WO2012174970A1 - pIgR作为肿瘤早期复发和/或转移的分子标志物和抗肿瘤转移的药物干预靶点的用途 - Google Patents

pIgR作为肿瘤早期复发和/或转移的分子标志物和抗肿瘤转移的药物干预靶点的用途 Download PDF

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丁健
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Definitions

  • Plg as a molecular marker for early recurrence and/or metastasis of tumors and anti-tumor metastasis
  • the present invention relates to the field of biomedicine, and in particular to the use of an antibody against a plgR protein for the preparation of a diagnostic agent for the diagnosis or prediction of recurrence and/or metastasis of a tumor; and for the plgR protein or its 662-735 segment or 680 -735 use of a substance whose expression is down-regulated in the preparation of a therapeutic agent for preventing and/or treating recurrence and/or metastasis of a tumor; and an antisense oligonucleotide or RNA interference fragment or stable production of RNA interference The expression vector of the fragment.
  • Malignant tumors are one of the major diseases that seriously threaten human life.
  • the metastasis of tumors is the main cause of death in cancer patients.
  • Data indicate that 90% of malignant tumor patients die from tumor metastasis and recurrence.
  • studies on the progress of tumor metastasis and recurrence, especially the study of tumor recurrence and metastasis molecular markers have been the focus of tumor recurrence and metastasis research. Therefore, finding new biomarkers for early diagnosis, predicting metastasis, and new target molecules for intervention therapy is an effective means to improve the cure rate and survival rate of cancer patients.
  • the important significance has become a challenging and significant area in life sciences and medical research.
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • the inflammatory microenvironment (especially the chronic inflammatory microenvironment), as an important physiological event in response to infection or stimuli, has an important role in promoting the development of EMT. Become an organ fibrosis, tumor, etc. Common pathological features of large pathological processes.
  • the polyimmunoglobulin receptor belongs to the type I transmembrane glycoprotein and is divided into an intracellular region (ie C-terminal 662-764 amino acids), an extracellular region (ie N-terminal 19-638 amino acids) and a transmembrane region ( 639-661 amino acids) three parts (P01833, UniProtKB/Swiss-Prot database). plgR plays an important role in both innate and acquired immunity by mediating the polar transport of intracellular polyimmunoglobulin dlgA/pIgM.
  • plgR is located on the basal membrane of glandular epithelial cells and hepatocytes (some species) and is usually up-regulated by the inflammatory environment to protect against viral or pathogen infection.
  • plgR polyimmunoglobulin receptor
  • the present invention provides a method for diagnosing or predicting recurrence and/or metastasis of a tumor by detecting expression of a plgR protein; and the present invention provides a plgR protein or a 662-735 segment or a 680-735 segment thereof by utilizing A method in which a protein is down-regulated to prevent and/or treat tumor recurrence and/or metastasis.
  • the invention provides the use of an antibody against a plgR protein for the preparation of a diagnostic agent for the diagnosis or prediction of recurrence and/or metastasis of a tumor.
  • diagnosis agent as used in the present invention can be used both to diagnose early tumor recurrence and/or metastasis, and to predict the risk of tumor recurrence and/or metastasis.
  • the antibody against the plgR protein is selected from the group consisting of an antibody against the plgR full-length protein, an antibody against the plgR intracellular region, and an antibody against the plgR extracellular region, but is not limited thereto. More preferably, the antibody against the plgR protein may be an antibody against the intracellular region of plgR. Most preferably, the antibody to the plgR protein is an antibody directed against a 662-735 segment or a 680-735 segment of the protein on plgR.
  • the method for diagnosing or predicting tumor recurrence and/or metastasis by detecting the expression of plgR protein comprises the steps of: taking tumor tissue, using an antibody against plgR, using the immunohistochemical method or immunoblotting described in the examples The method detects the expression of plgR protein.
  • the present invention provides a kit for diagnosing or predicting recurrence and/or metastasis of a tumor, characterized in that the kit comprises an antibody against a plgR protein.
  • the present invention provides the use of a substance which down-regulates plgR protein expression for the preparation of a therapeutic agent for preventing and treating recurrence and/or metastasis of a tumor.
  • the present invention provides a substance for downregulating 662-735 segment or 680-735 segment protein expression of a plgR protein in the preparation of a medicament for preventing and/or treating recurrence and/or metastasis of a tumor use.
  • the substance which down-regulates the expression of the PG-735 or 680-735 protein of the plgR protein is an antisense oligonucleotide or an RNA interference fragment or an expression vector stably generating an RNA interference fragment.
  • the antisense oligonucleotide or RNA interference fragment or an expression vector stably producing an RNA interference fragment is a single-stranded or double-stranded design targeting a 662-735 segment or a 680-735 segment protein on plgR having a targeting sequence
  • the antisense oligonucleotide or RNA interference fragment or an expression vector stably producing an RNA interference fragment comprises targeting Sequence of 13-24 nucleotide sequences.
  • the antisense oligonucleotide or the RNA interference fragment or the expression vector stably generating the RNA interference fragment is targeted to the template sequence as follows:
  • the tumor is selected from the group consisting of liver cancer, colorectal cancer, prostate cancer, gastric cancer, lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, kidney cancer, bladder cancer, ovarian cancer, glioma, melanoma. , head and neck cancer, cholangiocarcinoma, nasopharyngeal cancer and thyroid cancer. More preferably, the tumor is liver cancer, colorectal cancer, prostate cancer, gastric cancer or lung cancer.
  • a method for preventing and/or treating tumor recurrence and/or metastasis using a substance which down-regulates the expression of PG-735 or 680-735 protein of the plgR protein comprises the following steps: using a drug delivery system, delivering a drug An oligonucleotide (such as a small RNA) interferes with the fragment to the target organ.
  • a drug delivery system delivering a drug
  • An oligonucleotide such as a small RNA
  • the present invention provides an antisense oligonucleotide or an RNA interference fragment or an expression vector stably producing an RNA interference fragment, or the antisense oligonucleotide or RNA interference fragment is stabilized
  • An expression vector for generating an RNA interference fragment is a single-stranded or double-stranded nucleotide fragment designed to target the sequence of the 662-735 or 680-735 segment of the plgR, or is capable of stably producing the above-described characteristics.
  • An expression vector for a nucleotide fragment, preferably, the antisense oligonucleotide or RNA interference fragment or an expression vector stably producing an RNA interference fragment comprises targeting Sequence of 13-24 nucleotide sequences.
  • the antisense oligonucleotide or the RNA interference fragment or the expression vector stably generating the RNA interference fragment is targeted to the template sequence as follows:
  • FIG. 1 is a graph showing the correlation between the expression of plgR protein and recurrence within two years after liver cancer.
  • Fig. 2 is a diagram showing that the high expression of plgR protein is particularly significant in the early stage of liver cancer in patients with liver cancer after two years of recurrence and metastasis;
  • FIG. 2A shows that high expression of plgR protein is postoperative for liver cancer patients. The indication of recurrence and metastasis rate in two years is particularly significant in patients with liver cancer without cancerous plug;
  • Figure 2B shows that the high expression of plgR protein is indicative of recurrence and metastasis rate in patients with liver cancer after two years of surgery.
  • FIG. 2C shows that the high expression of plg protein is particularly significant for liver cancer patients with a tumor tumor diameter of less than 5 cm;
  • 2D is a graph showing that the high expression of plgR protein is indicative of recurrence and metastasis rate in patients with liver cancer in two years after liver cancer in patients with stage I TNM.
  • Fig. 3 is a diagram showing that high expression of plgR can significantly promote malignant transformation of EMT (cell morphology, EMT marker protein, exercise ability); wherein, Fig. 3A is a graph showing the effect of the expression level of plgR on cell morphology; Figure of the effect of plgR expression levels on EMT-associated marker proteins; Figures 3C and 3D are graphs showing the effect of plgR expression levels on cell motility.
