WO2012172147A1 - Bebida funcional cardiosaludable de vino y extractos de lúpulo - Google Patents

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Guillermo J. REGLERO RADA
Enrique De Miguel Del Campo
Francisco MARÍN MARTÍN
Tiziana Fornari Reale
Marin PRODANOV PRODANOV
Alejandro RUIZ RODRÍGUEZ
Carlota Largo Aramburu
María TABERNERO URBIETA
Elena IBÁÑEZ EZEQUIEL
Laura Jaime De Pablo
Cristina Soler Rivas
Mónica RODRÍGUEZ GARCÍA-RISCO
Susana Santoyo Diez
Monserrat GONZÁLEZ LORENTE
Elena ARRANZ GUTIÉRREZ
Alicia GIL RAMÍREZ
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Consejo Superior de Investigaciones Científicas
Autonomous University of Madrid
Hospital Universitario La Paz
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Consejo Superior de Investigaciones Científicas
Autonomous University of Madrid
Hospital Universitario La Paz
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients

Definitions

  • the present invention belongs to the field of foods for specific use for health constituted by food products enriched with natural bioactive ingredients.
  • it refers to the so-called functional foods, specifically in the field of healthy drinks, in particular being a wine-based beverage that has been incorporated with natural extracts with antioxidant and anti-inflammatory effects with cardiovascular risk prevention effects .
  • Mann & Folts Mann, LB; Folts, JD Effects of ethanol and other constituents of alcoholic beverages on coronary heart disease. Areview. Pathophysiology. 10: 105-111; 2004
  • Mann & Folts provide an interesting review on this subject. These authors consider that the mechanisms that contribute to the initiation and progress of atherosclerosis are mechanisms with specific endpoints that can be directly measured; and that at the other end of the scientific spectrum of atherogenesis are epidemiological studies, which suggest a beneficial effect by moderate consumption of alcoholic beverages.
  • Mann & Folts (2004) state that, when one measures the specific endpoints related to atherogenesis, it would take place that alcoholic beverages with higher polyphenol contents offer greater protection against arteriosclerosis than ethanol alone.
  • this fraction has an antiatetrogenic effect through the five key events of the same.
  • platelet antiaggregant effect and ability to increase levels of HDLs which must be opposed, when assessing the benefit-risk ratio, to its prooxidant activity, causing the balance between alcohol and polyphenols in wine it can be critical about its effect on the oxidation of LDLs (Schroder, H .; Marrugat, J .; Fito, M .; Weinbrenner, T .; Covas, Ml Alcohol consumption is directly associated with circulating oxidized low-density lipoprotein. Free Radical Biology & Medicine. 40: 1474-1481; 2006).
  • the main phenolic compounds present in grapes and wines are of the noflavonoid type (hydroxycinnamic acid derivatives and hydroxybenzoic), flavonoids (anthocyanins, flavonols, flavanols) and stilbenes (resveratrol, viniferin, piceid). Many of them have the ability to neutralize free radicals and complexing of transition metals. They are known as good lipid antioxidants, have been reported to exert anti-inflammatory effects and act as protectors of LDL against oxidation.
  • Phenolic compounds could be classified according to their mechanism of action on LDL. Thus, we can distinguish flavonoids, phenolic acids, anthocyanins and derivatives that act by non-hormonal mechanisms (previously mentioned) that are own compounds of wine and derived products, and the phytoestrogens of hops, used to aromatize beer, which act by hormonal mechanisms
  • the phenolic fraction of the wine responsible for the heart-healthy properties of the wine, has a high complexity in terms of its composition. So, you can find flavonols such as quercetin, kaemferol and myricetin, flavan-3-oles such as catechin, epicatechin and tannins, in addition to anthocyanins. These compounds may also be present, depending on the nature of each of them, in free form as an aglycone, as a glycoside, ramnoglycoside or as part of polymeric structures such as procyanidins.
  • hydroxycinnamic acid derivatives such as caffeic and p-cumaric acid, of hydroxybenzoic acid, such as gallic acid, or the type of stilbenes (Van de Wiel, A .; Van Golde, PHM; Hart, HC Blessings of the grape. European Journal of International Medicine. 12: 484-489; 2001).
  • This complexity in the composition could be responsible for the synergistic effects observed both in vitro (Cirico, TL; Omaye, ST Additive or synergetic effects of phenolic compounds on human low density lipoprotein oxidation.
  • the polyphenols present in beer provide the same antioxidant effects and protective effects of cardiovascular diseases that have already been described for wine polyphenols. These compounds mainly come from hops added to beer to give it its characteristic bitter taste. Hops contains among other xanthohumol polyphenols and other derived prenylflavonoids. Xanthohumol and other pre-packed chalcones are the subject of recent studies as they appear to act as chemical preventive agents for cancer.
  • Phytoestrogens are chemical compounds of plant origin that show suggestive effects of estrogenicity, such as binding to estrogen receptors, the induction of estrogen-specific genetic responses for the production of certain compounds, etc. These compounds are structurally similar to the endogenous estrogens of mammals and can act as antagonists or agonists depending on their concentration in the tissues where they must act.
  • phytoestrogens such as genistein and daidzein (soy) bind to the estrogenic beta receptor (ER- ⁇ ) while 8-prenylnaringenin of hops, although one type of enantiomer is also able to bind to this receptor , has a high affinity and high selectivity for the alpha form of the estrogen receptor (ER- ⁇ ), about 100 times greater than genistein (Shaefer, O .; Humpel, M .; Fritzemeier, KH; Bohlmann, R .; Schleuning , WD 8- Prenylnaringenin is a potent Eralpha selective phytoestrogen present in hops and beer. Journal of Steroid Biochemistry.
  • the estrogen receptors ER- ⁇ and ER- ⁇ have considerable homology and their difference seems to be that only while some tissues, such as the ovaries and the uterus, express both receptors, other tissues preferably express one receptor more than another.
  • phytoestrogens are not only reduced to improve the health of women (acting as 170-estradiol, female hormone), it has also been shown to inhibit cardiovascular diseases and reduce the risk of arteriosclerosis acting as LDL level reducing compounds in plasma, cholesterol and triglycerides either by the mechanisms mentioned above for being polyphenols or by other specific and specific mechanisms for their ability to act as hormones.
  • phytoestrogens on lipid plasma concentrations result from the estrogen-receptor action on liver expression of gene genes.
  • apoproteins ApoA, B, D and E, and Lp (a)). These increase high density lipoproteins (HDL), antiatherogenic lipoprotein, and reduce the levels of low density lipoproteins (LDL) and lipoprotein (a) (Lp (a)), both atherogenic lipoproteins.
  • phytoestrogens by interfering with the activity of the transcription factor NF-kB, produce a dramatic reduction in the expression of inflammatory genes.
  • vascular smooth muscle endothelial cells express both ER- ⁇ and ER- ⁇ receptors.
  • estrogens reverse the vasoconstriction induced by acetylcholine, via stimulation of nitric oxide synthetase, through the activation of ER- ⁇ .
  • Estrogens have rapid vasodilator actions and long-term effects that inhibit responses to vascular damage, preventing atherosclerosis.
  • Extractions based on pressurized fluids can have the advantage of performing extraction in one step and not leaving traces of organic solvents, so they have come to be called clean extraction technologies. These include the ESFC and the globally known as PLE Pressurized Liquid Extraction), in which a solvent is pressurized without reaching its critical point.
  • PLE Pressurized Liquid Extraction in which a solvent is pressurized without reaching its critical point.
  • the combined use of high temperatures and high pressures allows fluid capacity to be improved extractant to dissolve substances of the matrix, at the same time that there is an increase in the rate of transfer of matter a decrease in the viscosity and rupture of the matrix, facilitating the extraction.
  • SWE Subcritical Water Extraction
  • the latter is the proposed technology to extract the phenolic grape and hop fractions intended to supplement the alcohol-free wine, being potentially more compatible with the polarity of the polyphenolic compounds of interest in this research project than those of C0 2 in supercritical conditions ( Reglero, G., Se ⁇ oráns, FJ, Ibá ⁇ ez, E. Supercritical fluid extraction: an alternative for the isolation of natural food preservatives In: Novel food processing technologies Barbosa-Cánovas, G., Tapia, MS, Cano, MP Eds. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, pp. 539-554; 2005).
  • the dielectric constant ( ⁇ ) of the water falls from 80 to the range of 30-3 behaving as a strong or moderate organic solvent, ie methanol ( ⁇ : 33), ethanol ( ⁇ : 24), with which extraction conditions similar to those made with these solvents or binary mixtures methanol water similar to those used for industrial extraction of polyphenols can be achieved.
  • composition of the invention relates to a composition (hereinafter composition of the invention) comprising alcohol-free wine, wine aroma and hop extract enriched in isoxantohumol.
  • the composition further comprises grape marc extract and grape seed extract.
  • a second aspect of the present invention is a process for the preparation of a composition as previously defined, which includes the addition of the wine aroma, the isoxantohumol-enriched hop extract and, optionally, the grape pomace extract and extract of grape seeds, on the alcohol-free wine.
  • the present invention is also directed to a process for obtaining isoxantohumol-enriched hop extract comprising: a) providing plant raw material from hops;
  • the invention relates to an isoxantohumol-enriched hop extract comprising: a) 0.05-80% dry weight of prenylflavanone isoxantohumol; b) 0.001-10% dry weight of prenilchalcona xanthohumol; Y
  • ⁇ and ⁇ -acids selected from cohumulone, n-humulone, ad-humulone, iso-co-humulone, iso-n-humulone, iso-ad-humulone, colupulone, n-lupulone and ad-lupulone, in addition to sugars, polysaccharides and amino acids.
  • the present invention also relates to a functional beverage comprising a composition as previously defined.
  • This drink also has sensory properties analogous to wine.
  • a further aspect of the present invention is the use of a composition as previously defined or of the functional beverage comprising it for the preparation of a medicament aimed at the prevention or treatment of metabolic syndrome.
  • Figure 1 Comparative effect of hops extracts on the production of cytokines in THP-1 macrophages. Treatments: 1. Control; 2. I ndometacin ⁇ g / mL); 3. Hop extract (1.5 ⁇ g / mL); 4. Isoxantohumol contained in the extract (10 ng / mL).
  • the present invention is directed to a composition
  • a composition comprising alcohol-free wine, wine aroma and hop extract enriched with isoxantohumol.
  • the alcohol-free wine is the base component of the composition of the invention.
  • De-alcoholic wine should be understood as a wine with an alcohol content of less than 1.2% by volume, preferably less than 1% by volume. Said desalcoholizado wine must also keep its biological activity as little as possible.
  • the alcohol-free wine comprises the phenolic fraction of the wine responsible for the biological activity, that is, the one that gives it its antioxidant and anti-inflammatory properties.
  • Said phenolic fraction comprises the phenolic compounds of wine as flavonols, among which are quercetin, kaemferol and myricetin; flavan-3-oles such as catechin, epicatechin and tannins, in addition to anthocyanins. These compounds may be present, depending on the nature of each of them, in free form as an aglycone, as a glycoside, ramnoglycoside or as part of polymeric structures such as procyanidins.
  • the flavonoid fraction are other phenols such as hydroxycinnamic acid derivatives, among which are caffeic acid and p-cumaric acid, and hydroxybenzoic acid derivatives such as gallic acid, or stilbene derivatives.
  • the desalcoholizado wine is obtained from any procedure that allows reducing the ethanol content of the wine to a percentage lower than 1.2% by volume. Since the wine usually contains more than 10% by volume of ethanol, it is necessary to selectively remove said ethanol under conditions where the biological activity of the wine is not altered. Desalcoholization or partial or total elimination of the alcoholic content in wine can be carried out by means of different techniques known in the state of the art that include distillation processes with recovery of aromas, evaporation in columns of downward flow dishes, such as rectification columns or columns centrifugal reviews, diffusion separation processes through semipermeable membranes, such as dialysis, reverse osmosis, pervaporation or extraction with supercritical fluids.
  • the desalcoholization of the wine is carried out by extracting the base wine with supercritical fluids, since it is the technique that best allows both the biological and organoleptic properties of the base wine to be preserved.
  • the desalcoholiza substances of drinks by means of extraction with supercritical fluids is based on the thermodynamic equilibrium that is established between the phases that come into contact, that is, the alcoholic beverage and the supercritical solvent (a substance in conditions of temperature and pressure above its critical values). Under these conditions, the solvent has properties that make it particularly attractive to be used as an extraction agent, since it is a dense gas, maintains transport properties similar to those of gases, and at the same time has great solvent power because it has typical densities of liquids.
  • the advantages offered by supercritical fluid technology as an alternative to traditional extraction and fractionation procedures are well known in the state of the art and consist in the conservation of their natural properties, due to low processing temperatures, and the absence of risks of permanence of waste. On the other hand, supercritical fluid technology allows rapid processing (for example, solvent removal from solutes simply by depressurization), high selectivity and no environmental aggression.
  • the desalcoholizado wine is obtained by supercritical extraction in countercurrent using carbon dioxide as a supercritical fluid or solvent.
  • the carbon dioxide is at a temperature between 40 and IOO ⁇ C and at a pressure between 200 and 400 bar. This method allows reducing the alcohol content to concentrations less than 1% by volume and maintaining an antioxidant activity similar to that of the starting wine.
  • the supercritical carbon dioxide extraction process consists in introducing the starting wine, or base wine, through the top of a column suitable for carbon dioxide extraction under supercritical conditions in countercurrent conditions, while from the bottom of the column, carbon dioxide is introduced.
  • the pressure inside the column can be between 5 and 11 MPa, preferably between 9 and 10 MPa, while the temperature of the column can range between 32 and 50 ⁇ C, preferably between 37 and 42 ⁇ C.
