WO2012145814A2

WO2012145814A2 - Gene, cassete de ancoragem do mer-r, cassete de expressão-ancoragem do mer-r, plasmideo recombinante, linhagem transgênica bacteriana, uso do dito gene, uso da dita linhagem em processos de biorremediação ambiental

Info

Publication number: WO2012145814A2
Application number: PCT/BR2012/000126
Authority: WO
Inventors: Elisabete José VICENTE; Ana Clara Guerrini SCHENBERG; Carolina Angélica da Silva PARADA; Ronaldo BIONDO
Original assignee: Vale S.A.; Universidade De São Paulo - Usp
Priority date: 2011-04-29
Filing date: 2012-04-30
Publication date: 2012-11-01
Also published as: WO2012145814A9; BRPI1101557A2; WO2012145814A3

Abstract

A presente invenção refere-se à construção e inserção de um vetor de amplo espectro para bactérias Gram-negativas, possuindo uma sequência gênica que, ao ser expressa, permite a ancoragem de uma proteína quelante de íons de mercúrio na superfície celular de bactérias Gram-negativas. Para tanto, o gene regulatório merR foi isolado do plasmídeo pMOL30 de Cupriavidus metallidurans, linhagem CH34 (SEQ. ID N°1 ) e inserido em vetor de clonagem pGEMT, originando o plasmídeo PGEMT-Hg (SEQ. ID N° 2). O vetor de expressão, contendo a sequencia correspondente ao cassete para a expressão e ancoragem de proteínas heterólogas em bactérias Gram- negativas, sob o controle do promotor pan (SEQ. ID N° 3), derivado do plasmídeo pCM2, foi obtido por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). O gene merR foi fusionado ao vetor de expressão amplificado, resultando na construção do plasmídeo pCMHg (SEQ. ID N° 4). Adicionalmente, o presente pedido provê cepas mutantes de bactérias Gram-negativas contendo o dito plasmídeo recombinante, método de obtenção, além de relatar a possível utilização das cepas transgênicas para a adsorção de íons de mercúrio em processos de biorremediação ambiental.

Description

Relatório descritivo de patente de invenção para "GENE, CASSETE DE ANCORAGEM DO MER-R, CASSETE DE EXPRESSÃO-ANCORAGEM DO MER-R, PLASMIDEO RECOMBINANTE, LINHAGEM TRANSGÊNICA BACTERIANA, USO DO DITO GENE, USO DA DITA LINHAGEM EM PROCESSOS DE BIORREMEDIAÇÃO AMBIENTAL".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção destina-se à construção e inserção de um vetor de amplo espectro para bactérias Gram-negativas, possuindo uma sequência gênica que, ao ser expressa, permite a ancoragem de uma proteína quelante de íons de mercúrio na superfície celular de bactérias Gram-negativas. Adicionalmente, o presente pedido provê cepas mutantes de bactérias Gram- negativas contendo o dito plasmídeo recombinante, método de obtenção, além de relatar a possível utilização das cepas transgênicas para a adsorção de íons de mercúrio em processos de biorremediação ambiental.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A ocorrência natural do mercúrio é devido a processos biológicos tais como, atividade vulcânica, movimento de águas, presença em sedimentos e nas camadas profundas do solo (FADINI, 2001 ). Entretanto, a maior parte de mercúrio presente no meio ambiente é resultado de atividades antropogênicas variadas, as quais podem ser citadas: a combustão de combustíveis fósseis, atividade de hidrelétricas, mineração de ouro devido à sua propriedade de formar amálgama tornando possível a extração do ouro granulométrico dispersos nos sedimentos de fundo, manufatura de cimento, uso de pesticidas, incineração de termómetros e barómetros, monitores de pressão sanguínea, incineração de equipamentos médicos e odontológicos, despejo de efluentes industriais, descarte inadequado de lâmpadas fluorescentes do "lixo tecnológico", tais como, televisores, celulares, baterias, pilhas e componentes de informática {World Health Organization, 2007).

O mercúrio existe em várias formas: elementar ou metálica, inorgânica (ex. sais de mercúrio) e orgânica (ex. metil e etil-mercúrio), podendo ser encontrado em três estados de oxidação (0, +1 , +2). Todas essas formas têm diferentes toxicidades e implicações. O mercúrio elementar, no estado de oxidação Hg⁰, é um líquido com elevada volatilidade, podendo permanecer durante anos na atmosfera, ser transportado globalmente e, posteriormente, sedimentado em lagos, rios e baías. Quando se combina com elementos tais como o enxofre, o cloro e o oxigénio, obtêm-se compostos inorgânicos de mercúrio. Se os íons de mercúrio ligam-se covalentemente a pelo menos um átomo de carbono, obtêm-se compostos orgânicos de mercúrio, absorvidos por fitoplâncton, ingeridos por zooplâncton e acumulados nos peixes (PFEIFFER, 2007). Em seu caráter qualitativo, o complexo metil-mercúrio é mais tóxico, quando comparado ao mercúrio elementar (GARREL, 1975). São, portanto, inúmeras as variáveis que interferem na exposição do homem ao mercúrio, relacionadas tanto ao comportamento do metal pesado no ambiente, quanto à cadeia trófica.

De acordo com os valores estabelecidos pela Organização Mundial de Saúde (OMS), a concentração de mercúrio total não deve ultrapassar 1 g/ na água a ser ingerida (WHO, 2004), 1 pg/m³ (média anual) no ar (WHO, 2000). No caso da inalação de vapor de mercúrio elementar, a exposição tolerável em longo prazo não deve ser superior a 0,2 pg/m³ (IPCS / WHO, 1990).

O primeiro maior impacto humano causado pela presença de Hg foi relatado no Japão, em 1956. Este episódio foi conhecido como o Desastre de Minamata, região onde 2.955 pessoas sofreram o envenenamento e cerca de 900 pessoas morreram com doses severas de contaminação (KINJO, 1993; FUKUDA, 1999; GEORGE, 2010). Entretanto, como exposto a seguir, estudos revelam casos de contaminação com Hg em nível mundial.

No Brasil, a contaminação com mercúrio tem merecido destaque, especialmente na região norte do país, onde a mineração é intensa. Estudos relatam a presença de mercúrio orgânico nas regiões do Pará (COUTO, 1988; SANTOS, 2003); Rondônia (BOISCHIO, 1991 ); Amazónia (SANTOS, 1992; GARDNER, 2010); porém também no Mato Grosso (OLIVEIRA; HACON, 1990); Rio de Janeiro, (MOLISANI, 2006; MACHADO, 2008) e em Minas Gerais (RAPOSO, 2001). Devido à intensa atividade de mineração na região norte, populações e ecossistemas de países próximos, como a Bolívia (BARBIERI, 2009); Suriname (VEIGA, 2010); Guiana Francesa (BOURDINEAUDI, 2008) e Peru (GAMMONS, 2007), apresentam contaminação mercurial. Outros países latino-americanos afetados incluem a Argentina (MARCOVECCHIO, 1994); Porto Rico (PÉREZ-COMAS, 1991 ); Chile (BRUHN, 1995); Venezuela (ROJAS, 2007); Colômbia (OLIVERO, 1995); México (WYATT, 1998); e Equador (TARRAS-WAHLBERG, 2001 ).

Analisando-se o norte do continente americano, as áreas contaminadas encontram-se na Groelândia (WEISS, 1971 ); no Golfo do Maine, costa nordeste da América do Norte (CHEN, 2009); Estados Unidos da América (WALTER, 1973; PHILLIPS, 1980; YOUNG, 1981 ; DUKERSSCHEIN, 1992; GUSTIN, 1995; MILLS, 1994; TCHOUNWOU, 1996; HEATON-JONES, 1997; WALTERS, 2010); e no Canadá (ELLIOT, 1990-1994 / 1996).

