WO2012169819A2 - 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법 - Google Patents

2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법 Download PDF

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박시재
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Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing polyhydroxyalkanoate containing 2-hydroxybutyrate as a monomer, and more specifically, to the polyhydroxyalkanoate containing 2-hydroxybutyrate using metabolic engineering. It relates to a method for preparing from a recombinant strain.
  • PHAs Polyhydroxyalkanoates
  • PHA synthase which uses several kinds of hydroxyacyl-CoA as a substrate.
  • hydroxyacyl-CoA has an asymmetric center at the carbon position of the hydroxy group, it is all an (R) -configuration.
  • various hydroxyacyl-CoAs such as 3-hydroxyacyl-CoAs, 4-hydroxyacyl-CoAs, 5-hydroxyacyl-CoAs, 6-hydroxyacyl-CoAs, and the like, PHA synthase is the most preferred substrate.
  • Roxiasil-CoAs (3HA-CoAs).
  • PLA polylactic acid
  • (D) -Lactyl-CoA is propionyl-CoA propionyl of Clostridium propionicum which converts (D) -lactate to (D) lactyl-CoA using acetyl-CoA as a CoA donor in the recombinant E. coli. CoA transferase) was employed to enable production.
  • lactate polymer (PLA) with lactyl-CoA Pseudomonas sp. was genetically engineered to use lactyl-CoA as a substrate. 6-19 PHA synthase (PhaC1 ps6-19 ) was employed.
  • the present inventors earnestly endeavored to develop a method of producing 2-hydroxybutyl-CoA, which is a substrate of PhaC1 ps6-19 , using propionyl-CoA, in order to develop PHA synthesized by a new route, propionate propionyl.
  • Propionyl-CoA synthetase (PrpE) from Ralstonia eutropha converting to -CoA, pyruvate formate lyase (PflB) converting propionyl-CoA to 2-ketobutyrate and 2-hydroxybutyrate dehydrogenase converting 2-ketobutyrate to 2HB
  • PflB pyruvate formate lyase
  • An object of the present invention is to provide a method for producing polyhydroxyalkanoate containing 2-hydroxybutyrate, a biodegradable polymer as a monomer, and a recombinant microorganism producing the polymer.
  • the present invention is a microorganism having a pathway for biosynthesis of acetyl-CoA from a carbon source, the gene encoding the lacdate dehydrogenase is deleted, and the polyhydroxy alkanoate synthase is encoded
  • a gene encoding the propionyl-CoA transferase, a gene encoding the D-2 hydroxy acid dehydrogenase, a gene encoding the propionyl-CoA synthetase, and a gene encoding the pyruvate formate lyase Provided is a recombinant microorganism having a polyhydroxyalkanoate producing ability containing 2-hydroxybutyrate as a monomer.
  • the present invention also relates to a microorganism having a pathway for biosynthesis of acetyl-CoA from a carbon source, wherein the gene encoding lacdate dehydrogenase is deleted, and the gene encoding polyhydroxy alkanoate synthase and propionyl- 2-hydroxy, characterized by introducing a gene encoding CoA transferase, a gene encoding D-2 hydroxy acid dehydrogenase, a gene encoding propionyl-CoA synthetase, and a gene encoding pyruvate formate lyase
  • a method for producing a recombinant microorganism having a polyhydroxyalkanoate-generating ability containing butyrate as a monomer is provided.
  • the present invention also comprises the steps of culturing the recombinant microorganism in a medium containing glucose and propionic acid to produce polyhydroxyalkanoate containing 2-hydroxybutyrate as a monomer; And it provides a method for producing a polyhydroxyalkanoate containing 2-hydroxybutyrate as a monomer comprising the step of obtaining a polyhydroxyalkanoate containing the produced 2-hydroxybutyrate as a monomer. do.
  • 1 shows a biosynthetic pathway for synthesizing polyhydroxyalkanoate containing 2-hydroxybutyrate as monomer from glucose, propionic acid and 3HB.
  • the present invention is a microorganism having a pathway for synthesizing acetyl-CoA from a carbon source, the gene encoding the lacdate dehydrogenase is deleted, the gene encoding a polyhydroxy alkanoate synthase and A gene encoding propionyl-CoA transferase, a gene encoding D-2 hydroxy acid dehydrogenase, a gene encoding propionyl-CoA synthetase, and a gene encoding pyruvate formate lyase are introduced.
  • the present invention relates to a recombinant microorganism having a polyhydroxyalkanoate producing ability containing oxybutyrate as a monomer.
  • the propionyl -CoA transferase may be characterized in that the mutant enzyme of the transferase or propionyl propionyl -CoA -CoA transferase of C. propionicum of C. propionicum Pct540.
  • the polyhydroxy alkanoate synthetase is Pseudomonas sp. It may be characterized by the 6-19 PHA synthase or its mutant enzyme.
  • the mutant of the PHA synthase is one or more mutations selected from the group consisting of E130D, S325T, L412M, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K and Q481R in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 It may be characterized in that it has an amino acid sequence comprising the amino acid sequence of E130D, S325T, L412M, S477G and Q481M mutation in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 (C1335); Amino acid sequence (C1310) in which E130D, S477F and Q481K are mutated in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; And in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 E130D, S477F and Q481R may be characterized by having any one amino acid sequence selected from the group consisting of mutated amino acid sequence (C1312).
  • the recombinant microorganism may be introduced with a gene encoding ⁇ -keto thiolase and a gene encoding acetoacetyl-CoA reductase, gene encoding the ⁇ -keto thiolase Is phaA derived from Ralstonia eutropha, and the gene encoding acetoacetyl-CoA reductase may be phaB derived from Ralstonia eutropha .
  • the gene encoding the introduced ⁇ -ketothiolase and the gene encoding acetoacetyl-CoA reductase are expressed in recombinant microorganisms to convert acetyl-CoA to acetoacetyl-CoA and convert the acetoacetyl- Recombinant microorganisms in which CoA is converted to 3-hydroxybutyryl-CoA, wherein phaA and phaB are additionally introduced, can be extracted from glucose and propionic acid without the addition of 3-hydroxybutyrate from p (2HB-co -3HB) can be produced.
  • the mutated PhaC1 ps6-19 has various substrate specificities, lactate also because it is a type of 2-hydroxy acid, the 2HB-CoA by PhaC1 ps6-19 may be copolymerized in 2HB-containing polymer.
