WO2013062209A1 - 바이오센서 - Google Patents

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WO2013062209A1
WO2013062209A1 PCT/KR2012/005125 KR2012005125W WO2013062209A1 WO 2013062209 A1 WO2013062209 A1 WO 2013062209A1 KR 2012005125 W KR2012005125 W KR 2012005125W WO 2013062209 A1 WO2013062209 A1 WO 2013062209A1
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WO
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enzyme
substrate
dehydrogenase
sensing electrode
biosensor
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Application number
PCT/KR2012/005125
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English (en)
French (fr)
Inventor
이성갑
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경상대학교 산학협력단
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Publication date
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    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
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    • G01N27/416—Systems

Definitions

  • the present invention relates to a bio-sensor for detecting a change in capacitance due to charge generation / desorption due to an ion change by an enzyme-substrate reaction as an electrical signal. More specifically, the sensing electrode detecting the ion change according to the substrate-enzyme reaction is for a bio-sensor characterized by applying a nano-microstructure obtained by anodizing aluminum.
  • bio-sensors for analyzing various biomaterials such as cancer, diabetes, various biomarkers, cholesterol, lactic acid, and urea
  • biomaterials such as cancer, diabetes, various biomarkers, cholesterol, lactic acid, and urea
  • it is widely applied as an environmental bio-sensor for monitoring pollutants in various environmental sites.
  • residual pesticides, antibiotics, pathogens, and other toxic chemicals contained in agricultural products can be used on site.
  • bio-sensors There is an increasing demand for bio-sensors that can be easily analyzed.
  • interest in military bio-sensors that can detect the use of biochemical weapons accurately and quickly in the field of battlefield and terrorism has been steadily increasing.
  • industrial, process and biological industries such as pharmaceutical, chemical, petrochemical, etc.
  • Many bio-sensors have been applied for the purpose of controlling and controlling fermentation processes.
  • the operation of the bio-sensors by an electrical sensing method detects changes in electrical properties induced when the target biomaterial to be detected specifically binds to the probe material, for example, an enzyme.
  • a bio-sensor having an electrolyte-insulator-semiconductor (EIS) structure as shown in Figure 1 for measuring the potential difference according to the pH change.
  • EIS electrolyte-insulator-semiconductor
  • This structure detects ion changes generated as the detection layer on the surface of the semiconductor is in contact with the solution containing the object to be detected and the object to be detected is bound to the probe material. Since the EIS structure is based on a semiconductor structure, the manufacturing process is complicated because a semiconductor manufacturing process is involved and a separate rear electrode is required at the rear of the substrate. There is a need for a simple type of bio-sensor system that does not involve a semiconductor process without losing the properties of the electrolyte-insulator structure of the EIS system.
  • the present invention provides a bio-sensor for detecting a change in capacitance due to charge generation / discharge according to an enzyme-substrate reaction as an electrical signal.
  • the present invention provides a bio-sensor comprising a sensing electrode maximizing the surface area of the electrode by applying a nano-microstructure according to anodization of aluminum to the sensing electrode.
  • the present invention relates to a biosensor designed to solve the above problems.
  • the biosensor includes a conductive substrate on which a metal oxide nanostructure is formed; And an ion sensitive membrane formed on the surface of the nanostructure.
  • the conductive substrate is preferably selected from the group consisting of aluminum, titanium, zinc, tin, niobium, tungsten and tantalum.
  • the ion sensitive membrane is used for the detection of hydrogen ions.
  • the metal oxide nanostructure is preferably formed by applying an anodization method to a conductive substrate.
  • the ion-sensitive film is preferably selected from the group consisting of Si 3 N 4 , Ta 2 O 5 and HfO 2 .
  • the present invention is an enzyme that reacts with the substrate to generate hydrogen; A biological fixation membrane to which the enzyme is immobilized; The sensing electrode and the reference electrode; And an electrolyte; and providing a bio-sensor for detecting an object to be detected by measuring an amount of change in capacitance of the sensing electrode.
  • the biosensor of the present invention preferably further includes an impedance analyzer for measuring the amount of change in capacitance.
  • the enzyme is glucose oxidase, glucose dehydrogenase, lactic acid oxidase, alcohol redox enzyme, aldehyde dehydrogenase, CH-CH redox enzyme, amino acid redox enzyme, CH-NH redox enzyme, lactate dehydrogenase, lactose dehydrogenase It is preferably selected from the group consisting of enzymes, pyruvate dehydrogenases, formate dehydrogenases and formaldehyde dehydrogenases.
  • the present invention has the effect of widening the specific surface area of the electrode by using the micro-nanostructure to which the AAO is applied as a sensing electrode, so that even if the biosensor is made small, the detection performance of ions is not deteriorated.
  • the conventional EIS type sensor uses a semiconductor substrate, a metal back electrode has to be separately provided, but the sensing electrode according to the present invention can use the aluminum substrate used as the back electrode, which makes the simple structure and manufacturing process complicated. Not.
  • FIG. 1 schematically shows a structure of a biosensor having a conventional EIS structure.
