WO2013083866A1 - Empleo de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina en el diagnóstico y seguimiento de la enfermedad celíaca - Google Patents

Empleo de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina en el diagnóstico y seguimiento de la enfermedad celíaca Download PDF

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WO2013083866A1
WO2013083866A1 PCT/ES2012/070853 ES2012070853W WO2013083866A1 WO 2013083866 A1 WO2013083866 A1 WO 2013083866A1 ES 2012070853 W ES2012070853 W ES 2012070853W WO 2013083866 A1 WO2013083866 A1 WO 2013083866A1
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lactoglobulin
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antibody
subject
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PCT/ES2012/070853
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Francisco Manuel MARTÍN BERMUDO
Bernat Soria Escoms
Mª Angeles ORTEGA DE LA TORRE
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Universidad Pablo De Olavide
Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
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    • G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
    • G01N2800/065—Bowel diseases, e.g. Crohn, ulcerative colitis, IBS

Definitions

  • the present invention relates to methods and kits for the diagnosis and / or monitoring of celiac disease, as well as to methods and kits for assessing the response and / or adherence to a gluten-free diet in celiac patients.
  • the methodologies of the invention are based on the determination of the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in blood or serum samples of a subject suffering from or susceptible to celiac disease.
  • Celiac disease or celiac disease is an autoimmune disease that appears in genetically predisposed people and is characterized by chronic inflammation of the proximal part of the small intestine, caused by exposure to gliadin.
  • Gliadin is one of the main components of gluten, so the only treatment for celiac disease today is the strict absence of gluten in the diet.
  • Symptoms of celiac disease include chronic diarrhea, stunted growth and / or childhood development, fatigue, skin rashes, weight loss, changes in character (irritability, apathy, introversion, sadness), vomiting, bloating, loss of appetite, fatigue, etc.
  • Celiac disease The prevalence of celiac disease in Europeans and their descendants is 1%, being more frequent in women with a 2: 1 ratio. Celiac disease usually manifests during childhood, although it has been shown that it can also manifest itself throughout of the adult stage.
  • the mucosa acts, on the one hand, as a physical barrier between the intestinal lumen and the submucosa, and, on the other, as a paracrine tissue that contributes to orchestrate the physiology of the intestine and its immune response.
  • intestinal permeability such as that described in diseases with a marked autoimmune component, such as celiac disease
  • the integrity of the physical barrier It decreases, and therefore the immune system is exposed to more antigens and possibly becomes more reactive.
  • the current diagnostic strategy for celiac disease is mainly based on demonstrating gluten-dependent enteropathy, for which invasive methods (biopsies) are still used, although serum markers such as gliadin antibodies are also analyzed.
  • biopsies invasive methods
  • serum markers such as gliadin antibodies
  • there are still no reliable analytical methods for monitoring the effectiveness of the proposed treatment since the histological analysis of duodenal biopsies is not feasible as a routine monitoring method to analyze the remission and efficacy of the treatment.
  • the invention relates to a method of in vitro diagnosis of celiac disease in a subject comprising
  • a level of anti-beta-lactoglobulin antibody in the sample of said subject greater than the level of said anti-beta-lactoglobulin antibody in said reference sample is indicative that said subject suffers from celiac disease.
  • the invention relates to an in vitro method of evaluating the response to a gluten-free diet in a subject suffering from celiac disease comprising
  • the invention relates to an in vitro method of evaluating the effectiveness of a gluten-free diet in a subject suffering from celiac disease comprising
  • an anti-beta-lactoglobulin antibody level obtained in (iia) lower than that obtained in (ia) is indicative that the gluten-free diet is effective;
  • a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained at (ib) below the level of said anti-beta-lactoglobulin antibody in said reference sample is indicative that the gluten-free diet is effective.
  • the invention relates to an in vitro method of evaluating adherence to a gluten-free diet by a subject suffering from celiac disease subjected to a gluten-free diet comprising
  • a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in (iia) lower than the value obtained in (ia) is indicative of adherence to the gluten-free diet by said subject;
  • a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in (ib) below the level of said anti-beta-lactoglobulin antibody in said reference sample is indicative of adherence to the gluten-free diet by said subject.
  • the invention in another aspect, relates to a kit comprising all or part of the elements necessary for the determination of the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in a blood or serum sample.
  • a kit comprising all or part of the elements necessary for the determination of the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in a blood or serum sample.
  • the use of said kit for the implementation of any of the methods provided by the present invention constitutes a further aspect of this invention.
  • the invention relates to a method (hereinafter the first method of the invention) of in vitro diagnosis of celiac disease in a subject comprising:
  • a level of anti-beta-lactoglobulin antibody in the sample of said subject greater than the level of said anti-beta-lactoglobulin antibody in said reference sample is indicative that said subject suffers from celiac disease.
  • celiac disease or "celiac disease” in the present invention refers to an autoimmune pathology characterized by chronic inflammation of the proximal part of the small intestine or jejunum, caused by exposure to gliadin, which is one of the components of the gluten. Celiac disease involves a permanent intolerance to gluten whose characteristic is an immune-based inflammatory reaction in the intestinal mucosa that hinders the absorption of nutrients.
  • Gluten is a protein present in cereals such as wheat ⁇ Triticum spp), barley (Hordeum vulgare), rye (Sécale cereale), triticale (Triticosecale, cereal from the cross between wheat and rye), kamut (Triticum turgidum), spelled ( Triticum spelta) and possibly oats (Avena spp), but absent in rice (Oriza sativa) and corn (Zea mays).
  • Gluten is made up of gliadin and glutenin, with gliadin being a prolamine type glycoprotein.
  • ingestion of gliadin causes the tissue transglutaminase enzyme to modify said protein and the immune system causes a cross reaction against the small intestine, causing an inflammatory reaction that causes atrophy of the villi that line the intestine and interference in nutrient absorption.
  • celiac disease is determined by both environmental (food) and genetic factors. Thus, celiac disease also implies a genetic predisposition since most celiacs have the antigen of Human leukocyte (HLA) type DQ2 (HLA-DQ2) and DQ8 (HLA-DQ8) (May-Ling J. et al. 2010 Immunogenetics 62: 641-651).
  • HLA Human leukocyte
  • HLA-DQ8 HLA-DQ8
  • subject refers to all animals classified as mammals and includes, but is not restricted to, domestic and farm animals, primates and humans, for example, humans, non-primates. humans, cows, horses, pigs, sheep, goats, dogs, cats or rodents. Preferably, the subject is a human being male or female of any age or race.
  • diagnosis includes the evaluation of the susceptibility of a subject to a disease, the determination of whether a subject currently has the disease and also the prognosis of a subject affected by the illness. As the person skilled in the art will understand, such evaluation may not be correct for 100% of the subjects to be diagnosed, although it is preferably correct. However, the term requires that a statistically significant part of the subjects can be identified as suffering from the disease or having a predisposition to it.
  • a part is statistically significant, it can be determined easily by the person skilled in the art using several well-known statistical evaluation tools, for example, the determination of confidence intervals, the determination of p-values, the Student's t-test, the Mann-Whitney test, etc. Details are provided in Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983.
  • Preferred confidence intervals are at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80 %, at least 90%, at least 95%.
  • P values are preferably 0.2, 0.1 or 0.05.
  • step (i) the level of anti-beta-lactoglobulin antibodies is determined in a blood or serum sample of the subject.
  • sample refers to a sample, capable of containing anti-beta-lactogobulin antibodies obtained from the subject under study (unless otherwise indicated), such as a sample of blood or serum obtained from said subject.
  • said blood sample comprises peripheral blood.
  • peripheral blood is related to the volume of circulating blood distant from the heart, this that is, the blood that circulates through the organism of a subject.
  • the blood sample can be obtained by conventional methods known to the person skilled in the art.
  • serum refers to the resulting blood component after blood clotting and removal of the resulting clot. Methods of obtaining blood samples from a subject are widely collected in the state of the art, as well as methods of obtaining serum from blood samples.
  • antibody refers to a glycoprotein that exhibits a specific binding activity for a particular protein, which is called an "antigen."
  • the antibody is an anti-beta-lactoglobulin antibody, that is, that specifically recognizes and binds to the beta-lactoglobulin protein, said protein being the antigen, to a fragment thereof.
  • said antibody is a human antibody.
  • said antibody is a human antibody with isotype A (IgA) or G (IgG).
  • beta-lactoglobulin is a protein present in the whey, being secreted in the milk of ruminants (such as cattle, sheep, goats or cervids), monogastric (such as pigs) and marsupials (terios mammals), but absent in the milk of humans, rodents and lagomorphs.
  • ruminants such as cattle, sheep, goats or cervids
  • monogastric such as pigs
  • marsupials terios mammals
  • Bovine beta-lactoglobulin is a protein formed by 162 amino acids and a molecular weight of 18.4 kDa. Under physiological conditions it is preferably in the form of a dimer, but it dissociates into monomers at pH below 3. There are genetic variants of bovine beta-lactoglobulin, the most common being A (with a valine in position 118 and an aspartic in position 64) and B (with alanine in position 118 and a glycine in position 64).
  • the beta-lactoglobulin protein against which anti-beta-lactoglobulin antibodies originate whose level is determined in the invention corresponds to beta-lactoglobulin from ruminant, monogastric and marsupial animals.
  • the beta-lactoglobulin protein against which anti-beta-lactoglobulin antibodies are originated whose level is determined in the invention corresponds to the beta-lactoglobulin of ruminant animals ⁇ Ruminantia). More preferably, the beta-lactoglobulin protein against which anti-beta-lactoglobulin antibodies are originated whose level is determined in the invention corresponds to bovine beta-lactoglobulin (subfamily of placental mammals belonging to the Bovinae family and includes the genera Bison, Bos, Boselaphus, Pseudoryx, Syncerus, Taurotragus, Tetracerus and Tragelaphus).
  • the beta-lactoglobulin protein against which anti-beta-lactoglobulin antibodies are originated whose level is determined in the invention is cow beta-lactoglobulin (Bos taurus), which comprises, without being limited to, both the cow of European origin or domestic cow (Bos taurus taurus) such as cow of Asian origin or zebu (Bos taurus indicus).
  • cow beta-lactoglobulin (Bos taurus), which comprises, without being limited to, both the cow of European origin or domestic cow (Bos taurus taurus) such as cow of Asian origin or zebu (Bos taurus indicus).
  • Cow beta-lactoglobulin (Bos taurus) is defined as it is collected in the NCBI database with accession number U31361 for the beta-lactoglobulin variant A gene (according to the July 31, 2001 version of said database), accession number DQ489319 for the beta-lactoglobulin variant B gene (according to the December 7, 2006 version of said database), accession number AF085193 for the variant D gene of beta-lactoglobulin (according to the October 14, 1999 version of said database).
  • the beta-lactoglobulin protein is not present in human milk, so the generation of anti-betalactoglobulin antibodies is produced with the intake in the food diet of milk from animals such as those indicated above or food products derived from that milk.
  • the subject has a food diet comprising milk and / or dairy.
  • Dairy products also called dairy products or dairy products, comprise those food products that are processed, usually fermented, derivatives of milk. Dairy derivatives include, but are not limited to, butter, margarine, yogurt, cheese, etc.
  • Methods for determining the level of anti-beta-lactoglobulin antibodies in a sample of a subject are known to those skilled in the art. In one embodiment of the present invention the determination of the levels of anti-beta-lactoglobulin antibodies is carried out by an immunoassay.
  • immunoassay includes any immunochemical technique based on the formation or use of immune complexes, that is, resulting from the conjugation of antibodies and antigens, as quantification references of an analyte (substance under analysis ) determined, which may be the antibody or an antigen, using for measurement a molecule as a marker that produces a detectable signal in response to a specific binding.
  • analyte substance under analysis
  • Said term includes both competitive and non-competitive immunoassays, as well as heterogeneous and homogeneous immunoassays.
  • markers include radioactive elements radioactive elements radioactive elements (e.g., sulfur, iodine, etc.); enzymes (e.g., peroxidase, glycosidase, alkaline phosphatase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -glucuronidase, etc.); fluorescent compounds or dyes (e.g., fluorescein, rhodamine, etc.), phosphorescent or chemiluminescent (e.g., dioxetanes, acridiniums, phenanthridines, ruthenium, luminol, etc.); latex or magnetic particles; colloidal particles of gold, silver, or selenium; metal chelates; coenzymes; etc.
  • radioactive elements e.g., sulfur, iodine, etc.
  • enzymes e.g., peroxidase, glycosidase,
  • the complex formed can be detected or visualized by any appropriate technique, depending on the chosen marker, known to those skilled in the art, using the appropriate devices, for example, by techniques based on radioactive, colorimetric, fluorimetric, (chemo) methods. luminescent, etc., all known to those skilled in the art.
  • the label is an enzyme
  • the detection of the complex (antigen-antibody) / label can be carried out by contacting said complex with an appropriate substrate and, optionally, with the appropriate enzymatic activators and / or amplifying agents .
  • substrates include:
  • Chromogenic substrates based on p-nitrophenyl phosphate (p-PP), 5- bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate / nitroblue tetrazolium (BCIP / NPT), etc.
  • Fluorogenic 4-metilumbelifenilo phosphate (4-MUP), 2- (5' - chloro-2' - phosphoryloxyphenyl) -6-chloro-4- (3H) -quinazolinone (CPPCQ), 3,6- fluorescein diphosphate ( 3,6-FDP), etc.
  • Chromogenic substrates based on 2,2-azinobis (3- ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) (ABTS), o-phenylenediamine (OPT), 3, 3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), o-dianisidine, 5-aminosalicylic acid, 3-dimethylaminobenzoic acid (DMAB) and 3-methyl-2-benzothiazolinhydrazone (MBTH), 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) and 3,3'-diaminobenzidine tetrachloride (DAB), etc.
  • ABTS 2,2-azinobis (3- ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid)
  • OPT o-phenylenediamine
  • TMB 3, 3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • DMAB 3-dimethylaminobenzoic acid
  • MBTH 2--benzothiazol
  • Fluorogenic 4-hydroxy-3-methoxyphenylacetic acid, reduced phenoxazines and reduced benzothiazines, including the Amplex ® Red reagent, Amplex UltraRed, reduced dihydroxanthenes, etc.
  • Chromogenic substrates based on o-nitrophenyl-P-D-galactoside (o-PG), p-nitrophenyl-P-D-galactoside and 4-methylumbelliphenyl-P-D-galactoside (MUG) for ⁇ -D-galactosidase, etc.
  • Fluorogenic resorufin ⁇ -D-galactopyranoside, fluorescein digalactoside (FDG), fluorescein diglucuronide, 4-methylumbelliferyl beta-D-galactopyranoside, carboxybumbiferifer beta-D-galactopyranoside, coumarin beta-D-galactopyranoside, etc.
  • immunoassays suitable for the implementation of the methods of the present invention include Western blot, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), DAS-ELISA ("Double Antibody Sandwich-ELISA"), competitive EIA ( competitive enzyme immunoassay), DELFIA (lanthanide augmented dissociation fluoroimmunoassay), FPIA (fluorescence polarization immunoassay), CMIA (chemiluminescent magnetic immunoassay), RIA (heterogeneous and competitive radioimmunoassay), IRMA and non-competitive heteroimmunoassay (microparticle immunoassay), luminoimmunoassays, immunocytochemical and immunoassay techniques histochemicals, techniques based on the use of biomarker biochips, biosensors (eg, immunobiosensors) or microarrays, lab-on-a-chip that include specific antibodies, tests based on colloidal precipitation in formats such as
  • the immunoassay used for the implementation of the methods of the present invention can be used to determine the amount (quantify) of anti-betalactoglobulin antibody in a sample since, with many markers, eg, enzymes, the amount of antibody present in The test sample is proportional to the generated signal.
  • the immunoassay is an ELISA.
  • the ELISA technique is based on the use of enzyme-labeled antigens or antibodies, so that the conjugates formed between the target antigen and the labeled antibody result in the formation of enzymatically active complexes. Because one of the components (the antigen or the antibody) is immobilized on a support, the antibody-antigen complexes are immobilized on the support, and therefore can be detected by the addition of a substrate that is converted by the enzyme in a product that is detectable, for example, by spectrophotometry or fluorometry.
  • the beta-lactoglobulin protein is used as a support antigen in a solid phase.
  • the first method of the invention contemplates the detection and / or determination of the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in a blood or serum sample by an immunoassay by lateral flow chromatography.
  • the level of anti-beta-lactoglobulin antibody is determined by the use of immunochromatographic strips.
  • lateral flow is meant in the present invention the flow of a liquid in a material in which the components that are dissolved in the sample are essentially transported by capillary with equal speed and with an intact lateral flow through the material.
  • the detection and / or determination of the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in a blood or serum sample by lateral flow chromatography comprises the following steps:
  • said blood or serum sample capable of containing anti-beta-lactoglobulin antibodies
  • a first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component under conditions that allow the formation of a complex between the anti-beta- antibody lactoglobulin and the first binding component
  • said first binding component is movable and is embedded in a reaction region of a strip comprising a porous material, wherein the strip comprises a second test region, comprising a second component binding to the anti-beta-lactoglobulin antibody immobilized in said strip
  • first and second binding components are selected from the group formed a specific antigen for the anti-beta-lactoglobulin antibody, or a fragment thereof capable of binding to said antibody.
  • strip comprising a porous material any element in the form of an elongated strip comprising a porous material.
  • porous material refers to a material capable of allowing lateral flow inside.
  • valid porous materials are, without limitation, copolymer of acrylonitrile, cotton, fiberglass, cellulose nitrate, mixtures of nitrocellulose and polyester or cellulose, nylon (polyamides), paper, rayon and the like.
