WO2012148024A1 - Primer and probe for detecting tamiflu resistance in new-strain influenza a/h1n1, and a diagnostic method using same - Google Patents

Primer and probe for detecting tamiflu resistance in new-strain influenza a/h1n1, and a diagnostic method using same Download PDF

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WO2012148024A1
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WO
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tamiflu
influenza
single nucleotide
nucleotide polymorphism
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PCT/KR2011/003240
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김동식
변상진
이충현
김미란
김성열
박한오
Original Assignee
㈜바이오니아
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to a primer, a probe for detecting Tamiflu resistance of H1N1 influenza A, and a diagnostic method using the same.
  • Swine Influenza is a respiratory disease called swine flu or swine influenza.
  • the World Health Organization (WHO) has replaced swine flu (H1N1) as “Influenza A (H1N1)” in 2009. Named as of April 30.
  • This new swine influenza A virus was first discovered in April 2009, and can cause infection in humans, pigs, and birds.
  • the path of infection is mainly respiratory infections and contact infections through coughing or sneezing of infected patients. All respiratory secretions, body fluids (including diarrhea and feces) have been reported to be potentially infectious.
  • the virus breaks down sialic acid, which is external to the cell, using neuraminidase made by the virus in order to create a new virus in the cell after infection and spread to other cells. It is necessary.
  • Tamiflu-resistant avian influenza viruses are known to occur through three genetic variations (Arg292Lys, Asn294Ser, His274Tyr) that normally alter the amino acids of Tamiflu's receptor protein to which Tamiflu binds.
  • the 274th amino acid the most highly expressed variant of the Tamiflu-resistant avian influenza virus, is a variant in which Thoflu's hydrophobic residues do not bind to Tamiflu receptors. If it is. It is a virus found in the United States and Europe in the 10 to 25% probability of the 2007-2008 season, increasing the risk of future mutations for swine flu. The emergence of these Tamiflu-resistant viruses therefore provides a justification for humans to continue developing new viral therapies.
  • SNPs for detecting single nucleotide polymorphism which are widely used in molecular genetics, include sequencing, PCR-SSCP (Polymerase chain reaction-Single stranded conformation polymorphism), allele specific hybridization, and ollie. There are oligo-ligation, mini-sequencing and enzymatic cleavage. A method using a DNA chip has also been introduced, which is in principle no different from an allele specific hybridization, but differentiated from a stationary phase to which an oligonucleotide probe is attached.
  • the sequencing method includes the Macsam-Gilbert method and the Sanger method, but the latter method is mainly used.
  • This method is not only to investigate the genetic variation of a specific position, but to identify the nucleotide sequence of all or a part of the gene, but if the nucleotide sequence is revealed, it can be used for SNP scoring because it can also identify the genetic variation of a specific position. have.
  • it is inefficient in that it reads not only the mutation of the SNP to be investigated but also reads the nucleotide sequence of the surrounding which does not need to be investigated.
  • PCR-SSCP (Orita, M. et.al, Genomics , 1989, 5: 8874-8879) amplifies the sequences containing the SNPs to be analyzed by PCR, separates them into their respective chains, and then polyacrylamide gels. Perform electrophoresis at. Since the secondary structure of the DNA chain is changed by one base difference, the base variation is examined according to the electrophoretic migration speed caused by this difference.
  • Allele specific hybridization is a method of hybridizing sample DNA labeled with a radioisotope to a probe attached to a nylon filter or the like, and examining whether or not there is a base mutation by controlling conditions such as temperature and hybridization.
  • Real-Time Polymerase Chain Reaction is a type of polymerase chain reaction method that checks amplification according to the intensity of a fluorescence signal using a primer and a probe.
  • the applicant also has a Ct value obtained from a reaction product obtained by performing a real-time polymerase chain reaction using an alleleic specific primer and a probe, more specifically, a Ct value ⁇ ⁇ 2, heterozygotes, and Ct values> ⁇ 2, in Korean Patent No. 2011-0004724, which identifies alleles of the target gene with the co-zygote, “A single base polymorphism of the target gene is determined by PCR. Method ”.
  • the ASP (Allelic Specific Primer) method used in the present invention is a method of amplifying a site including a single base polymorphism using a polymerase chain reaction device and comparing the degree of amplification to determine a single base polymorphism.
  • the present inventors apply a method for determining a single nucleotide polymorphism of a target gene through PCR and a composition for a hot start PCR including blocking oligonucleotides.
  • the present invention aims to provide an efficient and accurate detection of a single nucleotide polymorphism site of a living organism having ribonucleic acid, which makes up for the shortcomings of the method for analyzing nucleotide polymorphism.
  • the present invention provides a single nucleotide polymorphism discriminative primer set capable of detecting a single nucleotide polymorphism of the Tamiflu-resistant C823T position of swine influenza A H1N1.
  • the present invention also provides a single nucleotide polymorphism discriminative probe capable of detecting a single nucleotide polymorphism at the Tamiflu-resistant C823T position of swine influenza A H1N1.
  • the present invention comprises a primer set for determining the single nucleotide polymorphism of the Tamiflu-resistant C823T position of the swine flu type A H1N1, a single nucleotide polymorphism probe of the Tamiflu-resistant C823T position of the H1N1 influenza A type H1N1, or a mixed construct thereof
  • a Tamiflu resistant C823T single nucleotide polymorphism discrimination kit of influenza A type H1N1 Provided are a Tamiflu resistant C823T single nucleotide polymorphism discrimination kit of influenza A type H1N1.
  • the present invention also provides a method for determining swine influenza resistant to Tamiflu by using the Tamiflu resistant C823T single nucleotide polymorphism discrimination kit of the swine influenza A type H1N1.
  • primer refers to a single stranded oligonucleotide sequence that is complementary to the nucleic acid strand to be copied and may serve as a starting point for the synthesis of the primer extension product.
  • the length and sequence of the primer should allow to start the synthesis of the extension product.
  • the specific length and sequence of the primer will depend on the primer utilization conditions such as temperature and ionic strength as well as the complexity of the DNA or RNA target required.
  • each primer in order to detect C823T single nucleotide polymorphism (SNP), each primer is a specific polynucleotide or a complementary polynucleotide thereof which detects a sensitive and resistant virus, respectively, and has a length of 10 It may consist of from 30 nucleotides.
  • the polynucleotide is a polymorphic sequence.
  • a polymorphic sequence refers to a sequence comprising a polymorphic site representing a single nucleotide polymorphism in a nucleotide sequence.
  • a polymorphic site refers to a site where a single nucleotide polymorphism occurs in the polymorphic sequence.
  • the polynucleotide can be DNA or RNA.
  • the primer is 630 to the influenza virus A / Korea / 01/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: GQ132185) and A / Denmark / 528/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: CY043352) gene
  • H1N1 NCBI GenBank No: GQ132185
  • H1N1 NCBI GenBank No: CY043352
  • a polynucleotide consisting of a nucleotide within a 1027th base or a complementary polynucleotide thereof and more specifically, a primer set consisting of a polynucleotide consisting of 10 or more consecutive DNA sequences including the 823th base or a complementary nucleotide thereof. do.
  • the primer set includes a primer set of all combinations consisting of forward and reverse primers for recognizing a target gene sequence, but preferably, the primer set provides an analysis result having specificity and sensitivity. May be made by mixing two or more primers selected from the primers set forth in SEQ ID NOs: 1 to 6, 9, and 10.
  • the primer set is SEQ ID NO: 1, 2, 9 and 10; SEQ ID NO: 3, 4, 9 and 10; characterized in that at least one kind.
  • SEQ ID NO: 9 and 10 is a blocking oligonucleotide having a 3 'terminal hydroxyl group is blocked and has a nucleotide sequence complementary to the primer, more specifically, the blocking oligonucleotide is a hydroxyl group of 3' terminal is substituted with a substituent other than the hydroxyl group Substituted, preferably substituted with amines, complementary to susceptibility and resistant viral sequences, and consist of polynucleotides designed with a low Tm value of 5 to 10 ° C.
  • the primer set of the present invention includes a blocking oligonucleotide, thereby suppressing a primer band dimer formation at a low temperature or a smeared band of a PCR amplification product due to a nonspecific reaction, thereby obtaining a more accurate PCR result.
  • the blocking oligonucleotide may specifically bind to any one of a forward primer and a reverse primer with respect to a primer set having a sequence complementary thereto, or may specifically bind to both the forward and reverse primers.
  • the present invention provides C823T single nucleotide polymorphism (SNP) in influenza virus A / Korea / 01/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: GQ132185) and A / Denmark / 528/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: CY043352) gene.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the probe is at least one selected from the probes set forth in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8.
  • probe refers to nucleic acid fragments such as RNA or DNA corresponding to short bases to hundreds of bases that can achieve specific binding with mRNA, and are labeled to confirm the presence or absence of specific mRNAs.
  • Probes may be prepared in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes and the like.
  • a fluorescent labeled probe can be used. More specifically, the fluorescent material is coupled to the 5 'end, and the quencher may be coupled to the 3' end.
  • the present invention includes a primer set for determining single nucleotide polymorphism at the Tamiflu-resistant C823T position of the swine flu type A H1N1, a single nucleotide polymorphism probe at the Tamiflu-resistant C823T position of the H1N1 influenza A type H1N1, or a mixed construct thereof.
  • a Tamiflu resistant C823T single nucleotide polymorphism discriminative kit of type H1N1 is provided.
  • the mixed construct is characterized in that SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10.
  • the kit may also include instructions.
  • the guide is a printed document that explains how to use the kit, such as how to prepare reverse transcription buffer and PCR buffer, and the reaction conditions presented.
  • the instructions include brochures in the form of pamphlets or leaflets, labels affixed to the kit, and instructions on the surface of the package containing the kit.
  • the guide includes information that is disclosed or provided through electronic media such as the Internet.
  • the present invention is a.
  • step 2 2) comparing the presence or absence of the polymorphic site detected in step 1);
  • It provides a method for determining the influenza, including a Tamiflu resistant.
  • sample includes samples such as blood, serum, saliva, or sputum, in which the HA and / or influenza A gene expression levels of swine influenza A H1N1 differ due to influenza virus infection, It is not limited to this.
  • the mixed construct is characterized in that SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10.
  • a single nucleotide polymorphism discrimination test was performed on a swine flu A (HN1) positive sample using primers and probes according to the present invention.
  • Virus RNA was extracted with Accuprep Viral RNA Extration kit ( Bionia , Korea) and subjected to real-time reverse transcription polymerase chain reaction using Exicycler TM Quantitative Thermal Block.