  • Figures 6A and 6B show that the 662-735 and 680-735 protein domains of plgR are induced by plgR A map of two important functional regions of EMT malignant transformation.
  • Figure 7 is a diagram showing that high expression of plg in different primary and different tissue-derived primary cells and cell lines can promote malignant transformation of EMT; wherein, Figure 7A shows high expression of plgR in hepatoma cell line BEL-7402 and hepatocyte LO2.
  • Figure 7B is a graph showing that high expression of plgR in lung cancer cells H1650 can promote malignant transformation of EMT;
  • Figure 7C is a graph showing that high expression of plgR in human umbilical vein endothelial cells HUVEC can promote malignant transformation of EMT;
  • 7D is a graph showing that high expression of plgR in mouse embryonic fibroblast MEF can promote malignant transformation of EMT.
  • the present inventors used immunohistochemical technique to detect the expression of plgR protein in 254 paraffin sections of liver cancer.
  • the results showed that the high expression of plg was closely related to the recurrence and metastasis rate of liver cancer 2 years after operation, and the high expression of plgR was liver cancer patient 2 Independent risk factors for recurrence and metastasis.
  • the inventors analyzed the relationship between the expression level of plgR and different clinicopathological features of liver cancer. The results showed that the high expression of plgR has a significant significance in the early stage of liver cancer in the early stage of liver cancer.
  • plgR high expression cell line is inoculated into severe combined immunodeficiency (SCID) mice.
  • SCID severe combined immunodeficiency
  • 662-735 and 680-735 protein domains of plgR are two important functional regions of plgR-induced malignant transformation of EMT.
  • the high expression of plgR in the original cells and cell lines of different species and different tissue sources led to the occurrence of EMT, indicating that plgR induced EMT transformation is a common phenomenon.
  • plgR EMT-inducing factor
  • Example 1 Relationship between plg and clinical features of tumors and correlation between plgR and tumor malignant transformation marker molecules
  • the liver cancer tissue specimen used in the present invention is derived from hepatocellular carcinoma patients confirmed by surgical resection and pathological examination at Zhongshan Hospital of Fudan University Cancer Research Institute. When the specimens are collected, the fresh tissue specimens removed during the operation are taken, and the specimens are taken immediately after cutting, and quickly placed in liquid nitrogen, and then stored in a refrigerator at -70 ° C for use. Each patient was treated with primary liver cancer and adjacent tumor-free liver tissue. The adjacent tumor-free liver tissue was taken as far as possible from the main tumor (outside 2 cm).
  • the donors of the liver cancer tissue specimens used in the present invention have the following characteristics: (1) pathologically confirmed hepatocellular carcinoma; (2) surgery is radical resection, the criteria are: complete resection of the tumor, histological examination of negative margin; (3) The patient's clinical case data and follow-up data are complete and reliable. All patients' specimens were obtained with the consent of the Zhongshan Hospital Ethics Committee, obtaining the patient's consent and signing the informed consent form.
  • Tumor recurrence is divided into early recurrence and late recurrence (late Recurrence), with two years after surgery, relapsed into early recurrence within two years, and relapsed into late relapse after two years.
  • Specimen selection According to the pathological number of the surgically removed specimen of the selected case, the corresponding paraffin-embedded specimen is taken out, including liver tumor tissue and corresponding adjacent tissues;
  • tissue array block is heated and fused in a 52 ° C constant temperature oven to closely connect the tissue core to the acceptor wax block;
  • tissue array block is sliced with a fully automatic tissue microtome at a feed rate of 4 ⁇ m/rev, and the slice is attached to the imported slide glass for the anti-offlet treatment;
  • the array slice is placed in a constant temperature oven at 60 ° C for 16 hours;
  • the tissue chip is extracted by HE every 10 sheets for HE staining
  • the pathologist conducts a follow-up quality check on each tissue sample in the sample tissue chip, and the result is input into the tissue chip database by the Ministry of Information;
  • tissue chip is baked in a oven at 92 ° C for 30 min; the wet box is pre-warmed; 2) De-waxed (pre-warmed) 100% xylene in two cylinders in turn, each at 37 ° C for 20 min;
  • RESULTS The tissue microarrays of HE staining and immunohistochemical staining were observed by two pathologists who did not know the clinical situation of the patients. The same chip was read by double-blind method. The sera staining intensity and area were scored.
  • the data were analyzed by SPSS16.0 software. One-way ANOVA was used to compare the differences between the groups. The positive rate was compared using the chi-square test or Fisher's exact probability method. The survival rate was Kaplan-Meier. Method calculation, comparison of survival differences using Log-rank test. Cox proportional hazards models were used to assess variables that influence postoperative prognosis. p ⁇ 0.05, the difference was significant.
  • the present inventors previously used immunohistochemical techniques to detect the expression of plgR protein in 254 hepatic paraffin sections. The results showed that the recurrence and metastasis rate of the plgR high expression group was significantly higher than that of the plgR low expression group (Fig. 1). And high expression of plgR is an independent risk factor for 2-year recurrence and metastasis of liver cancer patients
  • the pcDNA3.1 empty vector plasmid (Invitrogen) and pcDNA3.1-pIgR plasmid (a gift from Dr. Finn-Eirik Johansen) were transfected into dog kidney epithelial cells MDCK cells (ATCC), transfected for 48 hours, and screened with neomycin G418. , obtained resistant cell lines - MDCK-mock and MDCK-pIgR.
  • the inventors designed and cloned sequences homologous to other genes in the genome according to the interference fragment design principle and the sequence of plgR, and obtained three ideal interference fragment template targets.
  • a shNA interference fragment having a hairpin structure was generated according to Ambion's instructions and cloned into the pSilencer2.1-U6 vector.
  • MDCK-pIgR cells were transfected into three interfering plasmids and negative control plasmids, designated shRNA shRNA2, shRNA3 and con. shRNA. 48 hours after transfection, the puromycin puro was screened to obtain resistant cell lines - MDCK-pIgR, MDCK-pIg -sh NAl , MDCK-pIg -sh NA2 , MDCK-pIg -sh NA3 , MDCK- pIgR-con.shRNA.
  • the pBABE-puro empty vector plasmid (Addgene) and pBABE-puro-pIgR plasmid were transfected into SMMC-7721 cells (biochemical cell bank), respectively, 48 hours after transfection.
  • the puromycin puro was screened to obtain a resistant cell line - SMMC-7721 and SMMC-7721-pIgR.
  • the above-mentioned dog kidney epithelial cells MDCK and liver cancer cells SMMC-7721 series engineered plgR expressing cell lines [MDCK series: empty vector control group (MDCK-mock), plg high expression group (MDCK-pIgR), interference control group (MDCK-pIgR) -con.shRNA), plg interference group (MDCK-pIgR-shRNA1, MDCK-pIg-shNA2, MDCK-pIg-sh NA3); SMMC-7721 series: empty vector control group (SMMC-7721 -mock), plg high
  • the expression group (SMMC-7721 -plgR)] was inoculated into a 12-well plate overnight, and after cell attachment was stretched, the cell morphology was observed under an optical microscope.
  • SMMC-7721-pIg inoculated in a 12-well plate, after the degree of fusion reached 80%, collect the cells, wash once with cold PBS (containing 1 mM sodium vanadate), add l xSDS gel loading buffer (50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2% SDS, 10% glycerol, 1 mM sodium vanadate, 0.1% bromophenol blue) lysed cells. The cell lysate was heated in a boiling water bath for 10 minutes and then centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes at 4 °C.