  • movable is meant that it is not bound to the porous material so that when the first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component comes into contact with the test sample, if it contains the antigen of interest (anti-antibody beta-lactoglobulin), the anti-beta-lactoglobulin- antibody complex First anti-beta-lactoglobulin antibody binding component can be displaced by the strip by means of lateral flow.
  • the first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component will preferably be in dried or dehydrated form and may be attached to a label.
  • said first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component may be accompanied by other molecules as preservatives, etc.
  • the strip has a zone or region to receive the sample (receiving region) that may be the same or different from the region where the first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component (reaction region) is located.
  • the region is different, both must be contacted by a porous material so that the sample can flow by capillarity to the region where the first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component is located so as to solubilize it. so that, if the sample contains anti-beta-lactoglobulin antibodies, the anti-beta-lactoglobulin antibody-first antibody-binding component complex is formed.
  • the invention contemplates that the sample be loaded together with a carrier solution to facilitate dissolution of the first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component as well as lateral flow.
  • the strip comprises a second anti-beta-lactoglobulin antibody binding component immobilized in a second region of said strip called test region.
  • the second anti-beta-lactoglobulin antibody binding component is immobilized in the porous material of the strip by means of covalent bonds or by other types of bonds.
  • the application of the second anti-beta-lactoglobulin antibody binding component to the test region can be performed using methods known in the state of the art.
  • the strip is placed in suitable conditions so that the anti-beta-lactoglobulin-first binding component antibody complex travels through the strip until reaching the test region.
  • the strip is structured in such a way that the anti-beta-lactoglobulin-first antibody binding component to the anti-beta-lactoglobulin antibody can circulate laterally to the test region, where the second anti-antibody binding component beta-lactoglobulin is immobilized to the strip material.
  • the anti-beta-lactoglobulin-first antibody binding component to the anti-beta-lactoglobulin antibody will bind the second component to the anti-beta-lactoglobulin antibody fixed on the strip so that a line can be formed that can be detected depending of the marker used.
  • a third step the binding of the anti-beta-lactoglobulin antibody-first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component to the second anti-beta-lactoglobulin antibody binding component immobilized in the test region is detected.
  • the first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component is labeled, however it is also contemplated that the mixture has been previously incubated with a label, so that all the molecules in the sample, including the antigens ( anti-beta-lactoglobulin antibodies) have been labeled.
  • markers that can be used as well as the methods for their detection have been named above.
  • the first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component is selected from the group consisting of an antigen specific for the anti-beta-lactoglobulin antibody or a fragment thereof capable of binding to said antibody.
  • the first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component is beta-lactoglobulin or a beta-lactoglobulin fragment capable of binding to said anti-beta-lactoglobulin antibody.
  • the second anti-beta-lactoglobulin antibody binding component is selected from, without being limited to, beta-lactoglobulin, a beta-lactoglobulin fragment capable of binding to the anti-beta-lactoglobulin antibody, or an antibody -anti-beta-lactoglobulin secondary.
  • the strip comprises an additional region (control region) comprising a third binding component that specifically binds to the first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component fixed in said strip.
  • the first binding component to the anti-beta-lactoglobulin antibody is an antigen (eg, beta-lactoglobulin) or a fragment of said antigen or a mixture thereof
  • the third binding component will be an antibody against that antigen , antibodies or antibody fragments capable of binding to antigen (anti-IgG).
  • the third binding component in the control region may contain the anti-beta-lactoglobulin antibody that is intended to be determined.
  • the test sample does not exhibit the anti-beta-lactoglobulin antibody, then the sample will flow through the reaction and test regions without binding to the first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component or the second binding component to the anti-beta-lactoglobulin antibody.
  • the first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component will travel alongside the sample and bind to the third binding component fixed in the strip in the control region.
  • control region comprises a binding component that specifically binds to a component fixed in an anterior region of the strip, wherein said component attached to said anterior region of the strip is a different protein of the anti-beta-lactoglobulin antibody.
  • said protein other than the anti-beta-lactoglobulin antibody is present in the reaction region of the strip.
  • Virtually any protein, with the exception of beta-lactoglobulin, different from the anti-beta-lactoglobulin antibody and that binds to a binding component may be present in said particular embodiment of the immunochromatographic strip.
  • said protein binding component other than the anti-beta-lactoglobulin antibody is an antibody specific to said protein other than the anti-beta-lactoglobulin antibody.
  • the different regions may be separated from each other with the same distance or with different distances and will be arranged, preferably transversely to the flow direction.
  • the distance between the different regions will depend on the design of the test apparatus or device in question as well as the components thereof.
  • the distance will vary between 2 and 5 mm, 6-10 mm, 11-15 mm, 16-20 mm, 21-30 mm, 31-40 mm, 41-60 mm, 61-150 mm, etc.
  • Preferably said distance is between 16 and 20 mm.
  • Kits for the determination of the level of anti-beta-lactoglobulin antibodies are commercially available.
  • Illustrative, non-limiting examples of such kits include: - Kits used for the analysis and quality of food products, or for detection of food fraud, such as:
  • Beta-lactoglobulin residue test ESMRDBLG-48, ELISA-Systems. Queensland, Australia;
  • beta-immunoglobulin ELISA kit E1023h. EIAab & USC LIFE (Wuhan EIAab Science Co., Ltd, Wuhan, 430079, China); beta-lactoglobulin ELISA kit, ESBL6812. Ever Systems Biology Laboratory, Inc. Sacramento, CA 95811, USA;
  • the analysis of human antibodies against bovine beta-lactoglobulin can be performed by suitable kits or analytical devices, using the bovine beta-lactoglobulin protein or a functionally equivalent fragment thereof (i.e., a fragment of bovine beta-lactoglobulin capable of binding to a bovine anti-beta-lactoglobulin antibody) as a support antigen.
  • the bovine beta-lactoglobulin protein or a functionally equivalent fragment thereof i.e., a fragment of bovine beta-lactoglobulin capable of binding to a bovine anti-beta-lactoglobulin antibody
  • the protein To develop the kit in plastic support, the protein must be fixed to a solid phase, fixing the antigen (bovine beta-lactoglobulin or an equivalent fragment thereof) to a plate.
  • the antigen thus supported is incubated with the test sera, the mixture is washed and incubated with the secondary antibody bound to a label (eg, alkaline phosphatase, etc.) and revealed.
  • a label eg, alkaline phosphatase, etc.
  • the presence of antibodies against Bovine beta-lactoglobulin as a marker of intestinal permeability associated with celiac disease can be subsequently validated in samples from previously diagnosed celiac patients. This validation allows the development of analytical kits and methods (eg, ELISA-based methods, immunoassays by lateral flow chromatography, etc., immunochromatographic strips of clinical application, etc.), for the routine and standardized analysis of antibodies against beta- bovine lactoglobulin, independently or in association with other markers of celiac disease or adherence to the gluten-free diet.
  • analytical kits and methods eg, ELISA-based methods, immunoassays by lateral flow chromatography, etc., immunochromatographic strips of clinical application, etc
  • the determination of the level of anti-lactoglobulin antibody is performed by using a biosensor (immunobiosensor).
  • said immunobiosensor is a device that integrates a nanoelectronic sensor system with a biological reagent suitable for practicing the invention.
  • said biological reagent comprises beta-lactoglobulin or a beta-lactoglobulin fragment capable of binding to an anti-beta-lactoglobulin antibody. This type of device allows to perform precise, economical and rapid immunoassays, in a simple way.
  • step (ii) the level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in a blood or serum sample of the subject under study is compared with the level of anti-beta- antibody lactoglobulin in a reference sample, wherein a level of anti-beta-lactoglobulin antibody in the sample of said subject greater than the level of said anti-beta-lactoglobulin antibody in said reference sample is indicative that said subject suffers from celiac disease
  • reference sample used in the first method of the invention refers to a sample from a subject (or set of subjects) diagnosed as non-celiac.
  • the reference sample may be a blood or serum sample, as described above.
  • the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in a reference sample is determined as described above.
  • an anti-beta-lactoglobulin antibody level obtained in the first stage of the first method of the invention is considered “higher” or “higher” or “above” the antibody level.
  • the level of bovine anti-beta-lactoglobulin human antibodies preferably cow anti-lactoglobulin, is determined, as previously defined.
  • the present invention is directed to an in vitro method (hereinafter second method of the invention) for evaluating the response to a gluten-free diet in a subject suffering from celiac disease comprising
  • a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in (ii) lower than that obtained in (i) is indicative that the response of said subject to the gluten-free diet is favorable.
  • evaluation of the response refers to the assessment of the effect (favorable, neutral or unfavorable), which has a gluten-free diet in a subject suffering from celiac disease. It is related to the short-term effect of the gluten-free diet in a subject suffering from celiac disease that initiates said diet.
  • the evaluation of the response to a gluten-free diet is "favorable" when the level of anti-beta-lactoglobulin antibody after a period of time after the start of the diet is less than the level of said antibody before the onset of the diet; It is also considered “unfavorable” when the level of anti-beta-lactoglobulin antibody after a period of time from the start of the diet is greater than the level of said antibody before the start of the diet; and it is "neutral" when the level of anti-beta-lactoglobulin antibody does not vary substantially after a period of time since the beginning of the diet with respect to the level at the beginning of the diet.
  • gluten-free diet corresponds to a food diet based on foods that do not contain gluten or gluten-free foods and in which both foods that contain gluten and foods are excluded. Foods that may contain gluten.
  • Foods can be classified into three categories based on their gluten content: (i) gluten-free (all those that by nature do not contain gluten),
  • gluten-free foods this group includes, but is not limited to, milk and derivatives (cheese, cheese spread without flavors, cottage cheese, cream, plain yogurt, curd), all kinds of meats and viscera (fresh, frozen or canned naturally ), uncooked fish (fresh or frozen), fresh seafood, canned fish and shellfish (natural or in oil), eggs, vegetables, vegetables, tubers, fruits, rice, corn, tapioca, legumes, sugar, honey, oils , butter, coffee, infusions, soft drinks (orange, lemon or cola), wines, sparkling drinks, salt, wine vinegar, spices (branch, grain, all natural);
  • this group includes, but is not limited to, sausages (chóped, mortadella, sausage, blood sausage, sausages, etc.), cheeses (melted, spread of flavors, especially for pizzas), canned meat, meatballs, hamburgers, canned fish (in sauce, with fried tomato), sauces, condiments, food colors, substitutes (coffee, chocolate, cocoa and others machine drinks, nuts (toasted or with flour and salt), candies, candies, some types of ice cream, chocolate substitutes; and gluten-containing foods: this group includes, but is not limited to, bread, flour (wheat, barley, rye), buns, cakes, pies, cookies, biscuits, pastries, pasta (noodles, macaroni, noodles), dried figs, distilled or fermented beverages from cereals (beer, beer water) and in general all those manufactured products whose composition includes flour from the mentioned cereals or in any of its forms (starches, starches, semolina, proteins).
  • the food industry produces special products called "gluten-free” that replace those made from wheat, barley, rye and oats.
  • FACE Federation of Celiac Associations of Spain
  • the international symbol used for those gluten-free foods is that of the "Barred Spike”.
  • the FACE produces lists of foods whose consumption is suitable for coeliacs.
  • the subject has a gluten-free food diet that includes milk and / or milk derivatives.
  • step (i) the level of anti-beta-lactoglobulin antibody is determined in a blood or serum sample of a subject suffering from celiac disease before the start of the free diet gluten.
  • the level of anti-beta-lactoglobulin antibody is determined before the subject suffering from celiac disease begins the gluten-free diet.
  • the determination of the level of anti-beta-lactoglobulin antibodies is performed by ELISA or by a immunoassay by lateral flow chromatography by, for example, the use of immunochromatographic strips.
  • step (ii) the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in a blood or serum sample of the subject under study is determined after a period of time since the Start of the gluten-free diet.
  • the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in the blood or serum sample of the subject under study is determined after a period of time elapsed since the start of the gluten-free diet. Said period of time can be variable, the level of anti-lactoglobulin antibody can be determined after, without being limited to, one or more days; one or more weeks, for example, 1 week, 2 weeks, 3 weeks etc .; one or more months, for example, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, 7 months, 8 months, 9 months, 10 months, 1 1 months, etc .; one or more years, for example, 1 year, 2 years or more than 2 years.
  • step (iii) the levels of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained from a blood or serum sample of a subject suffering from celiac disease are compared before the onset of gluten-free diet (first stage) and from a blood or serum sample of said subject after a period of time elapsed since the beginning of the gluten-free diet (second stage), where an anti-antibody level -beta- lactoglobulin obtained in the second stage lower than that obtained in the first stage is indicative that the response of said subject to the gluten-free diet is favorable.
  • a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in the second stage is considered “lower” or “lower” or “lower” with respect to the level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in the first stage when the level value obtained in the second stage is decreased by at least 10%, at least 15%, at least 20%), at least 25%>, at least 30%>, at least 35%>, at least 40 %>, at least 45%>, at least 50%>, at least 55%>, at least 60%>, at least 65% or, at least 70%>, at least 75% >, at least 80%>, at least 85, at least 90%, at least 95% or 100% with respect to the value of the level obtained in the first stage.
  • a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in the second stage is considered “higher” or “higher” or “higher” with respect to the level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in the first stage when the level value obtained in the second stage is increased by at least 10%>, at least 15%, at least 20%), at least 25%, at least 30%>, at least 35%, at least 40% , at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%), at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85, at least 90%), at least 95% or 100%> with respect to the value of the level obtained in the first stage.
  • the level of bovine anti-beta-lactoglobulin human antibodies preferably cow anti-lactoglobulin, is determined, as previously defined.
  • the invention relates to an in vitro method (from now on the third method of the invention) for evaluating the effectiveness of a gluten-free diet in a subject suffering from celiac disease comprising
  • an anti-beta-lactoglobulin antibody level obtained in (iia) lower than that obtained in (ia) is indicative that the gluten-free diet is effective;
  • a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in (ib) lower or similar to the level of said anti-beta-lactoglobulin antibody in said reference sample is indicative that the gluten-free diet is effective.
  • beta-lactoglobulin and "anti-beta-lactoglobulin antibody” have been described in detail above and are used with the same meaning in the context of the third method of the invention.
  • the subject has a gluten-free food diet that includes milk and / or milk derivatives.
  • the term "effectiveness evaluation" of the third method of the invention refers to the assessment of whether the effect that a gluten-free diet has on a subject suffering from celiac disease is favorable and if said effect is also maintained over time . It is related to the medium / long term effect of the gluten-free diet in a subject suffering from celiac disease and maintaining said diet.
  • step (ia) comprises determining in a blood or serum sample of the subject the level of anti-beta-lactoglobulin antibody before the start of the free diet gluten.
  • the level of anti-beta-lactoglobulin antibodies is determined by ELISA or by an immunoassay by lateral flow chromatography by, for example, the use of immunochromatographic strips.
  • the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in the blood or serum sample of the subject under study is determined before said subject suffering from celiac disease initiates the gluten free diet.
  • the second stage of alternative (a) of the third method of the invention comprises determining in a sample of the subject at the level of anti-beta-lactoglobulin antibody after a period of time elapsed since the beginning of the gluten free diet.
  • the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in the blood or serum sample of the subject under study is determined after a period of time elapsed since the start of the gluten-free diet. Said period of time can be variable, the level of anti-lactoglobulin antibody can be determined after, without being limited to, one or more days; one or more weeks, for example, 1 week, 2 weeks, 3 weeks etc .; one or more months, for example, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, 7 months, 8 months, 9 months, 10 months, 11 months, etc., one or more years, for example, 1 year, 2 years or more than 2 years.
  • the third method of the invention contemplates the possibility of making determinations of anti-beta-lactoglobulin antibody levels after the start of the gluten-free diet at different times, or even periodically, for example, semiannual, annual determinations. and biennial.
  • the third stage of alternative (a) of the third method of the invention [step (iiia)] involves comparing the levels of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in the first (ia) and second (iia) stages of alternative (a ) of said method, wherein a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in the second stage (iia) lower than that obtained in the first stage (ia) is indicative that the gluten-free diet is effective.
  • a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in the second stage is considered “lower” or “lower” or “lower” with respect to the level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in the first stage when the level value obtained in the second stage is decreased by at least 10%, at least 15%, at least 20%), at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%), at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85, at least 90%), at least 95% or 100% with respect to the value of the level obtained in the first stage.
  • a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in (ib) lower or similar to the level of said anti-beta-lactoglobulin antibody in said reference sample is indicative that the gluten-free diet is effective.
  • the first stage of alternative (b) of the third method of the invention [step (ib)] comprises determining in a blood or serum sample of the subject under study the level of anti-beta-lactoglobulin antibody after a period of Time elapsed since the beginning of the gluten-free diet.
  • the determination of the level of anti-beta-lactoglobulin antibodies is performed by ELISA or by an immunoassay by lateral flow chromatography by, for example, immunochromatographic strips.
  • the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in the blood or serum sample of the subject under study is determined after a period of time since the start of the gluten free diet. Said period of time can be variable, the level of anti-lactoglobulin antibody can be determined after, without being limited to, one or more days; one or more weeks, for example, 1 week, 2 weeks, 3 weeks etc .; one or more months, for example, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, 7 months, 8 months, 9 months, 10 months, 11 months, etc., one or more years, for example, 1 year, 2 years or more than 2 years.
  • the second stage of alternative (b) of the third method of the invention [step (iib)] comprises comparing the level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in the first stage of alternative (b) of said method with the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in a reference sample, wherein a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in the first stage below the level of said anti-beta-lactoglobulin antibody in said reference sample is indicative that the diet Gluten free is effective.
  • reference sample used in the third method of the invention refers to a sample from a subject (or set of subjects) diagnosed as non-celiac.