  • Accuprep Viral RNA Extration kit Bionia , Korea
  • Exicycler TM Quantitative Thermal Block Exicycler TM Quantitative Thermal Block.
  • Tamiflu-resistant C823T single nucleotide polymorphism discriminating primer sets and probes of the H1N1 influenza A type according to the present invention can not only accurately and efficiently analyze genetic variation of living organisms with ribonucleic acid but also Tamiflu resistance of the H1N1 influenza A type H1N1.
  • the C823T single nucleotide polymorphism site can be efficiently and accurately detected in a short time, greatly contributing to the development of new viral therapeutics such as Tamiflu-resistant virus.
  • Figure 1 shows the nucleotide sequence of influenza virus A / Korea / 01/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: GQ132185) according to the present invention
  • Figure 2 shows the nucleotide sequence of influenza virus A / Denmark / 528/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: CY043352) according to the present invention
  • Figure 3 shows the results (graph and detection sensitivity) of the real-time reverse transcription polymerase chain reaction for the primer set (10p) described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 5 according to the present invention
  • Figure 4 shows the results of the real-time reverse transcription polymerase chain reaction for the primer set (15p) described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 5 according to the present invention (graph and detection sensitivity),
  • Figure 5 shows the results (graph and detection sensitivity) of the real-time reverse transcription polymerase chain reaction for the primer set (10p) described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 6 according to the present invention
  • Figure 7 shows the results (graph and detection sensitivity) of the real-time reverse transcription polymerase chain reaction for the primer set (10p) described in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5 according to the present invention
  • FIG. 10 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction for primer sets (15p) described in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 6 according to the present invention.
  • FIG. 11 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction for primer sets (10p) described in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5 according to the present invention
  • FIG. 13 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction for primer sets (10p) described in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 6 according to the present invention.
  • 21 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction of the primer set of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6 and the probe of SEQ ID NO: 7 according to the present invention
  • FIG. 23 is a graph of a single nucleotide polymorphism sensitive RNA standard template of Swine Flu for Example 3 of the present invention using Exicycler TM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block,
  • FIG. 24 shows a graph of the standard template for single nucleotide polymorphism resistance of swine flu against Example 3 of the present invention using Exicycler TM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block,
  • FIG. 25 shows standard curves of a standard template graph of susceptibility / tolerance of single nucleotide polymorphism of Swine Flu for Example 3 of the present invention using Exicycler TM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block
  • FIG. 26 shows the detection sensitivity ( ⁇ Ct) of real-time reverse transcription polymerase chain reaction of the susceptible standard template 10 5 of FIG. 23 using Exicycler TM 96 Real-Time Quantitative Thermal block.
  • FIG. 27 shows the detection sensitivity ( ⁇ Ct) of real-time reverse transcription polymerase chain reaction for the resistant standard template 10 5 of FIG. 24 using Exicycler TM 96 Real-Time Quantitative Thermal block.
  • FIG. 28 shows the results of detection of resistant single nucleotide polymorphism of a new influenza A (HN1) negative sample for Example 4 of the present invention using an Exicycler TM 96 Real-Time Quantitative Thermal block.
  • FIG. 29 shows the results of detection of resistant single nucleotide polymorphism of Swine Influenza A (HN1) positive samples for Example 4 of the present invention using Exicycler TM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block.
  • H1N1 susceptible influenza A
  • H1N1 susceptible influenza A
  • NCBI GenBank No: GQ132185 SEQ ID NO: 11
  • a / Denmark / 528/2009 H1N1
  • resistant to influenza A H1N1
  • NCBI GenBank No: CY043352 SEQ ID NO: 12
  • the reaction solution was inoculated into LB plates containing ampicillin, IPTG, and X-Gal, followed by incubation at 37 ° C for 16 hours.
  • the cultured white colonies were taken, cultured in LB liquid medium for 16 hours, centrifuged, the supernatant was discarded, and plasmid DNA was extracted from the pellets using Accuprep plasmid DNA prep kit ( Bionia ).
  • the plasmid DNA was measured using a UV spectrometer (manufactured by Shimazu, Japan) to measure the concentration and purity, and confirmed that the purity was between 1.8 and 2.0.
  • the plasmid DNA was transcribed into RNA using the MAXIscipt In vitro Transcription Kit (Ambion, USA). .
  • RNA copy number was calculated by the following formula.
  • H1N1 A / Korea / 01/2009 (H1N1), the susceptible influenza A (H1N1) of SEQ ID NO: 11 (NCBI GenBank No: GQ132185, and A / Denmark / 528/2009 (H1N1), the resistant influenza A (H1N1) of SEQ ID NO: 12
  • primers for cDNA synthesis were randomly selected such that the primers had a length of 24 to 25mer and a Tm value of 55 ° C to 60 ° C as reverse primers (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6)
  • the blocking oligonucleotide to prevent the action of a single nucleotide polymorphism in the cDNA synthesis step was designed to be 17mer, Tm value is 45 °C, the cDNA synthesis Tm (SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10).
  • Specific susceptible / resistant forward primers (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4) for detecting single nucleotide polymorphisms using cDNA between 23-24mer in length and 55-60 ° C in Tm
  • the forward nucleotide sequence was selected so that the single base polymorphic portion was located at the 3 ′ end, and the probe (SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8) length was a Tm 60 to 65 ° C. probe between 24 and 26mer. Tm values were checked using the Primer3Plus program.
  • the primers of Table 1 were combined into a set of Table 2 below to perform real-time reverse transcription polymerase chain reaction using Exicycler TM Quantitative Thermal Block (Bionia, Korea).
  • the blocking oligonucleotide AccPower GreenStar TM qPCR Premix the template RNA used in DW 45 ⁇ l here using (( ⁇ ) Bioneer Korea) (scale of 10 5) was diluted in the above Example 1
  • the final total dose was 50 ⁇ l and the experiment was performed in the combination as shown in Table 2 above.
  • primer set 4 could be selected from the results of FIGS. 3 to 18.
  • Probe with good PCR efficiency was selected using the selected primer set 4.
  • the probe was used by custom fabrication (Bionia Co., Ltd.) to attach FHQ fluorescence at the 5 ′ region and BHQ1 at the 3 ′ region.
  • the probes were prepared in the combinations shown in Table 3 below, and 2 ⁇ l of 10X RT Buffer, Taq polymerase 1U, MMLV RTase 350 U (above Bionic), dNTP 20 mM, DTT 50 mM, RNasin 15U, and DEPC (Diethylpyrocarbonate) DW, respectively. After mixing and mixing, the mixture was made to 45 ⁇ l per well, and the resultant was dispensed into a 96-well plate and reacted at 45 ° C. for 15 minutes to synthesize cDNA. 45 cycles were reacted for 5 seconds.
  • RNA prepared in Example 1 was used as a template, and real-time reverse transcription polymerase chain reaction was performed using the primers and probes selected in Example 2 and Exicycler TM Quantitative Thermal Block (Bionia, Korea).
  • the number of copies was calculated according to the method of Example 1, as a result template RNA was able to detect a minimum of 10 copies, to prepare a standard graph of the standard template real-time reverse transcription polymerase chain reaction
  • the slope was -3.01 to -3.15, and the linearity R 2 value was 0.997 to 0.999.
  • the R 2 is a correlation coefficient indicating the linearity of the graph when the standard graph of the real-time polymerase chain reaction is drawn, and the closer to 1 (the closer to the straight line), the PCR was properly performed.
  • Example 2 Using the primers and probes prepared in Example 2, a single nucleotide polymorphism discrimination test was performed on Swine Flu A (HN1) positive specimens (provided by Chungnam National University Hospital). Virus RNA was extracted with an Accuprep Viral RNA Extration kit ( Bionia , Korea) and subjected to real-time reverse transcription polymerase chain reaction under the same conditions as in Example 2 using Exicycler TM Quantitative Thermal Block. This is to confirm whether the same result is obtained when the primer and probe of the present invention are applied to the actual sample as well as the standard template of Example 3.
  • influenza A virus Inf A
  • influenza B virus Inf B
  • avian influenza virus AIV
  • HCV hepatitis C virus
  • Noro RNA
  • EV virus EV virus
  • HTLV 1 virus HTLV 1 virus
  • the Tamiflu-resistant C823T single nucleotide polymorphism discriminating primer set and probe of the H1N1 influenza A type H1N1 can accurately and efficiently analyze the genetic variation of a living organism having ribonucleic acid, as well as the H1N1 influenza A type.
  • the Tamiflu-resistant C823T single nucleotide polymorphism site of H1N1 can be efficiently and accurately detected in a short time, greatly contributing to the development of new viral therapeutics such as Tamiflu-resistant virus.
  • SEQ ID NO: 1 is a nucleotide sequence of primer SIV_M_wild forward primer 1 for detecting single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of H1N1 influenza A according to the present invention.
  • SEQ ID NO: 2 is a nucleotide sequence of primer SIV_M_mutant forward primer 1 for detecting single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of H1N1 influenza A according to the present invention.
  • SEQ ID NO: 3 is a nucleotide sequence of primer SIV_M_wild forward primer 2 for detecting a single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of the new influenza A type H1N1 according to the present invention.
  • SEQ ID NO: 4 is a nucleotide sequence of primer SIV_M_mutant forward primer 2 for detecting single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of H1N1 influenza A according to the present invention.
  • SEQ ID NO: 5 is a nucleotide sequence of a primer SIV reverse primer 1 for detecting a single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of the H1N1 influenza A according to the present invention.
  • SEQ ID NO: 6 is a nucleotide sequence of primer SIV reverse primer 2 for detecting a single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of the new influenza A type H1N1 according to the present invention.
  • SEQ ID NO: 7 is a nucleotide sequence of the probe SIV probe 1 for detecting a single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of the new influenza A type H1N1 according to the present invention.
  • SEQ ID NO: 8 is a nucleotide sequence of the probe SIV probe 2 for detecting a single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of the new influenza A type H1N1 according to the present invention.
  • SEQ ID NO: 9 is a nucleotide sequence of a primer wild blocking primer for detecting a single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of the new influenza A type H1N1 according to the present invention.
  • SEQ ID NO: 10 is a nucleotide sequence of a primer mutant blocking primer for detecting a single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of the new influenza A type H1N1 according to the present invention.
  • SEQ ID NO: 11 is a nucleotide sequence of influenza virus A / Korea / 01/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: GQ132185) according to the present invention.
  • SEQ ID NO: 12 is a nucleotide sequence of influenza virus A / Denmark / 528/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: CY043352) according to the present invention.

