WO2013108983A1 - ｐＨ-반응 고밀도 리포단백질-유사 입자 결합체 - Google Patents

ｐＨ-반응 고밀도 리포단백질-유사 입자 결합체 Download PDF

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WO2013108983A1
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권대혁
신재윤
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Sungkyunkwan University
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/14—Peptides being immobilised on, or in, an inorganic carrier
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1275—Lipoproteins or protein-free species thereof, e.g. chylomicrons; Artificial high-density lipoproteins [HDL], low-density lipoproteins [LDL] or very-low-density lipoproteins [VLDL]; Precursors thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides

Definitions

  • the present invention relates to a pH-responsive high density lipoprotein-like particle conjugate, and more particularly, the present invention relates to apolipoprotein AI (apoA-I) and to the drug contained therein so as to release a drug trapped therein under acidic pH conditions.
  • a high density lipoprotein (HDL) -like particle conjugate comprising a drug and a method for preparing the same.
  • nano-particles (NPs) in the form of liposomes capable of delivering drugs under specific cell-specific environmental conditions such as pH and temperature may be used to improve selectivity for specific cells. All cells present in vivo generally have uniform environmental conditions (especially temperature conditions, etc.), but also partially have cell-specific or tissue-specific environmental conditions. For example, compared to normal tissues, the tissue site in which the cancer develops is known to have a low pH level.
  • liposome complexes (Tirrell et al., Macromolecules, 1984, 17, 1692), in which polyethylacrylic acid and phosphatidylcholine bind to the outside of liposomes and change the structure of liposomes according to the change in acidity
  • Liposome complexes (Francis et al., Biomacromolecules 2001, 2, 741), which are composed of aliphatic polymers that contain liposomes and can be changed according to acidity changes, and are acrylic acid and n- Polymer-liposomal nanocomposites (Korean Patent Registration No.716802) have been developed using polymers composed of alkyl methacrylates.
  • aliphatic polymers containing acrylic acid have been developed using polymers composed of alkyl methacrylates.
  • aliphatic polymers containing acrylic acid have been
  • liposome-drug complexes prepared using peptide-phospholipid particles composed of phospholipids, unsaturated fats and peptides exhibiting flexibility (WO 2009/073984), cationic amphiphilic molecules And pH-responsive liposomes (WO 2010/104128) composed of anionic positively-philic molecules have been developed.
  • the drug complex or liposome developed as described above is configured to include multiple components in order to impart various properties.
  • the drug complex or liposome including multiple components has a disadvantage in that long-term stability is not proven.
  • the medicine used for a particular disease is not prepared immediately and administered to the patient when the patient occurs, but is prepared and stored in advance in large quantities, and then delivered to the patient when the drug is required, so the liposome is used for medical purposes.
  • the drug complex or liposomes developed above are susceptible to various salts due to various components, and thus long-term stability has not been demonstrated. Therefore, there is a need for the development of drug complexes or liposomes of the material that can maintain the long-term stability while controlling the release of the drug according to tissue-specific pH changes.
  • the inventors of the present invention when forming a high-density lipoprotein (HDL) -like particle conjugate using apo lipoprotein AI (apoA-I) known as a conventional lipoprotein, can control the release of the drug according to the pH change, It was confirmed that the stability can be maintained in the long term, and completed the present invention.
  • HDL high-density lipoprotein
  • apoA-I apo lipoprotein AI
  • One object of the present invention is to provide a high density lipoprotein (HDL) -like particle binder capable of releasing a pH dependent entrapped material.
  • HDL high density lipoprotein
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing the HDL-like particle binder.
  • the high-density lipoprotein (HDL) -like particle conjugate of the present invention can release the drug collected under acidic conditions, but exhibits stability even when the temperature is varied in a wide range in non-acidic conditions. It will be widely used in the development of
  • 1 is a schematic of nanoparticles capable of releasing the pH dependent entrapped material of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph illustrating a process of determining the sizes of PTX-NP and PTX-PL-NP.
  • A is a graph showing the results of size exclusion chromatography analysis of PTX-NP and PTX-PL-NP
  • B is a graph showing the results of size exclusion chromatography analysis of free apoA-I
  • C is PTX It is a graph showing the results of dynamic light scattering analysis for -NP
  • (D) is a graph showing the results of dynamic light scattering analysis for PTX-PL-NP.
  • FIG. 3 is an electron micrograph showing the results of transmission electron microscopic analysis of nanoparticles capable of releasing the pH-dependently collected material of the present invention
  • a and B shows two representative images of PTX-NP
  • C And D shows two representative images of PTX-PL-NP, with scale bars showing 20 nm.
  • FIG. 4 is a graph showing the time and pH-dependent emission of PTX from PTX-NP, (A) shows the results of measuring static light scattering in proportion to the amount of dissolved NPs as a function of time under various pH conditions, ( B) shows the results of analysis of SEC using apoA-I peel removal from PTX-NP.
  • Figure 5 is a graph showing the thermal stability of PTX-NP, the sample was incubated for 120 hours at 4 °C ( ⁇ ), 25 °C ( ⁇ ) and 37 °C ( ⁇ ), as a liposome control, one large double layer Phosphorous endoplasmic reticulum was incubated at 4 ° C. ( ⁇ ) for 120 hours and the light scattering intensity was measured after centrifugation to remove large precipitates (15,000 rpm for 30 minutes).
  • Figure 6 is a graph comparing the size of each HDL-like particle conjugate and apoA-I prepared by reacting DX (doxorubicin), MTX (methotrexate), SF (Sorafenib) or EpoB (Epothilone B) and apoA-I .
  • Figure 7 is a graph showing the results of comparing the size of the original EpoB and EpoB dissociated from the HDL-like particle conjugate (Epo NP) containing EpoB.
  • FIG. 9 is a graph showing the survival rate of the cells according to the concentration of the drug or SK-OV3 cells treated with HDL-like particle conjugate containing the drug.
  • the present invention comprises apolipoprotein AI (apoA-I) and drugs encapsulated therein, the high-density lipoprotein (HDL)-which can release the pH-dependently captured drug Similar particle binders are provided.
  • apoA-I apolipoprotein AI
  • HDL high-density lipoprotein
  • apolipoprotein AI (apoA-I) is composed of a single polypeptide consisting of 243 amino acids having a molecular weight of 28 kDa, and has 11 repeating amino acids or 8 repeating domains consisting of 22 amino acids. It means a protein having a ratio of the alpha-helix of the secondary structure forming a 60 to 75%, preferably a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a protein that can be expressed from the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: Can be.
  • the apoA-I is mainly used as a component of high density lipoprotein (HDL), which plays a direct role in removing cholesterol from surrounding tissues and transporting it to the liver or other lipoproteins.
  • HDL high density lipoprotein
  • the apoA-I is used as a constituent component of the HDL-like particle conjugate, and the apoA-I captures a desired drug and performs a function of releasing a pH-dependently captured drug.
  • It can be any kind of native or variant protein that can. For example, one or several amino acids at one or more positions of the amino acid sequence of native apoA-I or native apoA-I, as long as it can capture the desired drug and release the pH dependent captured drug.
  • Protein mutants or artificial modifications having an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion or addition of the same, and at least 80%, preferably at least 90%, more preferably of the amino acid sequence of the native apoA-I May be a protein having a homology of at least 95%, particularly preferably at least 97%, but is not particularly limited thereto.
  • the drug is not particularly limited, but may be administered to tissues exhibiting an acidic pH to be a substance capable of treating, alleviating, or preventing a particular disease or disorder.
  • the drug includes apoA- Paclitaxel, doxorubicin, MTX (methotrexate), SF (Sorafenib), EpoB (Epothilone B), cyclosporine, ursodeoxycholic acid (UDCA), Ilaprazole, amine derivatives (e.g. leevec, etc.) It may be a drug having a steroidal backbone, but is not particularly limited thereto.
  • emulsified paclitaxel (PTX) used as a drug through heating in the presence of a phospholipid and a surfactant HDL-like particle binder composed of phospholipids, PTX and apoA-I, mixed by adding apoA-I while diluting the concentration of the surfactant below the critical micelle concentration through dilution, and centrifugation and size exclusion chromatography PTX-PL-NP) was prepared (Example 1-2), and sonication of paclitaxel (PTX) used as a drug in the presence of a surfactant was carried out to capture PTX inside the micelle composed of a surfactant, and then diluted.
  • PTX emulsified paclitaxel
  • PTX-NP HDL-like particle conjugate
  • PTX-PN-NP has a diameter of 12.2nm, while PTX-NP is 9.2 It was confirmed that the structure has a diameter of nm (Fig. 2c and d), PTX-NP shows a circular form (Fig. 3), while PTX-PL-NP shows a ring-like structure having a halo circle of the border 3C and d.
  • PTX-PL-NP maintained a stable structure at a pH of 3.8 to 10.0
  • PTX -NP maintained a stable structure in neutral and basic conditions (pH 7.7 to 10.0)
  • acidic conditions pH 3.8 and 5.5
  • the PTX-NP was confirmed to maintain a stable structure even under a wide range of temperature conditions in the neutral and basic conditions (Fig. 5).
  • the present invention provides a method for producing the HDL-like particle binder.