  • the reference sample may be a blood or serum sample, as described above.
  • the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in a reference sample is determined as described above.
  • a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in the first stage of said method is considered “lower” or “lower” or “lower” with respect to the anti-beta-lactoglobulin antibody level obtained in a reference sample when the value of the level obtained in the first stage is decreased by at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25% , at least 30%, at least 35%, at least 40%), at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85, at least 90%, at least 95% or 100% with respect to the value obtained in the reference sample.
  • the level of bovine anti-beta-lactoglobulin human antibodies preferably cow anti-lactoglobulin, is determined, as previously defined.
  • the invention relates to an in vitro method (hereafter referred to as the fourth method of the invention) for assessing adherence to a gluten-free diet by a subject suffering from celiac disease undergoing a diet free of gluten that comprises
  • a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in (iia) lower than the value obtained in (ia) is indicative of adherence to the gluten-free diet by said subject;
  • a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in (ib) below the level of said anti-beta-lactoglobulin antibody in said reference sample is indicative of adherence to the gluten-free diet by said subject.
  • the subject has a gluten-free food diet that includes milk and / or milk derivatives.
  • the term "adherence evaluation" of the fourth method of the invention refers to the assessment of the follow-up of the gluten-free diet by the subject suffering from celiac disease and following said diet.
  • This assessment of the follow-up of the gluten-free diet by the celiac subject allows, on the one hand, to determine the degree of completeness in the follow-up of said diet, that is, to determine whether the diet effectively excludes or not those foods containing or they may contain gluten and, on the other hand, detect the existence of refractory celiac disease in those cases in which the celiac subject strictly follows the gluten-free diet but nevertheless the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in said subject increases or It remains substantially constant.
  • refractory celiac disease A small percentage of patients in whom celiac disease manifests during adulthood develop primary or secondary resistance to the gluten-free diet. This condition is what is called refractory celiac disease or refractory celiac disease (RCD).
  • RCD refractory celiac disease
  • the RCD can be divided into two types: RCD type I and RCD type II. In both types, clinical and histological signs of gluten-free diet resistance are given. RCD II type, however, is associated with the presence of an aberrant population of intraepithelial lymphocytes that lack the expression of the T-cell receptor (TCR) -CD3 but have CD3s and rearrangements of the TCRy genes. For this reason, RCD II is considered a pre-malignancy condition, and about 50% of RCD II patients develop lymphoma within 5 years after diagnosis (May-Ling J. et al. 2010 Immunogenetics 62 : 641-651).
  • TCR T-cell receptor
  • the fourth method of the invention contemplates two alternatives.
  • Alternative (a) of said method comprises:
  • a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in (iia) lower or similar to the value obtained in (ia) is indicative of adherence to the gluten-free diet by said subject.
  • the first stage of alternative (a) of the fourth method of the invention [step (ia)] comprises determining in a blood or serum sample of the subject under study the level of anti-beta-lactoglobulin antibody at a time ti.
  • the determination of the level of anti-beta-lactoglobulin antibodies is performed by ELISA or by an immunoassay by lateral flow chromatography by, for example, immunochromatographic strips.
  • the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in the blood or serum sample of the subject under study is determined at a time ti.
  • This time corresponds to a temporary moment in which the subject follows a gluten-free diet, from the diagnosis of the disease.
  • Time can be placed in time, without being limited to one or more days; one or more weeks, for example, 1 week, 2 weeks, 3 weeks etc .; one or more months, for example, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, 7 months, 8 months, 9 months, 10 months, 11 months, etc., one or more years, for For example, 1 year, 2 years or more than 2 years, since said subject began the gluten-free diet.
  • the second stage of alternative (a) of the fourth method of the invention comprises determining in a sample of the subject the level of anti-beta-lactoglobulin antibody at a time t2, where t2 corresponds to a point at The time after you.
  • the level of anti-beta-lactoglobulin antibody is determined after a t2 time.
  • Time t2 corresponds to a time in time after you and in which the subject continues on a gluten-free diet.
  • the time interval elapsed from t 1 to t2 can vary widely, one or more days; one or more weeks, for example, 1 week, 2 weeks, 3 weeks etc .; one or more months, for example, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, 7 months, 8 months, 9 months, 10 months, 1 1 months, etc., one or more years, for example, 1 year, 2 years or more than 2 years, for example, 3 years, 4 years or more, etc.
  • the fourth method of the invention contemplates the possibility of making determinations of the level of anti-beta-lactoglobulin antibody at different t2 times, all of them always after you.
  • the third stage of alternative (a) of the fourth method of the invention [step (iiia)] comprises comparing the level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in the first stage (ia) and the second stage (iia), wherein a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in the second stage (iia) lower or similar to the value obtained in the first stage (ia) is indicative of adherence to the gluten-free diet by the subject.
  • a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in the second stage is considered “lower” or “lower” or “lower” with respect to the level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in the first stage when the level value obtained in the second stage is decreased by at least 10%, at least 15%, at least 20%), at least 25%>, at least 30%>, at least 35%>, at least 40 %>, at least 45%>, at least 50%>, at least 55%>, at least 60%>, at least 65%), at least 70%>, at least 75% >, at least 80%>, at least 85, at least 90%), at least 95%> or 100% with respect to the value of the level obtained in the first stage.
  • the fourth method of the invention also contemplates the alternative (b) comprising:
  • a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in (ib) below the level of said anti-beta-lactoglobulin antibody in said reference sample is indicative of adherence to the gluten-free diet by said subject.
  • the first stage of alternative (b) of the fourth method of the invention [step (ib)] comprises determining in a blood or serum sample of the subject under study the level of anti-beta-lactoglobulin antibody.
  • the level of anti-beta-lactoglobulin antibodies is determined by ELISA or by an immunoassay by lateral flow chromatography by, for example, by immunochromatographic strips.
  • the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in the blood or serum sample of the subject under study is determined at any time throughout the follow-up. of the gluten-free diet by the subject.
  • This moment corresponds to a temporary moment in which the subject follows a gluten-free diet, from the diagnosis of the disease, and can be located, without being limited to, one or more days; one or more weeks, for example, 1 week, 2 weeks, 3 weeks etc .; one or more months, for example, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, 7 months, 8 months, 9 months, 10 months, 11 months, etc., one or more years, for For example, 1 year, 2 years or more than 2 years, since said subject began the gluten-free diet.
  • the second stage (iib) of alternative (b) of the fourth method of the invention [step (iib)] comprises comparing the level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in the first stage (ib) of alternative (b) of said method with the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in a reference sample, wherein a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in the first stage (ib) lower or similar to the level of said anti-beta-lactoglobulin antibody in said reference sample it is indicative of adherence to the gluten-free diet by said subject.
  • reference sample used in alternative (b) of the fourth method of the invention refers to a sample from a subject (or set of subjects) diagnosed as non-celiac.
  • the reference sample may be a blood or serum sample, as described above.
  • the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in a reference sample is determined as described above.
  • a level of anti-beta-lactoglobulin antibody obtained in the first stage of said method is considered “lower” or “lower” or “below” the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in a reference sample when the level obtained in the first stage is decreased by at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least one 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%), at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70 %, at least 75%, at least 80%, at least 85, at least 90%, at least 95% or at least 100% s relative to the level of anti-beta-lactoglobulin antibody in the sample reference.
  • the level of bovine anti-beta-lactoglobulin human antibodies preferably cow anti-lactoglobulin, is determined, as previously defined.
  • kits for the determination of the level of anti-beta-lactoglobulin antibody by appropriate analytical methods such as ELISA kits and kits for immunoassays by lateral flow chromatography, for example, immunochromatographic strips.
  • said anti-lactoglobulin antibodies are antibodies of human origin, for example, IgA or IgG, anti-bovine beta-lactoglobulin, preferably, cow anti-becta-lactoglobulin.
  • said kit of the invention is a kit suitable for the detection of anti-beta-lactoglobulin antibodies by ELISA as described above; said kit may also contain all or part of the elements necessary for the determination and visualization of the immunological reactions between beta-lactoglobulin and antibodies against beta-lactoglobulin.
  • the person skilled in the art can easily design suitable kits for the detection of antibodies or antigens by ELISA.
  • said kit comprises a solid phase on which beta-lactoglobulin or a functionally equivalent fragment thereof has been fixed (i.e., capable of being recognized by an anti-lactoglobulin antibody), optionally labeled with an appropriate marker , for example, an enzyme, etc.
  • said kit of the invention comprises at least one immunochromatographic strip suitable for performing an immunoassay by lateral flow chromatography as described above; said kit may also contain all or part of the elements necessary for the determination and visualization of the immunological reactions between beta-lactoglobulin and antibodies against beta-lactoglobulin.
  • the prior art describes devices suitable for the detection of antibodies or antigens by side-flow chromatography immunoassays comprising at least one immunochromatographic strip (see, for example, EP 186799, EP 291194, EP 383619, etc.).
  • the invention provides an immunochromatographic strip, suitable for the detection of beta-lactoglobulin, preferably bovine beta-lactoglobulin, by an immunoassay by lateral flow chromatography, hereinafter, immunochromatographic strip of the invention, comprising:
  • reaction region which comprises a first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component, wherein said first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component is movable and embedded in a porous material;
  • test region which comprises a second anti-beta-lactoglobulin antibody binding component immobilized in said test region; wherein said first and second binding component are selected from the group formed a specific antigen for the anti-beta-lactoglobulin antibody, or a fragment of said functionally equivalent antigen, that is, capable of binding to said anti-beta-lactoglobulin antibody .
  • the first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component is beta-lactoglobulin or a functionally equivalent beta-lactoglobulin fragment, that is, capable of binding to said anti-beta-lactoglobulin antibody.
  • porous material is a material that allows lateral flow inside.
  • porous materials include copolymer of acrylonitrile, cotton, fiberglass, cellulose nitrate, mixtures of nitrocellulose and polyester or cellulose, nylon (polyamides), paper, rayon and the like.
  • movable indicates that it is not bound to the porous material so that when the first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component comes into contact with the test sample, if it contains the antigen of interest (anti-antibody beta-lactoglobulin), the anti-beta-lactoglobulin antibody-first antibody-binding component complex can be displaced by the strip by means of lateral flow.
  • the first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component will preferably be in dry or dehydrated form and may be attached to a label.
  • said first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component (for example, beta-lactoglobulin or a functionally equivalent fragment thereof), is bound and / or coating microspheres, wherein said microspheres are advantageously , colored in one color, for example, in red, etc., which may be in dried or dehydrated form and are reconstituted in contact with the sample.
  • the sample contains anti-beta-lactoglobulin antibodies, they bind to the beta-lactoglobulin that is bound or coats said microspheres, the complex that advances and reaches the test region containing said second binding component is formed.
  • the anti-beta-lactoglobulin antibody for example, beta-lactoglobulin or a functionally equivalent fragment thereof, arranged in, for example, a line, so that the generated immunoreaction results in a colored line (eg, red, etc. .), which would be indicative of the presence of anti-beta-lactoglobulin antibodies in the analyzed sample.
  • said first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component may be accompanied by other molecules as preservatives, etc.
  • the second anti-beta-lactoglobulin antibody binding component is immobilized in the porous material present in the test region by covalent bonds or by other types of bonds.
  • the reaction and test regions may be formed by the same porous material or by different porous materials; In any case, both regions are contacted with each other through a porous material so that the sample can flow by capillarity from the reaction region to the test region.
  • the immunochromatographic strip of the invention comprises a receiving region or zone for receiving the sample, which may be the same or different from the reaction region where the first anti-beta-antibody binding component is located.
  • lactoglobulin In the event that the region is different, both must be contacted by a porous material so that the sample can flow by capillarity from the receiving region to the reaction region.
  • said immunochromatographic strip of the invention comprises a control region comprising a third binding component that specifically binds to the first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component.
  • the first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component is beta-lactoglobulin or a functionally equivalent fragment of said protein, or a mixture of both
  • the third binding component can be an antibody against said protein or fragment of the same.
  • the third binding component in the control region may contain the anti-beta-lactoglobulin antibody to be determined.
  • the sample to be analyzed does not contain anti-beta-lactoglobulin antibodies, then the sample will flow through the reaction and test regions without binding to the first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component or the second binding component. to the anti-beta-lactoglobulin antibody, and the first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component will travel alongside the sample and bind to the third binding component fixed in the strip in the control region.
  • the control region comprises a binding component that specifically binds to a component fixed in an anterior region of the strip, wherein said component fixed to said anterior region of the strip is a different protein from the anti-beta-lactoglobulin antibody.
  • said protein other than the anti-beta-lactoglobulin antibody is present in the reaction region.
  • Virtually any protein, with the exception of beta-lactoglobulin, different from the anti-beta-lactoglobulin antibody and that binds to a binding component may be present in said particular embodiment of the immunochromatographic strip.
  • said protein binding component other than the anti-beta-lactoglobulin antibody is an antibody specific to said protein other than the anti-beta-lactoglobulin antibody.
  • the different regions possibly present in the immunochromatographic strip of the invention may be separated from each other at the same distance or at different distances and will be arranged, preferably transversely to the flow direction.
  • the distance between the different regions will depend on the design of the test apparatus or device in question as well as the components thereof. The distance will vary between 2 and 5 mm, 6-10 mm, 11-15 mm, 16-20 mm, 21-30 mm, 31-40 mm, 41-60 mm, 61-150 mm, etc. Preferably said distance is between 16 and 20 mm.
  • the immunchromatographic strip of the invention may be contained within a device, as is usual in this type of strips.
  • the kit of the invention comprises, in addition to at least one immunochromatographic strip of the invention, a carrier solution to facilitate dissolution of the first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component as well as lateral flow.
  • the kit of the invention comprises, in addition to at least one immunochromatographic strip of the invention the reagents necessary for the visualization of the complex or complexes formed.
  • the immunochromatographic strip of the invention comprises a reaction visualization system comprising colloidal particles or colored microspheres coated with beta-lactoglobulin.
  • the immunochromatographic strip of the invention comprises:
  • first microspheres colored in a first color, for example, in red, optionally, in dry or dehydrated form and capable of being reconstituted in contact with the sample to be analyzed, wherein said first microspheres are bound to, or completely coated or partially by said first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component, for example, beta-lactoglobulin or a functionally equivalent fragment thereof;
  • second microspheres colored in a second color, different from said first color, for example, in blue, optionally, in dry or dehydrated form and capable of being reconstituted in contact with the sample to be analyzed, wherein said second microspheres are bound to, or totally or partially coated by a control protein, wherein said control protein is a different protein from said first anti-beta-lactoglobulin antibody binding component.
  • the sample contains anti-beta-lactoglobulin antibodies, they bind to the beta-lactoglobulin that is bound or coats said first microspheres, the complex formed advances and reaches the test region containing said second component.
  • binding to the anti-beta-lactoglobulin antibody for example, beta-lactoglobulin or a functionally equivalent fragment thereof, arranged in, for example, a line, so that the generated immunoreaction results in a colored line (eg, red ), which would be indicative of the presence of anti-beta-lactoglobulin antibodies in the analyzed sample.
  • these second microspheres eg, colored in blue
  • the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique was used to look for the presence of anti-beta-lactoglobulin IgG antibodies in the serum of healthy, diabetic, celiac or both children.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the protein was first fixed to the solid phase, fixing the beta-lactoglobulin antigen to a 96-well plate, by means of a solution of 1 mg / ml of beta-lactoglobulin in a C0 3 Na 2 buffer (carbonate) - C0 3 HNa (bicarbonate) 0.05 M overnight, pH 9.6 and at 4 o C in a humid chamber. After 12 h, excess protein was removed by 3 washes with 200 ⁇ of PBS-0.5% Tween 20 (PBST). Once the beta-lactoglobulin was bound, it was incubated 2 h at room temperature with 200 ⁇ per well of a 1/100 dilution of each of the problem sera in PBST.
  • PBST PBS-0.5% Tween 20
  • the antibody that had not been retained was removed by 3 washes with 200 ⁇ of PBST. It was incubated for 3 h at room temperature with the secondary antibody bound to the enzyme, with 200 ⁇ of a 1/3700 dilution of the human anti-alkaline IgG antibody bound to alkaline phosphatase (Sigma) in PBST. The excess of antibody was removed by washing 3 times with 200 ⁇ of PBST. It was then revealed with a tablet of 4-nitrophenyl / phosphate hexahydrate sodium salt (Sigma) for every 6 ml of diethanolamine buffer, always ensuring that the buffer had a pH of 9.8. 200 ⁇ of this solution was used per well, the colorimetric reaction was allowed to take place at room temperature.
  • Table 1 shows the percentages of children, from the aforementioned groups, that presented anti-beta-lactoglobulin antibodies.
  • the group of celiac children has the highest percentage of positivity against the anti-beta-lactoglobulin antibody. That percentage reverses significantly when celiac children correctly follow a gluten-free diet.
  • the levels of anti-beta-lactoglobulin antibodies found in the sera of healthy, diabetic, celiac and celiac children treated are indicated in Figure 1.
  • celiac children have a serum anti-beta-lactoglobulin antibody level 4 times higher than in healthy children.
  • the serum antibody level reverses to levels equal to those found in healthy children positive for the anti-beta-lactoglobulin antibody, in the group of celiac children who correctly follow the gluten-free diet.
  • One of the methods developed in the present invention is based on lateral flow immunochromatographic strips.
  • the strips consist of several layers that provide everything you need.
  • the strip is treated in a two-band test.
  • the strips are introduced in microtiter plates containing in a dilution 1/20, 1/50 or 1/100, previously prepared, of the serum of the patients to be studied, with a phosphate-based buffered saline solution (PBS) at pH and physiological saline concentration with 1% bovine albumin (BSA).