Abstract

The present invention relates to a primer and a probe for detecting Tamiflu resistance in new-strain influenza A/H1N1, and to a diagnostic method using same. A Tamiflu resistant C823T single nucleotide polymorphism discriminating primer set and probe for new-strain influenza A/H1N1 according to the present invention make a substantial contribution to the development of new antiviral drugs for Tamiflu resistant viruses and the like, since not only do they make it possible to accurately and efficiently analyse genetic variation in forms of life which have ribonucleic acid but they also make it possible to efficiently and accurately detect the Tamiflu resistant C823T single nucleotide polymorphism site in new-strain influenza A/H1N1 within a short time.

Description

신종 인플루엔자 Α형 Η１Ｎ１의 타미플루 내성 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 진단 방법Primer, probe for detecting Tamiflu resistance of swine flu type Η1N1, and diagnostic method using the same
본 발명은 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a primer, a probe for detecting Tamiflu resistance of H1N1 influenza A, and a diagnostic method using the same.
신종 돼지 인플루엔자 A(H1N1)(swine Influenza)는 ‘돼지 독감’ 또는 ‘돼지 인플루엔자’로 불리는 호흡기 질환으로 세계보건기구(WHO)에서는 신종 인플루엔자 A(H1N1)를 “Influenza A(H1N1)”로 2009년 4월 30일 기준으로 명명하였다. 이러한 신종 돼지 인플루엔자 A 바이러스는 2009년 4월 처음 발견되었으며, 사람, 돼지, 조류에서 감염을 일으킬 수 있으며, 감염 경로는, 주로 감염된 환자의 기침이나 재채기를 통한 호흡기 감염과 접촉 감염이 있다. 모든 호흡기 분비물, 체액,(설사, 대변 포함)이 잠재적으로 감염성을 가지는 것으로 보고되었다.Swine Influenza (Swine Influenza) is a respiratory disease called swine flu or swine influenza. The World Health Organization (WHO) has replaced swine flu (H1N1) as “Influenza A (H1N1)” in 2009. Named as of April 30. This new swine influenza A virus was first discovered in April 2009, and can cause infection in humans, pigs, and birds. The path of infection is mainly respiratory infections and contact infections through coughing or sneezing of infected patients. All respiratory secretions, body fluids (including diarrhea and feces) have been reported to be potentially infectious.
현재 조류 및 돼지 인플루엔자, 신종 인플루엔자의 유일한 치료제는 바이러스 기원의 뉴라미니데이즈에 선택적인 저해물질로 개발된 경구용 치료제인 타미플루(oseltamivir phosphate)와 흡입형인 리렌자(zanamivir) 등이다. 경구용 치료제로서 많이 사용하고 있는 타미플루의 부작용으로는 오심, 구토, 신경계나 정신계의 이상이 보고되었으며, 일본의 경우 타미플루를 승인 후 확인된 소아환자의 사망예가 15건이 될 정도로 부작용을 갖고 있다. 또한, 경구용 치료제로 사용되고 있는 타미플루에 대한 내성 바이러스가 발병할 경우를 대비하여야 한다. 최근에 이미 신종 인플루엔자의 확산에 치명적인 타미플루에 대한 내성 바이러스의 출현이 보고되고 있으며, 타미플루 내성 바이러스의 인간 대 인간 전염조차도 발견되고 있는 실정이다. 따라서 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종 인플루엔자에 대한 바이러스 치료제의 개발은 인간의 보건안전에 필수적인 사항이며, 특히 대유행을 앞두고 있는 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루와의 전쟁에 있어서 더욱 필요하다.Currently, the only treatments for avian and swine influenza and swine influenza include orltamivir phosphate, an oral therapeutic agent developed as a selective inhibitor of neuraminidase of viral origin, and inhalable zanamivir. Side effects of Tamiflu, which is widely used as an oral treatment, have been reported such as nausea, vomiting, nervous or psychological problems, and in Japan, there are 15 cases of death in pediatric patients confirmed after Tamiflu approval. In addition, it should be prepared for the development of resistant virus against Tamiflu, which is used as an oral treatment. Recently, the emergence of Tamiflu-resistant virus, which is fatal to the spread of swine flu, has been reported, and even human-to-human transmission of Tamiflu-resistant virus has been found. Therefore, the development of viral treatments for avian and swine flu and swine flu is essential for human health and safety, especially in the war against pandemic avian and swine flu and swine flu.
바이러스의 감염 및 증식과정을 살펴보면 바이러스는 세포에 감염 후 세포내에서 새로운 바이러스를 만들고 다른 세포로 전파되기 위하여 세포 외부에 존재하는 시알릭산(siliac acid)을 바이러스가 만든 뉴라미니데이즈를 이용하여 절단하는 것이 필요하다.In the process of infection and proliferation of the virus, the virus breaks down sialic acid, which is external to the cell, using neuraminidase made by the virus in order to create a new virus in the cell after infection and spread to other cells. It is necessary.
타미플루 내성 조류 인플루엔자 바이러스는 보통 타미플루가 결합하는 타미플루의 수용체 단백질의 아미노산을 변화시키는 3개의 유전적 변이(Arg292Lys, Asn294Ser, His274Tyr)를 통해 발생하는 것으로 알려지고 있다. 3곳의 유전적 변이 중 타미플루 내성 조류 인플루엔자 바이러스의 변종으로 가장 많이 발현하는 274번째의 아미노산이 His가 Tyr으로 변화한 바이러스의 경우는 타미플루의 소수성 잔기(hydrophobic residue)가 타미플루 수용체에 결합하지 못하게 변이된 경우이다. 이는 미국과 유럽에서 2007 내지 2008년 시즌에 10 내지 25% 확률로 발견된 바이러스로서, 향후의 신종 인플루엔자에 대한 변이가능성에 대한 위험도를 증가시키고 있다. 따라서 이들 타미플루 내성 바이러스의 등장은 인간이 새로운 바이러스 치료제를 지속적으로 개발하여야 하는 당위성을 제공하고 있다.Tamiflu-resistant avian influenza viruses are known to occur through three genetic variations (Arg292Lys, Asn294Ser, His274Tyr) that normally alter the amino acids of Tamiflu's receptor protein to which Tamiflu binds. Of the three genetic variants, the 274th amino acid, the most highly expressed variant of the Tamiflu-resistant avian influenza virus, is a variant in which Thoflu's hydrophobic residues do not bind to Tamiflu receptors. If it is. It is a virus found in the United States and Europe in the 10 to 25% probability of the 2007-2008 season, increasing the risk of future mutations for swine flu. The emergence of these Tamiflu-resistant viruses therefore provides a justification for humans to continue developing new viral therapies.
한편, 분자 유전학에서 많이 사용되고 있는 단일 염기 다형성을 검출하는 SNP스코링 방법으로는 염기서열 분석법, PCR-SSCP(Polymerase chain reaction -Single stranded conformation polymorphism), 대립형질 특이적 혼성화(allele specific hybridization), 올리고리게이션(oligo-ligation)법, 미니-시퀀싱 (mini-sequencing) 그리고 효소 절단법에 의한 것들이 있다. DNA칩을 이용한 방법도 소개되고 있는데 원리적으로 대립형질 특이적 혼성화와 다르지 않고, 다만 올리고뉴클레오티드 프로브 등을 부착하는 고정상에 차별을 둔 것이다.On the other hand, SNPs for detecting single nucleotide polymorphism, which are widely used in molecular genetics, include sequencing, PCR-SSCP (Polymerase chain reaction-Single stranded conformation polymorphism), allele specific hybridization, and ollie. There are oligo-ligation, mini-sequencing and enzymatic cleavage. A method using a DNA chip has also been introduced, which is in principle no different from an allele specific hybridization, but differentiated from a stationary phase to which an oligonucleotide probe is attached.
염기서열 분석법은 맥삼-길버트법과 생거법이 있으나 현재는 후자의 방법이 주로 사용되고 있다. 이 방법은 특정 위치의 유전변이 여부만을 조사하기 위한 방법이라기보다는 유전자 전체 또는 일부 부위의 염기서열을 밝히기 위한 방법이지만, 염기서열을 밝히면 특정 위치의 유전변이 여부도 확인할 수 있으므로 SNP스코링에 사용될 수 있다. 그러나, 조사하고자 하는 SNP의 변이만을 확인하는 것이 아니라 굳이 조사하지 않아도 되는 주변의 염기서열을 함께 읽는다는 면에서 비효율적이다.The sequencing method includes the Macsam-Gilbert method and the Sanger method, but the latter method is mainly used. This method is not only to investigate the genetic variation of a specific position, but to identify the nucleotide sequence of all or a part of the gene, but if the nucleotide sequence is revealed, it can be used for SNP scoring because it can also identify the genetic variation of a specific position. have. However, it is inefficient in that it reads not only the mutation of the SNP to be investigated but also reads the nucleotide sequence of the surrounding which does not need to be investigated.
PCR-SSCP(Orita, M. et.al, Genomics, 1989, 5:8874-8879)는 PCR로 분석하고자 하는 SNP를 포함하는 서열을 증폭한 후, 각각의 체인으로 분리시킨 다음, 폴리 아크릴 아마이드 젤에서 전기영동을 수행한다. 하나의 염기 차이에 의하여 DNA 체인의 2차 구조가 달라지므로 이 차이에 기인한 전기영동 이동속도 차이에 따라 염기변이 여부를 조사한다.PCR-SSCP (Orita, M. et.al, Genomics , 1989, 5: 8874-8879) amplifies the sequences containing the SNPs to be analyzed by PCR, separates them into their respective chains, and then polyacrylamide gels. Perform electrophoresis at. Since the secondary structure of the DNA chain is changed by one base difference, the base variation is examined according to the electrophoretic migration speed caused by this difference.
대립형질 특이적 혼성화는 나일론 필터 등에 부착된 프로브에 방사선동위원소 등으로 표지된 샘플 DNA를 혼성화하되, 온도 등 혼성화의 조건을 조절함으로써 염기변이의 여부를 조사하는 방법이다. Allele specific hybridization is a method of hybridizing sample DNA labeled with a radioisotope to a probe attached to a nylon filter or the like, and examining whether or not there is a base mutation by controlling conditions such as temperature and hybridization.
실시간 유전자 분석법(Real-Time Polymerase Chain Reaction)은 중합효소연쇄반응법의 일종으로 프라이머(primer) 및 프로브(Probe)를 이용하여 형광신호의 세기에 따라 증폭 여부를 확인하는 방법이다.Real-Time Polymerase Chain Reaction is a type of polymerase chain reaction method that checks amplification according to the intensity of a fluorescence signal using a primer and a probe.