  • PBS containing 1 mM sodium vanadate
  • l xSDS gel loading buffer 50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2% SDS, 10% glycerol, 1 mM sodium vanadate, 0.1% bromophenol blue
  • the supernatant was taken for SDS-PAGE electrophoresis.
  • the protein was transferred to a nitrocellulose membrane (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL, USA) using a semi-dry electrotransfer system, and the nitrocellulose membrane was placed in a blocking solution. (5% skimmed milk powder diluted in TBS/T containing 1 mM sodium vanadate) was blocked at room temperature for 1 hour, and then the membrane was placed on an anti-plgR antibody (Santa Cruz, Cat.
  • MDCK series empty vector control group (MDCK-mock), plg high expression group (MDCK-pIg), interference control group (MDCK-pIgR) Con.sh NA )
  • plg interference group MDCK-pIgR shRNA1 , MDCK
  • SPF-grade severe combined immunodeficiency mice 4 to 6 weeks old, weighing 16 to 20 grams, were provided by the Shanghai Experimental Animal Center of the Chinese Academy of Sciences. Naked mice are kept in the absence of special pathogens, and the photos are replaced every 12 hours. The feed and water can be used after disinfection. All experiments were strictly in accordance with the ethical standards for animal feeding and use.
  • mice were randomly divided into 4 groups, empty vector control group (MDCK-mock), plgR high expression group (MDCK-pIgR), interference The control group (MDCK-pIgRcon.shRNA) and the plgR interference group (MDCK-pIgR shRNA3) were each in each group of 5.
  • the cells prepared according to the method of Example 2 (MDCK-mock, MDCK-pIgR, MDCK-pIgR con.sh NA, MDCK-pIgR sh NA3) were respectively digested and diluted with PBS to a concentration of 2.5 ⁇ 10 6 /200.
  • SMMC-7721 series plgR expressing cell lines Animals were randomly divided into 2 groups, empty vector control group (SMMC-7721-mock) and plg high expression group (SMMC-7721-pIg). 5 only.
  • the cells prepared according to the method of Example 2 (SMMC-7721-mock, SMMC-7721-pIg) were digested and diluted with PBS to a concentration of lx10 6 /200 ⁇ L, and 200 cell suspensions were injected through the tail vein.
  • Group SCID mice in vivo. After 10 weeks, the mice were sacrificed, the lungs were taken, and the lung tissues were fixed in 4% paraformaldehyde for more than 24 hours. The number of total metastatic nodules on the 5 lungs of each lung was recorded under a dissecting microscope, and a histogram was made and made. The t test calculates the statistical difference. #p ⁇ 0.05, mock group vs. plg group.
  • the inventors used the pcDNA3.1-pIgR plasmid (a gift from Dr. Finn-Eirik Johansen) as a template to construct a plgR (662-735) expression plasmid and a plgR (680-735) expression plasmid [pcDNA3.1] according to conventional methods of molecular biology.
  • -pIgR (662-735) and pcDNA3.1-pIgR (680-735) MDCK or SMMC-7721 cells were seeded in 12-well plates at a concentration of 80%, and transfected with p C DNA3.1 empty vector plasmid, pcDNA3.1-pIgR expression plasmid, pcDNA3.1, respectively.
  • -pIg (662-735) expression plasmid and pcDNA3.1-pIgR (680-735) expression plasmid.
  • the cells were collected, washed once with cold PBS (containing 1 mM sodium vanadate), and added to l xSDS gel.
  • the cells were lysed by loading buffer (50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2% SDS, 10% glycerol, 1 mM sodium vanadate, 0.1% bromophenol blue).
  • the cell lysate was heated in a boiling water bath for 10 minutes at 4. Centrifuge at 12,000 rpm for 10 minutes.
  • the supernatant was taken for SDS-PAGE electrophoresis.
  • the protein was transferred to a nitrocellulose membrane (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL, USA) using a semi-dry electrotransfer system, and the nitrocellulose membrane was placed in a blocking solution. (5% skim milk powder diluted in TBS/T containing 1 mM sodium vanadate) was blocked at room temperature for 1 hour, and then the membrane was placed in anti-E-cadherin antibody (BD) or anti-Pan-cytokeratin antibody (Sigma) or anti-Vimentin antibody ( Abeam) or anti-Fibronectin antibody (Abeam) or anti-GAPDH antibody (kangchen) was blocked overnight at 4 °C.
  • BD anti-E-cadherin antibody
  • anti-Pan-cytokeratin antibody Sigma
  • anti-Vimentin antibody Abeam
  • Abeam anti-Fibronectin antibody
  • Abeam anti-GAPDH antibody
  • Example 5 Effect of purine expression of plg on malignant transformation of EMT in primary cells and cell lines of different species and different tissue sources
  • Hepatoma cell line BEL-7402 (biochemical cell bank), liver cell LO2 (biochemical cell line) Cell bank), lung cancer cell H1650 (ATCC), human umbilical vein endothelial cell HUVEC (ATCC) and mouse embryonic fibroblast MEF (ATCC) were seeded in 12-well plates, respectively. When the degree of fusion reached 80%, liposome was used.
  • the plasmid was transfected with pcDNA3.1 empty vector plasmid (Invitrogen), pcDNA3.1-pIg expression plasmid (a gift from Dr. Finn-Eirik Johansen), and after 48 hours, cells were collected using cold PBS (containing 1 mM sodium vanadate).
  • l xSDS gel loading buffer 50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2% SDS, 10% glycerol, 1 mM sodium vanadate, 0.1% bromophenol blue. After the cell lysate was heated in a boiling water bath for 10 minutes, it was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes at 4 °C.
  • the supernatant was taken for SDS-PAGE electrophoresis.
  • the protein was transferred to a nitrocellulose membrane (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL, USA) using a semi-dry electrotransfer system, and the nitrocellulose membrane was placed in a blocking solution. (5% skimmed milk powder diluted in TBS/T containing 1 mM sodium vanadate) was blocked at room temperature for 1 hour, and then the membrane was placed on an anti-plgR antibody (Santa Cruz, Cat.
  • plgR induces EMT. Conversion is a common phenomenon.

