WO2012143141A2 - Compositions antivirales dirigees contre la nucleoproteine des virus influenza - Google Patents

Compositions antivirales dirigees contre la nucleoproteine des virus influenza Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to pharmaceutical compositions comprising compounds which inhibit the binding of viral RNA to the nucleoproteins of Influenza A viruses, the use of said compositions for the treatment of Influenza A virus infection as well as an identification method. such inhibitory compounds.
  • Influenza viruses are responsible for many respiratory tract infections each year and kill as many as 250,000 to 500,000 people worldwide. In addition to seasonal strains, new strains have emerged in recent years: the H1N1 Influenza A virus that emerged in pigs caused a relatively large pandemic in 2009, which, however, resulted in low mortality. Influenza A strain H5N1, more commonly known as "bird flu”, has emerged in avian animal breeds and has been found to be particularly pathogenic, with infection spreading to humans with a mortality rate of up to 60%.
  • Influenza viruses responsible for influenza are single-stranded RNA viruses belonging to the family Orthomyxovirideae and constituting the genus Influenza virus. This genus is divided into three types of Influenza A, B or C virus, the type depending on the antigenic characteristics of certain proteins of said viruses and not disinfecting the same hosts.
  • Influenza A viruses have the ability to infect different animal species, including mammals and birds, and have high pathogenicity. They have the distinction of being subdivided into different sub-types depending on the surface proteins hemagglutinins (HA) and neuraminidases (NA) they present. To date, 16 hemagglutinins (H1 to H16) and 9 neuraminidases (NI to N9) have been identified.
  • HA hemagglutinins
  • NA neuraminidases
  • viruses are structurally composed of 8 segments of single-stranded RNA of negative polarity in a viral capsid itself protected by a phospholipid envelope. These 8 RNA segments encode the different viral proteins required for transcription of the negative-polarity RNA segments into positive-polarity RNA fragments. but also necessary for viral replication, namely the nucleoproteins which will each associate with an RNA fragment as well as the PA, PB1 and PB2 proteins forming a ribonucleoprotein polymerase complex.
  • viruses are also encoded by the structural proteins of the virus such as the envelope proteins (neuraminidase and hemagglutinin) but also the M1 and M2 proteins located under or in the viral envelope to maintain the structure of the viruses as well as the proteins non-structural NS I and NS2.
  • envelope proteins neuroaminidase and hemagglutinin
  • M1 and M2 proteins located under or in the viral envelope to maintain the structure of the viruses as well as the proteins non-structural NS I and NS2.
  • RNA fragments of influenza viruses Since the RNA fragments of influenza viruses have a negative polarity, they must be transcribed into positive polarity messenger RNA fragments by RNA-dependent RNA polymerase viral enzymes for viral replication. Positive-polarity RNA fragments then serve as messenger RNAs necessary for protein translation.
  • the infection of host cells with Influenza A virus and the propagation of the virions produced by said cells is ensured by the activity of two proteins of the viral envelope: hemagglutinin and neuraminidase.
  • Haemagglutinin HA is a trimeric glycoprotein consisting of two HA1 and HA2 subunits possessing receptor specific binding sites for attachment of the virus to the host cell and release of the viral genome into the cytoplasm of said host cell.
  • the haemagglutinin is indeed responsible for the attachment of the virus to the target cell at the level of sialic acid, also called N-acetyl-neuraminic acid, end of the glycoprotein or glycolipid chains of the membrane receptors of the host cell thus allowing the entry of the virus into the cell by endocytosis.
  • sialic acid also called N-acetyl-neuraminic acid
  • Neuraminidase is also a surface protein of influenza A viruses. Although it has a smaller amount than hemagglutinin, its role is no less complementary. Indeed, the neuraminidase has an enzymatic activity responsible for the cleavage of the osidic bonds formed between the hemagglutinin on the surface of the virions and the sialic acid residues of the membrane of the host cell. The virions newly formed and attached to the membrane of the infected cell can be released, thus avoiding their aggregation at the host cell. This enzymatic activity also facilitates the detachment of virions from mucus rich in sialic acid and present in the respiratory epithelium.