Na Ásia, quantidades significativas de mercúrio total e metíl-mercúrio foram constatadas na China (CHAI, 1994); Taiwan (JENG, 1995); Coréia (LEE, 1999); Bangladesh (HOLSBEEK, 1996); Filipinas (APPLETON, 1999); Cazaquistão (HEAVEN, 2000); Tailândia (MUENHOR, 2009); índia (RAMA, 2009); Irã (EBRAHIMI, 2009) e Cambodia (AGUSA, 2005).

No continente europeu, destacam-se a Áustria (UDERMANN, 1978); Roménia (BRAVO, 2010); Eslováquia (KOTTFEROVÁ, 1995); República Tcheca (SVOBODOVÁ, 1999); Alemanha (Offentl Gesundheitswes. 46(1 ): 41-5, 1984); Itália (BUGGIANI, 1980); França (VERGER, 2007); Grécia (CHRISTOFORIDIS, 2008); Croácia (BLANUSA, 2001 ); Espanha (NAVARRO, 1993); Portugal (GAGGI, 1996); Finlândia (HYNNINEN, 1986; LUOMA, 1992); Noruega (SKAARE, 1990); Polónia (WOJCIECHOWSKA-MAZUREK, 1996); Suécia (OSKARSSON, 1994) e Luxemburgo (BOSCHER, 2010). Na Eurásia, a Geórgia e a Turquia são as regiões mais atingidas (GARIBOLD, 1998; GEMICI, 2008).

A Tanzânia e Zimbabué (VAN STRAATEN, 2000); África do Sul (PAPU- ZAMXAKA, 2009); Tunísia (CHAARI, 2009); Costa do Marfim (AVOAKA-BONI, 2007) e Gana também apresentam contaminação mercurial (AGORKU, 2009).

Na Oceania, elevados níveis de Hg foram encontrados em Papua Nova

Guiné (ABE, 1995); Nova Zelândia (CRUMP, 1998); Indonésia, Nova Caledônia (CHOUVELON, 2009) e Austrália (CHURCHILL, 2004). Publicações relatam a presença de mercúrio total e metilmercúrio também no Oriente Médio, em especial, na Bacia do Kuwait (BUTAYBAN, 2004).

O potencial tóxico do mercúrio ao organismo humano é diverso. O sistema nervoso central é o principal órgão atingido. Sintomas clínicos em adultos incluem parestesia, ataxia e disartria, além de distúrbios visuais e auditivos. A inalação de vapor de mercúrio produz efeitos letais nos sistemas imune e digestivo, pulmões e rins. Sais inorgânicos de mercúrio são corrosivos quando em contato com a pele e olhos, além de induzir toxicidade gastrointestinal e nos rins, se ingerido. O mercúrio orgânico ultrapassa facilmente a barreira placentária, sendo o feto, mais sensível a menores concentrações. O quadro clínico de crianças geradas sob tais exposições incluem microcefalia, hiperreflexia, deficiência visual, auditiva, motora e mental. A ocorrência de sintomas clínicos em crianças e adultos é dose-dependente. (IPCS / WHO, 1990). Devido à sua toxicidade e persistência na natureza, é evidente, portanto, que os níveis de Hg precisam ser controlados no ambiente, obrigando as fontes produtoras a tratar seus resíduos, o que requer o desenvolvimento de novas legislações para controle e recentes tecnologias de tratamento.

No Brasil, a legislação ambiental estabelece parâmetros físicos, químicos e microbiológicos de qualidade da água, a fim de regular o lançamento de efluentes em corpos receptores (Resolução 357/2005).

A Lei n° 9.605, de 12 de fevereiro de 1998 dispõe sobre as sanções penais e administrativas derivadas de condutas e atividades lesivas ao meio ambiente. Apesar das legislações vigentes no Brasil, muitos cursos d'água do nosso país apresentam alto potencial mutagênico devido à presença de contaminantes tóxicos como metais pesados, descartados inadvertidamente (OHE, 2004).

Nos Estados Unidos, a Food and Drug Administration (FDA) estabelece as concentrações seguras de presença de mercúrio em frutos do mar disponíveis ao consumo humano (US-FDA, 2006/ 2010). Naquele país, as medidas, inspeção, relatórios de emissão, legislação e regulação estabelecendo os níveis de íons Hg²⁺ no ar, solo, vegetação e águas são realizados pela United States Environmental Protection Agency (EPA).

Na União Européia, a preocupação com os níveis de contaminação aliada à escassez de recursos hídricos forçou o aperfeiçoamento da legislação ambiental, limitando a descarga de contaminantes tóxicos de águas residuais, incluindo metais pesados, obrigando os diversos segmentos produtivos a aplicar tecnologias avançadas de tratamento (REMOUDAKI, 2003).

A busca por processos que utilizem "tecnologias limpas" vem crescendo nas últimas décadas devido, principalmente, ao aprimoramento de regras legislativas, que incentivam o desenvolvimento de procedimentos físico- químicos e biotecnológicos que contribuam para a minimização dos impactos causados pela liberação de mercúrio.

O tratamento clássico de efluentes contendo metais pesados em geral, envolve processos físico-químicos de precipitação, troca iônica, adsorção e extração por solventes. Geralmente, processos subsequentes, como sedimentação e filtração, são necessários para que a água tratada seja recuperada. Contudo, essas técnicas tradicionais são inadequadas para a descontaminação de grandes volumes de efluentes, devido à baixa eficiência operacional e aos elevados custos (GAVRILESCU, 2004; LLOYD, 2001 ; REMOUDAKI, 2003).

Métodos alternativos, como o emprego de microrganismos e plantas, para a retirada de metais pesados de águas de rios e aterros apresentam baixos custos e alta eficiência e, portanto, têm sido mais atrativos do que os físico-químicos (GADD, 1992; MACASKIE, 1990; WATANABLE, 1997).

A fitorremediação é definida como o uso de plantas para remover metais pesados e/ou detoxificá-los a subprodutos menos perigosos. Esta técnica envolve o uso de plantas tolerantes ao poluente alvo e aproveita a habilidade natural destas plantas em absorver e concentrar estes elementos em seus tecidos, especialmente raízes, a partir de ambientes aquáticos ou solos, imobilizando-os e, consequentemente, limitando a sua difusão no ambiente (DUSHENKOV, 1999; KRAMER, 2005). Apesar de esta técnica apresentar baixos custos, mostra, porém, várias limitações, tais como: (i) baixos níveis de contaminantes não podem ser extraídos pelas plantas, (ii) plantas não crescem em ambientes com altos níveis de contaminação, (iii) trata-se de um processo remediador de longo prazo e (iv) há risco da planta entrar na cadeia alimentar (DINARDI, 2003; SURESH, 2004). Portanto, o estudo de processos mais eficientes tem focado o uso de microrganismos, que podem ser altamente resistentes aos contaminantes e realizar a biorremediação de mercúrio de forma simples, pouco onerosa, e em curto prazo.

A biorremediação é realizada empregando-se microrganismos cuja interação com íons de metais pesados vem ocorrendo desde o início da vida no planeta, há 4 bilhões de anos, o que permitiu a evolução de sistemas biológicos de resistência para garantir sua sobrevivência em ambientes contendo elevadas concentrações de mercúrio e outros metais pesados (SILVER, 2005; VALLS, 2002). Uma vez dentro da célula, o metal, em concentrações acima dos limites fisiológicos, causa diversos danos, tais como, inibição da transcrição, da tradução, da divisão celular e de atividade enzimática (ROANE, 2000).

A toxicidade do mercúrio, aliada à captação constante desses íons pelas células, forçou o desenvolvimento de sistemas de homeostase para proteção contra danos e manutenção da sobrevivência. Como o mercúrio não pode ser degradado, três mecanismos de resistência se estruturaram ao longo da evolução: bombas de efluxo, biossorção em moléculas contendo grupamentos tióis (SH) e mudança do estado de oxidação do íon para um estado oxidativo menos tóxico (NIES, 1999; SILVER, 2005).

Devido ao desenvolvimento natural desses mecanismos de resistência, tornou-se possível a utilização de diferentes microrganismos em estratégias de biorremediação de ambientes contendo íons Hg²⁺, pois possuem capacidade de colonizar tais ambientes e atuar como poderosas ferramentas biotecnológicas em projetos de biorremediação.