  • the relationship between the carbon dioxide flow rate and the wine flow rate ranges between 10 and 40, preferably between 18 and 22.
  • Wine with a reduced ethanol content is collected in a container placed at the bottom of the column and connected with the same.
  • Aroma of wine The aroma of wine is made up of many volatile organic compounds, among which esters and alcohols stand out as major components.
  • the wine aroma can also be obtained by supercritical countercurrent extraction using carbon dioxide. carbon as a supercritical fluid or solvent according to the aforementioned procedure.
  • the carbon dioxide is at a temperature between 40 and 70 and at a pressure between 80 and 200 bars.
  • the starting wine, or base wine is introduced through the upper part of a column suitable for carbon dioxide extraction under supercritical conditions in countercurrent, while the lower part of the column is introduced carbon dioxide.
  • the pressure inside the column can be between 5 and 11 MPa, preferably between 9 and 10 MPa, while the temperature of the column can range between 32 and 50 ⁇ C, preferably between 37 and 42 ⁇ C.
  • the ratio between the carbon dioxide flow rate and the wine flow rate ranges between 1 and 6, preferably between 2 and 4.
  • the aromatic extract is collected in a container placed at the top of the column and connected with it maintained at a pressure between 3 and 6 MPa and at a temperature between 29 and 37 ⁇ C. For each liter of wine, between 10 and 30 mL of aromatic extract are collected. This extract shows an intense smell and very similar to that of the starting wine and a transparent, colorless appearance.
  • Hops (Humulus lupulus) is a plant of the genus humulus, belonging to the Cannabaceae family. Hops contain, among other polyphenols, a prenilflavonoid such as xanthohumol, as well as derivatives thereof.
  • the hop extract contained in the composition of the invention is enriched with isoxantohumol, isomerization product of xanthohumol, which is also present in hops although in smaller proportions.
  • the ratio of soxantohumohxantohumol in the plant material of origin is approximately 1: 8, so to obtain a hop extract rich in Soxantohumol is required to increase the proportion of isoxantohumol, either by performing a selective extraction of said component or by transforming xanthohumol into isoxantohumol.
  • the authors of the present invention have developed a process that, unlike the processes of extraction by means of organic solvents, of chemical synthesis or of extraction of xanthohumol and transformation into isoxantohumol used in the state of the art, allows to obtain extracts enriched in isoxantohumol selectively, favoring the extraction of isoxantohumol and simultaneously the transformation of xanthohumol into isoxantohumol in a single step, also preserving the presence of a and ⁇ -acids characteristic of lupulin, as well as other chemical compounds typical of hops, thus allowing to take advantage the pharmacological properties of the plant.
  • This procedure uses superheated and pressurized water as the extraction solvent, in conditions close to its critical point.
  • the procedure developed is based mainly on the conditioning of the vegetable raw material and on the modification of the physical conditions to which the extraction process is carried out, taking advantage of the variation of the chemical behavior of the water as a solvent, to obtain plant extracts enriched in isoxantohumol and simultaneously produce the isomerization of xanthohumol in the former, using the latter's behavior under high temperature conditions.
  • the present invention relates to a process for obtaining isoxantohumol-enriched hop extract comprising: a) providing plant raw material from hops;
  • the female catkins or cones of the plant, its dehydrated products and presented in any form, as well as the cake exhausted from the lupulin extraction processes, both from methods can be mentioned traditional as extraction with supercritical fluids.
  • the drying of the part of the plant to be used can be carried out in an oven or in a dryer with forced air flow at a temperature between 55 2C and 65 2C, preferably at 60 ⁇ c.
  • the duration of the drying is variable depending on the amount of raw material to dry and the state of humidity in which it can be varied and can vary between a few hours and several days. A usual drying period can be approximately 1 day.
  • the dried raw material is crushed, using, for example, a mill, to a particle size between 500 ⁇ and 1000 ⁇ .
  • This product, dried and ground, constitutes the vegetable raw material that is subjected to the extraction process with pressurized and superheated water.
  • Said extraction is carried out in a suitable device capable of generating the pressures and temperatures used in this procedure.
  • a suitable device capable of generating the pressures and temperatures used in this procedure.
  • the plant material conveniently dried and ground
  • the proportion of plant material / water can range from 1/3 to any proportion of water greater than 3.
  • the vessel is preheated to reach the extraction temperature and pressure.
  • the temperature can range between 25 and 374 ⁇ c, preferably between 100 and 250 ⁇ c, while the pressure can be between 100 and 218 bars, preferably between 125 and 200 bars.
  • the process can be done through different extractive cycles.
  • the number of cycles can range between 1 and 10 cycles, with a duration between 3 and 60 minutes each of the cycles.
  • the aqueous extract is collected, filtered and allowed to cool. After filtration an aqueous suspension is obtained in which the isoxanthohumol progressively loses its solubility as a result of the variation of the behavior as solvent of the water with the variation of the physical conditions, so it is necessary to immediately carry out the separation of the solid and of the aqueous suspension.
  • the water is removed from said suspension by any of the existing procedures.
  • Vegetable extracts obtained by means of the present process, have the advantage of being able to be used directly in the formulation of different types of fortified foods without providing any type of chemical solvent to the food.
  • An additional advantage of this process lies in the use of water as the sole solvent, thus avoiding the presence of impurities or residues of organic solvents, other reagents or possible side reactions.
  • the process described in the present invention provides an extract enriched in isoxantohumol in which the ratio between soxantohumohxantohumol is reversed, going from ratios of less than 1: 8 in the plant material of origin, to ratios greater than 10: 1 in the extract obtained according to said procedure.
  • the isoxantohumol-enriched hop extract comprises: - 0.05-80% dry weight of prenylflavanone isoxantohumol;
  • ⁇ and ⁇ -acids selected from cohumulone, n-humulone, ad-humulone, iso-co-humulone, iso-n-humulone, iso-ad- humulone, colupulone, n-lupulone and ad-lupulone, in addition to sugars, polysaccharides and amino acids.
  • the isoxanthumol-enriched hop extract comprises: 0.2-60% dry weight of prenylflavanone isoxantohumol;
  • ⁇ -acids selected from cohumulone, n-humulone, ad-humulone, iso-co-humulone, iso-n-humulone, iso-ad-humulone, colupulone, n-lupulone and ad- Lupulone, in addition to sugars, polysaccharides and amino acids.
  • the base wine used as a starting product for obtaining the alcohol-free wine and the wine aroma is red, it usually contains enough polyphenols such as providing a high antioxidant and anti-inflammatory activity.
  • the base wine has a low antioxidant activity, whether it is a rosé wine or a white wine, it is convenient to add an extract rich in polyphenols.
  • said extract comes from pomace and / or grape seeds.
  • the composition of the invention further comprises grape marc extract and grape seed extract.
  • Such extracts can be obtained from grape skins and seeds using a conventional solid / liquid extraction procedure.
  • the extraction of skins and seeds is carried out separately.
  • the pomace is collected immediately after pressing and separated into seeds and skins in a mechanized way, using a vibrating sieve separator.
  • the seeds are dried in a dryer with forced air at temperatures between 60 and 90 ⁇ C, preferably between 70 ⁇ C and 80 ⁇ C. They are stored cold for later extraction, while the skins are subjected to extraction immediately after separation.
  • the solid / liquid extraction is carried out on both substrates, skins and seeds, with water and S0 2 at different temperatures and with hydroalcoholic mixtures with and without S0 2 .
  • Conventional solid-liquid extraction procedures with ethanol / water ratios varying between 90/10 and 50/50 are applied at temperatures between 50 and 80 ⁇ C, preferably between 60 ⁇ C and 70 ⁇ C.
  • the higher proportions of ethanol favor the extraction of phenolic compounds (both from seeds and skins) and at the same time suppress the extraction of undesirable compounds (oligo and polycarbohydrates), which indicates that the extracts obtained with higher ethanol content have higher content in polyphenols and, therefore, are of greater interest to be used as additives in preparation of the composition of the invention.
  • alcoholic extract of pomace and grape seeds reinforces the antioxidant properties of the composition, without substantially increasing its alcoholic strength and without significantly altering its sensory properties.
  • composition of the invention is Composition of the invention.
  • composition of the invention comprises:
  • hops extract enriched in isoxantohumol and optionally:
  • the wine aroma is in a proportion between 9 and 11% by weight.
  • the isoxantohumol-enriched hop extract is in a proportion of between 0.1 and 5% by weight, more preferably between 0.1 and 1% by weight.
  • the grape pomace extract is in a proportion of between 0.1 and 5% by weight, more preferably between 0.1 and 1% by weight.
  • the grape seed extract is in a proportion of between 0.1 and 5% by weight, more preferably between 0.1 and 1% by weight.
  • the composition of the invention contains an ethanol ratio of less than 1.2% by weight, more preferably less than 1% by weight, even more preferably less than 0.5% by weight.
  • the composition of the invention is further characterized by not containing traces of organic solvents other than ethanol.
  • the present invention is directed to a process for the preparation of the composition of the invention, wherein said process comprises the addition of the wine aroma, the isoxantohumol-enriched hop extract and, optionally, the pomace extract of grape and grape seed extract, on the alcohol-free wine.
  • the different components of the formulation are added in the proportions mentioned above.
  • the present invention is directed to a functional beverage comprising the composition of the invention.
  • “functional beverage” means a traditional beverage that has been modified in its composition by incorporating substances that it does not naturally contain, in order to acquire a biological activity beneficial for prevention or improvement. of diseases.
  • said beverage comprises desalcoholized wine and wine aroma from a base wine to which an extract of hops enriched in isoxantohumol is incorporated.
  • a grape marc extract and a grape seed extract can be added to said beverage. This drink has sensory properties similar to wine.
  • Said functional beverage may further comprise vitamins or vitamin precursors, including vitamin A, ascorbic acid (Vitamin C), beta carotene, niacin (Vitamin B3), riboflavin (Vitamin B2), thiamine (Vitamin Bl), niacinamide, folate or folic acid, alpha-tocopherols or esters thereof, Vitamin D, Vitamin E, Vitamin K, retinyl acetate, retinyl palmitate, pyridoxine (Vitamin B6), folic acid (Vitamin B9), cyanocobalimine (Vitamin B12), pantothenic acid , biotin and combinations thereof.
  • vitamins or vitamin precursors including vitamin A, ascorbic acid (Vitamin C), beta carotene, niacin (Vitamin B3), riboflavin (Vitamin B2), thiamine (Vitamin Bl), niacinamide, folate or
  • said beverage may include flavorings, flavor enhancing agents, additives, coloring agents, emulsifiers, mineraels, micronutrients, preservatives, stabilizers, thickeners and combinations thereof. Consumption of said functional drink on a regular basis throughout the day can be an effective way of maintaining a sufficient concentration of functional ingredients that provide the desired therapeutic or prophylactic effect.
  • a functional beverage comprising the composition of the invention allows to stimulate the production of the anti-inflammatory cytokine IL-10 in native THP-1 macrophages, in the absence and presence of oxidized LDL lipoprotein particles triggering atherosclerosis. It also reduces the production of inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ and I L-6, in the presence of said oxidized LDL particles.
  • oxidized LDL particles in atherogenesis is developed by multiple routes. They induce the expression of adhesion and chemotactic signals in endothelial cells.
  • T-cells secrete IL-1 that increases proliferation of smooth muscle cells, IL-2 that activates monocytes and increases proliferation of T cells, and induces IFN- ⁇ that induces MHC expression in endothelial cells and Smooth muscle, generating a feedback process.
  • macrophages already activated secrete a wide variety of cytokines (TNF-a, TGF- ⁇ , M-CSAF, etc.) that influence the expression of other mediators such as NO.
  • aldehydes produced in the oxidation of LDLs exert a direct toxic effect on the endothelium and platelets (Kaliora, AC; Dedoussis, GVZ; Schmidt, H. Dietary antioxidants in preventing atherogenesis. Atherosclerosis 187: 1-17; 2006).
  • said beverage allows an effective control of plasma triglyceride levels preventing its increase.
  • said drink causes an effective decrease in oxidation levels in organs with high fat content, such as liver, kidney and adipose tissue, as well as a decrease in inflammatory levels in adipose tissue and an effective modulation of the metabolic activity of said adipose tissue.
  • a further aspect of the present invention is the use of a composition comprising alcohol-free wine, wine aroma and hop extract enriched with isoxantohumol, for the preparation of a medicament aimed at the prevention or treatment of metabolic syndrome.
  • “Metabolic syndrome” should be understood as a set of risk factors and physical conditions that increase the propensity to develop pathologies such as type 2 diabetes, atherosclerosis and cardiovascular diseases.
  • the international diabetes federation stands out (The International Diabetes Federation: The IDF consensus worldwide definition of the metabolic syndrome, 2005 Available at: http://www.idf.org/webdata/docs/Metac) .
  • the International Diabetes Federation The IDF consensus worldwide definition of the metabolic syndrome, 2005 Available at: http://www.idf.org/webdata/docs/Metac
  • Atherogenic dyslipidemia is characterized by high triglyceride levels, increased low density lipoprotein (LDL), especially smaller and higher density particles (sdLDL) and decreased high density lipoprotein (HDL) levels.
  • LDL low density lipoprotein
  • HDL high density lipoprotein
  • An increase in circulating levels of oxidized LDL associated with metabolic syndrome has also been described.
  • atherogenic dyslipidemia precedes the clinical manifestation of metabolic syndrome.
  • composition of the invention Since the composition of the invention has been shown to control and prevent the increase in triglyceride levels, said composition is useful in the treatment of atherogenic dyslipidemia. Therefore, in a preferred embodiment the composition of the invention is directed to the prevention or treatment of atherogenic dyslipidemia.