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Abstract

本发明公开了plgR作为诊断或预测肿瘤早期复发和/或转移的分子标志物和抗肿瘤转移的药物干预靶点的用途。具体而言，本发明提供了针对plgR蛋白的抗体在制备用于诊断或预测肿瘤早期复发和/或转移的诊断剂中的用途。此外，本发明还提供了使plgR蛋白表达下调的物质在制备用于预防和/或治疗肿瘤的复发和/或转移的药物中的用途。此外，本发明还提供了一种反义寡聚核苷酸或者RNA干扰片段或者稳定产生RNA干扰片段的表达载体。

Description

plg 作为肿瘤早期复发和 /或转移的分子标志物和抗肿瘤转移
的药物干预靶点的用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及针对 plgR蛋白的抗体在制备 用于诊断或预测肿瘤的复发和 /或转移的诊断剂中的用途； 以及使 plgR蛋白 或者其 662-735段或 680-735段蛋白表达下调的物质在制备用于预防和 /或治 疗肿瘤的复发和 /或转移的治疗药物中的用途； 以及一种反义寡聚核苷酸或者 RNA干扰片段或者稳定产生 RNA干扰片段的表达载体。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类生命的主要疾病之一， 肿瘤的转移则是造成癌 症患者死亡的主要原因。 有资料表明 90%的恶性肿瘤患者死于肿瘤的转移和 复发。 目前有关肿瘤转移复发进展的研究， 特别是肿瘤复发转移分子标志物 的研究一直是肿瘤复发转移研究的热点。 因此， 找到用于早期诊断、 预测转 移的新的生物标志物和用于干预治疗的新的靶分子， 是提高肿瘤患者治愈率 与生存率的行之有效的手段， 对于肿瘤的诊断和治疗具有重要的意义， 已成 为当今生命科学和医药研究中极富挑战性且意义重大的领域。
在肿瘤转移的研究中， 上皮间质转化 ( epithelial-mesenchymal transition, EMT)近来受到越来越多的关注。 EMT是指具有极性的上皮特征的细胞转换 成具有活动能力、 能够在细胞基质间自由移动的具有间质特征细胞的过程。 上皮细胞表型转化过程是由精细的细胞内信号转导机制调控， 与多种慢性疾 病 （特别是肿瘤的发生、 浸润和转移） 密切相关， 因此成为肿瘤研究中前沿 的热点。 EMT 的发生不仅取决于细胞本身特性， 同时受到细胞微环境 ( microenvironment) 的调节。 越来越多的研究表明， 炎性微环境（尤其是慢 性炎症微环境）， 作为机体免疫系统对感染或剌激响应的重要生理事件， 在 EMT的发生发展过程中具有重要的促进作用， 已成为器官纤维化、肿瘤等重 大病理过程转化的共有病理特征。
多聚免疫球蛋白受体 （plgR) 属于 I型跨膜糖蛋白， 分为胞内区 （即 C 末端 662-764氨基酸）、胞外区（即 N末端 19-638氨基酸）和跨膜区（639-661 氨基酸）三个部分（P01833, UniProtKB/Swiss-Prot数据库）。 plgR通过介导 细胞内多聚免疫球蛋白 dlgA/pIgM的极性转运， 在先天与后天免疫中均发挥 了重要的作用。 plgR位于腺上皮细胞和肝细胞 （某些物种） 的基侧膜上， 通 常感受炎性环境上调， 抵御病毒或病原体感染。 事实上， 早在几十年前就有 plgR在肿瘤中表达的研究， 但表达水平高低不一， 特别重要的是， 这种表达 的差异与肿瘤病人的临床预后尚未见报道。
发明内容
针对现有技术中存在的问题， 本发明人进行了广泛和深入的研究， 最终 完成本发明。
本发明的一个目的是提供了多聚免疫球蛋白受体 （plgR) 作为诊断或预 测肿瘤早期复发和 /或转移的分子标志物和 /或抗肿瘤转移的药物干预靶点的 用途。
为了实现上述目的，本发明提供了通过检测 plgR蛋白的表达来诊断或预 测肿瘤的复发和 /或转移的方法； 以及本发明提供了通过利用使 plgR蛋白或 者其 662-735段或 680-735段蛋白表达下调的物质来预防和 /或治疗肿瘤的复 发和 /或转移的方法。
根据本发明的一个方面，本发明提供了针对 plgR蛋白的抗体在制备用于 诊断或预测肿瘤的复发和 /或转移的诊断剂中的用途。
本发明中所用的术语 "诊断剂" 既可用来诊断肿瘤早期复发和 /或转移， 又可用来预测肿瘤复发和 /或转移的风险。
本发明中， 优选地， 所述针对 plgR蛋白的抗体选自针对 plgR全长蛋白 的抗体、针对 plgR胞内区的抗体和针对 plgR胞外区的抗体中，但不限于此。 更优选地， 所述针对 plgR蛋白的抗体可为针对 plgR胞内区的抗体。 最优选 地， 所述针对 plgR蛋白的抗体为针对 plgR上 662-735段或 680-735段蛋白 的抗体。
本发明中， 通过检测 plgR蛋白的表达来诊断或预测肿瘤的复发和 /或转 移的方法包括以下步骤： 取肿瘤组织， 利用 plgR的抗体， 采用实施例中所述 的免疫组化方法或者免疫印记方法检测 plgR蛋白的表达。
同时， 本发明提供了一种用于诊断或预测肿瘤的复发和 /或转移的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括针对 plgR蛋白的抗体。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了使 plgR蛋白表达下调的物质在 制备用于预防和治疗肿瘤的复发和 /或转移的治疗药物中的用途。
根据本发明的还一个方面， 本发明提供了使 plgR蛋白的 662-735段或 680-735 段蛋白表达下调的物质在制备用于预防和 /或治疗肿瘤的复发和 /或 转移的药物中的用途。
本发明中， 优选地， 所述使 plgR蛋白者其 662-735段或 680-735段蛋 白表达下调的物质为反义寡聚核苷酸或者 RNA干扰片段或者稳定产生 RNA 干扰片段的表达载体， 所述反义寡聚核苷酸或者 RNA干扰片段或者稳定产 生 RNA干扰片段的表达载体是针对 plgR上 662-735段或 680-735段蛋白设 计的单链或者双链的具有靶向该段序列表达的核苷酸片段， 或能够稳定产生 具有上述特性的核苷酸片段的表达载体。 更优选地， 所述反义寡聚核苷酸或 者 RNA 干扰片段或者稳定产生 RNA 干扰片段的表达载体包含靶向于 13-24个核苷酸序列的序列。
本发明中， 优选地， 所述反义寡聚核苷酸或者 RNA干扰片段或者稳定 产生 RNA干扰片段的表达载体， 靶向针对的模板序列如下：
模板序列 1, 5 '-AGAACGUCGACCGAGUUUCAAU-3 '；
模板序列 2， 5 '-ACGUCGACCGAGUUUCAAUCAG-3 '； 或
模板序列 3, 5 '-AGAAGAGUUUGUUGCCACCACU-3，。
本发明中， 优选地， 所述肿瘤选自肝癌、 结直肠癌、 前列腺癌、 胃癌、 肺癌、 乳腺癌、 胰腺癌、 宫颈癌、 肾癌、 膀胱癌、 卵巢癌、 神经胶质瘤、 黑 色素瘤、 头颈部癌症、 胆管癌、 鼻咽癌和甲状腺癌中。 更优选地， 所述肿瘤 为肝癌、 结直肠癌、 前列腺癌、 胃癌或肺癌。
