WO2012164135A1 - Procedimiento de obtención de una prótesis biodegradable - Google Patents

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María del Carmen ARAQUE MONRÓS
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Jorge MAS ESTELLES
Manuel MONLEÓN PRADAS
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Asociacion de Investigacion de la Industria Textil AITEX
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Universidad Politecnica de Valencia
Asociacion de Investigacion de la Industria Textil AITEX
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Definitions

  • the present invention relates to a new method of obtaining a biodegradable prosthesis, in particular of tendons or ligaments, comprising the injection of microparticles with cells that induce cell regeneration inside the prosthesis.
  • Tendon and ligament prostheses have been studied throughout the 20th century, with studies related to the development of permanent prostheses where non-biodegradable fibers have been used, such as polyesters (Mersilene, Terylene, Dracon, etc.) or polyamides (Nylon). These prostheses have a limited duration and over time the materials used gradually lose their characteristics. In the case of ligamentous prostheses, due to the continuous tensions to which it is subjected, they are lengthening and recovering their initial length less and less, thus losing the size that they must maintain so that it can continue to be useful.
  • fiber coatings have been used by the use of a hydrogel, obtaining improvements in mechanical properties.
  • Studies have also been conducted through the use of biodegradable fibers, which have provided promising results.
  • the latest trends point to the use of poly-L-lactic acid (PLLA) and polyglycolic acid (PGA), either separately, well copolymerized, since they have mechanical properties and degradation rates that can be "adjusted” to those of the tissue natural.
  • PLLA poly-L-lactic acid
  • PGA polyglycolic acid
  • these fibers are coated by a protein matrix, such as fibronectin, gelatin or fibrin, an improvement in adhesion and cell growth is achieved.
  • Patent application EP1561481 (Kladakis et al., 2005) describes an implant for the repair of tendons and ligaments comprising a tissue support of biodegradable synthetic polymeric materials and pockets adapted to contain the viable tissue.
  • materials disclosed are haluronates, chitosan and polylactic acids (L and D).
  • L and D haluronates
  • This prior art document also mentions the possibility of including particles of other materials to the braided material that forms the implant.
  • Cell diffusion towards the radial axis of the prosthesis can be problematic (Liu, Fan et al., 2008), so the use of a prosthesis with inductive cells only on its surface may not achieve cell regeneration inside the prosthesis. prostheses efficiently.
  • the present invention solves this problem by providing a new method for introducing cells that induce cell regeneration inside the prosthesis by injection. Description of the invention
  • the present invention provides a new method of obtaining a biodegradable prosthesis comprising a) a braided support material, b) microparticles and, c) a coating, characterized in that the microparticles are introduced inside the braided material. According to a preferred embodiment, the microparticles are introduced into the braided support material by injection.
  • the biodegradable prosthesis of the present invention is characterized in that the microparticles comprise cells that induce cell regeneration, such as, for example, mesenchymal cells or fibroblasts.
  • the cell regeneration inducing cells are mesenchymal cells. More preferably, human mesenchymal cells of the patient, from bone marrow or fat.
  • This regeneration can be initiated by means of a cell carrier, which may or may not be loaded with growth factors such as, for example, BMP-12, TGF- ⁇ , IGF-1, VEGF or bFGF.
  • the implant of the prosthesis in the organism can be done, either immediately after the injection of the microparticles with the cells, or after a period of culture in a bioreactor. Initially, the prosthesis should behave as a resistant element until the new tissue is formed and all the materials that form it are biodegraded.
  • a cell culture is carried out on the microparticles, these are placed inside the braided material by injection and a mechanical stimulus is applied so that these cells generate an extracellular matrix and collagen fibers, which will leave guiding and giving rise to tissue regeneration and the complete disappearance of the prosthesis.
  • the structure of the prosthesis of the present invention comprises a) a braided support material, b) microparticles inside the braid and, c) a coating ( Figures 1 and 2).
