WO2012156508A1 - Verfahren zur herstellung von separationsmedien zur aufreinigung und/oder isolierung von enzymen und/oder proteinen - Google Patents

Verfahren zur herstellung von separationsmedien zur aufreinigung und/oder isolierung von enzymen und/oder proteinen Download PDF

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Friedrich Ruf
Gordon Thie
Hubert Kuhn
Friederike SANDER
Kathrin Ralla
Sascha BEUTEL
Cornelia Kasper
Thomas Scheper
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    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes

Definitions

  • the present invention relates to a method for
  • a mixture of proteins is first purified by ion exchange chromatography. This may possibly further steps, such. As a hydrophobic interaction chromatography or affinity chromatography, followed.
  • Enzyme purification is the so-called immobilized metal chelate
  • Anchoring groups are complexing agents
  • This adsorbent can now be used to adsorb histidine-rich proteins via complex formation.
  • To remove corresponding protein again from the separation medium can be eluted, for example, with a histidine-rich buffer.
  • Metal chelate media with relatively toxic heavy metal ions such as. B. Co 2+ and Ni 2+ .
  • the preparation of the known separation media is very complicated and expensive, so that they have therefore found no input into the technical separation processes.
  • Metal chelate media can also be used to purify and isolate proteins and enzymes that are later used in pharmaceutical and food technology processes. Furthermore, it is necessary to
  • the object of the invention is therefore to provide alternative metal chelate media which do not have the disadvantages of the prior art and which can be applied in a cost-effective manner to the carrier materials.
  • impregnated support materials are suitable as
  • food technology processes can be prepared by metal fatty acid salts in an organic solvent on the carrier materials
  • the present invention therefore relates in a first
  • a process for preparing a separation medium comprising the steps of a) contacting at least one metal salt
  • a fatty acid with an organic solvent b) contacting the mixture according to step a) with at least one support material; c) separating the carrier material.
  • separation medium is understood as meaning a medium in which a solid inorganic or organic support with a
  • Solvent is understood in the context of the present invention, any type of in-Kontakt-Bringens, which is known in the art as suitable for the purpose of the invention.
  • the metal salt of the fatty acid is at least partially, more preferably completely, in the organic
  • the "bringing into contact at least one metal salt of a fatty acid with an organic solvent” is carried out in the context of the present invention preferably in a
  • Solvent in the context of the present invention preferably carried out at atmospheric pressure.
  • Solvent is preferably in the range 0.01 to 1,
  • Range 0.15 to 0.9 more preferably in the range 0.2 to 0.8, also preferably in the range 0.3 to 0.75 and most preferably in the range 0.35 to 0.7.
  • fatty acid is used in the context of
  • Suitable fatty acids are, for example, saturated fatty acids having 8 to 24 carbon atoms, unsaturated fatty acids selected from the group of oleic acid, elaidic acid, linoleic acid and linolenic acid, hydroxyfatty acids such as ricinoleic acid and
  • Epoxy fatty acids such as vernolic acid.
  • Invention also subsumes fatty acid derivatives, i. Fatty acids which have been modified, for example, by hydroxy, alkyl, keto, and / or metoxy groups.
  • fatty acid derivatives i. Fatty acids which have been modified, for example, by hydroxy, alkyl, keto, and / or metoxy groups.
  • the fatty acids contain no primary, secondary and / or tertiary amino groups.
  • Particularly suitable are unsaturated fatty acids and fatty acid derivatives such as hydroxy fatty acids, which improved the metal ion Have accessibility and / or better complex with the metal ion.
  • the metal salt of the fatty acid in a preferred embodiment of the present invention is a zinc, iron, magnesium or calcium salt of a fatty acid, with a zinc or iron salt being particularly preferred.
  • Fe 2+ and Fe 3+ fatty acids can be used, with Fe 3+ fatty acids being preferred since these are less
  • fatty acid metal salts are used.
  • Particularly preferred metal salts are zinc salts of
  • Fatty acids such as zinc oleate and zinc ricinoleate.
  • the organic solvent in the context of the present invention is preferably an alcohol or an alcohol-containing solvent, with an ethanol-containing solvent being particularly preferred.
  • an alcohol or an alcohol-containing solvent is particularly preferred.
  • Solvents are acetone, cyclohexanone, iso-octane,
  • the ethanol content of the solvent at 1 to 99 vol .-%, more preferably 5 to 98 vol .-%, particularly preferably 15 to 95 vol .-%, more preferably 25 to 93 vol .-%, in particular preferably 35 to 92% by volume, also preferably 45 to 91% by volume and most preferably 50 to 85% by volume. Also preferred is a
  • the carrier material may be an organic or inorganic material.
  • Preferred support materials are inorganic metal oxides (such as
  • Filter unit or depth filter layer is used, such as membranes or porous monolithic stationary phases.
  • Process is understood to mean any kind of contacting which is known to the person skilled in the art as suitable for the purpose according to the invention.
  • Solvent with the carrier material by immersion of the carrier material in the mixture or by spraying the mixture onto the carrier material.
  • Carrier material adsorbed.
  • the "contacting the mixture of a metal salt of a fatty acid and a solvent with the support material” according to step b) of the method according to the invention is preferably carried out at a temperature of 1 to 80 ° C, more preferably 5 to 75 ° C, more preferably 15 to 72nd ° C, also preferably at 25 to 70 ° C, more preferably at 35 to 65 ° C and most preferably at 45 to 60 ° C. Further, "contacting the mixture of a metal salt of a fatty acid and a solvent with the carrier material" in step b) of the invention
  • the separation is carried out by the solvent or the solvent mixture is evaporated.
  • the evaporation is preferably carried out at a temperature of 50 to 90 ° C, more preferably 60 to 85 ° C, on
  • the present invention relates to a separation medium, which according to the invention
  • the present invention relates to a separation medium comprising a carrier material to which at least one metal fatty acid has been applied.
  • the "application” is carried out in the context of the present invention by adsorbing the at least one metal fatty acid on the carrier material This can be achieved in that the at least one metal fatty acid together with a
  • Solvent is brought into contact with the carrier material (see also above). It is also possible to apply the at least one
  • Metal fatty acid on the carrier material in the form of a powder or a suspension.
  • the term “applied” is thus understood to mean that the at least one metal fatty acid is present on the carrier material
  • the at least one metal fatty acid applied is zinc fatty acid.
  • the present invention in a further aspect relates to the use of a separation medium as above
  • the present invention relates to a method for purifying and / or
  • Separation medium as defined above; ii) separating the separation medium.
  • the "bringing into contact a solution containing at least one protein and / or enzyme with the separation medium” is carried out in the context of the present invention preferably in a
  • the solution is brought into contact with at least one protein and / or enzyme Separation medium "is preferably at a temperature of 1 to 25 ° C, more preferably 2 to 20 ° C, more preferably 3 to 15 ° C, and most preferably 4 to 10 ° C.