本发明中， 利用使 plgR蛋白者其 662-735段或 680-735段蛋白表达下调 的物质来预防和 /或治疗肿瘤的复发和 /或转移的方法包括以下步骤： 以药物 运输系统， 输送反义寡聚核苷酸 (如小 RNA)干扰片段至靶器官。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种反义寡聚核苷酸或者 RNA 干扰片段或者稳定产生 RNA干扰片段的表达载体， 所述反义寡聚核苷酸或 者 RNA干扰片段或者稳定产生 RNA干扰片段的表达载体是针对 plgR上 662-735 段或 680-735段蛋白设计的单链或者双链的具有靶向该段序列表达 的核苷酸片段， 或能够稳定产生具有上述特性的核苷酸片段的表达载体， 优 选地， 所述反义寡聚核苷酸或者 RNA干扰片段或者稳定产生 RNA干扰片段 的 表 达 载 体 包 含 靶 向 于 13-24个核苷酸序列的序列。
本发明中， 优选地， 所述反义寡聚核苷酸或者 RNA干扰片段或者稳定 产生 RNA干扰片段的表达载体， 靶向针对的模板序列如下：
模板序列 1, 5 '-AGAACGUCGACCGAGUUUCAAU-3 '；
模板序列 2， 5 '-ACGUCGACCGAGUUUCAAUCAG-3 '； 或
模板序列 3, 5 '-AGAAGAGUUUGUUGCCACCACU-3，。
附图说明
图 1为说明 plgR蛋白的表达与肝癌患者术后两年内复发相关性的图。 图 2为说明 plgR蛋白的高表达对肝癌患者术后两年复发转移率的指征在 肝癌发生的早期尤其具有显著意义的图； 其中， 图 2A为显示 plgR蛋白的高 表达对肝癌患者术后两年复发转移率的指征在无癌栓的肝癌患者中尤其具有 显著意义的图； 图 2B为显示 plgR蛋白的高表达对肝癌患者术后两年复发转 移率的指征在肿瘤单发的肝癌患者中尤其具有显著意义的图； 图 2C为显示 plg 蛋白的高表达对肝癌患者术后两年复发转移率的指征在肿瘤瘤径小于 5cm的肝癌患者中尤其具有显著意义的图； 图 2D为显示 plgR蛋白的高表达 对肝癌患者术后两年复发转移率的指征在 TNM为 I期的肝癌患者中尤其具 有显著意义的图。
图 3为说明 plgR的高表达能够明显促进 EMT恶性转化（细胞形态、 EMT 标志蛋白、 运动能力） 的图； 其中， 图 3A为显示 plgR的表达水平对细胞形 态的影响的图； 图 3B为显示 plgR的表达水平对 EMT相关标志蛋白的影响 的图； 图 3C和图 3D为显示 plgR的表达水平对细胞运动能力的影响的图。
图 4和图 5均为说明 plgR高表达能够明显促进 SCID小鼠实验性肺转移 的图。
图 6A和 6B为说明 plgR的 662-735段和 680-735段蛋白域是 plgR诱导 EMT恶性转化的两个重要功能区域的图。
图 7 为说明在不同种属、 不同组织来源的原代细胞和细胞株中高表达 plg 均能促进 EMT恶性转化的图；其中，图 7A为显示在肝癌细胞 BEL-7402、 肝细胞 LO2中高表达 plgR能促进 EMT恶性转化的图； 图 7B为显示在肺癌 细胞 H1650中高表达 plgR能促进 EMT恶性转化的图； 图 7C为显示在人脐 静脉内皮细胞 HUVEC中高表达 plgR能促进 EMT恶性转化的图； 图 7D为 显示在小鼠胚胎成纤维细胞 MEF中高表达 plgR能促进 EMT恶性转化的图。 具体实施方式
本发明人利用免疫组化技术，检测了 254例肝癌石蜡切片中 plgR蛋白的 表达情况，研究结果表明， plg 高表达与肝癌术后 2年复发转移率密切相关， 且 plgR高表达是肝癌患者 2年复发转移的独立危险因素。继而发明人分析了 plgR表达水平与肝癌不同临床病理特征之间的关系，结果显示， plgR高表达 对肝癌患者 2年复发转移率的指征在肝癌发生的早期尤其具有显著的意义。 深入研究显示， 在细胞中高表达 plgR均能够显著诱导 EMT 的发生， 利用 shRNA干扰 plgR的表达， EMT发生明显逆转； 体内试验显示， plgR高表达 细胞株接种到重度联合免疫缺陷 （SCID) 小鼠中， 能够明显促进肺转移。 深 入研究发现， plgR的 662-735段及 680-735段蛋白域均是 plgR诱导 EMT恶 性转化的两个重要功能区域。 此外， 发明人在不同种属、 不同组织来源的原 代细胞和细胞株中高表达 plgR均能导致 EMT的发生， 表明 plgR诱导 EMT 转化是个共性现象。 发明人的研究首次揭示了一个全新的 EMT 诱导因子 plgR, 发现 plgR是肿瘤转移以及肿瘤早期复发的重要生物标志物和干预靶 标， 上述研究为肿瘤早期诊断与早期治疗提供了重要的实验依据， 同时为抗 肿瘤转移药物研究开发提供了一个新靶标。
下列实施例举例说明了发明人的标准实验室实践， 用于示范本发明的模 式， 而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。 实施例 1: plg 与肿瘤临床特征之间的关系以及 plgR与肿瘤恶性转化 标志分子之间的相关性
1、 实验方法
组织标本
本发明中所使用的肝癌组织标本来源于在复旦大学肝癌研究所中山医院 经外科手术切除及病理学检查证实的肝细胞肝癌患者。 收集标本时， 取手术 中切除的新鲜组织标本，标本切下后立即取材，迅速置于液氮中，然后置 -70°C 冰箱保存备用。 每例病人均取肝癌原发瘤及其相邻无瘤肝组织， 其中， 相邻 无瘤肝组织取距离主瘤尽可能远 （2cm以外） 的组织。
本发明中所使用的肝癌组织标本的供体均具有以下特点： （1 ) 病理证实 是肝细胞肝癌； （2) 手术为根治性切除， 标准为： 完全切除肿瘤， 组织学检 查切缘阴性； （3 ) 病人临床病例资料及随访资料完整可靠。 所有病人标本的 获取都经中山医院伦理委员会同意， 取得病人的同意并签署知情同意书。
临床病理资料及随访资料
所有病例均有完整的术后随访资料，随访截止时间到 2010年 4月 20日， 随访内容除了患者的一般资料， 包括年龄、 性别、 肝炎情况等， 还有肿瘤的 特征包括甲胎蛋白 （alpha-fetoprotein, AFP ) , 谷丙转氨酶 （ALT , alanine aminotransferase )、 肝硬化程度、 肿瘤大小、 有无包膜、 数目、 Edmondson分 级、 生存、 复发情况等， 部分病例进行了 CT、 M I和动脉造影检查和治疗 过程等； 在本研究中各个病例的组织标本经高年资病理医生诊断及复诊， 将 Edmondson I-II级归为分化好， III-IV级归为分化差； 肝癌复发标准： 根据影 像学、 血清学及组织学检查结果， 如出现 AFP增高、 肝脏占位以及远处转移 等典型复发征象， 结合临床表现及治疗、 随访情况确定是否为复发。
在无瘤生存（disease-free survival) 分析中， 我们对肿瘤早期复发事件进 行分析统计。 肿瘤复发分为早期复发 （early recurrence ) 和晚期复发 （late recurrence ) , 以术后两年为界， 两年内复发为早期复发， 两年后复发为晚期 复发。
组织芯片的制备及免疫组化染色
组织芯片构建：
1) 标本选择： 根据所选定病例的手术切除标本病理号将其相应的石蜡包 埋标本取出， 包括肝脏肿瘤组织和对应的癌旁组织；
2) HE染色切片病理诊断， 并标记病变组织的范围。 每个病例均经过高 年资病理科医生核对；
3) 按照实验目的设计组织芯片阵列的组织类型和排列方式；
4) 用组织包埋机制备合适的空白受体蜡块；
5) 用组织阵列仪按照阵列设计抽提病理蜡块组织芯并有规律的排列在 空白受体蜡块上；
6) 组织阵列块在 52°C恒温烤箱中加热融合， 使组织芯与受体蜡块紧密 相连；
7) 用全自动组织切片机以 20微米 /转的进刀速度对组织阵列块进行修整 蜡块， 直至 80%的组织芯完全曝露；