  • Another of the main causes of the metabolic syndrome is obesity.
  • the mechanism of action is related to an increase in the oxidative stress of accumulated fats.
  • a direct correlation between Systemic oxidative stress levels and accumulated fat deposits, both in humans and in murine models (Carriére A, Carmona MC, Fernandez Y, Rigoulet M, Wenger RH, Pénicaud L, Casteilla L. Mitochondrial reactive oxygen species control the transcription factor CHOP-10 / GADD153 and adipocyte differentiation: a mechanism for hypoxia-dependent effect. J Biol Chem. 2004 Sep 24; 279 (39): 40462-9, 2004).
  • obesity itself is characterized by an increase in oxidative stress at the level of adipose tissue.
  • This oxidative stress increases the proliferation of preadipocytes and their subsequent differentiation, modulated by transcription factors sensitive to free radicals. Therefore, there is a feedback cycle in the increase of adipose tissue that increases oxidative stress, which in turn promotes the synthesis of triglycerides and the differentiation of adipocytes, thereby promoting and amplifying the basis of obesity.
  • composition of the invention has been shown to significantly reduce the levels of oxidative stress and lipid peroxidation in organs with high fat content such as liver, kidney and adipose tissue.
  • composition of the invention is directed to the prevention or treatment of obesity.
  • apoptosis cell processes As described above, before a process of oxidative stress the proliferation of adipose tissue increases, increasing the volume of tissue, which at certain levels can affect the circulatory vessels, so that blood supply is affected. Therefore, localized hypoxia situations occur that result in the triggering of apoptosis cell processes. This situation begins an inflammatory process, increasing the production of proinflammatory cytokines and macrophage infiltration into adipose tissue. Adipocytes, preadipocytes and other cells, can synthesize TNF- ⁇ , and several interleukins, especially I L-lbeta and I L-6. It has been described that the levels of markers of inflammation such as TNF- ⁇ , I L-6 and C-reactive protein are consistently elevated in obese individuals and animal models.
  • composition of the invention significantly reduces the levels of gene expression of the proinflammatory cytokine TNF- ⁇ in adipose tissue, which causes a decrease in the levels of inflammation in said tissue. Therefore, in another preferred embodiment the composition of the invention is directed to the prevention or treatment of inflammation, and particularly in adipose tissue.
  • PPARs peroxisome proliferation activated receptors
  • the composition of the invention is directed to the prevention or treatment of metabolic dysfunction, and particularly of metabolic dysfunction in adipose tissue.
  • EXAMPLE 1 In vitro evaluation of the anti-inflammatory activity of a functional beverage based on alcohol-free wine and hop extract.
  • a functional drink was prepared according to the following procedure.
  • a fraction of red wine of the Merlot variety of 12 alcoholics was taken. It was subjected to extraction with supercritical carbon dioxide at a pressure of 9.5 Mpa, a temperature of 308 K and a ratio between the flow rate of carbon dioxide and the wine flow rate of 3.5.
  • An extract of wine aroma was obtained.
  • the residue from the previous extraction was subjected to extraction with supercritical carbon dioxide at a pressure of 9.5 Mpa, a temperature of 308 K and a relationship between the flow rate of carbon dioxide and the wine flow of 20.
  • Low-ethanol wine aroma extract was added in a proportion of 10 ml of aroma extract per liter of wine.
  • Female flowers of hops (Humulus lupulus) were taken and subjected to a drying, milling, water extraction, filtration and subsequent drying process. They are then subjected to extraction with pressurized water in a proportion of plant material and 1: 3 water, pressure of 125 atm and temperature of 200 ⁇ C.
  • An extract of hops enriched in isoxanthumol is obtained.
  • Said hop extract was added to the mixture of low ethanol wine and previously obtained wine aroma, thus obtaining the functional drink.
  • the anti-inflammatory properties of the beverage have been evaluated in cell cultures of THP-1 monocytes, in which the production and gene expression of pro-inflammatory cytokines (TN Fa, I L- ⁇ and I L-6) and of anti-inflammatory cytokines (I L-10), activated with oxidized and non-activated LDL particles, in the presence of oxidized LDL and non-oxidized LDL particles, after supplying said beverage.
  • pro-inflammatory cytokines TN Fa, I L- ⁇ and I L-6
  • I L-10 anti-inflammatory cytokines
  • Functional drink that includes doses of hop extract equal to or less than 2 ⁇ g / mL caused a decrease in the production of pro-inflammatory cytokines (TNF-a, I L- ⁇ and I L-6) and an increase in production of cytokines to nti-inflammatories (I L-10), both when macrophages have been activated with LDL-oxidized particles and when they are not.
  • the increase observed in the production of anti-inflammatory cytokines in macrophages activated by oxidized LDL particles is approximately 243% for doses of 1.5 ⁇ g of extract / mL respectively; being the increase of approximately 195% in non-activated macrophages.
  • TNF- ⁇ proinflammatory cytokines
  • I L-6 and I L- ⁇ proinflammatory cytokines
  • hop doses between 0, 01 ⁇ g / mL 0.05 ⁇ g / mL give rise to variations of IL-10 in a range of 15% and 30% with respect to control treatments with oxidized LDL particles and in the absence of these, respectively; while hop extracts, obtained in accordance with what is described in the present invention, containing the same amount of isoxanthohumol give rise to IL-10 production increases of the order of 255% and 195% in macrophages activated with oxidized IDL particles and in his absence, respectively.
  • this extract has a suppressive activity of the production of pro-inflammatory cytokines (TNF- ⁇ and IL-6), and of stimulation of anti-inflammatory cytokines (IL-10) far superior to anti-inflammatory drugs such as indomethacin at pharmacological doses ⁇ g / mL)
  • EXAMPLE 2 In vivo evaluation of the healthy effects of a functional drink based on alcohol-free wine and hops extracts.
  • a functional drink was prepared according to the following procedure. A fraction of red wine of the Merlot variety of 12 alcoholics was taken. It was subjected to extraction with supercritical carbon dioxide at a pressure of 9.5 Mpa, a temperature of 308 K and a ratio between the flow rate of carbon dioxide and the wine flow rate of 3.5. An extract of wine aroma was obtained. The residue from the previous extraction was subjected to extraction with supercritical carbon dioxide at a pressure of 9.5 Mpa, a temperature of 308 K and a ratio between the flow rate of carbon dioxide and the wine flow of 20. obtained a wine with an ethanol content of 1% and DPPH and ORAC values similar to the original wine. Low-ethanol wine aroma extract was added in a proportion of 10 ml of aroma extract per liter of wine.
  • hops Male flowers of hops (Humulus lupulus) were taken and subjected to a drying, milling, water extraction, filtration and subsequent drying process. They are then subjected to extraction with pressurized water in a proportion of plant material and 1: 3 water, pressure of 125 atm and temperature of 200 ⁇ C. An extract of hops enriched in isoxanthumol is obtained. Hop extract was added to the low ethanol wine at a rate of 50 ml per liter.
  • the animals were housed in groups of 4.
  • the animals were individually weighed at zero time.
  • the current regulations on animal protection for experimentation RD 1201/2005 were followed at all times.
  • the animals were distributed in 2 groups randomly. Each group was given a different beverage with the intention of evaluating the physiological effect of the prototype (hops group) against a negative control (control group).
  • the Animals received in the drinking water the different products in an amount equivalent to that of a moderate consumption of ethanol in man (300 ml / day - 70 Kg) (1.07 ml / animal / day).
  • the bottles were prepared daily and the animals had free access to the drink.
  • the liquid intake of the experimental unit (cage) was assessed daily for the verification of any increase or decrease in it.
  • the control group took a sugar solution (5.9 gr / l).
  • the animals received during the study and simultaneously with the administration of the different drinks, a diet rich in cholesterol (2%) ad libitum.
  • the animals followed the treatment for 12 weeks. After that period they were sacrificed by exanguination by intracardiac puncture and subsequent administration of KCI (1M) under inhalation anesthesia with 2% isofluorane (Forane ® ). Blood samples were collected to obtain serum and plasma. The blood collected by intracardiac puncture was transferred to tubes with EDTA and Gelatin (biochemistry) (6 ml). Plasma and serum were obtained by centrifugation (4,000 rpm for 10 min). In turn, the animals were dissected and the complete aortas, samples of heart, liver, kidney and adipose tissue (retoperitoneal fat) were obtained. All tissues were washed, coded and immediately frozen in liquid nitrogen. They were stored at -80 ⁇ C until analysis. Subsequent analyzes were performed under "blind" conditions.
  • the plasma lipid concentration of the animals was analyzed as the results show below:
  • Lipid peroxidation in fatty tissues liver, kidney and adipose
  • plasma as species reactive with thiobarbituric acid (milliequivalent MDA / mg protein or mL of plasma). Average values followed by the standard difference. The different letters in superscript indicate significant differences between the samples
  • composition of the invention is also effective in decreasing the levels of inflammation in adipose tissue.
  • composition of the invention allows the metabolic activity of adipose tissue to be modulated.

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Abstract

La presente invención se refiere a una bebida funcional que comprende vino desalcoholizado, aroma de vino, extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol y, opcionalmente extracto de orujo de uva y extracto de semillas de uva, y a un procedimiento para la obtención del extracto de lúpulo, así como al uso de dicha bebida en la prevención o tratamiento del síndrome metabólico.

Description

BEBIDA FUNCIONAL CARDIOSALUDABLE DE VINO Y EXTRACTOS DE LÚPULO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención pertenece al campo de los alimentos de uso específico para la salud constituidos por productos alimenticios enriquecidos con ingredientes bioactivos naturales. En particular, se refiere a los denominados alimentos funcionales, de forma específica al campo de las bebidas saludables, tratándose en concreto de una bebida a base de vino a la que se han incorporado extractos naturales con efectos antioxidantes y antiinflamatorios con efectos preventivos del riesgo cardiovascular.
ANTECEDENTES
En los últimos 10 años, la bibliografía internacional recoge numerosos artículos sobre trabajos de investigación que tratan de establecer las bases fisiológicas de la asociación entre vino y salud, puesta de manifiesto por numerosos estudios epidemiológicos (Sun, A. Y.; Simony, A.; Sun, G.Y. The "French paradox" and beyond: neuroprotective effects of polyphenols. Free Radical Biology and Medicine. 32: 314- 318; 2002). La mayoría de estos estudios demuestran ciertos efectos protectores de vino frente a enfermedades cardiovasculares. Durante mucho tiempo se ha mantenido la controversia de si es el etanol o la fracción polifenólica la responsable de las propiedades cardiosaludable del vino. En unos casos se atribuyen las propiedades saludables del vino a su contenido en etanol por los efectos de éste en el incremento de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) (McDonough, K. H. Antioxidant nutrients and alcohol. Toxicology 189:89-97; 2003) y su repercusión en diversos factores hemostáticos y en la función endotelial (Abou-Agag, L.H.; Khoo, N.K.; Binsack, R.; White, C.R.; Darley-Usmar, V.; Grenett, H.E.; Booyse, F.M.; Digerness, S.B.; Zhou, F.; Parks, D.A. Evidence of cardiovascular protection by modérate alcohol: role of nitric oxide. Free Radical Biology and Medicine 39:540-548; 2005). Pero, por el contrario, también es bien conocido que el etanol actúa como oxidante en diversas rutas metabólicas (Wu, D.; Cederbaum, A. I. Alcohol, oxidative stress, and free radical damage. Alcohol Research & Health. 27: 277-284; 2003). Recientemente, se han obtenido resultados de la fuerte asociación entre el consumo de etanol a niveles tan bajos como 10 g/día, y el incremento de los niveles circulatorios de lipoproteínas de baja densidad oxidadas, siendo independiente de si la bebida alcohólica es vino, cerveza o un licor (Schroder, H.; Marrugat, J.; Fito, M.; Weinbrenner, T.; Covas, M.l. Alcohol consumption is directly associated with circulating oxidized low-density lipoprotein. Free Radical Biology & Medicine. 40: 1474-1481; 2006).
Mann & Folts (Mann, L.B.; Folts, J.D. Effects of ethanol and other constituents of alcoholic beverages on coronary heart disease. Areview. Pathophysiology. 10 : 105- 112; 2004) proporcionan una interesante revisión sobre este tema. Estos autores consideran que los mecanismos que contribuyen a la iniciación y progreso de la arterosclerosis, son mecanismos con puntos finales específicos que pueden ser medidos directamente; y que en el otro extremo del espectro científico de la aterogénesis se encuentran los estudios epidemiológicos, que sugieren un efecto beneficioso por el consumo moderado de bebidas alcohólicas. Sin embargo, Mann & Folts (2004) afirman que, cuando uno mide los puntos finales específicos relacionados con la aterogénesis, tendría lugar que las bebidas alcohólicas con mayores contenidos en polifenoles ofrecen mayor protección frente a la arteriosclerosis que el etanol por sí solo. En lo que respecta a los polifenoles del vino, esta fracción tiene un efecto antiaterogénico a través de los cinco eventos claves del mismo. En cuanto al etanol, se le ha descrito efecto antiagregante plaquetario y capacidad de incrementar los niveles de HDLs, que debe ser contrapuesta, a la hora de evaluar la relación beneficio-riesgo, a su actividad prooxidante, haciendo que el balance entre alcohol y polifenoles en el vino pueda ser crítico sobre su efecto en la oxidación de las LDLs (Schroder, H.; Marrugat, J.; Fito, M.; Weinbrenner, T.; Covas, M.l. Alcohol consumption is directly associated with circulating oxidized low-density lipoprotein. Free Radical Biology & Medicine. 40: 1474-1481; 2006).