  • Separation medium in the context of the present invention at atmospheric pressure or at a pressure of 1.5 to 50 bar, preferably 2 to 45 bar, more preferably 3 to 40 bar, also
  • solution containing at least one protein and / or enzyme is understood to mean any fluid which contains at least one protein and / or enzyme Suitable solutions are lyophilisates of
  • These fermented liquids can be used with or without the microorganisms by which they were fermented.
  • the microorganisms still contained in the fermented liquid can be lyophilized with the separation medium before the solution is brought into contact.
  • Proteins and / or enzymes modified proteins and / or enzymes, for example modified by the addition of one or more histidine groups.
  • the liquid contains a proportion of H 2 O, the most preferably from 1 to 99 vol .-%, more preferably from 2 to 95 vol .-%, more preferably from 5 to 90 vol .-%, in particular from 10 to 85 vol %, more preferably 15 to 80% by volume and most preferably 20 to 75% by volume.
  • H 2 O the most preferably from 1 to 99 vol .-%, more preferably from 2 to 95 vol .-%, more preferably from 5 to 90 vol .-%, in particular from 10 to 85 vol %, more preferably 15 to 80% by volume and most preferably 20 to 75% by volume.
  • the liquid contains a portion of a buffer, preferably an MES buffer or a TRIS buffer.
  • a buffer preferably an MES buffer or a TRIS buffer.
  • Other possible buffers are selected from the group BIS-TRIS, PIPES, BES, MOPS, phosphate buffer, TES, HEPES and tricine.
  • Other possible ingredients are salts, such as NaCl. NaCl can be used to advantage in the liquid for interactions
  • Suitable concentrations of NaCl are 5 to 500 mM, preferably 50 to 450 mM, more preferably 100 to 400 mM, more preferably 150 to 350 mM and most preferably 170 to 320 mM, more preferably in a proportion of 1 to 99% by volume, more preferably 2 to 95% by volume, more preferably 5 to 90% by volume, in particular from 10 to 85% by volume, more preferably from 15 to 80% by volume and most preferably from 20 to 75% by volume.
  • the solution further comprises one or more ingredients selected from the group consisting of sodium chloride, glycol,
  • the separation of the separation medium according to step ii) can be carried out in any manner which is known to the person skilled in the art as suitable for the purpose according to the invention. It is possible, for example, a filtration of the separation medium.
  • the method for purifying and / or isolating enzymes and / or proteins further comprises the step iii) contacting the separation medium according to
  • Step ii) with at least one buffer solution
  • the preferred "buffer solution” is a solution which promotes the desorption of the proteins and / or enzymes adsorbed on the separation medium, more preferably a buffer solution containing phosphate and / or imidazole 50 to 1000 mM, preferably 75 to 750 mM, more preferably 100 to 500 mM, and most preferably 150 to 250 mM imidazole and / or 1 to 250 mM Phoshpat, preferably 5 to 200 mM, more preferably 10 to 150 mM, and most preferably 50 to 100 mM.
  • Particularly preferred is sodium phosphate, which is used alone or in combination with imidazole.
  • the separation medium in step iii) of the invention is a particularly preferred embodiment, the separation medium in step iii) of the invention
  • wash buffer brought into contact is preferably an acidic or basic wash buffer.
  • Preferred acidic wash buffers are selected from the group consisting of acetate buffers and formate buffers
  • preferred basic wash buffers are selected from the group consisting of TRIS buffer and CAPS buffer.
  • Bste stearothermophilus esterase won.
  • Bste is provided with a His tag at the C-terminus and has one
  • FIG. 1 shows the SDS gels of the supernatants of adsorption, washing and desorption step on adsorber 1
  • Fig. 5 Step gradient in two steps with 250 mM imidazole and
  • Fig. 6 Step gradient in three steps with 100 mM imidazole, then 250 mM imidazole and 500 mM imidazole Fractions from the chromatogram of Figure 4
  • Example 1 Coating of alumina with zinc ricinoleate and zinc oleate
  • alumina can be coated with other zinc fatty acids, such as.
  • zinc oleate e.g., adsorbent 2 in Example 3
  • Example 2 Binding of Bacillus stearothermophilus esterase (Bste) from cell digestion on adsorbent 1 (2% ZnRi 2 out
  • lyophilized supernatant from E. coli cell disruption was dissolved in ddH 2 ⁇ 0 (2 mg / mL) and incubated with binding buffer (0.5 mL sol
  • Lyophilisate and 0.5 mL binding buffer MES or TRIS) to the Materials are pipetted and incubated for 1 hour in an overhead mixer at about 0.5 rpm.
  • binding buffers were used:
  • Table 1 indicates under which conditions as much as possible BST bound to the ZnRi 2 occupied materials.
  • Table 1 Comparison of the binding of BST to adsorbent 1 and uncoated Al 2 O 3 at different pH values and different NaCl concentrations.
  • Example 3 Elution of Bacillus stearothermophilus esterase of the adsorbent from Example 2
  • Imidazole (100 mM, 250 mM and 500 mM) with pH values between 8 and 8.5 and a IMAC elution buffer by Sigma (HIS-Select ® H5413 Elution Buffer 250 mM imidazole, 300 mM NaCl and 50 mM Na-phosphate , pH 8).
  • Imidazole is the functional group of
  • HCP Host Cell Protein
  • Elution fractions were collected and analyzed by SDS-PAGE.
  • the aluminum oxide according to Example 1 was coated with 2.5 and 10 wt.% ZnRi.
  • 10% zinc oleate-treated alumina was still investigated.
  • Binding was done in 50 mM MES buffer with 500 mM NaCl at pH 7. A sample volume of
  • Figure 2 shows an example of the chromatogram of an FPLC run performed under the conditions mentioned. Fractions 4-6 and 13-15 were collected and subjected to SDS-PAGE. The gel is shown in Figure 3.
  • Adsorbent 2 (10% zinc oleate on alumina 90)
  • Adsorbent 3 (5% zinc ricinoleate on alumina 90)
  • the elution fractions have a relatively high purity in the case of this material.
  • the occupancy with 5% zinc ricinoleate seems to be over a relatively high His-tag specific
  • Adsorbent 4 (10% zinc ricinoleate on alumina 90)
  • Figures 14 and 15 show the chromatograms of the FPLC runs performed. The fractions were collected and analyzed by SDS PAGE examined. The SDS gels are shown in Figures 16 and 17.
  • this material has a basic suitability for Bste- purification.
  • SDS-PAGE the use of the 5% ZnRi 2- based aluminum-based material appears to result in higher purity of the eluted BST fractions.