  • 3HB was chosen as the second monomer because 3-HB-CoA acts as an initiator in the synthesis of lactate containing polymers.
  • the variation PhaC1 ps6-19 and mutated Pct cp has a V193A mutation and four silent mutations of the nucleotide sequence (T78C, T669C, A1125G and T1158C) and Pct540 PhaC1 ps6-19d
  • Recombinant Escherichia coli containing PhaC1437 containing four variants of E130D, S325T, S477G and Q481K in E. coli efficiently produced P (3HB-co-LA) copolymer with high lactate fraction.
  • these enzymes were used for the biosynthesis of polyhydroxyalkanoates containing 2-hydroxybutyrate as monomer.
  • the gene encoding the D-2 hydroxy acid dehydrogenase is Lactobacillus lactis Origin panE It may be characterized in that, the gene encoding the propionyl-coA synthetase is Ralstonia eutropha Origin prpE It can be characterized as that the pyruvate formate lyase Clostridium difficile Origin pflB Can be characterized as being.
  • panE derived from Lactobacillus lactis was used as a gene encoding D-2 hydroxy acid dehydrogenase, but it was limited as long as it was expressed in the introduced host cell to express the activity of D-2 hydroxy acid dehydrogenase. Can be used without
  • a prpE derived from Ralstonia eutropha was used as a gene encoding a propionyl-CoA synthetase, it can be used without limitation as long as it is expressed in the introduced host cell and shows the activity of pyruvate formate lyase.
  • Ralstonia converts propionate to propionyl-CoA in recombinant E. coli metabolically engineered to express propionyl-CoA transferase gene.
  • the gene encoding the eutropha- derived propionyl-CoA synthetase (PrpE) was expressed, and the enzyme encoding pyruvate formate lyase (PflB), which converts propionyl-CoA to 2-ketobutyrate, and 2-ketobutyrate to 2HB.
  • PrpE eutropha- derived propionyl-CoA synthetase
  • PflB pyruvate formate lyase
  • the gene encoding 2-hydroxybutyrate dehydrogenase was expressed.
  • the introduction of phaA from Ralstonia eutropha, which is a gene encoding ⁇ -ketothiolase, and phaB, which is a gene encoding acetoacetyl-CoA reductase, to the recombinant microorganism of the present invention is pCnCAB.
  • phaA from Ralstonia eutropha which is a gene encoding ⁇ -ketothiolase
  • phaB which is a gene encoding acetoacetyl-CoA reductase
  • the present invention relates to a gene and a propie, which are deleted from a gene encoding lacdate dehydrogenase, and a polyhydroxy alkanoate synthase, in a microorganism having a pathway for biosynthesis of acetyl-CoA from a carbon source.
  • 2- characterized by introducing a gene encoding onyl-CoA transferase, a gene encoding D-2 hydroxy acid dehydrogenase, a gene encoding propionyl-CoA synthetase, and a gene encoding pyruvate formate lyase.
  • the present invention relates to a method for producing a recombinant microorganism having a polyhydroxyalkanoate producing ability containing hydroxybutyrate as a monomer.
  • the present invention comprises the steps of culturing the recombinant microorganism in a medium containing glucose and propionic acid to produce a polyhydroxyalkanoate containing 2-hydroxybutyrate as a monomer; And a process for producing polyhydroxyalkanoate containing 2-hydroxybutyrate as a monomer, comprising obtaining polyhydroxyalkanoate containing the produced 2-hydroxybutyrate as a monomer.
  • the polyhydroxyalkanoate containing 2-hydroxybutyrate as a monomer may be 2-hydroxybutyrate-co-3-hydroxybutyrate-co-lactate.
  • the medium may be characterized as further containing 3-hydroxybutyrate.
  • the E. coli XLdh strain from which the ldhA gene was removed from the chromosome of E. coli XL1-Blue was used as a host cell for P (2HB-co-3HB) copolymer synthesis.
  • the present inventors adopted a route for producing 2-ketobutyrate from propionyl-CoA to produce the 2-ketobutyrate.
  • a gene encoding the pyruvate formate lyase of Clostridium difficile and a gene encoding the propionyl-CoA synthetase of R. eutropha in a host cell through gene recombination. was expressed.
  • D-2-hydroxy acid dehydrogenases have selectivity for the optical isomers and use NADH as a cofactor to reduce 2-keto acid to D-2-hydroxy acid.
  • the D-2-hydroxy acid dehydrogenase is 2-ketoisocaproate, 2-ketoisovalerate, 2-ketovalorate, 2-ketobutyrate and It has a wide range of substrate specificities, including mandelate.
  • L. lactissub sp. Among various D-2-hydroxy acid dehydrogenases . 2HB was synthesized using D-2 hydroxy acid dehydrogenase, which is encoded by the panE gene of lactis Il1403.
  • 2HB when synthesizing p (2HB-co-3HB) polymer using recombinant E. coli, 2HB must be produced intracellularly from glucose, and 2HB is converted to 2HB-CoA by Pct540. do. In order to produce 3HB-CoA in cells, 3HB had to be added to the medium, and as the concentration of 3HB in the medium increased, the 2HB monomer fraction in the synthesized polymer decreased.
  • the present invention relates to a (2-hydroxybutyrate-co-3-hydroxybutyrate) polymer.
  • vector refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing DNA in a suitable host.
  • the vector may be a plasmid, phage particles, or simply a potential genomic insert. Once transformed into the appropriate host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are the most commonly used form of current vectors, “plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably in the context of the present invention. For the purposes of the present invention, it is preferred to use plasmid vectors.
  • Typical plasmid vectors that can be used for this purpose include (a) a replication initiation point that allows for efficient replication to include hundreds of plasmid vectors per host cell, and (b) host cells transformed with the plasmid vector. It has a structure comprising an antibiotic resistance gene and (c) a restriction enzyme cleavage site into which foreign DNA fragments can be inserted. Although no appropriate restriction enzyme cleavage site is present, the use of synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods facilitates ligation of the vector and foreign DNA.
  • the vector should be transformed into the appropriate host cell.
  • preferred host cells are prokaryotic cells.