Por otro lado, los escasos estudios médicos de intervención, en los que se evalúa el efecto del vino en el estrés oxidativo, muestran un efecto positivo del vino tinto frente a la práctica ausencia de efecto en blanco, lo que confirma la responsabilidad de la fracción polifenólica (Pignatelli et al, 2006). Finalmente, haciendo un balance entre los pocos efectos positivos descritos para el etanol, y los adversos, cabe decir que este juega un papel químico en la estabilidad de los polifenoles del vino favoreciendo su solubilidad, biodisponibilidad, así como por el efecto sobre la microflora intestinal y los posibles metabolitos de degradación de los compouestos fenolicos, además de incrementar el ratio de excreccion vía aumento de diuresis (Manach, C; Scalbert, A.; Morand, C; Remesy C; Jiménez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. The American Journal of Clinical Nutrition 79: 727-747; 2004), por lo que un vino desalcoholizado (0^) no tendría un efecto idéntico al producto de partida, lo que explicaría el efecto diferente encontrado en algunos estudios (Mann, L.B.; Folts, J.D. Effects of ethanol and other constituents of alcoholic beverages on coronary heart disease. Areview. Pathophysiology. 10 : 105- 112; 2004).
Es creciente el número de publicaciones que relacionan el efecto saludable del vino con su contenido en compuestos fenolicos antioxidantes (Akcay Y.D.; Yildirim H.K.; Güvenc U.; Sózmen E.Y. The effects of consumption of organic and nonorganic red wine on low-density lipoprotein oxidation and antioxidant capacity in humans. Nutrition Research 24: 541-554; 2004). Estos compuestos proceden del metabolismo secundario de los vegetales. Se encuentran básicamente en las partes sólidas de cubertura, semillas, corteza u hojas. En la uva las mayores concentraciones están en los hollejos, semillas y raspones (36%, 38% y 20%, respectivamente) y muy poco (6%) en la pulpa. Su contenido depende de muchos factores como la variedad, las condiciones de cultivo de la vid y las prácticas enologicas. Los principales compuestos fenolicos presentes en las uvas y en los vinos son de tipo noflavonoide (derivados de ácidos hidroxicinámicos e hidroxibenzoicos), flavonoides (antocianos, flavonoles, flavanoles) y estilbenos (resveratrol, viniferin, piceid). Muchos de ellos poseen capacidad de neutralizar radicales libres y de acomplejamiento de metales de transición. Son conocidos como buenos antioxidantes lipidíeos, se ha descrito que ejercen efectos antiinflamatorios y que actúan como protectores de las LDL frente a la oxidación. Sin embargo, queda mucho por estudiar acerca de los mecanismos de su actividad in vivo ya que aún se sabe poco de su biodisponibilidad y de su metabolismo (Cerdá, B.; Llorach, R.; Cerón, J.J., Espín, J.C.; Tomás-Barberán, F.A. Evaluation of the bioavailability and metabolism in the rat of punicalagin, an antioxidant polyphenol from pomegranate juice. European Journal of Nutrition. 42: 18-28; 2003).
Otra línea de investigación sobre la relación vino y salud es el estudio del efecto del vino como protector de daños al DNA mediados por especies oxígeno reactivas. Los daños al DNA están asociados a enfermedades crónicas no transmisibles (Lu, T.; Pan, Y.; Kao, S.Y.; Li, C; Kohane, I.; Chan, J.; Yankner, B. Gene regulatíon and DNA damage in the ageíng human brain. Nature 429: 883-891; 2004). Los estudios realizados hasta el momento en esta línea, establecen una cierta relación entre efecto protector del vino frente a la oxidación del DNA atribuible a los compuestos fenólicos, pero queda mucho trabajo por hacer, ya que los resultados aun no son concluyentes (Greenrod, W.; Stockley, C.S.; Burcham, P.; Abbey, M.; Fenech, M. Modérate acute ¡ntake of de-alcoholised red wíne, but not alcohol, is protectíve against radíation-índuced DNA damage ex vivo— Results of a comparative ¡n vivo ¡ntervention study ¡n younger men. Mutation Research 591: 290-301; 2005)
Los compuestos fenólicos se podrían clasificar según su mecanismo de actuación sobre de las LDL. Así, se pueden distinguir los flavonoides, ácidos fenólicos, antocianinas y derivados que actúan por mecanismos no hormonales (anteriormente mencionados) que son compuestos propios del vino y productos derivados, y los fitoestrógenos propios del lúpulo, usado para aromatizar la cerveza, que actúan por mecanismos hormonales.
La fracción fenólica del vino, responsable de las propiedades cardiosaludables del mismo, presenta una alta complejidad en cuanto a su composición. Así, se pueden encontrar flavonoles como la quercetina, el kaemferol y la miricetina, flavan-3-oles como la catequina, epicatequina y taninos, además de antocianinas. Estos compuestos pueden estar presentes además, dependiendo de la naturaleza de cada uno de ellos, en forma libre como aglicón, como glucósido, ramnoglucósido o formando parte de estructuras poliméricas como las procianidinas. Junto a la fracción flavonoidea se encuentran otros fenoles no fenólicos como los derivados del ácido hidroxicinámico, como el cafeico y el p-cumárico, del ácido hidroxibenzoico, como el gálico, o del tipo de los estilbenos (Van de Wiel, A.; Van Golde, P.H.M.; Hart, H.C. Blessings of the grape. European Journal of International Medicine. 12: 484-489; 2001). Esta complejidad en la composición podría ser la responsable de los efectos sinergicos observados tanto in vitro (Cirico, T.L.; Omaye, S.T. Additive or synergetic effects of phenolic compounds on human low density lipoprotein oxidation. Food and Chemical Toxicology 44: 510-516; 2006) como in vivo (Pignatelli, P.; Ghiselli, A.; Buchetti, B.; carnevale, R.; Natella, F.; Germano, G.; Fimognari, F.; Di Santo, S.; Lanti, L; Violi, F. Polyphenols synergistically inhibit oxidative stress in subjects given red and white wine. Atherosclerosis. 188: 77-83; 2006). Este efecto abre la posibilidad de aumentar la actividad biológica de la fracción fenólica del vino mediante suplementación con polifenoles procedentes de la misma uva o de otras fuentes. Por su parte, los polifenoles presentes en la cerveza aportan los mismos efectos antioxidantes y efectos protectores de enfermedades cardiovasculares que se han descrito ya para los polifenoles del vino. Estos compuestos provienen fundamentalmente del lúpulo añadido a la cerveza para concederle su característico sabor amargo. El lúpulo contiene entre otros polifenoles xanthohumol y otros prenilflavonoides derivados. El xanthohumol y otras chalconas preniladas son tema de estudios recientes ya que parecen actuar como agentes químicos preventivos del cáncer. Otros derivados como la 8-prenilnaringenina, el producto de isomerización del desmetilxanthohumol se considera un potente fitoestrógeno (Stevens, J.F.; Page, J.E. Xanthohumol and related prenylflavonoids from hops and beer: to your good health. Phytochemistry. 65: 1317-1330; 2004).
Los fitoestrógenos son compuestos químicos de origen vegetal que muestran efectos sugestivos de estrogenicidad, como la unión a receptores de estrogenos, la inducción de respuestas genéticas estrógeno-especificas para la producción de ciertos compuestos, etc. Estos compuestos son estructuralmente similares a los estrogenos endógenos de mamíferos y pueden actuar como antagonistas o agonistas dependiendo de su concentración en los tejidos donde deben actuar.
La mayoría de los fitoestrógenos más conocidos, como la genisteina y la daidzeina (soja) se unen al receptor estrogénico beta (ER-β) mientras que la 8- prenilnaringenina del lúpulo, aunque un tipo de enantiomero también es capaz de unirse a este receptor, tiene una altísima afinidad y una alta selectividad por la forma alfa del receptor de estrogenos (ER-α), unas 100 veces mayor que genisteina (Shaefer, O.; Humpel, M.; Fritzemeier, K.H.; Bohlmann, R.; Schleuning, W.D. 8- Prenylnaringenin is a potent Eralpha selective phytoestrogen present in hops and beer. Journal of Steroid Biochemistry. Molecular Biology. 84: 359-360; 2003). Los receptores estrogénicos ER-α y ER-β tienen considerable homología y su diferencia parece ser que únicamente radica en que mientras que algunos tejidos, tales como los ovarios y el útero, expresan ambos receptores, otros tejidos expresan preferentemente un receptor más que otro.
La actividad de los fitoestrógenos no solo se reduce a mejorar la salud de las mujeres (actuando como el 170-estradiol, hormona femenina), también se ha demostrado que inhiben enfermedades cardiovasculares y reducen el riesgo de arteriosclerosis actuando como compuestos reductores del nivel de LDL en plasma, de colesterol y de triglicéridos bien por los mecanismos anteriormente mencionados por ser polifenoles o bien por otros mecanismos propios y específicos por su capacidad de actuar como hormonas.
Los efectos de los fitoestrógenos en las concentraciones plasmáticas lipídicas resultan de la acción estrógeno-receptor sobre la expresión hepática de genes de apoproteínas (ApoA, B, D y E, y Lp(a)). Estos incrementan las lipoproteínas de densidad alta (HDL), lipoproteína antiaterogénica, y reduce los niveles de las lipoproteínas de densidad baja (LDL) y de la lipoproteína(a) (Lp(a)), ambas lipoproteínas aterogénicas. También los fitoestrogenos, al interferir con la actividad del factor de transcripción NF-kB, producen una dramática reducción en la expresión de genes inflamatorios.
Existen numerosos estudios que sugieren además que los fitoestrogenos influyen la regulación del tono vascular. Las células endoteliales y musculares lisas vasculares expresan ambos receptores ER-α y ER-β. En la vasculatura coronaria, los estrogenos revierten la vasoconstricción inducida por acetilcolina, vía estimulación de la sintetasa del óxido nítrico, a través de la activación de ER-α. Los estrogenos tienen acciones vasodilatadoras rápidas y efectos a largo plazo que inhiben las respuestas el daño vascular, previniendo la ateroesclerosis. Los efectos rápidos probablemente ocurren sin cambios en la expresión genética (efectos no-genómicos), mientras que los efectos a largo plazo comprenden cambios en la expresión genética (efectos genómicos) mediada por los receptores (Mendelsohn, M.E.; Karas, R.H. Estrogen and the blood vessel wall. Current Opinión on Cardiology 9: 619-26; 1994).
Aunque son bien conocidas las propiedades saludables que confieren los compuestos fenólicos del vino y la cerveza, no se han descrito hasta la fecha las propiedades beneficiosas para la salud resultantes de la combinación de los compuestos fenólicos del vino con los fitoestrogenos procedentes del lúpulo.
Por otra parte, las técnicas tradicionales de extracción requieren de varios pasos que incluyen trituración y secado y, frecuentemente, del uso de disolventes orgánicos que pueden presentar problemas de residuos. Las extracciones basadas en fluidos presurizados pueden presentar la ventaja de realizar la extracción en un solo paso y no dejar trazas de disolventes orgánicos, por lo que han venido en denominarse como tecnologías limpias de extracción. Estas incluyen a la ESFC y a los globalmente conocidos como PLE Pressurized Liquid Extraction), en los que un disolvente es presurizado sin llegar a alcanzar su punto crítico. El uso combinado de altas temperaturas y altas presiones permite mejorar la capacidad del fluido extractante de disolver sustancias de la matriz, al mismo tiempo que se produce un aumento en la velocidad de transferencia de materia una disminución de la viscosidad y ruptura de la matriz, facilitando la extracción. De entre estas, el uso de agua presurizada y sobrecalentada recibe el nombre, de SWE (Subcritical Water Extraction). Esta última es la tecnología propuesta para extraer las fracciones fenólicas de uva y lúpulo destinadas a suplementar el vino desalcoholizado, al ser potencialmente más compatible con la polaridad de los compuestos polifenólicos de interés en este proyecto de investigación que las del C02 en condiciones supercríticas (Reglero, G., Señoráns, F.J., Ibáñez, E. Supercritical fluid extraction: an alternative for the isolation of natural food preservatives. En: Novel food processing technologies. Barbosa-Cánovas, G., Tapia, M.S., Cano, M.P. Eds. CRC Press. Boca Ratón. Florida. USA. pp. 539-554; 2005).