Cupriavidus metallidurans CH34 é uma bactéria adaptada a ambientes contendo altas concentrações de metais, incluindo o mercúrio e, de fato, viceja nesse tipo de ambiente (DIELS, 1990). A linhagem hoje conhecida como C. metallidurans CH34 já recebeu, no passado, vários diferentes nomes: Alcaligenes eutrophus CH34 (MERGEAY, 1978); Ralstonia eutropha CH34 (YABUUCHI, 1995); Ralstonia metallidurans CH34 (GORIS, 2001 ); Wautersia metallidurans CH34 (VANEECHOUTTE, 2004); até receber o seu nome atual Cupríavidus metallidurans CH34 (VANDAMME, 2004). C. metallidurans CH34 é uma β-proteobactéria, Gram-negativa, não patogênica, capaz de crescer em elevadas concentrações de, pelo menos, treze diferentes metais pesados (MONCHY, 2006). Esta linhagem bacteriana foi primeiramente isolada em sedimentos de tanques de decantação de zinco em Liège, Bélgica, em 1978 (MERGEAY, 1978; MERGEAY, 2003). Possui alta resistência aos íons Ag²⁺, Bi²⁺, Cd²⁺, Co²⁺, Cr0₄-², Cu²⁺, Hg²⁺, Mn²⁺, Ni²⁺, Pb²⁺, Se0₄ ³, Tl¹⁺ e Zn²⁺, conferidas por pelo menos 150 genes de resistência, presentes em seus quatro replicons: o cromossomo (3,9 Mb), o megaplasmídeo (2,6 Mb) e os dois plasmídeos pMOL30 (234 Kb) e pMOL28 (171 Kb) (MERGEAY, 2003; MONCHY, 2006; TAGHAVI, 1997). O genoma deste microrganismo já foi inteiramente sequenciado pelo Joint Genome Institute, Califórnia-USA e os resultados estão disponíveis no banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI).

A análise genômica de C. metallidurans CH34 permitiu a identificação de grande parte dos genes que codificam o seu repertório protéico. Foram identificadas 6985 proteínas, das quais 4072 foram consideradas citoplasmáticas e 2913 transmembranares. Comparada a outros procariotos, C. metallidurans CH34 apresenta grande proporção de proteínas de membrana de todos os tipos topológicos (PAULSEN, 2000; VON ROZYCKI, 2005). Nesse microrganismo, foram identificadas 932 proteínas relacionadas ao transporte, das quais 300 estão envolvidas no transporte de compostos inorgânicos, 400 no transporte de compostos orgânicos, 102 no transporte de macromoléculas e 130 no transporte de diversos compostos, sendo que 94 proteínas interagem com especificidade a íons de metais (VON ROZYCKI, 2005).

Entende-se que a estruturação da rede de detoxificação, responsável pela alta resistência a íons metálicos de C. metallidurans CH34, deveu-se à transferência gênica horizontal e à atividade de elementos transponíveis (ISs) (TAGHAVI, 1997; VON ROZYCKI, 2005). De fato, o genoma da C. metallidurans CH34 é rico em sequências de inserção IS (48 ISs identificados), assim como em transposons da família Tn3 e Tn2í (DONG, 1992; MERGEAY, 2003; TAGHAVI, 1997; MONCHY, 2004).

Outro sistema, que conferiu uma vantagem evolutiva a C. metallidurans CH34, é a existência do mecanismo parA e parB, pelo qual essa bactéria conserva os dois plasmídeos ricos em genes de resistência, pMOL30 e pMOL28, garantindo estabilidade segregacional e a sobrevivência em ambientes contendo metais (TAGHAVI, 1996; VON ROZYCKI, 2005).

Por fim, a análise genômica permitiu a identificação de 17 possíveis proteínas com similaridade a fatores sigma. Em Escherichia coli, por exemplo, apenas sete fatores sigma estão disponíveis para a ligação com o núcleo da RNA-polimerase e controle do início da transcrição nas diferentes fases da vida da célula. O alto número de fatores sigma existentes em C. metallidurans CH34 indica a existência de um alto grau de complexidade na regulação da expressão de suas proteínas (NIES, 2004).

C. metallidurans CH34 é uma bactéria mesofílica, quimiolitotrófica facultativa, capaz de crescer autotroficamente em meio mineral e em diferentes concentrações de H₂, 0₂ e C0₂. Apresenta crescimento heterotrófico em uma variedade de compostos orgânicos como gluconato, succinato, malato, lactato, piruvato, acetato, hexanoato, benzoato, formato, glicerol, n-butanol, n-propanol, fenol, histidina, treonina, triptofano, prolina, glicina, entre outros. No entanto, não é capaz de assimilar CO, CH₄, glicose, frutose e outros açúcares. Além disso, sob restrição de N₂, acumula mais de 15% do seu peso em poli-3- hidroxibutanoato (PHB) (STEINBÚCHEL, 1983; MERGEAY, 1985). Por meio de análise genômica, foi possível mostrar que essa bactéria possui 41 sistemas de transporte específicos para carboidratos e 110 sistemas de transporte específicos para aminoácidos, sugerindo que, nesta bactéria, o metabolismo de aminoácidos pode ser mais importante do que o de carboidratos, para o crescimento heterotrófico (VON ROZYCKI, 2005).

O fato dos sistemas de transporte de vários metais pesados terem sido mais estudados e melhor caracterizados nessa bactéria do que em qualquer outra, confere a C. metallidurans CH34 a condição de organismo modelo para pesquisas de resistência a metais e homeostase (VON ROZYCKI, 2005; NIES, 2006).

O plasmídeo pMOL30 possui 5 operons: (i) czc - relacionado à resistência a íons Cd²⁺, Zn²⁺ e Co²⁺, (ii) pbr - relacionado à resistência a íons Pb²⁺, (iii) cop - relacionado à resistência a íons Cu²⁺, (iv) mer - relacionado à resistência a íons Hg²⁺, (v) sil - relacionado à resistência a íons Ag⁺. (TAGHAVI, 1997; MERGEAY, 2003.)

O plasmídeo pMOL28 possui 3 operons: (i) cnr - relacionado à resistência a íons Co²⁺ e Ni²⁺, (ii) mer - relacionado à resistência a íons Hg²⁺ e (iii) chr - relacionado à resistência a íons Cr0₄ ^2" (TAGHAVI, 1997; MERGEAY, 2003.)

O megaplasmídeo, por sua vez, possui o gene de uma ATPase - zntA - relacionada à resistência a íons Cd²⁺, Zn²⁺, Bi²⁺ e Tl¹⁺, um sistema RND (de resistência, nodulação e divisão celular) de resistência a íons Ag⁺ e Cu²⁺, além de parte do operon cop de resistência a Cu²⁺ (TAGHAVI, 1997; MERGEAY, 2003).

O cromossomo carrega uma multiplicidade de resistências: ATPases (CadA, CupA, ArsBC), sistemas RND (CzcCBA), CDF (facilitadores de difusão de cátions -DmeF e FieF), e redutase de mercúrio (TAGHAVI, 1997; MERGEAY, 2003).

O principal mecanismo de resistência de C. metallidurans ao mercúrio, consiste num sistema expresso pelo operon mer da bactéria que está presente no cromossomo e nos dois plasmídeos pMOL28 e pMOL30. No plasmídeo pMOL30 o operon mer está em um transposon (Tn4380), possuindo os genes merR, merT, merP, merA, merD e merE; adicionalmente esse plasmídeo carrega também uma região com genes merPTR que não são funcionais (TAGHAVI, 1997; MERGEAY, 2003.)