  • Amantadine distributed under the name MANTADIX®, makes it possible to inhibit the replication of the virus by binding to the M2 protein, the ionic channel protein of the capsid of viruses. It also makes it possible to inhibit the fusion between said capsid and the plasma membrane of the host cell as well as the release of the viral genetic material into the cytoplasm of the host cell.
  • Rimantadine also has an action of inhibiting the fusion of the viral capsid with the membrane of the host cell by inactivation of the M2 protein.
  • Neuraminidase is also one of the existing antiviral targets including oseltamivir (under the trade name TAMIFLU ®) and zanamivir (RELENZA ®) inhibitors of said protein on the surface of viruses.
  • Ribavirin is one of these inhibitors. In addition to the treatment of Influenza viruses, it is also used for the treatment of respiratory syncytial virus infections or the treatment of hepatitis C.
  • Influenza viruses are developing more and more resistance to these antiviral treatments. These phenomena of resistance are due to the great genetic plasticity that the Influenza viruses present. Two phenomena are involved in the appearance of a strong variation of the genome of the viruses: the antigenic slides, caused by minor variations of the genome resulting from substitution of one or more amino acids on one or two proteins (HA or NA), as well as antigenic leaps, resulting from the mixed infection of two different type A viruses whose fragments are recombined.
  • H 1N1 circulating in the United States was resistant to TAMIFLU® and all strains isolated from H3N2 were resistant to amantadines. It was also noted that half of the infected with the H5N1 virus have died despite treatment with both classes of antiviral drugs directed against the surface proteins of influenza A viruses. It therefore appears to be necessary to develop as quickly as possible new inhibitors of influenza A viruses capable of to treat infections with said viruses while being less sensitive to the phenomena of gene variations thereof.
  • the inventors have identified novel antivirals targeting the nucleoprotein (NP) of the Influenza A viruses, which protein associates with the viral RNA and a viral AR polymerase to form the ribonucleoprotein complex responsible for transcription and transcription. viral replication.
  • NP nucleoprotein
  • the nucleoprotein of Influenza A viruses is an internal protein synthesized from viral messenger RNA in the host cell, which gives it a mutation rate much lower than that of surface proteins prone antigenic leaps and slides as described above. It has indeed been observed that the nucleoproteins of type H1 and H5 viruses have a very high identity rate (97%). On the other hand, the nucleoprotein also has the advantage of not being present in virus-infected host cells. Thus, any compound intended to act specifically at the level of the nucleoprotein will not lead in principle to interference with the cellular mechanisms or the proteins of the host cell.
  • the inventors have therefore identified compounds capable of binding specifically at the level of the viral RNA binding domain on the nucleoprotein of Influenza A viruses.
  • the binding of the viral RNA on the nucleoprotein of said viruses is not specifically dependent on a particular sequence. It is the very structure of the protein that allows the viral RNA to lodge in a groove formed at the center of the nucleoprotein to form the nucleoprotein complex to which the RNA polymerase will bind to form the ribonucleoprotein complex.
  • the inventors have in fact demonstrated that the use of compounds capable of binding at the level of said viral RNA binding domain on the nucleoprotein of Influenza A viruses prevents the binding of said RNA on the nucleoprotein in a competitive manner. .
  • the absence of binding of the viral RNA to the nucleoprotein inhibits the formation of the complex Ribonucleoprotein with RNA polymerase, a complex required for viral transcription and replication.
  • the inventors By analyzing the structure of the binding domain of the viral RNA on the nucleoprotein of influenza viruses as well as the protein portions in the vicinity of said domain, the inventors have also demonstrated a correlation between the binding of RNA and the oligomerization of nucleoprotein; this implies that inhibitors capable of preventing the binding of viral RNA to the nucleoprotein of Influenza A viruses will also cause a deficiency in the oligomerization of the nucleoprotein, a step necessary for viral replication.
  • the antivirals according to the invention are therefore intended to treat subjects infected with an influenza virus, especially of type A, thanks to a specific mechanism of action associated with the binding site of the viral RNA on the nucleoprotein of said virus.
  • antivirals currently available to fight infections with certain strains of Influenza virus type A are subject to variability constraints of said strains due to frequent mutations in the surface proteins of said viruses.
