolated and phylogenetically characterized in the same manner as described in Example 1.
  • 3 fragments were obtained: one of 668 bp, one of 516 bp and finally one of 331 bp, which correspond to the internal digestion of the released insert.
  • Figure 4 shows a scheme of digestion with the EcoRI enzyme of the 16S rDNA sequence of the Urna BH12 strain.
  • the thick line corresponds to the cloned fragment of the 16S rDNA sequence of 1493 bp, while the thin line corresponds to the piece of plasmid included in the digestion.
  • the 2 enzyme cut sites inside the cloned insert are indicated at 660 bp and 991 bp.
  • Plasmids from positive clones were sent to the Macrogen ® company in Korea for sequencing.
  • the sequence list includes the rDNA16S gene sequence of the urn BH12 strain (Seq ID No. 3).
  • the rDNA16S sequence of the Urna BH12 strain was initially analyzed using BLAST from the NCBI database (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Alignment of this sequence with the NCBI database showed that the microorganism cultured with the highest percentage of identity (99%) is Acidithiobacillus ferrooxidans YTW.
  • Figure 5 shows the phylogenetic position of the Urna BH12 strain with respect to the other members of the Acidithiobacillus genus. It can be seen that this strain is phylogenetically related to Acidithiobacillus ferrooxidans YTW.
  • the Urna BH12 strain is phylogenetically closer to Acidithiobacillus ferrivorans than to Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270.
  • the Urna BH12 strain shares with Acidithiobacillus ferrivorans the characteristic of being psychrotolerant, but other characteristics such as its inability to move and its smaller size that make it similar Acidithiobacillus ferrooxidans.
  • Figure 5 also shows that there is an important phylogenetic distance between the Urna BH12 strain and the microorganisms disclosed in patent documents US 7,601,530, US 7,700,343 and JP 2007228960.
  • the bacterium Urna BH12 deposited as DSM 25298, can be classified as a new psychrotolerant strain with the ability to form biofilms on solid supports of the genus Acidithiobacillus.
  • the growth of the Urna BH12 strain and the Puri BH20 strain in iron at different temperatures was performed. To that end, 1 mL of each of these strains was inoculated into different Erlenmeyer flasks of 125 mL with 50 mL of 9K medium, pH 2.5, as described in Example 1. The flasks were incubated in parallel, statically, to the following temperatures: 5 ° C, 10 ° C, 15 ° C, 21 ° C, 28 ° C and 35 ° C. The bacterial count was performed periodically using the Petroff Hausser chamber, observed by a phase contrast microscope (Cari Zeiss Axioskop 20). The generation time for each strain at each temperature was determined from the growth kinetics curves.
  • Figure 6 shows the effect of temperature on the growth rate in iron (expressed as generation times) of the Urna BH12 strain (empty squares) and the Puri BH20 strain (filled triangles). It is observed that the Urna BH12 strain has a wide temperature range for growth, between 5 and 35 ° C, with a minimum generation time at 21 ° C. No growth was observed at 42 ° C. This strain was able to grow at 5 ° C, but with a generation time of approximately 450 hours. On the other hand, the Puri BH20 strain has a temperature range for growth, between 5 and 28 ° C, but was not able to grow at 35 ° C. Its shortest generation time was presented at 28 ° C. This strain was able to grow at 5 ° C with a generation time of approximately 60 h.
  • Yaku BH19 and Puri BH20 strains were grown in iron at 5 ° C. For this, 1 mL of each of these strains was inoculated in different Erlenmeyer flasks of 125 mL with 50 mL of 9K medium, ⁇ 2.5, as described in Example 1. The flasks were incubated in parallel in static form at 5 ° C. The bacterial count was performed periodically using the Petroff Hausser chamber, and was observed by a phase contrast microscope (Cari Zeiss Axioskop 20). From the growth kinetics curves at 5 ° C a generation time of 117 hours was determined for the Yaku BH19 strain and a 62 hours generation time for the Puri BH20 strain.
  • a column-shaped bioreactor was designed, consisting of a transparent polycarbonate tube 1 cm long and 2.4 cm in diameter, to which threads were made at both ends, to close it with PVC covers.
  • a polypropylene adapter was placed to allow the connection of a connection at both ends of the bioreactor.
  • the bioreactor was filled with a solid support material consisting of 41 g of 3 mm diameter glass beads.
  • the bioreactor was inoculated by filling it with a bacterial suspension containing the Puri BH20, Yaku BH19 and Urna BH12 strains.
  • FIG. 7 shows a scheme of the system used to allow adhesion and initiation of the formation of the biofilm of the bacterial consortium on the support material.
  • This system consists of a bioreactor 1 (described above), filled with a support material 2 (41 g of 3 mm diameter glass beads) a conduit 3, consisting of a Masterflex ® No. 13 silicone hose and a Masterflex ® peristaltic pump 4 with head No. 13, which allows the recirculation of the inoculated liquid with the bacterial consortium with a flow of approximately 8 mIJh. The liquid was recirculated for 21 days, until the adhesion and the beginning of the biofilm formation of the bacterial consortium on the support material is reached.
  • the diluted 9K culture medium is composed of a solution A and a solution B.
  • solution A the following salts are dissolved in 990 mL of distilled water: (NH 4 ) 2 S0 4 , 0.6 g; KCI, 0.02 g; K 2 HP0 > 0.1 g; MgS0 4 x 7H 2 0, 0.1 g and Ca (N0 3 ) 2 0.002 g.
  • the pH is adjusted to 2.5 with 1N H2SO4.
  • the final solution is autoclaved at 121 ° C for 20 minutes.
  • FIG. 8 shows a scheme of the system used for continuous production of the inoculant. constituted by a bacterial suspension of the consortium from a fixed bed bioreactor containing a support material with the film of the bacterial consortium. For this, the bioreactor 1, filled with a support material 2 with the film of the bacterial consortium is fed with culture medium.
  • the system consists of a pond 5 (10 L Schott ® glass bottle), which contains the culture medium 6 and an air inlet 7, which allows the oxygenation of the culture medium.
  • a pond 5 (10 L Schott ® glass bottle), which contains the culture medium 6 and an air inlet 7, which allows the oxygenation of the culture medium.
  • the pond 5 was placed inside a controlled refrigerator at 5 ° C.
  • the culture medium is fed to the bioreactor 1 through a conduit 8, consisting of a Masterflex ® No. 13 silicone hose and a Masterflex ® peristaltic pump 4 with head No. 13, which allows the bioreactor to be fed with the culture of the inoculated liquid with an average flow of 0.8 mlih.
  • a drop count 9 is placed in the duct 8.
  • the passage of the culture medium through the bioreactor 1 allows the continuous release of bacteria from the biofilm, which It generates a bacterial suspension that constitutes the inoculant for a bioleaching process.
  • the parameters were monitored in time at the exit of the bioreactor for a period of 45 days.
  • the microbial concentration was determined weekly by analyzing the cellular ATP by bioluminescence, using the LixKit ® method (according to the biohyduminance test protocol of the company Biohidrica ® ), the potential for oxidization reduction by means of an Eh electrode, the pH value, and the morphological and mobility characteristics were observed by microscopy.
  • Figure 9 shows the permanent presence of the active bacterial biomass at the bioreactor outlet, measured as bacterial ATP in relative units of light (URL) and the oxidizing potential-reduction of the solution.
  • the operation of the continuous generation process of the inoculant was maintained for a period of 18 months.