Cerca del punto crítico (374^C, 22.1 MPa) la constante dieléctrica (ε) del agua cae desde 80 hasta el rango de 30-3 comportándose como un disolvente orgánico fuerte o moderado, i.e. metanol (ε:33), etanol (ε:24), con lo que se pueden alcanzar condicionesde extracción similares a las realizadas con estos disolventes o mezclas binarias metanol agua similares a las utilizadas para la extracción industrial de polifenoles. Hasta el momento se han realizado algunos trabajos, bastante conservadores en el uso de disolventes, de extracción de polifenoles con PLE (Ju, Z.Y.; Howard, L.R. Effects of solvent and temperature on pressurized liquid extraction of anthocyanins and total poliphenolics from died red grape skin. Journa l of Agricultural and Food Chemistry 51: 5207-5213; 2003; Piñeiro, Z.; Palma, M.; Barroso, C.G. Determination of catechins by jeans of extraction with pressurized liquids. Journal of Chromatography A. 1026: 19-23; 2004). A este respecto, se ha utilizado metanol a temperaturas con rango entre 80 ^c y 130 ^c para la extracción de polifenoles de uva, en particular catequinas y antocianinas. Por el contrario, en nuestro grupo de investigación hemos realizado varios estudios, en los que hemos extraído de forma efectiva diferentes tipos de polifenoles con estructura de flavona, flavanona y flavanol a partir de orégano (Rodriguez-Meizoso, I.; Marín, F.R.; Herrero, M.; Señorans, F.J.; Cifuentes, A.; Ibáñez, E. Subcritical water extraction of antioxidants from orégano. Chemical and functional characterization. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. Special Issue in Nutraceutical Analysis. 41: 1560-1565; 2006) así como terpenos fenólicos procedentes de romero (Ibáñez, E.; Kubatova, A.; Señorans, F.J.; Cavero, S.; Reglero, G.; Hawthorne, B. Subcritical water extraction of antioxidant compounds from rosemary plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51: 375-382; 2003). Igualmente, miembros del grupo de investigación, han realizadoe studios preliminares en donde se confirma que extracciones secuenciales con SWE permiten obtener rendimientos de extracción para catequinas y aprocianidinas superiores a los obtenidos con las solucines hidroalcohólicas de metanol :agua (75:25) tradicionalmente usadas (García-Marino, M.; Rivas-Gonzalo, J.C.; Ibañez, E.; García-Moreno, C. Recovery of catechins and proanthocyanidins from winery by-products using subcritical water extraction. Analytica Chimica Acta 56344-56350; 2006). Por el contrario, no se han encontrado referencias bibliográficas respecto al uso de SWE en la extracción de fitoestrógenos de lúpulo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han encontrado que la combinación de vino desalcoholizado, aroma de vino y un extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol posee una importante actividad para deprimir las señales inflamatorias y estimular las antiinflamatorias tanto en presencia como en ausencia de desencadenantes de ateroesclerosis como partículas LDL oxidadas. Asimismo, la administración de dicha combinación permite controlar los niveles de triglicéridos plasmáticos e impedir su incremento en dietas hipercolesterolémicas, así como disminuir la inflamación, reducir el estrés oxidativo y la peroxidación lipídica en órganos con alto contenido en grasa como el tejido adiposo, y modular la actividad metabólica, propiedades todas ellas que permiten reducir la aparición de factores de riesgo que conducen al desarrollo de ateroesclerosis y enfermedades cardiovasculares. Por tanto, en un primer aspecto la invención se relaciona con una composición (de aquí en adelante composición de la invención) que comprende vino desalcoholizado, aroma de vino y extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol.
En una realización particular, la composición comprende además extracto de orujo de uva y extracto de semillas de uva.
Un segundo aspecto de la presente invención lo constituye un procedimiento para la preparación de una composición como se ha definido previamente, que comprende la adición del aroma de vino, del extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol y, opcionalmente del extracto de orujo de uva y extracto de semillas de uva, sobre el vino desalcoholizado.
Adicionalmente, se ha desarrollado un procedimiento que permite la obtención de extractos enriquecidos en isoxantohumol de manera selectiva, favoreciendo la extracción del isoxantohumol y simultáneamente la transformación del xantohumol en isoxantohumol en un solo paso, conservando además la presencia de α y β- ácidos característicos de la lupulina, así como de otros compuestos químicos propios del lúpulo.
Así, la presente invención también se dirige a un procedimiento para la obtención de extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol que comprende: a) proporcionar materia prima vegetal procedente de lúpulo;
b) secado de dicha materia prima vegetal;
c) trituración o molienda de la materia prima vegetal seca;
d) extracción de la materia prima vegetal seca y molida con agua presurizada y sobrecalentada en condiciones de temperatura comprendida entre 25 y 374^C y presión comprendida entre 100 y 218 bares.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol que comprende: a) 0.05-80% en peso seco de prenilflavanona isoxantohumol; b) 0.001-10% en peso seco de prenilchalcona xantohumol; y
c) 1-90% en peso seco de α y β-ácidos seleccionados entre cohumulona, n- humulona, ad-humulona, iso-co-humulona, iso-n-humulona, iso-ad- humulona, colupulona, n-lupulona y ad-lupulona, además de azúcares, polisacáridos y aminoácidos.
La presente invención también se relaciona con una bebida funcional que comprende una composición como se ha definido previamente. Dicha bebida presenta además unas propiedades sensoriales análogas al vino.
Un aspecto adicional de la presente invención lo constituye el uso de una composición como se ha definido previamente o de la bebida funcional que la comprende para la preparación de un medicamento dirigido a la prevención o tratamiento del síndrome metabólico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: Efecto comparativo de extractos de lúpulo sobre la producción d citoquinas en macrófagos THP-1. Tratamientos: 1. Control; 2. I ndometacin ^g/mL); 3. Extracto de lúpulo (1,5 μg/mL); 4. Isoxantohumol contenido en e extracto (10 ng/mL).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención se dirige a una composición que comprende vino desalcoholizado, aroma de vino y extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol.
Se ha observado que la suplementacion de los componentes fenólicos presentes en el vino desalcoholizado, responsables de la actividad antioxidante y antiinflamatoria del vino, con fitoestrógenos presentes en el lúpulo, y en particula r con isoxantohumol, permite tratar, o al menos prevenir, los riesgos que conducen a l desarrollo de ateroesclerosis y enfermedades cardiovasculares, y que constituyen algunos de los síntomas del síndrome metabólico.
Vino desalcoholizado
El vino desalcoholizado es el componente base de la composición de la invención. Por vino desalcoholizado debe entenderse un vino con un contenido en alcohol inferior al 1.2% en volumen, preferentemente inferior al 1% en volumen. Dicho vino desalcoholizado debe mantener además su actividad biológica lo menos alterada posible.
Así, el vino desalcoholizado comprende la fracción fenólica del vino responsable de la actividad biológica, es decir, la que le confiere sus propiedades antioxidantes y antiinflamatorias. Dicha fracción fenólica comprende los compuestos fenólicos del vino como flavonoles, entre los que se encuentran la quercetina, el kaemferol y la miricetina; flavan-3-oles como la catequina, epicatequina y taninas, además de antocianinas. Estos compuestos pueden estar presentes, dependiendo de la naturaleza de cada uno de ellos, en forma libre como aglicón, como glucósido, ramnoglucósido o formando parte de estructuras poliméricas como las procianidinas. Junto a la fracción flavonoidea se encuentran otros fenoles como los derivados del ácido hidroxicinámico, entre los que se encuentran el ácido cafeico y el ácido p-cumárico, y los derivados del ácido hidroxibenzoico como el ácido gálico, o derivados de estilbeno.
El vino desalcoholizado se obtiene a partir de cualquier procedimiento que permita reducir el contenido en etanol del vino hasta un porcentaje inferior al 1.2% en volumen. Dado que el vino suele contener más de un 10% en volumen de etanol, es preciso eliminar selectivamente dicho etanol en condiciones en las que no resulte alterada la actividad biológica del vino. La desalcoholización o eliminación parcial o total del contenido alcohólico en vino puede realizarse mediante distintas técnicas conocidas en el estado de la técnica que incluyen procesos de destilación con recuperación de los aromas, evaporación en columnas de platos con flujo descendente, como columnas de rectificación o columnas críticas centrífugas, procesos de separación por difusión a través de membranas semipermeables, como diálisis, osmosis inversa, pervaporación o extracción con fluidos supercríticos.
No obstante, en una realización preferente la desalcoholización del vino se efectúa mediante extracción del vino base con fluidos supercríticos, dado que es la técnica que mejor permite conservar tanto las propiedades biológicas como las organolépticas del vino base.
La desalcoholización de bebidas por medio de extracción con fluidos supercríticos se fundamenta en el equilibrio termodinámico que se establece entre las fases que se ponen en contacto, es decir la bebida alcohólica y el solvente supercrítico (una sustancia en condiciones de temperatura y presión por encima de sus valores críticos). En estas condiciones el solvente tiene unas propiedades que lo hacen particularmente atractivo para ser utilizado como agente de extracción, ya que es un gas denso, mantiene propiedades de transporte similares a las de los gases, y posee a la vez un gran poder solvente por tener densidades típicas de los líquidos. Las ventajas que ofrece la tecnología de fluidos supercríticos como alternativa a los procedimientos tradicionales de extracción y fraccionamiento son bien conocidas en el estado de la técnica y consisten en la conservación de sus propiedades naturales, debido a las bajas temperaturas de procesamiento, y a la ausencia de riesgos de permanencia de residuos. Por otro lado, la tecnología de fluidos supercríticos permite rapidez de procesado (por ejemplo, eliminación del solvente de los solutos simplemente por despresurización), alta selectividad y nula agresión medioambiental.
En una realización particular, el vino desalcoholizado se obtiene mediante extracción supercrítica en contracorriente utilizando dióxido de carbono como fluido o solvente supercrítico. De forma preferente, el dióxido de carbono se encuentra a una temperatura comprendida entre 40 y ÍOO^C y a una presión comprendida entre 200 y 400 bares. Este método permite reducir el contenido de alcohol a concentraciones menores al 1% en volumen y mantener una actividad antioxidante similar a la del vino de partida. A modo de ejemplo, el procedimiento de extracción supercrítica con dióxido de carbono consiste en introducir el vino de partida, o vino base, por la parte superior de una columna apta para realizar la extracción con dióxido de carbono en condiciones supercríticas en contracorriente, mientras que por la parte inferior de la columna, se introduce el dióxido de carbono. La presión en el interior de la columna puede estar comprendida entre 5 y 11 MPa, preferentemente entre 9 y 10 MPa, mientras que la temperatura de la columna puede oscilar entre 32 y 50^C, preferentemente entre 37 y 42^C. La relación entre el caudal de dióxido de carbono y el caudal de vino oscila entre 10 y 40, preferentemente entre 18 y 22. El vino con un contenido reducido en etanol se recoge en un recipiente colocado en la parte inferior de la columna y conectado con la misma.
Este procedimiento permite además recoger en la parte superior de la columna el extracto que contiene los compuestos responsables del aroma del vino. Así, una ventaja importante de la tecnología de extracción supercrítica, respecto de las demás técnicas de desalcoholización mencionadas previamente, radica en la posibilidad de recuperar una fracción importante del aroma simplemente por despresurización parcial del mencionado extracto, pudiéndose modificar la calidad del aroma recuperado variando las condiciones de extracción y de fraccionamiento. Por tanto, mediante la técnica de extracción con fluidos supercríticos se puede obtener tanto el vino desalcoholizado como el aroma de vino, y la mezcla resultante permite conservar tanto las propiedades biológicas como las propiedades organolépticas del vino base o vino de partida.
Aroma de vino El aroma de vino lo constituyen numerosos compuestos orgánicos volátiles entre los que destacan ésteres y alcoholes como componentes mayoritarios.
Tal como se ha mencionado previamente, el aroma de vino se puede obtener también mediante extracción supercrítica en contracorriente utilizando dióxido de carbono como fluido o solvente supercrítico según el procedimiento anteriormente mencionado.
En una forma de realización preferente, el dióxido de carbono se encuentra a una temperatura comprendida entre 40 y 70 y a una presión comprendida entre 80 y 200 bares.
A modo de ejemplo, se introduce el vino de partida, o vino base, por la parte superior de una columna apta para realizar la extracción con dióxido de carbono en condiciones supercríticas en contracorriente, mientras que por la parte inferior de la columna, se introduce el dióxido de carbono. La presión en el interior de la columna puede estar comprendida entre 5 y 11 MPa, preferentemente entre 9 y 10 MPa, mientras que la temperatura de la columna puede oscilar entre 32 y 50^C, preferentemente entre 37 y 42^C. La relación entre el caudal de dióxido de carbono y el caudal de vino oscila entre 1 y 6, preferentemente entre 2 y 4. El extracto aromático se recoge en un recipiente colocado en la parte superior de la columna y conectado con la misma mantenido a una presión entre 3 y 6 MPa y a una temperatura entre 29 y 37^C. Por cada litro de vino se recogen entre 10 y 30 mL de extracto aromático. Dicho extracto muestra un olor intenso y muy similar al del vino de partida y un aspecto transparente, sin color.
Extracto de lúpulo
El lúpulo (Humulus lupulus) es una planta del género humulus, perteneciente a la familia de las Cannabáceas. El lúpulo contiene, entre otros polifenoles, un prenilflavonoide como el xantohumol, así como derivados del mismo.
El extracto de lúpulo contenido en la composición de la invención está enriquecido en isoxantohumol, producto de isomerización del xantohumol, que también se encuentra presente en el lúpulo aunque en menores proporciones.
La relación de ¡soxantohumohxantohumol en el material vegetal de origen es de aproximadamente 1:8, por lo que para obtener un extracto de lúpulo rico en ¡soxantohumol se requiere aumentar la proporción de isoxantohumol, bien realizando una extracción selectiva de dicho componente o bien transformado el xantohumol en isoxantohumol.
Los autores de la presente invención han desarrollado un procedimiento que, a diferencia de los procesos de extracción mediante disolventes orgánicos, de síntesis química o de extracción de xantohumol y transformación en isoxantohumol utilizados en el estado de la técnica, permite la obtención de extractos enriquecidos en isoxantohumol de manera selectiva, favoreciendo la extracción del isoxantohumol y simultáneamente la transformación del xantohumol en isoxantohumol en un solo paso, conservando además la presencia de a y β-ácidos característicos de la lupulina, así como de otros compuestos químicos propios del lúpulo, permitiendo así aprovechar las propiedades farmacológicas de la planta. Dicho procedimiento utiliza como disolvente de extracción agua sobrecalentada y presurizada, en condiciones cercanas a su punto crítico. El procedimiento desarrollado se basa fundamentalmente en el acondicionamiento de la materia prima vegetal y en la modificación de las condiciones físicas a las que se realiza el proceso de extracción, aprovechando la variación del comportamiento químico del agua como disolvente, para obtener extractos vegetales enriquecidos en isoxantohumol y producir simultáneamente la isomerización del xantohumol en el anterior, utilizando el comportamiento de este último en condiciones de alta temperatura.