  • FIG. 2 schematically shows a cross-sectional view of a sensing electrode and a manufacturing process thereof by applying aluminum anodization.
  • Figure 3 schematically illustrates one exemplary embodiment of a bio-sensor structure comprising a sensing electrode according to the present invention.
  • FIG. 4 schematically illustrates another exemplary embodiment of a bio-sensor structure comprising a sensing electrode according to the present invention.
  • the present invention provides a bio-sensor that detects ionic change by an enzyme-substrate reaction, in particular a change in capacitance due to charge generation / desorption due to an increase in hydrogen ions, as an electrical signal.
  • the biosensor includes a sensing electrode 210, a reference electrode 220, an enzyme 230, an enzyme fixation membrane 240, and an electrolyte 250.
  • the biosensor may further include an impedance analyzer 260 connected to the sensing electrode and the reference electrode to calculate the capacitance according to the ion change.
  • the sensing electrode 210 is characterized by applying a nano-microstructure obtained by anodizing a conductive metal substrate.
  • the bottom view shows a cross section of the sensing electrode 210 according to the present invention.
  • the sensing electrode includes a sensing unit 110a and an electrode unit 110b including a nanostructure of a metal oxide and a sensitive film formed on a surface of the nanostructure.
  • Figure 2 shows a cross-sectional view of the sensing electrode and the manufacturing process thereof included in the bio-sensor according to the present invention.
  • the substrate itself serves as a rear electrode by using a conductive metal substrate instead of a silicon substrate, so that a separate rear electrode is not required.
  • the sensing electrode applied to the sensor there is an advantage that the structure or manufacturing process of the sensor is simplified.
  • the conductive substrate 100 is prepared to form the sensing electrode. Since the sensing electrode of the present invention not only serves to sense a change in capacitance according to the reaction of the enzyme-substrate, but also has to play the role of the electrode at the same time, it is preferable to use a substrate made of a conductive material.
  • the material of the conductive substrate one or more may be selected from the group consisting of aluminum, titanium, zinc, tin, niobium, tungsten and tantalum. Preferably it is aluminum.
  • FIG. 2 illustrates a process of forming the nanostructure 120 on the conductive substrate 100 to form the sensing electrode of the present invention. Next, the manufacturing process of the sensing electrode was described in order.
  • the second view from the top is a cross-sectional view schematically illustrating a state in which the nanostructure 120 made of metal oxide is formed on one surface of the substrate by anodizing the conductive substrate 100.
  • the substrate 100 has a nanostructure 120 formed of a metal oxide on at least one surface thereof, and a portion of the nanostructure 120 formed thereon is a sensitive film 130 capable of detecting ions on the surface of the nanostructure.
  • a portion in which the nanostructure 120 is formed on the metal substrate is divided into the sensing unit 110a and the rest of the structure by the electrode unit 110b.
  • the material of the conductive substrate 100 is aluminum will be described as an example.
  • the substrate 100 In the anodic oxidation process, it is preferable to expose the substrate 100 in a state where 40 V is applied to 0.3 M oxalic acid at 10 ° C. for 500 seconds.
  • anodization is applied to the aluminum substrate, the surface portion of the substrate is oxidized to be modified into aluminum oxide (Al 2 O 3 ), and a nano fine structure in which nano-sized pores are regularly distributed on the surface is formed.
  • the anodized aluminum oxide (AAO) nanostructures may be used as a framework for making nanostructures such as nanowires, and the AAO nanostructures may be used as masks.
  • the substrate 100 is preferably subjected to anodization pretreatment.
  • the pretreatment method may be, for example, a method of washing in acetone and ethanol and then drying in an oven to remove impurities from the surface of the substrate 100, but is not limited thereto.
  • a metal such as titanium may be used as an anode, and a platinum electrode may be used as a cathode.
  • the electrolyte for anodic oxidation is ethylene glycol, formamide, dimethyl formamide, dimethyl sulfoxide, diethylene glycol, glycerol, methanol ) And an organic solvent, but are not limited thereto.
  • a predetermined amount of NH 4 F or HF may be added to the anodic oxidation electrolyte.
  • nanostructures can be obtained by changing the time, temperature, and applied voltage of the anodization.
  • the shape of the nanostructures may be mainly in the form of nano-tubes, nano-wires, nano-rods, nano-fibers. It may be formed in the form of at least one of nano-ring, nano-horn (nano-horn).
  • nanostructures 120 in the form of nano-rods for convenience.
  • the number of nanostructures 120 formed in the sensing unit 110a may vary depending on the spacing between them.
  • the nanostructures 120 are uniformly arranged in one direction, but may be irregularly arranged.
  • the AAO is an aluminum oxide film anodized in a strong acid atmosphere, and has a characteristic of being a porous material having nanopores with high regularity and anisotropy.
  • the nanostructure manufactured by the anodic oxidation method as described above is in an amorphous state 120a, and it is preferable to perform heat treatment so that it becomes a phase side in the crystallized state 120b.
  • Al 2 O 3 itself may act as a hydrogen ion sensitive film.