  • a higher ligand density can be

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Separationsmediums, das nach dem Verfahren hergestellte Separationsmedium, auf das mindestens eine Metallfettsäure aufgebracht ist, die Verwendung des Separationsmediums zur Aufreinigung und/oder Isolierung von Enzymen und/oder Proteinen sowie ein Verfahren zur Aufreinigung und/oder Isolierung von Proteinen und/oder Enzymen.

Description

Verfahren zur Herstellung von Separationsmedien zur
Aufreinigung und/oder Isolierung von Enzymen und/oder
Proteinen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung eines Separationsmediums , das nach dem Verfahren hergestellte Separationsmedium, auf das mindestens eine
Metallfettsäure aufgebracht ist, die Verwendung des
Separationsmediums zur Aufreinigung und/oder Isolierung von Enzymen und/oder Proteinen sowie ein Verfahren zur
Aufreinigung und/oder Isolierung von Proteinen und/oder
Enzymen .
Um Proteine oder Enzyme mit festen Trennmedien aufzureinigen, sind die unterschiedlichsten Verfahren einsetzbar. In der Regel werden mehrere Schritte bzw. Adsorptionsmedien
miteinander kombiniert. Üblicherweise wird ein Gemisch von Proteinen zunächst einmal durch eine Ionenaustauschchromato- graphie aufgereinigt . Daran können sich ggf. weitere Schritte, wie z. B. eine hydrophobe Interaktionschromatographie oder eine Affinitätschromatographie, anschließen.
Ein spezielles Verfahren zur Protein- und/oder
Enzymaufreinigung ist die sog. immobilisierte Metallchelat-
Affinitätschromatographie, die im Englischen oft auch , IMAC abgekürzt wird. Die Abkürzung kommt von ,Immobilized Metal
Affinity Chromatography ' . Details zu dieser Methode sind insbesondere in dem Buch von L. Kagedal, Protein
Purifications, Principles, High-Resolution Methods, and
Applications, Kapitel 8, Immobilized Metal Ion Affinity
Chromatography, Wiley-VCH (1998) angegeben. Dieses Verfahren beruht auf einer Komplexbildung von insbesondere
Histidingruppen der Proteine oder Enzyme mit dem Trennmedium. Als Ankergruppen werden dabei an Komplexbildnern
immobilisierte Metallionen zur Verfügung gestellt. Hierzu ist es erforderlich, solche Trennmedien herzustellen, bei denen ein festes Adsorbens, bestehend aus einem anorganischen oder organischen Träger, mit einem Komplexbildner zunächst
funktionalisiert wird. Üblicherweise wird hierzu ein Derivat von Aminodiessigsäure eingesetzt, welches beispielsweise eine Silangruppe tragen kann, um es auf Silicagelen zu verankern. Im nächsten Schritt wird das mit dem Komplexbildner
funktionalisierte Trennmedium an Metallionen aufgebracht.
Dieses Adsorbens kann nun eingesetzt werden, um histidinreiche Proteine über Komplexbildung zu adsorbieren. Um das
entsprechende Protein wieder vom Trennmedium zu entfernen, kann man beispielsweise mit einem histidinreichen Puffer eluieren .
Um die Effizienz dieses Trennprozesses zu steigern, kann man das Zielprotein oder Zielenzym, wenn dieses gentechnologisch produziert wird, so modifizieren, dass es endständig noch mehrere Histidingruppen trägt. Man spricht von sog. his-tags. Dadurch wird die Wechselwirkung mit Metallchelatmedien noch weiter gesteigert.
Es ist im Stand der Technik bereits eine große Reihe von
Metallchelatmedien kommerziell verfügbar. Trotzdem haben diese bereits bekannten Metallchelatmedien eine Reihe von
Nachteilen: Einerseits arbeitet ein großer Teil der
Metallchelatmedien mit relativ giftigen Schwermetallionen, wie z. B. Co2+ und Ni2+. Dies schränkt die Möglichkeit ein, die Trennprozesse in technischem Maßstab beispielsweise für die Produktion von pharmazeutisch aktiven Proteinen oder im Bereich der Lebensmittelproduktion einzusetzen. Weiterhin ist die Herstellung der bekannten Trennmedien sehr aufwendig und teuer, so dass sie auch deshalb noch keinen Eingang in die technischen Trennprozesse gefunden haben. Hier ist
insbesondere die kostenintensive Entsorgung der Schwermetalle problematisch. Drittens ist es mit den bisher zur Verfügung stehenden Verfahren zur Einführung von komplexbildenden
Gruppen nicht möglich, beliebige Substrate zu
funktionalisieren . So werden im Stand der Technik entweder die Komplexbildner über kovalente organische Gruppen oder in Form von Silanfunktionalitäten an entsprechende Träger aufgebracht. Eine Herstellung von Metallchelatmedien über Physisorption ist bisher im Stand der Technik noch nicht näher untersucht worden .
Aufgrund des verstärkten Einsatzes von biotechnologischen Prozessen, sowohl bei der Herstellung von pharmakologisch aktiven Proteinen als auch bei der Herstellung von technischen Proteinen und Enzymen, besteht ein ständiger Bedarf an
alternativen und effizienten Trennmedien. Dies gilt
insbesondere auch für das Einsatzgebiet der
Lebensmittelproduktion. Es ist daher dringend erforderlich, dass einerseits Oberflächenfunktionalisierungen gefunden werden, bei denen toxische Schwermetallionen, wie z. B. Ni2+ und Co2+, durch weniger toxische Metallionen, wie z. B. Fe3+ 2+ und Zn2+, ersetzt werden können. Nur dann können diese
Metallchelatmedien auch zur Aufreinigung und Isolierung von Proteinen und Enzymen eingesetzt werden, die später Verwendung in pharmazeutischen und lebensmitteltechnologischen Prozessen finden. Weiterhin ist es notwendig, die
Oberflächenfunktionalisierungen mit den aktiven
komplexbildenden Gruppen zu vereinfachen, um so den
Herstellungsprozess der Metallchelatmedien zu vereinfachen und damit auch zu vergünstigen. Die Erfindung hat sich deshalb die Aufgabe gestellt, alternative Metallchelatmedien zur Verfügung zu stellen, die die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen und die auf kostengünstige Art und Weise auf die Trägermaterialien aufgebracht werden können. Erstaunlicherweise wurde nun gefunden, dass sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beliebige Trägermaterialein mit einer Schicht aus
Metallfettsäure überziehen lassen und dass die so
imprägnierten Trägermaterialien geeignet sind, um als
Metallchelatmedien auch in pharmakologischen und
lebensmitteltechnologischen Verfahren eingesetzt zu werden.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben nun überraschend gefunden, dass sich besonders vorteilhafte Separationsmedien, die sowohl in pharmakologischen wie auch
lebensmitteltechnologischen Verfahren eingesetzt werden können, herstellen lassen, indem Metallfettsäuresalze in einem organischen Lösungsmittel auf die Trägermaterialien
aufgebracht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher in einem ersten
Aspekt ein
Verfahren zur Herstellung eines Separationsmediums umfassend die Schritte a) In-Kontakt-Bringen mindestens eines Metallsalzes
einer Fettsäure mit einem organischen Lösungsmittel; b) In-Kontakt-Bringen des Gemischs gemäß Schritt a) mit mindestens einem Trägermaterial; c) Abtrennen des Trägermaterials.