O operon mer do plasmídeo pMOL28 apresenta grande homologia e a mesma disposição dos genes do operon mer do plasmídeo pMOL30, e também faz parte de um transposon (Tn4378) (CHAMPIER, 2004; MERGEAY, 1985). No cromossomo, o operon é composto pelos genes merR, merT, merP, merA. O mecanismo de resistência bacteriano a mercúrio é principalmente devido à redução de íons Hg²⁺ a mercúrio metálico (Hg⁰), que é um elemento volátil, capaz de se difundir passivamente para o exterior da célula (SILVER, 2005). O gene merP codifica uma proteína periplasmática (MerP), capaz de se ligar especificamente a íons Hg⁺² e transportá-los à proteína de membrana MerT, cuja função é transferir o íon Hg²⁺ diretamente à redutase de mercúrio MerA (CHAMPIER, 2004; ROSSY, 2004). A regulação da expressão desse operon é realizada pelas proteínas MerR e MerD. MerD não se liga a DNA, mas interage com o complexo MerR-promotor-operador, sendo um co-regulador da indução do operon. Na falta de íons de Hg²⁺, forma-se um complexo ternário entre MerR, MerD e a região do promotor-operador, reprimindo a expressão dos genes do operon. Na presença de íons de Hg²⁺, MerR se liga a esse íon, e é então deslocado da região do promotor-operador pela ação de MerD, o que permite a expressão dos genes do operon; no entanto, a falta de MerD (ausência do gene merD) não impede a expressão dos genes de resistência Hg²⁺ desse operon (CHAMPIER, 2004). A proteína MerE, por sua vez, não tem função conhecida (SILVER, 2005).

Portanto, o mecanismo de resistência de C. metallidurans a íons Hg ⁺ consiste no efluxo dos cátions e subsequente redução a Hg⁰, que é volatilizado. Isto promove a detoxificação do citoplasma da bactéria, mas não a descontaminação do meio ambiente externo; e, portanto, não é naturalmente adequado para a biorremediação. Assim, para que este microrganismo pudesse desenvolver plenamente o seu potencial biotecnológico, faz-se necessário submetê-lo a manipulações genéticas que lhe confiram a capacidade de imobilizar íons de mercúrio na sua superfície celular.

O uso de proteínas naturais de superfície como uma ferramenta para ancoragem de proteínas heterólogas ("cell surface display") vem apresentando ampla aplicação nas diferentes áreas da ciência. Por meio desta estratégia, diversos peptídeos foram ancorados na superfície de diferentes bactérias com várias finalidades, como a produção de anticorpos, biocatalizadores, biorremediadores, entre outros (WERNÉRUS, 2004).

No caso da biorremediação, recentemente a literatura tem mostrado que microrganismos recombinantes, cuja superfície celular foi enriquecida com proteínas quelantes de metais, apresentam capacidade superior de adsorção de íons metálicos, quando comparados com as linhagens não recombinantes, constituindo, portanto, uma estratégia biotecnológica para desenvolvimento de agentes biorremediadores de grande potencial (SOUSA, 1998; KOTRBA, 1999; BAE, 2000; VALLS, 2000; BAE, 2001 ).

Várias estratégias podem ser utilizadas para ancorar peptídeos na membrana externa de bactérias Gram-negativas: inserções de genes nas sequências codificadoras de estruturas celulares, como flagelos, pili, proteínas de membrana externa ou, ainda, utilizando o mecanismo de secreção de proteínas autotransportadoras, como é o caso do sistema de secreção da protease da imunoglobulina A (IgA) da bactéria Neisseria gonorrhoeae (WERNÉRUS, 2004).

Os autores Klauser e seus colaboradores (KLAUSER, 1990) foram os primeiros a adaptar o sistema natural de secreção da IgA protease de N. gonorrhoeae para a ancoragem de peptídeos na superfície de outras bactérias. Esses pesquisadores utilizaram partes do sistema de secreção da IgA protease para a ancoragem do domínio β da toxina da cólera (ctxB) na superfície celular de Salmonella typhimurium (CtxB). Para tanto, a sequência gênica correspondente ao domínio cfxB foi clonada entre as sequências codificadoras do peptídeo sinal (PS) e a do β-domínio do sistema de secreção da IgA protease de N. gonorrhoeae e, após a expressão da construção, estes autores verificaram que o peptídeo CtxB estava exposto na superfície celular do microrganismo. A partir de então, diferentes peptídeos foram ancorados na membrana externa de bactérias Gram-negativas (E. coli, C. metallidurans, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, S. typhimurium, P. putida) por intermédio desse sistema (WERNÉRUS, 2004).

Considerando que Valls e colaboradores (VALLS, 2000) conseguiram realizar a ancoragem da metalotioneína de camundongo na membrana externa de C. metallidurans CH34, utilizando o sistema de secreção da IgA protease de Neisseria gonorrhoeae, essa estratégia foi adotada no presente trabalho, como meio de enriquecer a superfície de C. metallidurans CH34 com peptídeos com superior capacidade de adsorver íons de mercúrio. Os organismos, de modo geral, defendem-se da presença de íons de metais pesados através da síntese de peptídeos capazes de ligar-se aos íons metálicos, seqiiestrando-os sob uma forma biologicamente inativa (BAE, 2000; MEJÁRE, 1995).

Diversos peptídeos com estas propriedades têm sido utilizados como adsorventes de íons de metais pesados em estratégias de biorremediação (KOTRBA, 1999; MEJÁRE, 2001 ; SOUSA, 1998).

Bae e colaboradores (BAE, 2000) desenvolveram uma estratégia que se baseou na obtenção de uma proteína análoga à fitoquelatina natural, ou seja, com a mesma sequência de aminoácidos; no entanto, sem a utilização de rotas enzimáticas ou moléculas precursoras, como é o caso das PCs, mas sim, pela expressão de um único gene codificador da sequência de interesse (BAE, 1997; BAE, 2001 ). Desta forma, foram construídos genes codificadores de sequências protéicas que continham 8, 11 e 20 repetições de ácido glutâmico e cisteína, denominadas fitoquelatinas sintéticas (ECs) (BAE, 2000). A EC com 20 repetições de ácido glutâmico e cisteína na cadeia peptídica (EC20) apresentou afinidade por íons de metais pesados de forma análoga à PC natural e muito superior às metalotioneínas. Entretanto, esses peptídeos não têm demonstrado eficiência em relação à captação de íons de mercúrio (BONTIDEAN, 1998).

Por outro lado, a proteína metaloregulatória MerR, presente no operon mer de bactérias Gram-negativas, é conservada entre as espécies e consiste em um dímero, sendo considerada o ligante de íons Hg²⁺ de maior afinidade já relatado na literatura (SHEWCHUK, 1989; SUMMERS, 1992; CHAMPIER, 2004). A proteína MerR em bactérias Gram-negativas geralmente é composta por três domínios: o N-terminal, composto pelos resíduos 10 a 29 responsável pela ligação com DNA, o C-terminal, envolvendo os resíduos 82 ao 126, que possui o sítio de ligação com o mercúrio e uma porção intermediária de função desconhecida (SUMMERS, 1992). De acordo com Song et al (2004) a alta afinidade e especificidade do MerR à íons de mercúrios devem-se à presença de três resíduos de cisteínas conservados, presentes no domínio C-terminal do dímero MerR, que constituem um sítio trigonal coordenado (SONG, 2004). Apesar da ocorrência natural do mercúrio, a maior parte das elevadas concentrações do metal encontradas no meio ambiente é resultado das atividades antrópicas variadas, as quais podemos citar a combustão de combustíveis fósseis, atividade de hidrelétricas, mineração de ouro devido à sua propriedade de formar amálgama tornando possível a extração do ouro granulomérico dispersos nos sedimentos de fundo, manufatura de cimento, uso de pesticidas, incineração de termómetros e barómetros, monitores de pressão sanguínea, incineração de equipamentos médicos e odontológicos, despejo de efluentes industriais, descarte inadequado de lâmpadas fluorescentes do "lixo tecnológico", tais como, televisores, celulares, baterias, pilhas e componentes de informática (WHO, 2007).