최근, 본 출원인 역시 타겟 유전자를 대립형질 특이적 프라이머(alleleic specific primer)와 프로브를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하여 얻어진 반응산물로부터 얻어진 Ct값을 통해, 보다 상세하게는 Ct값이 ≤±2인 경우에는 이형접합체, Ct값이 >±2인 경우에는 동협접합체로 타겟 유전자의 대립형질을 판별할 수 있는 대한민국 특허 제 2011-0004724호에서 “PCR을 통해서 타겟 유전자의 단일염기 다형성을 판별하는 방법”을 출원한바 있다. 상기 발명에서 사용한 ASP(Allelic Specific Primer) 방법은 중합효소연쇄반응장치를 이용하여 단일 염기 다형성을 포함하는 부위를 증폭하여 그 증폭정도를 비교하여 단일 염기 다형성을 판별하는 방법이다.Recently, the applicant also has a Ct value obtained from a reaction product obtained by performing a real-time polymerase chain reaction using an alleleic specific primer and a probe, more specifically, a Ct value ≤ ± 2, heterozygotes, and Ct values> ± 2, in Korean Patent No. 2011-0004724, which identifies alleles of the target gene with the co-zygote, “A single base polymorphism of the target gene is determined by PCR. Method ”. The ASP (Allelic Specific Primer) method used in the present invention is a method of amplifying a site including a single base polymorphism using a polymerase chain reaction device and comparing the degree of amplification to determine a single base polymorphism.
또한, 본 출원인 통상의 PCR용 조성물에 3’ 말단이 블로킹되고 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 소정 농도의 블로킹 올리고뉴클레오티드를 추가로 첨가하여 중합효소 연쇄반응을 수행함에 있어서 프라이머-주형 핵산 결합의 멜팅(melting) 온도 보다 프라이머-블로킹올리고뉴클레오티드 결합이 다소 낮은 멜팅 온도를 가지고 있어 프라이머의 어닐링 온도 이전에 블로킹올리고뉴클레오티드가 해리되어 버리므로 낮은 온도에서의 프라이머-다이머 형성이나 비특이적인 반응에 의한 PCR 증폭 산물의 끌림 현상(Smeared band) 등을 억제시켜 보다 정확한 PCR 결과물을 얻을 수 있는 대한민국 특허 제 2011-0017226호에서 “블로킹 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핫스타트 PCR용 조성물”을 출원한바 있다.In addition, Melting of primer-template nucleic acid binding in the polymerase chain reaction by additionally adding a blocking oligonucleotide of a predetermined concentration having a base sequence complementary to the primer and blocking the 3 'terminal to the conventional PCR composition PCR-amplification products by primer-dimer formation or non-specific reactions at low temperatures because primer-blocking oligonucleotide bonds have a lower melting temperature than the melting temperature and the blocking oligonucleotides dissociate before the annealing temperature of the primer In the Republic of Korea Patent No. 2011-0017226, which can obtain a more accurate PCR results by suppressing the snagging band (Smeared band) and the like has applied for a "composition for a hot start PCR comprising a blocking oligonucleotide".
이에, 본 발명자들은 바이오니아에서 출원한 ‘PCR을 통해서 타겟 유전자의 단일염기 다형성을 판별하는 방법’ 및 ‘블로킹 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핫스타트 PCR용 조성물’을 적용하여, 기존 2단계에 걸쳐 리보핵산의 단일 염기다형성을 분석하는 방법의 단점을 보완한 리보핵산을 가진 생명체의 단일 염기다형성 부위를 빠른 시간 내에 효율적이고 정확하게 검출할 수 있는 제공하고자 한다.Accordingly, the present inventors apply a method for determining a single nucleotide polymorphism of a target gene through PCR and a composition for a hot start PCR including blocking oligonucleotides. The present invention aims to provide an efficient and accurate detection of a single nucleotide polymorphism site of a living organism having ribonucleic acid, which makes up for the shortcomings of the method for analyzing nucleotide polymorphism.
본 발명의 목적은 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성과 연관된 뉴라미니데이즈 275번째 아미노산 변이(His275Tyr) 판별, 상세하게는 823번째 염기가 C>T인 단일 염기다형성 판별방법을 제공하기 위한 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for determining neuraminidase 275th amino acid mutation (His275Tyr) associated with Tamiflu resistance of swine influenza type A H1N1, specifically, for single nucleotide polymorphism wherein the 823th base is C> T.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 위치의 단일 염기다형성을 검출할 수 있는, 단일 염기다형성 판별형 프라이머 세트를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a single nucleotide polymorphism discriminative primer set capable of detecting a single nucleotide polymorphism of the Tamiflu-resistant C823T position of swine influenza A H1N1.
또한, 본 발명은 본 발명은 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 위치의 단일 염기다형성을 검출할 수 있는, 단일 염기다형성 판별형 프로브를 제공한다.The present invention also provides a single nucleotide polymorphism discriminative probe capable of detecting a single nucleotide polymorphism at the Tamiflu-resistant C823T position of swine influenza A H1N1.
또한, 본 발명은 상기 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 위치의 단일 염기다형성 판별용 프라이머 세트, 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 위치의 단일 염기다형성 프로브 또는 이들의 혼합 구성물을 포함하는, 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 단일 염기다형성 판별형 키트를 제공한다.In addition, the present invention comprises a primer set for determining the single nucleotide polymorphism of the Tamiflu-resistant C823T position of the swine flu type A H1N1, a single nucleotide polymorphism probe of the Tamiflu-resistant C823T position of the H1N1 influenza A type H1N1, or a mixed construct thereof Provided are a Tamiflu resistant C823T single nucleotide polymorphism discrimination kit of influenza A type H1N1.
또한, 본 발명은 상기 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 단일 염기다형성 판별형 키트를 이용하여 타미플루에 내성을 보이는 신종 인플루엔자를 판별하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for determining swine influenza resistant to Tamiflu by using the Tamiflu resistant C823T single nucleotide polymorphism discrimination kit of the swine influenza A type H1N1.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에 있어서, “프라이머”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.In the present invention, “primer” refers to a single stranded oligonucleotide sequence that is complementary to the nucleic acid strand to be copied and may serve as a starting point for the synthesis of the primer extension product. The length and sequence of the primer should allow to start the synthesis of the extension product. The specific length and sequence of the primer will depend on the primer utilization conditions such as temperature and ionic strength as well as the complexity of the DNA or RNA target required.
인플루엔자 바이러스 A/Korea/01/2009(H1N1)(NCBI GenBank No: GQ132185) 및 A/Denmark/528/2009(H1N1)(NCBI GenBank No: CY043352) 유전자 내 C823T SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출할 수 있는, 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 단일 염기다형성 판별형 프라이머 세트를 제공한다. C823T single nucleotide polymorphism (SNP) in influenza virus A / Korea / 01/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: GQ132185) and A / Denmark / 528/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: CY043352) genes Tamiflu resistant C823T single nucleotide polymorphism discriminating primer set of swine influenza type A H1N1.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 C823T SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출하기 위하여, 감수성(Sensitive)과 내성(Resistant) 바이러스를 각각 검출하는 특이적인 폴리뉴클레오티드로 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 길이는 10개 내지 30개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열이다. 다형성 서열(polymorphic sequence)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일 염기다형을 나타내는 다형성 부위 (polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위(polymorphic site)란 다형성 서열중 단일 염기다형이 일어나는 부위를 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.In the present invention, in order to detect C823T single nucleotide polymorphism (SNP), each primer is a specific polynucleotide or a complementary polynucleotide thereof which detects a sensitive and resistant virus, respectively, and has a length of 10 It may consist of from 30 nucleotides. The polynucleotide is a polymorphic sequence. A polymorphic sequence refers to a sequence comprising a polymorphic site representing a single nucleotide polymorphism in a nucleotide sequence. A polymorphic site refers to a site where a single nucleotide polymorphism occurs in the polymorphic sequence. The polynucleotide can be DNA or RNA.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 상기 인플루엔자 바이러스 A/Korea/01/2009(H1N1)(NCBI GenBank No: GQ132185) 및 A/Denmark/528/2009(H1N1)(NCBI GenBank No: CY043352) 유전자 내 630 내지 1027번째 염기 내의 뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 것으로, 보다 상세하게는 823번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 세트를 제공한다. In the present invention, the primer is 630 to the influenza virus A / Korea / 01/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: GQ132185) and A / Denmark / 528/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: CY043352) gene A polynucleotide consisting of a nucleotide within a 1027th base or a complementary polynucleotide thereof, and more specifically, a primer set consisting of a polynucleotide consisting of 10 or more consecutive DNA sequences including the 823th base or a complementary nucleotide thereof. do.
본 발명에서 프라이머 세트는 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머 세트를 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 세트인 것으로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6, 9 및 10으로 기재된 프라이머로부터 선택된 2 이상의 프라이머가 혼합되어 이루어질 수 있다.In the present invention, the primer set includes a primer set of all combinations consisting of forward and reverse primers for recognizing a target gene sequence, but preferably, the primer set provides an analysis result having specificity and sensitivity. May be made by mixing two or more primers selected from the primers set forth in SEQ ID NOs: 1 to 6, 9, and 10.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1, 2, 9 및 10; 서열번호 3, 4, 9 및 10;으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the primer set is SEQ ID NO: 1, 2, 9 and 10; SEQ ID NO: 3, 4, 9 and 10; characterized in that at least one kind.
상기 서열번호 9 및 10은 3' 말단의 수산기가 블로킹되고 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드인 것으로, 보다 상세하게는 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 3' 말단의 수산기가 상기 수산기 이외의 치환기로 치환되어 있으며, 바람직하게는 아민으로 치환된 것이며, 감수성과 내성 바이러스 염기서열에 상보적이며, Tm 값이 5 내지 10℃ 낮게 디자인된 폴리뉴클레오티드로 구성된다.SEQ ID NO: 9 and 10 is a blocking oligonucleotide having a 3 'terminal hydroxyl group is blocked and has a nucleotide sequence complementary to the primer, more specifically, the blocking oligonucleotide is a hydroxyl group of 3' terminal is substituted with a substituent other than the hydroxyl group Substituted, preferably substituted with amines, complementary to susceptibility and resistant viral sequences, and consist of polynucleotides designed with a low Tm value of 5 to 10 ° C.