  • the method for producing the HDL-like particle conjugate of the present invention comprises the steps of: (a) sonicating a buffer containing a desired drug and a surfactant, trapping the desired drug in the micelle composed of the surfactant; (b) adding a buffer containing apolipoprotein A-I (apoA-I) to the sonicated reactant to dilute the reactant; And (c) recovering the lipoprotein (HDL) -like particle conjugate from the diluted reactant.
  • apoA-I apolipoprotein A-I
  • the drug may be a drug that can be easily captured and discharged by apoA-I including a ring structure, preferably paclitaxel, but is not particularly limited thereto.
  • the surfactant may be used that can form a micelle by sonic grinding, preferably sodium cholate, but is not particularly limited thereto.
  • the buffer may be used for all kinds of buffers that can maintain a neutral pH, preferably may be a disk-forming buffer that can maintain pH 7.4, including 10mM Tris HCl and 100mM NaCl, but is not particularly limited Does not.
  • the sound wave pulverization may be carried out under a condition of irradiating with a short time interval as a condition of the minimum output of the sound wave so as not to generate heat in the temperature conditions of the low temperature phase, preferably the total output at a temperature condition of 5 to 15 °C 5 to 20% of the output may be performed under the condition of irradiating sound waves 1 to 10 times for 5 to 20 seconds at intervals of 1 to 3 seconds, but is not particularly limited thereto.
  • the dilution is carried out for the purpose of removing the micelles formed by the surfactant by lowering the concentration of the surfactant contained in the reaction solution, and for the purpose of adding the appropriate molar ratio of apoA-I to the drug.
  • -I is carried out in such a way that the same buffer dissolved in the appropriate concentration is added.
  • the mixing ratio of the drug and the added apoA-I may be preferably 1:10 to 1: 200 (molar ratio), more preferably 1:20 to 1: 150 (molar ratio), and most preferably It may be 1:50 to 1: 100 (molar ratio), but is not particularly limited thereto.
  • the method of recovering the HDL-like particle binder is not particularly limited, but may be performed through a size exclusion chromatography method.
  • the surfactant in order to improve the production yield of the HDL-like particle binder and to easily remove impurities, after the step (b), the surfactant is completely removed or the HDL-like particles from the diluted reactant.
  • the method may further comprise centrifuging the reaction to remove the precipitate prior to recovering the binder.
  • the removal of the surfactant may be performed using a method of treating a surfactant adsorbent, a dialysis method, a chromatography method and the like.
  • the surfactant adsorbent is a polystyrene copolymer.
  • Bio-bead SM2 XAD 1, XAD 2, XAD 3, XAD 4, IRC and the like can be used, but is not particularly limited thereto.
  • the chromatography method may be performed using a gel filtration chromatography method, but is not particularly limited.
  • Phospholipids 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine were prepared in 25 mM stock solution in chloroform and placed on the inner wall of the test tube. It was dried with nitrogen gas to produce a lipid film. The glass tube containing the phospholipid film was placed overnight in vacuo to remove the remaining solvent. The dried POPC film was mixed in a disk forming buffer (10 mM Tris HCl, 100 mM NaCl, pH 7.4) with 100 mM sodium cholate, a kind of surfactant, and dissolved by heating at 60 ° C. to achieve a final ratio of lipid to cholate. Set to 1: 4 and further dissolve at 37 ° C.
  • 0.1 ml of 1.64 mM POPC solution was then mixed with paclitaxel (PTX, 1.64 mM) at a concentration of 4 mg / ml dissolved in disk formation buffer containing 100 mM sodium cholate.
  • PTX paclitaxel
  • the mixed solution was diluted with 2 ml disk formation buffer containing purified apoA-I to remove the sodium cholate concentration by lowering it below the critical micelle concentration.
  • the mixing ratio of apoA-I to (PTX + POPC) was maintained at 1:75 (molar ratio).
  • the diluted mixed solution was centrifuged at 15,000 rpm for 30 minutes to aggregate the protein and lipids to remove precipitates and to obtain a supernatant.
  • the supernatant obtained was subjected to size exclusion chromatography (SEC) using a Superdex-200 10/300 GL column on an ACTA FPLC device (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) while maintaining the temperature at 25 ° C.
  • SEC size exclusion chromatography
  • the column was equilibrated using a suitable buffer solution (10 mM Tris HCl, pH 8.0), the injection amount of the sample is 100ul, the injection rate of the sample was carried out under the condition of 0.5ml / min.
  • HDL-like paclitaxel nanoparticles (PTX-PL-NP) were prepared and showed a final PTX recovery of 50-60%.
  • PTX-PL-NP could be obtained following procedures widely used for HDL-like particle conjugates, but without HDL-like paclitaxel nanoparticles (PTX-NP) ) could not be formed in the same way as above.
  • the sound wave grinding method of the disk-forming buffer containing 100 mM sodium cholate and PTX (1.64 mM) dissolved at 4 mg / ml PTX was trapped inside micelles formed by sodium cholate.
  • the used acoustic grinding condition is that the probe that the sound wave is output is composed of the micro-tip type within the minimum output 20% by using the size that can be probed inside the sample at intervals of 1 second at low temperature so that heat does not occur. Repeated three times for 10 seconds.
  • the sonic milled disk formation buffer was then diluted with 2 ml disk formation buffer containing apoA-I to lower the sodium cholate concentration below the critical micelle concentration, wherein the mixing ratio of apoA-I to PTX was 1: It was 100 (molar ratio).
  • Bio-beads SM-2 bio-Rad Laboratories
  • a surfactant adsorbent was added to the diluted mixed solution to completely remove sodium cholate present below the critical micelle concentration, and then as in Example 1-2.
  • HDL-like particle conjugates (PTX-NP) were prepared by sequentially applying centrifugation and size exclusion chromatography (SEC) to determine the concentration of apoA-I, PTX concentration and production yield.
  • Example 1-4 Dynamic Light Scattering and Transmission Electron Microscopy
  • PTX was quantified using a Capcell Pak C18 MG reversed phase column (Shiseido, Tokyo, Japan) and high pressure liquid chromatography (HPLC) equipped with an ultraviolet detector. Pure ethanol was used as the isocratic mobile phase at a flow rate of 1.0 ml / min. Paclitaxel concentrations were quantified from standard curves.
  • PTX emissions from HDL-like particle binders were observed using static light scattering. Static light scattering was measured using a Molecular Device SpectraMax M2 Fluorimeter with excitation and emission at 500 nm. After measuring the value for 2 hours at the same pH (7.4), the pH of the sample was increased or decreased.
  • HDL-like particle binders reported so far did not show pH dependence. Almost all HDL-like particle binders included phospholipids, cholesterol and cholesteryl esters as well as fat affinity drugs. Since phospholipids such as phosphatidylcholine are important for apoA-I binding around the edges of disc nanostructures, it was inferred that excluding phospholipids from NP would be sensitive to environmental changes such as pH.
  • PTX-PL-NP and PTX-NP two types of HDL-like particle conjugates (PTX-PL-NP and PTX-NP) were prepared using apoA-I, and the reverse phase chromatography method was used to prepare each binder. The initial concentration of paclitaxel used, the final concentration of paclitaxel collected in each binder, and the yield were calculated, respectively.
  • the initial paclitaxel and the paclitaxel collected in each binder were quantitatively analyzed by reversed phase chromatography, respectively.
  • the area was calculated, and the ratio of the area of paclitaxel collected in each binder to the area of the initial paclitaxel was calculated, and the final concentration and production yield of paclitaxel collected in each binder were calculated, respectively (Table 1).
  • the production yield was increased by about three times.
  • the yield of the HDL-like particle assembly was improved by improving the emulsification efficiency of PTX. It was analyzed that it can improve.
  • HDL-like particle conjugate (PTX-NP) prepared by the method of Example 1-3, unlike the results of PTX-PL-NP, not only simple dilution method and dialysis method, but also heating and dilution method Even when sequentially applied, since the normal HDL-like particle conjugates in which PTX was collected was not formed, it was confirmed that HDL-like particle conjugates could be prepared by applying sonic pulverization method and dilution method sequentially (Table 2). ).
  • the production yield of the HDL-like particle binder prepared by sequentially applying the sonic grinding method and dilution method is 62.2%, which is similar to the production yield of the binder prepared by the method of Example 1-2. Indicated.
  • the ratio of the protein contained in the prepared PTX-NP and paclitaxel is compared in terms of molar ratio, it was calculated to be about 1:55, which means that one molecule of apoA-I captures about 110 PTX molecules. It was analyzed.
  • PTX-PN-NP has a diameter of 12.2nm
  • PTX-NP is a structure having a diameter of 9.2nm (Fig. 2c and d).
  • PTX-NP showed a circular form (Fig. 3), while PTX-PL-NP was confirmed to exhibit a ring-like structure having a halo circle of the border (Fig. 3c and d).
  • PTX-NP was free of phospholipids, it was as stable as PTX-PL-NP at physiological pH. In contrast, the light scattering intensity of PTX-NP was markedly decreased at pH 5.5, and the rate of intensity reduction was faster at pH 3.8. PTX-PL-NP remained stable even at pH 3.8. Interestingly, the two NPs showed no difference in light scattering intensity in the basic pH range (pH 8.2-10.0).