  • the use of currently available antivirals is also limited to the specific treatment of infections by certain strains of Influenza virus. type A, said strains being dependent on the types of target proteins present on the surface of the viruses.
  • the antivirals according to the invention do not target the surface proteins of influenza viruses, especially of type A, but are intended to bind at the level of the binding domain of the viral RNA on the nucleoprotein of said viruses.
  • the nucleoprotein of influenza viruses is an internal protein not subject to the frequent phenomena of mutation as observed in the surface proteins of these viruses. Thus, even Influenza virus strains, especially of type A, which will have mutations, especially at the level of their surface proteins, will remain targets of the antivirals according to the invention.
  • the nucleoprotein is also a predominantly conserved protein within different strains of Influenza virus type A and other types. In addition to the conservation of the nucleoprotein sequence within Influenza virus strains (greater than 90%), it has been shown that the groove which fixes the RNA in particular at the level of said nucleoprotein does not vary structurally between a virus. H1N1 and H5N1 (Ye et al, 2006, Ng et al, 2008).
  • the antivirals according to the invention have the advantage of being able to be used to treat a broad spectrum of Influenza A virus infections, without specificity. of strains, unlike antivirals currently on the market.
  • the invention thus relates to novel compounds having the property of acting as an inhibitor of the binding of viral RNA to the nucleoprotein of influenza A viruses by binding to the binding domain of the viral RNA on said nucleoprotein, thereby inhibiting viral replication.
  • a first aspect of the invention therefore relates to a pharmaceutical composition for the treatment of a viral infection by an Influenza A virus in a subject, which composition comprises a compound having the property of acting as an inhibitor of the attaching the viral RNA to the nucleoprotein of influenza A viruses, said compound having the property of binding in a sphere-forming site of at least 12 angstroms ( ⁇ ) in diameter centered on the TYR148 residue belonging to the binding of the viral RNA on said nucleoprotein, said domain: comprising the amino acids Arg65, Gin149, Tyr148, Argl50, Argl52, Arg56, Arg177, Arg75, Arg195, Arg199, Arg213, Arg214, Arg221, Arg236, Pro354, Arg355 , Lys357, Arg361, Arg391, Lysl 84, Lys198, Gly212, Ile217, Ala218, Lys227, Lys229, Lys273 and Val353 of a sequence comprising the sequence
  • R4 OH or OR3 or H the triazole of formula (C) or a derivative thereof of formula (D) or (E) with:
  • composition according to the invention is characterized in that said sequence comprising the sequence SEQ ID No. 1 corresponding to the sequence SEQ ID No. 2.
  • said composition according to the invention is characterized in that said binding domain comprising more than 10% of arginine amino acid residues, preferably more than 20% of arginine amino acid residues.
  • said composition according to the invention is characterized in that said compound is not a nitro derivative of Naproxen as described in PCT International Application WO 2005/030224 A1 of line 1, page 2 to line 14, page 17.
  • the composition according to the invention is characterized in that the subject is a mammal, preferably a human, infected with an influenza virus of type A.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of a viral infection by an Orthomyxovirus in a subject, which composition comprises a compound as defined in claim 1.
  • composition according to the invention is characterized in that said compound is not a nitro derivative of Naproxen as described in PCT application WO 2005/030224 A1 (NICOX) of line 1, page 2 to line 14, page 17.
  • NICOX NICOX
  • the composition according to the invention is characterized in that said compound is not a triazole derivative as described in PCT International Application WO 2007134678 A2 (MERCK) of line 4, page 19 to line 20 , page 39 and line 19, page 45 to line 31, page 50.
  • MERCK PCT International Application WO 2007134678 A2
  • composition according to the invention is characterized in that said compound is the Naproxen compound of formula (A) or a derivative thereof of formula (B) as defined in claim 1.
  • composition according to the invention is characterized in that said compound is a derivative of Naproxen of Formula (L)
  • composition according to the invention is characterized in that said compound is the compound derived from Naproxen of formula (F) or the compound derived from Naproxen of formula (G):
  • composition according to the invention is characterized in that said compound is a triazole of formula (C) or one of its derivatives of formulas (D) or (E) as defined above.