본 발명의 프라이머 세트는 블로킹 올리고뉴클레오티드를 포함함으로써 낮은 온도에서의 프라이머-다이머 형성이나 비특이적인 반응에 의한 PCR 증폭 산물의 끌림 현상(Smeared band) 등을 억제시켜 보다 정확한 PCR 결과물을 얻을 수 있는 장점이 있다.The primer set of the present invention includes a blocking oligonucleotide, thereby suppressing a primer band dimer formation at a low temperature or a smeared band of a PCR amplification product due to a nonspecific reaction, thereby obtaining a more accurate PCR result. have.
상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 이와 상보적인 서열을 갖는 프라이머 세트에 대하여 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 중 어느 하나에 특이적으로 결합하거나, 상기 정방향 및 역방향 프라이머 모두에 특이적으로 결합할 수 있다.The blocking oligonucleotide may specifically bind to any one of a forward primer and a reverse primer with respect to a primer set having a sequence complementary thereto, or may specifically bind to both the forward and reverse primers.
본 발명은 인플루엔자 바이러스 A/Korea/01/2009(H1N1)(NCBI GenBank No: GQ132185) 및 A/Denmark/528/2009(H1N1)(NCBI GenBank No: CY043352) 유전자 내 C823T SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출할 수 있는, 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 검출용 프로브를 제공한다.The present invention provides C823T single nucleotide polymorphism (SNP) in influenza virus A / Korea / 01/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: GQ132185) and A / Denmark / 528/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: CY043352) gene. Provided is a probe for detecting influenza Tamiflu resistance of swine flu type A H1N1.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 7, 서열번호 8로 기재된 프로브로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the probe is at least one selected from the probes set forth in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8.
본 발명에서 “프로브”란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링이 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 또한, 실시간 PCR을 수행하기 위해서는 형광표식 프로브를 이용할 수 있다. 보다 구체적으로 5’말단에는 형광물질이 결합되어 있고, 3’말단에는 퀀처(Quencher)가 결합될 수 있다.In the present invention, the term "probe" refers to nucleic acid fragments such as RNA or DNA corresponding to short bases to hundreds of bases that can achieve specific binding with mRNA, and are labeled to confirm the presence or absence of specific mRNAs. Can be. Probes may be prepared in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes and the like. In addition, in order to perform real-time PCR, a fluorescent labeled probe can be used. More specifically, the fluorescent material is coupled to the 5 'end, and the quencher may be coupled to the 3' end.
본 발명은 상기 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 위치의 단일 염기다형성 판별용 프라이머 세트, 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 위치의 단일 염기다형성 프로브 또는 이들의 혼합 구성물을 포함하는, 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 단일 염기다형성 판별형 키트를 제공한다.The present invention includes a primer set for determining single nucleotide polymorphism at the Tamiflu-resistant C823T position of the swine flu type A H1N1, a single nucleotide polymorphism probe at the Tamiflu-resistant C823T position of the H1N1 influenza A type H1N1, or a mixed construct thereof. A Tamiflu resistant C823T single nucleotide polymorphism discriminative kit of type H1N1 is provided.
본 발명에 있어서, 상기 혼합 구성물은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 10인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the mixed construct is characterized in that SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10.
또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.The kit may also include instructions. The guide is a printed document that explains how to use the kit, such as how to prepare reverse transcription buffer and PCR buffer, and the reaction conditions presented. The instructions include brochures in the form of pamphlets or leaflets, labels affixed to the kit, and instructions on the surface of the package containing the kit. In addition, the guide includes information that is disclosed or provided through electronic media such as the Internet.
본 발명은 The present invention
1) 검체를 주형으로, 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 위치의 단일 염기다형성 판별용 프라이머 세트, 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 위치의 단일 염기다형성 프로브 또는 이들의 혼합 구성물을 포함하는 키트를 이용하여 다형성 부위를 검출하는 단계; 및 1) A kit containing a sample as a template, a primer set for discriminating single nucleotide polymorphism at the Tamiflu-resistant C823T position of H1N1 influenza, a single nucleotide polymorphism probe at the Tamiflu-resistant C823T position of H1N1 influenza A, or a mixed construct thereof Detecting a polymorphic site using; And
2) 단계 1)에서 검출된 다형성 부위의 유무를 비교하는 단계;2) comparing the presence or absence of the polymorphic site detected in step 1);
를 포함하는, 타미플루에 내성을 보이는 신종 인플루엔자의 판별방법을 제공한다.It provides a method for determining the influenza, including a Tamiflu resistant.
본 발명에서 “검체”란 인플루엔자 바이러스 감염에 의해 돼지 인플루엔자 A H1N1(swine influenza A H1N1)의 HA 유전자 및/또는 인플루엔자 A 유전자 발현 수준이 차이나는 혈액, 혈청, 침 또는 가래와 같은 시료를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.As used herein, the term "sample" includes samples such as blood, serum, saliva, or sputum, in which the HA and / or influenza A gene expression levels of swine influenza A H1N1 differ due to influenza virus infection, It is not limited to this.
본 발명에 있어서, 상기 혼합 구성물은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 10인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the mixed construct is characterized in that SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브를 이용하여 신종인플루엔자 A(HN1)양성 검체에 대해 단일 염기다형성 판별시험을 하였다. 바이러스의 RNA는 Accuprep Viral RNA Extration kit(바이오니아, 한국)로 추출하고, ExicyclerTM Quantitative Thermal Block을 이용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 진행하였다. 그 결과, 리보핵산을 가진 생명체의 유전변이를 정확하고 효율적으로 분석할 수 있을 뿐 아니라 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 단일 염기다형성 부위를 빠른 시간 내에 효율적이고 정확하게 검출할 수 있었다. In a specific embodiment of the present invention, a single nucleotide polymorphism discrimination test was performed on a swine flu A (HN1) positive sample using primers and probes according to the present invention. Virus RNA was extracted with Accuprep Viral RNA Extration kit ( Bionia , Korea) and subjected to real-time reverse transcription polymerase chain reaction using Exicycler TM Quantitative Thermal Block. As a result, the genetic variation of living organisms with ribonucleic acid can be analyzed accurately and efficiently, and the Tamiflu-resistant C823T single nucleotide polymorphism site of H1N1 influenza A can be detected quickly and efficiently.
본 발명에 따른 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 단일 염기다형성 판별형 프라이머 세트 및 프로브는 리보핵산을 가진 생명체의 유전변이를 정확하고 효율적으로 분석할 수 있을 뿐 아니라 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 단일 염기다형성 부위를 빠른 시간 내에 효율적이고 정확하게 검출할 수 있어, 타미플루 내성 바이러스 등의 새로운 바이러스 치료제 개발에 크게 기여할 것이다.Tamiflu-resistant C823T single nucleotide polymorphism discriminating primer sets and probes of the H1N1 influenza A type according to the present invention can not only accurately and efficiently analyze genetic variation of living organisms with ribonucleic acid but also Tamiflu resistance of the H1N1 influenza A type H1N1. The C823T single nucleotide polymorphism site can be efficiently and accurately detected in a short time, greatly contributing to the development of new viral therapeutics such as Tamiflu-resistant virus.
도 1은 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스 A/Korea/01/2009(H1N1)(NCBI GenBank No: GQ132185)의 염기서열을 나타낸 것이고,Figure 1 shows the nucleotide sequence of influenza virus A / Korea / 01/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: GQ132185) according to the present invention,
도 2는 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스 A/Denmark/528/2009(H1N1)(NCBI GenBank No: CY043352)의 염기서열을 나타낸 것이며,Figure 2 shows the nucleotide sequence of influenza virus A / Denmark / 528/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: CY043352) according to the present invention,
도 3은 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 5로 기재된 프라이머 세트(10p)에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이고,Figure 3 shows the results (graph and detection sensitivity) of the real-time reverse transcription polymerase chain reaction for the primer set (10p) described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 5 according to the present invention,
도 4는 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 5로 기재된 프라이머 세트(15p)에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이며,Figure 4 shows the results of the real-time reverse transcription polymerase chain reaction for the primer set (15p) described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 5 according to the present invention (graph and detection sensitivity),
도 5는 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 6으로 기재된 프라이머 세트(10p)에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이고,Figure 5 shows the results (graph and detection sensitivity) of the real-time reverse transcription polymerase chain reaction for the primer set (10p) described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 6 according to the present invention,
도 6은 본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 6으로 기재된 프라이머 세트(15p)에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이며,6 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction for the primer set (15p) described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 6 according to the present invention,
도 7은 본 발명에 따른 서열번호 3 및 서열번호 5로 기재된 프라이머 세트(10p)에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이고,Figure 7 shows the results (graph and detection sensitivity) of the real-time reverse transcription polymerase chain reaction for the primer set (10p) described in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5 according to the present invention,
도 8은 본 발명에 따른 서열번호 3 및 서열번호 5로 기재된 프라이머 세트(15p)에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이며,8 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction for primer sets (15p) described in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5 according to the present invention,
도 9는 본 발명에 따른 서열번호 3 및 서열번호 6으로 기재된 프라이머 세트(10p)에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이고,9 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction of the primer set (10p) described in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 6 according to the present invention,
도 10은 본 발명에 따른 서열번호 3 및 서열번호 6으로 기재된 프라이머 세트(15p)에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이며,FIG. 10 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction for primer sets (15p) described in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 6 according to the present invention.
도 11은 본 발명에 따른 서열번호 2 및 서열번호 5로 기재된 프라이머 세트(10p)에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이고,11 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction for primer sets (10p) described in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5 according to the present invention,
도 12는 본 발명에 따른 서열번호 2 및 서열번호 5로 기재된 프라이머 세트(15p)에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이며,12 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction for primer sets (15p) described in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5 according to the present invention,
도 13은 본 발명에 따른 서열번호 2 및 서열번호 6으로 기재된 프라이머 세트(10p)에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이고,FIG. 13 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction for primer sets (10p) described in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 6 according to the present invention.