  • PTX-NP was incubated for 5 hours at pH 7.4 or 5.5 and analyzed using SEC. As a result, the content of PTX-NP was maintained at a stable physiological pH of pH 7.4, but the concentration of PTX-NP was decreased at pH 5.5, and pure apoA-I was generated in the solution.
  • PTX-NP can selectively release PTX at low pH (pH-dependent discharge capacity), but PTX-PL-NP does not exhibit pH-dependent discharge capacity.
  • the PTX-NP lacking phospholipids releases the pH-dependently trapped material only in the acidic pH range. It may be used as a suitable therapeutic for.
  • An HDL-like particle binder including a drug other than paclitaxel identified in Example 2 was prepared, and each of the prepared HDL-like particle binders was determined to show the same characteristics as those of Example 2 above.
  • FIG. 6 is a graph comparing the size of each HDL-like particle conjugate and apoA-I prepared by reacting DX (doxorubicin), MTX (methotrexate), SF (Sorafenib) or EpoB (Epothilone B) and apoA-I .
  • DX doxorubicin
  • MTX metalhotrexate
  • SF Sorafenib
  • EpoB EpoB
  • HDL-like particle binder comprises DX, MTX, SF or EpoB, it is composed of the form trapped inside of apoA-I, similar to paclitaxel.
  • Epo NP which is an HDL-like particle binder including EpoB, was used to determine whether the drug was chemically modified by collection.
  • Epo B extracted from Epo NP was dissolved by adding methanol to the reaction product from which the solvent was removed, and subjected to high-pressure liquid chromatography (HPLC) equipped with a Capcell Pak C18 MG reversed phase column (Shiseido, Tokyo, Japan) and an ultraviolet detector. After the analysis, the analysis pattern was confirmed whether the chemical change (Fig.
  • Figure 7 is a graph showing the results of comparing the size of the original EpoB and EpoB dissociated from the HDL-like particle conjugate (Epo NP) containing EpoB.
  • EpoB was collected inside apoA-I to form an HDL-like particle conjugate, EpoB was not chemically modified.
  • PTX-NP can selectively release PTX at low pH (pH-dependent discharge capacity), but it was confirmed that PTX-PL-NP does not exhibit pH-dependent discharge capacity, so that the EpoB Epo NP, which is an HDL-like particle binder including the same, was intended to confirm whether or not it has the same ability.
  • the static light scattering method was used to confirm the capability, and when EpoB was released from Epo NP, the static light scattering intensity (dispersion intensity) was used in proportion to the emitted EpoB concentration.
  • the Epo NP is exposed to conditions of pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 10, and the relative dispersion strength of Epo B emitted from the Epo NP is measured using a static light scattering method and mutually Comparison was made (FIG. 8).
  • the static light scattering method was performed using a Molecular Device SpectraMax M2 Fluorimeter with excitation and emission wavelengths set to 500 nm, and after measuring the dispersion strength for about 2 hours at pH 7.4 and setting it as a reference value, the pH of the sample After increasing or decreasing, the dispersion strength was measured again, and the pH dependent discharge capacity was evaluated based on the change level of these dispersion strengths.
  • Epo NP HDL-like particle binder
  • the dispersion strength of Epo NP was not decreased under the conditions of pH 7 to 10, but the dispersion strength of Epo NP was decreased due to the decrease of the dispersion strength of Epo NP under the conditions of pH 3 to 6.
  • EpoB is released from Epo NP, suggesting that Epo-NP with this property can be used as a suitable therapeutic for the treatment of cancer cells in vivo, which creates acidic pH conditions.
  • HDL-like particle binders containing drugs rather than drugs can improve cell safety
  • Different concentrations (0-100 nM) were produced in SK-OV3 cells, each of which produced a conjugate, EpoB-NP, and each of these conjugates or each drug derived from the ovary to overexpress HER2 and express low levels of Sr-BI receptors.
  • the survival rate of SK-OV3 cells was measured according to the treatment concentration.
  • SK-OV3 cells were initially cultured using a medium consisting of RPMI 1640 with 2.05mM L-glutamine, with 10% FBS, and Antibiotic Antimycotic solution (Hyclone), and the number of cultured cells was counted. 10 4 cells were dispensed into each well of a 96 well cell culture plate (SPL) and incubated with CO 2 incubator MCO-18AIC (Sanyo Elecric Co.) at 37 ° C., 5% CO 2 for 24 hours.
  • SPL 96 well cell culture plate
  • a negative control group of HDL-like-particle conjugates was treated with PBS (8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na 2 HPO 4 and 0.24 g KH 2 PO 4 , pH 7.4) to the cells.
  • PBS 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na 2 HPO 4 and 0.24 g KH 2 PO 4 , pH 7.4
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the drug or HDL-like-particle conjugates were added to the cultured cells with 0nM, 1nM, 2.5nM, 5nM, 10nM, 50nM or 100nM.
  • the survival rate of the cells treated with the drug or HDL-like-particle conjugate was measured by MTT assay, and the measured values were compared with the cell viability obtained by performing MTT assay on the samples of each control group ( 9).
  • MTT assay was performed as follows: First, 3- (4,5-Dimethyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium Bromide (MTT, Calbiochem) at 5 mg / ml concentration The MTT concentrate dissolved in was filtered and diluted (10%) to prepare an MTT solution. Meanwhile, after removing the medium and the drug from the cells treated with the drug or the HDL-like-particle conjugate, 100 ⁇ l of the prepared MTT solution was dispensed for each well, followed by a first reaction at 37 ° C. and 5% CO 2 for 3 hours.
  • MTT 5-diphenyl-2H-tetrazolium Bromide
  • the medium and the MTT solution were removed, and 100 ⁇ l of 100% DMSO was dispensed in each well, followed by secondary reaction at room temperature for 20 minutes under light shielding conditions. After the completion of the secondary reaction, the absorbance was measured at 570 nm using a spectrophotometer (Spectra M2, Molecular device) and the cell survival rate was calculated by substituting the measured value into the following formula.
  • Figure 9 is a graph showing the change in survival rate of the cells according to the concentration of the drug or SK-OV3 cells treated with HDL-like particle conjugate containing the drug.

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Abstract

본 발명은 pH-반응 고밀도 리포단백질-유사 입자 결합체에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 산성 pH 조건에서 내부에 포집된 약물을 방출할 수 있도록 아포리포단백질 A-I(apoA-I)과 이에 포집된 약물을 포함하는 고밀도 리포단백질(HDL)-유사 입자 결합체 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 고밀도 리포단백질(HDL)-유사 입자 결합체는 산성조건에서 포집된 약물을 배출할 수 있으면서도, 산성조건이 아닌 경우에는 온도가 넓은 범위로 변화될 경우에도 안정성을 나타내므로, 표적 특이적인 약물의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

ｐＨ-반응 고밀도 리포단백질-유사 입자 결합체
본 발명은 pH-반응 고밀도 리포단백질-유사 입자 결합체에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 산성 pH 조건에서 내부에 포집된 약물을 방출할 수 있도록 아포리포단백질 A-I(apoA-I)과 이에 포집된 약물을 포함하는 고밀도 리포단백질(HDL)-유사 입자 결합체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
최근, 리포좀을 이용한 약물전달시스템의 유용성이 대두되면서, 다양한 지질 성분 혼합을 통해 보다 효과적인 지질-기반 나노전달체를 제조하려는 연구들이 주목받고 있다. 주로, 리포좀 내부에 포집된 생리활성 성분이 생체세포에 높은 효율로 전달되어 활성성분의 효능을 최대한 발휘할 수 있도록 하고자, 리포좀의 구성 성분을 다양하게 하여 제조하는 연구가 활발히 이루어지고 있는데, 이러한 연구의 일환으로서, 특정 세포에 대한 선택성을 향상시키기 위하여, pH, 온도 등과 같은 특정세포 특이적인 환경조건에서 약물을 전달할 수 있는 리포좀 형태의 나노입자(nano-particle, NP)를 들 수 있다. 생체내에 존재하는 모든 세포는 대체로 균일한 환경조건(특히, 온도조건 등)을 가지지만, 부분적으로는 세포특이적이거나 조직특이적인 환경조건을 갖기도 한다. 예를 들면, 정상조직에 비하여 암이 발병된 조직부위는 낮은 pH 수준을 나타낸다고 알려져 있다.
이처럼, 특정한 환경조건이 요구되는 조직 또는 발병부위에 물질을 전달하거나 또는 치료용 약물을 전달하기 위하여는 상기 환경조건에서 포집된 약물의 방출을 조절할 수 있는 나노입자로 구성된 리포좀의 개발이 필수적으로 요구된다. 예를 들어, 폴리 에틸 아크릴산과 포스파티딜콜린이 리포좀의 외부에 결합하여 산도변화에 따라 리포좀의 구조를 변화시킬 수 있는 리포좀 복합체(Tirrell et al., Macromolecules, 1984, 17, 1692), 상기 폴리 에틸 아크릴산을 포함하는 지방족 고분자로 구성되어, 산도변화에 따라 리포좀을 구성하는 지방족 고분자의 구조가 변화될 수 있는 리포좀 복합체(Francis et al., Biomacromolecules 2001, 2, 741), 산성도 민감성 고분자로서 메타아크릴산과 n-알킬 메타아크릴레이트로 구성된 고분자를 이용한 고분자-리포좀 나노복합체(대한민국 특허등록 제716802호) 등이 개발되었으나 상기 아크릴산을 포함하는 지방족 고분자는 아크릴산의 경직성으로 인하여 안정적인 리포좀을 형성할 수 없다는 단점이 발견되었다.