  • the composition according to the invention is characterized in that the subject is a mammal, more preferably a human, infected with an Orthomyxo virus.
  • the composition according to the invention is characterized in that said composition is intended for the treatment of a viral infection by an influenza virus in a subject.
  • the composition according to the invention is characterized in that the subject is a mammal, more preferably a human, infected with an influenza virus.
  • composition according to the invention is characterized in that it may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Another aspect of the invention relates to a compound having the property of acting as an inhibitor of the binding of viral RNA to the nucleoprotein of Influenza A viruses, said compound having the property of binding in a site forming a sphere of at least 12 angstroms ( ⁇ ) in diameter centered on the TYR148 residue belonging to the binding domain of the viral RNA on said nucleoprotein, said domain:
  • Another aspect of the invention relates to a method of identifying a compound having the property of binding at the level of the viral RNA binding domain on the nucleoprotein of Influenza A viruses, said method comprising the following steps : a) Model the three-dimensional (3D) structure of the nucleoprotein of an Influenza A virus;
  • Said domain comprising the amino acids Arg65, Glnl49, Tyr148, Argl 50, Argl 52, Argl 56, Argl 74, Argl 75, Argl 95, Argl 99, Arg213, Arg214, Arg221, Arg236, Pro354, Arg355, Lys357, Arg361, Arg391, Lysl 84, Lysl98, Gly212, Ile217,
  • Said domain being delimited by two loops, the first loop comprising the amino acid residues Glu 73 to Lys 90 and the second loop comprising the residues amino acids Gly 200 to Arg 214 of a sequence comprising the sequence SEQ ID No. 1.
  • said method is characterized in that a sequence comprising the sequence SEQ ID No. 1 is the sequence SEQ ID No. 2.
  • said method is characterized in that it comprises a complementary step e) consisting in testing in vitro the capacity of a compound identified according to step d) to inhibit the binding of the viral RNA to the nucleoprotein as well as than viral replication.
  • said method is characterized in that it comprises a step (f) of selecting such a compound as being an inhibitor of viral replication.
  • Figure 1 Representative structure of the wild type Influenza A nucleoprotein.
  • Figure 2 Crystal structure of Influenza A virus Nucleoprotein showing a large central groove for RNA binding.
  • FIG. 3 Root Mean Square Fluctuation (RMSF) of NP nucleoprotein and mutants R361A and R416A.
  • Figure 4 Naproxen binding in the nucleoprotein RNA binding groove and residues involved in the interaction, both by formation of electrostatic bonds with R361 (R355) or polar (N149) and hydrophobic with Y148, F489 .
  • FIG. 5 Influenza A virus nucleoprotein whose amino acids corresponding to the groove intended for fixing the RNA are represented in dark.
  • Figure 6 Detection of signals resulting from the binding of NP or mutants R416A and R361 A to single-stranded RNAs.
  • Figure 9 Comparison of the effect of naproxen - tamiflu on MDCK cells infected with Influenza A / WSN virus.
  • Figure 1 1 Effect of naproxen treatment in mice.
  • A weight loss normalized to the initial weight at the day of infection;
  • B viral titre of the lungs of mice 7 days after infection. Representative results from 3 experiments, 7 to 10 mice are used for each concentration of naproxen and for the witness in each experiment; intranasal infection with 2000 pfu by the A / PR8 (H1N1) virus
  • Figure 12 Comparison of mean weight loss with Influenza virus type A / PR8 at 50 pfu / ml without and with IP injection 2 mg naproxen / mouse / day or 0.2 mg tamiflu / mouse / day.
  • Figure 13 Observation of lung cells from infected (A), infected and treated (B), uninfected (C) cells.