도 14는 본 발명에 따른 서열번호 2 및 서열번호 6으로 기재된 프라이머 세트(15p)에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이며,14 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction for primer sets (15p) described in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 6 according to the present invention,
도 15는 본 발명에 따른 서열번호 4 및 서열번호 5로 기재된 프라이머 세트(10p)에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이고,15 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction for primer sets (10p) described in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 according to the present invention,
도 16은 본 발명에 따른 서열번호 4 및 서열번호 5로 기재된 프라이머 세트(15p)에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이며,16 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction for primer sets (15p) described in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 according to the present invention,
도 17은 본 발명에 따른 서열번호 4 및 서열번호 6으로 기재된 프라이머 세트(10p)에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이고,17 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction for the primer set (10p) described in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6 according to the present invention,
도 18은 본 발명에 따른 서열번호 4 및 서열번호 6으로 기재된 프라이머 세트(15p)에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이며,18 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction for primer sets (15p) described in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6 according to the present invention,
도 19는 본 발명에 따른 서열번호 3 및 서열번호 6으로 기재된 프라이머 세트와 서열번호 7로 기재된 프로브에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이고,19 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction of the primer set of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 6 and the probe of SEQ ID NO: 7 according to the present invention,
도 20은 본 발명에 따른 서열번호 3 및 서열번호 6으로 기재된 프라이머 세트와 서열번호 8로 기재된 프로브에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이며,20 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction of the primer set of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 6 and the probe of SEQ ID NO: 8 according to the present invention,
도 21은 본 발명에 따른 서열번호 4 및 서열번호 6으로 기재된 프라이머 세트와 서열번호 7로 기재된 프로브에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이고,21 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction of the primer set of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6 and the probe of SEQ ID NO: 7 according to the present invention,
도 22는 본 발명에 따른 서열번호 4 및 서열번호 6으로 기재된 프라이머 세트와 서열번호 8로 기재된 프로브에 대한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과(그래프 및 검출민감도)를 보여주는 것이며,22 shows the results (graph and detection sensitivity) of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction of the primer set of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6 and the probe of SEQ ID NO: 8 according to the present invention,
도 23은 ExicyclerTM96 Real-Time Quantitative Thermal block을 사용하여 본 발명의 실시예 3에 대한 신종인플루엔자의 단일 염기다형성 감수성 RNA 표준 주형의 그래프를 나타낸 것이고,FIG. 23 is a graph of a single nucleotide polymorphism sensitive RNA standard template of Swine Flu for Example 3 of the present invention using Exicycler ™ 96 Real-Time Quantitative Thermal Block,
도 24는 ExicyclerTM96 Real-Time Quantitative Thermal block을 사용하여 본 발명의 실시예 3에 대한 신종인플루엔자의 단일 염기다형성 내성의 표준 주형의 그래프를 나타낸 것이며,FIG. 24 shows a graph of the standard template for single nucleotide polymorphism resistance of swine flu against Example 3 of the present invention using Exicycler ™ 96 Real-Time Quantitative Thermal Block,
도 25는 ExicyclerTM96 Real-Time Quantitative Thermal block을 사용하여 본 발명의 실시예 3에 대한 신종인플루엔자의 단일 염기다형성의 감수성/내성의 표준 주형 그래프의 표준 곡선을 나타낸 것이고,FIG. 25 shows standard curves of a standard template graph of susceptibility / tolerance of single nucleotide polymorphism of Swine Flu for Example 3 of the present invention using Exicycler ™ 96 Real-Time Quantitative Thermal Block
도 26은 ExicyclerTM96 Real-Time Quantitative Thermal block을 사용하여 상기 도 23의 감수성 표준주형(105)에 대한 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응의 검출민감도(△Ct )를 확인한 것이며,FIG. 26 shows the detection sensitivity (ΔCt) of real-time reverse transcription polymerase chain reaction of the susceptible standard template 10 5 of FIG. 23 using Exicycler ™ 96 Real-Time Quantitative Thermal block.
도 27은 ExicyclerTM96 Real-Time Quantitative Thermal block을 사용하여 상기 도 24의 내성 표준주형(105)에 대한 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응의 검출민감도(△Ct )를 확인한 것이고,FIG. 27 shows the detection sensitivity (ΔCt) of real-time reverse transcription polymerase chain reaction for the resistant standard template 10 5 of FIG. 24 using Exicycler ™ 96 Real-Time Quantitative Thermal block.
도 28은 ExicyclerTM96 Real-Time Quantitative Thermal block을 사용하여 본 발명의 실시에 4에 대한 신종 인플루엔자 A(HN1) 음성검체의 내성 단일 염기다형성의 검출결과를 보여주는 것이며,FIG. 28 shows the results of detection of resistant single nucleotide polymorphism of a new influenza A (HN1) negative sample for Example 4 of the present invention using an Exicycler ™ 96 Real-Time Quantitative Thermal block.
도 29는 ExicyclerTM96 Real-Time Quantitative Thermal block을 사용하여 본 발명의 실시에 4에 대한 신종 인플루엔자 A(HN1) 양성검체의 내성 단일 염기다형성의 검출결과를 보여주는 것이다.FIG. 29 shows the results of detection of resistant single nucleotide polymorphism of Swine Influenza A (HN1) positive samples for Example 4 of the present invention using Exicycler ™ 96 Real-Time Quantitative Thermal Block.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.The invention is explained in more detail by the following examples. However, the following examples are only to aid the understanding of the present invention, and the scope of the present invention in any sense is not limited by these examples.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.At this time, if there is no other definition in the technical terms and scientific terms used, it has a meaning commonly understood by those of ordinary skill in the art to which the present invention belongs, the gist of the present invention in the following description and the accompanying drawings Descriptions of well-known functions and configurations that may be unnecessarily blurred are omitted.
[실시예 1] 주형 RNA 제조Example 1 Template RNA Preparation
실시간 중합효소 연쇄반응을 실시하기 위해, 내성/감수성 주형 RNA를 제조하였다. 구체적으로 감수성 인플루엔자 A(H1N1)인 A/Korea/01/2009(H1N1)(NCBI GenBank No: GQ132185(서열번호 11), 내성 인플루엔자 A(H1N1)인 A/Denmark/528/2009(H1N1)(NCBI GenBank No: CY043352)(서열번호 12)의 단일 염기다형성 부위를 포함하는 823 bp 포함하는 부분을 유전자 합성방법(NBiochem. Biophys. Res. Commun.1998, 248, 200-203)으로 감수성/내성의 주형을 합성하고, 그 중 일부를 pGEM-T-Easy Vector(Cat: A1360, Promega, 미국)에 클로닝하였다. To perform real-time polymerase chain reaction, resistance / sensitive template RNA was prepared. Specifically, A / Korea / 01/2009 (H1N1), susceptible influenza A (H1N1) (NCBI GenBank No: GQ132185 (SEQ ID NO: 11), A / Denmark / 528/2009 (H1N1), resistant to influenza A (H1N1) (NCBI) GenBank No: CY043352) (SEQ ID NO: 12) containing a portion of 823 bp containing a single nucleotide polymorphism site by gene synthesis method ( NBiochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 248, 200-203) And some of them were cloned into pGEM-T-Easy Vector (Cat: A1360, Promega, USA).
구체적으로 2X rapid ligation buffer(Promega사제, 미국) 5 ㎕, T-Easy Vector(Promega사제, 미국) 1 ㎕, T4 DNA ligase 1 ㎕(Promega사제, 미국), 합성된 유전자 3 ㎕(8 ng)를 동일한 튜브에 넣어 혼합한 다음 37℃에서 1시간 정온배치 하였다. 그 후, E. coli 만능세포(competent cell) 50 ㎕에 상기의 정온 배치한 반응액 5 ㎕을 넣고 얼음 상에 40분간 놓아둔 뒤, 42℃에서 40초 배양하고 다시 얼음 상에 2분 놓아두었다. Specifically, 5 μl of 2X rapid ligation buffer (manufactured by Promega, USA), 1 μl of T-Easy Vector (manufactured by Promega, USA), 1 μl of T4 DNA ligase (manufactured by Promega, USA), 3 μl of synthesized gene (8 ng) The mixture was put in the same tube, and then placed at a constant temperature at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, 5 µl of the reaction solution placed at the constant temperature was placed in 50 µl of E. coli pluripotent cells (competent cells), and placed on ice for 40 minutes. .
앰피실린, IPTG, X-Gal이 포함된 LB 플레이트에 상기 반응액을 접종한 후 37℃에서 16시간 배양하였다. 배양 된 흰 콜로니를 취하여 LB 액체 배지에서 16시간 정도 배양한 후 원심분리하여 상층액은 버리고 Accuprep plasmid DNA prep kit((주)바이오니아)를 사용하여 펠렛으로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. The reaction solution was inoculated into LB plates containing ampicillin, IPTG, and X-Gal, followed by incubation at 37 ° C for 16 hours. The cultured white colonies were taken, cultured in LB liquid medium for 16 hours, centrifuged, the supernatant was discarded, and plasmid DNA was extracted from the pellets using Accuprep plasmid DNA prep kit ( Bionia ).
상기 플라스미드 DNA는 UV 분광계(Shimazu사제, 일본)로 농도와 순도를 측정한 다음 순도가 1.8 내지 2.0 사이인 것을 확인하고 MAXIscipt In vitro transcription Kit(Ambion, 미국)를 사용하여 플라스미드 DNA를 RNA로 전사시켰다.The plasmid DNA was measured using a UV spectrometer (manufactured by Shimazu, Japan) to measure the concentration and purity, and confirmed that the purity was between 1.8 and 2.0. The plasmid DNA was transcribed into RNA using the MAXIscipt In vitro Transcription Kit (Ambion, USA). .
전사 후 UV 분광계로 농도와 순도를 측정하여 순도가 1.8 내지 2.0 사이에 있으면 이후의 실시간 중합효소 연쇄반응에서 주형 RNA로 사용하였다. RNA 카피수(copy number)는 아래의 공식에 의하여 계산하였다.After the transcription, the concentration and purity were measured by UV spectrometer, and when the purity was between 1.8 and 2.0, it was used as template RNA in the subsequent real-time polymerase chain reaction. RNA copy number was calculated by the following formula.
6.02×1023×농도(UV 분광계로 측정된 농도 g/ml)/(3015+432)×340[3015 bp: T-easy vector의 크기, 432 bp: 신종 인플루엔자 A(H1N1) 감수성/ 내성 주형 RNA의 크기] 주형 RNA의 카피수를 계산한 다음 1X TE buffer(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA)로 10진 희석하여 사용시까지 -70℃에 보관하였다.6.02 × 10 23 × concentration (concentration g / ml measured by UV spectrometer) / (3015 + 432) × 340 [3015 bp: size of T-easy vector, 432 bp: Swine Flu A (H1N1) susceptibility / resistant template RNA Size] The copy number of the template RNA was calculated and then diluted in 1X TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) and stored at -70 ° C until use.