이러한 단점을 극복하기 위하여 다양한 연구를 수행한 결과, 유연성을 나타내는 인지질, 불포화 지방 및 펩타이드로 구성된 펩타이드-인지질 입자를 이용하여 제조된 리포좀-약물 복합체(WO 2009/073984), 양이온성 양 친매성 분자와,음이온성 양 친매성 분자로 구성된 pH 응답성 리포좀(WO 2010/104128) 등이 개발되었다. 이처럼 개발된 약물복합체 또는 리포좀은 여러가지 특성을 부여하기 위하여 다중성분을 포함하도록 구성되어 있는데, 이처럼 다중적인 구성요소를 포함하는 약물복합체 또는 리포좀은 장기적인 안정성이 입증되지 않는다는 단점이 있었다. 특정 질환에 사용되는 의약은 환자가 발생한 경우 즉각적으로 제조하여 환자에게 투여하는 것이 아니라, 대량으로 미리 제조하여 보관한 다음, 상기 의약의 투여가 필요할 경우 환자에게 전달되므로, 상기 리포좀이 의약용도로 사용되기 위하여는 장기적인 안정성이 입증되어야만 하나, 상기 개발된 약물복합체 또는 리포좀은 다양한 구성요소로 인하여 각종 염에 대한 취약성을 나타내므로, 장기적인 안정성이 입증되지 않았다. 따라서, 조직특이적인 pH 변화에 따라 약물의 방출을 조절할 수 있으면서도 장기적으로 안정성이 유지될 수 있는 소재의 약물복합체 또는 리포좀의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명자들은 종래의 지질단백질로 알려진 아포리포단백질 A-I(apoA-I)을 이용하여 고밀도 리포단백질(HDL)-유사 입자 결합체를 형성할 경우, pH 변화에 따라 약물의 방출을 조절할 수 있으면서도 단일물질로 구성되어 장기적으로 안정성이 유지될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 pH 의존적으로 포집된 물질을 방출할 수 있는 고밀도 리포단백질(HDL)-유사 입자 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 HDL-유사 입자 결합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 고밀도 리포단백질(HDL)-유사 입자 결합체는 산성조건에서 포집된 약물을 배출할 수 있으면서도, 산성조건이 아닌 경우에는 온도가 넓은 범위로 변화될 경우에도 안정성을 나타내므로, 표적 특이적인 약물의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 pH 의존적으로 포집된 물질을 방출할 수 있는 나노파티클의 개략도이다.
도 2는 PTX-NP 및 PTX-PL-NP의 크기를 결정하는 과정을 나타내는 그래프이다. (A)는 PTX-NP 및 PTX-PL-NP의 크기 배제 크로마토그래피 분석결과를 나타내는 그래프이고, (B)는 자유 apoA-I의 크기 배제 크로마토그래피 분석결과를 나타내는 그래프이며, (C)는 PTX-NP에 대한 동적광산란 분석결과를 나타내는 그래프이고, (D)는 PTX-PL-NP에 대한 동적광산란 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 pH 의존적으로 포집된 물질을 방출할 수 있는 나노파티클의 투과 전자 현미경 분석결과를 전자현미경 사진으로서, (A 및 B)는 PTX-NP의 2가지 대표적인 이미지를 나타내고, (C 및 D)는 PTX-PL-NP의 2가지 대표적인 이미지를 나타내며, 스케일 바는 20nm를 나타낸다.
도 4는 PTX-NP로부터 PTX의 시간 및 pH-의존 배출성을 나타내는 그래프로서, (A)는 용해된 NPs 양에 비례한 정적광산란을 다양한 pH 조건하에서 시간의 함수로서 측정한 결과를 나타내고, (B)는 PTX-NP로부터의 apoA-I 껍질 제거를 SEC를 사용하여 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 PTX-NP의 열안정성을 나타내는 그래프로서, 시료는 4℃(●), 25℃(○) 및 37℃(▼)에서 120시간 동안 항온 처리되었고, 리포좀 대조군으로서, 커다란 이중 층이 하나인 소포체를 4℃(△)에서 120 시간 동안 항온 처리하였으며, 원심분리에 의해 거대 침전물을 제거한 후 광 산란강도를 측정하였다(30분 동안 15,000rpm).
도 6은 DX(doxorubicin), MTX(methotrexate), SF(Sorafenib) 또는 EpoB(Epothilone B)와 apoA-I를 반응시켜 제조한 각각의 HDL-유사 입자 결합체와 apoA-I의 크기를 비교한 그래프이다.
도 7은 EpoB을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체(Epo NP)로부터 해리된 EpoB와 원래의 EpoB의 크기를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 서로 다른 pH 조건에서 EpoB을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체(Epo NP)의 상대적인 분산강도를 나타내는 그래프이다.
도 9는 약물 또는 상기 약물을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체가 처리된 SK-OV3 세포의 농도변화에 따른 상기 세포의 생존율 변화를 나타내는 그래프이다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 아포리포단백질 A-I(apoA-I) 및 이에 포집된 약물을 포함하고, pH 의존적으로 포집된 약물을 배출할 수 있는 고밀도 리포단백질(HDL)-유사 입자 결합체를 제공한다.
본 발명의 용어 "아포리포단백질 A-I(apoA-I)"이란, 분자량 28kDa의 243개의 아미노산으로 이루어진 단일 폴리펩타이드로 구성되고, 11개의 아미노산 혹은 22개의 아미노산으로 이루어진 8개의 반복단위 도메인을 가지며, HDL을 이루는 2차 구조의 알파-헬릭스의 비율이 60 내지 75%인 단백질을 의미하며, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열로부터 발현될 수 있는 단백질이 될 수 있다. 상기 apoA-I은 주로 주변조직으로부터 콜레스테롤을 제거하여 간 또는 다른 리포단백질로 운반하는 직접적인 역할을 수행하는 고밀도 리포단백질(HDL)의 구성요소로서 사용된다. 본 발명의 목적상 상기 apoA-I은 HDL-유사 입자 결합체를 구성하는 구성요소로서 사용되는데, 상기 apoA-I은 목적하는 약물을 포집하고, pH 의존적으로 포집된 약물을 배출할 수 있는 기능을 수행할 수 있는 모든 종류의 천연형 또는 변이체 단백질이 될 수 있다. 예를 들어, 목적하는 약물을 포집하고, pH 의존적으로 포집된 약물을 배출할 수 있는 한, 천연형 apoA-I 또는 천연형 apoA-I의 아미노산 서열의 하나 이상의 위치에서의 1개 또는 수 개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가 등을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질 돌연변이체 또는 인위적인 변형체일 수 있고, 상기 천연형 apoA-I의 아미노산 서열의 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 단백질이 될 수도 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "약물"이란, 상기 apoA-I에 의하여 포집되고, 산성 pH 조건에서 배출되어 목적을 달성할 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 약물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 산성 pH를 나타내는 조직에 투여되어 특정한 질환 또는 장애를 치료, 경감 또는 예방할 수 있는 물질이 될 수 있는데, 바람직하게는 링구조를 포함하여 apoA-I에 의한 포집과 배출이 용이한 파클리탁셀, 독소루비신, MTX(methotrexate), SF(Sorafenib), EpoB(Epothilone B), 사이클로스포린, UDCA(ursodeoxycholic acid), Ilaprazole, amine 유도체(예를 들어, leevec 등) 뿐만 아니라 steroidal backbone을 갖는 약물이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, pH 의존적으로 포집된 약물을 배출할 수 있는 HDL-유사 입자 결합체를 제조하기 위하여, 인지질과 계면활성제의 존재하에서 가열을 통하여 약물로 사용된 파클리탁셀(PTX)을 유화시키고, 희석을 통하여 상기 계면활성제의 농도를 임계 미셀농도 이하로 저하시키면서 apoA-I을 가하여 혼합하고, 원심분리 및 크기 배제 크로마토그래피를 통하여 인지질, PTX 및 apoA-I으로 구성된 HDL-유사 입자 결합체(PTX-PL-NP)를 제조하고(실시예 1-2), 계면활성제의 존재하에 약물로 사용된 파클리탁셀(PTX)을 음파분쇄하여 계면활성제로 구성된 미셀내부에 PTX를 포집시킨 다음, 희석을 통하여 상기 계면활성제의 농도를 임계 미셀농도 이하로 저하시키면서 apoA-I을 가하여 혼합하고, 원심분리 및 크기 배제 크로마토그래피를 통하여 PTX 및 apoA-I으로 구성된 HDL-유사 입자 결합체(PTX-NP)를 제조하였으며(실시예 1-3) 이들의 수율을 비교한 결과 각각 66% 및 62.2%의 수율을 나타냄을 확인하였다(실시예 2-1 표 1 및 2).
아울러, 상기 제조된 각각의 HDL-유사 입자 결합체(PTX-PL-NP 및 PTX-NP)의 크기 및 형태를 확인한 결과, PTX-PN-NP는 12.2nm의 직경을 가지는 반면, PTX-NP은 9.2nm의 직경을 갖는 구조체임을 확인하였고(도 2c 및 d), PTX-NP는 원형 형태를 나타내는 반면(도 3), PTX-PL-NP는 테두리의 후광 원을 갖는 링-유사 구조를 나타냄을 확인하였다(도 3c 및 d).