  • Braided material is one of the most important parts of the prosthesis, and its main function is to withstand mechanical loads.
  • the braided material part of the structure of the prosthesis of the present invention is a tubular mesh or hollow braid.
  • the braided structure allows the mechanical properties of the resulting braid to be adjusted, depending on the way the braid is made.
  • the braided material may be composed of PLLA (poly-L-lactic acid), PGA (polyglycolic acid), poly-e-caprolactone or copolymers formed by PLLA and PGA.
  • PLLA poly-L-lactic acid
  • PGA polyglycolic acid
  • poly-e-caprolactone copolymers formed by PLLA and PGA.
  • the braided material may consist mainly of PLLA (poly-L-lactic acid).
  • the morphological and mechanical characteristics of this braided material may vary so that it reproduces the tension curve. characteristic deformation of the mechanical behavior of the natural tissue, in particular tendon or ligament, which is intended to regenerate. For small deformations the braid is not very resistant, but as it deforms it becomes increasingly rigid.
  • Young's modulus of the prosthesis of the present invention in the linear behavior zone is similar to the values cited in the literature for natural tendon and ligaments.
  • the braided material is made with 12 threads of 3 or 4 ends of 336 dtex each.
  • the inner core of the braid (figures 3a and 3b) is extracted giving rise to braided material with an inner diameter between 1000-800 ⁇ and is obtained after extracting the inner core from the braid.
  • Mechanical tests performed show that the PLLA braids of the present invention reproduce the typical strain strain curve of a ligament ( Figure 4a and 4b) or tendon.
  • the microparticles are located inside the braided material and have the function of transporting the cells and providing matrix components extracellular These microparticles are characterized by having a diameter smaller than the internal diameter of the braid, preferably between 50 and 100 ⁇ .
  • These microparticles can be formed of different materials, preferably it is chosen from poly-L-lactic acid (PLLA), chitosan (CHT), hyaluronic acid (HA) and mixture thereof, in particular mixtures of PLLA: HA.
  • the coating included in the prostheses of the present invention has as its main function to avoid adhesions with the surrounding tissues, to protect the braided material and, preferably, to be resistant to abrasion.
  • This coating can be made on the braided material itself or by manufacturing a tube or sheath, where the braided material can then be introduced (Figure 5).
  • the coating comprises hyaluronic acid since it is part of the extracellular matrix, so it is completely biocompatible. Even so, the use of other biodegradable materials such as chitosan or mixtures of hyaluronic acid and chitosan is not ruled out.
  • the coating is formed by a cross-linked hyaluronic acid tube.
  • the ends of the tendon or ligament prosthesis can be anchored to the body by suturing or by biodegradable screws in the bone.
  • the ends of the prosthesis can have a flat or ring-shaped shape, so that the suture can be made, and in the second case, the ring-shaped end is most convenient to be able to anchor it to the screw.
  • Figure 1 Structure of the prosthesis obtained by the method of the present invention.
  • Figure 2 Scheme of the structure of the prosthesis comprising a) PLLA hollow braid, b) microparticles and c) coating.
  • Figure 3a Photograph showing a PLLA braid made with 12 threads with 4 ends of 336 dtex adding a total of 1344 dtex / thread. Outside diameter approximately 2 rom.
  • Figure 3b Photograph of a PLLA braid made with 12 threads with 4 ends of 336 dtex adding a total of 1344 dtex / thread to which the internal soul is extracted. Inner diameter after extracting the inner soul between 1000 and 800 ⁇ .
  • Figure 4a Typical strain-strain curve of a ligament.
  • Figure 4b Typical strain-strain curve of a PLLA braid made with 12 strands to 4 ends of 336 dtex totaling 1344 dtex / strand.
  • Figure 5 Braids inside a hyaluronic acid coating made on the braid itself.
  • Figure 6a Culture with L929 cell line, mouse fibroblasts, in microparticles of poly-L-lactic acid (PLLA).