Así, en un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un procedimiento para la obtención de extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol que comprende: a) proporcionar materia prima vegetal procedente de lúpulo;
b) secado de dicha materia prima vegetal;
c) trituración o molienda de la materia prima vegetal seca;
d) extracción de la materia prima vegetal seca y molida con agua presurizada y sobrecalentada en condiciones de temperatura comprendida entre 25 y 374^C y presión comprendida entre 100 y 218 bares.
Como materia prima vegetal más adecuada para utilizarse en este procedimiento, pueden mencionarse los amentos o conos femeninos de la planta, sus productos deshidratados y presentados en cualquier forma, así como la torta extenuada de los procesos de extracción de la lupulina, tanto procedente de métodos tradicionales como de extracción con fluidos supercríticos.
El secado de la parte de la planta a utilizar puede llevarse a cabo en una estufa o en un secadero con corriente de aire forzado a una temperatura comprendida entre 55 2C y 65 2C, preferentemente a 60 ^c. La duración del secado es variable dependiendo de la cantidad de materia prima a secar y del estado de humedad en que se encuentre la misma pudiendo variar entre unas cuantas horas y varios días. Un periodo de secado habitual puede ser de aproximadamente 1 día.
En una realización particular, la materia prima seca se tritura, utilizando por ejemplo un molino, hasta un tamaño de partícula entre 500 μιη y 1000 μιη. Este producto así secado y molido constituye la materia prima vegetal que se somete al proceso de extracción con el agua presurizada y sobrecalentada.
Dicha extracción se lleva a cabo en un dispositivo adecuado capaz de generar las presiones y las temperaturas utilizadas en este procedimiento. Así, en una realización particular, una vez colocado el material vegetal, convenientemente secado y molido, en un vaso de extracción, se procede a llenarlo de agua a la que se le habrá retirado el oxígeno disuelto, mediante cualquiera de los procedimientos disponibles. La proporción de material vegetal/agua puede oscilar desde 1/3 hasta cualquier proporción de agua mayor de 3. A continuación, y una vez lleno el vaso de extracción, se procede a precalentar el vaso hasta alcanzar la temperatura y la presión de extracción. La temperatura puede oscilar entre 25 y 374 ^c, preferentemente entre 100 y 250 ^c, mientras que la presión puede hacerlo entre 100 y 218 bares, preferentemente entre 125 y 200 bares. El proceso puede realizarse mediante diferentes ciclos extractivos. El número de ciclos puede oscilar entre 1 y 10 ciclos, con una duración entre 3 y 60 minutos cada uno de los ciclos. Una vez transcurrido ese tiempo se recoge el extracto acuoso, se filtra y se deja enfriar. Tras la filtración se obtiene una suspensión acuosa en la que el isoxanthohumol pierde progresivamente su solubilidad como consecuencia de la variación del comportamiento como disolvente del agua con la variación de las condiciones físicas, por lo que es necesario realizar de manera inmediata la separación del sólido y de la suspensión acuosa. Para la obtención del extracto seco se procede a eliminar el agua, de dicha suspensión, mediante cualquiera de los procedimientos existentes.
Los extractos vegetales, obtenidos mediante el presente procedimiento, tienen la ventaja de poder ser utilizados directamente en la formulación de distintos tipos de alimentos enriquecidos sin aportar ningún tipo de disolvente químico al alimento. Una ventaja adicional de este procedimiento radica en la utilización del agua como único disolvente, evitándose así la presencia de impurezas o residuos de disolventes orgánicos, de otros reactivos o de posibles reacciones secundarias.
El procedimiento descrito en la presente invención proporciona un extracto enriquecido en isoxantohumol en el que se invierte la relación entre ¡soxantohumohxantohumol, pasando de relaciones inferiores a 1:8 en el material vegetal de origen, a relaciones superiores a 10:1 en el extracto obtenido conforme a dicho procedimiento.
En una forma de realización preferente, el extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol comprende: - 0.05-80% en peso seco de prenilflavanona isoxantohumol;
0.001-10% en peso seco de prenilchalcona xantohumol; y
1-90% en peso seco de α y β-ácidos seleccionados entre cohumulona, n- humulona, ad-humulona, iso-co-humulona, iso-n-humulona, iso-ad- humulona, colupulona, n-lupulona y ad-lupulona, además de azúcares, polisacáridos y aminoácidos.
De forma aún más preferente, el extracto de lúpulo enriquecido en isoxantumol comprende: - 0.2-60% en peso seco de prenilflavanona isoxantohumol;
0.01-1% en peso seco de prenilchalcona xantohumol; y
10-50% en peso seco de a y β-ácidos seleccionados entre cohumulona, n-humulona, ad-humulona, iso-co-humulona, iso-n-humulona, iso-ad- humulona, colupulona, n-lupulona y ad-lupulona, además de azúcares, polisacáridos y aminoácidos.
Extractos de orujo y semillas de uva
Cuando el vino base utilizado como producto de partida para la obtención del vino desalcoholizado y del aroma de vino es tinto, éste suele contener polifenoles suficientes como proporcionar una alta actividad antioxidante y antiinflamatoria. Sin embargo, cuando el vino base posee una actividad antioxidante baja, bien por tratarse por ejemplo de un vino rosado o de un vino blanco, es conveniente adicionar un extracto rico en polifenoles. De forma particular, dicho extracto procede de orujos y/o de semillas de uva. Así, en una realización particular, la composición de la invención comprende además extracto de orujo de uva y extracto de semillas de uva.
Dichos extractos se pueden obtener a partir de los hollejos y semillas de la uva utilizando un procedimiento de extracción sólido/líquido convencional.
Así, en una realización particular, se lleva a cabo la extracción por separado de hollejos y semillas. El orujo se recoge inmediatamente después de su prensado y se separa en semillas y hollejos de una forma mecanizada, utilizando un separador de tamices vibratorio. Las semillas se secan en un secadero con aire forzado a temperaturas comprendidas entre 60 y 90^C, preferentemente entre 70^C y 80^C. Se almacenan en frío para su posterior extracción, mientras los hollejos se someten a extracción inmediatamente después de su separación.
La extracción sólido/líquido se lleva a cabo sobre ambos sustratos, hollejos y semillas, con agua y S02 a distintas temperaturas y con mezclas hidroalcoholicas con y sin S02. Se aplican procedimientos de extracción convencional sólido-líquido con proporciones etanol/agua que varían entre 90/10 y 50/50 a temperaturas entre 50 y 80^C, preferentemente entre 60^C y 70^C. Las mayores proporciones de etanol favorecen la extracción de compuestos fenólicos (tanto de semillas, como de hollejos) y al mismo tiempo suprimen la extracción de compuestos no deseables (oligo y policarbohidratos), lo que indica que los extractos obtenidos con mayor contenido en etanol tienen mayor contenido en polifenoles y, por tanto, son de mayor interés para ser utilizados como aditivos en preparación de la composición de la invención.
Posteriormente, todos los extractos hidroalcohólicos se destilan y se restauran con agua hasta su volumen original. Se obtienen extractos con una actividad antioxidante 40 veces superior a la natural de un vino, para el mismo volumen.
La adición de extracto alcohólico de orujo y semillas de uva refuerza las propiedades antioxidantes de la composición, sin incrementar sustancialmente su grado alcohólico y sin alterar significativamente sus propiedades sensoriales.
Composición de la invención
De forma preferente, la composición de la invención comprende:
50-98.9% en peso de vino desalcoholizado;
1-20% en peso de aroma de vino;
- 0.1-20% en peso de extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol, y opcionalmente:
0-20% en peso de extracto de orujo de uva; y
0-20% en peso de extracto de semillas de uva. En una realización preferente, el aroma de vino se encuentra en una proporción de entre 9 y 11% en peso.
En una realización preferente, el extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol se encuentra en una proporción de entre 0.1 y 5% en peso, más preferentemente entre 0.1 y 1% en peso.
En una realización preferente, el extracto de orujo de uva se encuentra en una proporción de entre 0.1 y 5% en peso, más preferentemente entre 0.1 y 1% en peso.
En una realización preferente, el extracto de semillas de uva se encuentra en una proporción de entre 0.1 y 5% en peso, más preferentemente entre 0.1 y 1% en peso.
En otra forma de realización preferente, la composición de la invención contiene una proporción de etanol inferior al 1.2% en peso, más preferentemente inferior al 1% en peso, aún más preferentemente inferior al 0.5% en peso. La composición de la invención se caracteriza además por no contener trazas de disolventes orgánicos distintos de etanol.
En un aspecto adicional, la presente invención se dirige a un procedimiento para la preparación de la composición de la invención, donde dicho procedimiento comprende la adición del aroma de vino, del extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol y, opcionalmente, del extracto de orujo de uva y del extracto de semillas de uva, sobre el vino desalcoholizado.
En una realización preferente, los distintos componentes de la formulación se adicionan en las proporciones mencionadas anteriormente.
Bebida funcional
En un aspecto adicional, la presente invención se dirige a una bebida funcional que comprende la composición de la invención. En el contexto de la presente invención, por "bebida funcional" se debe entender una bebida tradicional que ha sido modificada en su composición incorporando sustancias que no contiene de forma natural, con el fin de que adquiera una actividad biológica beneficiosa para la prevención o mejora de enfermedades. En la presente invención, dicha bebida comprende vino desalcoholizado y aroma de vino procedente de un vino base al que se incorpora un extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol. De manera opcional, se puede adicionar a dicha bebida un extracto de orujo de uva y un extracto de semillas de uva. Dicha bebida presenta unas propiedades sensoriales análogas al vino. Dicha bebida funcional puede comprender además vitaminas o precursores de vitaminas, entre las que se incluyen vitamina A, ácido ascórbico (Vitamina C), beta caroteno, niacina (Vitamina B3), riboflavina (Vitamina B2), tiamina (Vitamina Bl), niacinamida, folato o ácido fólico, alfa-tocoferoles o ésteres de los mismos, Vitamina D, Vitamina E, Vitamina K, retinil acetato, retinil palmitato, piridoxina (Vitamina B6), ácido fólico (Vitamina B9), cianocobalimina (Vitamina B12), ácido pantoténico, biotina y combinaciones de las mismas.
Asimismo, dicha bebida puede incluir aromatizantes, agentes potenciadores del sabor, aditivos, agentes colorantes, emulsificantes, mineraels, micronutrientes, conservantes, estabilizadores, agentes espesantes y combinaciones de los mismos. El consumo de dicha bebida funcional de forma regular a lo largo del día puede resultar una manera efectiva de mantener una concentración suficiente de ingredientes funcionales que proporcionan el efecto terapéutico o profiláctico deseado.
Indicaciones profilácticas y terapéuticas
Los ensayos in vitro aportados en la presente solicitud han puesto de manifiesto que la administración de una bebida funcional que comprende la composición de la invención permite estimular la producción de la citoquina antiinflamatoria IL-10 en macrófagos THP-1 nativos, en ausencia y presencia de partículas de lipoproteínas LDL oxidadas desencadenantes de ateroesclerosis. Asimismo, reduce la producción de citoquinas inflamatorias como TNF-α y I L-6, en presencia de dichas partículas de LDL oxidadas. El papel de las partículas de LDL oxidadas en la aterogénesis se desarrolla mediante múltiples rutas. Inducen la expresión de señales de adhesión y quimiotácticas en células endoteliales. Esta sobreexpresion resulta, en la unión de los monocitos a las células endoteliales dentro de la pared arterial, su entrada en el sistema vascular, su diferenciación en macrófagos, y finalmente su transformación en células floculantes. Asimismo, estimulan a las células T a través del MHC y el receptor CD4+helperT-cell receptor. Las células T secretan IL-1 que incrementa la proliferación de células de músculo liso, IL-2 que activa a los monocitos e incrementa la proliferación de las células T, e induce IFN-γ que induce la expresión de MHC en las células endoteliales y de músculo liso, generando un proceso de retroalimentación. Además, los macrófagos ya activados secretan una amplia variedad de citoquinas (TNF-a, TGF-β, M-CSAF, etc) que influyen sobre la expresión de otros mediadores como el NO. De manera adicional, los aldehidos producidos en la oxidación de las LDLs ejercen un efecto tóxico directo sobre el endotelio y las plaquetas (Kaliora, A.C.; Dedoussis, G.V.Z.; Schmidt, H. Dietary antioxidants in preventing atherogenesis. Atherosclerosis 187: 1-17; 2006).
Por otra parte, los ensayos in vivo sobre ratones sometidos a una dieta enriquecida en colesterol han demostrado que la administración de dicha bebida permite un eficaz control de los niveles de triglicéridos plasmáticos impidiendo su incremento. Asimismo, dicha bebida provoca un eficaz descenso de los niveles de oxidación en órganos con alto contenido en grasas, como es el caso de hígado, riñon y tejido adiposo, así como un descenso de los niveles inflamatorios en tejido adiposo y una eficaz modulación de la actividad metabólica de dicho tejido adiposo.
Como se verá más adelante, todos estos ensayos están relacionados con distintos factores de riesgo que conducen al desarrollo de ateroesclerosis y enfermedades cardiovasculares. Por tanto, un aspecto adicional de la presente invención lo constituye el uso de una composición que comprende vino desalcoholizado, aroma de vino y extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol, para la preparación de un medicamento dirigido a la prevención o tratamiento del síndrome metabólico. Por "síndrome metabólico" debe entenderse un conjunto de factores de riesgo y condiciones físicas que incrementan la propensión a desarrollar patologías tales como diabetes tipo 2, ateroesclerosis y enfermedades cardiovasculares. Existen distintas definiciones entre la que destaca la de la federación internacional de diabetes (The International Diabetes Federation: The IDF consensus worldwide definition of the metabolic syndrome, 2005 Disponible en: http://www.idf.org/webdata/docs/Metac). A pesar de la falta de consenso en las directrices para el diagnóstico del síndrome metabólico, existen evidencias que soportan las alteraciones metabólicas asociadas al desarrollo de esta enfermedad.