  • the presence of the Puri BH20, Yaku BH19 and Urna BH12 strains at the bioreactor outlet was confirmed by centrifuging the bioreactor effluent, carrying out the bacterial DNA extraction, amplifying the 16S rDNA by PCR, obtaining different clones and sending the plasmids from positive clones to the Macrogen ® company in Korea, for sequencing, according to the method described in example 1.
  • the operation of the continuous generation process of the inoculant was maintained for a period of 8 months.
  • the presence of the Puri BH20 and Yaku BH19 strains at the bioreactor outlet was confirmed by centrifuging the bioreactor effluent, carrying out the bacterial DNA extraction, amplifying the 16S rDNA by PCR, obtaining different clones and sending the plasmids of the positive clones to Macrogen ® of Korea, for sequencing, according to the method described in example 1.
  • solution A the following salts are dissolved in 999 mL of distilled water: (NH) 2 S0 4 , 0.6 g; KCI, 0.02 g; K 2 HP0 4 , 0.1 g; MgS0 4 x 7H 2 0, 0.1 g and Ca (N0 3 ) 2 0.002 g.
  • the pH is adjusted to 2.5 with H 2 S0 4 1N.
  • the final solution was autoclaved at 121 ° C for 20 minutes.
  • solution B 4.42 g of FeS0 4 x 7 H 2 0 is dissolved in 10 mL with distilled water adjusted to pH 1.5 with H 2 S0 4 1. This solution is sterilized with 0.2 pm membrane filters. Then, once solution A is cold, 1 mL of solution B is sterilely added.
  • the operation of the continuous generation process of the inoculant was maintained for a period of 8 months.
  • the presence of the Puri BH20 and Yaku BH19 strains at the bioreactor outlet was confirmed by centrifuging the bioreactor effluent, performing bacterial DNA extraction, amplifying the 16S rDNA by PCR, obtaining different clones and sending the plasmids of the positive clones to the Macrogen ® company of Korea, for sequencing, according to the method described in example 1.

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Abstract

La presente invención se refiere a cepas bacterianas aisladas de Acidithiobacillus que son capaces de biolixiviar sulfuros minerales a bajas temperaturas. Estas cepas tienen la capacidad de crecer a temperaturas entre 5 a 10 °C y tienen la característica de adherirse a soportes sólidos, separadamente o en consorcio, formando una biopelícula. Las cepas de Acidithiobacillus denominadas Puri BH20, Yaku BH19 y Urna BH12, están depositadas en la colección DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania) con los números de acceso DSM 25319, DSM 25318 y DSM 25298, respectivamente. La presente invención se refiere también a un proceso para la generación continua de un inoculante bacteriano para un proceso de biolixiviación de minerales sulfurados en pilas o botaderos a baja temperatura.

Description

MICROORGANISMOS PARA PROCESOS DE BIOLIXIVIACION A BAJAS TEMPERATURAS
CAMPO DE APLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a microorganismos capaces de participar en la biolixiviación de sulfuras minerales a bajas temperaturas.
La presente invención se refiere también a un proceso para la generación continua de un inoculante bacteriano para un proceso de biolixiviación de minerales sulfurados en pilas o botaderos a baja temperatura.
DESCRIPCIÓN DE LO CONOCIDO EN LA MATERIA
Actualmente, se está aplicando cada vez más la lixiviación bacteriana en los procesos de producción de cobre a partir de minerales sulfurados, especialmente sulfuras secundarios tales como calcosina y covelina. La lixiviación bacteriana es la disolución de minerales sulfurados por medio de bacterias que requieren sólo de compuestos inorgánicos muy simples para multiplicarse, los mismos que se encuentran comúnmente en las aguas de los procesos hidrometalúrgicos (González y Cotoras, Bases químico-biológicas de la lixiviación bacteriana, Revista Chilena de Educación Química 3: 75-79 1978; Morel y Cotoras, Aplicación de la cromatografía de gases en el estudio de procesos biohidrometalúrgicos. En: "Investigaciones Mineras y Metalúrgicas 1977" pág. 322-326, A. Sutulov (editor), CIMM, Santiago). Otra de las características especiales de estas bacterias es su capacidad de crecer en soluciones extremadamente ácidas.
A partir de fines de los años ochenta, los diversos procesos de lixiviación en pila se difundieron en forma amplia y preferentemente en la minería cuprífera de Chile. Así, la lixiviación en pilas TL como la ruta completa LX - SX - EW se convirtieron en una de las innovaciones importantes de la minería y metalurgia del cobre no solamente en Chile sino en el ámbito mundial.
Para acelerar el proceso de biolixiviación, se han dado a conocer numerosos aislados microbianos que sirven de inóculos para pilas y botaderos de biolixiviación. Entre ellos se pueden encontrar bacterias del género Acidithiobacillus ferrooxidans, como la cepa Wenelen, depositada en DSM 16786, descrita en la Patente Norteamericana US 7.601.530. Por otra parte, la Patente Norteamericana US 7.700.343 da a conocer la cepa bacteriana de Acidithiobacillus thiooxidans, llamada Licanantay, depositada con el número DSM 17318. La patente Norteamericana US 7.837.760 describe el aumento de la velocidad de biolixiviación de minerales y concentrados de sulfuras metálicos mediante la inoculación continua de Acidithiobacillus thiooxidans, con o sin presencias de microorganismos nativos o junto con un microorganismo aislado de Acidithiobacillus ferrooxidans. La solicitud de Patente Norteamericana 20070202584 da a conocer una cepa bacteriana del género Acidithiobacillus que tiene la capacidad para oxidar el sulfuro a altas concentraciones de iones de cloruro. Se ha descrito también otras bacterias de géneros diferentes a Acidithiobacillus como inoculantes de procesos de biolixiviación. Entre ellas, se puede encontrar a la cepa bacteriana Leptospirillum ferrooxidans, llamada Yagan, depositada con el número DSM 17947, descrita en la Solicitud de Patente Chilena N° 2077-2007. La Solicitud de Patente Norteamericana US 20110201095 da a conocer un proceso de biolixiviación de cobre, que hace uso de un consorcio que incluye Leptospirillum fem'philum, depositado con el número DSM 22399, y un microorganismo halófilo o halotolerante oxidante de azufre. La Solicitud Patente Australiana AU 2002254782 describe un método de biolixiviación de un mineral de sulfuro en una solución con un contenido de cloruro de más de 5000 ppm a una temperatura superior a 10 0 C. utilizando al menos una cepa bacteriana de Thiobacillus prosperus, seleccionada entre las cepas depositadas en los números de acceso DSM14175 y DSM14174.
Además de estas cepas bacterianas, también se han descrito cepas de Archaeas, capaces de aumentar la recuperación de metales en los procesos de biolixiviación. Entre ellas, se puede mencionar a la cepa denominada fer1 de Ferroplasma acidarmanus, descrita en la Patente Norteamericana US 6.589.772. La Patente Española ES 2087033 da a conocer el microorganismo Sulfolobus rívotincti, depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo en el número de registro CECT 4489 y su uso en la biolixiviación de sulfuras metálicos para la recuperación de metales. La solicitud de Patente Norteamericana 20070264703 presenta un método de biolixiviación de sulfuras minerales a altas temperaturas y pH extremadamente bajo, que emplea la cepa Acidianus sp. JP7 (número DSM 15471), que es un microorganismo termófilo y acidófilo extremo.