8) 用全自动组织切片机以 4微米 /转的进刀速度对组织阵列块进行切片， 切片裱附在防脱片处理的进口载玻片上；
9) 阵列切片置于 60°C恒温烤箱中烤片 16h;
10) 组织芯片按编号每隔 10张抽取一张作 HE染色；
11) 病理医生对抽检组织芯片中每一个组织样本进行复诊质检， 结果由 信息部输入组织芯片数据库；
12 ) 组织芯片实验白片保存在切片盒中， 置于冰箱 4°C冷藏室保存。 免疫组化方法， 实验步骤如下：
1) 组织芯片 92°C烘箱烘 30 min; 湿盒预温； 2) 依次置入两缸 100%二甲苯脱蜡 （预温）， 37°C各 20 min;
3) 于 100%、 95 %、 80%、 70%酒精中漂洗各 10 min， PBS漂洗 5 min;
4) 于现配 3 %H2O2-甲醇溶液中室温孵育 10 min, PBS漂洗 5 minx3次；
5) 加热 /微波抗原修复 5 minx2次:将芯片置入沸腾的抗原修复液 (0.01M 柠檬酸钠缓冲液， pH=6.0)中，再放入微波炉中加热，保持抗原修复液为 90°C 左右， 不能沸腾； 自然冷却至室温， 蒸馏水洗， PBS漂洗 5min;
6) 吸去芯片周围液体， 滴加封闭液 （10%绵羊血清一 PBS) 封闭， 置于 37°〇湿盒孵育25 11^11; 吸去封闭液， 勿洗；
7) 加入 plgR抗体（ Santa Cruz) 4°C孵育过夜（ 1： 300 )； PBS漂洗 3 minx3 次；
8) 加入辣根过氧化物酶标记的二抗 （即用型）， 37°C湿盒孵育 lh， PBS 漂洗 3 minx 3次；
9) 加入 DAB常温显色 （棕色） l-3 min， 镜下控制显色时间， 蒸馏水漂 洗， PBS漂洗 5min;
10) 苏木素复染 2 min， 镜下控制染色时间； 蒸馏水洗， PBS漂洗 5 min， 风干， 中性树胶封片， 显微镜下观察；
所有芯片染色均在相同条件下进行，每批染色均设阳性对照、空白对照； 阳性对照用已知染色阳性的肝癌组织进行， 结果为阳性； 空白对照用相当于 一抗浓度的血清代替一抗孵育组织切片， 结果为阴性。
结果观察： 由 2名不知患者临床情况的病理科医生观察 HE染色及免疫 组化染色之组织芯片， 采用双盲法分别对同一芯片判读。 按照胞浆染色强度 和面积进行评分。
数据分析：
应用 SPSS16.0软件分析所得数据，单因素方差分析比较组间差异； 阳性 率的差别比较使用卡方检验或 Fisher精确概率法， 生存率采用 Kaplan-Meier 法计算， 生存期差别的比较用 Log-rank检验。用 Cox比例风险模型评估影响 术后预后的各变量。 p<0.05， 差异有显著性。
2、 实验结果
本发明人前期利用免疫组化技术， 检测了 254 例肝癌石蜡切片中 plgR 蛋白的表达情况，结果显示， plgR高表达组术后 2年复发转移率显著高于 plgR 低表达组 （图 1 )， 且 plgR高表达是肝癌患者 2年复发转移的独立危险因素
…
(见下表 1 )。继而我们分析了 plgR表达水平与 HCC不同临床病理特征之间 的关系， 结果表明， plgR高表达对肝癌患者 2年复发转移率的指征在肝癌发 生的早期 （无癌栓、 肿瘤单发、 肿瘤瘤径小于 5cm或 TNM=I时） 尤其具有 显著的意义 （图 2)。
表 l . pIgR高表达是肝癌患者 2年复发转移的独立危险因素 复发生存率
HR (95% CI) P值
Ή·?1¾ { 5 ¾ vs. 1,76 ί1.07-2.92) 0.03
2.2S 0 -50-3,48) < 0.001
1 ,62 (1.07-≤.45) 0.024 实施例 2: plgR表达对上皮间充质转化的影响
1、 实验方法
各种 plgR表达细胞株的构建：
将 pcDNA3.1空载体质粒（Invitrogen)与 pcDNA3.1-pIgR质粒 (Finn-Eirik Johansen博士馈赠)分别转染狗肾上皮细胞 MDCK细胞 (ATCC),转染 48小时 后， 加新霉素 G418筛选， 获得具有抗性的阳性细胞株—— MDCK-mock和 MDCK-pIgR。
发明人根据干扰片段设计原则和 plgR的序列， 设计并通过 Blast软件排 除与基因组其他基因具有同源性的序列， 获得三个理想的干扰片段模板靶序 列：
模板序列 1, 5 '-AGAACGUCGACCGAGUUUCAAU-3 '；
模板序列 2， 5 '-ACGUCGACCGAGUUUCAAUCAG-3 '；
模板序列 3, 5 '-AGAAGAGUUUGUUGCCACCACU-3，。
针对上述模板靶序列， 按照 Ambion 的说明书， 生成具有发夹结构的 sh NA干扰片段， 并克隆入 pSilencer2.1-U6载体中。
将 MDCK-pIgR 细胞分别转染三个干扰质粒及阴性对照质粒， 命名为 shRNA shRNA2、 shRNA3和 con.shRNA。 转染 48小时后加嘌呤霉素 puro 进行筛选 ， 获得具有抗性 的 阳 性细胞株—— MDCK-pIgR， MDCK-pIg -sh NAl ， MDCK-pIg -sh NA2 ， MDCK-pIg -sh NA3 ， MDCK-pIgR-con.shRNA。
将 pBABE-puro空载体质粒 （Addgene) 与 pBABE-puro-pIgR质粒 (分子 生物学常规方法克隆构建获得)分别转染肝癌细胞 SMMC-7721 细胞 (生化细 胞所细胞库)， 转染 48小时后， 加嘌呤霉素 puro筛选， 获得具有抗性的阳性 细胞株—— SMMC-7721禾 Π SMMC-7721-pIgR。
( 1 ) plgR对细胞形态的影响
上述狗肾上皮细胞 MDCK及肝癌细胞 SMMC-7721系列工程构建 plgR 表达细胞株【MDCK系列： 空载体对照组 （MDCK-mock)、 plg 高表达组 ( MDCK-pIgR )、 干扰对照组 （ MDCK-pIgR-con.shRNA )、 plg 干扰组 ( MDCK-pIgR-shRNAl、 MDCK-pIg -sh NA2、 MDCK-pIg -sh NA3 )； SMMC-7721 系列： 空载体对照组 （SMMC-7721 -mock )、 plg 高表达组 ( SMMC-7721 -plgR) ], 接种于十二孔板， 过夜， 细胞贴壁伸展后， 光学显 微镜观察细胞形态。
(2) pIgR对上皮细胞间充质标志分子的影响（免疫印记法， western blot) 上述狗肾上皮细胞 MDCK及肝癌细胞 SMMC-7721系列工程构建 plgR 表达细胞株【MDCK系列： 空载体对照组 （MDCK-mock)、 plg 高表达组 ( MDCK-pIg ) , 干扰对照组 （ MDCK-pIgR-con.shRNA )、 plg 干扰组 ( MDCK-pIg -sh NAl、 MDCK-pIg -sh NA2、 MDCK-pIg -sh NA3 )； SMMC-7721 系列： 空载体对照组 （SMMC-7721-mock)、 plg 高表达组
( SMMC-7721-pIg ) ], 接种于十二孔板， 融合度达到 80%后， 收集细胞， 用冷的 PBS (含 1 mM钒酸钠)洗一次， 加入 l xSDS凝胶上样缓冲液 （50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2% SDS, 10%甘油， I mM钒酸钠， 0.1% 溴酚蓝)裂解细胞。 细胞裂解物在沸水浴中加热 10分钟后， 于 4°C 12000 rpm 离心 10分钟。