O uso de microrganismos capazes de sequestrar metais pesados do meio ambiente contaminado com mercúrio tem recebido uma considerável atenção. Uma grande diversidade de proteínas e peptídeos capazes de se ligar a metais pesados já foi encontrada em sistemas de tolerância microbianos e estas estruturas têm sido utilizadas ancoradas à superfície celular de bactérias geneticamente modificadas para a sua aplicação na biorremediação ambiental (BAE, 2001 ; VALLS, 2000).

Tanto as Metalotioneínas e Fitoquelatinas (por exemplo, a EC20) têm sido amplamente utilizadas na construção de bactérias geneticamente modificadas onde sua expressão na superfície da célula demonstrou melhor captação e bioadsorção de metais pesados em ambientes contaminados (BAE, 2001 ; VALLS, 2000). Entretanto, a mesma eficiência não foi visualizada para a captação do íon Hg²⁺ (BONTIDEAN, 1998). A partir destas observações e sabendo-se que o mercúrio é um dos metais pesados mais tóxicos e ainda é lançado em grandes quantidades na natureza por atividades humanas em todos os lugares do mundo, torna-se necessária a construção de bactérias especialmente desenhadas para a biorremediação de íons Hg²⁺.

O documento de patente PI 0801282-2 descreve a construção de uma linhagem de C. metallidurans CH34 capaz de ligar metais em sua superfície. Para tanto, os inventores dotaram esta bactéria de um sistema genético que permite a ancoragem na superfície desta bactéria da proteína EC20, sintetizada in vitro, utilizando o peptídeo sinal e o domínio de ancoragem do sistema de secreção da IgA protease de Neisseria gonorrhoeae e a expressão do sistema sob o controle do promotor pan de Bacillus subtilis (RIBEIRO-DOS- SANTOS, 2010).

Tendo em vista tais tecnologias disponíveis, e ainda os inconvenientes e limitações percebidos em ensinamentos anteriores, os Depositantes, desenvolveram um plasmídeo recombinante contendo o gene merR do plasmídeo pMOL30 de C. metallidurans CH34 fusionado em cassete gênico para expressão e ancoragem de proteínas heterólogas, sob regulação do promotor pan, com a finalidade de quelar mercúrio presente do ambiente e suas ditas linhagens bacterianas Gram-negativas.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

É objetivo da presente invenção a construção de um plasmídeo recombinante possuindo uma sequencia gênica que, ao ser expressa, permite a ancoragem de uma proteína quelante de metais na superfície celular de bactérias Gram-negativas.

Ainda, são objetos da presente invenção linhagens bacterianas Gram- negativas contendo o dito plasmídeo recombinante para potencial uso na adsorção de íons Hg²⁺ em processos de biorremediação ambiental.

Ademais, a invenção provê um gene merR.

É, ainda, objeto da presente invenção, a obtenção de um vetor de expressão contendo cassete gênico com sequencia codificadora de um peptídeo sinal.

Adicionalmente, a presente invenção provê um plasmídeo recombinante pCMHg portador do cassete de ancoragem do merR.

Além disso, a presente invenção descreve linhagens transgênicas derivadas de algumas bactérias Gram-negativas contendo o plasmídeo recombinante pCMHg.

A presente invenção tem por finalidade desenvolver cepas mutantes de bactérias Gram-negativas com potencial para a descontaminação de ambientes contendo mercúrio.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A figura 1 A (painel A) mostra o DNA total de C. metallidurans previamente extraído, que foi utilizado como DNA molde para a obtenção do gene merR através de ensaio de PCR.

A figura 1 B (painel B) demonstra o fragmento de 454 pares de bases obtido por PCR, correspondente ao gene merR de C. metallidurans CH34.

A seguir, o gene merR clonado no vetor de clonagem pGEMT, originado o plasmídeo pGEMT-Hg. A figura 2 A (painel A) demonstra o esquema representativo da construção do plasmídeo PGEMT-Hg que, após digestão enzimática com as enzimas Xbal e Sa//, liberou um fragmento com extremidades coesivas. A figura 2 B (painel B) demonstra a confirmação da construção através de análise de restrição.

A figura 3 apresenta esquema representativo da construção do plasmídeo pCMHg.

As figuras 4A e 4B mostram os perfis de proteínas totais visualizados em SDS-PAGE com coloração de "Coomassie Blue R250".

A figura 5A apresenta o fracionamento protéico de E. coli UT5600 e E. coli UT5600/pCMHg, em Fração Solúvel (FS), Membrana Interna (Ml) e Membrana Externa (ME), visualizados em SDS-PAGE com coloração de "Coomassie Blue R250". A figura 5B, demonstra respectivo ensaio imunoenzimático das diferentes frações celulares após incubação com anticorpo anti-E-tag (GE Life Sciences).

A figura 6A, apresenta o fracionamento protéico de E. coli BL21 (DE3) e E. coli BL21 (DE3)/pCMHg, em Fração Solúvel (FS), Membrana Interna (Ml) e Membrana Externa (ME), visualizados em SDS-PAGE com coloração de "Coomassie Blue R250". A figura 6B, demonstra respectivo ensaio imunoenzimático das diferentes frações celulares após incubação com anticorpo anti-E-tag (GE Life Sciences).

A figura 7A mostra o fracionamento protéico de C. metallidurans CH34 e C. metallidurans CH34/pCMHg, em Fração Solúvel (FS), Membrana Interna (Ml) e Membrana Externa (ME), visualizados em SDS-PAGE com coloração de "Coomassie Blue R250". A figura 7B demonstra respectivo ensaio imunoenzimático das diferentes frações celulares após incubação com anticorpo anti-E-tag (GE Life Sciences).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção destina-se à construção de . um plasmídeo recombinante possuindo uma sequência gênica que, ao ser expressa, permite a ancoragem de uma proteína quelante de metais na superfície celular de bactérias Gram-negativas. Para tanto, o gene merR de SEQ. ID N°1 foi isolado do plasmídeo pMOL30 e C. metallidurans CH34 e fusionado à sequência codificadora do sistema de secreção da IgA protease de Neisseria gonorrhoeae, resultando no plasmídeo pCMHg (SEQ. ID N° 2), sob o controle do promotor pan (SEQ. ID N° 3). Adicionalmente, o presente pedido provê linhagens bacterianas Gram-negativas contendo o dito plasmídeo recombinante para potencial uso na adsorção de íons Hg²⁺ em processos de biorremediação ambiental.

Em uma primeira realização, a invenção provê um gene merR obtido in vitro sem o códon de terminação de síntese protéica de SEQ. ID N°1.

Em uma segunda realização, o presente pedido consiste na obtenção de um vetor de expressão contendo cassete gênico com sequência codificadora de um peptídeo sinal, a sequência codificadora do gene merR, a sequência codificadora de um E-tag e a sequência codificadora de um β-domínio (cassete de ancoragem do merR).

Em uma terceira realização, a invenção provê um plasmídeo recombinante pCMHg portador do cassete de ancoragem do merR sob o controle de expressão do promotor pan (cassete de expressão-ancoragem do merR)

Adicionalmente, o pedido de patente refere-se também às linhagens transgênicas derivadas das bactérias Escherichia coli UT5600, Escherichia coli BL21 (DE3), Cupriavidus metallidurans CH34, e outras bactérias Gram- negativas como estas, contendo o plasmídeo recombinante pCMHg, que podem ser microrganismos com potencial para serem utilizadas na remoção de íons de mercúrio do meio ambiente devido à presença da proteína MerR na sua superfície celular. A invenção tem por finalidade desenvolver cepas mutantes de bactérias Gram-negativas com potencial para a descontaminação de ambientes contendo mercúrio. A modificação genética introduzida nestas linhagens confere-lhe a capacidade de produzir uma proteína quelante de mercúrio de alta afinidade (MerR) e, a seguir, secretar esta proteína através das membranas interna e externa, ficando finalmente a proteína ancorada na membrana externa das bactérias. As bactérias, assim recoberta por proteínas MerR, podem funcionar como um ímã para os íons Hg²⁺ podendo ser aplicadas em novos processos de remediação. Em etapa subsequente, os metais adsorvidos poderão ser recuperados, por acidificação ou incineração das bactérias.