  • PBS phosphate-based buffered saline solution
  • BSA bovine albumin
  • the liquid rises by capillarity and reconstitutes red colored microspheres that were dry and coated with chromatographically purified beta-lactoglobulin from bovine milk, if the sample contains antibodies against beta- lactoglobulin
  • the complex formed by the colored red microspheres, the chromatographically purified beta-lactoglobulin from bovine milk and the anti-beta-lactoglobulin antibodies present in the patient sample ascends and reaches a region that contains a chromatographically purified beta-lactoglobulin line from bovine milk, causing an immunoreaction that results in a red line.
  • That red band indicates the presence of anti-beta-lactoglobulin antibodies, type IgA or IgG, in the analyzed sample.
  • As a system control in the absorbent region of the strip are also located other dry microspheres colored blue and coated with a certain protein. The complex of the reconstituted protein-coated blue microspheres ascends the strip until it reaches a region where monoclonal antibodies are fixed against said protein, reacting immunologically and resulting in a blue band.
  • the serum is not immunoreactive only a blue control band develops, while in case of immunoreactivity, in addition to the blue band, a band of red results develops after about 5-10 min. If none of the two bands appear, the analysis is not valid and should be repeated with a new strip. No additional equipment is required for the development of the test.

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Abstract

Los anticuerpos anti-beta-lactoglobulinapueden ser utilizados en el diagnóstico y/o seguimiento de la enfermedad celiaca, así como en la evaluación de la respuesta y/o la adherencia a una dieta libre de gluten en enfermos celíacos.

Description

USE OF ANTI - BETA - LACTOGLOBULIN ANTIBODIES IN DIAGNOSING AND MONITORING OF CELIAC DISEASE
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con métodos y kits para el diagnóstico y/o seguimiento de la enfermedad celíaca, así como con métodos y kits para la evaluación de la respuesta y/o la adherencia a una dieta libre de gluten en enfermos celíacos. Las metodologías de la invención están basadas en la determinación del nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en muestras de sangre o de suero de un sujeto que padece o es susceptible de padecer celiaquía.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La celiaquía o enfermedad celíaca es una enfermedad autoinmune que aparece en personas genéticamente predispuestas y que se caracteriza por una inflamación crónica de la parte proximal del intestino delgado, causada por la exposición a la gliadina. La gliadina es uno de los componentes principales del gluten, por lo que el único tratamiento a día de hoy para la celiaquía es la estricta ausencia de gluten en la dieta.
Los síntomas de la enfermedad celíaca incluyen diarrea crónica, retraso del crecimiento y/o desarrollo infantil, fatiga, erupciones en la piel, pérdida de peso, cambios en el carácter (irritabilidad, apatía, introversión, tristeza), vómitos, distensión abdominal, pérdida de apetito, fatiga, etc.
La prevalencia de la enfermedad celíaca en europeos y sus descendientes es del 1%, siendo más frecuente en las mujeres con una proporción 2: 1. Habitualmente la celiaquía se manifiesta durante la etapa infantil, aunque se ha demostrado que también puede manifestarse a lo largo de la etapa adulta.
En un intestino f ncionalmente normal, la mucosa actúa, por una parte, como una barrera física entre el lumen intestinal y la submucosa, y, por otra, como un tejido paracrino que contribuye a orquestar la fisiología del intestino y su respuesta inmune. Ante un aumento de la permeabilidad intestinal, como la descrita en enfermedades con marcado componente autoinmune, como la celiaquía, la integridad de la barrera física disminuye, y por tanto el sistema inmune está expuesto a más antígenos y posiblemente se hace más reactivo.
Los pacientes tratados con dietas libres de gluten muestran menores actividades séricas de antígenos frente al gluten. Sin embargo, esa reducida actividad al gluten, tras la introducción de este tipo de dietas, puede ser consecuencia del catabolismo de los anticuerpos ya formados, así como de una disminución de su síntesis por una menor estimulación antigénica al gluten, y no necesariamente por una mejora en la integridad de la mucosa intestinal.
La estrategia actual de diagnóstico para la enfermedad celíaca se basa fundamentalmente en demostrar una enteropatía dependiente del gluten, para lo cual aún se utilizan preferentemente métodos invasivos (biopsias), aunque también se analizan marcadores séricos como los anticuerpos frente a la gliadina. Sin embargo, aún no hay métodos analíticos fiables para el seguimiento de la efectividad del tratamiento propuesto, ya que el análisis histológico de biopsias duodenales no es factible como método de monitorización rutinario para analizar la remisión y eficacia del tratamiento.
Se ha propuesto la determinación de los niveles de anticuerpos frente a otros antígenos alimentarios, así como las medidas de la permeabilidad intestinal como métodos de diagnóstico alternativos de celiaquía (Wahnschaffe U et al. Gastroenterology 2001; 121(6): 1329-1338; Arranz E et al. Gut 1994; 35(4): 476-482). Estos métodos tendrían como ventaja la ausencia de requerimiento de muestras de biopsias.
Los métodos analíticos actuales de la enfermedad celíaca basados en el análisis histológico de biopsias duodenales tampoco permiten evaluar la adherencia a una dieta libre de gluten por parte de los celíacos. Se ha sugerido que el análisis de los cambios cuantitativos y cualitativos en anticuerpos relacionados con la enfermedad celíaca puede ser de utilidad para monitorizar la adherencia al tratamiento con dieta libre de gluten, y de hecho, algunos de los anticuerpos analizados para ello son los anticuerpos frente a la transglutaminasa (anti-tTG) y a la gliadina desaminada (AGA). Sin embargo, estos análisis no reflejan necesariamente el grado real de integridad intestinal, ya que una disminución en esos anticuerpos puede ser consecuencia de un aumento de su catabolismo o una disminución de su síntesis por menor estimulación antigénica al gluten en las dietas libres de gluten. Por lo tanto, a la vista del estado de la técnica, sigue existiendo la necesidad de desarrollar métodos que permitan tanto el diagnóstico como el seguimiento de la enfermedad celíaca cuya fiabilidad sea mayor o al menos aporten más información que la de los métodos descritos hasta la fecha, y que permita una monitorización rutinaria de la evolución de la enfermedad. Asimismo, se hace necesario también el desarrollo de una metodología que permita evaluar tanto la respuesta como el seguimiento a una dieta libre de gluten en los enfermos celíacos.
COMPENDIO DE LA INVENCION
En un primer aspecto, la invención se relaciona con un método de diagnóstico in vitro de celiaquía en un sujeto que comprende
(i) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina; y
(ii) comparar el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (i) con el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en una muestra de referencia;
en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en la muestra de dicho sujeto mayor que el nivel de dicho anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en dicha muestra de referencia es indicativo de que dicho sujeto padece celiaquía.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro de evaluación de la respuesta a una dieta libre de gluten en un sujeto que padece celiaquía que comprende
(i) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina antes del inicio de la dieta libre de gluten;
(ii) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina al cabo de un periodo de tiempo transcurrido desde el inicio de la dieta libre de gluten; y
(iii) comparar los niveles de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenidos en (i) e (ii);
en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (ii) inferior al obtenido en (i) es indicativo de que la respuesta de dicho sujeto a la dieta libre de gluten es favorable. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro de evaluación de la efectividad de una dieta libre de gluten en un sujeto que padece celiaquía que comprende
(ia) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina antes del inicio de la dieta libre de gluten;
(iia) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina al cabo de un periodo de tiempo transcurrido desde el inicio de la dieta libre de gluten; y
(iiia) comparar los niveles de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenidos en
(ia) e (iia),
en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (iia) inferior al obtenido en (ia) es indicativo de que la dieta libre de gluten es efectiva;
o alternativamente,
(ib) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina al cabo de un periodo de tiempo transcurrido desde el inicio de la dieta libre de gluten; y
(iib) comparar el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (ib) con el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en una muestra de referencia;
en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (ib) inferior al nivel de dicho anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en dicha muestra de referencia es indicativo de que la dieta libre de gluten es efectiva.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro de evaluación de la adherencia a una dieta libre de gluten por parte de un sujeto que padece celiaquía sometido a una dieta libre de gluten que comprende
(ia) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina a un tiempo ti;
(iia) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina a un tiempo t2, en donde t2 corresponde a un punto en el tiempo posterior a ti; y (iiia) comparar el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenidos en (ia) y (üa);
en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (iia) inferior al valor obtenido en (ia) es indicativo de adherencia a la dieta libre de gluten por parte de dicho sujeto;
o, alternativamente,
(ib) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina; y
(iib) comparar el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (ib) con el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en una muestra de referencia;
en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (ib) inferior al nivel de dicho anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en dicha muestra de referencia es indicativo de adherencia a la dieta libre de gluten por parte de dicho sujeto.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit que comprende la totalidad o parte de los elementos necesarios para la determinación del nivel de anticuerpo anti- beta-lactoglobulina en una muestra de sangre o de suero. El empleo de dicho kit para la puesta en práctica de cualquiera de los métodos proporcionados por la presente invención constituye un aspecto adicional de esta invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra los niveles de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina en sueros de niños sanos, diabéticos, celíacos y celíacos tratados. Los niveles de anticuerpos se expresan en niveles de absorbancia. San = niños sanos; Diab = niños diabéticos; Cel = niños celíacos; CelT = niños celíacos tratados. *p<0,05; **p<0,01. N = 200.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han encontrado que la determinación de los niveles de anticuerpos séricos frente a beta-lactoglobulina en muestras de sangre o de suero permite efectuar el diagnóstico y seguimiento de la enfermedad celíaca y de la respuesta y adherencia a una dieta libre de gluten. Método de diagnóstico de celiaquía en un sujeto (primer método de la invención)
En un primer aspecto, la invención se refiere a un método (de aquí en adelante primer método de la invención) de diagnóstico in vitro de celiaquía en un sujeto que comprende:
(i) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina; y
(ii) comparar el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (i) con el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en una muestra de referencia;
en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en la muestra de dicho sujeto mayor que el nivel de dicho anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en dicha muestra de referencia es indicativo de que dicho sujeto padece celiaquía.
El término "celiaquía" o "enfermedad celíaca" en la presente invención hace referencia a una patología autoinmune caracterizada por una inflamación crónica de la parte próxima del intestino delgado o yeyuno, causada por la exposición a la gliadina, que es uno de los componentes del gluten. La enfermedad celíaca supone una intolerancia permanente al gluten cuya característica es una reacción inflamatoria de base inmune en la mucosa intestinal que dificulta la absorción de los nutrientes.
El gluten es una proteína presente en cereales tales como trigo {Triticum spp), cebada (Hordeum vulgare), centeno (Sécale cereale), triticale (Triticosecale, cereal procedente del cruce entre trigo y centeno), kamut (Triticum turgidum), espelta (Triticum spelta) y posiblemente avena (Avena spp), pero ausente en arroz (Oriza sativa) y maíz (Zea mays). El gluten se compone de gliadina y glutenina, siendo la gliadina una glucoproteína de tipo prolamina. En el sujeto que padece la celiaquía o celíaco, la ingestión de gliadina provoca que el enzima transglutaminasa tisular modifique dicha proteína y el sistema inmune origine una reacción cruzada contra el intestino delgado, causando una reacción inflamatoria que causa atrofia de las vellosidades que recubren el intestino e interferencia en la absorción de nutrientes.
El desarrollo de la enfermedad celíaca está determinado tanto por factores ambientales (alimentación) como genéticos. Así, la celiaquía implica también una predisposición genética ya que la mayor parte de celíacos presentan el antígeno de leucocito humano (HLA) de tipo DQ2 (HLA-DQ2) y DQ8 (HLA-DQ8) (May-Ling J. et al. 2010 Immunogenetics 62:641-651).
El término "sujeto", tal como se usa en la invención, se refiere a todos los animales clasificados como mamíferos e incluye, pero no está restringido a, animales domésticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano hombre o mujer de cualquier edad o raza.
El término "diagnóstico", tal como se usa en el primer método de la invención, comprende la evaluación de la susceptibilidad de un sujeto a una enfermedad, la determinación de si un sujeto tiene actualmente la enfermedad y también el pronóstico de un sujeto afectado por la enfermedad. Tal como entenderá el experto en la técnica, tal evaluación normalmente puede no ser correcta para el 100% de los sujetos que van a diagnosticarse, aunque preferiblemente es correcta. Sin embargo, el término requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos pueda identificarse como que padece la enfermedad o que tiene una predisposición a la misma. Si una parte es estadísticamente significativa puede determinarlo de manera sencilla el experto en la técnica usando varias herramientas de evaluación estadísticas bien conocidas, por ejemplo, la determinación de intervalos de confianza, la determinación de valores de p, la prueba de la t de Student, la prueba de Mann-Whitney, etc. Se proporcionan detalles en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%. Los valores de p son preferiblemente 0,2, 0,1 ó 0,05.
En una primera etapa del primer método de la invención [etapa (i)], se determina en una muestra de sangre o de suero del sujeto el nivel de anticuerpos anti-beta- lactoglobulina.
El término "muestra", tal como se emplea en la presente invención, hace referencia a una muestra, susceptible de contener anticuerpos anti-beta-lactogobulina obtenida partir del sujeto bajo estudio (salvo que se indique lo contrario), tal como una muestra de sangre o de suero obtenida a partir de dicho sujeto. En una realización particular, dicha muestra de sangre comprende sangre periférica. El término "sangre periférica" se relaciona con el volumen de sangre circulante distante del corazón, esto es, la sangre que circula por el organismo de un sujeto. La muestra de sangre puede obtenerse por métodos convencionales conocidos por el técnico en la materia. El término "suero", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere al componente de la sangre resultante tras la coagulación de ésta y eliminación del coágulo resultante. Métodos de obtención de muestras de sangre a partir de un sujeto están ampliamente recogidos en el estado de la técnica, así como métodos de obtención de suero a partir de muestras de sangre.
El término "anticuerpo", tal como se emplea en la presente invención, se refiere a una glucoproteína que exhibe una actividad de unión específica por una proteína particular, a la que se denomina "antígeno". En el contexto de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo anti-beta-lactoglobulina, es decir, que reconoce y se une de modo específico a la proteína beta-lactoglobulina, siendo dicha proteína el antígeno, a un fragmento de la misma. En una realización particular, dicho anticuerpo es un anticuerpo humano. En una realización particular, dicho anticuerpo es un anticuerpo humano con isotipo A (IgA) o G (IgG).
El término "beta-lactoglobulina" al que hace referencia la invención es una proteína presente en el suero de la leche, siendo secretada en la leche de rumiantes (tales como bovinos, ovinos, caprinos o cérvidos), monogástricos (tales como porcinos) y marsupiales (mamíferos terios), pero ausente en la leche de humanos, roedores y lagomorfos. De las tres proteínas alergénicas más abundantes en el suero de la leche de vaca o Bos taurus (caseína, alfa-lactoalbúmina y beta-lactoglobulina), la beta- lactoglobulina es la proteína soluble presente en mayor concentración, alcanzando concentraciones de 2 a 4 mg/ml en el lactosuero bovino. La función de esta proteína aún no está clara, aunque supone un potente alérgeno en seres humanos. Presenta una alta resistencia a la digestión ácida del estómago.
La beta-lactoglobulina bovina es una proteína formada por 162 aminoácidos y un peso molecular de 18,4 kDa. En condiciones fisiológicas se encuentra preferiblemente en forma de dímero, pero se disocia en monómeros a pH por debajo de 3. Existen variantes genéticas de la beta-lactoglobulina bovina, siendo las más comunes la A (con una valina en posición 118 y un aspártico en posición 64) y la B (con una alanina en posición 118 y una glicina en posición 64). La proteína beta-lactoglobulina frente a la cual se originan anticuerpos anti-beta- lactoglobulina cuyo nivel se determina en la invención corresponde a la beta- lactoglobulina procedente de animales rumiantes, monogástricos y marsupiales. Preferiblemente, la proteína beta-lactoglobulina frente a la cual se originan anticuerpos anti-beta-lactoglobulina cuyo nivel se determina en la invención corresponde a la beta- lactoglobulina de animales rumiantes {Ruminantia). Más preferiblemente, la proteína beta-lactoglobulina frente a la cual se originan anticuerpos anti-beta-lactoglobulina cuyo nivel se determina en la invención corresponde a la beta-lactoglobulina de bovinos (subfamilia de mamíferos placentarios que pertenece a la familia Bovinae e incluye los géneros Bison, Bos, Boselaphus, Pseudoryx, Syncerus, Taurotragus, Tetracerus y Tragelaphus). Aún más preferiblemente, la proteína beta-lactoglobulina frente a la cual se originan anticuerpos anti-beta-lactoglobulina cuyo nivel se determina en la invención es la beta-lactoglobulina de vaca (Bos taurus), que comprende, sin limitarse a, tanto la vaca de origen europeo o vaca doméstica (Bos taurus taurus) como la vaca de origen asiático o cebú (Bos taurus indicus).
La beta-lactoglobulina de vaca (Bos taurus) se define tal como es recogida en la base de datos NCBI con número de acceso U31361 para el gen de la variante A de beta- lactoglobulina (según la versión del 31 de julio de 2001 de dicha base de datos), número de acceso DQ489319 para el gen de la variante B de la beta-lactoglobulina (según la versión del 7 de diciembre de 2006 de dicha base de datos), número de acceso AF085193 para el gen de la variante D de la beta-lactoglobulina (según la versión del 14 de octubre de 1999 de dicha base de datos).