  • Suitable prokaryotic host cells include E. coli DH5 ⁇ , E. coli JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue (Stratagene), E. coli B, E. coli B21, etc. It includes.
  • E. coli strains such as FMB101, NM522, NM538 and NM539 and other prokaryotic species and genera may also be used. In addition to the aforementioned E.
  • strains of the genus Agrobacterium such as Agrobacterium A4, bacilli , such as Bacillus subtilis , Salmonella typhimurium or Serratia marghesen another variety of enteric bacteria and Pseudomonas (Pseudomonas) in strains such as marcescens) may be used as host cells.
  • an expression vector known in the art may be used, and it is preferable to use a pET family vector (Novagen).
  • a pET family vector Novagen
  • histidine groups are bound to the ends of the expressed protein, and thus the protein can be effectively purified.
  • a general method known in the art may be used, and specifically, it may be separated by a chromatographic method using Ni-NTA His-binding resin (Novagen).
  • the recombinant vector may be characterized in that the pET-SLTI66, the host cell may be characterized in that E. coli or Agrobacterium.
  • control sequence refers to a DNA sequence essential for the expression of a coding sequence operably linked in a particular host organism.
  • regulatory sequences include promoters for performing transcription, any operator sequence for regulating such transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosomal binding sites, and sequences that control the termination of transcription and translation.
  • suitable control sequences for prokaryotes include promoters, optionally operator sequences, and ribosomal binding sites.
  • Eukaryotic cells include promoters, polyadenylation signals, and enhancers. The factor that most influences the amount of gene expression in the plasmid is the promoter.
  • an SR ⁇ promoter As the promoter for high expression, an SR ⁇ promoter, a promoter derived from cytomegalovirus, and the like are preferably used.
  • any of a wide variety of expression control sequences can be used in the vector.
  • Useful expression control sequences include, for example, early and late promoters of SV40 or adenovirus, lac system, trp system, TAC or TRC system, T3 and T7 promoters, major operator and promoter regions of phage lambda, fd code protein Regulatory region of, promoter for 3-phosphoglycerate kinase or other glycolysis enzymes, promoters of the phosphatase such as Pho5, promoter of yeast alpha-crossing system and gene expression of prokaryotic or eukaryotic cells or viruses Other sequences known to modulate and various combinations thereof.
  • the T7 promoter can be usefully used to express the proteins of the invention in E. coli.
  • Nucleic acids are "operably linked” when placed in a functional relationship with other nucleic acid sequences. This may be genes and regulatory sequence (s) linked in such a way as to allow gene expression when appropriate molecules (eg, transcriptional activating proteins) bind to regulatory sequence (s).
  • the DNA for a pre-sequence or secretion leader is operably linked to the DNA for the polypeptide when expressed as a shear protein that participates in the secretion of the polypeptide;
  • a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosomal binding site is operably linked to a coding sequence when positioned to facilitate translation.
  • "operably linked” means that the linked DNA sequence is in contact, and in the case of a secretory leader, is in contact and present within the reading frame.
  • enhancers do not need to touch. Linking of these sequences is performed by ligation (linking) at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods are used.
  • expression vector generally refers to a fragment of DNA that is generally double stranded as a recombinant carrier into which fragments of heterologous DNA have been inserted.
  • heterologous DNA refers to heterologous DNA, which is DNA not naturally found in host cells.
  • the gene must be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that function in the selected expression host.
  • the expression control sequence and the gene of interest are included in one expression vector including the bacterial selection marker and the replication origin. If the host cell is a eukaryotic cell, the expression vector must further comprise an expression marker useful in the eukaryotic expression host.
  • Host cells transformed or transfected with the expression vectors described above constitute another aspect of the present invention.
  • transformation means introducing DNA into a host so that the DNA is replicable as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration.
  • transfection means that the expression vector is accepted by the host cell whether or not any coding sequence is actually expressed.
  • the relative strength of the sequence, the controllability, and the compatibility with the DNA sequences of the present invention should be considered, particularly with regard to possible secondary structures.
  • Single cell hosts may be selected from a host for the selected vector, the toxicity of the product encoded by the DNA sequence of the invention, the secretory properties, the ability to accurately fold the protein, culture and fermentation requirements, the product encoded by the DNA sequence of the invention from the host. It should be selected in consideration of factors such as the ease of purification.
  • one skilled in the art can select a variety of vector / expression control sequence / host combinations capable of expressing the DNA sequences of the invention in fermentation or large scale animal culture.
  • a binding method binding method
  • a panning method a panning method
  • a film emulsion method and the like can be applied.
  • Table 1 shows the strains and plasmids used in the examples below.
  • Example 1 (2-hydroxybutyrate-co-3-hydroxybutyrate-co-lactate) polymer from glucose, propionic acid and 3HB using recombinant strain [P (2HB-co-3HB-co-LA) Biosynthesis
  • E. coli XL1-Blue (Stratgene Cloning System, USA) was used as a host cell for gene cloning, and cultured in 37 ° C. LB medium.
  • E. coli XLdh strain was incubated for 72 h at 250 rpm at 30 ° C using MR medium containing 20 g / L glucose, propionic acid and the desired concentration of 3HB, and the concentrations of 2HB, 3HB and LA depending on the culture conditions. Adjusted.
  • Plasmid p619C1437-pct540 under the PHA synthase operon promoter of Ralstonia eutropha , contains four variants of E130D, S325T, S477G and Q481K in PHA synthase of Pseudomonas sp.6-19 and propionyl-CoA transferase of C. propionicum .
  • PanE gene of lactis Il1403 was introduced and shaken cultured for 30 hours at 30 ° C. and 250 rpm using MR medium containing 20 g / L glucose and the desired concentration of propionate and 3HB, depending on the culture conditions of 2HB and 3HB. The concentration was adjusted to prepare p (2HB-co-3HB-co-LA).
  • the primers used in the preparation of the recombinant plasmid in this example are shown in Table 2.
  • the expression vector pZE12-MCS (EXPRESSYS, USA) is a PHA biosynthetic gene transcription terminator of muti-cloning sites (MCS) and Ralstonia eutropha of pTacLac (Lee et al . Appl. Microbiol. Biotechnol. 79,633-641,2008) . Transformed to have.