또한, 상기 제조된 각각의 HDL-유사 입자 결합체(PTX-PL-NP 및 PTX-NP)의 pH 의존성 배출여부를 확인한 결과, PTX-PL-NP는 pH 3.8 내지 10.0에서 안정한 구조를 유지하였으나, PTX-NP는 중성 및 염기성 조건(pH 7.7 내지 10.0)에서는 안정한 구조를 유지한 반면, 산성조건(pH 3.8 및 5.5)에서는 구조가 붕괴되어 포집된 PTX가 배출됨을 확인하였다(도 4a). 뿐만 아니라, 상기 PTX-NP는 중성 및 염기성 조건에서는 광범위한 온도조건에서도 안정한 구조를 유지함을 확인하였다(도 5).
한편, PTX 이외의 다른 약물을 사용할 경우에도, HDL-유사 입자 결합체를 제조할 수 있는지를 확인하기 위하여, DX(doxorubicin), MTX(methotrexate), SF(Sorafenib) 또는 EpoB(Epothilone B)를 각각 apoA-I을 가하여, 각 약물과 apoA-I으로 구성된 HDL-유사 입자 결합체를 제조하고, 이들의 크기를 비교한 결과, 약물이 처리되지 않은 apoA-I과 별다른 차이를 나타내지 않았으므로, 상기 약물들 역시 PTX 와 유사하게 apoA-I에 포집됨을 알 수 있었다(도 6).
아울러, 상기 약물중의 하나인 EpoB을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체(Epo NP)로부터 해리된 EpoB와 원래의 EpoB를 비교한 결과 약물의 화학적 변형이 나타나지 않았고(도 7), 상기 Epo NP는 pH 의존적으로 포집된 EpoB를 배출할 수 있음을 확인하였으며(도 8), 난소로부터 유래되어 HER2를 과발현시키고, Sr-BI 리셉터를 낮은 수준으로 발현시키는 SK-OV3 세포에 약물 또는 상기 약물을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체를 서로 다른 농도로 각각 처리할 경우, 약물의 처리에 의해 SK-OV3 세포의 손상율이 높은 수준을 나타내는 반면, 약물을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체의 처리에 의하여는 SK-OV3 세포의 손상율이 낮은 수준을 나타냄을 확인하였다(도 9).
상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 HDL-유사 입자 결합체의 제조방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 HDL-유사 입자 결합체의 제조방법은 (a) 목적하는 약물과 계면활성제를 포함하는 완충액을 음파분쇄하여, 계면활성제로 구성된 미셀내부에 목적하는 약물을 포집시키는 단계; (b) 상기 음파분쇄된 반응물에 아포리포단백질 A-I(apoA-I)을 포함하는 완충액을 가하여 반응물을 희석시키는 단계; 및 (c) 희석된 반응물로부터 리포단백질(HDL)-유사 입자 결합체를 회수하는 단계를 포함한다.
상기 방법에 있어서, 상기 약물은 링구조를 포함하여 apoA-I에 의한 포집과 배출이 용이한 약물이 될 수 있고, 바람직하게는 파클리탁셀이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 계면활성제는 음파분쇄에 의하여 미셀을 형성할 수 있는 것을 사용할 수 있고, 바람직하게는 소듐 콜레이트가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 아울러, 상기 완충액은 중성 pH를 유지할 수 있는 모든 종류의 완충액을 사용할 수 있고, 바람직하게는 10mM Tris HCl과 100mM NaCl을 포함하여 pH 7.4를 유지할 수 있는 디스크 형성 완충액이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 다음으로, 상기 음파분쇄는 저온상의 온도조건에서 발열이 되지 않도록 음파의 최소출력의 조건으로 짧은 시간간격을 두고 조사하는 조건으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 5 내지 15℃의 온도조건에서 전체출력의 5 내지 20%의 출력으로 1 내지 3초 간격으로 5 내지 20초 동안 1 내지 10회로 음파를 조사하는 조건으로 수행할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
또 다음으로, 상기 희석은 반응액에 포함된 계면활성제의 농도를 저하시켜서 계면활성제로 인하여 형성된 미셀을 제거하려는 목적과, 상기 약물에 적정 몰비의 apoA-I을 가하기 위한 목적으로 수행되는데, 대체로 apoA-I이 적정농도로 용해된 동일한 완충액을 부가하는 방식으로 수행된다. 이때, 상기 약물과 부가된 apoA-I의 혼합비는 바람직하게는 1:10 내지 1:200(몰비)일 수 있고, 보다 바람직하게는 1:20 내지 1:150(몰비)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 1:50 내지 1:100(몰비)일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 끝으로, 상기 HDL-유사 입자 결합체를 회수하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 크기 배제 크로마토그래피 방법을 통하여 수행할 수 있다.
한편, 상기 방법에 있어서, HDL-유사 입자 결합체의 제조수율을 향상시키고, 불순물을 용이하게 제거하기 위하여, 상기 (b) 단계 이후에, 계면활성제를 완전히 제거하거나 또는 희석된 반응물로부터 HDL-유사 입자 결합체를 회수하기 전에 반응물을 원심분리하여 침전물을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다. 이때, 상기 계면활성제의 제거는 계면활성제 흡착제를 처리하는 방법, 투석방법, 크로마토그래피 방법 등을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 계면활성제 흡착제로는 폴리스티렌 혼성중합체(polystylene copolymer). 바람직하게는 Bio-bead SM2, XAD 1, XAD 2, XAD 3, XAD 4, IRC 등을 사용할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 크로마토그래피 방법은 겔여과 크로마토그래피 방법을 이용하여 수행할 수 있으나, 이 또한 특별히 제한되지 않는다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재료 및 방법
실시예 1-1: 재조합 apoA-I의 발현 및 정제
코돈-최적화된 인간 apoA-I의 발현은 이전에 기술된 발현 벡터인 pNFXex-apoA-I를 이용한 pET 단백질 발현 시스템(Novagen, 메디슨, 위스콘신)을 사용하여 실시하였다(R.O. Ryan, et al., Protein Expr. Purif., 27:98-103, 2003). His-태그된 apoA-I의 정제는 공지된 바에 따라 수행하였다(J.Y. Shin, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 388:217-221, 2009).
실시예 1-2: 인지질을 이용한 HDL-유사 파클리탁셀 나노파티클의 제조
인지질의 일종인 1-팔미토일-2-올래오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC; Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL)을 클로로포름에 25mM의 스톡 용액으로 제조하였고 테스트 튜브의 내벽에 지질 필름을 생성하고자 질소가스로 건조하였다. 인지질 필름을 포함하는 글래스 튜브를 진공상태에서 하룻밤 위치시켜 남은 용매를 제거하였다. 건조된 POPC의 필름을 계면활성제의 일종인 100mM 소듐 콜레이트가 첨가된 디스크 형성 완충액(10mM Tris HCl, 100mM NaCl, pH 7.4)에 혼합하고 60℃에서 가열하는 방식으로 용해시켜서 지질 대 콜레이트의 최종 비율을 1:4로 맞추고, 완전한 용해를 위해 37℃에서 2시간 동안 추가로 용해시켰다. 그런 다음, 1.64mM POPC 용액 0.1㎖를 100mM 소듐 콜레이트를 포함하는 디스크 형성 완충액에 용해된 4mg/㎖ 농도의 파클리탁셀(PTX,1.64mM)과 혼합하였다. PTX-PL-NP의 형성을 유도하기 위해, 혼합 용액을 정제된 apoA-I를 포함하는 2㎖ 디스크 형성 완충액으로 희석하여 상기 소듐 콜레이트 농도를 임계 미셀 농도(critical micelle concentration) 아래로 저하시켜 제거하였으며, 이때, apoA-I 대 (PTX+POPC)의 혼합비율은 1:75(몰비)로 유지하였다.
상기 희석된 혼합용액을 15,000rpm에서 30분간 원심분리하여, 단백질과 지질이 응집되어 침전된 침전물을 제거하고, 상층액을 수득하였다. 상기 수득한 상층액을 25℃로 유지하면서, ACTA FPLC 장치(GE Healthcare, Buckinghamshire, 영국)에서 Superdex-200 10/300 GL 컬럼을 사용하여 크기 배제 그로마토그래피(SEC)에 적용하였다. 이때, 상기 컬럼을 적절한 완충용액(10mM Tris HCl, pH 8.0)을 사용하여 평형화하고, 시료의 주입량은 100㎕이며, 시료의 주입속도는 0.5㎖/분의 조건으로 수행하였다.
상기 SEC를 수행한 결과, HDL-유사 파클리탁셀 나노파티클(PTX-PL-NP)을 제조하였고, 50 내지 60%의 최종 PTX 회수율을 나타내었다.
실시예 1-3: 인지질을 이용하지 않은 HDL-유사 파클리탁셀 나노파티클의 제조
상기 실시예 1-2에 개시된 바와 같이, HDL-유사 입자 결합체를 위해 널리 사용된 절차를 따라 PTX-PL-NP를 수득할 수 있었으나, 인지질을 포함하지 않는 HDL-유사 파클리탁셀 나노파티클(PTX-NP)은 상기와 같은 방법으로 형성될 수 없었다.