  • PLLA poly-L-lactic acid
  • Figure 6b Culture with L929 cell line, mouse fibroblasts, in chitosan microparticles (CHT).
  • Figure 6c Culture with L929 cell line, mouse fibroblasts, in hyaluronic acid (HA) microparticles.
  • Figure 7 Culture with L929 cell line, mouse fibroblasts, in microparticles of mixtures of PLLA and HA
  • Figure 8 Aggregates of microparticles-cells seen by electron microscope.
  • Figure 10 Micrographs by electron microscope showing the adhered cells on the surface. Examples
  • Poly-L-lactic acid is dissolved in dichloromethane (CH 2 CI 2 ) in a concentration of 5%, (1 gr of PLLA in 20 ml of CH 2 CI 2 ).
  • This solution organic phase
  • PVA polyvinyl alcohol
  • a 2% chitosan solution (CHT) is prepared, for which 2 g of chitosan is weighed and dissolved in 100 ml of a 1% acetic acid solution. This solution is added dropwise at a rate of 10 ml / h on the organic phase composed of 100 ml of mineral oil, plus 1 ml of Tween 80. It is stirred for 30 min at 1750 rpm and then, from here all In the absence of light, the genipin crosslinker with a concentration of 30 mM (0.068 g of genipin in 10 ml of distilled water) is added, at a rate of lml / min. It is stirred for 15 hours with the same revolutions, 1750 rpm, washed and centrifuged repeatedly with ethanol. 100 ml of Mineral OH +
  • a solution of 5% hyaluronic acid (0.5 g of HA in 10 ml of 0.2M NaOH) is prepared and added dropwise, at a rate of 10 ml / h on a solution of 100 ml of isooctane, 1.7 ml of heptanol and 1.34 gr of sodium bis (2-etihexyl) sulfosuccyanate.
  • Example 4 Long time cell culture of the different microparticles (CHT, PLLA and HA) obtained in examples 1, 2 and 3
  • microparticles 50 mg are weighed in the wet state of ETOH 70% / Eppendorf, sterilized with 70% ethanol for 4-5 h and conditioned 24 h in Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM (Sigma) 4.5 g / 1 D-glucose. After this time they are cultured with the type of cells chosen (cell line L929, mouse fibroblasts) 100,000 cells / 50 mg of microparticles are cultured.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Example 5 Long time cell culture of mixtures of different microparticles
  • microparticles are cultured according to the above procedure with L929 cell line cells, mouse fibroblasts, but instead of using a single type of microparticles, the culture is carried out on a mixture of PLLA microparticles and HA microparticles in compositions ( PLLA: HA) (2: 1, 1: 2). The test times 1, 7 and 14 days. The results are shown in Figure 7.
  • Example 6 Short-term cell culture of PLLA microparticles to prevent good injectability
  • a culture test has been carried out at short times: 1, 2, 3 and 6h in order to observe at what time it would be optimal to perform a good injectability and to be able to avoid the obturation of the needle by the aggregates (microparticles + cells) that could be formed
  • the L929 cell line mouse fibroblasts
  • a cell suspension of 100 ⁇ is grown on the microparticles with a density of 5 cells / 50 mg of microparticles, sterilized and preconditioned.
  • the whole cells / microparticles are incubated at short times (1, 2, 3, 6 hours), after that time they are fixed with a 2.5% glutaraldehyde solution and observed under the electron microscope ( Figure 8). It is observed that at 6 h aggregates are formed (cells / microparticles) that could worsen the good injectability by needle sealing.
  • Example 7 Long time cell culture of PLLA microparticles
  • the culture is carried out with the same L929 cell line and the same procedure is followed above but for long times 1, 7, and 14 days in order to observe if the cells grow and proliferate on the support. This is checked by a cell viability and electron microscopy (SEM) and confocal test.