Así, entre los factores de riesgo que incrementan el desarrollo de la ateroesclerosis se incluye la dislipemia aterogénica. Clínicamente, la dislipemia aterogénica se caracteriza por elevados niveles de triglicéridos, incremento de lipoproteínas de baja densidad (LDL) especialmente las partículas de menor tamaño y mayor densidad (sdLDL) y descenso de los niveles de lipoproteínas de alta densidad (HDL). También se ha descrito un incremento de los niveles circulantes de LDL oxidado asociado al síndrome metabólico. Generalmente la dislipemia aterogénica precede a la manifestación clínica del síndrome metabólico.
Dado que la composición de la invención ha demostrado controlar e impedir el aumento en los niveles de triglicéridos, dicha composición resulta de utilidad en el tratamiento de la dislipemia aterogéncia. Por tanto, en una realización preferente la composición de la invención se dirige a la prevención o tratamiento de la dislipemia aterogénica.
Por otra parte, otro de los principales causantes del síndrome metabólico es la obesidad. El mecanismo de acción está relacionado con un incremento en el estrés oxidativo de las grasas acumuladas. Se ha demostrado una correlación directa entre los niveles de estrés oxidativo sistémico y los depósitos de grasa acumuladas, ta nto en humanos como en modelos murinos (Carriére A, Carmona MC, Fernandez Y, Rigoulet M, Wenger RH, Pénicaud L, Casteilla L. Mitochondrial reactive oxygen species control the transcription factor CHOP-10/GADD153 and adipocyte differentiation : a mechanism for hypoxia-dependent effect. J Biol Chem. 2004 Sep 24;279(39):40462-9, 2004). Por lo tanto, la obesidad en sí misma se ca racteriza por un incremento del estrés oxidativo a nivel de tejido adiposo. Este estrés oxidativo incrementa la proliferación de preadipociotos y su posterior diferenciación, modulado por factores de tra nscripción sensibles a los radicales libres. Por lo ta nto, se produce un ciclo retroalimentativo en el incremento de tejido adiposo que incrementa el estrés oxidativo, que a su vez promueve la síntesis de triglicéridos y la diferenciación de adipocitos por lo que se promueve y amplifica la base de la obesidad.
En este sentido, la composición de la invención ha demostrado reducir significativamente los niveles de estrés oxidativo y peroxidación lipídica en órga nos con alto contenido en grasa como hígado, riñon y tejido adiposo.
En consecuencia, en otra rea lización preferente la composición de la invención se dirige a la prevención o tratamiento de la obesidad.
Como se ha descrito anteriormente, ante un proceso de estrés oxidativo la proliferación del tejido adiposo aumenta, incrementando el volumen del tejido, que en determinados niveles puede afectar a los vasos circulatorios, de tal manera que la irrigación sanguínea se ve afectada. Ocurren por tanto situaciones localizadas de hipoxia que tienen como consecuencia el desencadenamiento de procesos celulares de apoptosis. Esta situación da inicio a un proceso inflamatorio, aumentando la producción de citoquinas proinflamatorias e infiltración de macrófagos en el tejido adiposo. Los adipocitos, preadipocitos y otras células, pueden sintetizar TNF-α, y varias interleucinas, sobre todo I L-lbeta e I L-6. Se ha descrito que los niveles de marcadores de inflamación como TNF-α, I L-6 y Proteína C reactiva se encuentran sistemáticamente elevados en individuos y modelos animales obesos. En los ensayos aportados, se ha demostrado que la administración de la composición de la invención reduce de forma significativa los niveles de expresión génica de la citoquina proinflamatoria TNF-α en tejido adiposo, lo que provoca un descenso en los niveles de inflamación en dicho tejido. Por tanto, en otra realización preferente la composición de la invención se dirige a la prevención o tratamiento de la inflamación, y de forma particular en el tejido adiposo.
Asimismo, en el proceso del desarrollo del síndrome metabólico se produce una desregulación en cuanto al uso de lípidos y carbohidratos como fuentes de energía, lo que conduce a una disfunción metabólica. Se producen situaciones anómalas que se asocian al proceso que desencadena la resistencia a insulina. En este proceso el músculo esquelético y el tejido adiposo juegan un papel clave en la utilización correcta de los triglicéridos circulantes o almacenados. En un correcto funcionamiento del tejido adiposo, el exceso de glucosa circulante es absorbido por los adipocitos estimulados por insulina. Los carbohidratos son metabolizados en triglicéridos para su almacenamiento. En caso de necesidad energética, los adipocitos liberan al torrente sanguíneo ácidos grasos libres, para su utilización como fuente de energía por parte del músculo esquelético e hígado.
En el caso del síndrome metabólico, se produce una desregulación de los adipocitos, liberando ácidos grasos al torrente sanguíneo cuando no es necesario, aumentando el riesgo aterogénico. En el control de la regulación metabólica del tejido adiposo, los receptores activados por proliferación de peroxisomas (PPAR) juegan un papel crucial. Son factores de transcripción que se activan por la unión de ligandos específicos (naturales o sintéticos) y regulan la expresión de genes involucrados en el metabolismo de los lípidos y de la glucosa, formando así una conexión directa entre las señales extracelulares y la expresión de genes. Existen tres subtipos de PPARs, los PPARa, PPARb/d y PPARg, cuya expresión es tejido- específica. La activación farmacológica de estos receptores con ligandos específicos ha permitido evidenciar su papel en la fisiología celular. Actualmente se utilizan en la clínica dos tipos de activadores, los fibratos específicos para los PPARa con efecto hipolipemiante, y las tiazolidinedionas o glitazonas, agonistas PPARg (Zariwala, Mark J. Holness. PPARs and the orchestration of metabolic fuel selection Pharmacological Research 60 (2009) 141-150) con acción hipoglucemiante, cuyos principales efectos radican en la activación de la oxidación y movilización de lípidos, y en la sensibilización de los tejidos periféricos a la acción de la insulina. Además de su efecto benéfico sobre la homeostasis lipídica y de la glucosa, la activación de los PPARs confiere protección al miocardio en el desarrollo de enfermedades y participa en la modulación de la respuesta inflamatoria
En este sentido, los ensayos sobre los niveles de expresión génica de PPAR en tejido adiposo han evidenciado que la administración de la composición de la invención aumenta los niveles de expresión génica de dicho factor de transcripción, por lo que dicha composición resulta de utilidad para el tratamiento de la disfunción metabólica.
Por tanto, en otra realización preferente, la composición de la invención se dirige a la prevención o tratamiento de la disfunción metabólica, y de forma particular de la disfunción metabólica en el tejido adiposo.
Ejemplos
EJEMPLO 1. Evaluación in vitro de la actividad antiinflamatoria de una bebida funcional a base de vino desalcoholizado y extracto de lúpulo.
Se preparó una bebida funcional según el siguiente procedimiento. Se tomó una fracción de vino tinto de la variedad Merlot de 12^ alcohólicos. Se sometió a extracción con dióxido de carbono supercrítico a una presión de 9,5 Mpa, temperatura de 308 K y relación entre el caudal de caudal de dióxido de carbono y el caudal de vino de 3,5. Se obtuvo un extracto de aroma de vino. El residuo de la anterior extracción se sometió a extracción con dióxido de carbono supercrítico a una presión de 9,5 Mpa, temperatura de 308 K y relación entre el caudal de caudal de dióxido de carbono y el caudal de vino de 20. Se obtuvo un vino con un contenido en etanol del 1% y valores de capacidad secuestrante del radical estable DPPH (2,2-d¡fen¡l-l-p¡cr¡lh¡draz¡l) y de capacidad ORAC (Capacidad de absorba ncia de radicales de oxígeno) similares al vino original. Se añadió extracto de aroma a l vino bajo en etanol en una proporción de 10 mi de extracto de aroma por litro de vino. Se tomaron flores femeninas de lúpulo (Humulus lupulus) y se sometieron a un proceso de secado, molienda, extracción con agua, filtrado y secado posterior. A continuación se someten a extracción con agua presurizada en una proporción de material vegetal y agua 1:3, presión de 125 atm y temperatura de 200^C. Se obtiene un extracto de lúpulo enriquecido en isoxantumol. Dicho extracto de lúpulo se adicionó a la mezcla del vino bajo en etanol y aroma de vino obtenido previamente, obteniéndose así la bebida funcional.
Las propiedades anti-inflamatorias de la bebida ha n sido evaluadas en cultivos celulares de monocitos THP-1, en los que se evaluó la producción y expresión génica de citoquinas proinflamatorias (TN F-a, I L-Ιβ y I L-6) y de citoquinas antiinflamatorias (I L-10), activadas con partículas de LDL-oxidado y no activados, en presencia de partículas de LDL oxidado y de LDL no oxidado, tras suministrar dicha bebida.
La bebida funcional que com prende dosis del extracto de lúpulo iguales o inferiores a 2 μg/mL provoca ron un descenso en la producción de citoquinas proinflamatorias (TNF-a, I L-Ιβ e I L-6) y un a umento de la producción de citoquinas a ntiinflamatorias (I L-10), tanto cuando los macrófagos han sido activados con partículas LDL-oxidadas como cuando no lo son. El aumento observado en la producción de citoquinas antiinflamatorias en macrófagos activados por partículas de LDL oxidadas es de aproximadamente un 243% para dosis de 1,5 μg de extracto/mL respectivamente; siendo el aumento de aproximadamente un 195% en macrófagos no activados. Simultáneamente, se midió una reducción en la producción de citoquinas proinflamatorias (TNF-α, I L-6 y I L-Ιβ) de aproximadamente un 51% de TNF-α para dosis de 1,5 μg de extracto/mL en macrófagos activados con partículas LDL- oxidadas, de aproximadamente un 67% de I L-6 para la dosis de 1,5 μg de extracto/mL respectivamente en macrófagos activados con partículas LDL-oxidadas, no considerándose relevantes, en las dos últimas citoquinas, en macrófagos no activados por LDL oxidadas. La variación en la producción de IL-Ιβ supuso un descenso de un 93% para dosis de 1,5 μg de extracto/mL en macrófagos activados con partículas LDL-oxidadas, y ligeros aumentos en ausencia de partículas de LDL oxidadas.
Asimismo, se evaluó el efecto anti-inflamatorio de la bebida funcional con respecto a una dosis de isoxantohumol y xantohumol puros como la contenida en el extracto de lúpulo, y frente a un fármaco antiinflamatorio convencional como la indometacina. Los resultados se muestran en la figura 1. Se observa que el patrón de producción de citoquinas de los macrófagos THP-1 cuando son tratados, en presencia y ausencia de partículas de LDL oxidadas, con cantidades de isoxanthohumol y xanthohumol puros indica que el patrón antioxidante no se justifica exclusivamente por la posible actividad de estos compuestos, sino que el extracto en su conjunto presenta una mayor, y diferente, actividad antiinflamatoria, tal como puede verse en la figura 1. Así, por ejemplo, dosis de lúpulo comprendidas entre 0,01 μg/mL 0,05 μg/mL dan lugar a variaciones de IL-10 en un rango del 15% y el 30% respecto a los tratamientos control con partículas de LDL oxidadas y en ausencia de estas, respectivamente; mientras que los extractos de lúpulo, obtenidos conforme a lo descrito en la presente invención, conteniendo la misma cantidad de isoxanthohumol dan lugar a incrementos de producción de IL-10 del orden de 255% y 195% en macrófagos activados con partículas de IDL oxidadas y en su ausencia, respectivamente. Asimismo, dicho extracto presenta una actividad supresora de la producción de citoquinas proinflamatorias (TNF-α e IL-6), y de estimulación de las citoquinas antiinflamatorias (IL-10) muy superior a fármacos antiinflamatorios como la indometacina a dosis farmacológicas ^g/mL).
EJEMPLO 2. Evaluación in vivo de los efectos saludables de una bebida funcional a base de vino desalcoholizado y extractos de lúpulo. Se preparó una bebida funcional según el siguiente procedimiento. Se tomó una fracción de vino tinto de la variedad Merlot de 12^ alcohólicos. Se sometió a extracción con dióxido de carbono supercrítico a una presión de 9,5 Mpa, temperatura de 308 K y relación entre el caudal de caudal de dióxido de carbono y el caudal de vino de 3,5. Se obtuvo un extracto de aroma de vino. El residuo de la anterior extracción se sometió a extracción con dióxido de carbono supercrítico a una presión de 9,5 Mpa, temperatura de 308 K y relación entre el caudal de cauda l de dióxido de carbono y el ca udal de vino de 20. Se obtuvo un vino con un contenido en etanol del 1% y valores de DPPH y ORAC similares al vino original. Se añadió extracto de aroma al vino bajo en etanol en una proporción de 10 mi de extracto de aroma por litro de vino.
Se tomaron flores femeninas de lúpulo (Humulus lupulus) y se sometieron a un proceso de secado, molienda, extracción con agua, filtrado y secado posterior. A continuación se someten a extracción con agua presurizada en una proporción de material vegetal y agua 1:3, presión de 125 atm y temperatura de 200^C. Se obtiene un extracto de lúpulo enriquecido en isoxantumol. Se añadió extracto de lúpulo a l vino bajo en etanol a razón de 50 mi por litro.