이에, 인지질을 사용하지 않고서도 PTX-NP을 높은 수율로 제조할 수 있는 방법을 개발하기 위하여, 100mM 소듐 콜레이트와 4mg/㎖로 용해된 PTX(1.64mM)를 포함하는 디스크 형성 완충액을 음파분쇄방법에 적용하여, 소듐 콜레이트에 의하여 형성되는 미셀내부에 PTX를 포집시켰다. 이때, 사용된 음파분쇄조건은 음파가 출력되는 탐침은 마이크로팁(micro-tip)형태로 시료 내부로 탐침이 가능한 크기를 이용하여 최소출력 20%내로 구성하고 발열이 일어나지 않도록 저온 상에서 1초간격으로 하여 전체 10초 3회 반복을 하였다. 이어, 상기 음파분쇄된 디스크 형성 완충액을 apoA-I를 포함하는 2㎖ 디스크 형성 완충액으로 희석하여 소듐 콜레이트 농도를 임계 미셀 농도 아래로 저하시켰으며, 이때, apoA-I 대 PTX의 혼합비율은 1:100(몰비)이었다.
그런 다음, 상기 희석된 혼합용액에 계면활성제 흡착제인 Bio-beads SM-2(bio-Rad Laboratories)를 첨가하여 임계 미셀농도 이하로 존재하는 소듐 콜레이트를 완전히 제거한 다음, 실시예 1-2와 동일하게 원심분리 및 크기 배제 그로마토그래피(SEC)에 순차적으로 적용하여 HDL-유사 입자 결합체(PTX-NP)를 제조하고 그에 포함된 apoA-I의 농도, PTX의 농도 및 제조수율을 측정하였다.
실시예 1-4: 동적광산란법 및 투과전자현미경
상기 실시예 1-2 및 1-3에서 각각 제조한 HDL-유사 입자 결합체(PTX-PL-NP 및 PTX-NP)의 크기 분배는 Dynapro apparatus(Wyatt Technology, 산타 바바라, 캘리포니아)를 사용한 동적 레이저광 산란법으로 결정하였다. 산란 각도 및 온도는 각각 90도 및 25℃로 고정하였다. LIBRA 120 전자 현미경(Carl Zeiss, Jena, 독일)에서 에너지 필터-투과전자현미경을 사용하였다. HDL-유사 입자 결합체를 탄소로 코팅된 100 메쉬 구리 그리드(mesh copper grid)에 침전시킨 후, 그리드를 필터 페이퍼로 두들겨 표면의 물을 제거하였고 2% 우라닐 아세테이트를 사용하여 음성적으로 염색하였다. 상기 샘플은 측정 전에 공기로 건조하였다.
실시예 1-5: 파클리탁셀의 정량 검사
a Capcell Pak C18 MG 역상 컬럼(Shiseido, 도쿄, 일본) 및 자외선 감지기가 장착된 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 PTX를 정량하였다. 순수 에탄올을 1.0㎖/분의 유속으로 등용매 이동상으로 사용하였다. 파클리탁셀의 농도를 표준 곡선으로부터 정량하였다.
실시예 1-6: HDL-유사 입자 결합체로부터 apoA-I의 시간 의존적 제거
HDL-유사 입자 결합체로부터의 PTX 배출을 정적 광 산란법을 사용하여 관찰하였다. 500nm에서 여기 및 방출을 가지고 Molecular Device SpectraMax M2 Fluorimeter를 사용하여 정적인 광 산란을 측정하였다. 같은 pH(7.4)에서 2시간 동안 값을 측정한 후에, 시료의 pH를 증가시키거나 또는 저하시켰다.
실시예 2: 결과
실시예 2-1: 파클리탁셀을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체의 제조
지금까지 보고된 다양한 HDL-유사 입자 결합체는 pH 의존성을 나타내지 않았다. 거의 모든 HDL-유사 입자 결합체는 인지질, 콜레스테롤 및 콜레스테릴 에스테르 뿐만 아니라 지방 친화성 약물을 포함하였다. 포스퍼티딜콜린과 같은 인지질이 원반 나노구조의 가장자리를 둘러싸는 apoA-I 결합에 중요하기 때문에, NP로부터 인지질을 제외하면 pH와 같은 환경적 변화에 민감도를 나타낼 것이라고 추론하였다.
이러한 추론을 확인하기 위해, apoA-I를 사용하여 2가지 형태의 HDL-유사 입자 결합체(PTX-PL-NP 및 PTX-NP)를 제조하고, 역상크로마토그래피 방법을 이용하여, 각 결합체의 제조시 사용된 초기 파클리탁셀의 농도, 각 결합체에 포집된 파클리탁셀의 최종농도 및 제조수율을 각각 산출하였다.
먼저, 실시예 1-2의 방법으로 제조된 HDL-유사 입자 결합체(PTX-PL-NP)의 경우, 초기 파클리탁셀 및 각 결합체에 포집된 파클리탁셀을 각각 역상크로마토그래피로 정량분석하여 각각의 크로마토그래프의 면적을 산출하고, 초기 파클리탁셀의 면적에 대한 각 결합체에 포집된 파클리탁셀의 면적의 비율을 산출하여, 각 결합체에 포집된 파클리탁셀의 최종농도 및 제조수율을 각각 산출하였다(표 1).
표 1 PTX-PL-NP에 포함된 파클리탁셀의 농도 및 제조수율
제조 방법 초기 파클리탁셀(㎍/㎖) 최종 파클리탁셀(㎍/㎖) 수율(%)
희석투석가열 + 희석음파분쇄 + 희석 1400140014001400 NDND302924 NDND2266
a 세제 제거전 혼합 용액에 용해된 파클리탁셀의 농도
b SEC 정제 후 HDL-유사 입자 결합체에 존재하는 파클리탁셀의 농도
ND: 검출되지 않음
상기 표 1에서 보듯이, 상기 apoA-I가 수용성 배지에서 상당히 가용성을 나타냄에도 불구하고, 희석방법 및 투석방법을 각각 단독적으로 사용할 경우에는 PTX가 포집된 정상적인 HDL-유사 입자 결합체가 형성되지 않았으나, 가열방법 및 희석방법을 순차적으로 적용하거나 또는 음파분쇄방법 및 희석방법을 순차적으로 적용할 경우에는, PTX가 포집된 정상적인 HDL-유사 입자 결합체가 형성됨을 확인할 수 있었다.
특히, 가열방법 대신에 음파분쇄방법을 사용할 경우, 제조수율이 약 3배로 증가함을 확인하였으므로, 가열방법 보다는 음파분쇄방법을 이용할 경우, PTX의 유화효율을 향상시켜서 HDL-유사 입자 결합체의 제조수율을 향상시킬 수 있는 것으로 분석되었다.
다음으로, 실시예 1-3의 방법으로 제조된 HDL-유사 입자 결합체(PTX-NP)의 경우, PTX-PL-NP의 결과와는 달리, 단순 희석방법 및 투석방법 뿐만 아니라, 가열 및 희석방법을 순차적으로 적용한 경우에도, PTX가 포집된 정상적인 HDL-유사 입자 결합체가 형성되지 않았으므로, 음파분쇄방법 및 희석방법을 순차적으로 적용하여 HDL-유사 입자 결합체를 제조할 수 있음을 확인하였다(표 2).
표 2 PTX-NP에 포함된 apoA-I과 파클리탁셀의 농도 및 제조수율
제조 방법 apoA-I(㎍/㎖) 최종 파클리탁셀(㎍/㎖) 수율(%)
음파분쇄 + 희석 560 924 62.2
상기 표 2에서 보듯이, 음파분쇄방법 및 희석방법을 순차적으로 적용하여 제조된 HDL-유사 입자 결합체의 제조수율은 62.2%로서 실시예 1-2의 방법으로 제조된 결합체의 제조수율과 유사한 수준을 나타내었다.
아울러, 상기 제조된 PTX-NP에 포함된 단백질과 파클리탁셀의 비율을 몰비로 환산하여 비교하면 약 1:55로 산출되었는데, 이러한 몰비는 apoA-I 한 분자가 약 110개의 PTX 분자를 포집한다는 것을 의미하는 것으로 분석되었다.
실시예 2-2: 파클리탁셀 나노파티클의 크기 및 형태
상기 제조된 각각의 HDL-유사 입자 결합체인 PTX-NP 및 PTX-PL-NP를 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과, PTX-NP의 피크는 PTX-PL-NP의 피크보다 더 높은 용출 부피로 약간 이동하였으므로, PTX-NP가 PTX-PL-NP보다 상대적으로 작은 크기를 갖는 것으로 분석되었다(도 2a).
아울러, 상기 각각의 HDL-유사 입자 결합체를 동적광산란 분석에 적용한 결과, PTX-PN-NP는 12.2nm의 직경을 가지는 반면, PTX-NP은 9.2nm의 직경을 갖는 구조체임을 확인하였다(도 2c 및 d).
한편, 투과 전자 현미경 분석결과, PTX-NP는 원형 형태를 나타내는 반면(도 3), PTX-PL-NP는 테두리의 후광 원을 갖는 링-유사 구조를 나타냄을 확인하였다(도 3c 및 d).