  • the pTacLac vector is a pTrc99A (SspI digested gene fragment containing a Tac promoter and transcription terminator obtained by cleaving the pTac99A (Park and Lee, J. Bacteriol. 185, 5391-5397, 2003) vector with SspI). Pharmacia Biotech, Sweden), and pTac99A was prepared by replacing the trc promoter of pTrc99A (Pharmacia Biotech, Sweden) with a tac promoter obtained by cleaving pKK223-3 (Pharmacia Biotech, Sweden) with PvuII and EcoRI.
  • a PHA biosynthetic gene transcription terminator gene fragment was obtained by PCR using the primers of SEQ ID NOS: 1 to 2 from p619C1437-pct540, and the obtained gene fragment was used as a template. PCR was performed using primers of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 to obtain PHA biosynthetic gene transcription terminators of RBS, pTacLac MCS and R. eutropha . The PCR product was digested with MfeI and AvrII and inserted into pZE12-MCS digested with EcoRI / AvrII to prepare pKE12-MCS.
  • the pKA32-MCS was PCR using primers SEQ ID NOs: 6 to 7 to amplify a gene fragment including a P LlacO-1 promoter, MCS, and a PHA biosynthetic gene transcription terminator of R. eutropha , and amplified the gene fragment.
  • pBBR1MCS2 ⁇ GenBank no. U23751; Kovach et al .
  • PKM22-MCS was prepared by insertion into the SspI site of Gene , 166,175-176,1995).
  • pKM22-MCS was inserted with lpanE gene amplified by PCR using primers of SEQ ID NOs: 8-9, pKM22PanE was prepared, and chromosomal DNA of C. difficile in pKM22PanE, In 630 hadA and C. difficile chromosomal DNA amplified by PCR using the primers of SEQ ID NOS: 10-11, pKM22PanEHadAPflB was prepared by inserting the pflB gene amplified by PCR using primers SEQ ID NOs: 12-13.
  • the hadA gene is an enzyme that converts 2-hydroxyisovalerate and 2-hydroxyisocaproate into 2-hydroxyisovaleryl-CoA and 2-hydroxyisocaproyl-CoA, but the role of making 2HB-CoA in the present invention was much lower than that of pct540.
  • Recombinant E. coli XLdh transformed with p619C1437-pct540, pKA32-RePrpE, pKM22PanEHadAPflB plasmids, expressing the phaC437, pct540, prpE, pflB and panE genes is glucose, at least 6.3% by weight of P (73 mol%) from propionic acid, 3HB 2HB-co-27 mol% LA) polymer was prepared (Table 3).
  • the present invention provides a recombinant microorganism capable of producing a polyhydroxyalkanoate containing 2-hydroxybutyrate, a new biodegradable polymer as a monomer, and a 2-hydroxybutyrate monomer, characterized by culturing the recombinant microorganism. There is an effect of providing a method for producing a polyhydroxyalkanoate containing.

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Abstract

본 발명은 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 2-하이드록시부티레이트를 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 대사공학을 이용한 재조합 균주로부터 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 생분해성 신규 폴리머인 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 제조할 수 있는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법을 제공하는 효과가 있다.

Description

2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법
본 발명은 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 2-하이드록시부티레이트를 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 대사공학을 이용한 재조합 균주로부터 제조하는 방법에 관한 것이다.
Polyhydroxyalkanoates (PHAs)는 세균에서 탄소원 및/또는 환원능 저장 물질로 사용되는 여러 종류의 하이드록시카복시산(hydroxy-carboxylic acid)으로 구성된 생분해성, 생체적합성 폴리에스테르이다. PHA는 여러 종류의 하이드록시아실-CoA를 기질로 사용하는 PHA synthase에 의하여 합성된다.
하이드록시아실-CoA가 하이드록시기의 탄소위치에 비대칭 중심을 가지면, 이는 모두 (R)-configuration이 된다. 3-하이드록시아실-CoAs, 4-하이드록시아실-CoAs나 5-하이드록시아실-CoAs, 6-하이드록시아실-CoAs 등 여러 하이드록시아실-CoA 중에서 PHA synthase가 가장 선호하는 기질은 3-하이드록시아실-CoAs(3HA-CoAs) 이다.
그러나, PHA 를 생산하는 미생물에서 2-하이드록시산을 모노머로 함유하는 PHA를 생산된 보고는 아직 없다. 천연 PHA synthase는 2-하이드록시아실-CoA에 대하여, 다른 하이드록시아실-CoA보다 매우 낮은 무시할 수 있는 정도의 활성을 가진다.
최근, 본 발명자들은 글루코오스로부터 직접발효에 의해 폴리락틱산(PLA) 중합체 및 이의 폴리머를 생산할 수 있는 대사공학적으로 재조합된 대장균을 개발하였다 (WO08/062996; Yang et al., Biotechnol. Bioeng. 105:150, 2010; Jung et al., Biotechnol. Bioeng., 105:161, 2010). 상기 재조합 대장균에서, PLA 생합성은 락틸-CoA 생성과 synthase에 의한 공중합이라는 2단계로 구성된다. (D)-락틸-CoA는 상기 재조합 대장균에 아세틸-CoA를 CoA 공여체로 사용하여, (D)-락테이트를 (D) 락틸-CoA로 전환하는 Clostridium propionicum의프로피오닐-CoA 전이효소(propionyl-CoA transferase)를 채용하여 생성가능하게 하였다. 락틸-CoA로 락테이트 폴리머(PLA)를 생성하기 위하여는, 락틸-CoA를 기질로 사용할 수 있도록 유전자 조작된 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase (PhaC1 ps6-19 )를 채용하였다. 또한, PLA 합성의 효율을 높이기 위하여 E. coli XL1-Blue 에서 무작위 변성(randum mutageneisis)에 의해 Clostridium propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소(propionyl-CoA transferase)의 활성을 향상시켜 락틸-CoA 생합성 능을 강화시켰다(Yang et al., Biotechnol. Bioeng., 105:150, 2010; Jung et al., Biotechnol. Bioeng., 105:161, 2010).