  • a separate ion-sensitive film 130 made of a material such as silicon nitride may be stacked on the surface in a subsequent process.
  • aluminum oxide (Al 2 O 3 ) is in a crystalline state, preferably an atanase type, there is an effect of improving the sensitivity of the hydrogen ions or the reactivity between the interface between the ion sensitive membrane 130 and aluminum oxide. Therefore, it is preferable to perform crystallization by performing heat treatment on the amorphous aluminum oxide.
  • the heat treatment may be achieved by a method of performing annealing after performing at about 400 ° C. to 500 ° C. under an inert gas atmosphere such as helium, argon, and neon.
  • FIG. 2C schematically illustrates a state 120b in which the surface portion of the nanostructure is phase-transformed into a crystalline form by performing heat treatment on the aluminum oxide nanostructure in the amorphous state 120a.
  • the nanostructure itself is sensitive to hydrogen ions, and the ion-sensitive film 130 is then formed on the surface of the aluminum oxide obtained above.
  • the ion sensitive membrane 130 serves to sense a change in capacitance, and preferably has a sensitivity to hydrogen ions generated by an enzyme-substrate reaction.
  • a sensitized film such as the silicon nitride thin film can be laminated using a known chemical vapor deposition method (hereinafter referred to as CVD).
  • CVD chemical vapor deposition method
  • thermal CVD plasma CVD
  • light CVD MO-CVD
  • laser CVD laser CVD
  • the sensing electrode 210 of the present invention manufactured according to the above process is formed by forming a nanostructure on one surface of a metal substrate by anodizing to form the sensing unit 110a, and the sensing unit and the electrode unit are integrally formed.
  • the sensing unit 110a may include an ion sensitive layer 130 on which a silicon nitride thin film is deposited on the surface of the nanostructure 120b made of crystalline aluminum oxide. Also,
  • FIG. 3 schematically illustrates a structure of a bio-sensor including a sensing electrode 210 according to the present invention.
  • the biosensor according to the present invention utilizes the electro-chemical properties of the enzyme-substrate reaction.
  • the biosensor converts the substrate into an electrochemical signal such as current, voltage, conductance, impedance, and the like. Serves to confirm the presence and / or concentration of
  • an embodiment of a biosensor according to the present invention is a sensing electrode 210 for detecting an ion change according to an enzyme-substrate reaction, fixing an electric potential of an electrolyte solution, and a difference in electrical output from the sensing electrode.
  • the ion concentration changed according to the reaction of the enzyme-substrate in the electrolyte is represented by an electrical property such as a change in capacitance, and the electrical property may be output as a change in magnitude of impedance.
  • the biosensor according to the present invention may further include an impedance detector 260 to calculate the impedance magnitude change.
  • the biosensor according to the present invention may directly fix the enzyme to the sensitizing film 130, which is the surface of the sensing electrode, without providing a fixed membrane to which the enzyme is attached (FIG. 4).
  • the enzyme may be variously selected according to the type of substrate to be detected. It is preferably one that reacts with the substrate to produce hydrogen ions, preferably an oxidase or dehydrogenase.
  • the following diagram shows the reaction mechanism of oxidase and dehydrogenase, and hydrogen ions (H + ) are produced as the final product of the reaction.
  • the enzyme dehydrogenase is specifically glucose oxidase, glucose dehydrogenase, lactate oxidase, alcohol redox enzyme, aldehyde dehydrogenase, CH-CH redox enzyme, amino acid redox enzyme, CH-NH redox enzyme, lactate At least one selected from the group consisting of dehydrogenase, lactose dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase, formate dehydrogenase and formaldehyde dehydrogenase.
  • the substrate is a biophysiological substance to be detected using the biosensor, and any substrate may be used as long as it reacts with the enzyme to generate hydrogen ions.
  • the bio-sensor can be used to check whether glucose is included in the prepared sample.
  • glucose oxidase glucose oxidase
  • the bio-sensor can be used to check whether glucose is included in the prepared sample.
  • glucose reacts with glucose oxidase hydrogen peroxide and gluconolactone (C 6 H 10 O 7 ) are produced and the gluconolactone is hydrolyzed to produce gluconate C 6 H 12 O 7 (see equation (1) below).
  • the gluconic acid is dissociated to produce hydrogen ions (see Equation 2 below).
  • Biosensor according to the present invention may be provided with an enzyme fixing membrane for fixing the enzyme.
  • an enzyme fixing membrane for fixing the enzyme.
  • the enzyme fixation membrane as long as the enzyme, which is a protein, can be stably fixed, a polymer resin such as polyethylene, carbon nanotubes, and metals such as gold (Au) can be used without limitation.
  • the electrolyte is characterized by using any one solution selected from potassium chloride (KCl) solution, sodium chloride (NaCl) solution or diluted dilute sulfuric acid (diluted H 2 SO 4 ) solution.
  • KCl potassium chloride
  • NaCl sodium chloride
  • diluted dilute sulfuric acid diluted H 2 SO 4
  • the reference electrode is for fixing the potential of the electrolyte solution and is preferably connected to the electrolyte solution.