Unter dem Begriff „Separationsmedium" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Medium verstanden, bei dem ein fester anorganischer oder organischer Träger mit einer
Verbindung beaufschlagt ist, die mit mindestens einem der aufzutrennenden Proteine oder Enzyme eine Verbindung eingehen kann. Diese „beaufschlagte Verbindung" bezeichnet man auch als „stationäre Phase". Die aufzutrennenden Proteine oder Enzyme werden in der „mobilen Phase" (Gas oder Flüssigkeit)
eingesetzt .
Unter dem Begriff „in Kontakt Bringen mindestens eines
Metallsalzes einer Fettsäure mit einem organischen
Lösungsmittel" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung jede Art des in-Kontakt-Bringens verstanden, die dem Fachmann als für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet bekannt ist.
Bevorzugt erfolgt das In-Kontakt-Bringen des Metallsalzes mit dem Lösungsmittel durch einfaches Mischen. In einer
bevorzugten Ausführungsform wird während des in-Kontakt- Bringens das Metallsalz der Fettsäure zumindest teilweise, besonders bevorzugt vollständig, in dem organischen
Lösungsmittel gelöst.
Das „in Kontakt Bringen mindestens eines Metallsalzes einer Fettsäure mit einem organischen Lösungsmittel" erfolgt im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt bei einer
Temperatur von 1 bis 80 °C, bevorzugter 5 bis 75 °C, weiter bevorzugt bei 15 bis 72 °C, ebenfalls bevorzugt bei 25 bis 70 °C, insbesondere bevorzugt bei 35 bis 65 °C und am meisten bevorzugt bei 45 bis 60 °C. Weiter kann das „in Kontakt Bringen mindestens eines Metallsalzes einer Fettsäure mit einem organischen
Lösungsmittel" im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt bei Normaldruck erfolgen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird während des „in Kontakt Bringens mindestens eines Metallsalzes einer
Fettsäure mit einem organischen Lösungsmittel" gerührt.
Das Mengenverhältnis (g Metallsalz : g organisches
Lösungsmittel) liegt bevorzugt im Bereich 0,01 bis 1,
bevorzugter im Bereich 0,1 bis 0,99, weiter bevorzugt im
Bereich 0,15 bis 0,9, insbesondere bevorzugt im Bereich 0,2 bis 0,8, ebenfalls bevorzugt im Bereich 0,3 bis 0,75 und am meisten bevorzugt im Bereich 0,35 bis 0,7.
Unter dem Begriff „Fettsäure" werden im Rahmen der
vorliegenden Erfindung alle Monocarbonsäuren, also
Verbindungen, die aus einer Carboxygruppe (-COOH) und aus einer unterschiedlich langen, aber fast ausschließlich
unverzweigten Kohlenwasserstoffkette bestehen, verstanden. Geeignete Fettsäuren sind beispielsweise gesättigte Fettsäuren mit 8 bis 24 Kohlenstoffatomen, ungesättigte Fettsäuren ausgewählt aus der Gruppe Ölsäure, Elaidinsäure, Linolsäure und Linolensäure, Hydroxyfettsäuren wie Ricinolsäure und
Epoxyfettsäuren wie Vernolsäure. Unter dem Begriff
„Fettsäurederivate" werden im Rahmen der vorliegenden
Erfindung auch Fettsäurederivate subsumiert, d.h. Fettsäuren, die beispielsweise durch Hydroxy-, Alkyl-, Keto-, und/oder Metoxygruppen modifiziert wurden. In einer bevorzugten
Ausführungsform enthalten die Fettsäuren keine primären, sekundären und/oder tertiären Aminogruppen . Besonders geeignet sind dabei ungesättigte Fettsäuren und Fettsäurederivate wie Hydroxyfettsäuren, die für das Metallion eine verbesserte Zugänglichkeit aufweisen und/oder mit dem Metallion besser komplexieren . Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können auch Mischungen von zwei oder mehr der vorgenannten Fettsäuren und Fettsäurederivate eingesetzt werden.
Bei dem Metallsalz der Fettsäure handelt es sich in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung um ein Zink-, Eisen-, Magnesium- oder Calciumsalz einer Fettsäure, wobei ein Zink oder Eisensalz besonders bevorzugt ist.
Prinzipiell können Fe2+ und Fe3+ Fettsäuren eingesetzt werden, wobei Fe3+ Fettsäuren bevorzugt sind, da diese weniger
oxidationsanfällig sind. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können auch Mischungen von zwei oder mehreren
unterschiedlichen Fettsäure-Metallsalzen eingesetzt werden. Besonders bevorzugte Metallsalze sind Zinksalze von
Fettsäuren, wie Zinkoleat und Zinricinoleat .
Bei dem organischen Lösungsmittel handelt es sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt um einen Alkohol oder ein Alkohol-haltiges Lösungsmittel, wobei ein Ethanol-haltiges Lösungsmittel besonders bevorzugt ist. Weitere geeignete
Lösungsmittel sind Aceton, Cyclohexanon, iso-Octan,
Cyclohepanon sowie Alkane deren Siedepunkt oberhalb des
Schmelzpunktes der Metallfettsäure liegt und deren Mischungen.
Besonders bevorzugt ist es dabei, wenn der Ethanolanteil des Lösungsmittels bei 1 bis 99 Vol.-%, bevorzugter 5 bis 98 Vol.- %, besonders bevorzugt 15 bis 95 Vol.-%, weiter bevorzugt 25 bis 93 Vol.-%, insbesondere bevorzugt 35 bis 92 Vol.-%, ebenfalls bevorzugt 45 bis 91 Vol.-% und am meisten bevorzugt bei 50 bis 85 Vol.% liegt. Ebenfalls bevorzugt ist ein
Ethanolgehalt von 100%. Bei dem Trägermaterial kann es sich um ein organisches oder inorganisches Material handeln. Bevorzugte Trägermaterialien sind anorganische Metalloxide (wie beispielsweise
Aluminiumoxid) , Kieselgel, Cellulose, Dextran und deren
Mischungen. Ebenfalls möglich ist, dass als Trägermaterial in dem erfindungsgemäßen Verfahren bereits eine fertige
Filtereinheit oder Tiefenfilterschicht eingesetzt wird, wie beispielsweise Membranen oder poröse monolithische stationäre Phasen .