다른 연구에서, 유사한 시스템을 사용하여 (3-하이드록시부티레이트-co-락테이트) 폴리머[P(3HB-co-LA)]를 생합성한 보고도 있다(Taguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 105:17323, 2008, Yamada et al., Biomacromolecules 10,:677, 2009). PhaC1 ps6-19 가 매우 다양한 기질 특이성을 가지고, 락테이트가 2-하이드록시산의 한 종류이기 때문에, 다른 2-하이드록시아실-CoA가 PhaC1 ps6-19 의 기질로 사용되어, 2-하이드록시산을 함유하는 새로운 PHA를 합성하는 것도 가능할 것이다. 이러한 여러 종류의 2-하이드록시산 중에서, 본 발명자들은 아미노산 합성 경로의 대사산물인, 2-하이드록시부티레이트(2HB)를 단량체로 하여, 폴리머 합성을 시도하였다.
이에, 본 발명자들은 새로운 경로로 합성되는 PHA를 개발하기 위하여, PhaC1 ps6-19 의 기질인 2-하이드록시부틸-CoA를 propionyl-CoA를 이용하여 생산하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, propionate를 propionyl-CoA로 전환하는 Ralstonia eutropha 유래의 propionyl-CoA synthetase (PrpE), propionyl-CoA를 2-ketobutyrate로 전환하는 pyruvate formate lyase (PflB) 및 2-ketobutyrate를 2HB로 전환하는 2-하이드록시부티레이트 디하이드로게나아제 유전자를 대장균에서 발현시켜, 배양하는 경우, 2-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시부티레이트 폴리머[P(2HB-co-3HB)]를 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 생분해성 폴리머인 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 방법 및 상기 폴리머를 생산하는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 탄소원으로부터 아세틸-CoA를 생합성하는 경로를 가지고 있는 미생물에서, 락데이트디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자, D-2 하이드록시산 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자, propionyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자 및 pyruvate formate lyase를 코딩하는 유전자가 도입되어 있으며, 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 탄소원으로부터 아세틸-CoA를 생합성하는 경로를 가지고 있는 미생물에서, 락데이트디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 결실시키고, 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자, D-2 하이드록시산 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자, propionyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자 및 pyruvate formate lyase를 코딩하는 유전자를 도입시키는 것을 특징으로 하는 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 글루코오스 및 프로피온산을 함유 배지에서 배양하여 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 단계; 및 상기 생산된 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 단계를 포함하는 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법을 제공한다.
도 1은 글루코오스, 프로피온산 및 3HB로부터 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 합성하는 생합성경로를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
일 관점에서, 본 발명은 탄소원으로부터 아세틸-CoA를 생합성하는 경로를 가지고 있는 미생물에서, 락데이트디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자, D-2 하이드록시산 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자, propionyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자 및 pyruvate formate lyase를 코딩하는 유전자가 도입되어 있으며, 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프로피오닐-CoA 전이효소는 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소 또는 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소의 변이효소인 Pct540인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase 또는 그 변이 효소인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 PHA synthase의 변이효소는 서열번호 14의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 PHA synthase의 변이효소는 서열번호 14의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477G 및 Q481M이 변이된 아미노산 서열(C1335); 서열번호 14의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(C1310); 및 서열번호 14의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481R이 변이된 아미노산 서열(C1312)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
2-하이드록시부티레이트를 아세틸-CoA를 프리커서로 사용하는 시트라말레이트 경로(citramalate pathway)등을 거쳐 생산할 때에는 세포의 성장을 저해시킬 수 있다. 또한, 3-하이드록시부티릴-CoA, 락틸-CoA 등도 아세틸-CoA를 통해 생산되기 때문에 서로 경쟁하게 된다. 따라서 2-HB-CoA를 프로피온산을 통해 생산할 때에는 2HB-CoA를 acetyl-CoA를 사용하지 않고 독립적으로 생산할 수 있기 때문에 고분자내의 2HB의 몰분율을 조절하기 쉬운 장점이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 β-케토티올레이즈를 코딩하는 유전자 및 아세토아세틸-CoA 리덕타아제를 코딩하는 유전자가 추가로 도입될 수 있으며, 상기 β-케토티올레이즈를 코딩하는 유전자는 Ralstonia eutropha 유래의 phaA이고, 아세토아세틸-CoA 리덕타아제를 코딩하는 유전자는 Ralstonia eutropha 유래의 phaB인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 도입된 β-케토티올레이즈를 코딩하는 유전자 및 아세토아세틸-CoA 리덕타아제를 코딩하는 유전자는 재조합 미생물내에서 발현되어 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시키고, 상기 전환된 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA로 전환시키는 역할을 하여, 상기 phaA 및 phaB가 추가로 도입된 재조합 미생물은 외부로부터의 3-하이드록시부티레이트의 첨가없이도, 글루코오스와 프로피온산으로부터 p(2HB-co-3HB)를 생산할 수 있다.
본 발명자들은 변이된 PhaC1ps6-19 및 변이된 Pctcp를 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 p(3HB-co-LA)의 생산성 향상시킨 바 있다.
변이된 PhaC1ps6-19가 다양한 기질특이성을 가지고, 락테이트 역시 2-하이드록시산의 한 종류이기 때문에, PhaC1ps6-19에 의하여 2HB-CoA가 2HB 함유 폴리머에 공중합될 수 있다. 재조합 대장균에서 2HB 함유 폴리머의 합성을 용이하게 하기 위하여, 3-HB-CoA가 락테이트 함유 폴리머의 합성에서 시발자(initiator) 역할을 하기 때문에, 3HB를 두번째 단량체로 선택하였다.
본 발명자들의 이전 연구에서, 변이된 PhaC1ps6-19 및 변이된 Pctcp,, Pctcp에서 V193A 변이와 뉴클레오티드 서열의 4개의 침묵변이(T78C, T669C, A1125G 및 T1158C)를 가지는 Pct540 및 PhaC1ps6-19d에서 E130D, S325T, S477G 및 Q481K의 4개의 변이를 함유하는 PhaC1437를 함유하는 재조합 대장균은 높은 락테이트 분획을 가지면서 P(3HB-co-LA) 공중합체를 효과적으로 생산하였다. 따라서, 상기 효소들을 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 생합성에 사용하였다.