A presente invenção consiste na construção de cepas mutantes de bactérias Gram-negativas com membrana externa enriquecida por proteínas MeR para serem utilizadas em processos de biorremediação de mercúrio. As várias etapas de manipulação de DNA, amplificação de DNA, transformação genética de bactérias, purificação e análise de DNA e de proteínas, e ensaios imunoenzimáticos, foram executados de acordo com o manual Sambrook J. e Russell, D.W. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. New York, Cold Spring Harbor Press, 2001.

Para tanto, o gene merR foi amplificado a partir do plasmídeo pMOL30 da bactéria C. metallidurans CH34 selvagem através de técnica de PCR. O fragmento foi inserido em vetor de clonagem pGEMT, gerando o plasmídeo recombinante pGEMT-Hg que foi isolado dos transformantes selecionados e submetido à digestão enzimática com Xba\ISal\ para a liberação do gene merR com extremidades coesivas específicas.

O vetor de expressão escojhido contém o completo cassete de ancoragem para a expressão de proteínas na superfície celular, além de possuir o promotor pan de Bacillus subtilis que demonstrou ter a capacidade de expressar elevados níveis de proteínas recombínantes em E. coli sem a necessidade da adição de um indutor, além de promover expressão protéica aumentada em C. metallidurans na presença de íons metálicos (RIBEIRO- DOS-SANTOS, 2010). A obtenção deste vetor de expressão foi também realizada mediante reação de PCR. Após reação de ligação, o gene merR foi inserido no vetor, originando o plasmídeo recombinante pCMHg que foi inserido na bactéria E. coli DH5a, empregando-se a técnica de transformação genética bacteriana. A construção do plasmídeo recombinante PCMHg foi confirmada por análise de restrição e sequenciamento.

A partir da confirmação da construção do PCMHg, este foi introduzido nas bactérias Gram-negativas E. coli UT5600, E. coli BL21 (DE3) e C. metallidurans CH34, por transformação bacteriana. Células dessas linhagens, selvagem e recombinante, sendo estas últimas hospedeiras do plasmídeo pCMHg, foram cultivadas na ausência de indutor e a expressão do cassete de ancoragem foi verificada através de SDS-PAGE, comparando-se o perfil protéico de cada linhagem. O gene do β-domínio do mecanismo de secreção codifica uma proteína de 45 kDa (VEIGA, 2004), e o gene do merR, do plasmídeo pMOL30 de C. metallidurans CH34, uma proteína de 15,8 kDa, que somadas formam uma proteína híbrida de 60,8 kDa. Pela análise do perfil de proteínas totais extraídas de cada linhagem, foi possível verificar que as linhagens recombinantes apresentaram uma banda adicional do tamanho esperado para a construção realizada quando comparadas às linhagens não transformadas.

Com o intuito de investigar a ancoragem da proteína MerR na membrana externa das bactérias recombinantes, as proteínas celulares foram fracionadas em: fração solúvel (FS), membrana interna (Ml) e membrana externa (ME). As três frações obtidas para cada linhagem analisada foram aplicadas em um ensaio de SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis). Após análise eletroforética, as frações protéicas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose e a expressão da fusão MerR/ -domínio na membrana externa das bactérias recombinantes foi confirmada utilizando como repórter o epítopo E-tag, que é reconhecido com especificidade pelo anticorpo anti-E-tag, durante os ensaios imunoenzimáticos. As bactérias selvagens foram utilizadas como controle negativo do experimento. Os resultados demonstraram que somente na fração de membrana externa das linhagens recombinantes, contendo o plasmídeo pCMHg, foi detectada a banda de 60,8 kDa pelo anticorpo anti-E-tag. A fração solúvel e a fração de membrana interna não apresentaram nenhuma reatividade, demostrando que, de fato, a proteína heteróloga está sendo produzida e que o mecanismo de secreção está sendo funcional, possibilitando a ancoragem da proteína MerR na membrana externa dessas bactérias. Esses resultados estão de acordo com aqueles obtidos por Veiga et ai (2004) ao utilizar este mecanismo de secreção para ancoragem de peptídeos em superfície celular externa bacteriana. Conclui-se, portanto, que a construção das bactérias Gram-negativas E. coli e C. metallidurans CH34 geneticamente modificadas, contendo membrana externa enriquecida com proteína MerR queladora de mercúrio de alta eficiência, foi realizada com sucesso.

Adicionalmente, o estudo demonstrou que, a bactéria E. coli JM109, contendo ancoragem e expressão da proteína MerR na superfície da célula, foi capaz de quelar 100% de íons Hg²⁺ em concentrações menores de 20 μΜ de mercúrio, além da capacidade de bioadsorção de íons Hg²⁺ ter sido demonstrada efetivamente específica, mesmo na presença de outros íons metálicos (BAE, 2003). Entretanto, é importante ressaltar que, a expressão da proteína MerR na superfície celular de E. coli J109 foi realizada mediante indução com 1 mM de isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside (IPTG).

Já as bactérias recombinantes construídas e apresentadas nesta invenção, apresentam expressão da proteína MerR constitutivamente, sob o controle do promotor pan de Bacillus subtilis (RIBEIRO-DOS-SANTOS, 2010), que demonstrou ter a capacidade de expressar elevados níveis de proteínas recombinantes em E. coli sem a necessidade da adição de um indutor, além de promover expressão protéica aumentada em C. metallidurans CH34 na presença de íons metálicos (BIONDO, 2008), fato isto representa um grande avanço para uma linhagem biorremediadora, uma vez que a desnecessária adição de indutores constitui relevante novidade biotecnológica na área.

Além da cepa transgênica de E. coli UT5600, a presente invenção relata linhagem recombinante de C. metallidurans CH34. Sabendo-se que a bactéria C. metallidurans CH34 é capaz de sobreviver em ambientes altamente contaminados com metais pesados e possui superior resistência a íons de mercúrio quando comparada à E. coli JM109, o microrganismo construído neste trabalho apresenta-se como modelo industrial para ser utilizado em processos de biorremediação. (MERGEAY, 1985; CHAMPIER, 2004; DIELS, 2009).

Destaca-se, ainda, que todos os trabalhos mencionados na literatura até o momento, envolvem a expressão e ancoragem da proteína MerR de E. coli, que contém três resíduos de cisteínas (Cys82, Cys1 17 e Cys126) na porção C- terminal da molécula, responsáveis pela ligação específica de íons Hg²⁺ (BAE, 2003; SONG, 2004; QIN, 2006). Observando que a bactéria C. metallidurans CH34 é capaz de sobreviver a maiores índices de mercúrio quando comparada à E. coli e a proteína MerR, codificada pelo gene merR do plasmídeo pMOL30 de C. metallidurans CH34 possui três resíduos de cisteínas, também na porção C-terminal da cadeia peptídica, porém com maior proximidade entre si (Cys115, Cys1 17, Cys126), é possível que tais modificações na conformação estrutural terciária do sítio de ligação com o metal, resultem na maior eficiência e especificidade na captação de íons Hg²⁺. Tais fatos levaram-nos a expressar e ancorar, de forma inédita, a proteína MerR de C. metallidurans CH34 na superfície das células hospedeiras.

O conjunto de resultados, aqui demonstrados, permite afirmar que a expressão e ancoragem da proteína MerR na superfície de E. coli e C. metallidurans CH34 é uma estratégia adequada para otimizar a capacidade destas bactéria em ligar íons de mercúrio, o que também abre oportunidades para uso deste sistema, que possui amplo espectro, em outras bactérias Gram- negativas que tenham potencial biorremediador natural ainda mais elevado, contribuindo para o desenvolvimento de novas linhagens recombinantes até o momento não relatadas.

Portanto, a presente invenção constata-se inovadora quanto à construção de linhagens bacterianas contendo o plasmídeo recombinante pCMHg de amplo espectro para bactérias Gram-negativas, capaz de expressar a proteína MerR de C. metallidurans CH34 na superfície celular, utilizando o peptídeo sinal e o domínio de ancoragem do sistema de secreção da IgA protease de Neisseria gonorrhoeae, sob o controle do promotor pan de Bacillus subtilis.