Unter dem Begriff „in Kontakt Bringen des Gemischs eines Metallsalzes einer Fettsäure und eines Lösungsmittels mit dem Trägermaterial" gemäß Schritt b) des erfindungsgemäßen
Verfahrens wird jede Art des in-Kontakt-Bringens verstanden, die dem Fachmann als für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet bekannt ist. Bevorzugt erfolgt das In-Kontakt-Bringen des Gemischs des Metallsalzes einer Fettsäure und des
Lösungsmittels mit dem Trägermaterial durch Immersion des Trägermaterials in das Gemisch oder durch Aufsprühen des Gemisches auf das Trägermaterial. Durch das „in-Kontakt- Bringen des Gemischs eines Metallsalzes einer Fettsäure und eines Lösungsmittels mit dem Trägermaterial" gemäß Schritt b)wird die mindestens eine Metallfettsäure auf dem
Trägermaterial adsorbiert.
Das „in Kontakt Bringen des Gemischs eines Metallsalzes einer Fettsäure und eines Lösungsmittels mit dem Trägermaterial" gemäß Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt bevorzugt bei einer Temperatur von 1 bis 80 °C, bevorzugter 5 bis 75 °C, weiter bevorzugt bei 15 bis 72 °C, ebenfalls bevorzugt bei 25 bis 70 °C, insbesondere bevorzugt bei 35 bis 65 °C und am meisten bevorzugt bei 45 bis 60 °C. Weiter kann das „in Kontakt Bringen des Gemischs eines Metallsalzes einer Fettsäure und eines Lösungsmittels mit dem Trägermaterial" gemäß Schritt b) des erfindungsgemäßen
Verfahrens im Rahmen der vorliegenden Erfindung bei
Normaldruck erfolgen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann das Abtrennen des Trägermaterials gemäß Schritt c) des erfindungsgemäßen
Verfahrens von dem Lösungsmittelgemisch auf jede Weise
erfolgen, die dem Fachmann als für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet bekannt ist. Bevorzugt erfolgt das Abtrennen indem das Lösungsmittel bzw. das Lösungsmittelgemisch verdampft wird. Das Verdampfen erfolgt bevorzugt bei einer Temperatur von 50 bis 90 °C, bevorzugter von 60 bis 85 °C, weiter
bevorzugt von 65 bis 75 °C.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Separationsmedium, das gemäß dem erfindungsgemäßen
Verfahren, wie vorstehend definiert, hergestellt wurde.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Separationsmedium umfassend ein Trägermaterial, auf das mindestens eine Metallfettsäure aufgebracht ist.
Das „Aufbringen" erfolgt im Rahmen der vorliegenden Erfindung durch Adsorbieren der mindestens einen Metallfettsäure auf dem Trägermaterial. Dies kann dadurch erreicht werden, dass die mindestens eine Metallfettsäure zusammen mit einem
Lösungsmittel mit dem Trägermaterial in Kontakt gebracht wird (siehe hierzu auch vorstehende Ausführungen). Ebenfalls möglich ist auch ein Aufbringen der mindestens einen
Metallfettsäure auf das Trägermaterial in Form eines Pulvers oder einer Suspension. Unter dem Begriff „aufgebracht" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung somit verstanden, dass die mindestens eine Metallfettsäure auf dem Trägermaterial
adsorbiert ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der mindestens einen aufgebrachten Metallfettsäure um Zinkfettsäure .
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt die Verwendung eines Separationsmediums wie vorstehend
definiert zum Aufreinigen und/oder Isolieren von Enzymen und/oder Proteinen.
Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zum Aufreinigen und/oder
Isolieren von Enzymen und/oder Proteinen
umfassend die Schritte i) In-Kontakt-Bringen einer Lösung enthaltend mindestens ein Protein und/oder Enzym mit einem
Separationsmedium wie vorstehend definiert; ii) Abtrennen des Separationsmediums .
Unter dem Begriff „in Kontakt Bringen einer Lösung enthaltend mindestens ein Protein und/oder Enzym mit dem
Separationsmedium" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung jede Art des in-Kontakt-Bringens verstanden, die dem Fachmann als für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet bekannt ist.
Bevorzugt erfolgt das In-Kontakt-Bringen einer Lösung
enthaltend mindestens ein Protein und/oder Enzym mit dem Separationsmedium durch Immersion des Separationsmediums in die Lösung. Es ist jedoch ebenfalls bevorzugt, wenn das In- Kontakt-Bringen erfolgt, indem die Lösung über eine Säule geleitet wird, in der das Separationsmedium enthalten ist. Möglich sind auch Kartuschen zum einmaligen Gebrauch.
Das „in Kontakt Bringen einer Lösung enthaltend mindestens ein Protein und/oder Enzym mit dem Separationsmedium" erfolgt im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt bei einer
Temperatur von 1 bis 60 °C, bevorzugter 5 bis 55 °C, weiter bevorzugt bei 10 bis 50 °C, ebenfalls bevorzugt bei 15 bis 55 °C, insbesondere bevorzugt bei 20 bis 50 °C und am meisten bevorzugt bei 21 bis 35 °C. In speziellen Ausführungsformen, beispielsweise in dem Fall, dass Enzyme und/oder Proteine eingesetzt werden, die über eine geringere Stabilität verfügen und/oder leicht proteolytisch abgebaut werden, erfolgt das „in Kontakt Bringen einer Lösung enthaltend mindestens ein Protein und/oder Enzym mit dem Separationsmedium" bevorzugt bei einer Temperatur von 1 bis 25 °C, bevorzugter 2 bis 20 °C, weiter bevorzugt bei 3 bis 15 °C und am meisten bevorzugt bei 4 bis 10 °C.
Weiter kann das „in Kontakt Bringen einer Lösung enthaltend mindestens ein Protein und/oder Enzym mit dem
Separationsmedium" im Rahmen der vorliegenden Erfindung bei Normaldruck oder bei einem Druck von 1,5 bis 50 bar, bevorzugt 2 bis 45 bar, weiter bevorzugt 3 bis 40 bar, ebenfalls
bevorzugt bei 4 bis 35 bar. Ein gegenüber dem Normaldruck erhöhter Druckbereich ist beispielsweise von Vorteil, wenn das „in Kontakt Bringen einer Lösung enthaltend mindestens ein Protein und/oder Enzym mit dem Separationsmedium" in einer Säule durchgeführt wird. Unter dem Begriff „Lösung enthaltend mindestens ein Protein und/oder Enzym" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung jede Flüssigkeit verstanden, die mindestens ein Protein und/oder Enzym enthält. Geeignete Lösungen sind Lyophilisate von
Bakterien, Schimmelpilzen und/oder Hefen bzw. mit Hilfe von Bakterien, Hefen und/oder Schimmelpilzen fermentierte
Flüssigkeiten. Diese fermentierten Flüssigkeiten können mit oder ohne die Mikroorganismen eingesetzt werden, durch die sie fermentiert wurden. Zudem können die noch in der fermentierten Flüssigkeit enthaltenen Mikroorganismen vor dem In-Kontakt- Bringen der Lösung mit dem Separationsmedium lyophilisiert werden .