본 발명에서는 락테이트 모노머가 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트로 함입되는 것을 억제하기 위하여, ldhA유전자가 결실된 숙주세포를 사용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 D-2 하이드록시산 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 Lactobacillus lactis 유래의 panE 인것을 특징으로 할 수 있고, 상기 propionyl-coA synthetase를 코딩하는 유전자는 Ralstonia eutropha 유래의 prpE 인것 특징으로 할 수 있으며, 상기 pyruvate formate lyase는 Clostridium difficile 유래의 pflB 인것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 D-2 하이드록시산 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자로 Lactobacillus lactis 유래의 panE을 사용하였으나, 도입된 숙주세포에서 발현되어 D-2 하이드록시산 디하이드로게나아제의 활성을 나타내는 한 제한없이 사용할 수 있다.
아울러, 본 발명에서는 pyruvate formate lyase를 코딩하는 유전자로 Clostridium difficile 유래의 pflB을 사용하였으나, 도입된 숙주세포에서 발현되어 pyruvate formate lyase의 활성을 나타내는 한 제한없이 사용할 수 있다.
아울러, 본 발명에서는 propionyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자로 Ralstonia eutropha 유래의 prpE를 사용하였으나 도입된 숙주세포에서 발현되어 pyruvate formate lyase의 활성을 나타내는 한 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 propionate로부터 2-HB를 생성할 수 있는 재조합 미생물을 제조하기 위하여, 프로피오닐-CoA 전이효소 유전자를 발현하도록 대장균을 대사공학적으로 조작한 재조합 대장균에서 propionate를 propionyl-CoA로 전환하도록 Ralstonia eutropha 유래의 propionyl-CoA synthetase(PrpE)를 코딩하는 유전자를 발현시켰으며, propionyl-CoA를 2-ketobutyrate로 전환하는 효소인 pyruvate formate lyase (PflB)를 코딩하는 유전자와 2-ketobutyrate를 2HB로 전환하는 2-하이드록시부티레이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 발현시켰다. 상기 재조합 대장균을 글루코스와 프로피온산이 포함된 배지에서 발효시키는 경우, 새로운 폴리머인 2-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시부티레이트) 폴리머[P(2HB-co-3HB)]를 제조할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, β-케토티올레이즈를 코딩하는 유전자인 Ralstonia eutropha 유래의 phaA 및 아세토아세틸-CoA 리덕타아제를 코딩하는 유전자인 phaB를 본 발명의 재조합 미생물에 추가로 도입시키는 것은 pCnCAB (Yang et al., Biotechnol. Bioeng. 105:150, 2010)을 SbfI/HindIII로 자른 후 수득한 phaAB 유전자를 아래에 사용한 pKM22-PanEHadAPflB 벡터를 SbfI/HindIII로 절단한 후 삽입하는 방법으로 수행될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 탄소원으로부터 아세틸-CoA를 생합성하는 경로를 가지고 있는 미생물에서, 락데이트디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 결실시키고, 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자, D-2 하이드록시산 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자, propionyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자 및 pyruvate formate lyase를 코딩하는 유전자를 도입시키는 것을 특징으로 하는 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법에 관한 것이다.
또다른 관점에서, 본 발명은 재조합 미생물을 글루코오스 및 프로피온산을 함유하는 배지에서 배양하여 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 단계; 및 상기 생산된 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 단계를 포함하는 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 상기 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트는 2-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시부티레이트-co-락테이트인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 배지는 3-하이드록시부티레이트를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, E.coli XL1-Blue의 염색체에서 ldhA 유전자를 제거한 E. coli XLdh 균주를 P(2HB-co-3HB) 공중합체 합성을 위한 숙주세포로 사용하였다.
본 발명자들은 2-케토부티레이트가 2-HB의 전구체로 사용가능하기 때문에, 상기 2-케토부티레이트를 생산하기 위하여 propionyl-CoA로부터 2-케토부티레이트를 생성하는 경로를 채용하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 상기 2-케토부티레이트 합성 경로를 구축하기 위하여, 유전자 재조합을 통하여 숙주세포에서 Clostridium difficile의 pyruvate formate lyase를 코딩하는 유전자 및 R. eutropha의 propionyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자를 발현시켰다.
본 발명에서 글루코오스로부터 2HB를 함유하는 폴리머의 합성경로를 구축하기 위하여는 propionyl-CoA를 통하여 합성된 2-케토부티레이트를 2HB로 전환시켜야 한다.
몇몇 미생물의 D-2-하이드록시산 디하이드로게나아제는 광학이성질체에 대한 선택성을 가지고, NADH를 코펙터로 사용하여, 2-케토산(keto acid)를 D-2-하이드록시산으로 환원시킨다. 상기 D-2-하이드록시산 디하이드로게나아제는 2-케토이소카프로에이트(2-ketoisocaproate), 2-케토이소발러레이트(2-ketoisovalerate), 2-케토발러레이트, 2-케토부티레이트 및 만델레이트(mandelate)를 포함하여 넓은 범위의 기질 특이성을 가지고 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 여러 D-2-하이드록시산 디하이드로게나아제 중 L. lactissub sp. lactisIl1403의 panE 유전자가 코딩하는 D-2 하이드록시산 디하이드로 게나아제를 채용하여 2HB를 합성하였다.
phaC437, pct540, prpE 및 pflB 유전자를 발현하는 재조합 E. coli XLdh에 L. lactis sub sp. lactisIl1403의 panE 유전자를 도입시키는 경우, 20 g/L 글루코오스, 2 g/L 프로피온산, 0.1 g/L 3HB로부터 6.2 중량%이상의 P(73mol%2HB-co-27mol%LA) 중합체를 제조할 수 있었다.
본 발명의 일실시예에서, 재조합 대장균을 사용하여 p(2HB-co-3HB) 중합체를 합성하는 경우, 글루코오스로부터 세포내에서 2HB가 생성되어야 하고, 생성된 Pct540에 의하여 2HB는 2HB-CoA로 전환된다. 세포 내에서 3HB-CoA를 생성시키기 위하여, 3HB가 배지에 첨가되어야 하고, 배지 내의 3HB의 농도가 증가될 수록, 합성된 폴리머에서의 2HB 단량체 분획은 감소하였다.
또다른 관점에서, 본 발명은 (2-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시부티레이트) 폴리머에 관한 것이다.
본 발명에서, "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환 되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli DH5α, E.coli JM101, E.coli K12, E.coli W3110, E.coli X1776, E.coli XL-1Blue(Stratagene), E.coli B, E.coli B21등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주및다른원핵생물의종(speices) 및 속(genera)등이 또한 사용될 수 있다. 전술한 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas)속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.