  • SEM cell viability and electron microscopy

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Abstract

Procedimiento de obtención de prótesis biodegradables que comprenden a) un material trenzado de soporte, b) microparticulas, y c) un recubrimiento, caracterizado porque las microparticulas se introducen en el interior del material trenzado de soporte. Preferentemente, las microparticulas se introducen en el interior del material trenzado de soporte mediante inyección. De acuerdo con otra realización preferente, las microparticulas comprenden células inductoras de la regeneración celular.

Description

PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE UNA PRÓTESIS BIODEGRADABLE
Sector de la técnica La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento de obtención de una prótesis biodegradable, en particular de tendones o ligamentos, que comprende la inyección de microparticulas con células inductoras de la regeneración celular en el interior de la prótesis.
Estado de la técnica
Las prótesis de tendones y ligamentos han sido estudiadas a lo largo de todo el siglo XX, existiendo estudios relacionados con la elaboración de prótesis permanentes donde se han utilizado fibras no biodegradables como, por ejemplo, poliésteres (Mersilene, Terylene, Dracon, etc) o poliamidas (Nylon) . Estas prótesis tienen una duración limitada y a lo largo del tiempo los materiales empleados van perdiendo paulatinamente sus características. En el caso de las prótesis ligamentosas, debido a las tensiones continuas a las que se ve sometido, van alargándose recuperando cada vez menos su longitud inicial, con lo que pierde el tamaño que debe mantener para que pueda seguir siendo útil. También, y debido al repetido sometimiento del ligamento a roces y flexiones con un material tan abrasivo como el hueso, se producen rasgados y posteriormente roturas, algo que también se puede hacer extensivo a las prótesis de tendones. En este último tipo de prótesis, en cambio, la característica tensión-deformación debe reproducir la del tejido natural, y no sólo durante el proceso de carga del tendón, sino también durante la descarga, permitiendo la recuperación de la dimensión previa a la carga.
Para mejorar estos resultados se han utilizado recubrimientos de las fibras (Kevlar, PET, etc.) mediante el uso de un hidrogel, obteniendo mejoras en las propiedades mecánicas. También se han realizado estudios mediante el uso de fibras biodegradables , las cuales han aportado resultados prometedores. Las últimas tendencias apuntan a la utilización de ácido poli-L-láctico (PLLA) y ácido poliglicólico (PGA) , bien por separado, bien copolimerizados, ya que presentan propiedades mecánicas y velocidades de degradación que pueden ser "ajustadas" a las del tejido natural. Además, si estas fibras son recubiertas mediante una matriz proteica como, por ejemplo, fibronectina, gelatina o fibrina, se consigue una mejora en la adhesión y en el crecimiento celular.
La solicitud de patente EP1561481 (Kladakis y col., 2005) describe un implante para la reparación de tendones y ligamentos que comprende un soporte de tejido de materiales poliméricos sintéticos biodegradables y bolsillos adaptados para contener el tejido viable. Entre los materiales divulgados se mencionan haluronatos, quitosano y ácidos polilácticos (L y D) . Este documento del estado de la técnica también menciona la posibilidad de incluir partículas de otros materiales al material trenzado que forma el implante. La difusión celular hacia el eje radial de la prótesis puede ser problemática (Liu, Fan y col., 2008) , por lo que la utilización de una prótesis con células inductoras únicamente en su superficie puede no conseguir la regeneración celular en el interior de la prótesis de forma eficiente. La presente invención soluciona este problema proporcionando un nuevo método para introducir células inductoras de la regeneración celular en el interior de la prótesis mediante inyección. Descripción de la invención
La presente invención proporciona un nuevo procedimiento de obtención de una prótesis biodegradable que comprende a) un material trenzado de soporte, b) microparticulas y, c) un recubrimiento, caracterizado porque las microparticulas se introducen en el interior del material trenzado. De acuerdo con un modo de realización preferente, las microparticulas se introducen en el interior del material trenzado de soporte mediante inyección.