La proteína beta-lactoglobulina no está presente en la leche humana, por lo que la generación de anticuerpos anti-betalactoglobulina se produce con la ingesta en la dieta alimenticia de leche procedente de animales tales como los indicados anteriormente o productos alimentarios derivados de esa leche. Así, en una realización particular de la invención, el sujeto tiene una dieta alimenticia que comprende leche y/o lácteos. Los lácteos, también denominados productos lácteos o derivados lácteos, comprenden aquellos productos alimenticios que son derivados procesados, generalmente fermentados, de la leche. Los derivados lácteos comprenden, sin limitarse a, mantequilla, margarina, yogur, queso, etc. Métodos para la determinación del nivel de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina en una muestra de un sujeto son conocidos por el experto en la materia. En una realización de la presente invención la determinación de los niveles de anticuerpos anti- beta-lactoglobulina se lleva a cabo mediante un inmunoensayo.
El término "inmunoensayo", tal como aquí se utiliza, incluye cualquier técnica inmunoquímica basada en la formación o empleo de complejos inmunes, es decir, resultantes de la conjugación de anticuerpos y antígenos, como referencias de cuantificación de un analito (sustancia objeto de análisis) determinado, que puede ser el anticuerpo o un antígeno, usando para la medición una molécula como marcador que produce una señal detectable en respuesta a una unión específica. Dicho término incluye tanto inmunoensayos competitivos como no competitivos, así como inmunoensayos heterogéneos y homogéneos.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de marcadores incluyen elementos radiactivos elementos radiactivos (e.g., azufre, iodo, etc.); enzimas (e.g., peroxidasa, glicosidasa, fosfatasa alcalina, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, β-galactosidasa, β- glucosidasa, β-glucuronidasa, etc.); compuestos o colorantes fluorescentes (e.g., fluoresceína, rhodamina, etc.), fosforescentes o quimioluminiscentes (e.g., dioxetanos, acridinios, fenantridinios, rutenio, luminol, etc.); partículas de látex o magnéticas; partículas coloidales de oro, plata, o selenio; quelatos metálicos; coenzimas; etc. La selección de un marcador particular no es crítica, siempre y cuando sea capaz de producir una señal por sí mismo o conjuntamente con una o más sustancias adicionales. Así, el complejo formado puede ser detectado o visualizado por cualquier técnica apropiada, dependiendo del marcador elegido, conocida por los técnicos en la materia, utilizando los dispositivos apropiados, por ejemplo, mediante técnicas basadas en métodos radiactivos, colorimétricos, fluorimétricos, (quimio)luminiscentes, etc., todas ellas conocidas por los técnicos en la materia. A modo ilustrativo, cuando el marcador es una enzima, la detección del complejo (antígeno-anticuerpo)/marcador puede llevarse a cabo poniendo en contacto dicho complejo con un sustrato apropiado y, opcionalmente, con los activadores y/o agentes de amplificación enzimáticos apropiados. Ejemplos ilustrativos de dichos sustratos incluyen:
• Para la fosfatasa alcalina: Cromogénico: sustratos basados en p-nitrofenil fosfato (p- PP), 5- bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitroblue tetrazolium (BCIP/NPT), etc. Fluorogénico: fosfato de 4-metilumbelifenilo (4-MUP), 2-(5'-cloro-2'- fosforiloxifenil)-6-cloro-4-(3H)-quinazolinona (CPPCQ), 3,6- fluoresceín-difosfato (3,6-FDP), etc.
• Para peroxidasas:
Cromogénico: sustratos basados en ácido 2,2-azinobis(3- etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS), o-fenilendiamina (OPT), 3, 3', 5,5'- tetrametilbenzidina (TMB), o-dianisidina, ácido 5-aminosalicílico, ácido 3-dimetilaminobenzoico (DMAB) y 3-metil-2-benzotiazolinhidrazone (MBTH), 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) y tetracloruro de 3,3'- diaminobenzidina (DAB), etc.
Fluorogénico: ácido 4-hidroxi-3-metoxifenilacético, fenoxazinas reducidas y benzotiazinas reducidas, incluyendo el reactivo Amplex® Red, Amplex UltraRed, dihidroxantenos reducidos, etc.
• Para glicosidasas:
Cromogénico: sustratos basados en o-nitrofenil-P-D-galactósido (o- PG), p-nitrofenil-P-D-galactósido y 4-metilumbelifenil-P-D-galactósido (MUG) para β-D-galactosidasa, etc.
Fluorogénico: resorufin β-D-galactopiranósido, fluoresceín digalactósido (FDG), fluoresceín diglucurónido, 4-metilumbeliferyl beta-D- galactopiranósido, carboxiumbeliferil beta-D-galactopiranósido, cumarin beta-D- galactopiranósidos fluorados, etc.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de inmunoensayos adecuados para la puesta en práctica de los métodos de la presente invención incluyen Western blot, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), DAS-ELISA ("Double Antibody Sandwich-ELISA"), EIA competitivo (inmunoensayo de enzima competitivo), DELFIA (fluoroinmunoensayo de disociación aumentada por lantánidos), FPIA (inmunoensayo por polarización de fluorescencia), CMIA (inmunoensayo magnético quimioluminiscente), RIA (radioinmunoensayo heterogéneo y competitivo), IRMA (radioinmunoensayo heterogéneo y no competitivo), MEIA (inmunoensayo por micropartícula), luminoinmunoensayos, técnicas inmunocitoquímicas e inmuno- histoquímicas, técnicas basadas en el uso de biochips de biomarcadores, biosensores (e.g., inmunobiosensores) o microarrays, lab-on-a-chip que incluyen anticuerpos específicos, ensayos basados en la precipitación coloidal en formatos tales como los "dipsticks", etc. En una realización particular, dicho inmunoensayo es un inmunoensayo de tipo ELISA, un inmunoensayo por cromatografía de flujo lateral basado en el empleo de tiras inmunocromatográficas o un inmunoensayo basado en el empleo de biosensores.
El inmunoensayo utilizado para la puesta en práctica de los métodos de la presente invención puede ser utilizado para determinar la cantidad (cuantificar) de anticuerpo anti-betalactoglobulina en una muestra ya que, con muchos marcadores, e.g., enzimas, la cantidad de anticuerpo presente en la muestra de ensayo es proporcional a la señal generada.
En una realización particular del primer método de la invención, el inmunoensayo es un ELISA. La técnica de ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con enzimas, de manera que los conjugados formados entre el antígeno diana y el anticuerpo marcado resulten en la formación de complejos enzimáticamente activos. Debido a que uno de los componentes (el antígeno o el anticuerpo) está inmovilizado en un soporte, los complejos anticuerpo-antígeno están inmovilizados en el soporte, y, por tanto, pueden ser detectados por la adición de un sustrato que es convertido por la enzima en un producto que es detectable, por ejemplo, por espectrofotometría o fluorometría. En una realización particular, la proteína beta- lactoglobulina se utiliza como antígeno de soporte en una fase sólida.
En otra realización particular, el primer método de la invención contempla la detección y/o determinación del nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en una muestra de sangre o de suero mediante un inmunoensayo por cromatografía de flujo lateral. En una realización particular, el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina se determina mediante el empleo de tiras inmunocromatográficas.
Por "flujo lateral" se entiende en la presente invención el flujo de un líquido en un material en el cual los componentes que están disueltos en la muestra son transportados esencialmente por capilaridad con velocidad igual y con un flujo lateral intacto por el material. En una realización particular de la invención, la detección y/o determinación del nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en una muestra de sangre o de suero por cromatografía de flujo lateral comprende las siguientes etapas:
poner en contacto dicha muestra de sangre o de suero, susceptible de contener anticuerpos anti-beta-lactoglobulina, con un primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-beta-lactoglobulina y el primer componente de unión, en donde dicho primer componente de unión es movible y está embebido en una región de reacción de una tira que comprende un material poroso, en donde la tira comprende una segunda región de test, que comprende un segundo componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina inmovilizado en dicha tira,
poner la tira bajo condiciones adecuadas para que el complejo anticuerpo anti- beta-lactoglobulina-primer componente de unión se desplace por la tira hasta alcanzar la región de test y
detectar la unión del complejo anticuerpo anti-beta-lactoglobulina-primer componente de unión al segundo componente de unión al anticuerpo anti-beta- lactoglobulina inmovilizado en la región de test de la tira,
en donde el primer y el segundo componente de unión se seleccionan del grupo formado un antígeno específico para el anticuerpo anti-beta-lactoglobulina, o un fragmento del mismo con capacidad de unión a dicho anticuerpo.
Por "tira que comprende un material poroso" se entiende cualquier elemento con forma de tira alargada que comprende un material poroso.
Por "material poroso" se refiere a un material capaz de permitir el flujo lateral por su interior. Ejemplos de materiales porosos váidos son, sin limitación, copolímero de acrilonitrilo, algodón, fibra de vidrio, nitrato de celulosa, mezclas de nitrocelulosa y poliéster o celulosa, nilón (poliamidas), papel, rayón y similares.
Por "movible" se entiende que no está unido al material poroso de manera que cuando el primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina se ponga en contacto con la muestra de ensayo, si ésta contiene el antígeno de interés (anticuerpos anti-beta-lactoglobulina), el complejo anticuerpo anti-beta-lactoglobulina- primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina puede desplazarse por la tira por medio de flujo lateral.
El primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina estará preferentemente en forma seca o deshidratada pudiendo estar unido a un marcador. Opcionalmente, dicho primer componente de unión al anticuerpo anti-beta- lactoglobulina puede estar acompañado de otras moléculas como conservantes, etc.
Está contemplado que la tira posea una zona o región para recibir la muestra (región de recepción) que puede ser la misma o diferente de la región donde se encuentra el primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina (región de reacción). En el caso de que la región sea diferente, ambas deben estar contactadas por un material poroso de manera que la muestra pueda fluir por capilaridad hasta la región donde el primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina está localizado de manera que lo solubilice de manera que, si la muestra contiene anticuerpos anti-beta-lactoglobulina, el complejo anticuerpo anti-beta-lactoglobulina- primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina se forme. Adicionalmente, la invención contempla que la muestra sea cargada junto con una solución de arrastre para facilitar la disolución del primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina así como el flujo lateral.
La tira comprende un segundo componente de unión al anticuerpo anti-beta- lactoglobulina inmovilizado en una segunda región de dicha tira denominada región de test. El segundo componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina está inmovilizado en el material poroso de la tira por medio de uniones covalentes o por otro tipo de uniones. La aplicación del segundo componente de unión al anticuerpo anti- beta-lactoglobulina a la región de test puede ser realizada usando métodos conocidos en el estado de la técnica.
Así, en un segundo paso, la tira es puesta en condiciones adecuadas para que el complejo anticuerpo anti-beta-lactoglobulina-primer componente de unión se desplace por la tira hasta alcanzar la región de test.
La tira está estructurada de tal manera que el complejo anticuerpo anti-beta- lactoglobulina-primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina puede circular por flujo lateral hasta la región de test, en donde el segundo componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina está inmovilizado al material de la tira. Así, el complejo anticuerpo anti-beta-lactoglobulina-primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina se unirá al segundo componente al anticuerpo anti- beta-lactoglobulina fijado en la tira de manera que se forme una línea que puede ser detectada dependiendo del marcador usado.
En un tercer paso, se procede a detectar la unión del complejo anticuerpo anti- beta-lactoglobulina-primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina al segundo componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina inmovilizado en la región de test de la tira. En una realización preferida, el primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina está marcado, sin embargo también se contempla que la mezcla haya sido previamente incubada con un marcador, de manera que todas las moléculas de la muestra, incluidos los antígenos (anticuerpos anti-beta- lactoglobulina) hayan sido marcados. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de marcadores que pueden ser usados así como los métodos para su detección han sido nombrados anteriormente.
El primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina se selecciona del grupo formado por un antígeno específico para el anticuerpo anti-beta- lactoglobulina o un fragmento del mismo con capacidad de unión a dicho anticuerpo. En una realización particular, el primer componente de unión al anticuerpo anti-beta- lactoglobulina es beta-lactoglobulina o un fragmento de beta-lactoglobulina con capacidad de unión a dicho anticuerpo anti-beta-lactoglobulina. En otra realización particular, el segundo componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina se selecciona entre, sin limitarse a, beta-lactoglobulina, un fragmento de beta- lactoglobulina con capacidad de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina, o un anticuerpo-anti-beta-lactoglobulina secundario.
En una realización particular, está contemplado que la tira comprenda una región adicional (región control) que comprende un tercer componente de unión que se une específicamente al primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina fijado en dicha tira. En el caso de que el primer componente de unión al anticuerpo anti- beta-lactoglobulina sea un antígeno (e.g., beta-lactoglobulina) o un fragmento de dicho antígeno o una mezcla de ellos, el tercer componente de unión será un anticuerpo contra ese antígeno, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con capacidad de unión al antígeno (anti-IgG). Adicionalmente, el tercer componente de unión la región control puede contener el anticuerpo anti-beta-lactoglobulina que se pretende determinar.
Así, si la muestra de ensayo no presenta el anticuerpo anti-beta-lactoglobulina, entonces la muestra fluirá por las regiones de reacción y de test sin unirse al primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina ni al segundo componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina. Así, el primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina viajará junto a la muestra y se unirá al tercer componente de unión fijado en la tira en la región de control.
En una realización alternativa de dicha tira, la región control comprende un componente de unión que se une de modo específico a un componente fijado en una región anterior de la tira, en donde dicho componente fijado a dicha región anterior de la tira es una proteína diferente del anticuerpo anti-beta-lactoglobulina. En una realización preferida, dicha proteína diferente del anticuerpo anti-beta-lactoglobulina está presente en la región de reacción de la tira. Prácticamente cualquier proteína, a excepción de la beta-lactoglobulina, diferente del anticuerpo anti-beta-lactoglobulina y que se une a un componente de unión puede estar presente en dicha realización particular de la tira inmunocromatográfica. En una realización particular, dicho componente de unión a la proteína diferente del anticuerpo anti-beta-lactoglobulina es un anticuerpo específico de dicha proteína diferente del anticuerpo anti-beta- lactoglobulina.
Las distintas regiones (región de recepción, región de reacción, región de test y región de control) pueden estar separadas entre sí con la misma distancia o con distancias diferentes y estarán dispuestas, preferentemente transversalmente a la dirección del flujo. La distancia entre las distintas regiones va a depender del diseño del aparato o dispositivo de ensayo en cuestión así como de los componentes del mismo. La distancia va a variar entre 2 y 5 mm, 6-10 mm, 11-15 mm, 16-20 mm, 21-30 mm, 31-40 mm, 41-60 mm, 61-150 mm, etc. Preferentemente dicha distancia está comprendida entre 16 y 20 mm.
Existen disponibles comercialmente kits para la determinación del nivel de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos kits incluyen: - Kits utilizados para el análisis y calidad de productos alimentarios, o para detección de fraudes alimentarios, tales como:
kit ELISA de proteínas lácteas (beta-lactoglobulina), ELISA cuantitativo tipo sándwich, 171LG, Crystal Chem Inc. Downers Grove, Illinois, USA;
- SafePath™ Milk Residue. SafePath Laboratorios, Carlsbad, CA 92010 USA;
- Ensayo de residuo beta-lactoglobulina, ESMRDBLG-48, ELISA- Systems. Queensland, Australia;
- etc.
- Kits utilizados para el análisis en sangre:
set de determinación ELISA de beta-lactoglobulina bovina, El 0-125 Laboratorios Bethyl. Montgomery, TX 77356, USA;
- kit ELISA beta-inmunoglobulina humana, E1023h. EIAab & USC LIFE (Wuhan EIAab Science Co.,Ltd, Wuhan, 430079, China); kit ELISA beta-lactoglobulina, ESBL6812. Ever Systems Biology Laboratory,Inc. Sacramento, CA 95811,USA;
kit ELISA beta-lactoglobulina IgA/G ELISA Kit. Génesis Diagnostics Ltd, Cambridgeshire CB6 1 SE, UK;
- kit ELISA beta-lactoglobulina IgG, ITC30100. Human Diagnostics
Worldwide, D65205 Wiesbaden, Alemania.;
etc.
En una realización particular de la invención, el análisis de anticuerpos humanos frente a beta-lactoglobulina bovina se puede realizar mediante kits o dispositivos analíticos adecuados, utilizando la proteína beta-lactoglobulina bovina o un fragmento funcionalmente equivalente de la misma (es decir, un fragmento de beta-lactoglobulina bovina con capacidad de unión a un anticuerpo anti-beta-lactoglobulina bovina) como antígeno de soporte. Para desarrollar el kit en soporte plástico hay que fijar la proteína a una fase sólida, fijando el antígeno (beta-lactoglobulina bovina o un fragmento equivalente de la misma) a una placa. El antígeno así soportado se incuba con los sueros problema, la mezcla se lava y se incuba con el anticuerpo secundario unido a un marcador (e.g., fosfatasa alcalina, etc.) y se revela. La presencia de anticuerpos frente a beta-lactoglobulina bovina como marcador de la permeabilidad intestinal asociado a la enfermedad celíaca puede ser validada posteriormente en muestras procedentes de pacientes celíacos previamente diagnosticados. Esa validación permite el desarrollo de métodos y kits analíticos (e.g., métodos basados en ELISA, inmunoensayos por cromatografía de flujo lateral, etc., tiras inmunocromatográficas de aplicación clínica, etc.), para el análisis rutinario y estandarizado de anticuerpos frente a beta- lactoglobulina bovina, de forma independiente o asociada a otros marcadores de enfermedad celíaca o adherencia a la dieta sin gluten.