Para a obtenção de bactérias transgênicas biorremediadoras de mercúrio, foram realizadas as seguintes etapas:

OBTENÇÃO DO GENE MERR DE C. metallidurans CH34

O DNA total de C. metallidurans CH34, contendo o plasmídeo pMOL30, foi extraído e visualizado por eletroforese em gel de agarose 0,8%, foi utilizado como DNA molde para a obtenção do gene merR através de ensaio de PCR (Figura 1 A). Para a amplificação do gene de interesse a partir do DNA total de C. metallidurans CH34, um par de sequências iniciadoras foram desenhadas tendo como alvo o gene que codifica a proteína reguladora merR do operon mer de C. metallidurans CH34, presente no plasmídeo pMOL30. Após reação de PCR, o gene merR foi obtido sem seu códon de terminação e flanqueado por sítios de reconhecimentos para as enzimas Xba\ e Sa/l (Figura 1 B).

O gene merR foi clonado no vetor pGEM-T e o plasmídeo resultante, denominado PGEMT-Hg (Figura 2A), foi empregado para transformar a linhagem de E. coli DH5a. O DNA plasmidial dos transformantes foi isolado e submetido à digestão dupla com as enzimas Xôal e Sa/l para verificar a presença do gene merR e confirmar o sucesso da construção (Figura 2B). Após etapa de digestão enzimática, o plasmídeo PGEMT-Hg liberou um fragmento correspondente ao gene merR com extremidades coesivas que, em seguida foi purificado e seguiu para a etapa de clonagem em vetor de expressão.

As figuras 2A e 2B ilustram Clonagem do gene merR de C. metallidurans em vetor de clonagem pGEMT.

Figura 2A: Clonagem do gene merR no vetor pGEMT, originando o plasmídio recombinante pGEMT-Hg. Após digestão dupla com Xba\ e Sa/l, o gene foi liberado contendo extremidades coesivas.

Figura 2B: Colónias contendo o plasmídio pGEMT-Hg foram analisadas em eletroforese em gel de agarose 0,8%. As preparações plasmidiais foram analisadas através de digestão enzimática com o par de enzimas Xba\ e Sa/l onde se comprovou a incorporação do inserto merR, no plasmídeo pGEMT (canaleta 5). A canaleta 1 mostra o marcador de peso molecular Gene 0^'ruler DNA 1 Kb (Fermentas). A canaleta 2 demonstra o plasmídio recombinante pGEMT-Hg circularizado. A canaleta 3 apresenta o plasmídio pGEMT-Hg digerido apenas com a enzima de restrição Sa/l em que o inserto foi liberado, demonstrando que o gene merR foi inserido em orientação contrária no vetor de clonagem. A canaleta 4 demonstra plasmídio pGEMT-Hg digerido apenas com a enzima de restrição Xóa/I , linearizando o plasmídio pGEMT-Hg com 3454 pb.

OBTENÇÃO DO VETOR CONTENDO SISTEMA DE EXPRESSÃO E ANCORAGEM DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS PARA BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS

O vetor contendo sistema de expressão e ancoragem de proteínas heterólogas para bactérias Gram- negativas é um derivado do plasmídeo pCM2. Visto que o pCM2 possui em sua sequência, o gene que codifica a fitoquelatina sintética EC20, tornou-se necessário obter o pCM2 com a ausência do gene que codifica a EC20. Para isso, Foram desenhadas duas sequências iniciadoras para a obtenção do pCM2 sem o inserto EC20, através de PCR. O iniciador dianteiro envolveu na sua extremidade 5^', o sítio para Sa/l já presente na sequencia do pCM2. O iniciador reverso teve um sítio de reconhecimento para a enzima Xbal inserido na sua extremidade 5^'. A reação de PCR foi otimizada e permitiu a obtenção do inteiro plasmídeo pCM2, com exceção da porção gênica que codifica a fitoquelatina. Como resultado, obtivemos um amplicon, com 6.496 pares de bases, que após digestão dupla com as enzimas Xba\ e Sa/l, gerou um vetor de expressão linear, com extremidades coesivas, contendo a sequência do sistema de secreção da IgA protease de Neisseria gonorrhoeae, além da sequência gênica do peptídeo sinal, a sequência codificadora do epítopo E-tag e a sequência codificadora da região do β- domínio do sistema de secreção da IgA protease. O gene merR coesivo, anteriormente isolado do plasmídeo pGEMT-Hg foi inserido no vetor de expressão linear obtido, contendo mesmas extremidades coesivas, o que facilitou a ligação entre as moléculas. A mistura de ligação desses fragmentos foi inserida em E. coli DH5a através de transformação genética. O novo vetor construído foi denominado pCMHg. A seqiiência gênica, promotor pan- peptídeo sinal-merR-E-tag^-domínio, foi denominada de cassete de ancoragem e a sequência nucleotídica dessa construção foi analisada por sequenciamento. (SEQ. ID N°3) (Figura 3).

A Figura 3 ilustra a obtenção do plasmídeo recombinante pCMHg. O gene merR de C. metallidurans com extremidades coesivas, obtido através da digestão enzimática do plasmídeo pGEMT-Hg com Xba\/Sal\, foi ligado ao vetor de expressão pCM2 sem EC20, obtido por PCR e pré-digerido com as mesmas enzimas. Os dois fragmentos foram ligados com enzima T4 ligase originando o plasmídeo pCMHerR.

ANÁLISE DA EXPRESSÃO DA FUSÃO merR-E-taq -dominio (SOB O COMANDO

DO PROMOTOR PAN) NAS BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS E. coli UT5600, E COLI BL21 (DE3) E C. metallidurans CH34

A expressão do cassete de ancoragem merR sob o comando do promotor pan foi avaliada nas linhagens de E. coli UT5600, E. coli BL21 (DE3) e C. metallidurans CH34 não transformadas e transformadas com o plasmídeo pCMHg, através da comparação do perfil protéico de cada linhagem por SDS- PAGE. Pela análise do perfil de proteínas totais, foi possível verificar que as linhagens E. coli UT5600/PCMHg, E. coli BL21 (DE3)/pCMHg e C. metallidurans CH34/pCMHg apresentaram uma banda adicional, de aproximadamente 60,8 kDa, quando comparadas às linhagens não transformadas, comprovando a expressão do cassete de ancoragem (Figura 4A Figura 4B, respectivamente).

As figuras 4A e 4B mostram perfis de proteínas totais visualizados em SDS-PAGE com coloração de "Coomassie Blue R250". A: 1 e 6- Prestained Protein MW Marker 20-120 kDa (Fermentas), 2- E. coli UT5600/pCMHg, 3- E. coli BL21 (DE3)/pCMHg, 4- E. coli UT5600 e 5- E. coli BL21 (DE3). B: 1- Prestained Protein MW Marker 20-120 kDa (Fermentas), 2- C. metallidurans CH34, 3- C. metallidurans CH34/pCMHg.

ANÁLISE DA EXPRESSÃO E ANCORAGEM DA PROTEÍNA MERR (SOB O COMANDO DO PROMOTOR pan) NA MEMBRANA EXTERNA DA BACTÉRIA GRAM-NEGATIVA E. coli UT5600.

Para avaliar se a proteína estava, de fato, ancorada na membrana externa de E. coli UT5600/PCMHg, as frações de membrana da linhagem transformada e não transformada foram isoladas em Fração Solúvel (FS), Membrana Interna (Ml) e Membrana externa (ME). As diferentes frações obtidas foram visualizadas em SDS-PAGE (Figura 5A). Após análise eletroforética, as frações protéicas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose e a expressão da fusão MerR-E tag-p-domínio na membrana externa da bactéria foi confirmada utilizando como repórter o epítopo E-tag, que foi reconhecido com especificidade pelo anticorpo primário anti-E-tag e anticorpo secundário anti-camundongo, conjugado com a peroxidase de rábano silvestre, durante ensaio imunoenzimático de 'Western Blot". A bactéria selvagem E. coli UT5600 foi utilizada como controle negativo do experimento. Os resultados mostraram que apenas na fração da membrana externa da linhagem E. coli UT5600/PCMHg foi detectada a presença do E-tag, indicando que, de fato, a proteína está ligada na membrana externa da bactéria (Figura 5B).