De acuerdo con un modo de realización preferente, la prótesis biodegradable de la presente invención se caracteriza porque las microparticulas comprenden células inductoras de la regeneración celular como, por ejemplo, células mesenquimales o fibroblastos. Preferentemente, las células inductoras de la regeneración celular son células mesenquimales. De forma más preferente, células mesenquimales humanas del propio paciente, provenientes de médula ósea o de la grasa. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método de obtención de una prótesis biodegradable adecuada para utilizar en la inducción de la regeneración de tejidos, en particular de tendones y ligamentos. Esta regeneración se puede iniciar mediante la ayuda de un soporte celular, que puede estar cargado o no con factores de crecimiento tales como, por ejemplo, BMP- 12, TGF-β, IGF-1, VEGF o bFGF. El implante de la prótesis en el organismo se puede hacer, bien inmediatamente tras la inyección de las microparticulas con las células, bien tras un periodo de cultivo en un biorreactor. En un inicio la prótesis debe comportarse como un elemento resistente hasta que se constituya el nuevo tejido y se biodegraden todos los materiales que la forman. Para la regeneración del tejido se parte de un cultivo celular realizado sobre las microparticulas , éstas se colocan en el interior del material trenzado mediante inyección y se aplica un estimulo mecánico para que estas células generen una matriz extracelular y fibras de colágeno, las cuales se irán orientando y dando lugar a la regeneración del tejido y a la completa desaparición de la prótesis .
La estructura de la prótesis de la presente invención comprende a) un material trenzado de soporte, b) microparticulas en el interior del trenzado y, c) un recubrimiento (figuras 1 y 2) .
El material trenzado es una de las partes más importantes de la prótesis, y su función principal es la de soportar las cargas mecánicas. De acuerdo con un modo de realización preferente, el material trenzado parte de la estructura de la prótesis de la presente invención es una malla de forma tubular o trenza hueca. La estructura trenzada permite ajusfar las propiedades mecánicas del trenzado resultante, según el modo en que se haga la trenza .
El material trenzado puede estar compuesto por PLLA (ácido poli-L-láctico ) , PGA (ácido poliglicólico ) , poli-e- caprolactona o copolimeros formados por PLLA y PGA. Según la composición de PLLA y PGA en el copolimero, es posible ajusfar las características mecánicas y la rapidez de la degradación del material resultante. Preferentemente, el material trenzado puede estar formado principalmente por PLLA (ácido poli-L-láctico) . Las características morfológicas y mecánicas de este material trenzado pueden variar de forma que reproduzca la curva tensión- deformación característica del comportamiento mecánico del tejido natural, en particular tendón o ligamento, que se pretenda regenerar. Para pequeñas deformaciones el trenzado es poco resistente, pero conforme se va deformando cada vez es más rígido.
Preferentemente, el módulo de Young de la prótesis de la presente invención en la zona de comportamiento lineal es similar a los valores citados en la literatura para tendón y ligamentos natural.
Son ampliamente conocidas y utilizadas tecnologías para el trenzado y la influencia que tienen determinados parámetros de trenzado, como el ángulo de trenzado o la sección resistente, en las características mecánicas resultantes, incluso en aplicaciones similares a las de esta patente (Freeman, Woods y Laurencin, 2007) . Esta posibilidad de controlar el producto resultante durante el trenzado es lo que nos permite conseguir prótesis adaptadas a distintos tejidos, en particular distintos tendones o ligamentos, del cuerpo.
Preferentemente, el material trenzado se realiza con 12 hilos de 3 o 4 cabos de 336 dtex cada uno. De forma aún más preferente, se extrae el alma interna de la trenza (figuras 3a y 3b) dando lugar a material trenzado con un diámetro interior entre 1000-800 μπι y se obtiene tras extraer el alma interna de la trenza. Ensayos mecánicos realizados muestran que las trenzas de PLLA de la presente invención reproducen la curva típica de tensión deformación de un ligamento (figura 4a y 4b) o tendón. Las micropartículas se encuentran localizadas en el interior del material trenzado y tienen la función de transportar las células y aportar componentes de la matriz extracelular . Estas micropartículas se caracterizan por tener un diámetro inferior al diámetro interno de la trenza, preferentemente entre 50 y 100 μπι. Estas microparticulas pueden estar formadas de distintos materiales, preferentemente se elige entre ácido poli-L- lactico (PLLA) , quitosano (CHT) , ácido hialurónico (HA) y mezcla de éstos, en particular mezclas de PLLA:HA.