En otra realización particular del primer método de la invención, la determinación del nivel de anticuerpo anti-lactoglobulina se realiza mediante el empleo de un biosensor (inmunobiosensor). En una realización particular, dicho inmunobiosensor es un dispositivo que integra un sistema sensor nanoelectrónico con un reactivo biológico adecuado para la puesta en práctica de la invención. Así, en una realización particular, dicho reactivo biológico comprende beta-lactoglobulina o un fragmento de beta-lactoglobulina con capacidad de unión a un anticuerpo anti-beta- lactoglobulina. Este tipo de dispositivos permite realizar inmunoensayos precisos, económicos y rápidos, de forma simple.
En una segunda etapa del primer método de la invención [etapa (ii)], se compara el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en una muestra de sangre o de suero del sujeto bajo estudio con el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en una muestra de referencia, en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en la muestra de dicho sujeto mayor que el nivel de dicho anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en dicha muestra de referencia es indicativo de que dicho sujeto padece celiaquía
El término "muestra de referencia" empleado en el primer método de la invención hace referencia a una muestra procedente de un sujeto (o conjunto de sujetos) diagnosticado como no celíaco. La muestra de referencia puede ser una muestra de sangre o de suero, tal como se ha descrito anteriormente. El nivel de anticuerpo anti- beta-lactoglobulina en una muestra de referencia se determina tal y como se ha descrito anteriormente.
Tal como se utiliza en el primer método de la invención, un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en la primera etapa del primer método de la invención se considera "mayor" o "superior" o "por encima" del nivel de anticuerpo anti-beta- lactoglobulina en una muestra de referencia cuando el nivel obtenido en la primera etapa está aumentado en al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%), al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 100% o incluso más con respecto al nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en la muestra de referencia.
En una realización particular del primer método de la invención, se determina el nivel de anticuerpos humanos anti-beta-lactoglobulina bovina, preferentemente, anti- becta-lactoglobulina de vaca, tal como se ha definido previamente.
Método de evaluación de la respuesta en un sujeto celíaco a una dieta libre de gluten (segundo método de la invención)
En un segundo aspecto, la presente invención se dirige a un método in vitro (de ahora en adelante segundo método de la invención) de evaluación de la respuesta a una dieta libre de gluten en un sujeto que padece celiaquía que comprende
(i) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina antes del inicio de la dieta libre de gluten;
(ii) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina al cabo de un periodo de tiempo transcurrido desde el inicio de la dieta libre de gluten; y
(iii) comparar los niveles de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenidos en (i) e (ii);
en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (ii) inferior al obtenido en (i) es indicativo de que la respuesta de dicho sujeto a la dieta libre de gluten es favorable.
Los términos "sujeto", "celiaquía", "gluten", "muestra", "beta-lactoglobulina" y "anticuerpo anti-beta-lactoglobulina" se han descrito en detalle anteriormente y se emplean con el mismo significado en el contexto del segundo método de la invención.
El término "evaluación de la respuesta" del segundo método de la invención hace referencia a la valoración del efecto (favorable, neutro o desfavorable), que tiene una dieta libre en gluten en un sujeto que padece celiaquía. Se relaciona con el efecto a corto plazo de la dieta libre de gluten en un sujeto que padece celiaquía que inicia dicha dieta. Así, la evaluación de la respuesta a una dieta libre de gluten es "favorable" cuando el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina transcurrido un periodo del tiempo desde el inicio de la dieta es menor que el nivel de dicho anticuerpo antes del inicio de la dieta; asimismo se considera "desfavorable" cuando el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina transcurrido un periodo de tiempo desde el inicio de la dieta es mayor que el nivel de dicho anticuerpo antes del inicio de la dieta; y es "neutro" cuando el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina no varía sustancialmente transcurrido un periodo de tiempo desde el inicio de la dieta respecto al nivel al inicio de la dieta.
Tal como se emplea en el segundo método de la invención, el término "dieta libre de gluten" corresponde a una dieta alimenticia basada en alimentos que no contienen gluten o alimentos libres de gluten y en la que se excluyen tanto los alimentos que contienen gluten como los alimentos que pueden contener gluten.
Los alimentos pueden clasificarse en tres categorías atendiendo a su contenido de gluten: (i) libres de gluten (todos aquellos que por naturaleza no contienen gluten),
(ii) que pueden tener gluten (aquellos que por naturaleza no contienen gluten pero que pueden llegar a incorporarlo por el proceso tecnológico o por contaminación cruzada) y
(iii) que tienen gluten (aquellos elaborados a partir de los cereales responsables de la celiaquía tales como trigo, cebada, centeno, triticale, kamut, espelta y posiblemente avena):
alimentos libres de gluten: este grupo comprende, sin limitarse a, leche y derivados (queso, queso de untar sin sabores, requesón, nata, yogur natural, cuajada), todo tipo de carnes y visceras (frescas, congeladas o en conserva al natural), pescado sin rebozar (fresco o congelado), marisco fresco, pescado y marisco en conserva (al natural o en aceite), huevos, verduras, hortalizas, tubérculos, frutas, arroz, maíz, tapioca, legumbres, azúcar, miel, aceites, mantequilla, café, infusiones, refrescos (de naranja, limón o cola), vinos, bebidas espumosas, sal, vinagre de vino, especias (en rama, en grano, todas las naturales);
alimentos que pueden contener gluten: este grupo comprende, sin limitarse a, embutidos (chóped, mortadela, chorizo, morcilla, salchichas, etc.), quesos (fundidos, de untar de sabores, especial para pizzas), conservas de carne, albóndigas, hamburguesas, conservas de pescado (en salsa, con tomate frito), salsas, condimentos, colorantes alimentarios, sucedáneos (de café, chocolate, cacao y otras bebidas de máquina, frutos secos (tostados o con harina y sal), caramelos, golosinas, algunos tipos de helados, sucedáneos de chocolate; y alimentos que contienen gluten: este grupo comprende, sin limitarse a, pan, harina (de trigo, de cebada, de centeno), bollos, pasteles, tartas, galletas, bizcochos, productos de repostería, pasta alimenticia (fideos, macarrones, tallarines), higos secos, bebidas destiladas o fermentadas a partir de cereales (cerveza, agua de cerveza) y en general todos aquellos productos manufacturados cuya composición comprenda harinas de los cereales citados o en cualquiera de sus formas (almidones, féculas, sémolas, proteínas).
La industria alimentaria elabora productos especiales denominados "sin gluten" que sustituyen a aquellos elaborados a partir de trigo, cebada, centeno y avena. En España, la Federación de Asociaciones de Celíacos de España (FACE) ha elaborado el símbolo "controlado por FACE" para aquellas empresas que elaboran productos alimenticios sin gluten. El símbolo internacional que se utiliza para aquellos alimentos sin gluten es el de la "Espiga Barrada". Asimismo, la FACE elabora listados de alimentos cuyo consumo es apto para celíacos.
En una realización particular de la invención, el sujeto tiene una dieta alimenticia libre de gluten que incluye leche y/o derivados lácteos.
En una primera etapa del segundo método de la invención [etapa (i)], se determina en una muestra de sangre o de suero de un sujeto que padece celiaquía el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina antes del inicio de la dieta libre de gluten.
Para la puesta en práctica de este método, el nivel de anticuerpo anti-beta- lactoglobulina se determina antes de que el sujeto que padece celiaquía inicie la dieta libre de gluten.
Métodos para la determinación del nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina han sido descritos en detalle con anterioridad y se incorporan aquí por referencia. En una realización preferida del segundo método de la invención, la determinación del nivel de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina se realiza mediante ELISA o mediante un inmunoensayo por cromatografía de flujo lateral mediante, por ejemplo, el empleo de tiras inmunocromatográficas.
En una segunda etapa del segundo método de la invención [etapa (ii)], se determina en una muestra de sangre o de suero del sujeto bajo estudio el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina al cabo de un periodo de tiempo transcurrido desde el inicio de la dieta libre de gluten.
Métodos para la determinación del nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina han sido descritos en detalle con anterioridad y se incorporan aquí por referencia.
De acuerdo con el segundo método de la invención, el nivel de anticuerpo anti- beta-lactoglobulina en la muestra de sangre o suero del sujeto bajo estudio se determina al cabo de un periodo de tiempo transcurrido desde el inicio de la dieta libre de gluten. Dicho periodo de tiempo puede ser variable, pudiendo determinarse el nivel de anticuerpo anti-lactoglobulina al cabo de, sin limitarse a, uno o más días; una o más semanas, por ejemplo, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas etc.; uno o más meses, por ejemplo, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 1 1 meses, etc.; uno o más años, por ejemplo, 1 año, 2 años o más de 2 años.
En una tercera etapa del segundo método de la invención [etapa (iii)], se comparan los niveles de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenidos a partir de una muestra de sangre o de suero de un sujeto que padece celiaquía antes del inicio de la dieta libre de gluten (primera etapa) y a partir de una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto al cabo de un periodo de tiempo transcurrido desde el inicio de la dieta libre de gluten (segunda etapa), en donde un nivel de anticuerpo anti-beta- lactoglobulina obtenido en la segunda etapa inferior al obtenido en la primera etapa es indicativo de que la respuesta de dicho sujeto a la dieta libre de gluten es favorable.
Un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en la segunda etapa se considera "inferior" o "menor" o "más bajo" respecto al nivel de anticuerpo anti-beta- lactoglobulina obtenido en la primera etapa cuando el valor del nivel obtenido en la segunda etapa está disminuido en al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%), al menos un 25%>, al menos un 30%>, al menos un 35%>, al menos un 40%>, al menos un 45%>, al menos un 50%>, al menos un 55%>, al menos un 60%>, al menos un 65%o, al menos un 70%>, al menos un 75%>, al menos un 80%>, al menos un 85, al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% con respecto al valor del nivel obtenido en la primera etapa.
Un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en la segunda etapa se considera "superior" o "mayor" o "más alto" respecto al nivel de anticuerpo anti-beta- lactoglobulina obtenido en la primera etapa cuando el valor del nivel obtenido en la segunda etapa está aumentado en al menos un 10%>, al menos un 15%, al menos un 20%), al menos un 25%, al menos un 30%>, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%), al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85, al menos un 90%), al menos un 95% o un 100%> con respecto al valor del nivel obtenido en la primera etapa.
En una realización particular del segundo método de la invención, se determina el nivel de anticuerpos humanos anti-beta-lactoglobulina bovina, preferentemente, anti- becta-lactoglobulina de vaca, tal como se ha definido previamente.
Método de evaluación de la efectividad de una dieta libre de gluten (tercer método de la invención)
En un tercer aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro (a partir de ahora tercer método de la invención) de evaluación de la efectividad de una dieta libre de gluten en un sujeto que padece celiaquía que comprende
(ia) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina antes del inicio de la dieta libre de gluten;
(iia) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina al cabo de un periodo de tiempo transcurrido desde el inicio de la dieta libre de gluten; y
(iiia) comparar los niveles de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenidos en
(ia) e (iia),
en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (iia) inferior al obtenido en (ia) es indicativo de que la dieta libre de gluten es efectiva;
o alternativamente, (ib) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina al cabo de un periodo de tiempo transcurrido desde el inicio de la dieta libre de gluten; y
(iib) comparar el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (ib) con el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en una muestra de referencia;
en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (ib) inferior o similar al nivel de dicho anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en dicha muestra de referencia es indicativo de que la dieta libre de gluten es efectiva.
Los términos "sujeto", "celiaquía", "gluten", "dieta libre de gluten", "muestra",
"beta-lactoglobulina" y "anticuerpo anti-beta-lactoglobulina" se han descrito en detalle anteriormente y se emplean con el mismo significado en el contexto del tercer método de la invención.
En una realización particular de la invención, el sujeto tiene una dieta alimenticia libre de gluten que incluye leche y/o derivados lácteos.
El término "evaluación de la efectividad" del tercer método de la invención hace referencia a la valoración de si el efecto que tiene una dieta libre de gluten en un sujeto que padece celiaquía es favorable y si dicho efecto además se mantiene a lo largo del tiempo. Se relaciona con el efecto a medio/largo plazo de la dieta libre de gluten en un sujeto que padece celiaquía y que mantiene dicha dieta.
El tercer método de la invención contempla dos alternativas. La alternativa (a) de dicho método comprende
(ia) determinar en una muestra de sangre o de suero del sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina antes del inicio de la dieta libre de gluten;
(iia) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina al cabo de un periodo de tiempo transcurrido desde el inicio de la dieta libre de gluten; y
(iiia) comparar los niveles de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenidos en (ia) e (iia),
en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (iia) inferior al obtenido en (ia) es indicativo de que la dieta libre de gluten es efectiva. La primera etapa de la alternativa (a) del tercer método de la invención [etapa (ia)] comprende determinar en una muestra de sangre o de suero del sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina antes del inicio de la dieta libre de gluten.
Métodos para la determinación del nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina han sido descritos en detalle con anterioridad y se incorporan aquí por referencia. En una realización preferida del tercer método de la invención, la determinación del nivel de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina se realiza mediante ELISA o mediante un inmunoensayo por cromatografía de flujo lateral mediante, por ejemplo, el empleo de tiras inmunocromatográficas.
En particular, de acuerdo con la alternativa (a) del tercer método de la invención, el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en la muestra de sangre o suero del sujeto bajo estudio se determina previamente a que dicho sujeto que padece celiaquía inicie la dieta libre de gluten.
La segunda etapa de la alternativa (a) del tercer método de la invención [etapa (iia)] comprende determinar en una muestra del sujeto al nivel de anticuerpo anti-beta- lactoglobulina al cabo de un periodo de tiempo transcurrido desde el inicio de la dieta libre de gluten.
Métodos para la determinación del nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina han sido descritos en detalle con anterioridad y se incorporan aquí por referencia.
De acuerdo con el tercer método de la invención, el nivel de anticuerpo anti- beta-lactoglobulina en la muestra de sangre o suero del sujeto bajo estudio se determina al cabo de un periodo de tiempo transcurrido desde el inicio de la dieta libre de gluten. Dicho periodo de tiempo puede ser variable, pudiendo determinarse el nivel de anticuerpo anti-lactoglobulina al cabo de, sin limitarse a, uno o más días; una o más semanas, por ejemplo, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas etc.; uno o más meses, por ejemplo, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, etc., uno o más años, por ejemplo, 1 año, 2 años o más de 2 años. Como puede apreciarse, el tercer método de la invención contempla la posibilidad de efectuar determinaciones de los niveles de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina tras el inicio de la dieta libre de gluten a diferentes tiempos, o incluso periódicamente, por ejemplo, determinaciones semestrales, anuales y bianuales. La tercera etapa de la alternativa (a) del tercer método de la invención [etapa (iiia)] supone comparar los niveles de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenidos en las etapas primera (ia) y segunda (iia) de la alternativa (a) de dicho método, en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en la segunda etapa (iia) inferior al obtenido en la primera etapa (ia) es indicativo de que la dieta libre de gluten es efectiva.
Un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en la segunda etapa se considera "inferior" o "menor" o "más bajo" respecto al nivel de anticuerpo anti-beta- lactoglobulina obtenido en la primera etapa cuando el valor del nivel obtenido en la segunda etapa está disminuido en al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%), al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%), al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85, al menos un 90%), al menos un 95% o un 100% con respecto al valor del nivel obtenido en la primera etapa.
Por otro lado, el tercer método de la invención también contempla la alternativa
(b) que comprende:
(ib) determinar en una muestra de sangre o de suero del sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina al cabo de un periodo de tiempo transcurrido desde el inicio de la dieta libre de gluten; y
(iib) comparar el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (ib) con el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en una muestra de referencia;
en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (ib) inferior o similar al nivel de dicho anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en dicha muestra de referencia es indicativo de que la dieta libre de gluten es efectiva.
La primera etapa de la alternativa (b) del tercer método de la invención [etapa (ib)] comprende determinar en una muestra de sangre o de suero del sujeto bajo estudio el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina al cabo de un periodo de tiempo transcurrido desde el inicio de la dieta libre de gluten.
Métodos para la determinación del nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina han sido descritos en detalle con anterioridad y se incorporan aquí por referencia. En una realización preferida del tercer método de la invención, la determinación del nivel de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina se realiza mediante ELISA o mediante un inmunoensayo por cromatografía de flujo lateral mediante, por ejemplo, tiras inmunocromatográficas.
En particular, de acuerdo con la alternativa (b) del tercer método de la invención, el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en la muestra de sangre o de suero del sujeto bajo estudio se determina al cabo de un periodo de tiempo transcurrido desde el inicio de la dieta libre de gluten. Dicho periodo de tiempo puede ser variable, pudiendo determinarse el nivel de anticuerpo anti-lactoglobulina al cabo de, sin limitarse a, uno o más días; una o más semanas, por ejemplo, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas etc.; uno o más meses, por ejemplo, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, etc., uno o más años, por ejemplo, 1 año, 2 años o más de 2 años.
La segunda etapa de la alternativa (b) del tercer método de la invención [etapa (iib)] comprende comparar el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en la primera etapa de la alternativa (b) de dicho método con el nivel de anticuerpo anti-beta- lactoglobulina en una muestra de referencia, en donde un nivel de anticuerpo anti-beta- lactoglobulina obtenido en la primera etapa inferior al nivel de dicho anticuerpo anti- beta-lactoglobulina en dicha muestra de referencia es indicativo de que la dieta libre de gluten es efectiva.
El término "muestra de referencia" empleado en el tercer método de la invención hace referencia a una muestra procedente de un sujeto (o conjunto de sujetos) diagnosticado como no celíaco. La muestra de referencia puede ser una muestra de sangre o de suero, tal como se ha descrito anteriormente. El nivel de anticuerpo anti- beta-lactoglobulina en una muestra de referencia se determina tal y como se ha descrito anteriormente.