Por lo tanto, en el estado de la técnica se describe una serie de microorganismos mesófilos y termófilos, que funcionan eficientemente a temperaturas ambientales templadas. Sin embargo, todos ellos presentan la desventaja de no estar diseñado para utilizarse en procesos de biolixiviación de minerales cuando las temperaturas ambientales son muy bajas, tal como ocurre en actividades mineras que se realizan en alta cordillera o en zonas geográficas de climas fríos (por ejemplo zonas sub-árticas o sub-antárticas). Se ha considerado generalmente que en ambientes de baja temperatura, las tasas de oxidación biológica de sulfuras en las minas y en relaves son insignificantes debido a las bajas temperaturas. La mayor dificultad que enfrentan los procesos de biolixiviación es el clima de alta cordillera con gastos de energía, ya que se requiere el precalentamiento de las soluciones de lixiviación y, además, el empleo de dispositivos de goteo semienterrados y grandes cantidades de material termo-aislantes para conservar el calor al interior de la pila. Para mejorar el calentamiento de las soluciones del biolixiviación, la solicitud de Patente Chilena N° 1053-2010 da a conocer un sistema de calentamiento inductivo de soluciones para plantas de biolixiviación y electro-obtención en altura. Sin embargo, esto no permite solucionar el problema del alto gasto energético y sus consecuencias ambientales. La solución ideal para este problema es utilizar microorganismos lixiviantes que puedan crecer adecuadamente a bajas temperaturas y sea posible emplearlos en un sistema de inoculación continua simple y de bajo costo.
Recientemente se dio a conocer el aislamiento desde ambientes impactados por la minería metálica de la especie bacteriana psicrotolerante Acidithiobacillus ferrivorans (Hallberg, K. B., Gonzalez-Toril, E. & Johnson, D. B. (2010). Acidithiobacillus ferrivorans, sp. nov.; facultatively anaerobio, psychrotolerant iron-, and sulfur-oxidizing acidophiles isolated from metal mine- impacted environments. Extremophiles 14, 9-19). Se describió esta nueva especie sobre la base de varias características que la hacen diferente de Acidithiobacillus ferrooxidans, tales como su capacidad de crecer a bajas temperaturas, su movilidad y su mayor tamaño.
Sin embargo, no se ha descrito que las cepas psicrotolerantes aisladas (Acidithiobacillus ferrivorans) sean capaces de unirse a superficies inertes formando una biopelícula. Por esta razón, estas cepas no permiten realizar cultivos en biorreactores de lecho fijo o lecho fluidizado, los cuales son de gran utilidad en ámbito industrial. Estos sistemas permiten el crecimiento de una alta densidad de biomasa en forma de biopelículas adheridas sobre diferentes materiales de soporte y la generación continua de un efluente como inoculante para las pilas de biolixiviación, a bajas temperaturas ambientales.
La presente invención resuelve el problema de la puesta en marcha de los procesos de biolixiviación de minerales sulfurados a temperaturas ambientales muy bajas, tal como ocurre en actividades mineras que se realizan en alta cordillera o en zonas geográficas de climas fríos (por ejemplo zonas sub-árticas o sub-antárticas). Para esto, esta invención provee cepas bacterianas aisladas útiles para realizar la inoculación de las pilas de biolixiviación. Estas nuevas cepas de Acidithiobacillus presentan en forma sorprendente la capacidad simultánea de crecer a bajas temperaturas y formar una biopelícula en diferentes materiales de soporte, tanto a minerales inertes como a minerales sulfurados. Esta capacidad, permite la colonización de un biorreactor que contiene un material de soporte y una solución de sales minerales. Una vez que se alcanza la formación de la biopelícula sobre el material de soporte, se genera una suspensión bacteriana que se libera permanentemente de la biopelícula, la cual hace llegar células bacterianas generada en el biorreactor a una pila o botadero de un mineral sulfurado, para un proceso de biolixiviación en pilas o botaderos a bajas temperaturas ambientales.
DEFINICIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a cepas bacteriana psicrotolerante ferro y sulfurooxidante, útiles para ser empleadas en forma pura o en un diseño de consorcio como un inoculante de partida en los procesos de biolixiviación de minerales sulfurados para la recuperación de metales. El principal objeto de la presente invención son cepas bacterianas aisladas de Acidithiobacillus. Estas cepas de Acidithiobacillus denominadas Puri BH20, Yaku BH19 y Urna BH12, están depositadas en la colección DSMZ (Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zelikulturen GmbH, Braunschweig, Alemania) con los números de acceso DSM 25319, DSM 25318 y DSM 25298, respectivamente y tienen la capacidad de adherirse a soportes sólidos, separadamente o en consorcio, formando una biopelícula.
En una realización de la invención, las cepas bacterianas aisladas tienen la capacidad de crecer a temperaturas entre 5 y 28 °C. En otra realización de la invención, las cepas bacterianas aisladas tienen la capacidad de crecer a temperaturas entre 5 y 15 °C. En una realización adicional, las cepas tienen la capacidad de crecer a temperaturas entre 5 y 10 °C. En una realización de la invención, la cepa Puri BH20 es un cultivo biológicamente puro de Acidithiobacillus ferrivorans, depositado en la colección DSMZ con el número de acceso DSM 25319.
En otra realización de la invención, la cepa Yaku BH19 es un cultivo biológicamente puro de Acidithiobacillus ferrivorans, depositado en la colección DSMZ con el número de acceso DSM 25318.
En una realización adicional, la cepa Urna BH12 es un cultivo biológicamente puro de Acidithiobacillus sp., depositado en la colección DSMZ con el número de acceso DSM 25298. En una realización particular de la invención,, las cepas bacterianas aisladas forman un consorcio que comprende al menos dos de las cepas de Acidithiobacillus depositadas con los número de acceso DSM 25319, DSM 25318 y DSM 25298 o una combinación de todas estas. El segundo objeto principal de la presente invención es un proceso para la generación continua de un inoculante para un proceso de biolixiviación de minerales sulfurados que utiliza las cepas bacterianas, que comprende:
a) inocular una cepa bacteriana aisladas de Acidithiobacillus, seleccionada del grupo de DSM 25319, DSM 25318 y DSM 25298 o un consorcio bacteriano, que comprende al menos dos de las cepas de Acidithiobacillus depositadas con los número de acceso DSM 25319, DSM 25318 y DSM 25298 o una combinación de todas estas, en un biorreactor que contiene un material de soporte y una solución de sales minerales.
b) permitir el crecimiento y la formación de la biopelícula de la cepa bacteriana aislada de Acidithiobacillus, o del consorcio bacteriano sobre el material de soporte. c) una vez que se alcanza la formación de la biopelícula sobre el material de soporte, iniciar la alimentación continua de una solución de sales minerales al reactor, para producir en forma continua una suspensión células bacterianas de la cepa bacteriana aislada de Acidithiobacillus, o el consorcio bacteriano; y
d) conducir la suspensión células bacterianas generada en el biorreactor a una pila o botadero de un mineral sulfurado a temperaturas ambientales entre 0 y 20 °C. En una realización particular de la invención, las temperaturas ambientales están entre O y 15 °C. En otra realización particular de la invención, las temperaturas ambientales están entre 5 y 10 °C.
En una realización particular de la invención, la solución de sales minerales que se utiliza en el proceso contiene sales de hierro (II).
En otra realización de la invención, el material de soporte para la formación de la biopelícula se selecciona de vidrio, tierra de diatomeas, tierra de diatomeas en forma de pellets, azufre, minerales sulfurados y silicatos.
En otra realización de la invención, el biorreactor que se utiliza en al proceso es un biorreactor de lecho fluidizado, un biorreactor de lecho fijo o un biofiltro.
En otra realización de la invención, en el proceso se utiliza un biorreactor, que es un biorreactor de lecho fijo, un biorreactor de lecho fluidizado o un biofiltro,
El tercer objeto principal de la presente invención es el uso de las cepas bacterianas aisladas, en donde las cepas se usan como un inoculante para un proceso de biolixiviación de minerales sulfurados.