El recubrimiento comprendido en las prótesis de la presente invención tiene como función principal evitar adherencias con los tejidos circundantes, proteger el material trenzado y, preferentemente, ha de ser resistente a la abrasión. Este recubrimiento se puede realizar sobre el propio material trenzado o mediante la fabricación de un tubo o vaina, donde seguidamente se puede introducir el material trenzado (figura 5) . Preferentemente, el recubrimiento comprende ácido hialurónico ya que éste forma parte de la matriz extracelular, por lo que es totalmente biocompatible . Aún asi, no se descarta el uso de otros materiales biodegradables como, por ejemplo quitosano o mezclas de ácido hialurónico y quitosano. De forma especialmente preferente, el recubrimiento está formado por un tubo de ácido hialurónico reticulado Los extremos de la prótesis de tendón o ligamento pueden anclarse al organismo mediante sutura o bien mediante tornillos biodegradables en el hueso. En el primer caso, los extremos de la prótesis pueden tener forma plana o en forma de anilla, para que pueda ser hecha la sutura, y en el segundo caso, lo más conveniente es el final en forma de anilla para poder anclarla al tornillo.
Breve descripción de la figura Figura 1: Estructura de la prótesis obtenida por el procedimiento de la presente invención. Figura 2: Esquema de la estructura de la prótesis que comprende a) trenza hueca de PLLA, b) microparticulas y c) recubrimiento . Figura 3a: Fotografía mostrando una trenza de PLLA realizada con 12 hilos a 4 cabos de 336 dtex sumando un total de 1344 dtex/hilo. Diámetro exterior aproximadamente 2 rom. Figura 3b: Fotografía de una trenza de PLLA realizada con 12 hilos a 4 cabos de 336 dtex sumando un total de 1344 dtex/hilo a la que se le extrae el alma interna. Diámetro interior tras extraer el alma interna entre 1000 y 800 μπι. Figura 4a: Curva típica de tensión-deformación de un ligamento .
Figura 4b: Curva típica de tensión-deformación de una trenza de PLLA realizada con 12 hilos a 4 cabos de 336 dtex sumando un total de 1344 dtex/hilo.
Figura 5: Trenzas en el interior de un recubrimiento de ácido hialurónico realizado sobre la propia trenza. Figura 6a: Cultivo con línea celular L929, fibroblastos de ratón, en microparticulas de ácido poli-L-láctico (PLLA) .
Figura 6b: Cultivo con línea celular L929, fibroblastos de ratón, en microparticulas de quitosano (CHT) .
Figura 6c: Cultivo con línea celular L929, fibroblastos de ratón, en microparticulas de ácido hialurónico (HA) .
Figura 7: Cultivo con línea celular L929, fibroblastos de ratón, en microparticulas de mezclas de PLLA y HA Figura 8: Agregados de micropartículas-células vistas por microscopio electrónico.
Figura 9: Aumento del número células viables con el tiempo (e emplo 7)
Figura 10: Micrografias por microscopio electrónico mostrando las células adheridas en la superficie. Ejemplos
La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos que no deben considerarse limitativos de la misma.
Ejemplo 1: Preparación de microparticulas de ácido poliláctico (PLLA)
El ácido poli-L-láctico (PLLA) se disuelve en diclorometano (CH2CI2) en una concentración del 5%, (1 gr de PLLA en 20 mi de CH2CI2) . Esta disolución (fase orgánica) se añade gota a gota, con un flujo de 1 ml/min sobre una fase acuosa de polivinil alcohol (PVA) al 0.5% en peso (0.5 gr de PVA en 99.5 mi de agua destilada) y se agita durante 24h a 1350 rpm. Transcurrido este tiempo las microparticulas obtenidas se lavan con agua destilada repetidas veces y se liofilizan.