  • the reference electrode is preferably formed of platinum or Ag / AgCl.
  • the present invention relates to a bio-sensor for detecting a change in capacitance due to charge generation / desorption due to an ion change by an enzyme-substrate reaction as an electrical signal.

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Abstract

본 발명은 기질-효소 반응에 따른 이온 변화를 검출하는 센싱 전극은 알루미늄을 양극산화시켜 얻어진 나노 미세 구조를 적용한 것을 특징으로 하는 바이오-센서에 대한 것이다. 상기 바이오 센서의 센싱 전극은 도전성 금속 기판을 양극 산화하여 얻어진 나노 미세 구조를 적용하는 것을 특징으로 한다.

Description

바이오센서
본 발명은 효소-기질 반응에 의한 이온 변화에 따른 전하 발생/소멸에 의한 정전용량 변화를 전기적 신호로 검출하는 바이오-센서에 대한 것이다. 더욱 상세하게는 기질-효소 반응에 따른 이온 변화를 검출하는 센싱 전극은 알루미늄을 양극산화시켜 얻어진 나노 미세 구조를 적용한 것을 특징으로 하는 바이오-센서에 대한 것이다.
암, 당뇨를 비롯한 각종 바이오 마커, 콜레스트롤, 젖산, 요소 등 다양한 생체 물질들을 분석하는 바이오-센서들에 대한 수요가 빠르게 증가하고 있다. 또한 다양한 환경 현장에서의 공해 물질 감시를 위한 환경용 바이오-센서로 많이 응용되고 있으며, 식품의 안전성을 효율적으로 관리하기 위하여 농축산품에 포함된 잔류농약, 항생제, 병원균, 기타 독성 화학물질들을 현장에서 간편하게 분석할 수 있는 바이오-센서에 대한 요구도 높아지고 있다. 최근에는 전장 및 테러의 현장에서 정확하고 신속하게 생물화학적 무기 사용의 여부를 감지할 수 있는 군사용 바이오-센서에 대한 관심도 꾸준히 증가하고 있으며, 산업용으로는 제약, 화학, 석유화학 등의 공정 및 생물 산업 발효 공정을 제어 관리하기 위한 목적으로 바이오-센서가 많이 응용되고 있다.
이러한 바이오-센서 중 전기적 감지 방식에 의해 작동되는 것은 검출하고자 하는 타깃 바이오 물질이 프로브 물질, 예를 들어 효소와 특이적으로 결합할 때 유도되는 전기적 특성 변화를 검출한다. 이러한 전기적 감지 방식에 있어서 대표적인 것으로 pH 변화에 따른 전위차를 측정하는 도 1과 같은 전해질-절연체-반도체(Electrolyte-insulator-semiconductor, EIS) 구조를 갖는 바이오-센서가 있다. 이 구조는 반도체 표면의 검출층이 피검출대상을 포함한 용액과 접촉하고 있고 피검출대상이 프로브 물질과 결합한 결과 생성되는 이온변화를 감지한다. 이러한 EIS구조는 반도체 구조를 기반으로 하고 있어 반도체 제조 공정이 수반되고 기판 후면에 별도의 후면 전극이 필요하기 때문에 제조 공정이 복잡한 단점이 있다. 이에 EIS 시스템의 전해질-절연체 구조의 특성을 잃지 않으면서 반도체 공정이 수반되지 않는 간소한 유형의 바이오-센서 시스템이 요청된다.
본원 발명은 효소-기질 반응에 따른 전하 발생/소멸에 의한 정전용량 변화를 전기적 신호로 검출하는 바이오-센서를 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 센싱 전극에 알루미늄의 양극산화에 따른 나노 미세 구조를 적용하여 전극의 표면적을 극대화한 센싱 전극을 포함하는 바이오-센서를 제공하는 것이다.
본원 발명은 상기 과제를 해결하기 위해 고안된 바이오 센서에 대한 것이다. 상기 바이오 센서는 일측면상에 금속 산화물 나노 구조체가 형성된 도전성 기판; 및 상기 나노 구조체의 표면에 형성된 이온 감응막;으로 구성된 바이오-센서용 센싱 전극을 포함한다.
상기 도전성 기판은 알루미늄, 티타늄, 아연, 주석, 니오븀, 텅스텐 및 탄탈륨으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것이 바람직하다.
상기 이온 감응막은 수소 이온의 검출을 위한 것으로 사용된다.
상기 금속 산화물 나노 구조체는 도전성 기판에 양극 산화법을 적용하여 형성되는 것이 바람직하다.
상기 이온 감응막은 Si3N4, Ta2O5 및 HfO2로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것이 바람직하다.
또한, 본원 발명은 기질과 반응하여 수소를 발생시키는 효소; 상기 효소가 고정된 생체 고정막; 상기 센싱 전극 및 기준 전극; 및 전해질;을 포함하며, 상기 센싱 전극의 정전용량의 변화량을 측정하여 피검출물을 검출하는 바이오-센서를 제공한다.
본원 발명의 바이오 센서는 상기 정전 용량의 변화량을 측정하기 위한 임피던스 분석기를 더 포함하는 것이 바람직하다.