La cepa denominada Puri BH20 DSM 25319 es acidófila (pH <5,0), aeróbica facultativa, psicrotolerante (5 a 28°C). Es una bacteria Gram-negativa con morfología bacilar, móvil, no formadora de endoesporas, con un tamaño de 2,0 a 2,4 x 0,5 pm. La cepa crece quimiolitotróficamente, utilizando como donador de electrones al ion ferroso, azufre elemental, tiosulfato o tetrationato. La cepa no es capaz de crecer utilizando los siguientes compuestos orgánicos como fuente de carbono y donador de electrones: glucosa, glicerol, ácido glutámico o ácido cítrico. La observación microscópica de una preparación al fresco, muestra que rápidamente se une a la superficie de vidrio del portaobjetos. Al crecer la cepa en columnas rellenas con materiales de soportes tales como perlas de vidrio, pellets de tierra de diatomeas o minerales sulfurados se adhiere al material de soportes en forma de biopelículas. El gen rRNA 16S de esta cepa fue secuenciado y se presenta más abajo como SEQ ID N° 1 (Figura 1). La cepa fue identificada taxonómicamente por secuenciación del 16S rDNA como Acidithiobacillus fem'vorans.
La cepa denominada Puri BH20 fue depositada el 26 de septiembre de 2011 en la colección DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany) con el número de acceso DSM 25319.
La cepa denominada Yaku BH19 DSM 25318 es acidófila (pH <5,0), aeróbica facultativa, psicrotolerante (5 a 35°C). Es una bacteria Gram-negativa con morfología bacilar, móvil, no formadora de endoesporas, con un tamaño de 2,0 a 2,4 x 0,5 μητι. La cepa crece quimiolitotróficamente, utilizando como donador de electrones al ion ferroso, azufre elemental, tiosulfato o tetrationato. La cepa no es capaz de crecer utilizando los siguientes compuestos orgánicos como fuente de carbono y donador de electrones: glucosa, glicerol, ácido glutámico o ácido cítrico. La observación microscópica de una preparación al fresco, muestra que rápidamente se une a la superficie de vidrio del portaobjetos. Al crecer la cepa en columnas rellenas con materiales de soportes tales como perlas de vidrio, pellets de tierra de diatomeas o minerales sulfurados se adhiere al material de soportes en forma de biopelículas. El gen rRNA 16S de esta cepa fue secuenciado y se presenta más abajo como SEQ ID N° 2 (Figura 2). La cepa fue identificada taxonómicamente por secuenciación del 16S rDNA como Acidithiobacillus ferrivorans.
La cepa denominada Yaku BH19 fue depositada el 26 de septiembre de 2011 en la colección DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany) con el número de acceso DSM 25318.
La denominada Urna BH12 DSM 25298 es acidófila (pH <5,0), aeróbica facultativa, psicrotolerante (5 a 28°C). Es una bacteria Gram-negativa con morfología bacilar, inmóvil, no formadora de endoesporas, con un tamaño de 1,0 x 0,5 pm. La cepa crece quimiolitotróficamente, utilizando como donador de electrones al ion ferroso, sulfuras metálicos, azufre elemental, tiosulfato o tetrationato. La cepa no es capaz de crecer utilizando los siguientes compuestos orgánicos como fuente de carbono y donador de electrones: glucosa, glicerol, ácido glutámico o ácido cítrico. La observación microscópica de una preparación al fresco, muestra que rápidamente se une a la superficie de vidrio del portaobjetos. Al crecer la cepa en columnas rellenas con materiales de soportes tales como perlas de vidrio o pellets de tierra de diatomeas se adhiere al material de soportes en forma de biopelículas. El gen rRNA 16S de esta cepa fue secuenciado y se presenta más abajo como SEQ ID N° 3 (Figura 3). La cepa fue identificada taxonómicamente por secuenciación del 16S rDNA como Acidithiobacillus sp.
La cepa denominada Urna BH12 fue depositada el 10 de octubre de 2011 en la colección DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany) con el número de acceso DSM 25298.
Descripción de las Figuras
FIGURA 1 :
La figura muestra la electroforesis en gel de agarosa al 1% de las digestiones de los plásmidos obtenidos con EcoRI. Carril 1: Generuler 1kb Fermentas®; carril 2: Yaku BH19: carril 3: Puri BH20; carril 4: Urna BH12.
FIGURA 2:
La figura muestra un esquema de la digestión con la enzima EcoRI de la secuencia del rDNA 16S de la cepa Puri BH20. La línea gruesa corresponde al fragmento clonado de la secuencia de rDNA 16S de 1494 pb, mientras que la delgada corresponde al trozo de plásmido incluido en la digestión. Se indica a 660 pb el único sitio de corte de la enzima al interior del inserto clonado.
FIGURA 3:
Esquema de la digestión con la enzima EcoRI de la secuencia del rDNA 16S de la cepa Yaku BH19. La línea gruesa corresponde al fragmento clonado de la secuencia de rDNA 16S de 1494 pb, mientras que la delgada corresponde al trozo de plásmido incluido en la digestión. Se indica a 660 pb y 991 pb los 2 sitios de corte de la enzima al interior del inserto clonado.
FIGURA 4:
Esquema de la digestión con la enzima EcoRI de la secuencia del rDNA 16S de la cepa Urna BH12. La línea gruesa corresponde al fragmento clonado de la secuencia de rDNA 16S de 1493 pb, mientras que la delgada corresponde al trozo de plásmido incluido en la digestión. Se indica a 660 pb y 991 pb los 2 sitios de corte de la enzima al interior del inserto clonado.
FIGURA 5:
La figura muestra el árbol filogenético sobre la base de datos de secuencias del rDNA 16S que ilustra la relación de las cepas Puri BH20, Yaku BH19 y Urna BH12 con los miembros descritos del género Acidithiobacillus. En este árbol filogenético se ha incluido también a cepas bacterianas del género Acidithiobacillus descritos en los siguientes documentos de patente: US 7.601.530, US 7.700.343 y JP 2007228960. El árbol filogenético, se realizó utilizando el método de máxima parsimonia
FIGURA 6:
La figura muestra el efecto de la temperatura en la velocidad de crecimiento en hierro (expresada como tiempos de generación) de la cepa Urna BH12 (cuadrados vacíos) y la cepa Puri BH20 (triángulos rellenos).
FIGURA 7:
La figura muestra un esquema del sistema utilizado para permitir la adherencia y el inicio de la formación de la biopelícula del consorcio bacteriano sobre el material de soporte. Este sistema está constituido por un bionreactor 1 , relleno con un material de soporte 2, un conducto 3 y una bomba 4, que permite la recirculación del líquido inoculado con el consorcio bacteriano. Se realiza la recirculación del líquido hasta que se alcanza la formación de la película del consorcio bacteriano sobre el material de soporte. El sistema se incubó a 5°C.
FIGURA 8:
La figura muestra un esquema del sistema utilizado para la producción continua de-un inoculante, constituido por una suspensión bacteriana del consorcio, desde un bionreactor de lecho fijo que contiene una material de soporte con la película del consorcio bacteriano. Para realizar la producción continua del inoculo bacteriano, el biorreactor 1 , relleno con un material de soporte 2 con la película del consorcio bacteriano se alimenta con medio de cultivo. El sistema está constituido por un estanque 5, que contiene el medio de cultivo 6, formado por una solución de sales y una entrada de aire 7, que permite la oxigenación del medio de cultivo. El medio de cultivo se alimenta al biorreactor 1 a través de un conducto 8, mediante una bomba 4. Para evitar la contaminación del medio de cultivo 6 que se encuentra en el estanque 5, se inserta un cuenta gotas 9 en el conducto 8. El paso del medio de cultivo por el biorreactor 1 permite la liberación continua de bacterias desde la biopelícula, lo que genera una suspensión bacteriana que constituye el inoculante para un proceso de biolixiviación. El sistema se incubó a 5°C.