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die
Proteine und/oder Enzyme modifizierte Proteine und/oder Enzyme beispielsweise modifiziert durch das Hinzufügen von ein oder mehreren Histidingruppen .
Bevorzugt enthält die Flüssigkeit einen Anteil an H2O, der besonders bevorzugt bei 1 bis 99 Vol.-%, bevorzugter bei 2 bis 95 Vol.-%, weiter bevorzugt bei 5 bis 90 Vol.-%, insbesondere bei 10 bis 85 Vol.-%, bevorzugter bei 15 bis 80 Vol.-% und am meisten bevorzugt bei 20 bis 75 Vol.-% liegt. In einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die Flüssigkeit einen Anteil eines Puffers, bevorzugt eines MES-Puffers oder eines TRIS-Puffers . Weitere mögliche Puffer sind ausgewählt aus der Gruppe BIS-TRIS, PIPES, BES, MOPS, Phosphat Puffer, TES, HEPES und Tricin. Weitere mögliche Bestandteile sind Salze, wie beispielsweise NaCl . NaCl kann vorteilhaft in der Flüssigkeit eingesetzt werden um Wechselwirkungen
unspezifischer Art (z.B. elektrostatische Wechselwirkungen) zu verringern. Geeignete Konzentrationen von NaCl sind 5 bis 500 mM, bevorzugt 50 bis 450 mM, bevorzugter 100 bis 400 mM, insbesondere bevorzugt 150 bis 350 mM und am meisten bevorzugt 170 bis 320 mM, besonders bevorzugt in einem Anteil von 1 bis 99 Vol.-%, bevorzugter bei 2 bis 95 Vol.-%, weiter bevorzugt bei 5 bis 90 Vol.-%, insbesondere bei 10 bis 85 Vol.-%, bevorzugter bei 15 bis 80 Vol.-% und am meisten bevorzugt bei 20 bis 75 Vol.-%.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Lösung desweiteren einen oder mehrere Bestandteile ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natriumchlorid, Glykol,
Harnstoff .
Das Abtrennen des Separationsmediums gemäß Schritt ii) kann auf jede Art und Weise erfolgen, die dem Fachmann als für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet bekannt ist. Möglich ist beispielsweise ein Abfiltrieren des Separationsmediums .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zum Aufreinigen und/oder Isolieren von Enzymen und/oder Proteinen desweiteren den Schritt iii) In-Kontakt-Bringen des Separationsmediums gemäß
Schritt ii) mit mindestens einer Pufferlösung.
Als „Pufferlösung" wird bevorzugt eine Lösung gewählt, die die Desorption der auf dem Separationsmedium adsorbierten Proteine und/oder Enzyme fördert. Besonders bevorzugt handelt es sich um eine Pufferlösung, die Phosphat und/oder Imidazol enthält. Die Anteile liegen in bevorzugten Ausführungsformen bei beispielsweise 50 bis 1000 mM, bevorzugt 75 bis 750 mM, bevorzugter 100 bis 500 mM und am meisten bevorzugt 150 bis 250 mM Imidazol und/oder 1 bis 250 mM Phoshpat, bevorzugt 5 bis 200 mM, bevorzugter 10 bis 150 mM und am meisten bevorzugt 50 bis 100 mM. Besonders bevorzugt ist Natrium-Phosphat, das allein oder in Kombination mit Imidazol eingesetzt wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform, wird das Separationsmedium in Schritt iii) des erfindungsgemäßen
Verfahrens vor dem in-Kontakt-Bringen mit einer Pufferlösung, die die Desorption der auf dem Separationsmedium adsorbierten Proteine und/oder Enzyme fördert, mit mindestens einem
Waschpuffer in Kontakt gebracht. Bei dem Waschpuffer handelt es sich bevorzugt um einen sauren oder basischen Waschpuffer. Bevorzugte saure Waschpuffer sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acetatpuffern und Formiatpuffern, bevorzugte basische Waschpuffer sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TRIS Puffer und CAPS Puffer.
Messmethoden und Verfahren
Bacillus stearothermophilus Esterase (Bste)
Mittels rekombinanter E. coli wurde eine Bacillus
stearothermophilus Esterase (Bste) gewonnen. Bste ist am C- Terminus mit einem His-Tag versehen und hat ein
Molekulargewicht von etwa 31 kDa.
Zur Untersuchung der Bindung von Bste an die erfindungsgemäßen Materialien wurde lyophilisierter Überstand aus dem
Zellaufschluss in demineralisiertem H20 gelöst (2 mg/mL und mit dem Bindungspuffer (0,5 mL gelöstes Überstandslyophilisat und 0,5 mL Bindungspuffer) versetzt.
Beispiele und Figuren
Die nachfolgenden Beispiele und Figuren dienen der näheren Erläuterung der vorliegenden Erfindung und stellen lediglich mögliche Ausführungsformen dar. In keinster Weise wird der Umfang der vorliegenden Erfindung durch den Offenbarungsgehalt der Beispiele und Figuren beschränkt.
Es zeigt
Fig.l: die SDS-Gele der Überstände von Adsorptions-, Wasch- und Desorptionsschritt an Adsorebens 1
AD: Adsorption
W: Waschen in Adsorptionspuffer
Dl: Desorption mit 100 mM Imidazol
D2 : Desorption mit 250 mM Imidazol
D3 : Desorption mit 500 mM Imidazol
D4: Desorption mit 250 mM Imidazol, 300 mM NaCl, 50 mM Na-Phosphat, pH 8
Fig.2: einen Stufengradient in einer Stufe mit 250 mM
Imidazol .
Fig.3: SDS-PAGE der Fraktionen aus dem Chromatogramm in
Figur 2.