取上清液进行 SDS-PAGE电泳， 电泳结束后， 用半干电转移系统将蛋白 转移至硝酸纤维素膜 (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL， USA), 将硝酸纤维素膜置于封闭液 (5%脱脂奶粉稀释于含 ImM 钒酸钠的 TBS/T)中 室温封闭 1小时， 然后将膜置于抗 plgR抗体 (Santa Cruz, 货号: sc-51694、 sc-20487、 sc-20485 或 sc-20656)或者抗 E-cadherin 抗体（BD)或者抗 Pan-cytokeratin抗体 (Sigma)或者抗 Vimentin抗体 (Abeam)或者抗 Fibronectin 抗体 (Abeam)或者抗 GAPDH抗体 (kangchen)中 4°C封闭过夜。用含 ImM钒酸 钠的 TBS/T洗涤三次， 每次 15分钟。 将膜置于二抗 (1 :2000)溶液中室温反应 1-2小时。 同上洗膜三次后， 用 ECL试剂发色， 压片， 显影。
(3 ) plgR对细胞运动能力的影响
上述狗肾上皮细胞 MDCK及肝癌细胞 SMMC-7721系列工程构建 plgR 表达细胞株【MDCK系列： 空载体对照组 （MDCK-mock)、 plg 高表达组 ( MDCK-pIg ) , 干扰对照组 （MDCK-pIgR con.sh NA ) , plg 干扰组 ( MDCK-pIgR shRNAl、 MDCK-pIgR shRNA2、 MDCK-pIgR sh NA3 )； SMMC-7721 系列： 空载体对照组 （SMMC-7721 -mock )、 plg 高表达组 ( SMMC-7721 -plgR) ], 接种于二十四孔板。 待细胞生长至一层致密的单细 胞层时， 取一 20(^L枪头， 于每孔中划出一道划痕， 并将培养液换成新鲜无 血清 RPMI-1640培养液 （Invitrogen)。 分别于 0、 3、 6、 9小时拍照， 进行比 较。 使用 Zeiss LSM Image Browser软件统计， 每张图取 3个最近距离， 求平 均值， 并计算迁移距离。 做柱状图并做 t检验计算统计学差异。 ## / 0.01， 漏 ρθ皿， mock组 vs. plgR组； * ρ<0·05， ** ρ<0·01， *** ρ<0·001， 干 扰组 vs. NC组。
2、 实验结果
实验结果如图 3所示， 在狗肾上皮细胞 MDCK及肝癌细胞 SMMC-7721 中高表达 plgR 能够促进细胞由上皮形态向间充质形态的转变， 细胞散在生 长， 同时伴随相应的 EMT标志性分子的改变， 即上皮标志分子 E-cadherin、 Pan-cytokeratin表达下调， 而间充质标志分子 Vimentin禾 Π Fibronectin表达上 调， 此外， 高表达 plgR后细胞的运动能力显著增强。 尤其值得注意的是， 在 MDCK-pIg 细胞中以 shRNA稳定干扰 plgR的表达后， 细胞形态发生较为 明显的变化， 恢复为规则的铺路石样上皮形态， 细胞成片生长； 同时伴随相 应的 EMT标志性分子的逆转以及运动能力的减弱。 上述结果表明， plgR的 表达与 EMT恶性转化密切相关， plgR高表达通过诱导 EMT转化促进细胞运 动能力增强。
实施例 3: plgR表达对实验性肺转移的影响
1、 实验方法
SPF级重度联合免疫缺陷 （SCID ) 小鼠， 4〜6周龄， 体重 16〜20克， 由 中国科学院上海实验动物中心提供。 裸小鼠饲养于无特殊病原菌条件下， 光 照每 12小时更替一次，饲料和水经消毒后方能使用。所有实验均严格遵守动 物饲养和使用伦理标准。
MDCK系列 plgR表达细胞株实验性肺转移能力比较:将动物随机分为 4 个组， 空载体对照组 （MDCK-mock)、 plgR高表达组 （MDCK-pIgR)、 干扰 对照组 （MDCK-pIgRcon.shRNA)、 plgR干扰组 （MDCK-pIgR shRNA3 ) 每 组各 5 只。 分别将按照实施例 2 中的方法制备的细胞 （MDCK-mock、 MDCK-pIgR, MDCK-pIgR con.sh NA, MDCK-pIgR sh NA3) 消化后， 用 PBS稀释成浓度 2.5xl06个 /200 取 200 μL细胞悬液通过尾静脉注射入各 组 SCID小鼠体内。 10周后处死小鼠， 取肺， 将肺组织固定于 4%多聚甲醛 中 24小时以上，在解剖显微镜下观测记录每个肺 5个肺叶上的总转移结节数， 做柱状图并做 t检验计算统计学差异。 #p<0.05, ## p<0.0\, mock组 vs. plgR 组； */ 0.05， 干扰组 vs.干扰对照组。
SMMC-7721系列 plgR表达细胞株实验性肺转移能力比较： 将动物随机 分为 2 个组， 空载体对照组 （ SMMC-7721-mock)、 plg 高表达组 (SMMC-7721-pIg ) 每组各 5 只。 将按照实施例 2 中的方法制备的细胞 (SMMC-7721-mock, SMMC-7721-pIg )消化后， 用 PBS稀释成浓度 lxlO6 个 /200 μL, 取 200 细胞悬液通过尾静脉注射入各组 SCID小鼠体内。 10 周后处死小鼠， 取肺， 将肺组织固定于 4%多聚甲醛中 24小时以上， 在解剖 显微镜下观测记录每个肺 5个肺叶上的总转移结节数， 做柱状图并做 t检验 计算统计学差异。 #p<0.05， mock组 vs. plg 组。
2、 实验结果
plgR高表达 SMMC-7721细胞和 MDCK细胞接种到重度联合免疫缺陷 (SCID) 小鼠中， 能够引起高转细胞的明显肺转移， 而 plgR干扰组小鼠肺转 移灶数显著下降 （图 4， 图 5) ， 表明在体内 plgR促进了肿瘤细胞的转移。
实施例 4: plgR诱导 EMT恶性转化功能段确定
1、 实验方法
发明人以 pcDNA3.1-pIgR质粒 (Finn-Eirik Johansen博士馈赠）为模板， 按 照分子生物学常规方法， 构建了 plgR (662-735)表达质粒及 plgR (680-735)表 达质粒【pcDNA3.1-pIgR (662 -735)及 pcDNA3.1-pIgR (680-735)】。 将 MDCK或 SMMC-7721细胞接种于十二孔板， 融合度达到 80%时，采 用脂质体法， 分别转染 pCDNA3.1空载体质粒、 pcDNA3.1-pIgR表达质粒、 pcDNA3.1-pIg (662 -735)表达质粒及 pcDNA3.1-pIgR (680-735)表达质粒， 48 小时后， 收集细胞， 用冷的 PBS (含 1 mM钒酸钠） 洗一次， 加入 l xSDS凝 胶上样缓冲液 （50 mM Tris-HCl (pH 6.8)， lOO mM DTT, 2% SDS, 10%甘油， 1 mM钒酸钠， 0.1%溴酚蓝)裂解细胞。 细胞裂解物在沸水浴中加热 10分钟 后， 于 4。C 12000 rpm离心 10分钟。
取上清液进行 SDS-PAGE电泳， 电泳结束后， 用半干电转移系统将蛋白 转移至硝酸纤维素膜 (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL， USA), 将硝酸纤维素膜置于封闭液 (5%脱脂奶粉稀释于含 ImM 钒酸钠的 TBS/T)中 室温封闭 1小时，然后将膜置于抗 E-cadherin抗体 (BD)或者抗 Pan-cytokeratin 抗体 (Sigma)或者抗 Vimentin抗体 (Abeam)或者抗 Fibronectin抗体 (Abeam)或 者抗 GAPDH抗体 (kangchen)中 4°C封闭过夜。 用含 ImM钒酸钠的 TBS/T洗 涤三次， 每次 15分钟。 将膜置于二抗 （1 :2000)溶液中室温反应 1-2小时。 同 上洗膜三次后， 用 ECL试剂发色， 压片， 显影。