FIGURA 9:
La figura muestra la generación del inoculante, a partir de un biorreactor que contiene una biopelícula de las cepas Puri BH20, Yaku BH19 y Urna BH12, por un periodo de 45 días. Se determinó la concentración microbiana mediante el análisis del ATP celular por bioluminiscencia (triángulos rellenos), empleando el método LixKit® (de acuerdo al protocolo del ensayo de bioluminiscencia de la empresa Biohidrica®) y el potencial de oxido reducción mediante un electrodo de Eh (cuadrados vacíos).
Los siguientes ejemplos ilustran algunas aplicaciones concretas de la invención, pero no pretenden limitar su marco o alcances.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
La cepa Puri BH20 DSM 25319 fue aislada de muestras obtenidas de drenajes ácidos de minas, empleando una estrategia orientada a la selección de microorganismos oxidantes de hierro, capaces de crecer a baja temperatura y con la habilidad de formar biopelículas sobre soportes sólidos. Las muestras se enriquecieron mediante cultivos sucesivos en matraces estáticos a 5°C con medio de cultivo 9K a pH 2,5. El medio de cultivo 9K está compuesto de una solución A y una solución B. Para preparar la solución A, en 900 mL de agua destilada se disuelve las siguientes sales: (NH4)2S04, 3,0 g; KCI, 0,1 g; K2HP04, 0,5 g; MgS0 x 7H20, 0,5 g y Ca( Ü3)2 0,01 g. Una vez preparada la solución, se le ajusta el pH a 2,5 con H2S04 1 N. La solución final se esteriliza en autoclave a 121 °C por 20 minutos. Para preparar la solución B, se disuelve 44,2 g de FeS04 x 7 H20 en 100 mL con agua destilada ajustada a pH 1,5 con H2S0 1N. Esta solución se esteriliza con filtros de membrana de 0,2 μηη. Luego, una vez que la solución A esté fría, se le adiciona de forma estéril la solución B. Posteriormente, la cepa pura Puri BH20 se aisló a partir de colonias obtenidas sobre filtros de membrana, utilizando un método simplificado y modificado de los filtros flotantes (de Bruyn, J.C., Boogerd, F. C, Bos, P., & Kuenen, G.J. 1990. Floating filters, a novel technique for isolation and enumeration of fastidious, acidophilic, iron-oxidizing, autotrophic bacteria. Appl. Environ. Microbiol., vol. 56(9), pp. 2891-2894). El análisis de la cepa obtenida mostró su capacidad de oxidar ion ferroso a férrico, su capacidad de crecer a baja temperatura y su habilidad de formar biopelículas sobre soportes sólidos.
La identificación molecular de la cepa se realizó a partir del DNA obtenido de un cultivo de 50 mL en medio 9K pH 2,5, incubado a 5°C e inoculado con 1 mL de un cultivo previo. El material genético se extrajo con el kit comercial Power Soil DNA isolation® de MoBio según las instrucciones del fabricante. Posteriormente, se amplificó por PCR el gen del rRNA16S, para lo cual se usó los partidores universales 8F y 1492R (Tabla 1), con el siguiente protocolo en el termociclador (Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler): hot start de 2 min a 94°C, 32 ciclos de: 1 minutos a 94°C, 1 minutos a 61 °C, 1 ,5 minutos a 72°C cada uno y finalmente una extensión de 10 minutos a 72°C. El amplicón obtenido, de 1494 pb, se clonó en bacterias DH5a ligándolo al plásmido pGem-T Easy® de Promega según las instrucciones del fabricante. Para verificar el correcto clonamiento del amplicón, se realizó un PCR de colonias con los partidores SP6 y T7 (Tabla 1) que se unen al plásmido pGem-T Easy® según el siguiente protocolo: hot start de 5 minutos a 95°C, 35 ciclos de 30 segundos a 94°C, 50 segundos a 55°C y 1 ,5 minutos a 72°C y finalmente una extensión de 5 minutos a 72°C.
Tabla 1: Partidores utilizados en el análisis molecular de las secuencias del rDNA16S
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Luego, se extrajo el plásmido de los clones positivos mediante el kit de extracción AxyPrep Plasmid miniprep kit de Axygen®, según las instrucciones del fabricante. Para esto, se incubó una colonia de cada clon positivo en tubos Falcon® de 15 mL con 3 mL de medio LB (NaCI 5 g/L, extracto de levadura 5 g/L, peptona de caseína 5 g/L) suplementado con ampicilina (100 mg/mL) por 14 horas a 37°C a 100 r.p.m. Una vez obtenidas las muestras, éstas se cuantificaron en el equipo Nanodrop® ND-1000 Spectrophotometer, para luego digerirlas con la enzima de restricción EcoRI de Fermentas® según las instrucciones del fabricante, todo esto con el fin de verificar que el fragmento clonado en los plásmidos fuera el esperado. El resultado de la digestión se muestra en la electroforesis de agarosa al 1% de la Figura 1. En el caso de la cepa Puri BH20 (Figura 1 , carril 3) se obtuvo 3 fragmentos: uno de 1516 pb que corresponde a la digestión de la enzima en los 2 sitios de corte del plásmido y por lo tanto, a la liberación del inserto clonado (1494 bp del inserto mas 22 pb del vector); uno de 668 pb y finalmente otro de 848 pb, los que corresponden a la digestión interna del inserto liberado. La Figura 2 muestra un esquema de la digestión con la enzima EcoRI de la secuencia del rDNA 6S de la cepa Puri BH20. La línea gruesa corresponde al fragmento clonado de la secuencia de rDNA 16S de 1494 pb, mientras que la delgada corresponde al trozo de plásmido incluido en la digestión. Se indica a 660 pb el único sitio de corte de la enzima al interior del inserto clonado.
Los plásmidos de los clones positivos fueron enviados a la empresa Macrogen® de Corea, para su secuenciacion. En la lista de secuencia se incluye la secuencia del gen del rDNA16S de la cepa Puri BH20 (Seq ID No. 1).
La secuencia del rDNA16S de la cepa Puri BH20 se analizó inicialmente empleando BLAST de la base de datos de NCBI (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). El alineamiento de esta secuencia con la base de datos de NCBI mostró que el microorganismo cultivado con mayor porcentaje de identidad (99%) es Acidithiobacillus ferrívorans NO-37.
La Figura 5 muestra la posición filogenética de la cepa Puri BH20 respecto a los otros miembros del género Acidithiobacillus. Se puede observar que esta cepa está incluida en el grupo compuesto por Acidithiobacillus ferrívorans NO-37, Acidithiobacillus ferrívorans Peru6, Acidithiobacillus ferrívorans CF27, Acidithiobacillus ferrívorans OP14 y Acidithiobacillus ferrívorans SS3. La Figura 5 también muestra que existe una importante distancia filogenética entre la cepa Puri BH20 y los microorganismos dados a conocer en los documentos de patente US 7.601.530, US 7.700.343 y JP 2007228960. Sobre la base de este estudio filogenético y las características fenotípicas de esta cepa descritas anteriormente (especialmente su movilidad y su psicrotolerancia), la bacteria Puri BH20, depositada como DSM 25319, se puede clasificar como una nueva cepa, con la capacidad de formar biopelículas en soportes sólidos, de Acidithiobacillus ferrívorans.