Fig.4 : Stufengradient in einer Stufe mit 500 mM Imidazol
Fig .5 : Stufengradient in zwei Stufen mit 250 mM Imidazol und
500 mM Imidazol
Fig .6 : Stufengradient in drei Stufen mit 100 mM Imidazol, dann 250 mM Imidazol und 500 mM Imidazol Fraktionen aus dem Chromatogramm aus Figur 4
Fraktionen aus dem Chromatogramm aus Figur 5
Fraktionen aus dem Chromatogramm aus Figur 6
Stufengradient in einer Stufe mit 250 mM Imidazol, 300 mM NaCl, 50 mM Na-Phosphat (pH 8)
Stufengradient in einer Stufe mit 500 mM Imidazol, 300 mM NaCl, 50 mM Na-Phosphat (pH 8)
Fraktionen aus dem Chromatogramm aus Figur 10
Fraktionen aus dem Chromatogramm aus Figur 11
Stufengradient in einer Stufe mit 250 mM Imidazol, 300 mM NaCl, 50 mM Na-Phosphat (pH 8) (A)
Stufengradient in einer Stufe mit 250 mM Imidazol, 300 mM NaCl, 50 mM Na-Phosphat (pH 8) (B)
Fraktionen aus dem Chromatogramm aus Figur 14
Fraktionen aus dem Chromatogramm aus Figur 15
Beispiel 1 : Beschichtung von Aluminiumoxid mit Zinkricinoleat und Zinkoleat
Die entsprechenden Mengen Zinkricinoleat (2g, 3g, 5g) wurden mit 30 ml Ethanol bei 60°C bis 70°C in einem 250ml Becherglas unter Rühren aufgelöst. Nach dem Auflösen des Zinkricinoleats wurden sofort 90g Aluminiumoxid 90 (Carl Roth, Karlsruhe) zugegeben. Je nach Füllhöhe des Becherglases musste Ethanol zugegeben werden, damit das zu belegende Substrat vollständig von der Zinkricinoleat-Ethanol-Lösung umgeben war.
Bei 60°C bis 70°C wurde so lange weitergerührt, bis der überwiegende Teil des Ethanols verdampft und das Substrat fast trocken war. Noch vorhandenes Ethanol wurde anschließend bei 75°C im Trockenschrank verdampft. Die so erhaltenen
Adsorbentien wurden zu Experimenten zur Auftrennung von
Proteinen und Enzymen benutzt.
Analog lässt sich Aluminiumoxid mit weiteren Zinkfettsäuren beschichten, wie z. B. mit Zinkoleat (z. B. Adsorbens 2 in Beispiel 3)
Beispiel 2 : Bindung von Bacillus stearothermophilus Esterase (Bste) aus Zellaufschluß an Adsorbens 1 (2 % ZnRi2 aus
Aluminiumoxid 90)
Bindung in Abhängigkeit von der Ionenstärke und dem pH-Wert
Zur Untersuchung der Bindung von Bste wurde lyophilisierter Überstand aus dem E. coli-Zellaufschluss in ddH2<0 gelöst (2 mg/mL) und zusammen mit Bindungspuffer (0,5 mL gelöstes
Lyophilisat und 0,5 mL Bindungspuffer MES oder TRIS) zu den Materialien (100 mg) pipettiert und für 1 Stunde in einem Überkopfmischer bei ca. 0,5 rpm inkubiert.
Nach Abzentrifugat ion der Materialien wurde der Überstand einer SDS-PAGE unterzogen. Die Bindung wurde an mit
Zinkricinoleat beschichteten und entsprechenden
unbeschichteten Materialien untersucht:
Folgende Bindungspuffer wurden verwendet:
Figure imgf000020_0001
Die Tabelle 1 gibt an, unter welchen Bedingungen möglichst viel Bste an die ZnRi2 belegten Materialien gebunden wurde.
Dem gegenüber gestellt sind die Bedingungen, unter welchen eine möglichst geringe Bindung von Bste an die unbelegten Materialien erfolgte. Die schraffierten Felder der Tabelle 1 kennzeichnen die die anhand der SDS-PAGE als optimal
eingeschätzten Bedingungen, unter welchen bei einer hohen Bste-Bindung an die ZnRi2-Materialien zugleich eine niedrige Bindung von Bste an die unbeschichteten Materialien (wenig unspezifische Bindung) erfolgt. Tabelle 1 : Vergleich der Bste-Bindung an Adsorbens 1 und unbeschichtetes AI2O3 bei unterschiedlichen pH-Werten und unterschiedlichen NaCl-Konzentrationen .
Figure imgf000021_0001
Im Fall von 2 % Zinkricinoleat auf Aluminiumoxid 90) wurde bei pH 7 und unter Zugabe von 500 mM NaCl bei möglichst hoher Bste-Adsorption eine möglichst geringe Adsorption der Bste an das unbeschichtete Material gefunden.
Beispiel 3 : Elution von Bacillus stearothermophilus Esterase des Adsorbens aus Beispiel 2
Zur Untersuchung der Desorption wurden unterschiedliche
Imidazolkonzentrationen (100 mM, 250 mM und 500 mM) mit pH- Werten zwischen 8 und 8,5 sowie ein IMAC-Elutionspuffer nach Sigma (HIS-Select® Elution Buffer H5413 mit 250 mM Imidazol, 300 mM NaCl und 50 mM Na-Phosphat, pH 8) verwendet. Bei Imidazol handelt es sich um die funktionelle Gruppe der
Aminosäure Histidin. Imidazol konkurriert bei der
Metallchelatchromatographie mit gebundenem Histidin um
Metallbindungsplätze. Die Adsorption erfolgte wie unter
Abschnitt vorstehend beschrieben. Im Anschluss an die
Adsorption erfolgte ein Waschschritt im Bindungspuffer, daran anschließend die Desorption. Nach jeden Schritt wurde ein Aliquot für SDS-PAGE aufbewahrt. Figur 1 zeigt die SDS-Gele der Überstände von Adsorptions-, Wasch- und
Desorptionsschritt .
Bei dem auf Aluminiumoxid basierten Material kann eine Zunahme der Desorption mit steigender Imidazolkonzentration beobachtet werden. Der IMAC-Elutionspuffer nach Sigma (250 mM Imidazol, 300 mM NaCl, 50 mM Na-Phosphat, pH 8) zeigt hier den stärksten Effekt. Bei diesem Material erfolgte keine sichtbare
Desorption von Host Cell Protein (HCP) .
Beispiel 4: Bste-Isolierung mittels präparativer
Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung der
erfindungsgemäßen Materialien aus Beispiel 1
Im Folgenden wurde die Isolierung von Bste im Säulenmodus untersucht. Das entsprechende Material wurde in eine 7,5 mm x 50 mm Omnifit-Quarzglassäule gefüllt und mit 50 mM MES-Puffer, pH 7 bzw. 50 mM MES-Puffer, pH 7 mit 500 mM NaCl bis zum
Erreichen einer geraden Basislinie (UV-Detektor, 280 nm) equilibriert (ca. 20 mL Puffer) . Nach der Equilibrierung erfolgte die Injektion der Probe. Es wurden unterschiedliche Elutionsgradienten getestet. Die Durchlauf- und
Elutionsfraktionen wurden aufgefangen und mittels SDS-PAGE untersucht . Um den Einfluss der Konzentration an Zinkricinoleat auf dem Trägermaterial auf die Aufreinigung des Enzyms unter diesen Bedingungen zu testen, wurden das Aluminiumoxid gemäß Beispiel 1 mit 2,5 undlO Gew.-% ZnRi belegt. Außerdem wurde noch wurde noch mit 10 % Zinkoleat belegtes Aluminiumoxid untersucht.