상기 효소는 글루코스 산화효소, 글루코스 탈수소효소, 젖산 산화효소, 알코올 산화환원 효소, 알데히드 탈수소효소, CH-CH 산화환원 효소, 아미노산 산화환원 효소, CH-NH 산화환원 효소, 락테이트 탈수소효소, 락토오스 탈수소효소, 피루베이트 탈수소효소, 포르메이트 탈수소효소 및 포름알데히드 탈수소효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명은 AAO를 적용한 미세 나노 구조체를 센싱 전극으로 사용함으로써 전극의 비표면적을 넓히는 효과가 있으므로 바이오 센서가 소형으로 제작되더라도 이온의 감지 성능이 저하되지 않는다. 또한, 종래 EIS 타입의 센서는 반도체 기판을 사용하기 때문에 금속 재질의 후면 전극을 별도로 구비하여야 했지만 본원 발명에 따른 센싱 전극은 사용된 알루미늄 기판을 후면 전극으로 이용할 수 있기 때문에 간단한 구조 및 제조 공정이 복잡하지 않다.
도 1은 종래 EIS 구조의 바이오 센서의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 알루미늄 양극산화법을 적용하여 센싱 전극의 단면도 및 이의 제조 공정도를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본원 발명에 따른 센싱 전극을 포함하는 바이오-센서 구조의 예시적인 일실시형태를 개략적으로 도시한 것이다.
도 4는 본원 발명에 따른 센싱 전극을 포함하는 바이오-센서 구조의 예시적인 다른 실시형태를 개략적으로 도시한 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본원 발명에 대하여 구체적으로 살펴보기로 한다.
본원 발명은 효소-기질 반응에 의한 이온 변화, 특히 수소 이온의 증가에 따른 전하 발생/소멸에 의한 정전용량 변화를 전기적 신호로 검출하는 바이오-센서를 제공한다.
상기 바이오 센서는 센싱 전극(210), 참조 전극(220), 효소(230), 효소 고정막(240) 및 전해질(250)를 포함한다. 또한, 상기 바이오 센서는 이온 변화에 따른 정전용량을 산출하기 위해 상기 센싱 전극 및 참조 전극과 연결된 임피던스 분석기(260)가 더 포함될 수 있다.
상기 센싱 전극(210)은 도전성 금속 기판을 양극 산화하여 얻어진 나노 미세 구조를 적용하는 것을 특징으로 한다. 도 2에서, 맨 아래 도면은 본원 발명에 따른 센싱 전극(210)의 단면을 도시한 것이다. 상기 센싱 전극은 금속 산화물의 나노 구조체 및 상기 나노 구조체의 표면에 형성된 감응막을 포함하는 센싱부(110a)와 전극부(110b)로 이루어진다.
도 2는 본원 발명에 따른 바이오-센서에 포함되는 센싱 전극의 단면도 및 이의 제조 공정도를 나타낸 것이다.
종래의 EIS 구조의 바이오-센서의 경우에는 후면전극을 별도로 구비하여야 했으므로 실리콘 기판의 후면에 알루미늄과 같은 도전성 금속 재료로 이루어진 후면 전극을 부착하는 부가적인 공정이 필요하였다. 그러나 본원 발명에 따른 바이오-센서의 경우에는 종래 EIS 타입의 센서와 달리 실리콘 기판이 아닌 전도성의 금속 기판을 사용하여 기판 자체가 후면 전극의 역할을 수행하므로 별도의 후면 전극이 필요하지 않아 EIS 타입의 센서에 적용되는 센싱 전극에 비해 센서의 구조나 제조 공정이 간략화되는 장점이 있다.
도 2에서, 맨 위 도면을 참조하면, 우선 센싱 전극의 형성을 위해 도전성 기판(100)을 준비한다. 본원 발명의 상기 센싱 전극은 효소-기질의 반응에 따른 정전 용량의 변화를 감지하는 역할을 할 뿐만 아니라 전극의 역할을 동시에 수행하여야 하므로 도전성 재질의 기판을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 도전성 기판의 재료로는 알루미늄, 티타늄, 아연, 주석, 니오븀, 텅스텐 및 탄탈륨으로 이루어진 그룹에서 하나 이상이 선택될 수 있다. 바람직하게는 알루미늄인 것이다.
도 2는 본원 발명의 센싱 전극을 형성하기 위해 도전성 기판(100) 상부에 나노 구조체(120)을 형성하는 공정을 도시한 것이다. 다음으로 센싱 전극의 제조 과정을 공정을 순서에 따라 설명하였다.
도 2에서, 위에서부터 두 번째 도면은 도전성 기판(100)에 양극 산화(anodizing)를 수행하여 기판의 일면에 금속 산화물로 이루어진 나노 구조체(120)가 형성된 상태를 개략적으로 도시한 단면도이다.