Ejemplo 2
La cepa Yaku BH19 DSM 25318 fue aislada y caracterizada filogenéticamente de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1. Como resultado de la digestión del plásmido que contiene como inserto clonado de la secuencia de rDNA 16S de la cepa Yaku BH19 (Figura 1 , carril 2) se obtuvo 3 fragmentos: uno de 668 pb, uno de 517 pb y finalmente uno de 331 pb, los que corresponden a la digestión interna del inserto liberado. Se observa una clara diferencia con la cepa Puri BH20, ya que cepa Yaku BH19 presenta un sitio de corte EcoRI adicional. La Figura 3 muestra un esquema de la digestión con la enzima EcoRI de la secuencia del rDNA 16S de la cepa Yaku BH19. La línea gruesa corresponde al fragmento clonado de la secuencia de rDNA 16S de 1494 pb, mientras que la delgada corresponde al trozo de plásmido incluido en la digestión. Se indica a 660 pb y 991 pb los 2 sitios de corte de la enzima al interior del inserto clonado. Los plásmidos de los clones positivos fueron enviados a la empresa Macrogen® de Corea, para su secuenciación. En la lista de secuencia se incluye la secuencia del gen del rDNA16S de la cepa Yaku BH19 (Seq ID No. 2).
La secuencia del rDNA16S de la cepa Yaku BH19 se analizó inicialmente empleando BLAST de la base de datos de NCBI (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). El alineamiento de esta secuencia con la base de datos de NCBI mostró que el microorganismo cultivado con mayor porcentaje de identidad (99%) es Acidithiobacillus fem'vorans SS3.
La Figura 5 muestra la posición filogenética de la cepa Yaku BH19 respecto a los otros miembros del género Acidithiobacillus. Se puede observar que esta cepa, a diferencia de la cepa Puri BH20, no está incluida en el grupo compuesto por Acidithiobacillus fenivorans NO- 37, Acidithiobacillus fenivorans Peru6, Acidithiobacillus fenivorans CF27, Acidithiobacillus fem'vorans OP14 y Acidithiobacillus fenivorans SS3. Sin embargo, la cepa Yaku BH19 tiene una relación filogenética estrecha con este grupo. La Figura 5 también muestra que existe una importante distancia filogenética entre la cepa Yaku BH19 y los microorganismos dados a conocer en los documentos de patente US 7.601.530, US 7.700.343 y JP 2007228960. Sobre la base de este estudio filogenético y las características fenotípicas de esta cepa descritas anteriormente (especialmente su movilidad y psicrotolerancia), la bacteria Yaku BH19, depositada como DSM 25318, se puede clasificar como una nueva cepa con la capacidad de formar biopelículas en soportes sólidos de Acidithiobacillus fem'vorans.
Ejemplo 3
La cepa Urna BH12 DSM 25298 fue aislada y caracterizada filogenéticamente de la misma manera como se describe en el Ejemplo 1. Como resultado de la digestión del plásmido que contiene como inserto clonado de la secuencia de rDNA 16S de la cepa Urna BH12 (Figura 1, carril 4) se obtuvo 3 fragmentos: uno de 668 pb, uno de 516 pb y finalmente uno de 331 pb, los que corresponden a la digestión interna del inserto liberado. La Figura 4 muestra un esquema de la digestión con la enzima EcoRI de la secuencia del rDNA 16S de la cepa Urna BH12. La línea gruesa corresponde al fragmento clonado de la secuencia de rDNA 16S de 1493 pb, mientras que la delgada corresponde al trozo de plásmido incluido en la digestión. Se indica a 660 pb y 991 pb los 2 sitios de corte de la enzima al interior del inserto clonado.
Los plásmidos de los clones positivos fueron enviados a la empresa Macrogen® de Corea, para su secuenciación. En la lista de secuencia se incluye la secuencia del gen del rDNA16S de la cepa Urna BH12 (Seq ID No. 3).
La secuencia del rDNA16S de la cepa Urna BH12 se analizó inicialmente empleando BLAST de la base de datos de NCBI (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). El alineamiento de esta secuencia con la base de datos NCBI mostró que el microorganismo cultivado con mayor porcentaje de identidad (99%) es Acidithiobacillus ferrooxidans YTW. La Figura 5 muestra la posición filogenética de la cepa Urna BH12 respecto a los otros miembros del género Acidithiobacillus. Se puede observar que esta cepa, está relacionada filogenéticamente con Acidithiobacillus ferrooxidans YTW. De acuerdo a este árbol basado en las secuencias del rDNA16S, la cepa Urna BH12 está más cercana filogenéticamente a Acidithiobacillus ferrivorans que a Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270. La cepa Urna BH12 comparte con Acidithiobacillus ferrivorans la característica de ser psicrotolerante, pero presenta otras características fenotípicas, tales como su incapacidad de movimiento y su menor tamaño que la hacen semejante Acidithiobacillus ferrooxidans. La Figura 5 muestra también que existe una importante distancia filogenética entre la cepa Urna BH12 y los microorganismos dados a conocer en los documentos de patente US 7.601.530, US 7.700.343 y JP 2007228960. Sobre la base de este estudio filogenético y las características fenotípicas de esta cepa, descritas anteriormente, la bacteria Urna BH12, depositada como DSM 25298, se puede clasificar, como una nueva cepa psicrotolerante con la capacidad de formar biopelículas en soportes sólidos del género Acidithiobacillus.
Ejemplo 4
Se realizó el crecimiento de la cepa Urna BH12 y de la cepa Puri BH20 en hierro a distintas temperaturas. Para ello se inoculó 1 mL de cada una de estas cepas en distintos matraces Erlenmeyer de 125 mL con 50 mL de medio 9K, pH 2,5, según lo descrito en el Ejemplo 1. Los matraces se incubaron paralelamente, en forma estática, a las siguientes temperaturas: 5°C, 10°C, 15°C, 21 °C, 28°C y 35°C. Se realizó el recuento bacteriano periódicamente empleando la cámara de Petroff Hausser, observada mediante un microscopio de contraste de fase (Cari Zeiss Axioskop 20). A partir de las curvas de cinética de crecimiento se determinó el tiempo de generación para cada cepa a cada temperatura. La Figura 6 muestra el efecto de la temperatura en la velocidad de crecimiento en hierro (expresada como tiempos de generación) de la cepa Urna BH12 (cuadrados vacíos) y la cepa Puri BH20 (triángulos rellenos). Se observa que la cepa Urna BH12 presenta un amplio margen de temperatura para el crecimiento, entre 5 y 35°C, con un mínimo de tiempo de generación a 21°C. No se observó crecimiento a 42°C. Esta cepa fue capaz de crecer a 5°C, pero con un tiempo de generación de aproximadamente 450 horas. Por otra parte, la cepa Puri BH20 presenta un margen de temperatura para el crecimiento, entre 5 y 28°C, pero no fue capaz de crecer a 35°C. Su menor tiempo de generación se presentó a 28°C. Esta cepa fue capaz de crecer a 5°C con un tiempo de generación de aproximadamente 60 h.
Ejemplo 5:
Se realizó el crecimiento de las cepas Yaku BH19 y Puri BH20 en hierro a 5°C. Para ello se inoculó 1 mL de cada una de estas cepas en distintos matraces Erlenmeyer de 125 mL con 50 mL de medio 9K, ρΗ 2,5, según lo descrito en el Ejemplo 1. Los matraces se incubaron paralelamente en forma estática a 5°C. Se realizó el recuento bacteriano periódicamente empleando la cámara de Petroff Hausser, y se observó mediante un microscopio de contraste de fase (Cari Zeiss Axioskop 20). A partir de las curvas de cinética de crecimiento a 5°C se determinó para la cepa Yaku BH19 un tiempo de generación de 117 horas y para la cepa Puri BH20 un tiempo de generación de 62 horas.