원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있으며, pET 계열 벡터(Novagen)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 pET 계열 벡터를 사용하여 클로닝을 수행하면, 발현되는 단백질의 말단에 히스티딘기들이 결합되어 나오므로, 상기 단백질을 효과적으로 정제할 수 있다. 클로닝된 유전자로부터 발현된 단백질을 분리하기 위해서는 당업계에 공지된 일반적인 방법이 이용될 수 있으며, 구체적으로, Ni-NTA His-결합 레진(Novagen)을 사용하는 크로마토그래피 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 재조합벡터는 pET-SLTI66인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 숙주세포는 대장균 또는 아그로박테리움인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 "발현 조절 서열 (expression control sequence)" 이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다. 본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어, Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 바이러스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 프로모터는 대장균에서 본 발명의 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)" 된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 본 발명에 따른 단백질의 cDNA를 클로닝하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
하기 실시예에서 사용한 균주 및 플라스미드에 대하여 표 1에 나타내었다.
표 1
Figure PCTKR2012004523-appb-T000001
실시예 1: 재조합 균주를 이용한 글루코스, 프로피온산 및 3HB로 부터의 (2-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시부티레이트-co-락테이트) 폴리머 [P(2HB-co-3HB-co-LA)] 생합성
글루코오스, 프로피온산 및 3-하이드록시부티레이트로부터 P(2HB-co-3HB-co-LA)를 생산할 수 있는 대사공학적으로 조작된 대장균을 제작하였다.
유전자 클로닝용 숙주세포로는 E. coli XL1-Blue (Stratgene Cloning System, USA)를 사용하였으며, 37℃ LB 배지에서 배양하였다.
폴리머 합성시에 락테이트 모노머가 P(2HB-co-3HB) 공중합체로 함입되는 것을 억제하기 위하여, E.coliXL1-Blue의 염색체에서 ldhA 유전자를 원스텝 불활성화방법(Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 6640-6645,2000)으로 제거한 E. coli XLdh 균주를 제조하고, 이를 P(2HB-co-3HB) 합성을 위한 숙주세포로 사용하였다.
E.coli XLdh 균주는 20g/L의 글루코오스, 프로피온산과 원하는 농도의 3HB가 포함된 MR 배지를 사용하여, 30℃에서 250rpm으로 72시간동안 진탕배양하였으며, 배양 조건에 따라 2HB, 3HB 및 LA의 농도는 조절하였다.
2-하이드록시부틸-CoA 생산에 관여하는 유전자는 R.eutropha NCIMB11599(KCTC), Clostridium difficile 630(ATCC) 및 Lactococcus lactis sub sp. lactisI l1403(ATCC)의 염색체 DNA 및 플라스미드 p619C1437-pct540(Yang et al., Biotechnol. Bioeng. 105,150-160,2010)으로부터 증폭하였다.
플라스미드 p619C1437-pct540는 Ralstonia eutropha의 PHA synthase 오페론 프로모터 하에, Pseudomonas sp.6-19의 PHA synthase에서 E130D, S325T, S477G 및 Q481K의 4개의 변이를 함유하는 PhaC1437과 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소에서 V193A 변이와 뉴클레오티드서열의 4개의 침묵변이(T78C, T669C, A1125G 및 T1158C)를 가지는 Pct540를 발현하는 재조합 플라스미드이다 (Yang et al., Biotechnol. Bioeng., 105:150,2010).
재조합 E.coli XLdh에서의 재조합된 유전자의 발현 유도는 배양액의 흡광도가 600nm에서 0.5가 되었을때 1mM 농도가 되도록 IPTG를 첨가하여 수행하였다.
본 실시예에서는 phaC437, pct540, prpE, hadA 및 pflB 유전자를 발현하는 재조합 E.coli XLdh에 L. lactis sub sp. lactisIl1403의 panE 유전자를 도입시켜, 20g/L의 글루코오스와 원하는 농도의 propionate 및 3HB가 포함된 MR 배지를 사용하여, 30℃에서 250rpm으로 72시간동안 진탕배양하였으며, 배양 조건에 따라 2HB 및 3HB의 농도는 조절하여 p(2HB-co-3HB-co-LA)를 제조하였다.
본 실시예에서 재조합 플라스미드의 제작에 사용된 프라이머를 표 2에 나타내었다.
표 2
Figure PCTKR2012004523-appb-T000002
발현용 벡터 pZE12-MCS(EXPRESSYS, 미국)는 pTacLac(Lee et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 79,633-641,2008)의 MCS(Muti-cloning sites) 및 Ralstonia eutropha의 PHA 생합성 유전자 전사 터미네이터를 가지도록 변형시켰다.
pTacLac 벡터는 pTac99A (Park and Lee, J. Bacteriol. 185, 5391-5397, 2003) 벡터를 SspI으로 절단하여 얻은 Tac 프로모터와 전사종결자(Transcription terminator)를 포함하는 유전자 단편을 SspI으로 절단한 pTrc99A (Pharmacia Biotech, Sweden)에 삽입하여 제작하였으며, 상기 pTac99A는 pTrc99A(Pharmacia Biotech, Sweden)의 trc 프로모터를 pKK223-3(Pharmacia Biotech, Sweden)를 PvuII 및 EcoRI으로 절단하여 얻어진 tac 프로모터로 치환하여 제작하였다.
먼저, 통상적인 방법으로 분리된 Ralstonia eutropha의 염색체 DNA로 부터, PHA 생합성 유전자 전사 터미네이터 유전자 단편을 p619C1437-pct540로부터 서열번호 1~2의 프라이머를 이용하여 PCR로 수득하고, 상기 수득한 유전자 단편을 주형으로 하여 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 RBS, pTacLac MCS 및 R. eutropha의 PHA 생합성 유전자 전사 터미네이터를 수득하였다. 상기 PCR 산물을 MfeI 및 AvrII를 처리하여 절단하고, EcoRI/AvrII로 절단된 pZE12-MCS에 삽입하여, pKE12-MCS를 제조하였다.
pKE31-MCS(EXPRESSYS, 미국)의 PLtetO-1 프로모터를 pKE12-MCS를 XhoI/EcoRI으로 절단하여 수득한 PLlacO-1 프로모터로 치환하여 pKA32-MCS를 제조하였다.