Tal como se utiliza en la alternativa (b) del tercer método de la invención, un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en la primera etapa de dicho método se considera "inferior" o "menor" o "más bajo" respecto al nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en una muestra de referencia cuando el valor del nivel obtenido en la primera etapa está disminuido en al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%), al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85, al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% con respecto al valor obtenido en la muestra de referencia.
En una realización particular del tercer método de la invención, se determina el nivel de anticuerpos humanos anti-beta-lactoglobulina bovina, preferentemente, anti- becta-lactoglobulina de vaca, tal como se ha definido previamente.
Método de evaluación de la adherencia a una dieta libre de gluten (cuarto método de la invención)
En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro (de ahora en adelante cuarto método de la invención) de evaluación de la adherencia a una dieta libre de gluten por parte de un sujeto que padece celiaquía sometido a una dieta libre de gluten que comprende
(ia) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina a un tiempo ti ;
(iia) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina a un tiempo t2, en donde t2 corresponde a un punto en el tiempo posterior a ti; y
(iiia) comparar el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenidos en (ia) y (iia);
en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (iia) inferior al valor obtenido en (ia) es indicativo de adherencia a la dieta libre de gluten por parte de dicho sujeto;
o, alternativamente,
(ib) determinar en una muestra de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti- beta-lactoglobulina; y
(iib) comparar el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (ib) con el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en una muestra de referencia;
en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (ib) inferior al nivel de dicho anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en dicha muestra de referencia es indicativo de adherencia a la dieta libre de gluten por parte de dicho sujeto. Los términos "sujeto", "celiaquía", "gluten", "dieta libre de gluten", "muestra", "beta-lactoglobulina" y "anticuerpo anti-beta-lactoglobulina" se han descrito en detalle anteriormente y se emplean con el mismo significado en el contexto del cuarto método de la invención.
En una realización particular de la invención, el sujeto tiene una dieta alimenticia libre de gluten que incluye leche y/o derivados lácteos.
El término "evaluación de la adherencia" del cuarto método de la invención hace referencia a la valoración del seguimiento de la dieta libre de gluten por parte del sujeto que padece celiaquía y sigue dicha dieta. Esta valoración del seguimiento de la dieta libre de gluten por parte del sujeto celíaco permite, por un lado, determinar el grado de exhaustividad en el seguimiento de dicha dieta, es decir, determinar si la dieta efectivamente excluye o no aquellos alimentos que contienen o que pueden contener gluten y, por otro lado, detectar la existencia de celiaquía refractaria en aquellos casos en los que el sujeto celíaco sigue de modo estricto la dieta libre de gluten pero sin embargo el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en dicho sujeto aumenta o se mantiene sustancialmente constante.
Un pequeño porcentaje de los pacientes en los que la enfermedad celíaca se manifiesta durante la etapa adulta desarrollan una resistencia primaria o secundaria a la dieta libre de gluten. Esta condición es lo que se denomina celiaquía refractaria o enfermedad celíaca refractaria (RCD, del inglés "refractory celiac disease").
La RCD puede dividirse en dos tipos: RCD tipo I y RCD tipo II. En ambos tipos, se dan signos clínicos e histológicos de la resistencia a la dieta libre de gluten. El tipo RCD II sin embargo se asocia a la presencia de una población aberrante de linfocitos intraepiteliales que carecen de la expresión del receptor de células T (TCR)-CD3 pero presentan CD3s y reordenamientos de los genes del TCRy. Por esta razón, la RCD II se considera una condición de pre-malignidad, y alrededor del 50% de los pacientes de RCD II desarrollan linfoma en un periodo de 5 años tras el diagnóstico (May-Ling J. et al. 2010 Immunogenetics 62:641-651).
El cuarto método de la invención contempla dos alternativas. La alternativa (a) de dicho método comprende:
(ia) determinar en una muestra de sangre o de suero del sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina a un tiempo ti; (iia) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina a un tiempo t2, en donde t2 corresponde a un punto en el tiempo posterior a ti; y
(iiia) comparar el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenidos en (ia) y (iia)
en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (iia) inferior o similar al valor obtenido en (ia) es indicativo de adherencia a la dieta libre de gluten por parte de dicho sujeto.
La primera etapa de la alternativa (a) del cuarto método de la invención [etapa (ia)] comprende determinar en una muestra de sangre o de suero del sujeto bajo estudio el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina a un tiempo ti.
Métodos para la determinación del nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina han sido descritos en detalle con anterioridad y se incorporan aquí por referencia. En una realización preferida del cuarto método de la invención, la determinación del nivel de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina se realiza mediante ELISA o mediante un inmunoensayo por cromatografía de flujo lateral mediante, por ejemplo, tiras inmunocromatográficas.
En particular, de acuerdo con la alternativa (a) del cuarto método de la invención, el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en la muestra de sangre o de suero del sujeto bajo estudio se determina a un tiempo ti . Dicho tiempo ti corresponde a un momento temporal en el que el sujeto sigue una dieta libre de gluten, desde el diagnóstico de la enfermedad. El tiempo ti puede situarse en el tiempo, sin limitarse a, uno o más días; una o más semanas, por ejemplo, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas etc.; uno o más meses, por ejemplo, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, etc., uno o más años, por ejemplo, 1 año, 2 años o más de 2 años, desde que dicho sujeto comenzó la dieta libre de gluten.
La segunda etapa de la alternativa (a) del cuarto método de la invención [etapa (iia)] comprende determinar en una muestra del sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta- lactoglobulina a un tiempo t2, en donde t2 corresponde a un punto en el tiempo posterior a ti .
Métodos para la determinación del nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina han sido descritos en detalle con anterioridad y se incorporan aquí por referencia. En particular, el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina se determina transcurrido un tiempo t2.
El tiempo t2 corresponde a un momento en el tiempo posterior a ti y en el que el sujeto continúa en una dieta libre de gluten. El intervalo de tiempo transcurrido desde t 1 hasta t2 puede variar ampliamente, uno o más días; una o más semanas, por ejemplo, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas etc.; uno o más meses, por ejemplo, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 1 1 meses, etc., uno o más años, por ejemplo, 1 año, 2 años o más de 2 años, por ejemplo, 3 años, 4 años o más, etc.
Como puede apreciarse, el cuarto método de la invención contempla la posibilidad de realizar determinaciones del nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina a diferentes tiempos t2, todos ellos siempre posteriores a ti .
La tercera etapa de la alternativa (a) del cuarto método de la invención [etapa (iiia)] comprende comparar el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenidos en la etapa primera (ia) y la etapa segunda (iia), en donde un nivel de anticuerpo anti-beta- lactoglobulina obtenido en la segunda etapa (iia) inferior o similar al valor obtenido en la primera etapa (ia) es indicativo de adherencia a la dieta libre de gluten por parte del sujeto.
Un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en la segunda etapa se considera "inferior" o "menor" o "más bajo" respecto al nivel de anticuerpo anti-beta- lactoglobulina obtenido en la primera etapa cuando el valor del nivel obtenido en la segunda etapa está disminuido en al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%), al menos un 25%>, al menos un 30%>, al menos un 35%>, al menos un 40%>, al menos un 45%>, al menos un 50%>, al menos un 55%>, al menos un 60%>, al menos un 65%), al menos un 70%>, al menos un 75%>, al menos un 80%>, al menos un 85, al menos un 90%), al menos un 95%> o un 100% con respecto al valor del nivel obtenido en la primera etapa.
Por otro lado, el cuarto método de la invención también contempla la alternativa (b) que comprende:
(ib) determinar en una muestra de sangre o de suero del sujeto bajo estudio el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina; y (iib) comparar el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (ib) con el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en una muestra de referencia,
en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (ib) inferior al nivel de dicho anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en dicha muestra de referencia es indicativo de adherencia a la dieta libre de gluten por parte de dicho sujeto.
La primera etapa de la alternativa (b) del cuarto método de la invención [etapa (ib)] comprende determinar en una muestra de sangre o de suero del sujeto bajo estudio el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina.
Métodos para la determinación del nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina han sido descritos en detalle con anterioridad y se incorporan aquí por referencia. En una realización preferida del cuarto método de la invención, la determinación del nivel de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina se realiza mediante ELISA o mediante un inmunoensayo por cromatografía de flujo lateral mediante, por ejemplo, mediante tiras inmunocromatográficas.
En particular, de acuerdo con la alternativa (b) del cuarto método de la invención, el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en la muestra de sangre o de suero del sujeto bajo estudio se determina en un momento cualquiera a lo largo del seguimiento de la dieta libre de gluten por parte del sujeto. Dicho momento corresponde a un momento temporal en el que el sujeto sigue una dieta libre de gluten, desde el diagnóstico de la enfermedad, y puede situarse, sin limitarse a, uno o más días; una o más semanas, por ejemplo, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas etc.; uno o más meses, por ejemplo, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, etc., uno o más años, por ejemplo, 1 año, 2 años o más de 2 años, desde que dicho sujeto comenzó la dieta libre de gluten.
La segunda etapa (iib) de la alternativa (b) del cuarto método de la invención [etapa (iib)] comprende comparar el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en la primera etapa (ib) de la alternativa (b) de dicho método con el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en una muestra de referencia, en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en la primera etapa (ib) inferior o similar al nivel de dicho anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en dicha muestra de referencia es indicativo de adherencia a la dieta libre de gluten por parte de dicho sujeto. El término "muestra de referencia" empleado en la alternativa (b) del cuarto método de la invención hace referencia a una muestra procedente de un sujeto (o conjunto de sujetos) diagnosticado como no celíaco. La muestra de referencia puede ser una muestra de sangre o de suero, tal como se ha descrito anteriormente. El nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en una muestra de referencia se determina tal y como se ha descrito anteriormente.
Tal como se utiliza en la alternativa (b) del cuarto método de la invención, un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en la primera etapa del dicho método se considera "inferior" o "menor" o "por debajo" del nivel de anticuerpo anti- beta-lactoglobulina en una muestra de referencia cuando el nivel obtenido en la primera etapa está disminuido en al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%), al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 100%s respecto al nivel de anticuerpo anti-beta- lactoglobulina en la muestra de referencia.
En una realización particular del cuarto método de la invención, se determina el nivel de anticuerpos humanos anti-beta-lactoglobulina bovina, preferentemente, anti- becta-lactoglobulina de vaca, tal como se ha definido previamente.
Kits de la invención
En otro aspecto, la presente invención contempla kits para la determinación del nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina mediante métodos análíticos apropiados, tales como kits de ELISA y kits para inmunoensayos por cromatografía de flujo lateral, por ejemplo, tiras inmunocromatográficas. En una realización particular, dichos anticuerpos anti-lactoglobulina son anticuerpos de origen humano, por ejemplo, IgA o IgG, anti-beta-lactoglobulina bovina, preferentemente, anti-becta-lactoglobulina de vaca. Estos métodos de determinación del nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina suponen métodos analíticos rutinarios, sencillos, rápidos y considerablemente menos invasivos que el estudio de biopsias para el seguimiento de la enfermedad celíaca y su tratamiento o recuperación. En una realización particular, dicho kit de la invención es un kit adecuado para la detección de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina mediante ELISA tal como se ha descrito anteriormente; dicho kit puede contener, además, la totalidad o parte de los elementos necesarios para la determinación y visualización de las reacciones inmunológicas entre la beta-lactoglobulina y anticuerpos frente a beta-lactoglobulina. El experto en la materia puede diseñar fácilmente kits adecuados para la detección de anticuerpos o antígenos mediante ELISA. En una realización particular, dicho kit comprende una fase sólida sobre la que se ha fijado beta-lactoglobulina o un fragmento funcionalmente equivalente de la misma (es decir, susceptible de ser reconocido por un anticuerpo anti-lactoglobulina), opcionalmente marcado con un marcador apropiado, por ejemplo, una enzima, etc.
En otra realización particular, dicho kit de la invención comprende al menos una tira inmunocromatográfica adecuada para la realización de un inmunoensayo por cromatografía de flujo lateral tal como se ha descrito anteriormente; dicho kit puede contener, además, la totalidad o parte de los elementos necesarios para la determinación y visualización de las reacciones inmunológicas entre la beta-lactoglobulina y anticuerpos frente a beta-lactoglobulina. El estado de la técnica describe dispositivos adecuados para la detección de anticuerpos o antígenos mediante inmunoensayos por cromatografía de flujo lateral que comprenden al menos una tira inmunocromatográfica (véase, por ejemplo, EP 186799, EP 291194, EP 383619, etc.).
En una realización particular, la invención proporciona una tira inmunocromatográfica, adecuada para la detección de beta-lactoglobulina, preferentemente beta-lactoglobulina bovina, mediante un inmunoensayo por cromatografía de flujo lateral, en adelante, tira inmunocromatográfica de la invención, que comprende:
- una región de reacción, que comprende un primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina, en donde dicho primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina es movible y está embebido en un material poroso; y
- una región de test, que comprende un segundo componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina inmovilizado en dicha región de test; en donde dicho primer y segundo componente de unión se seleccionan del grupo formado un antígeno específico para el anticuerpo anti-beta-lactoglobulina, o un fragmento de dicho antígeno funcionalmente equivalente, es decir, con capacidad de unión a dicho anticuerpo anti-beta-lactoglobulina.
En una realización particular, el primer componente de unión al anticuerpo anti- beta-lactoglobulina es beta-lactoglobulina o un fragmento de beta-lactoglobulina funcionalmente equivalente, es decir, con capacidad de unión a dicho anticuerpo anti- beta-lactoglobulina.
Un "material poroso" es un material que permite el flujo lateral por su interior. Ejemplos ilsutrativos, no limitativos, de materiales porosos incluyen copolímero de acrilonitrilo, algodón, fibra de vidrio, nitrato de celulosa, mezclas de nitrocelulosa y poliéster o celulosa, nilón (poliamidas), papel, rayón y similares.
El término "movible" indica que no está unido al material poroso de manera que cuando el primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina se ponga en contacto con la muestra de ensayo, si ésta contiene el antígeno de interés (anticuerpos anti-beta-lactoglobulina), el complejo anticuerpo anti-beta-lactoglobulina- primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina puede desplazarse por la tira por medio de flujo lateral.
En una realización particular, el primer componente de unión al anticuerpo anti- beta-lactoglobulina estará preferentemente en forma seca o deshidratada pudiendo estar unido a un marcador. En otra realización particular, dicho primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina (por ejemplo, beta-lactoglobulina o un fragmento funcionalmente equivalente de la misma), está unido y/o recubriendo unas microesferas, en donde dichas microesferas están, ventajosamente, coloreadas en un color, por ejemplo, en rojo, etc., que pueden estar en forma seca o deshidratada y se reconstituyen en contacto con la muestra. De este modo, si la muestra contiene anticuerpos anti-beta- lactoglobulina, estos se unen a la beta-lactoglobulina que está unida o recubre dichas microesferas, se forma el complejo que avanza y alcanza la región de test que contiene dicho segundo componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina, por ejemplo, beta-lactoglobulina o un fragmento funcionalmente equivalente de la misma, dispuesta en por, ejemplo, una línea, de manera que la inmunoreacción generada da lugar a una línea coloreada (e.g., roja, etc.), que sería indicativa de la presencia de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina en la muestra analizada. Opcionalmente, dicho primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina puede estar acompañado de otras moléculas como conservantes, etc.
El segundo componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina está inmovilizado en el material poroso presente en la región de test mediante uniones covalentes o por otro tipo de uniones.
Las regiones de reacción y de test pueden estar formadas por el mismo material poroso o por materiales porosos diferentes; en cualquier caso, ambas regiones están contactadas entre sí a través de un material poroso de manera que la muestra pueda fluir por capilaridad desde la región de reacción hasta la región de test.
En una realización particular, la tira inmunocromatográfica de la invención comprende una región de recepción o zona para recibir la muestra, que puede ser la misma o diferente de la región de reacción en donde se encuentra el primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina. En el caso de que la región sea diferente, ambas deben estar contactadas por un material poroso de manera que la muestra pueda fluir por capilaridad desde la región de recepción hasta la región de reacción.
En otra realización particular, dicha tira inmunocromatográfica de la invención comprende una región control que comprende un tercer componente de unión que se une específicamente al primer componente de unión al anticuerpo anti-beta- lactoglobulina. En caso de que el primer componente de unión al anticuerpo anti-beta- lactoglobulina sea beta-lactoglobulina o un fragmento funcionalmente equivalente de dicha proteína, o una mezcla de ambos, el tercer componente de unión puede ser un anticuerpo contra dicha proteína o fragmento de la misma. Adicionalmente, si se desea, el tercer componente de unión la región control puede contener el anticuerpo anti-beta- lactoglobulina que se pretende determinar. De este modo, si la muestra a analizar no contiene anticuerpos anti-beta-lactoglobulina, entonces la muestra fluirá por las regiones de reacción y de test sin unirse al primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina ni al segundo componente de unión al anticuerpo anti-beta- lactoglobulina, y el primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina viajará junto a la muestra y se unirá al tercer componente de unión fijado en la tira en la región de control. Asimismo, en una realización alternativa, la región control comprende un componente de unión que se une de modo específico a un componente fijado en una región anterior de la tira, en donde dicho componente fijado a dicha región anterior de la tira es una proteína diferente del anticuerpo anti-beta-lactoglobulina. En una realización preferida, dicha proteína diferente del anticuerpo anti-beta-lactoglobulina está presente en la región de reacción. Prácticamente cualquier proteína, a excepción de la beta-lactoglobulina, diferente del anticuerpo anti-beta-lactoglobulina y que se une a un componente de unión puede estar presente en dicha realización particular de la tira inmunocromatográfica. En una realización particular, dicho componente de unión a la proteína diferente del anticuerpo anti-beta-lactoglobulina es un anticuerpo específico de dicha proteína diferente del anticuerpo anti-beta-lactoglobulina.