Para la evaluación del efecto de la bebida de manera parcialmente trasladable a la población general sana, se diseño un modelo animal joven y sano al que se le sometió a un leve estrés cardiovascular, mediante la suplementación en la dieta con col este rol.
El estudio se llevó a ca bo en 24 ratas Wistar machos adultos, de dos meses y peso medio 275g, procedentes de un distribuidor oficial. Los animales se estabularon en grupos de 4. Los animales fueron pesados individualmente a tiempo cero. En todo momento se siguió la normativa vigente sobre protección de los animales para experimentación RD 1201/2005.
Los animales fueron distribuidos en 2 grupos de manera aleatoria. A cada grupo se le suministró una bebida diferente con la intención de evaluar el efecto fisiológico del prototipo (grupo lúpulo) frente a un control negativo (grupo control). Los animales recibieron en el agua de bebida los distintos productos en cantidad equivalente a la de un consumo de etanol moderado en el hombre (300 ml/día - 70 Kg) (1.07 ml/animal/día). Los biberones se prepararon a diario y los animales tuvieron libre acceso a la bebida. Durante la primera semana se valoro diariamente la ingesta líquida de la unidad experimental (jaula) para la verificación de cualquier incremento o descenso de la misma. El grupo control tomó una solución azucarada (5,9 gr/l). Los animales recibieron durante el estudio y simultáneamente con la administración de las distintas bebidas, una dieta enriquecida en colesterol (2%) ad libitum. Tras el periodo de adaptación los animales siguieron el tratamiento durante 12 semanas. Tras ese periodo fueron sacrificados por exanguinación mediante punción intracardíaca y posterior administración de KCI (1M) bajo anestesia inhalatoria con isofluorano (Forane®) al 2%. Se recolectaron muestras de sangre para la obtención de suero y plasma. La sangre recogida mediante punción intracardíaca fue transferida a tubos con EDTA y Gelatina (bioquímica) (6 mi). Mediante centrifugado (4.000 rpm durante 10 min) se obtuvo plasma y suero. A su vez, se diseccionaron los animales y se obtuvieron las aortas completas, muestras de corazón, hígado, riñon y tejido adiposo (grasa retoperitoneal). Todos los tejidos fueron lavados, codificados e inmediatamente congelados en nitrógeno líquido. Se almacenaron a - 80^C hasta su análisis. Los posteriores análisis se realizaron en condiciones "ciegas".
Se analizó la concentración de lípidos plasmáticos de los animales tal y como muestran los resultados a continuación:
Concentraciones de colesterol total y triglicéridos tras la intervención (mg/dL). Valores medios seguidos de la diferencia estándar. Las diferentes letras en superíndice indican diferencias significativas entre las muestras
Control Bebida funcional
Media DS Media DS Colesterol 68,00 6,16a 61,50 10,56 a
Triglicéridos 115,57 30,53 a 58,20 6,94 b
A pesar del aparente descenso en las concentraciones de colesterol total, el análisis de la varianza de los resultados reveló ausencia de diferencias significativas entre los grupos control y bebida funcional (ANOVA p<0.01). Sin embargo, el análisis de la varianza de las concentraciones triglicéridos tras la intervención, revelaron diferencias significativas entre los grupos (ANOVA p<0.01). Cabe destacar, que a pesar de seguir la misma dieta alta en colesterol el grupo tratado con la bebida funcional presentaba casi la mitad de las concentraciones de triglicéridos plasmáticos observadas en el grupo control (p<0.001). Estos resultados ponen de manifiesto que la composición de la invención es eficaz en el control de los niveles de triglicéridos plasmáticos e impide su incremento en dietas hipercolesterolémicas.
Por otra parte, se obtuvieron los tejidos y los plasmas de cada animal y se procesaron para el análisis de la concentración de peróxidos lipidíeos, tal y como muestran los siguientes resultados:
Peroxidación lipídica en tejidos grasos (hígado, riñon y adiposo) y plasma como especies reactivas con ácido tiobarbitúrico (miliequivalentes MDA/mg proteína o mL de plasma). Valores medios seguidos de la diferencia estándar. Las diferentes letras en superíndíce indican diferencias significativas entre las muestras
Control Bebida funcional
Media DS Media DS
Hígado 4,04 0,61 a 3,15 0,80 b
Riñon 7,45 1,91 a 4,20 1,23 bb
Plasma 163,26 39,60a 145,11 22,38 a
Grasa 504,48 216,76 a 191,03 67,29 bb Para determinar el efecto de las bebidas añadidas en la dieta en el estatus oxidativo global del modelo animal se analizaron las concentraciones de equivalentes de MDA (malondialdehído) en los plasmas recolectados tras 12 meses de tratamiento. Tras el análisis de la varianza de este parámetro no se observaron diferencias significativas entre los grupos (ANOVA p<0.01).
Por el contrario, se encontraron diferencias significativas al analizar el efecto de la bebida enriquecida en lúpulo en los niveles de peroxidación lipídica de órganos grasos. En concreto, tras el análisis de la varianza de los niveles de especies reactivas con el ácido tiobarbitúrico en homogenados hepáticos tras la intervención, se observaron diferencias significativas entre los grupos (ANOVA p<0.01). En concreto el grupo tratado con la bebida funcional presentó unos valores significativamente inferiores de peróxidos hepáticos comparado con el grupo Control (p<0.05).
De manera similar, tras el análisis de la varianza de los niveles de especies reactivas con el ácido tiobarbitúrico en homogenados renales tras la intervención, se observaron diferencias significativas entre los grupos (ANOVA p<0.01). En concreto el grupo tratado con la bebida funcional presentó unos valores significativamente inferiores de peróxidos renales comparado con el grupo Control (p<0.01).
Por último, tras el análisis de la varianza de los niveles de especies reactivas con el ácido tiobarbitúrico en homogenados de tejido adiposo (grasa retroperitoneal) tras la intervención, se observaron diferencias significativas entre los grupos (ANOVA p<0.01). En concreto el grupo tratado con la bebida funcional presentó unos valores significativamente inferiores de peróxidos en tejido adiposo comparado con el grupo Control (p<0.01). Por lo tanto, estos resultados demuestran que la administración de la composición de la invención provoca un eficaz descenso de los niveles de oxidación en órganos con alto contenido en grasas, más concretamente hígado, riñon y tejido adiposo.
Asimismo, se obtuvo el tejido adiposo de cada animal y se congeló inmediatamente una muestra en nitrógeno líquido. Tras la extracción de RNA se sintetizó cDNA, se utilizaron cebadores específicos del gen TNF-α para cuantificar su expresión mediante RT-PCR, usando como gen constitutivo de referencia S26. Los resultados obtenidos se muestran a continuación:
Niveles de expresión génica a nivel de tejido adiposo de TNF- a, referido al gen constitutivo S26 (unidades arbitrarias). Valores medios seguidos de la diferencia estándar. Las diferentes letras en superíndice indican diferencias significativas entre las muestras
Figure imgf000035_0001
El análisis de la varianza de los niveles de expresión génica de TNF- α en tejido adiposo mostró diferencias significativas entre los grupos (ANOVA p<0.05). En concreto, el grupo tratado con la bebida funcional (p<0.05), presentó unos valores significativamente menores de expresión génica con respecto al grupo Control (disminuye un 30% la expresión de TNF- a). Por lo tanto, la composición de la invención resulta asimismo eficaz para disminuir los niveles de inflamación en tejido adiposo.
Se obtuvo el tejido adiposo de cada animal y se congeló inmediatamente una muestra en nitrógeno líquido. Tras la extracción de RNA se sintetizó cDNA, y se utilizaron cebadores específicos del gen PPAR-δ para cuantificar su expresión mediante RT-PCR, usando como gen constitutivo de referencia S26. Los resultados obtenidos se muestran a continuación:
Niveles de expresión génica a nivel de tejido adiposo de PPAR-δ, referido al gen constitutivo S26 (unidades arbitrarias). Valores medios seguidos de la diferencia estándar. Las diferentes letras en superíndice indican diferencias significativas entre las muestras Control Bebida funcional
Media DS Media DS
PPAR-δ /S26 0,1425 0,03735 a 0,1926 0,04128b
El análisis de la varianza de los niveles de expresión génica de PPAR-δ en tejido adiposo mostró diferencias significativas entre los grupos (ANOVA p<0.05). En concreto, el grupo tratado con la composición de la invención (p<0.05), presentó unos valores significativamente mayores de expresión génica con respecto al grupo Control (aumenta un 35% la expresión de PPAR-δ).
Estos resultados demuestran que la composición de la invención permite modular la actividad metabólica del tejido adiposo.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende vino desalcoholizado, aroma de vino y extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol.
2. Composición según la reivindicación 1, que además comprende extracto de orujo de uva y extracto de semillas de uva.
3. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 que comprende:
50-98.9% en peso de vino desalcoholizado;
1-20% en peso de aroma de vino;
0.1-20% en peso de extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol; y opcionalmente:
0-20% en peso de extracto de orujo de uva; y
0- 20% en peso de extracto de semillas de uva.
4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol comprende: - 0.05-80% en peso seco de prenilflavanona isoxantohumol;
0.001-10% en peso seco de prenilchalcona xantohumol; y
1- 90% en peso seco de α y β-ácidos seleccionados entre cohumulona, n- humulona, ad-humulona, iso-co-humulona, iso-n-humulona, iso-ad- humulona, colupulona, n-lupulona y ad-lupulona, además de azúcares, polisacáridos y aminoácidos.
5. Composición según reivindicación 4, donde el extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol comprende:
0.2-60% en peso seco de prenilflavanona isoxantohumol;
0.01-1% en peso seco de prenilchalcona xantohumol; y
- 10-50% en peso seco de a y β-ácidos seleccionados entre cohumulona, n-humulona, ad-humulona, iso-co-humulona, iso-n-humulona, iso-ad- humulona, colupulona, n-lupulona y ad-lupulona, además de azúcares, polisacáridos y aminoácidos.
6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizada por contener etanol en una proporción entre 0 y 1.2% en peso.
7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por no contener trazas de disolventes orgánicos distintos de etanol.
8. Un procedimiento para la preparación de una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende la adición del aroma de vino, del extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol y, opcionalmente, del extracto de orujo de uva y del extracto de semillas de uva, sobre el vino desalcoholizado.
9. Procedimiento según reivindicación 8, donde el vino desalcoholizado se obtiene mediante extracción supercrítica del vino base con dióxido de carbono, a una temperatura del dióxido de carbono comprendida entre 32^C y 50^C y a una presión de dióxido de carbono comprendida entre 5 y 11 MPa.
10. Procedimiento según reivindicación 8, donde el aroma de vino se obtiene mediante extracción supercrítica del vino base con dióxido de carbono, a una temperatura de dióxido de carbono comprendida entre 32^C y 50^C y a una presión de dióxido de carbono comprendida entre 5 y 11 MPa.
11. Procedimiento según reivindicación 8, donde el extracto de orujo de uva se obtiene mediante un procedimiento de extracción sólido-líquido que comprende:
secado de los orujos mediante aire forzado a una temperatura entre 60 y 90?C; y
extracción del orujos secos con una mezcla etanol agua en una proporción comprendida entre 99/1 y 50/50 a una temperatura entre 30 y 80?C
12. Procedimiento según reivindicación 8, donde el extracto de semillas de uva se obtiene mediante un procedimiento de extracción sólido-líquido que comprende: secado de las semillas de uva mediante aire forzado a una temperatura entre 60 y 90^C; y
extracción del orujos secos con una mezcla etanol agua en una proporción comprendida entre 99/1 y 50/50 a una temperatura entre 30 y 80?C.
13. Un procedimiento para la obtención de extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol que comprende: a) proporcionar materia prima vegetal procedente de lúpulo;
b) secado de dicha materia prima vegetal;
c) trituración o molienda de la materia prima vegetal seca;
d) extracción de la materia prima vegetal seca y molida con agua presurizada y sobrecalentada en condiciones de temperatura comprendida entre 25 y 374^C y presión comprendida entre 100 y 218 bares.
14. Un extracto de lúpulo enriquecido en isoxantohumol obtenible según el procedimiento definido en la reivindicación 13.
15. Un extracto de lúpulo que comprende:
0.05-80% en peso seco de prenilflavanona isoxantohumol;
0.001-10% en peso seco de prenilchalcona xantohumol; y
- 1-90% en peso seco de α y β-ácidos seleccionados entre cohumulona, n- humulona, ad-humulona, iso-co-humulona, iso-n-humulona, iso-ad- humulona, colupulona, n-lupulona y ad-lupulona, además de azúcares, polisacáridos y aminoácidos.
16. Extracto de lúpulo según reivindicación 15, que comprende: - 0.2-60% en peso seco de prenilflavanona isoxantohumol;
0.01-1% en peso seco de prenilchalcona xantohumol; y
10-50% en peso seco de a y β-ácidos seleccionados entre cohumulona, n-humulona, ad-humulona, iso-co-humulona, iso-n-humulona, iso-ad- humulona, colupulona, n-lupulona y ad-lupulona, además de azúcares, polisacáridos y aminoácidos.
17. Bebida funcional que comprende una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
18. Uso de una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o de una bebida funcional como se define en la reivindicación 17 para la preparación de un medicamento dirigido a la prevención o el tratamiento del síndrome metabólico.
19. Uso según reivindicación 18, para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la dislipemia aterogénica.
20. Uso según reivindicación 18, para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la obesidad.
21. Uso según reivindicación 18, para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la inflamación.
22. Uso según reivindicación 21, donde la inflamación se produce en el tejido adiposo.
23. Uso según reivindicación 18, para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la disfunción metabólica.
24. Uso según reivindicación 23, donde la disfunción metabólica se produce en el tejido adiposo.
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