Ejemplo 6
Para realizar la producción continua de un inoculante en un biorreactor de lecho fijo, se diseñó un biorreactor en forma de columna, constituido por un tubo de policarbonato transparente de 1 cm de largo y 2,4 cm de diámetro, al cual se le realizó hilos en ambos extremos, para cerrarlo con tapas de PVC. A estas últimas, se les colocó un adaptador de polipropileno para permitir la unión de un conectar en ambos extremos del biorreactor. El biorreactor se rellenó con un material de soporte sólido constituido por 41 g de perlas de vidrio de 3 mm de diámetro. El biorreactor se inoculó rellenándolo con una suspensión bacteriana que contenía las cepas Puri BH20, Yaku BH19 y Urna BH12. Para mantener la temperatura del biorreactor a 5°C, éste se sumerge en un baño refrigerado controlado a 5°C (como liquido refrigerante se empleó etilenglicol al 10%). La Figura 7 muestra un esquema del sistema utilizado para permitir la adherencia y el inicio de la formación de la biopelícula del consorcio bacteriano sobre el material de soporte. Este sistema está constituido por un biorreactor 1 (descrito anteriormente), relleno con un material de soporte 2 (41 g de perlas de vidrio de 3 mm de diámetro) un conducto 3, constituido por una manguera de silicona Masterflex® N° 13 y una bomba 4 peristáltica Masterflex® con cabezal N° 13, que permite la recirculación del líquido inoculado con el consorcio bacteriano con un flujo de aproximadamente 8 mIJh. Se realizó la recirculación del líquido por 21 días, hasta que se alcanza la adherencia y el inicio de la formación de la biopelícula del consorcio bacteriano sobre el material de soporte.
Una vez que se logró la adherencia y el inicio de la formación de la biopelícula del consorcio bacteriano sobre el material de soporte, se inició la alimentación continua de una solución de sales, constituida por el medio 9K diluido. El medio de cultivo 9K diluido está compuesto de una solución A y una solución B. Para preparar la solución A, en 990 mL de agua destilada se disuelven las siguientes sales: (NH4)2S04, 0,6 g; KCI, 0,02 g; K2HP0 > 0,1 g; MgS04 x 7H20, 0,1 g y Ca(N03)2 0,002 g. Una vez preparada la solución, se le ajusta el pH a 2,5 con H2SO4 1N. La solución final se esteriliza en autoclave a 121 °C por 20 minutos. Para preparar la solución B, se disuelve 4,42 g de FeS04 x 7 H20 en 10 mL con agua destilada ajustada a pH 1,5 con H2S04 1N. Esta solución se esteriliza con filtros de membrana de 0,2 μητ Luego, una vez que la solución A esté fría, se le adiciona de forma estéril la solución B. La Figura 8 muestra un esquema del sistema utilizado para la producción continua del inoculante constituido por una suspensión bacteriana del consorcio desde un biorreactor de lecho fijo que contiene una material de soporte con la película del consorcio bacteriano. Para esto, el biorreactor 1 , relleno con un material de soporte 2 con la película del consorcio bacteriano se alimenta con medio de cultivo. El sistema está constituido por un estanque 5 (frasco de vidrio Schott® de 10 L), que contiene el medio de cultivo 6 y una entrada de aire 7, que permite la oxigenación del medio de cultivo. Para mantener baja la temperatura del medio de cultivo el estanque 5 se colocó al interior de un refrigerador controlado a 5°C. El medio de cultivo se alimenta al biorreactor 1 a través de un conducto 8, constituido por una manguera de silicona Masterflex® N° 13 y una bomba 4 peristáltica Masterflex® con cabezal N° 13, que permite la alimentación del biorreactor con el medio de cultivo del líquido inoculado con un flujo promedio de 0,8 mlih. Para evitar la contaminación del medio de cultivo 6 que se encuentra en el estanque 5, se coloca un cuenta gotas 9 en el conducto 8. El paso del medio de cultivo por el biorreactor 1 permite la liberación continua de bacterias desde la biopelícula, lo que genera una suspensión bacteriana que constituye el inoculante para un proceso de biolixiviación.
Después de aproximadamente un mes de alimentación continua del biorreactor 1, se observó que la solución saliente presentaba un color café-rojizo, debido a la oxidación de ión ferroso del medio de cultivo a ión férrico y se observó microscópicamente la presencia de bacterias.
Para evaluar la evolución de estos cultivos, se realizó el seguimiento en el tiempo de los parámetros en la salida del biorreactor por un periodo de 45 días. Para ello, se determinó semanalmente la concentración microbiana mediante el análisis del ATP celular por bioluminiscencia, empleando el método LixKit® (de acuerdo al protocolo del ensayo de bioluminiscencia de la empresa Biohidrica®), el potencial de oxido reducción mediante un electrodo de Eh, el valor de pH, y se observó las características morfológicas y de movilidad por microscopía. La Figura 9 muestra la presencia permanente de la biomasa bacteriana activa en la salida del biorreactor, medida como ATP bacteriano en unidades relativas de luz (URL) y el potencial de oxido-reducción de la solución.
Se mantuvo la operación del proceso de generación continua del inoculante por un periodo de 18 meses. La presencia de las cepas Puri BH20, Yaku BH19 y Urna BH12 en la salida del biorreactor se confirmó concentrando por centrifugación el efluente del biorreactor, realizando la extracción del DNA bacteriano, amplificando el rDNA 16S por PCR, obteniendo diferentes clones y enviando los plásmidos de los clones positivos a la empresa Macrogen® de Corea, para su secuenciación, de acuerdo a método descrito en el ejemplo 1.
Ejemplo 7
Se realizó la producción continua de un inoculante en un biorreactor de lecho fijo de la misma manera que en el Ejemplo 6, con la diferencia que la biopelícula estaba formada por las cepas Puri BH20 y Urna BH12. Se mantuvo la operación del proceso de generación continua del inoculante por un periodo de 18 meses. La presencia de las cepas Puri BH20 y Urna BH12 en la salida del biorreactor se confirmó concentrando por centrifugación el efluente del biorreactor, realizando la extracción del DNA bacteriano, amplificando el rDNA 16S por PCR, obteniendo diferentes clones y enviando los plásmidos de los clones positivos a la empresa acrogen® de Corea, para su secuenciación, de acuerdo a método descrito en el ejemplo 1.
Ejemplo 8
Se realizó la producción continua de un inoculante en un biorreactor de lecho fijo de la misma manera que en el Ejemplo 6, con la diferencia que la biopelícula estaba formada por las cepas Puri BH20 y Yaku BH19 y el biorreactor se rellenó con 41 g de Celite R635 (pellet de 1,6 cm de tierra de diatomeas, fabricado por Celite Corporation, EEUU).
Se mantuvo la operación del proceso de generación continua del inoculante por un periodo de 8 meses. La presencia de las cepas Puri BH20 y Yaku BH19 en la salida del biorreactor se confirmó concentrando por centrifugación el efluente del biorreactor, realizando la extracción del DNA bacteriano, amplificando el rDNA 16S por PCR, obteniendo diferentes clones y enviando los plásmidos de los clones positivos a la empresa Macrogen® de Corea, para su secuenciación, de acuerdo a método descrito en el ejemplo 1.