상술한 바와 같이, 상기 제조된 각각의 HDL-유사 입자 결합체인 PTX-NP 및 PTX-PL-NP는 서로 상이한 구조적 특성을 나타냄을 알 수 있었다. 이러한 구조적 특성은 인지질의 유무에 의하여 기인한 것으로 파악되었으므로, 상기 인지질은 HDL-유사 입자 결합체의 원반구조를 유지하는 구성요소로서 사용된 것으로 분석되었다.
실시예 2-3: PTX-NP의 pH 의존성 반응
암 화학요법을 위해 pH 의존성 HDL-유사 입자 결합체의 중요한 특징은 낮은 pH에서 약물의 선택적 방출이고 상기 약물은 생리학적 pH에서 NP내에 안정적으로 유지되어야 한다는 점이다. HDL-유사 입자 결합체의 pH-의존 행동을 측정하고자, 정적 광 산란법이 사용되었다. 순수한 apoA-I의 크기는 HDL-유사 입자 결합체보다 현저하게 작기 때문에(도 2b), 상기 HDL-유사 입자 결합체로부터 PTX를 제거하면, 정적 광 산란법에 의해 측정된 수치가 감소하게 된다. 광 산란 강도는 HDL-유사 입자 결합체의 양에 비례하는데, 상기 각 실시예에서 제조된 HDL-유사 입자 결합체(PTX-PL-NP 및 PTX-NP)의 정적 광 산란값을 pH 3.8, 5.5 및 7.4에서 6시간 동안 측정하였다(도 4a).
생리학적 pH인 pH 7.7에서는, 두 NPs에 대한 광 산란 강도에서 어떠한 변화도 없었다. PTX-NP가 인지질이 없음에도 불구하고, 그것은 생리학적 pH에서 PTX-PL-NP 만큼 안정하였다. 대조적으로, PTX-NP의 광 산란 강도는 pH 5.5에서 현저하게 감소하였고, 강도 감소 속도는 pH 3.8에서 더욱 빨랐다. PTX-PL-NP는 심지어 pH 3.8에서도 안정적으로 유지되었다. 흥미롭게도, 두 NPs는 염기성 pH 범위(pH 8.2 내지 10.0)에서 광 산란 강도에서 어떠한 차이도 보여주지 않았다. 낮은 pH에서 PTX-NP의 낮추어진 광 산란 강도가 PTX의 방출에 의한 것인지의 여부를 확인하기 위하여, pH 7.4 또는 5.5에서 PTX-NP를 5시간동안 항온처리하고, SEC을 사용하여 분석하였다. 그 결과, 생리학적 pH인 pH 7.4에서는 PTX-NP의 함량이 안정적으로 유지되었으나, pH 5.5에서는 PTX-NP의 농도가 감소하고, 용액중에 순수한 apoA-I이 발생함을 확인하였다.
상기 결과로부터 PTX-NP가 낮은 pH에서 PTX를 선택적으로 배출할 수 있지만(pH 의존성 배출능력), PTX-PL-NP는 pH 의존성 배출능력을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.
상기 pH 의존성 배출능력을 나타내는 PTX-NP의 안정성을 분석한 결과, pH 7 내지 10의 조건에서 25℃로 5일간 유지할 경우에도, 광 산란 강도가 변화되지 않았고, 광범위한 온도 범위(4, 25 및 37℃)에서도 안정성이 유지됨을 확인하였으나, 대조군으로 사용된 결합체는 이러한 안정성을 나타내지 않음을 알 수 있었다(도 5).
상술한 결과를 종합하면, 인지질이 결핍된 PTX-NP는 오직 산성 pH 범위에서 pH 의존적으로 포집된 물질을 방출함을 알 수 있으므로, 상기 PTX-NP는 산성 pH 조건을 조성하는 생체내 암세포의 치료를 위한 적합한 치료제로서 사용될 수 있을 것이다.
실시예 3: 파클리탁셀 이외의 약물을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체의 제조 및 특성 평가
상기 실시예 2에서 확인된 파클리탁셀 이외의 약물을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체를 제조하고, 상기 제조된 각각의 HDL-유사 입자 결합체가 상기 실시예 2의 것과 동일한 특성을 나타내는지 확인하고자 하였다.
실시예 3-1: 파클리탁셀 이외의 약물을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체의 제조
크기배제 크로마토 그래피로서 Superdex-200 10/300 GL 컬럼 대신에 Superose-12 10/300 GL 컬럼을 사용하고, 약물로서 파클리탁셀 대신에 DX(doxorubicin), MTX(methotrexate), SF(Sorafenib) 또는 EpoB(Epothilone B)을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-3과 동일한 방법으로 DX, MTX, SF 또는 EpoB를 포함하는 HDL-유사 입자 결합체를 제조하였다.
실시예 3-2: 파클리탁셀 이외의 약물을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체의 크기분석
상기 실시예 3-1에서 제조한 각각의 HDL-유사 입자 결합체가 정상적으로 형성되었는지를 확인하기 위하여, 제조된 각 HDL-유사 입자 결합체의 크기를 약물을 포집하지 않은 apoA-I의 크기와 비교하였다(도 6). 도 6은 DX(doxorubicin), MTX(methotrexate), SF(Sorafenib) 또는 EpoB(Epothilone B)와 apoA-I를 반응시켜 제조한 각각의 HDL-유사 입자 결합체와 apoA-I의 크기를 비교한 그래프이다. 도 6에서 보듯이, 각각의 서로 다른 약물이 포집된 4종의 HDL-유사 입자 결합체는 약물을 포집하지 않은 apoA-I와 동일한 용출곡선을 나타내므로, 상기 HDL-유사 입자 결합체는 apoA-I의 내부에 약물이 포집된 형태로 제조된 것임을 알 수 있었다.
이는 HDL-유사 입자 결합체가 DX, MTX, SF 또는 EpoB를 포함할 경우에도, 파클리탁셀과 유사하게, apoA-I의 내부에 포집된 형태로 구성됨을 의미하는 것으로 분석되었다.
실시예 3-3: HDL-유사 입자 결합체에 포집된 약물의 변형여부 분석
상기 실시예 3-1에서 제조된 각각의 HDL-유사 입자 결합체 중에서 EpoB을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체인 Epo NP를 대상으로 하여, 포집에 의해 약물이 화학적으로 변형되는지의 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 제조된 Epo NP에 포집된 약물을 추출하기 위해서 hexane : 2-propanol을 5:3(v/v)의 비율로 첨가하여 4℃에서 약 12시간 동안 반응시키고, 반응이 종료된 후 반응물을 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 상기 수득한 상층액에 질소가스처리 및 진공처리를 순차적으로 적용하여 용매를 완전히 제거하였다. 상기 용매가 제거된 반응산물에 메탄올을 가하여 용해시키고, Capcell Pak C18 MG 역상 컬럼(Shiseido, 도쿄, 일본) 및 자외선 감지기가 장착된 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 적용하여 Epo NP로부터 추출된 Epo B를 분석한 다음, 분석 패턴을 확인하여 화학적 변화 여부를 확인하였다(도 7). 이때, HPLC 분석조건은 이동상으로서 순수 메탄올을 사용하고, 상기 이동상의 속도를 1.0㎖/분으로 설정하였으며, 249nm파장에서 분석하였다. 도 7은 EpoB을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체(Epo NP)로부터 해리된 EpoB와 원래의 EpoB의 크기를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7에서 보듯이, EpoB가 apoA-I의 내부에 포집되어 HDL-유사 입자 결합체를 형성하여도, EpoB가 화학적으로 변형되지는 않음을 알 수 있었다.
실시예 3-4: EpoB를 포함하는 HDL-유사 입자 결합체의 pH 의존성 반응
상기 실시예 2-3의 결과로부터 PTX-NP가 낮은 pH에서 PTX를 선택적으로 배출할 수 있지만(pH 의존성 배출능력), PTX-PL-NP는 pH 의존성 배출능력을 나타내지 않음을 확인하였으므로, 상기 EpoB을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체인 Epo NP도 동일한 능력을 갖는지의 여부를 확인하고자 하였다. 상기 능력을 확인하기 위하여 정적 광 산란법을 사용하였는데, Epo NP로부터 EpoB가 방출되면 정적 광 산란도(분산강도)가 방출된 EpoB 농도에 비례하는 특성을 이용하였다.
구체적으로, 상기 Epo NP를 pH 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 10의 조건에 노출시키고, 상기 Epo NP로부터 방출된 Epo B의 상대적인 분산강도를 정적 광 산란법을 사용하여 측정하고 상호비교하였다(도 8). 이때, 정적 광 산란법은 여기 및 방출파장을 500nm로 설정한 Molecular Device SpectraMax M2 Fluorimeter를 사용하여 수행하였는데, pH 7.4에서 약 2시간 동안 분산강도를 측정하고 이를 기준값으로 설정한 후, 상기 시료의 pH를 증가 또는 감소시킨 후에 다시 분산강도를 측정하고, 이들 분산강도의 변화수준에 근거하여 pH 의존성 배출능력을 평가하였다.
도 8은 서로 다른 pH 조건에서 EpoB을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체(Epo NP)의 상대적인 분산강도를 나타내는 그래프이다. 도 8에서 보듯이, pH 7 내지 10의 조건에서는 Epo NP의 분산강도가 감소되지 않았으나, pH 3 내지 6의 조건에서는 Epo NP의 분산강도가 감소되어 상대적으로 저하되었으므로, pH 3 내지 6의 조건에서는 Epo NP로부터 EpoB가 방출되며, 이러한 특성을 가지는 Epo-NP는 산성 pH 조건을 조성하는 생체내 암세포의 치료를 위한 적합한 치료제로서 사용될 수 있음을 시사하였다.