2、 实验结果
结果如图 6所示， plgR上 662-735段或 680-735段蛋白序列的表达就能 够促进上皮标志分子 E-cadherin、 Pan-cytokeratin 下调， 而间充质标志分子 Vimentin和 Fibronectin表达上调， 与全长 plgR表达效应相似， 表明 plgR上 662-735段或 680-735段蛋白域在 plgR诱导的 EMT恶性转化中发挥重要作 用。
实施例 5: 在不同种属、 不同组织来源的原代细胞和细胞株中髙表达 plg 对 EMT恶性转化的影响
1、 实验方法
肝癌细胞 BEL-7402 (生化细胞所细胞库）、 肝细胞 LO2 (生化细胞所细 胞库）、 肺癌细胞 H1650 (ATCC)、 人脐静脉内皮细胞 HUVEC (ATCC) 及 小鼠胚胎成纤维细胞 MEF (ATCC) 分别接种于十二孔板， 融合度达到 80% 时， 采用脂质体法， 分别转染 pcDNA3.1 空载体质粒 （ Invitrogen )、 pcDNA3.1-pIg 表达质粒 (Finn-Eirik Johansen博士馈赠）， 48小时后， 收集细 胞， 用冷的 PBS (含 1 mM钒酸钠）洗一次， 加入 l xSDS凝胶上样缓冲液 (50 mM Tris-HCl (pH 6.8)， 100 mM DTT， 2% SDS， 10%甘油， 1 mM钒酸钠， 0.1%溴酚蓝)裂解细胞。细胞裂解物在沸水浴中加热 10分钟后，于 4°C 12000 rpm离心 10分钟。
取上清液进行 SDS-PAGE电泳， 电泳结束后， 用半干电转移系统将蛋白 转移至硝酸纤维素膜 (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL， USA), 将硝酸纤维素膜置于封闭液 (5%脱脂奶粉稀释于含 ImM 钒酸钠的 TBS/T)中 室温封闭 1小时， 然后将膜置于抗 plgR抗体 (Santa Cruz, 货号: sc-51694、 sc-20487、 sc-20485 或 sc-20656)或者抗 E-cadherin 抗体（BD)或者抗 Pan-cytokeratin抗体 (Sigma)或者抗 Vimentin抗体 (Abeam)或者抗 GAPDH抗 体 (kangchen)中 4°C封闭过夜。 用含 ImM 钒酸钠的 TBS/T洗涤三次， 每次 15分钟。将膜置于二抗 （1 :2000)溶液中室温反应 1-2小时。同上洗膜三次后， 用 ECL试剂发色， 压片， 显影。
2、 实验结果
结果如图 7所示， 在肝癌细胞 BEL-7402、肝细胞 LO2、肺癌细胞 H1650、 人脐静脉内皮细胞 HUVEC及小鼠胚胎成纤维细胞 MEF中高表达 plgR均 能导致 EMT的发生， 表明 plgR诱导 EMT转化是个共性现象。

Claims

权 利 要 求
1、 针对多聚免疫球蛋白受体（plgR) 蛋白的抗体在制备用于诊断或预 测肿瘤的复发和 /或转移的诊断剂中的用途。
2、 根据权利要求 1所述的用途， 其中， 所述针对 plgR蛋白的抗体选 自针对 plgR全长蛋白的抗体、针对 plgR胞内区的抗体和针对 plgR胞外区 的抗体中。
3、 根据权利要求 2所述的用途， 其中， 所述针对 plgR蛋白的抗体为 针对 plgR胞内区的抗体。
4、 根据权利要求 2所述的用途， 其中， 所述针对 plgR蛋白的抗体为 针对 plgR上 662-735段或 680-735段蛋白的抗体。
5、根据权利要求 1所述的用途， 其中， 所述肿瘤选自肝癌、结直肠癌、 前列腺癌、 胃癌、 肺癌、 乳腺癌、 胰腺癌、 宫颈癌、 肾癌、 膀胱癌、 卵巢 癌、 神经胶质瘤、 黑色素瘤、 头颈部癌症、 胆管癌、 鼻咽癌和甲状腺癌中， 优选地， 所述肿瘤为肝癌、 结直肠癌、 前列腺癌、 胃癌或肺癌。
6、 使多聚免疫球蛋白受体（plgR) 蛋白表达下调的物质在制备用于预 防和 /或治疗肿瘤的复发和 /或转移的药物中的用途。
7、 使多聚免疫球蛋白受体 （plgR) 蛋白的 662-735段或 680-735段蛋 白表达下调的物质在制备用于预防和 /或治疗肿瘤的复发和 /或转移的药物 中的用途。
8、 根据权利要求 6或 7所述的用途， 其中， 所述使 plgR蛋白或者其 662-735段或 680-735段蛋白表达下调的物质为反义寡聚核苷酸或者 RNA 干扰片段或者稳定产生 RNA干扰片段的表达载体，所述反义寡聚核苷酸或 者 RNA干扰片段或者稳定产生 RNA干扰片段的表达载体是针对 plgR上 662-735段或 680-735段蛋白设计的单链或者双链的具有靶向该段序列表达 的核苷酸片段， 或能够稳定产生具有上述特性的核苷酸片段的表达载体， 优选地， 所述反义寡聚核苷酸或者 RNA干扰片段或者稳定产生 RNA干扰 段 的 表 达 载 体
Figure imgf000020_0001
13-24个核苷酸序列的序列。
9、 根据权利要求 8所述的用途， 其中， 所述反义寡聚核苷酸或者 RNA 干扰片段或者稳定产生 RNA干扰片段的表达载体， 靶向针对的模板序列如 下：
模板序列 1, 5 '-AGAACGUCGACCGAGUUUCAAU-3 '；
模板序列 2， 5 '-ACGUCGACCGAGUUUCAAUCAG-3 '； 或
模板序列 3, 5 '-AGAAGAGUUUGUUGCCACCACU-3，。
10、 根据权利要求 6或 7所述的用途， 其中， 所述肿瘤选自肝癌、 结直 肠癌、 前列腺癌、 胃癌、 肺癌、 乳腺癌、 胰腺癌、 宫颈癌、 肾癌、 膀胱癌、 卵巢癌、 神经胶质瘤、 黑色素瘤、 头颈部癌症、 胆管癌、 鼻咽癌、 甲状腺癌 中， 优选地， 所述肿瘤为肝癌、 结直肠癌、 前列腺癌、 胃癌或肺癌。
11、 多聚免疫球蛋白受体（plgR) 作为诊断或预测肿瘤早期复发和 /或转 移的分子标志物和 /或抗肿瘤转移的药物干预靶点的用途。
12、一种反义寡聚核苷酸或者 RNA干扰片段或者稳定产生 RNA干扰片 段的表达载体， 所述反义寡聚核苷酸或者 RNA干扰片段或者稳定产生 RNA 干扰片段的表达载体是针对 plgR上 662-735段或 680-735段蛋白设计的单链 或者双链的具有靶向该段序列表达的核苷酸片段， 或能够稳定产生具有上述 特性的核苷酸片段的表达载体， 优选地， 所述反义寡聚核苷酸或者 RNA干 扰片段或者稳定产生 RNA 干扰片段的表达载体包含靶向于
13-24个核苷酸序列的序列。
13、 根据权利要求 12所述的反义寡聚核苷酸或者 RNA干扰片段或者稳 定产生 RNA干扰片段的表达载体， 其中， 所述反义寡聚核苷酸或者 RNA干 扰片段或者稳定产生 RNA干扰片段的表达载体， 靶向针对的模板序列如下: 模板序列 1, 5 '-AGAACGUCGACCGAGUUUCAAU-3 '；
模板序列 2， 5 '-ACGUCGACCGAGUUUCAAUCAG-3 '； 或
模板序列 3, 5 '-AGAAGAGUUUGUUGCCACCACU-3，。
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