상기 pKA32-MCS의 EcoRI 및 KpnI 부위에 R. eutropha의 염색체 DNA를 서열번호 4~5의 프라이머를 이용하여, PCR로 증폭한 prpE 유전자를 삽입하여, pKA32-ReprpE를 제조하였다.
상기 pKA32-MCS를 서열번호 6~7의 프라이머를 사용하여 PCR하여, PLlacO-1 프로모터, MCS 및 R. eutropha의 PHA 생합성 유전자 전사 터미네이터를 포함하는 유전자 단편을 증폭시켰고, 상기 증폭된 유전자 단편을 pBBR1MCS2{GenBank no. U23751; Kovach et al. Gene, 166,175-176,1995)의 SspI 부위에 삽입하여, pKM22-MCS를 제조하였다.
상기 pKM22-MCS에 L. lactis lactisIl1403의 염색체 DNA에서, 서열번호 8~9의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭한 lpanE 유전자를 삽입하여, pKM22PanE를 제조하였고, pKM22PanE에 C. difficile의 염색체 DNA에서, 서열번호 10~11의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭한 630 hadA와 C. difficile의 염색체 DNA에서, 서열번호 12~13의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭한 pflB 유전자를 삽입하여, pKM22PanEHadAPflB를 제조하였다. 위의 hadA 유전자는 2-hydroxyisovalerate와 2-hydroxyisocaproate를 2-hydroxyisovaleryl-CoA 및 2-hydroxyisocaproyl-CoA로 전환하는 효소이나, 본 발명에서 2HB-CoA를 만드는 역할은 pct540에 비하여 매우 낮았다.
p619C1437-pct540, pKA32-RePrpE, pKM22PanEHadAPflB 플라스미드들로 형질전환되어, phaC437, pct540, prpE, pflB 및 panE 유전자를 발현하는 재조합 E.coli XLdh는 글루코오스로, 프로피온산, 3HB로부터 6.3 중량%이상의 P(73mol%2HB-co-27mol%LA) 중합체를 제조하였다 (표 3).
배지 내의 3HB의 농도가 증가될수록, 합성된 폴리머에서의 2HB 단량체와 LA 분획은 감소하였다.
표 3
Figure PCTKR2012004523-appb-T000003
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 생분해성 신규 폴리머인 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 제조할 수 있는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법을 제공하는 효과가 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (25)

  1. 탄소원으로부터 아세틸-CoA를 생합성하는 경로를 가지고 있는 미생물에서, 락테이트디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자, D-2 하이드록시산 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자, propionyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자 및 pyruvate formate lyase를 코딩하는 유전자가 도입되어 있으며, 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase 또는 그 변이 효소인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 변이효소는 서열번호 14의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 변이효소는 서열번호 14의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477G 및 Q481M이 변이된 아미노산 서열(C1335);
    서열번호 14의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(C1310); 및
    서열번호 14의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481R이 변이된 아미노산 서열(C1312)로
    이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 프로피오닐-CoA 전이효소는 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소 또는 그 변이효소인 Pct540인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  6. 제1항에 있어서, D-2 하이드록시산 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 Lactobacillus lactis 유래의 panE인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  7. 제1항에 있어서, propionyl-coA synthetase를 코딩하는 유전자는 Ralstonia eutropha 유래의 prpE인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  8. 제1항에 있어서, pyruvate formate lyase는 Clostridium difficile 유래의 pflB인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  9. 제1항에 있어서, β-케토티올레이즈를 코딩하는 유전자 및 아세토아세틸-CoA 리덕타아제를 코딩하는 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  10. 제1항에 있어서, β-케토티올레이즈를 코딩하는 유전자는 Ralstonia eutropha 유래의 phaA이고, 아세토아세틸-CoA 리덕타아제를 코딩하는 유전자는 Ralstonia eutropha 유래의 phaB인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  11. 탄소원으로부터 아세틸-CoA를 생합성하는 경로를 가지고 있는 미생물에서, 락데이트디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 결실시키고, 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소를 코딩하는 유전자 및 프로피오닐-CoA 전이효소를 코딩하는 유전자, D-2 하이드록시산 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자, propionyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자 및 pyruvate formate lyase를 코딩하는 유전자를 도입시키는 것을 특징으로 하는 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 폴리하이드록시 알카노에이트 합성효소는 Pseudomonas sp. 6-19의 PHA synthase 또는 그 변이 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 변이효소는 서열번호 14의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 변이효소는 서열번호 14의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477G 및 Q481M이 변이된 아미노산 서열(C1335);
    서열번호 14의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(C1310); 및
    서열번호 14의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481R이 변이된 아미노산 서열(C1312)로
    이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 프로피오닐-CoA 전이효소는 C. propionicum의 프로피오닐-CoA 전이효소 또는 그 변이효소인 Pct540인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제11항에 있어서, D-2 하이드록시산 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 Lactobacillus lactis 유래의 panE인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제11항에 있어서, ppropionyl-coA synthetase를 코딩하는 유전자는 Ralstonia eutropha 유래의 prpE인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제11항에 있어서, pyruvate formate lyase는 Clostridium difficile 유래의 pflB인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제11항에 있어서, β-케토티올레이즈를 코딩하는 유전자 및 아세토아세틸-CoA 리덕타아제를 코딩하는 유전자를 추가로 도입시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제11항에 있어서, β-케토티올레이즈를 코딩하는 유전자는 Ralstonia eutropha 유래의 phaA이고, 아세토아세틸-CoA 리덕타아제를 코딩하는 유전자는 Ralstonia eutropha 유래의 phaB인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1항의 재조합 미생물을 글루코오스 및 프로피온산을 함유하는 배지에서 배양하여 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 단계; 및 상기 생산된 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 단계를 포함하는 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  22. 제21항에 있어서, 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트는 2-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시부티레이트-co-락테이트인 것을 특징으로 하는 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 배지는 3-하이드록시부티레이트를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  24. 제9항의 재조합 미생물을 글루코오스 및 프로피온산을 함유하는 배지에서 배양하여 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 단계; 및 상기 생산된 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 단계를 포함하는 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
  25. 제24항에 있어서, 2-하이드록시부티레이트를 모노머로 함유하고 있는 폴리하이드록시알카노에이트는 2-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시부티레이트 인 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
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