실시예 3-5: HDL-유사 입자 결합체의 안전성 평가
약물보다는 약물을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체가 세포에 대한 안전성을 향상시킬 수 있는지의 여부를 확인하기 위하여, 파클리탁셀을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체인 PTX-NP와 EpoB를 포함하는 HDL-유사 입자 결합체인 EpoB-NP를 각각 제작하고, 이들 각 결합체 또는 상기 각 약물을 난소로부터 유래되어 HER2를 과발현시키고, Sr-BI 리셉터를 낮은 수준으로 발현시키는 SK-OV3 세포에 서로 다른 농도(0 내지 100nM)로 처리하고, 처리농도 변화에 따른 SK-OV3 세포의 생존율 변화를 측정하고자 하였다.
먼저, SK-OV3 세포는 RPMI 1640 with 2.05mM L-glutamine, with 10% FBS, with Antibiotic Antimycotic solution (Hyclone)로 구성된 배지를 이용하여 초도 배양하고, 배양된 세포의 수를 계수한 다음, 4 X 104개의 세포를 96 well cell culture plate (SPL)의 각 웰에 각각 분주하고 CO2 incubator MCO-18AIC (Sanyo Elecric Co.)으로 37℃, 5% CO2에서 24시간동안 배양하였다.
다음으로, 대조군 시료로서 HDL-유사-입자 결합체의 음성대조군으로는 PBS(8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4 및 0.24 g KH2PO4, pH 7.4)를 세포에 처리한 시료를 사용하고; 약물의 음성대조군으로는 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 세포에 처리한 시료를 사용하였으며; 세포가 완전히 죽었을 때의 결과 값을 나타내는 양성대조군으로는 상기 배양된 세포에 2% Trito X-100을 2시간 처리한 시료를 사용하고; 무처리 시료(Blank)로서, 세포 없이 배지만 plate well에 분주한 시료를 사용하였다.
상술한 바와 같이, 약물 또는 HDL-유사-입자 결합체의 부작용을 확인하기 위하여, 상기 약물 또는 HDL-유사-입자 결합체를 상기 배양된 세포에 0nM, 1nM, 2.5nM, 5nM, 10nM, 50nM 또는 100nM가 되도록 처리하고, 상기 약물 또는 HDL-유사-입자 결합체가 처리된 세포의 생존율을 MTT 분석법으로 측정하였으며, 측정된 값을 상기 각 대조군의 시료를 대상으로 MTT 분석법을 수행하여 얻어진 세포 생존율과 비교하였다(도 9).
끝으로, MTT 분석법은 다음과 같이 수행하였다: 먼저, 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium Bromide (MTT, Calbiochem)을 5mg/ml농도로 PBS에 용해시킨 MTT 농축액을 여과 및 희석(10%)하여 MTT 용액을 준비하였다. 한편, 상기 약물 또는 HDL-유사-입자 결합체가 처리된 세포에서 배지와 약물을 제거한 후에 상기 준비된 MTT 용액을 각 웰당 100㎕씩 분주한 다음, 37℃, 5% CO2 에서 3시간 동안 1차 반응시키고, 반응이 종료된 후, 배지와 MTT 용액을 제거 하고 100% DMSO를 각 웰당 100㎕씩 분주하고, 차광조건에서 20분간 상온에서 2차 반응시켰다. 2차 반응이 종료된 후, 분광광도계 (Spectra M2, Molecular device)를 이용하여 시료를 대상으로 570nm에서 흡광도를 측정하고, 측정된 수치를 하기 식에 대입하여 세포 생존율을 산출하였다.
세포 생존율(%) = (S-P-B)/(N-P-B) X 100
상기 식에서,
S: 약물 또는 HDL-유사-입자 결합체를 처리한 시료의 흡광도
B: 무처리 시료의 흡광도
P: 양성대조군의 흡광도
N: 음성 대조군의 흡광도
도 9는 약물 또는 상기 약물을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체가 처리된 SK-OV3 세포의 농도변화에 따른 상기 세포의 생존율 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9에서 보듯이, 약물을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체를 처리할 경우에는 100nM의 농도로 처리하여도 50% 이상의 세포 생존율을 나타내는 반면, 약물을 처리할 경우에는 10nM의 농도로 처리하여도 50% 이하의 세포 생존율을 나타냄을 확인하였으므로, 약물을 포함하는 HDL-유사 입자 결합체는 세포에 대하여 높은 안전성을 나타냄을 확인하였다.

Claims (21)

  1. 아포리포단백질 A-I(apoA-I) 및 이에 포집된 약물을 포함하고, pH 의존적으로 포집된 약물을 배출할 수 있는 고밀도 리포단백질(HDL)-유사 입자 결합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아포리포단백질 A-I(apoA-I)은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인
  3. 제1항에 있어서,
    상기 약물은 링구조를 포함하는 것인 결합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 약물은 파클리탁셀, DX(doxorubicin), MTX(methotrexate), SF(Sorafenib) 및 EpoB(Epothilone B)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 결합체.
  5. 목적하는 약물을 아포리포단백질 A-I(apoA-I)에 포집시키는 단계를 포함하여, pH 의존적으로 포집된 약물을 배출할 수 있는 고밀도 리포단백질(HDL)-유사 입자 결합체의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 아포리포단백질 A-I(apoA-I)은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    인지질 또는 콜레스테롤 없이 아포리포단백질 A-I(apoA-I)만을 사용하여 약물을 포집하는 것인 방법
  8. (a) 목적하는 약물과 계면활성제를 포함하는 완충액을 음파분쇄하여, 계면활성제로 구성된 미셀내부에 목적하는 약물을 포집시키는 단계
    (b) 상기 음파분쇄된 반응물에 아포리포단백질 A-I(apoA-I)을 포함하는 완충액을 가하여 반응물을 희석시키는 단계; 및
    (c) 희석된 반응물로부터 리포단백질(HDL)-유사 나노입자(NP) 결합체를 회수하는 단계를 포함하는, 리포단백질(HDL)-유사 나노입자(NP) 결합체의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 아포리포단백질 A-I(apoA-I)은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법
  10. 제8항에 있어서,
    상기 약물은 링구조를 포함하는 것인 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 약물은 상기 약물은 파클리탁셀, DX(doxorubicin), MTX(methotrexate), SF(Sorafenib) 및 EpoB(Epothilone B)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 계면활성제는 음파분쇄에 의하여 미셀을 형성하는 것인 방법.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 계면활성제는 소듐 콜레이트인 것인 방법.
  14. 제8항에 있어서,
    완충액은 디스크 형성 완충액(Tris HCl, NaCl, pH 7.4)인 것인 방법.
  15. 제8항에 있어서,
    상기 음파분쇄는 5 내지 15℃의 온도조건에서 수행되는 것인 방법.
  16. 제8항에 있어서,
    상기 희석은 apoA-I와 목적하는 약물의 혼합비를 1:50 내지 1:100(몰비)로 유지하고, 계면활성제의 농도를 임계 미셀농도 이하로 저하시키도록 수행되는 것인 방법.
  17. 제8항에 있어서,
    상기 (b) 단계 이후에, 계면활성제를 완전히 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    계면활성제 흡착제를 처리하여 수행하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 계면활성제 흡착제는 폴리스티렌 혼성중합체(polystylene copolymer)인 것인 방법.
  20. 제8항에 있어서,
    상기 희석된 반응물로부터 HDL-유사 NP 결합체를 회수하기 전에 반응물을 원심분리하여 침전물을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  21. 제8항에 있어서,
    상기 HDL-유사 NP 결합체의 회수는 크기 배제 크로마토그래피 방법을 통하여 수행되는 것인 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111936861A (zh) * 2018-03-30 2020-11-13 希森美康株式会社 对脂蛋白质的吸收能力进行测定的方法及试剂

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100716802B1 (ko) * 2005-12-30 2007-05-14 (주)아모레퍼시픽 산성도 민감성 고분자를 포함한 고분자-리포좀 나노복합체제조 및 이를 함유하는 피부 외용제 조성물
KR20110039798A (ko) * 2009-10-12 2011-04-20 주식회사 녹십자 난용성 약물의 전달을 위한 고밀도지단백 나노입자의 제조방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100716802B1 (ko) * 2005-12-30 2007-05-14 (주)아모레퍼시픽 산성도 민감성 고분자를 포함한 고분자-리포좀 나노복합체제조 및 이를 함유하는 피부 외용제 조성물
KR20110039798A (ko) * 2009-10-12 2011-04-20 주식회사 녹십자 난용성 약물의 전달을 위한 고밀도지단백 나노입자의 제조방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHIN, J. Y. ET AL., BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 388, 2009, pages 217 - 221 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111936861A (zh) * 2018-03-30 2020-11-13 希森美康株式会社 对脂蛋白质的吸收能力进行测定的方法及试剂
CN111936861B (zh) * 2018-03-30 2023-09-01 希森美康株式会社 对脂蛋白质的吸收能力进行测定的方法及试剂

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