As figuras 5A e 5B ilustram o fracionamento protéico de E. coli UT5600 e

E. coli UT5600/pCMHg, visualizados em SDS-PAGE com coloração de "Coomassie Blue R250" e ensaio imunoenzimático das diferentes frações celulares após incubação com anticorpo anti-E-tag.

Figura 5A: SDS-PAGE: 1- Prestained Protein MW Marker 20-120 kDa (Fermentas), 2- (FS) E. coli UT5600, 3- (FS) UT5600/pCMHg, 4- (Ml) E. coli UT5600, 5- (Ml) UT5600/pCMHg, 6- (ME) E. coli UT5600, 7- (ME) UT5600/pCMHg, 8- Page-Ruler Unstained Protein Marker 10-200 kDa (Fermentas).

Figura 5B: "Western Blot": 1- Prestained Protein MW Marker 20-120 kDa (Fermentas), 2- (FS) E. coli UT5600, 3- (FS) E. coli UT5600/pCMHg, 4- (Ml) E. coli UT5600, 5- (Ml) E. coli UT5600/pCMHg, 6- (ME) E. coli UT5600, 7- (ME) E. coli UT5600/pCMHg, 8- Page-Ruler Unstained Protein Marker 10-200 kDa (Fermentas). Houve reatividade de banda aparente de 60, 8 kDa na canaleta 7, correspondente à membrana externa da UT5600/pCMHg.

ANÁLISE DA EXPRESSÃO E ANCORAGEM DA PROTEÍNA MERR (SOB O COMANDO

DO PROMOTOR pari) NA MEMBRANA EXTERNA DA BACTÉRIA GRAM-NEGATIVA E. coli BL2KDE3). Para avaliar a ancoragem da proteína Mer na membrana externa de E. coli BL21 (DE3)/PCMHg, as frações de membrana da linhagem transformada e não transformada foram isoladas em: Fração Solúvel (FS), Membrana Interna (Ml) e Membrana externa (ME). As diferentes frações obtidas foram visualizadas em SDS-PAGE (Figura 6A). Após análise eletroforética, as frações protéicas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose e a expressão da fusão MerR-E tag-3-domínio na membrana externa da bactéria foi confirmada utilizando como repórter o epítopo E-tag, que foi reconhecido com especificidade pelo anticorpo primário anti-E-tag e anticorpo secundário anti-camundongo, conjugado com a peroxidase de rábano silvestre, durante ensaio de 'Western Blot". A bactéria selvagem E. coli BL21(DE3) foi utilizada como controle negativo do experimento. Os resultados demostraram que apenas na fração da membrana externa da linhagem E. coli BL21 (DE3)/PCMHg foi detectada a presença do E-tag, indicando que, de fato, a proteína está ligada à membrana externa da bactéria (Figura 6B).

As figuras 6A e 6B ilustram o fracionamento de proteínas da bactéria E. coli BL21 (DE3) e BL21 (DE3)/pCMHg.

Figura 6A: SDS-PAGE: 1 - (FS) BL21 (DE3), 2- (FS) BL21(DE3)/pCMHg, 3- (Ml) BL21 (DE3), 4- (Ml) BL21 (DE3)/pCMHg, 5- (ME) BL21 (DE3), 6- (ME) BL21 (DE3)/pCMHg, 7- Page-Ruler Unstained Protein Marker 10-200 kDa (Fermentas).

Figura 6B: Western-blot: Houve reatividade de banda aparente de 60, 8 kDa na canaleta 6, correspondente à membrana externa da BL21 (DE3):pCMHg.

ANÁLISE DA EXPRESSÃO E ANCORAGEM DA PROTEÍNA MERR (SOB O COMANDO

DO PROMOTOR PAN) NA MEMBRANA EXTERNA DA BACTÉRIA GRAM-NEGATIVA C. metallidurans CH34.

Para avaliar a ancoragem da proteína MerR na membrana externa de C. metallidurans CH34/PCMHg, as frações de membrana da linhagem transformada e não transformada foram isoladas em: Fração Solúvel (FS), Membrana Interna (Ml) e Membrana externa (ME). As diferentes frações obtidas foram visualizadas em SDS-PAGE (Figura 7A). Após análise eletroforética, as frações protéicas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose e a expressão da fusão MerR-E tag-p-domínio na membrana externa da bactéria foi confirmada utilizando como repórter o epítopo E-tag, que foi reconhecido com especificidade pelo anticorpo primário anti-E-tag e anticorpo secundário anti-camundongo, conjugado com a peroxidase de rábano silvestre, durante 'Western Blot". A bactéria selvagem C. metallidurans CH34 foi utilizada como controle negativo do experimento. Os resultados demostraram que apenas na fração da membrana externa da linhagem C. metallidurans CH34/PCMHg foi detectada a presença do E-tag, indicando que, de fato, a proteína está ligada à membrana externa da bactéria (Figura 7 B).

As figuras 7A e 7B demonstram:

7A: Fracionamento de proteínas da bactéria C. metallidurans CH34 e CH34/pCMHg. 1- Prestained Protein MW Marker 20-120 kDa (Fermentas), 2- (ET) CH34, 3- (ET) CH34/pCMHg, 4- (FS) CH34, 5- (FS) CH34/pCMHg, 6- (Ml) CH34, 7- (Ml) CH34/pCMHg, 8- (ME) CH34, 9- (ME) CH34/pCMHg, 10- Page- Ruler Unstained Protein Marker 10-200 kDa (Fermentas).

7B: "Western-blot": Houve reatividade de banda aparente de 60, 8 kDa nas canaletas 3 e 9, correspondentes ao extrato total e membrana externa da CH34/pCMHg, respectivamente.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. GENE, caracterizado pelo fato de compreender o gene merR de SEQ. ID N°1 sem o códon de terminação de síntese protéica.

2. GENE, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de codificar uma proteína de alta afinidade e especifidade à íons de mercúrio.

3. CASSETE DE ANCORAGEM DO MER-R, caracterizado pelo fato de compreender a SEQ. ID N°3.

4. CASSETE DE ANCORAGEM DO MER-R, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência codificadora de um peptídeo sinal, uma sequência codificadora da proteína MerR, uma sequência codificadora de um E-tag e uma sequência codificadora do β- domínio da IgA protease de Neisseria gonorrhoeae.

5. CASSETE DE EXPRESSÃO-ANCORAGEM DO MER-R, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de expressar a sequência codificadora do cassete de ancoragem do merR sob o controle do promotor pan.

6. PLASMÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de compreender a SEQ. ID N°4.

7. PLASMÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de compreender a sequência gênica codificadora do cassete de expressão-ancoragem do merR.

8. PLASMÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com as reivindicações 6 e 7, caracterizado pelo fato de conter a sequência gênica que codifica um sistema de ancoragem de uma proteína quelante de mercúrio na superfície celular de bactérias Gram-negativas.

9. LINHAGEM TRANSGÊNICA BACTERIANA, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato das bactérias compreenderem, preferencialmente, Escherichia coli e Cupriavidus metallidurans.

10. LINHAGEM TRANSGÊNICA BACTERIANA, de acordo com as reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de replicar o plasmídeo recombinante e expressar o cassete de ancoragem do merR em níveis basais elevados.

1 1. USO DO GENE, de acordo com as reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de codificar uma proteína capaz de ligar-se a íons de metálicos.

12. USO DO GENE, de acordo com a reivindicação 1 1 , caracterizado pelo fato dos íons metálicos compreenderem especificamente Hg²⁺.

13. USO DA LINHAGEM BACTERIANA, de acordo com as reivindicações 9 a 10, caracterizada pelo fato de ter potencial para ser empregada em processos de biorremediação ambiental de mercúrio.