Ejemplo 9
Se realizó la producción continua de un inoculante en un biorreactor de lecho fijo de la misma manera que en el Ejemplo 6, con la diferencia que la biopelícula estaba formada por las cepas Puri BH20 y Yaku BH19 y el biorreactor se rellenó 20 g pirita cristalina de un tamaño de partícula de aprox. 4 mm., mezclada con 21 g de perlas de vidrio de 3 mm de diámetro. En este caso, se utilizó un medio 9K diluido con baja concentración de sulfato de hierro. Este medio de cultivo está compuesto de una solución A y una solución B. Para preparar la solución A, en 999 mL de agua destilada se disuelven las siguientes sales: (NH )2S04, 0,6 g; KCI, 0,02 g; K2HP04, 0,1 g; MgS04 x 7H20, 0,1 g y Ca(N03)2 0,002 g. Una vez preparada la solución, se le ajusta el pH a 2,5 con H2S04 1N. La solución final se esterilizó en autoclave a 121 °C por 20 minutos. Para preparar la solución B, se disuelve 4,42 g de FeS04 x 7 H20 en 10 mL con agua destilada ajustada a pH 1,5 con H2S041 . Esta solución se esteriliza con filtros de membrana de 0,2 pm. Luego, una vez que la solución A esté fría, se adiciona de forma estéril 1 mL de la solución B.
Se mantuvo la operación del proceso de generación continua del inoculante por un periodo de 8 meses. La presencia de las cepas Puri BH20 y Yaku BH19 en la salida del biorreactor se confirmó concentrando por centrifugación el efluente del biorreactor, realizando la extracción del DNA bacteriano, amplificando el rDNA 16S por PCR, obteniendo diferentes clones y enviando los plásmidos de los clones positivos a la empresa Macrogen® de Corea, para su secuenciación, de acuerdo a método descrito en el ejemplo 1.
Ejemplo 10
Se realizó la producción continua de un inoculante en un biorreactor de lecho fijo de la misma manera que en el Ejemplo 9, con la diferencia que la biopelícula estaba formada por la cepa Yaku BH19 y el biorreactor se rellenó con 20 g de un mineral sulfurado cristalino (constituido por 82.46% de calcopirita, 15,55% de calcosina, 1 ,35% de pirita y 0,65% de ganga no metálica), de un tamaño de partícula de aprox. 4 mm., mezclado con 21 g de perlas de vidrio de 3 mm de diámetro. Se utilizó el medio de cultivo descrito en el Ejemplo 9.
Se mantuvo la operación del proceso de generación continua del inoculante por un periodo de 18 meses. La presencia de la cepa Yaku BH19 en la salida del biorreactor se confirmó concentrando por centrifugación el efluente del biorreactor, realizando la extracción del DNA bacteriano, amplificando el rDNA 16S por PCR, obteniendo diferentes clones y enviando los plásmidos de los clones positivos a la empresa Macrogen® de Corea, para su secuenciación, de acuerdo a método descrito en el Ejemplo 1.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Cepas bacterianas aisladas de Acidithiobacillus, CARACTERIZADAS PORQUE dichas cepas de Acidithiobacillus denominadas Puri BH20, Yaku BH19 y Urna BH12, están depositadas en la colección DSMZ (Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania) con los números de acceso DSM 25319, DSM 25318 y DSM 25298, respectivamente y tienen la capacidad de adherirse a soportes sólidos, separadamente o en consorcio, formando una biopelícula.
2. Cepas bacterianas aisladas, de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADAS PORQUE, dichas cepas tienen la capacidad de crecer a temperaturas entre 5 y 28 °C.
3. Cepas bacterianas aisladas, de acuerdo a la reivindicación 2, CARACTERIZADAS PORQUE, dichas cepas tienen la capacidad de crecer a temperaturas entre 5 y 15 °C.
4. Cepas bacterianas aisladas, de acuerdo a la reivindicación 3, CARACTERIZADAS PORQUE, dichas cepas tienen la capacidad de crecer a temperaturas entre 5 y 10 °C.
5. Cepas bacterianas aisladas, de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADAS PORQUE dicha cepa Puri BH20 es un cultivo biológicamente puro de Acidithiobacillus ferrivorans, depositado en la colección DSMZ con el número de acceso DSM 25319.
6. Cepas bacterianas aisladas, de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADAS PORQUE dicha cepa Yaku BH19 es un cultivo biológicamente puro de Acidithiobacillus ferrivorans, depositado en la colección DSMZ con el número de acceso DSM 25318.
7. Cepas bacterianas aisladas, de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADAS PORQUE dicha cepa Urna BH12 es un cultivo biológicamente puro de Acidithiobacillus sp., depositado en la colección DSMZ con el número de acceso DSM 25298.
8. Cepas bacterianas aisladas, de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADAS PORQUE forman un consorcio que comprende al menos dos de las cepas de Acidithiobacillus depositadas con los número de acceso DSM 25319, DSM 25318 y DSM 25298 o una combinación de todas estas.
9. Un proceso para la generación continua de un inoculante para un proceso de biolixiviación de minerales sulfurados que utiliza las cepas bacterianas, de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADO PORQUE comprende: a) inocular una cepa bacteriana aisladas de Acidithiobacillus, seleccionada del grupo de DSM 25319, DS 25318 y DSM 25298 o un consorcio bacteriano, que comprende al menos dos de las cepas de Acidithiobacillus depositadas con los número de acceso DSM 25319, DSM 25318 y DSM 25298 o una combinación de todas estas, en un biorreactor que contiene un material de soporte y una solución de sales minerales. b) permitir la adherencia y el inicio de la formación de la biopelícula de la cepa bacteriana aislada de Acidithiobacillus, o del consorcio bacteriano sobre el material de soporte. c) una vez que se alcanza la formación de la biopelícula sobre el material de soporte, iniciar la alimentación continua de una solución de sales minerales al reactor, para producir en forma continua una suspensión células bacterianas de la cepa bacteriana aislada de Acidithiobacillus, o el consorcio bacteriano; y d) conducir la suspensión células bacterianas generada en el biorreactor a una pila o botadero de un mineral sulfurado a temperaturas ambientales entre 0 y 20 °C.
10. Un proceso, de acuerdo a la reivindicación 10, CARACTERIZADO PORQUE dichas temperaturas ambientales están entre 0 y 15 °C.
11. Un proceso, de acuerdo a la reivindicación 9, CARACTERIZADO PORQUE dichas temperaturas ambientales están entre 5 y 10 °C.
12. Un proceso, de acuerdo a las reivindicaciones 9 a 10, CARACTERIZADO PORQUE la solución de sales minerales contiene sales de hierro (II).
13. Un proceso, de acuerdo a las reivindicaciones 9 a 11 , CARACTERIZADO PORQUE el material de soporte para la formación de la biopelícula se selecciona de vidrio, tierra de diatomeas, tierra de diatomeas en forma de pellets, azufre, minerales sulfurados y silicatos.
14. Un proceso, de acuerdo a las reivindicaciones 9 a 12, CARACTERIZADO PORQUE el biorreactor es un biorreactor de lecho fluidizado.
15. Un proceso, de acuerdo a las reivindicaciones 10 a 12, CARACTERIZADO PORQUE el biorreactor es un biorreactor de lecho fijo.
16. Un proceso, de acuerdo a la reivindicación 14, CARACTERIZADO PORQUE el biorreactor es un biofiltro.
17. Uso de las cepas bacterianas aisladas, de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADO PORQUE dichas cepas se usan como un inoculante para un proceso de biolixiviación de minerales sulfurados.
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