Material Adsorbens 1 (2 % Zinkricinoleat auf Aluminiumoxid 90)
Beim folgenden Versuch wurden je 500 mg des Adsorbens
211800801 eingesetzt. Die Bindung erfolgte in 50 mM MES-Puffer mit 500 mM NaCl bei pH 7. Es wurde ein Probevolumen von
1500 pL (2 mg/mL) injiziert. Die Flussrate betrug 1 mL/min. Die Elution wurde mittels Stufengradient mit 250 mM Imidazol mit 300 mM NaCl in 50 mM Na-Phosphat bei pH 8 durchgeführt.
Abbildung 2 zeigt beispielhaft das Chromatogramm eines unter den genannten Bedingungen durchgeführten FPLC-Durchlaufes . Die Fraktionen 4-6 und 13-15 wurden aufgefangen und einer SDS-PAGE unterzogen. Das Gel ist in Abbildung 3 dargestellt.
Diese ersten Versuche zeigen, dass eine präparative
chromatographische Isolierung von Bste mit diesem Material prinzipiell möglich ist.
Adsorbens 2(10 % Zinkoleat auf Aluminiumoxid 90)
Bei den folgenden Versuchen wurden je 500 mg des Adsorbens 2 eingesetzt. Die Bindung erfolgte in 50 mM MES-Puffer (pH 7) . Es wurde je ein Probevolumen von 1500 pL (2 mg/mL) injiziert. Die Flussrate betrug 1 mL/min. Es wurden unterschiedliche Stufengradienten zur Elution untersucht. Die Chromatogramme sind in Abbildung 4-6 gezeigt. Abbildung 7-9 zeigen die SDS- Gele der aufgefangenen Fraktionen. Unabhängig vom eingesetzten Stufengradient kann jeweils in der ersten Elutionsfraktion eine relativ hohe Reinheit der Bste erreicht werden. Auch dieses Material zeigt eine prinzipielle Eignung für die chromatographische Aufreinigung von Bste.
Adsorbens 3 (5 % Zinkrizinoleat auf Aluminiumoxid 90)
Bei den folgenden Versuchen wurden je 1000 mg des Adsorbens 02070940 eingesetzt. Die Bindung erfolgte in 50 mM MES-Puffer mit 500 mM NaCl (pH 7) . Es wurde je ein Probevolumen von
1000 pL (2 mg/mL) injiziert. Die Flussrate betrug 1 mL/min. Die Elution wurde mittels Stufengradient mit 250 mM Imidazol, 300 mM NaCl, 50 mM Na-Phosphat (pH 8) durchgeführt. Abbildung 10 und 11 zeigen Chromatogramme zweier FPLC-Durchläufe
(Elution mit 250 mM bzw. 500 mM Imidazol im Elutionspuffer ) . Die Fraktionen 4+5 und 9-13 bzw. 14 wurden aufgefangen und einer SDS-PAGE unterzogen. Die Gele sind in Abbildung 12 und
13 dargestellt.
Die Elutionsfraktionen weisen im Fall dieses Materials eine relativ hohe Reinheit auf. Die Belegung mit 5 % Zinkrizinoleat scheint über eine relativ hohe His-tag-spezifische
Adsorptionskapazität zu verfügen, so dass dieses Material besonders für eine Isolierung der Bste geeignet ist.
Adsorbens 4(10 % Zinkrizinoleat auf Aluminiumoxid 90)
Bei den folgenden Versuchen wurden je 1000 mg (A) bzw. 2000 mg (B) des Adsorbens 4 eingesetzt. Die Bindung erfolgte in 50 mM MES mit 500 mM NaCl (pH 7) . Es wurde je ein Probevolumen von 1000 pL (4 mg/mL) injiziert. Die Flussrate betrug 1 mL/min. Die Elution wurde mittels Stufengradient mit 250 mM Imidazol, 300 mM NaCl, 50 mM Na-Phosphat (pH 8) durchgeführt. Abbildung
14 und 15 zeigen die Chromatogramme der durchgeführten FPLC- Durchläufe. Die Fraktionen wurden aufgefangen und mittels SDS- PAGE untersucht. Die SDS-Gele sind in Abbildungen 16 und 17 dargestellt .
Auch dieses Material weist eine prinzipielle Eignung zur Bste- Aufreinigung auf. Anhand der SDS-PAGE betrachtet scheint die Verwendung des Aluminuimoxid basierten Materials mit 5 % ZnRi2 allerdings zu einer höherern Reinheit der eluierten Bste- Fraktionen zu führen. Eine höhere Ligandendichte kann
sterische Behinderungen auf der Oberfläche zur Folge zu haben, was sich negativ auf die spezifische Adsorptionskapazität auswirken kann.

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Herstellung eines Separationsmediums umfassend die Schritte a) In-Kontakt-Bringen mindestens eines Metallsalzes
einer Fettsäure mit einem organischen Lösungsmittel; b) In-Kontakt-Bringen des Gemischs gemäß Schritt a) mit mindestens einem Trägermaterial; c) Abtrennen des Trägermaterials.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem
mindestens einen Metallsalz um ein Zink oder Eisensalz einer Fettsäure handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei es sich es sich bei dem organischen Lösungsmittel um Ethanol, Aceton, Cyclohexanon, iso-Octan, Cyclohepanon oder deren
Mischungen handelt.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Trägermaterial ausgewählt ist aus anorganischen
Metalloxiden, Kieselgel, Cellulose, Dextran, und deren Mischungen .
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Abtrennen gemäß Schritt c) durch Verdampfen des
Lösungsmittels erfolgt.
Separationsmedium umfassend ein Trägermaterial auf das mindestens eine Metallfettsäure aufgebracht ist.
7. Separationsmedium gemäß Anspruch 6, wobei es sich bei der Metallfettsäure um Zinkfettsäure handelt.
8. Verwendung eines Separationsmediums wie in einem der
Ansprüche 6 oder 7 definiert zum Auftrennen und/oder
Isolieren von Enzymen und/oder Proteinen.
9. Verfahren zum Auftrennen und/oder Isolieren von Enzymen und/oder Proteinen umfassend die Schritte i) In-Kontakt-Bringen einer Lösung enthaltend mindestens ein Protein und/oder Enzym mit einem
Separationsmedium wie in einem der Ansprüche 6 oder 7 definiert ; ii) Abtrennen des Separationsmediums ;
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Lösung mindestens einen weiteren Bestandteil ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natriumchlorid, Harnstoff und Glykol
enthält .
11. Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, weiter umfassend den Schritt iii) In-Kontakt-Bringen des Separationsmediums gemäß
Schritt ii) mit einer Pufferlösung.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Pufferlösung
mindestens einen Bestandteil ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Imidazol, Phosphat, NaCl enthält.
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