양극 산화에 의해 상기 기판은(100)은 적어도 일면에 금속 산화물로 이루어진 나노 구조체(120)가 형성되며 나노 구조체(120)가 형성된 부분은 이후 나노 구조체 표면에 이온을 감지할 수 있는 감응막(130)을 형성하여 전해질의 정전 용량 변화를 감지하는 역할을 수행하고 산화물로 변성되지 않은 나머지 기판 부분(100b)은 전극으로서의 역할을 수행한다. 이하 상기 금속 기판에 나노 구조체(120)가 형성된 부분을 센싱부(110a), 그 외 나머지 부분에 대해서는 전극부(110b)로 구분하여 설명한다.
이하 설명상 편의를 위해 상기 도전성 기판(100)의 재료가 알루미늄인 경우를 예로 들어 설명한다.
양극 산화 공정은 상기 기판(100)을 10℃의 0.3 M의 옥살산(oxalic acid)에 40V를 가한 상태에 500초간 노출시키는 것이 바람직하다. 상기 알루미늄 기판에 양극 산화를 가하면, 기판의 표면부가 산화되어 산화 알루미늄(Al2O3)으로 변성되며 표면에 나노 크기의 기공이 규칙적으로 분포되어 있는 나노 미세 구조체가 형성된다. 이러한 양극 산화 알루미늄(AAO) 나노 구조체는 나노와이어 등 나노 구조를 만드는 틀로서 사용되기도 하며, AAO 나노 구조체 자체가 마스크로 활용될 수도 있다.
상기 기판(100)은 양극산화 전 전처리를 수행하는 것이 바람직하다. 상기 전처리 방법은 기판(100) 표면에서 불순물을 제거하기 위해 예를 들어 아세톤 및 에탄올에서 각각 세척한 후 오븐에서 건조시키는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
양극산화를 위한 이전극 전기화학셀 중 애노드로는 티타늄 등의 금속을 사용하고 캐소드로는 백금 전극을 사용하여 진행할 수 있다. 양극산화용 전해질은 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 포마마이드(formamide), 디메틸 포마마이드(dimethyl formamide), 디메틸 설파옥사이드(dimethyl sulfoxide), 디에틸렌 글리콜(diethylene glycol), 글리세롤(glycerol), 메탄올(methanol)와 유기용매를 사용하는데 이에 한정되는 것은 아니다. 특히 기공을 가지는 산화층이 형성되도록 하기 위해서 양극 산화용 전해질로 NH4F 혹은 HF를 소정량 첨가할 수 있다.
양극산화법를 진행하면 생성, 유지, 소멸 단계로 구분되는데 양극산화법을 적용하는 시간, 온도, 인가전압을 변화시켜 다양한 형태의 나노 구조체를 얻을 수 있다. 나노 구조체의 형상은 주로 나노 튜브(nano-tube), 나노 와이어(nano-wire), 나노 로드(nano-rod), 나노 파이버(nano-fiber)의 형태가 될 수 있으며, 경우에 따라 나노 링(nano-ring), 나노 혼(nano-horn) 중 적어도 하나의 형태로 형성될 수 있다.
도 2에서는 편의상 나노 로드(nano-rod) 형태의 나노 구조물들을 도시하였다. 상기 센싱부(110a)에 형성되는 나노 구조체(120)의 갯수는 이들이 형성되는 간격에 따라 달라질 수 있다. 또한, 도 2에서, 구체적으로, 위에서부터 두 번째 및 맨 아래 도면에서는 나노 구조체(120)가 일정하게 한 방향으로 정렬되어 형성된 것으로 도시되어 있으나, 불규칙하게 배열되는 것도 가능하다.
이러한 알루미늄의 양극 산화기술은 오랜 역사를 갖는다. 이미 1923년에 내부 알루미늄의 보호와 장식용을 목적으로 상업적인 알루미늄의 표면을 양극산화시키는 기술이 보고되어 있다. 양극산화 과정에서 자발적으로 생성된 나노기공을 포함하는 구조 또한 알루마이트(alumite)라는 상업화된 이름으로 널리 알려져 있다.
최근에는 나노 구조에 대한 산업적인 요구와 관심이 나날이 커지면서, 미세 다층구조, 나노선재, 나노입자 등에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 이들 나노 구조에 대한 전기화학적인 제조법은 경제적인 비용절감과 조작의 간편함 그리고 복잡한 형상에 대한 유연성 때문에 새롭게 각광받고 있다. 이러한 AAO는 강산 분위기에서 양극산화된 알루미늄 산화막으로서 규칙성과 이방성이 큰 나노 기공을 보유한 다공성 재료라는 특성이 있다.
상기와 같이 양극 산화법으로 제조된 나노 구조체는 비정질 상태(120a)인데, 이것이 결정화 상태(120b)로 상변이 되도록 열처리를 수행하는 것이 바람직하다. 양극 산화에 의해 형성된 산화 알루미늄 나노 구조체(120)는 Al2O3 자체가 수소 이온 감응막으로 작용할 수 있다. 또는 후속 과정에서 표면에 질화 규소와 같은 재료로 이루어진 별도의 이온 감응막(130)이 적층될 수 있다. 산화 알루미늄(Al2O3)이 결정질 상태, 바람직하게는 아타나제 형인 경우 수소 이온의 감응성이나 이온 감응막(130)과 산화 알루미늄의 계면간 반응성이 향상되는 효과가 있다. 따라서 비정질 상태의 산화 알루미늄에 열처리를 수행하여 결정화하는 것이 바람직하다.