[실시예 2] 프라이머 및 프로브 디자인Example 2 Primer and Probe Design
상기 서열번호 11의 감수성 인플루엔자 A(H1N1)인 A/Korea/01/2009(H1N1)(NCBI GenBank No: GQ132185 및 상기 서열번호 12의 내성 인플루엔자 A(H1N1)인 A/Denmark/528/2009(H1N1)(NCBI GenBank No: CY043352)의 합성 RNA 주형에서 cDNA합성을 위한 프라이머는 길이를 24 내지 25mer, Tm 값은 55℃ 내지 60℃가 되도록 임의로 염기서열을 선택하여 역방향 프라이머로 하였으며(서열 번호 5, 서열번호 6), cDNA합성 단계에서 단일 염기 다형성의 작용을 막기 위한 블로킹 올리고 뉴클레오티드는 17mer, Tm 값은 cDNA 합성 Tm인 45℃가 되도록 디자인(서열 번호 9, 서열 번호 10) 하였다. A / Korea / 01/2009 (H1N1), the susceptible influenza A (H1N1) of SEQ ID NO: 11 (NCBI GenBank No: GQ132185, and A / Denmark / 528/2009 (H1N1), the resistant influenza A (H1N1) of SEQ ID NO: 12 In the synthetic RNA template of (NCBI GenBank No: CY043352), primers for cDNA synthesis were randomly selected such that the primers had a length of 24 to 25mer and a Tm value of 55 ° C to 60 ° C as reverse primers (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6), the blocking oligonucleotide to prevent the action of a single nucleotide polymorphism in the cDNA synthesis step was designed to be 17mer, Tm value is 45 ℃, the cDNA synthesis Tm (SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10).
cDNA를 이용하여 단일 염기 다형성을 검출하기 위한 특이적인 감수성/내성 정방향 프라이머(서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호, 3, 서열번호 4) 길이는 23 내지 24mer 사이, Tm 값은 55 내지 60℃ 사이에서 단일염기 다형성 부분이 3` 끝에 위치하도록 정방향 염기서열을 선택하였고, 프로브(서열번호 7, 서열번호 8) 길이는 24 내지 26mer 사이 Tm 60 내지 65℃ 프로브로 하였다. Tm 값은 Primer3Plus 프로그램을 사용하여 체크하였다. Specific susceptible / resistant forward primers (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4) for detecting single nucleotide polymorphisms using cDNA between 23-24mer in length and 55-60 ° C in Tm The forward nucleotide sequence was selected so that the single base polymorphic portion was located at the 3 ′ end, and the probe (SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8) length was a Tm 60 to 65 ° C. probe between 24 and 26mer. Tm values were checked using the Primer3Plus program.
모든 프라이머/프로브는 하기 표 1과 같이 제작하였다.All primers / probes were prepared as in Table 1 below.
Figure PCTKR2011003240-appb-I000001
Figure PCTKR2011003240-appb-I000001
상기 표 1의 프라이머를 하기 표 2의 세트로 조합하여 ExicyclerTM Quantitative Thermal Block(바이오니아, 한국)을 이용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 진행하였다. The primers of Table 1 were combined into a set of Table 2 below to perform real-time reverse transcription polymerase chain reaction using Exicycler ™ Quantitative Thermal Block (Bionia, Korea).
Figure PCTKR2011003240-appb-I000002
Figure PCTKR2011003240-appb-I000002
구체적으로 정방향/역방향 프라이머와 프로브, 블로킹 올리고 뉴클레오타이드 AccPower GreenStarTM qPCR Premix(㈜바이오니아 한국)를 이용하여 D.W 45 ㎕ 여기에 사용된 주형 RNA는 상기 실시예 1에서 희석한(105의 배율) 것을 5 ㎕ 사용함으로써, 최종 총 용량이 50 ㎕이 되도록 하여 상기 표 2와 같은 조합으로 실험을 수행하였다. 그 결과 도 3 내지 18의 결과로부터 프라이머 세트 4를 선정할 수 있었다.Specifically, 5 the forward / reverse primers and probes, the blocking oligonucleotide AccPower GreenStar TM qPCR Premix the template RNA used in DW 45 ㎕ here using (㈜ Bioneer Korea) (scale of 10 5) was diluted in the above Example 1 By using μl, the final total dose was 50 μl and the experiment was performed in the combination as shown in Table 2 above. As a result, primer set 4 could be selected from the results of FIGS. 3 to 18.
상기 선정된 프라이머 세트 4를 이용하여 PCR 효율이 좋은 프로브 선정하였다.Probe with good PCR efficiency was selected using the selected primer set 4.
상기 프로브는 5’부위에 FAM 형광, 3’부위에는 BHQ1이 부착되도록 주문제작((주)바이오니아)하여 사용하였다. 프로브를 하기 표 3과 같은 조합으로 하여 각각 10X RT Buffer 2㎕, Taq polymerase 1U, MMLV RTase 350 U(이상 (주)바이오니아), dNTP 20 mM, DTT 50 mM, RNasin 15U 및 DEPC(Diethylpyrocarbonate) D.W를 넣고 혼합한 후 1 웰 당 45 ㎕가 되도록 하여 96-웰 플레이트에 분주하여 이를 45℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성하고, 95℃에서 5분간 변성시킨 후, 95℃에서 5초, 55℃에서 5초씩 45 사이클을 반응시켰다. The probe was used by custom fabrication (Bionia Co., Ltd.) to attach FHQ fluorescence at the 5 ′ region and BHQ1 at the 3 ′ region. The probes were prepared in the combinations shown in Table 3 below, and 2 μl of 10X RT Buffer, Taq polymerase 1U, MMLV RTase 350 U (above Bionic), dNTP 20 mM, DTT 50 mM, RNasin 15U, and DEPC (Diethylpyrocarbonate) DW, respectively. After mixing and mixing, the mixture was made to 45 μl per well, and the resultant was dispensed into a 96-well plate and reacted at 45 ° C. for 15 minutes to synthesize cDNA. 45 cycles were reacted for 5 seconds.
Figure PCTKR2011003240-appb-I000003
Figure PCTKR2011003240-appb-I000003
상기 표 3의 프라이머/프로브 조합으로 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 진행한 결과 도 19 내지 도 22에서도 확인할 수 있듯이, PCR 효율이 좋은 프로브-2를 선택하였다.As a result of real-time reverse transcription polymerase chain reaction using the primer / probe combinations of Table 3, as shown in FIGS. 19 to 22, probe-2 having a high PCR efficiency was selected.
상기 결과로부터 최종적으로 효율이 좋은 프라이머/프로브를 선정하였으며, 표 4에 표시하였다.From the above results, a primer / probe with good efficiency was finally selected and shown in Table 4.
Figure PCTKR2011003240-appb-I000004
Figure PCTKR2011003240-appb-I000004
[실시예 3] 표준 주형 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응Example 3 Standard Template Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
상기 실시예 1에서 제작한 RNA를 주형으로 하고, 상기 실시예 2에서 선택된 프라이머 및 프로브, 그리고 ExicyclerTM Quantitative Thermal Block(바이오니아, 한국)을 이용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실행하였다.The RNA prepared in Example 1 was used as a template, and real-time reverse transcription polymerase chain reaction was performed using the primers and probes selected in Example 2 and Exicycler ™ Quantitative Thermal Block (Bionia, Korea).
상기 실시예 2와 동일한 조건으로 45 사이클의 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시하였고, 음성대조군(NTC: negative control)은 신종 인플루엔자 주형 대신 DEPC-DW로 대체한 공시료로서, 상기와 동일한 조건으로 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 실행하였다.45 cycles of real-time reverse transcriptase chain reaction were carried out under the same conditions as in Example 2, and the negative control group (NTC: negative control) was a blank sample replaced with DEPC-DW instead of a new influenza template. Reverse transcription polymerase chain reaction was performed.
도 23 내지 도 25에서도 확인할 수 있듯이, 상기 실시예 1의 방법대로 카피수를 계산하였으며, 그 결과 주형 RNA은 최저 10 카피까지 검출이 가능하였고, 표준 주형 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응의 표준 그래프를 작성했을 때, 기울기는 -3.01 내지 -3.15, 직선성 R2 값은 0.997 내지 0.999이었다As can be seen in Figures 23 to 25, the number of copies was calculated according to the method of Example 1, as a result template RNA was able to detect a minimum of 10 copies, to prepare a standard graph of the standard template real-time reverse transcription polymerase chain reaction The slope was -3.01 to -3.15, and the linearity R 2 value was 0.997 to 0.999.
상기 R2는 실시간 중합효소연쇄반응의 표준 그래프를 그렸을 때 그래프의 직선성을 나타내는 상관계수로 1에 가까울수록(직선에 가까울수록), PCR이 제대로 진행되었음을 의미한다.The R 2 is a correlation coefficient indicating the linearity of the graph when the standard graph of the real-time polymerase chain reaction is drawn, and the closer to 1 (the closer to the straight line), the PCR was properly performed.
[실시예 4] 신종 인플루엔자 내성 단일염기다형성 검출 실험Example 4 H1N1 Influenza Resistant Monobasic Polymorphism Detection Experiment
상기 실시예 2에서 제작한 프라이머 및 프로브를 이용하여 신종인플루엔자 A(HN1)양성 검체(충남대학교 병원 진단 검사 의학과 제공)에 대해 단일 염기다형성 판별시험을 하였다. 바이러스의 RNA는 Accuprep Viral RNA Extration kit(바이오니아, 한국)로 추출하고, ExicyclerTM Quantitative Thermal Block을 이용하여 실시예 2와 같은 조건으로 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 진행하였다. 이는 본 발명의 프라이머 및 프로브를 상기 실시예 3의 표준 주형 뿐 아니라 실제 검체에 적용하였을 때에도 동일한 결과가 나오는지 확인하기 위함이다.Using the primers and probes prepared in Example 2, a single nucleotide polymorphism discrimination test was performed on Swine Flu A (HN1) positive specimens (provided by Chungnam National University Hospital). Virus RNA was extracted with an Accuprep Viral RNA Extration kit ( Bionia , Korea) and subjected to real-time reverse transcription polymerase chain reaction under the same conditions as in Example 2 using Exicycler ™ Quantitative Thermal Block. This is to confirm whether the same result is obtained when the primer and probe of the present invention are applied to the actual sample as well as the standard template of Example 3.