Disolución PVA 0.5%
(Polivinil alcohol)
PLLA 5% CH2CI2
(Dicloro metano)
Agitar 24h/1350 rpm
Obtención micropartículas
Lavado y c entrifugación
Liofilización
Ejemplo 2: Preparación de micropartículas de quitosano (CHT)
Se prepara una disolución de quitosano (CHT) al 2%, para ello se pesa 2 gr de quitosano y se disuelve en 100 mi de una disolución de ácido acético al 1%. Esta disolución se añade gota a gota con una velocidad de 10 ml/h sobre la fase orgánica compuesta de 100 mi de aceite mineral, más 1 mi de Tween 80. Se agita durante 30 min a 1750 rpm y seguidamente, a partir de aquí todo en ausencia de luz, se añade el entrecruzador genipin con una concentración de 30 mM (0.068 gr de genipin en 10 mi de agua destilada), a una velocidad de lml/min. Se agita durante 15 horas con las mismas revoluciones, 1750 rpm, se lavan y centrifugan repetidas veces con etanol. 100 mi de Mineral OH +
1 mi tween 80
CHT 2%
(10 ml/h)
Agitar 1750 rpm/30 min
Genipin 30 mM
(1 ml/min)
oscuridad
Aaitar 15 h
Figure imgf000012_0001
Ejemplo 3: Preparación de micro-partículas de ácido hialurónico (HA)
Se prepara un disolución de ácido hialurónico al 5% (0.5 gr de HA en 10 mi de NaOH 0.2M) y se añade gota a gota, con una velocidad de 10 ml/h sobre una disolución de 100 mi de isooctano, 1.7 mi de heptanol y 1.34 gr de sodio bis ( 2-etihexil ) sulfosuccianato . Se agita a 1300 rpm durante 15 min y seguidamente se añade 112 μΐ de divinil sulfona(DVS) agitando a 1300 rpm durante 20 min. Transcurrido este tiempo se lava con acetona repetidas veces, se centrifuga y se liofilizan.
Figure imgf000013_0001
Ejemplo 4: Cultivo celular a tiempos largos de las distintas microparticulas (CHT, PLLA y HA) obtenidas en los ejemplos 1, 2 y 3
Se pesan 50 mg de microparticulas en estado húmedo de ETOH 70%/Eppendorf, se esterilizan con etanol al 70% durante 4-5 h y se acondicionan 24 h en Dulbecco's Modified Eagle Médium, DMEM (Sigma) 4.5 g/1 D-glucosa. Transcurrido dicho tiempo se cultivan con el tipo de células elegido (linea celular L929, fibroblastos de ratón) Se cultiva 100.000 células/50 mg de microparticulas. Estas 100.000 células se concentran en ΙΟΟμΙ de DMEM 4.5 g/1 D-glucosa suplementado con 10% de suero bovino fetal FBS (Fisher), 1% penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina (Lonza) y Amphotericin B Solution 5% (Sigma) , se mantienen 1 h sin adicionar más medio con el fin de mejorar la adhesión celular. Transcurrido dicho periodo se añade medio hasta completar los 1000 μΐ . Se utiliza como control un Eppendorf. El medio de cultivo se renueva cada 3 días en ambiente de 37 °C y 5% de CO2. Los tiempos de ensayo son 1,7 y 14 días. Los resultados se muestran en las figuras 6a, 6b y 6c.
Ejemplo 5: Cultivo celular a tiempos largos de mezclas de distintas microparticulas
Las microparticulas se cultivan de acuerdo al procedimiento anterior con células de la linea celular L929, fibroblastos de ratón, pero en vez de utilizar un único tipo de microparticulas, el cultivo se realiza sobre una mezcla de microparticulas de PLLA y microparticulas de HA en composiciones (PLLA:HA) (2:1, 1:2) . Los tiempos de ensayos 1, 7 y 14 días. Los resultados se muestran en la figura 7.