상기 열처리는 헬륨, 아르곤, 네온과 같은 비활성 기체 분위기 하에서 대략 400℃ ~ 500℃로 수행한 후 서랭시키는 방법에 의해 달성될 수 있다. 도 2c는 비정질 상태(120a)의 산화 알루미늄 나노 구조체에 열처리를 수행함으로써 나노 구조체의 표면부가 결정형으로 상변이된 상태(120b)를 개략적으로 도시한 것이다.
산화 알루미늄(Al2O3) 자체가 수소 이온에 대한 감응성이 있어 열처리된 상태의 나노 구조체를 다음으로 상기에서 얻어진 산화알루미늄 표면에 이온 감응막(130)을 형성한다. 상기 이온 감응막(130)은 정전용량 변화를 감지하는 역할을 하는 것으로서 바람직하게는 효소-기질 반응에 의해 생성되는 수소 이온에 대해 감응성을 갖는 것이다. 본원 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면 상기 감응막의 재료로 수소 이온에 대한 감응성이 큰 Si3N4, Ta2O5 및 HfO2을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 질화규소 박막과 같은 감응막은 공지의 화학적 기상 층착법(이하 CVD)을 사용하여 적층할 수 있다. 예를 들어 열 CVD, 플라즈마 CVD, 광 CVD, MO-CVD 또는 레이져 CVD를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기와 같이 도 2를 참조하여 본원 발명의 바이오-센서에 사용되는 센싱 전극의 제조 공정을 설명하였다. 상기 공정에 따라 제조된 본원 발명의 센싱 전극(210)은 금속 기판의 일측 표면을 양극산화법으로 나노구조체를 형성하여 센싱부(110a)를 형성한 것으로서 센싱부와 전극부가 일체형으로 이루어져 있다. 상기 센싱부(110a)는 결정형의 산화 알루미늄으로 이루어진 나노 구조체(120b)의 표면에 질화규소 박막이 증착된 이온 감응막(130)을 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한,
다음으로는 상기 센싱 전극(210)을 일 구성요소로 포함하는 바이오-센서에 대해 설명한다.
도 3은 본원 발명에 따른 센싱 전극(210)을 포함하는 바이오-센서의 구조를 개략적으로 도시한 것이다.
본원 발명에 따른 바이오 센서는 효소-기질 반응의 전기-화학적인 특성을 이용한 것으로서, 상기 반응을 통해 이온 및/또는 전자가 생성되면 이를 전류, 전압, 컨덕턴스, 임피던스 등의 전기화학적 신호로 변환시켜 기질의 존재 및/또는 농도를 확인하는 역할을 한다.
도 3을 참조하면, 본원 발명에 따른 하는 바이오 센서의 일 실시형태는 효소-기질 반응에 따른 이온 변화를 감지하는 센싱 전극(210), 전해질 용액의 전위를 고정시키고 상기 센싱 전극과의 전기적 출력 차이를 검출하기 위한 기준 전극(220), 검출 대상 기질과 반응하는 효소(230), 상기 효소가 고정되는 효소 고정막(240) 및 상기 효소와 기질의 반응을 매개하는 전해질(250)을 포함한다. 전해질 중 효소-기질의 반응에 따라 변화된 이온 농도는 정전 용량의 변화와 같은 전기적 특성으로 나타나는데 이러한 전기적 특성은 임피던스의 크기 변화로 출력될 수 있다. 상기 임피던스 크기 변화를 산출하기 위해 본원 발명에 따른 바이오 센서는 임피던스 검출기(260)가 더 포함될 수 있다. 다른 실시형태에 따르면 본원 발명에 따른 바이오 센서는 효소가 부착되는 고정막을 별도로 구비하지 않고 효소를 센싱 전극의 표면인 감응막(130)에 직접 고정시킬 수 있다(도 4).
본 발명의 일 실시예에 있어서 상기 효소는 검출하고자 하는 기질의 종류에 따라 다양하게 선택될 수 있다. 바람직하게는 기질과 반응하여 수소 이온을 생성하는 것으로서 바람직하게는 산화효소 또는 탈수소효소인 것이다.
다음은 산화 효소 및 탈수소 효소의 반응 메커니즘을 도식화하여 나타낸 것으로 반응의 최종 산물로 수소 이온(H+)이 생성된다.