Las distintas regiones eventualmente presentes en la tira inmunocromatográfica de la invención (región de recepción (opcional), región de reacción, región de test, y región de control (opcional)) pueden estar separadas entre sí a la misma distancia o a distancias diferentes y estarán dispuestas, preferentemente transversalmente a la dirección del flujo. La distancia entre las distintas regiones va a depender del diseño del aparato o dispositivo de ensayo en cuestión así como de los componentes del mismo. La distancia va a variar entre 2 y 5 mm, 6-10 mm, 11-15 mm, 16-20 mm, 21-30 mm, 31-40 mm, 41-60 mm, 61-150 mm, etc. Preferentemente dicha distancia está comprendida entre 16 y 20 mm.
La tira inmuncromatográfica de la invención puede estar contenida dentro de un dispositivo, tal como es habitual en este tipo de tiras.
En una realización particular, el kit de la invención comprende, además de al menos una tira inmunocromatográfica de la invención, una solución de arrastre para facilitar la disolución del primer componente de unión al anticuerpo anti-beta- lactoglobulina así como el flujo lateral.
Asimismo, en otra realización particular, el kit de la invención comprende, además de al menos una tira inmunocromatográfica de la invención el reactivo reactivos necesarios para la visualización del complejo o complejos formados. Ejemplos ilustartivos de dichos marcadores y reactivos para su revelado han sido mencionados previamente en esta descripción. En una realización particular, la tira inmunocromatográfica de la invención comprende un sistema de visualización de la reacción que comprende partículas coloidales o microesferas coloreadas recubiertas con beta-lactoglobulina. A modo ilustrativa, en una realización particular, la tira inmunocromatográfica de la invención comprende:
a) unas primeras microesferas, coloreadas en un primer color, por ejemplo, en rojo, opcionalmente, en forma seca o deshidratada y susceptibles de ser reconstituidas en contacto con la muestra a analizar, en donde dichas primeras microesferas están unidas a, o recubiertas total o parcialmente por dicho primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina, por ejemplo, beta-lactoglobulina o un fragmento funcionalmente equivalente de la misma; y
b) unas segundas microesferas, coloreadas en un segundo color, diferente a dicho primer color, por ejemplo, en azul, opcionalmente, en forma seca o deshidratada y susceptibles de ser reconstituidas en contacto con la muestra a analizar, en donde dichas segundas microesferas están unidas a, o recubiertas total o parcialmente por una proteína-control, en donde dicha proteína- control es una proteína diferente a dicho primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina.
De acuerdo con esta realización particular, si la muestra contiene anticuerpos anti-beta-lactoglobulina, estos se unen a la beta-lactoglobulina que está unida o recubre dichas primeras microesferas, el complejo formado avanza y alcanza la región de test que contiene dicho segundo componente de unión al anticuerpo anti-beta- lactoglobulina, por ejemplo, beta-lactoglobulina o un fragmento funcionalmente equivalente de la misma, dispuesta en por, ejemplo, una línea, de manera que la inmunoreacción generada da lugar a una línea coloreada (e.g., roja), que sería indicativa de la presencia de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina en la muestra analizada. Paralelamente, una vez reconstituidas dichas segundas microesferas (e.g., coloreadas en azul) por acción de la muestra, avanzan hasta alcanzar la región control en la que se han fijado unos anticuerpos frente a dicha proteína-control, con lo que tiene lugar una reacción inmunológica entre dicha proteína-control y dicho anticuerpo frente a dicha proteína-control y generando como resultado una banda coloreada (azul en este caso). Cuando la muestra analizada no contiene anticuerpos anti-beta-lactoglobulina, entonces solo se desarrolla una banda de control de color azul (en este caso), mientras que si la muestra analizadas contiene anticuerpos anti-beta-lactoglobulina, además de la banda azul, se desarrolla una banda de color rojo (en este caso), al cabo de un cierto tiempo, típicamente, del orden de minutos, por ejemplo, al cabo de al menos 1 minuto, típicamente, entre 3 y 15 minutos, habitualmente entre 5 y 10 minutos. En caso de que no aparezca ninguna de las dos bandas el análisis no sería válido. Esta realización particular, posibilita un control sencillo de la reacción.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.
EJEMPLO 1
Determinación de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina en sueros de niños 1.1 Metodología: ELISA
La técnica de ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) se utilizó para buscar la presencia de anticuerpos IgG anti-beta-lactoglobulina en el suero de niños sanos, diabéticos, celíacos o con ambas enfermedades. Al utilizar el ELISA de forma cualitativa no se tuvieron que realizar curvas patrón para cuantificar la cantidad de anticuerpo, sino que únicamente se buscó la presencia o ausencia del anticuerpo en los distintos sueros.
Para realizar el ELISA primero se fijó la proteína a la fase sólida, fijando el antígeno beta-lactoglobulina a una placa de 96 pocilios, mediante una disolución de 1 mg/ml de beta-lactoglobulina en un tampón C03Na2 (carbonato)- C03HNa (bicarbonato) 0.05 M durante toda la noche, pH 9,6 y a 4o C en cámara húmeda. Pasadas 12 h se procedió a la eliminación de la proteína en exceso mediante 3 lavados con 200 μΐ de PBS-0.5 % Tween 20 (PBST). Una vez unida la beta-lactoglobulina, se incubó 2 h a temperatura ambiente con 200 μΐ por pocilio de una dilución 1/100 de cada uno de los sueros problema en PBST. Luego, se eliminó el anticuerpo que no había sido retenido mediante 3 lavados con 200 μΐ de PBST. Se incubó durante 3 h a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario unido a la enzima, con 200 μΐ de una dilución de 1/3700 del anticuerpo anti IgG humano unido a fosfatasa alcalina (Sigma) en PBST. El exceso de anticuerpo se eliminó lavando 3 veces con 200 μΐ de PBST. Después se reveló con una tableta de sal di sódica hexahidratada de 4-nitrofenil/fosfato (Sigma) por cada 6 mi de tampón de dietanolamina, asegurando siempre que el tampón tuviera un pH de 9,8. Se utilizaron 200 μΐ de esta disolución por pocilio, se dejo que tuviera lugar la reacción colorimétrica a temperatura ambiente. Pasados 30 min se paró la reacción con 75 μΐ de NaOH 3 N por pocilio y se procedió a leer su densidad óptica a 405 nm. La existencia de coloración amarilla indicó la presencia de anticuerpo anti beta-lactoglobulina y la coloración incolora indicó la ausencia de este anticuerpo.
En todos los casos se realizaron las muestras por duplicado, con la presencia de un control positivo (anticuerpo anti-beta-lactoglobulina) y de un control negativo.
1.2 Resultados
Siguiendo el procedimiento anterior se determinó la presencia de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina en sueros de niños sanos, diabéticos, celíacos y celíacos que estaban siguiendo el tratamiento.
En la Tabla 1 se muestran los porcentajes de los niños, de los grupos anteriormente mencionados, que presentaban anticuerpos anti-beta-lactoglobulina. Se valoró la presencia de anticuerpos en niños sanos (285), niños diabéticos entre 1-14 años de edad y con menos de un año transcurrido desde el debut de la enfermedad (299), niños celíacos (227) y niños celíacos que seguían correctamente una dieta sin gluten (197). Como se puede observar el grupo de niños celíacos es el que presenta un porcentaje mayor de positividad frente al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina. Ese porcentaje revierte de un modo significativo cuando los niños celíacos siguen correctamente una dieta sin gluten.
Tabla 1
Porcentaje de niños sanos, diabéticos, celíacos y celíacos tratados positivos frente al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina
Positivos Negativos
Sanos (285) 4% 96%
Diabéticos (299) 43% 57%
Celíacos (227) 84% 16% Celíacos tratados (197) 22% 78%
En la Figura 1 se indican los niveles de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina encontrados en los sueros de los niños sanos, diabéticos, celíacos y celíacos tratados. En dicha figura se puede observar que los niños celíacos presentan un nivel de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina en suero 4 veces superior al de los niños sanos. Además, el nivel de anticuerpos en suero revierte hasta niveles iguales a los encontrados en los niños sanos positivos para el anticuerpo anti-beta-lactoglobulina, en el grupo de los niños celíacos que siguen correctamente la dieta libre de gluten.
EJEMPLO 2
Determinación de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina en sueros de niños
mediante tiras inmunocromatográficas
Uno de los procedimientos desarrollados en la presente invención se basa en unas tiras inmunocromatográficas de flujo lateral. Las tiras consisten en varias capas que aportan todo lo necesario.
La tira se trata en una prueba de dos bandas. Las tiras se introducen en placas de microtitulación que contienen en una dilución 1/20, 1/50 o 1/100, previamente preparada, del suero de los pacientes a estudiar, con una solución salina tamponadora a base de fosfatos (PBS) a pH y concentración salina fisiológica con un 1% de albúmina bovina (BSA). A poner la tira dentro de la muestra diluida, el líquido asciende por capilaridad y reconstituye unas microesferas coloreadas en rojo que se encontraban secas y recubiertas con beta-lactoglobulina purificada cromatográficamente a partir de leche bovina, si la muestra contiene anticuerpos frente a la beta-lactoglobulina. El complejo formado por las microesferas rojas coloreadas, la beta-lactoglobulina purificada cromatográficamente a partir de leche bovina y los anticuerpos anti-beta- lactoglobulina presentes en la muestra del paciente, asciende y alcanza una región que contiene una línea de beta-lactoglobulina purificada cromatográficamente a partir de leche bovina, provocando una inmunoreacción que da como resultado una línea roja. Esa banda roja indica la presencia de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina, tipo IgA o IgG, en la muestra analizada. Como control del sistema, en la región absorbente de la tira también están situadas otras microesferas secas coloreadas de azul y recubiertas con una proteína determinada. El complejo de las microesferas azules recubiertas de proteínas, reconstituidas, asciende por la tira hasta alcanzar una región en la que están fijados unos anticuerpos monoclonales frente a dicha proteína, reaccionando inmunológicamente y dando como resultado una banda azul. Cuando el suero no es inmunoreactivo solo se desarrolla una banda de control azul, mientras que en caso de inmunoreactividad, además de la banda azul, se desarrolla una banda de resultados roja pasados unos 5-10 min. En caso de no aparecer ninguna de las dos bandas el análisis no es valido y habría que repetirlo con una nueva tira. No se necesita equipamiento adicional para el desarrollo del ensayo.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método de diagnóstico in vitro de celiaquía en un sujeto que comprende (i) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina; y
(ii) comparar el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (i) con el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en una muestra de referencia; en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en la muestra de dicho sujeto mayor que el nivel de dicho anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en dicha muestra de referencia es indicativo de que dicho sujeto padece celiaquía.
2. Método in vitro de evaluación de la respuesta a una dieta libre de gluten en un sujeto que padece celiaquía que comprende determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina antes del inicio de la dieta libre de gluten; determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina al cabo de un periodo de tiempo transcurrido desde el inicio de la dieta libre de gluten; y comparar los niveles de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenidos en (i) e (ii); en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (ii) inferior al obtenido en (i) es indicativo de que la respuesta de dicho sujeto a la dieta libre de gluten es favorable.
3. Método in vitro de evaluación de la efectividad de una dieta libre de gluten en un sujeto que padece celiaquía que comprende
(ia) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina antes del inicio de la dieta libre de gluten;
(iia) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina al cabo de un periodo de tiempo transcurrido desde el inicio de la dieta libre de gluten; y
(iiia) comparar los niveles de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenidos en (ia) e (iia), en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (iia) inferior al obtenido en (ia) es indicativo de que la dieta libre de gluten es efectiva; o alternativamente,
(ib) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina al cabo de un periodo de tiempo transcurrido desde el inicio de la dieta libre de gluten; y
(iib) comparar el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (ib) con el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en una muestra de referencia; en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (ib) inferior al nivel de dicho anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en dicha muestra de referencia es indicativo de que la dieta libre de gluten es efectiva.
Método in vitro de evaluación de la adherencia a una dieta libre de gluten por parte de un sujeto que padece celiaquía sometido a una dieta libre de gluten que comprende
(ia) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina a un tiempo ti;
(iia) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina a un tiempo t2, en donde t2 corresponde a un punto en el tiempo posterior a ti; y
(iiia) comparar el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenidos en (ia) y (üa); en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (iia) inferior al valor obtenido en (ia) es indicativo de adherencia a la dieta libre de gluten por parte de dicho sujeto; o, alternativamente,
(ib) determinar en una muestra de sangre o de suero de dicho sujeto el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina; y
(iib) comparar el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (ib) con el nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en una muestra de referencia; en donde un nivel de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina obtenido en (ib) inferior al nivel de dicho anticuerpo anti-beta-lactoglobulina en dicha muestra de referencia es indicativo de adherencia a la dieta libre de gluten por parte de dicho sujeto.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho sujeto tiene una dieta alimenticia que incluye leche y/o derivados lácteos.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha beta- lactoglobulina es una beta-lactoglobulina de un animal rumiante.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha beta- lactoglobulina es beta-lactoglobulina bovina.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha beta- lactoglobulina es beta-lactoglobulina de vaca.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que los niveles de anticuerpo anti-beta-lactoglobulina se determinan mediante un inmunoensayo, preferentemente un inmunoensayo tipo ELISA, un inmunoensayo por cromatografía de flujo lateral basado en el empleo de tiras inmunocromatográficas o un inmunoensayo basado en el empleo de inmunobiosensores.
10. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra de referencia es una muestra de un sujeto, o conjunto de sujetos, diagnosticado como no celíaco.
11. Método según la reivindicación 3, en el que la muestra de referencia de la etapa (iib) es una muestra de un sujeto, o conjunto de sujetos, diagnosticado como no celíaco.
12. Método según la reivindicación 4, en el que la muestra de referencia de la etapa (iib) es una muestra de un sujeto, o conjunto de sujetos, diagnosticado como no celíaco. 13. Una tira inmunocromatográfica para la detección de anticuerpos frente a beta- lactoglobulina, que comprende: - una región de reacción, que comprende un primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina, en donde dicho primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina es movible y está embebido en un material poroso; y
- una región de test, que comprende un segundo componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina inmovilizado en dicha región de test; en donde dicho primer y segundo componente de unión se seleccionan del grupo formado un antígeno específico para el anticuerpo anti-beta-lactoglobulina, o un fragmento de dicho antígeno con capacidad de unión a dicho anticuerpo anti-beta- lactoglobulina.
Tira inmunocromatográfica según la reivindicación 13, en la que dicho primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina es beta-lactoglobulina o un fragmento de beta-lactoglobulina con capacidad de unión a dicho anticuerpo anti-beta-lactoglobulina.
15. Tira inmunocromatográfica según la reivindicación 13, en la que dicho primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina está en forma seca o deshidratada.
16. Tira inmunocromatográfica según la reivindicación 13, en la que dicho primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina está unido y/o recubriendo unas microesferas.
17. Tira inmunocromatográfica según la reivindicación 16, en la que dichas microesferas están coloreadas.
18. Tira inmunocromatográfica según la reivindicación 16, en la que dichas microesferas están en forma seca o deshidratada.
19. Tira inmunocromatográfica según la reivindicación 18, en la que dichas microesferas en forma seca o deshidratada se reconstituyen en contacto con la muestra.
20. Tira inmunocromatográfica según la reivindicación 13, que comprende, además, una región de recepción para recibir la muestra.
21. Tira inmunocromatográfica según la reivindicación 20, en la que dicha región de recepción se sitúa en la región de reacción que comprende el primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina.
22. Tira inmunocromatográfica según la reivindicación 20, en la que dicha región de recepción se sitúa en una región diferente de la región de reacción que comprende el primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina.
23 Tira inmunocromatográfica según la reivindicación 13, que comprende: a) unas primeras microesferas, coloreadas en un primer color, en forma seca o deshidratada y susceptibles de ser reconstituidas en contacto con la muestra a analizar, en donde dichas primeras microesferas están unidas a, o recubiertas total o parcialmente por un primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina; y unas segundas microesferas, coloreadas en un segundo color, diferente a dicho primer color, opcionalmente, en forma seca o deshidratada y susceptibles de ser reconstituidas en contacto con la muestra a analizar, en donde dichas segundas microesferas están unidas a, o recubiertas total o parcialmente por una proteína-control, en donde dicha proteína-control es una proteína diferente a dicho primer componente de unión al anticuerpo anti-beta-lactoglobulina.
24. Un kit que comprende al menos una tira inmunocromatográfica según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 23.
25. Uso de un kit que comprende un primer componente de unión al anticuerpo anti- beta-lactoglobulina para diagnosticar celiaquía en un sujeto; o para
evaluar la respuesta a una dieta libre de gluten en un sujeto que padece celiaquía; o para
- evaluar la efectividad de una dieta libre de gluten en un sujeto que padece celiaquía; o para
evaluar la adherencia a una dieta libre de gluten por parte de un sujeto que padece celiaquía sometido a una dieta libre de gluten.
26. Uso de un kit según la reivindicación 25, en el que dicho kit es un kit adecuado para un inmunoensayo tipo ELISA, o un kit adecuado para un inmunoensayo por cromatografía de flujo lateral basado.
27. Uso de un kit según la reivindicación 26, en el que dicho kit comprende una tira inmunocromatográfica según cualquiera de las reivindticaciones 13 a 23.
28. Uso de un kit según la reivindicación 26, en el que dicho kit comprende un biosensor para la detección de anticuerpos anti-betalactoglobulina.
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