Ejemplo 6: Cultivo celular a tiempos cortos de microparticulas de PLLA para preveer una buena inyectabilidad
Se ha realizado un ensayo de cultivo a tiempos cortos: 1, 2, 3 y 6h con el fin de observar a qué tiempo seria el óptimo para realizar una buena inyectabilidad y poder evitar la obturación de la aguja por los agregados (microparticulas + células) que se pudieran formar.
Para ello, se utiliza la linea celular L929, fibroblastos de ratón. Una suspensión celular de 100 μΐ es cultivada sobre las microparticulas con una densidad lxlO5 células/50 mg de microparticulas, esterilizadas y acondicionadas previamente. El conjunto células/ microparticulas se incuba a tiempos cortos (1, 2, 3, 6 horas), trancurrido dicho tiempo se fijan con una disolución de glutaraldehido 2.5% y se observan al microscopio electrónico (figura 8) . Se observa que a las 6 h se forman agregados (células/microparticulas) que podían empeorar la buena inyectabilidad por obturación de la aguja.
Ejemplo 7: Cultivo celular a tiempos largos de microparticulas de PLLA
Se realiza el cultivo con la misma línea celular L929 y se sigue el mismo procedimiento anterior pero a tiempos largos 1, 7, y 14 días con el fin de observar si las células crecen y proliferan sobre el soporte. Esto se comprueba mediante un ensayo de viabilidad celular y microscopía electrónica (SEM) y confocal .
En el ensayo de viabilidad celular realizado con MTS, se observa que el número de células viables aumenta conforme transcurre el tiempo (figura 9) .
En las micrografías del microscopio electrónico (SEM) a tiempos: 1 (a), 7 (b) y 14 (c) días se observa como las células están bien adheridas en la superficie. Lo mismo ocurre con la micrografía de confocal a 7 días (d) , donde se observa su actina (verde) bien desarrollada (figura 10) .

Claims

Reivindicaciones
1. - Procedimiento de obtención de prótesis biodegradables que comprenden a) un material trenzado de soporte, b) microparticulas, y c) un recubrimiento, caracterizado porque las microparticulas se introducen en el interior del material trenzado de soporte.
2. - Procedimiento de obtención de prótesis biodegradables según la reivindicación 1, caracterizado porque las microparticulas se introducen en el interior del material trenzado de soporte mediante inyección.
3. - Procedimiento de obtención de prótesis biodegradables según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque las microparticulas comprenden células inductoras de la regeneración celular.
4. - Procedimiento de obtención de prótesis biodegradables según la reivindicación 3, caracterizado porque las células inductoras de la regeneración celular son células mesenquimales .
5. - Procedimiento de obtención de prótesis biodegradables según la reivindicación 4, caracterizado porque comprende inyectar una mezcla que comprende una proporción de 2000 células/mg de microparticulas.
6. - Procedimiento de obtención de prótesis biodegradables según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque adicionalmente las microparticulas comprenden al menos un factor de crecimiento.
7. - Procedimiento de obtención de prótesis biodegradables según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el material trenzado está formado por ácido poli-L-láctico .
8. - Procedimiento de obtención de prótesis biodegradables según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las micropartículas están formadas por un material que se elige entre ácido poli-L-láctico, quitosano, ácido hialurónico y mezclas de éstos.
9. - Procedimiento de obtención de prótesis biodegradables según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el recubrimiento está formado por un tubo de ácido hialurónico reticulado.
10. - Prótesis biodegradable obtenida por un procedimiento tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. - Prótesis biodegradable obtenida por un procedimiento tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, adecuada para utilizar en la regeneración de tejido.
12. - Prótesis biodegradable según la reivindicación 11, adecuada para utilizar en la regeneración de tendones o ligamentos .
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