산화효소(oxidase)
효소 반응: 기질+ O2 → 산물 + H2O2
과산화수소의 산화반응 : H2O2 → O2 + 2H+ + 2e-
탈수소효소(dehydrogenase)
효소반응: [S]+NAD(P+) → [P] + NAD(P)H
전기화학적 반응 : NAD(P)H → [P] + NAD(P+)+ H+ + e-
상기 반응식을 통해 알 수 있는 바와 같이 효소-기질 반응을 통해 수소 이온이 발생되어 전해질 중 수소 이온 농도가 증가하면 이를 이온 감응막이 감지하게 되고 기준전극과 센싱전극간 정전 용량의 변화인 전기적 특성 변화가 발생한다. 상기와 같이 반응 전/후의 정전 용량의 변화 정도를 측정하여 기질의 존재 또는 기질의 양을 확인할 수 있다. 구체적으로는 상기 바이오 센서의 일단에 임피던스 분석장치를 구비하고 상기 정전 용량 변화에 따른 전기적 신호를 상기 장치에 의해 검출할 수 있다.
상기 효소는 탈수소효소는 구체적으로 글루코스 산화효소, 글루코스 탈수소효소, 젖산 산화효소, 알코올 산화환원 효소, 알데히드 탈수소효소, CH-CH 산화환원 효소, 아미노산 산화환원 효소, CH-NH 산화환원 효소, 락테이트 탈수소효소, 락토오스 탈수소효소, 피루베이트 탈수소효소, 포르메이트 탈수소효소 및 포름알데히드 탈수소효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것이다.
상기 기질은 상기 바이오 센서를 이용해서 검출하고자 하는 생체 생리 활성 물질인 것으로서 상기 효소와 반응하여 수소 이온을 발생하는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다.
예를 들어 본원 발명에 따른 바이오센서가 글루코오스 산화효소(GOD)를 포함하는 것이면 상기 바이오-센서는 준비된 시료 중 글루코오스가 포함되었는지 확인하는데 사용될 수 있다. 글루코오스가 글루코오스 산화효소와 반응하면 과산화수소와 글루코노락톤 (C6H10O7)이 생성되고 상기 글루코노락톤이 가수분해되어 글루콘산C6H12O7을 생성한다(하기 식 (1) 참조). 후속적으로 상기 글루콘산은 해리되어 수소이온을 생성한다(하기 식 (2) 참조).
C6H12O6＋H2O → C6H12O7 ........(1)
C6H12O7 → C6H11O7 － ＋ H＋........(2)
본원 발명에 따른 바이오 센서는 상기 효소를 고정하기 위한 효소 고정막을 구비할 수 있다. 상기 효소 고정막으로는 단백질인 효소가 안정적으로 고정될 수 있는 것이면 폴리에틸렌과 같은 고분자 수지, 탄소나노튜브, 금(Au)와 같은 금속 등 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 전해질은 염화칼륨(KCl)용액, 염화나트륨(NaCl) 용액 또는 묽게 희석된 황산(diluted H2SO4)용액 중에서 선택된 어느 하나의 용액을 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기 기준 전극은 상기 전해질 용액의 전위를 고정시키기 위한 것으로서 상기 전해질 용액과 연결되는 것이 바람직하다. 상기 기준 전극으로는 백금 또는 Ag/AgCl으로 형성되는 것이 바람직하다.
이상에서는 본 발명의 바람직한 실시 예에 대하여 도시하고 설명하였지만, 본 발명은 상술한 특정의 실시 예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에 의해 다양한 변형실시가 가능한 것은 물론이고, 이러한 변형 실시 예들은 본 발명의 기술적 사상이나 전망으로부터 개별적으로 이해되어서는 안될 것이다.
본 발명은 효소-기질 반응에 의한 이온 변화에 따른 전하 발생/소멸에 의한 정전용량 변화를 전기적 신호로 검출하는 바이오-센서에 대한 것이다.

Claims (8)

  1. 일측면상에 금속 산화물 나노 구조체가 형성된 도전성 기판; 및 상기 나노 구조체의 표면에 형성된 이온 감응막;으로 구성된 바이오 센서용 센싱 전극.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 도전성 기판은 알루미늄, 티타늄, 아연, 주석, 니오븀, 텅스텐 및 탄탈륨으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것인, 센싱 전극.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 이온 감응막은 수소 이온의 검출을 위한 것인, 센싱 전극.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 금속 산화물 나노 구조체는 도전성 기판에 양극 산화법을 적용하여 형성되는 것인, 센싱 전극.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 이온 감응막은 Si3N4, Ta2O5 및 HfO2로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것인, 센싱 전극.
  6. 기질과 반응하여 수소를 발생시키는 효소;
    상기 효소가 고정된 생체 고정막;
    제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 센싱 전극 및 기준 전극; 및
    전해질;을 포함하며,
    상기 센싱 전극의 정전용량의 변화량을 측정하여 피검출물을 검출하는 바이오 센서.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 정전 용량의 변화량을 측정하기 위한 임피던스 분석기를 더 포함하는 것인, 바이오 센서.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 효소는 글루코스 산화효소, 글루코스 탈수소효소, 젖산 산화효소, 알코올 산화환원 효소, 알데히드 탈수소효소, CH-CH 산화환원 효소, 아미노산 산화환원 효소, CH-NH 산화환원 효소, 락테이트 탈수소효소, 락토오스 탈수소효소, 피루베이트 탈수소효소, 포르메이트 탈수소효소 및 포름알데히드 탈수소효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 바이오 센서.
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