그 결과 도 26 내지 도 29에서도 확인할 수 있듯이, 상기의 모든 바이러스를 검출할 수 있었다. 한편, 교차반응 유무를 판단하기 위하여, 다른 RNA 주형 바이러스인 A형 인플루엔자 바이러스(Inf A), B형 인플루엔자 바이러스(Inf B), 조류인플루엔자(AIV), C형간염 바이러스(HCV), 노로(Noro) 바이러스, EV 바이러스, HTLV 1 바이러스의 RNA를 추출하여, 실시간 중합효소 연쇄반응을 진행한 경우에는 증폭이 되지 않았다. As a result, as shown in FIGS. 26 to 29, all of the above viruses could be detected. On the other hand, to determine the presence of cross-reaction, influenza A virus (Inf A), influenza B virus (Inf B), avian influenza virus (AIV), hepatitis C virus (HCV), Noro ) RNA, EV virus, and HTLV 1 virus were extracted and subjected to real-time polymerase chain reaction, which did not amplify.
따라서 교차반응이 일어나지 않았음을 확인하였으며, 신종 인플루인자의 판별 방법인 감수성/내성 신호간의 검출 신호 차이는 3.32 내지 4.97 Ct 정도 차이를 보였다. Therefore, it was confirmed that no cross-reaction occurred, and the difference in detection signal between susceptibility / tolerance signals, which is a method of identifying influenza, was about 3.32 to 4.97 Ct.
상기의 결과로부터 본 발명에 따른 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 단일 염기다형성 판별형 프라이머 세트 및 프로브는 리보핵산을 가진 생명체의 유전변이를 정확하고 효율적으로 분석할 수 있을 뿐 아니라 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 단일 염기다형성 부위를 빠른 시간 내에 효율적이고 정확하게 검출할 수 있어, 타미플루 내성 바이러스 등의 새로운 바이러스 치료제 개발에 크게 기여할 것이다.From the above results, the Tamiflu-resistant C823T single nucleotide polymorphism discriminating primer set and probe of the H1N1 influenza A type H1N1 according to the present invention can accurately and efficiently analyze the genetic variation of a living organism having ribonucleic acid, as well as the H1N1 influenza A type. The Tamiflu-resistant C823T single nucleotide polymorphism site of H1N1 can be efficiently and accurately detected in a short time, greatly contributing to the development of new viral therapeutics such as Tamiflu-resistant virus.
서열목록 1은 본 발명에 따른 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 위치의 단일 염기다형성을 검출을 위한 프라이머 SIV_M_wild forward primer 1의 염기서열이다.SEQ ID NO: 1 is a nucleotide sequence of primer SIV_M_wild forward primer 1 for detecting single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of H1N1 influenza A according to the present invention.
서열목록 2는 본 발명에 따른 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 위치의 단일 염기다형성을 검출을 위한 프라이머 SIV_M_mutant forward primer 1의 염기서열이다.SEQ ID NO: 2 is a nucleotide sequence of primer SIV_M_mutant forward primer 1 for detecting single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of H1N1 influenza A according to the present invention.
서열목록 3은 본 발명에 따른 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 위치의 단일 염기다형성을 검출을 위한 프라이머 SIV_M_wild forward primer 2의 염기서열이다.SEQ ID NO: 3 is a nucleotide sequence of primer SIV_M_wild forward primer 2 for detecting a single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of the new influenza A type H1N1 according to the present invention.
서열목록 4는 본 발명에 따른 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 위치의 단일 염기다형성을 검출을 위한 프라이머 SIV_M_mutant forward primer 2의 염기서열이다.SEQ ID NO: 4 is a nucleotide sequence of primer SIV_M_mutant forward primer 2 for detecting single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of H1N1 influenza A according to the present invention.
서열목록 5는 본 발명에 따른 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 위치의 단일 염기다형성을 검출을 위한 프라이머 SIV reverse primer 1의 염기서열이다.SEQ ID NO: 5 is a nucleotide sequence of a primer SIV reverse primer 1 for detecting a single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of the H1N1 influenza A according to the present invention.
서열목록 6은 본 발명에 따른 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 위치의 단일 염기다형성을 검출을 위한 프라이머 SIV reverse primer 2의 염기서열이다.SEQ ID NO: 6 is a nucleotide sequence of primer SIV reverse primer 2 for detecting a single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of the new influenza A type H1N1 according to the present invention.
서열목록 7은 본 발명에 따른 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 위치의 단일 염기다형성을 검출을 위한 프로브 SIV probe 1의 염기서열이다. SEQ ID NO: 7 is a nucleotide sequence of the probe SIV probe 1 for detecting a single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of the new influenza A type H1N1 according to the present invention.
서열목록 8은 본 발명에 따른 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 위치의 단일 염기다형성을 검출을 위한 프로브 SIV probe 2의 염기서열이다.SEQ ID NO: 8 is a nucleotide sequence of the probe SIV probe 2 for detecting a single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of the new influenza A type H1N1 according to the present invention.
서열목록 9는 본 발명에 따른 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 위치의 단일 염기다형성을 검출을 위한 프라이머 wild blocking primer의 염기서열이다.SEQ ID NO: 9 is a nucleotide sequence of a primer wild blocking primer for detecting a single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of the new influenza A type H1N1 according to the present invention.
서열목록 10은 본 발명에 따른 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 위치의 단일 염기다형성을 검출을 위한 프라이머 mutant blocking primer의 염기서열이다.SEQ ID NO: 10 is a nucleotide sequence of a primer mutant blocking primer for detecting a single nucleotide polymorphism of the Tamiflu resistant C823T position of the new influenza A type H1N1 according to the present invention.
서열목록 11은 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스 A/Korea/01/2009(H1N1)(NCBI GenBank No: GQ132185)의 염기서열이다.SEQ ID NO: 11 is a nucleotide sequence of influenza virus A / Korea / 01/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: GQ132185) according to the present invention.
서열목록 12는 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스 A/Denmark/528/2009(H1N1)(NCBI GenBank No: CY043352)의 염기서열이다.SEQ ID NO: 12 is a nucleotide sequence of influenza virus A / Denmark / 528/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: CY043352) according to the present invention.

Claims (10)

  1. 인플루엔자 바이러스 A/Korea/01/2009(H1N1)(NCBI GenBank No: GQ132185) 및 A/Denmark/528/2009(H1N1)(NCBI GenBank No: CY043352) 유전자 내 C823T SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출할 수 있는, 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 단일 염기다형성 판별형 프라이머 세트.C823T single nucleotide polymorphism (SNP) in influenza virus A / Korea / 01/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: GQ132185) and A / Denmark / 528/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: CY043352) genes Tamiflu resistant C823T single nucleotide polymorphism discriminative primer set of swine influenza type A H1N1.
  2. 제 1항에 있어서,The method of claim 1,
    상기 프라이머는 상기 인플루엔자 바이러스 A형 유전자 내 630 내지 1027번째 염기 내의 뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 단일 염기다형성 판별형 프라이머 세트.Tamiflu resistance C823T single nucleotide polymorphism discrimination primer set of the new influenza A type H1N1, characterized in that the primer consists of a polynucleotide or a complementary polynucleotide of the nucleotide within the 630 to 1027 base in the influenza virus type A gene.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,The method according to claim 1 or 2,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6, 9 및 10으로 기재된 프라이머로부터 선택된 2 이상의 프라이머가 혼합되어 이루어진 것을 특징으로 하는, 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 단일 염기다형성 판별형 프라이머 세트.The primer set is a mixture of two or more primers selected from the primers set forth in SEQ ID NOs: 1 to 6, 9, and 10, Tamiflu-resistant C823T single nucleotide polymorphism discriminative primer set of swine influenza A type H1N1.
  4. 제 3항에 있어서,The method of claim 3, wherein
    상기 프라이머 세트는 서열번호 1, 2, 9 및 10; 서열번호 3, 4, 9 및 10;으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 단일 염기다형성 판별형 프라이머 세트.The primer set comprises SEQ ID NOs: 1, 2, 9 and 10; Tamiflu resistant C823T single nucleotide polymorphism discriminative primer set of swine influenza A type H1N1, characterized in that at least one selected from SEQ ID NO: 3, 4, 9 and 10.
  5. 인플루엔자 바이러스 A/Korea/01/2009(H1N1)(NCBI GenBank No: GQ132185) 및 A/Denmark/528/2009(H1N1)(NCBI GenBank No: CY043352) 유전자 내 C823T SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출할 수 있는, 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 검출용 프로브.C823T single nucleotide polymorphism (SNP) in influenza virus A / Korea / 01/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: GQ132185) and A / Denmark / 528/2009 (H1N1) (NCBI GenBank No: CY043352) genes Probe for Tamiflu resistance detection of H1N1 influenza A.
  6. 제 5항에 있어서,The method of claim 5,
    상기 프로브는 서열번호 7, 서열번호 8로 기재된 프로브로부터 선택되는 1종 이상의 프로브인 것을 특징으로 하는, 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 단일 염기다형성 판별형 프로브.Tamiflu resistance C823T single nucleotide polymorphism discriminative probe of the new influenza type A H1N1, characterized in that the probe is at least one probe selected from the probes set forth in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8.
  7. 제 1항에 따른 프라이머 세트, 제 5항에 따른 프로브 또는 이들의 혼합 구성물을 포함하는, 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 단일 염기다형성 판별형 키트.Tamiflu resistance C823T single nucleotide polymorphism discrimination kit of swine influenza type A H1N1, comprising the primer set according to claim 1, the probe according to claim 5, or a mixed construct thereof.
  8. 제 7항에 있어서,The method of claim 7, wherein
    상기 혼합 구성물은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 10인 것을 특징으로 하는, 신종 인플루엔자 A형 H1N1의 타미플루 내성 C823T 단일 염기다형성 판별형 키트.Said mixed construct is SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, Tamiflu resistance C823T single nucleotide polymorphism discrimination kit of H1N1 influenza.
  9. 1) 검체를 주형으로, 제 1항에 따른 프라이머 세트, 제 5항에 따른 프로브 또는 이들의 혼합 구성물을 포함하는 키트를 이용하여 다형성 부위를 검출하는 단계; 및 1) detecting a polymorphic site using a kit comprising a sample set as a template, a primer set according to claim 1, a probe according to claim 5, or a mixed construct thereof; And
    2) 단계 1)에서 검출된 다형성 부위의 유무를 비교하는 단계;2) comparing the presence or absence of the polymorphic site detected in step 1);
    를 포함하는, 타미플루에 내성을 보이는 신종 인플루엔자의 판별방법.Determination method of swine flu showing resistance to Tamiflu, including.
  10. 제 9항에 있어서,The method of claim 9,
    상기 혼합 구성물은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 10인 것을 특징으로 하는, 타미플루에 내성을 보이는 신종 인플루엔자의 판별방법.Said mixed construct is SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, How to determine the influenza of swine influenza resistant to Tamiflu.
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