  • Figure 14 Docking of Naproxen A and Co in the Influenza Virus Nucleoprotein
  • Figure 15 Structure of the compounds of interest Naproxen A and Naproxen CO
  • Figure 19 Measurement of viral titer in the presence of different inhibitors: compound 59, compound 72 and naproxen.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of a viral infection by an Influenza A virus in a subject, which composition comprises a compound having the property of acting as an inhibitor of the fixing the viral RNA to the nucleoprotein of influenza A viruses, said compound having the property of binding in a sphere forming site of at least 12 angstroms ( ⁇ ) of diameter centered on the residue Tyr 148, belonging to the binding domain of the viral RNA on said nucleoprotein, said domain:
  • the first loop comprising the amino acid residues Glu73 to Lys90 and the second loop comprising the amino acid residues
  • nucleoprotein of Influenza A viruses means the viral protein intended to associate with a viral nucleic fragment and an RNA polymerase in order to form the ribonucleoprotein complex responsible for transcription as well as viral replication.
  • Nucleoproteins are proteins known to those skilled in the art and may have variations depending on the strains from which they are derived. Examples of protein sequences of nucleoproteins of Influenza virus type A are as follows:
  • SEQ ID NO: 2 nucleoprotein of influenza H1N1 strain A / WSN / 1933, accession number GenBank CY034135,
  • SEQ ID No. 4 nucleoprotein of strain A / Hong Kong / 483/97 (H5N1), accession number GenBank AF084277.
  • a sequence comprising the sequence SEQ ID No. 1 is the sequence SEQ ID No. 2.
  • a compound according to the invention is capable of binding to the nucleoprotein of influenza A viruses at the level of the viral RNA binding domain thus preventing the binding of the latter to the nucleoprotein.
  • the inhibition of the binding of the viral RNA on the nucleoprotein has two consequences which remain however correlated: on the one hand, the ribonucleoprotein complex, composed of the nucleoprotein, the viral RNA and the RNA polymerase, can not be formed on the other hand, the inventors have demonstrated that the binding of the viral RNA on the nucleoprotein plays a role in the oligomerization of the nucleoprotein, a step necessary for viral replication.
  • the absence of binding of the viral RNA to the nucleoprotein prevents not only the formation of the ribonucleoprotein complex but also the oligomerization of the protein, this resulting in a lack of viral replication.
  • the pharmaceutical composition according to the invention makes it possible to treat any subject infected with a virus. Influenza type A without specificity of strains and in the absence of problems related to the variability of the nucleoprotein.
  • binding domain refers to the nucleoprotein of Influenza A virus the protein domain to which the viral RNA binds to form the nucleoprotein complex.
  • the binding site of the compounds is centered around a Tyrosine amino acid residue at position 148. This amino acid is conserved in the nucleoproteins of the different types of Influenza virus type A but also in the nucleoproteins of Influenza viruses type B and C and is directly involved in the formation of bonds between the viral RNA and the nucleoprotein.
  • the viral RNA binding domain on the nucleoprotein of Influenza A viruses forms a distinct central groove in the structure of the nucleoprotein as can be seen in Figure 2.
  • Said domain constitutes a region rich in basic amino acids Arginines and lysines promoting binding with an inhibitory molecule or a nucleic acid.
  • said binding domain comprises more than 10% arginine amino acid residues, preferably more than 15% arginine amino acid residues.
  • said binding domain comprises the following arginine amino acid residues: Arg65, Argl 50, Argl 52, Argl 56, Argl 74, Argl 75, Argl95, Argl 99, Arg213, Arg214, Arg221, Arg236, Arg355, Arg361 , Arg391.
  • said binding domain comprises the following lysine amino acid residues: Lys357, Lysl 84, Lys198, Lys227, Lys229 and Lys273.
  • the inventors have also demonstrated that the binding domain of viral RNA on the nucleoprotein of Influenza A viruses is delimited by several protein loops having a role in the activity of the nucleoprotein.
  • two loops have been identified as participating in the fixation of the viral RNA on the nucleoprotein: the first loop comprises the amino acid residues Glu73 to Lys90 and the second loop comprises the residues Gly200 to Arg214. These loops (also called "loop”) are visible in Figure 1.
  • Subject means a mammal, preferably a human, infected with an influenza A virus.
  • a compound as defined above is not a nitro derivative of Naproxen as described in PCT International Application WO 2005/030224 Help line 30 page 2 to page 17 incorporated herein by reference.
  • Naproxen also "naproxen” is a nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID) of formula (A):
  • a compound as defined above is a Naproxen compound of formula (A) or a derivative thereof of formula (B) with:
  • R4 OH or OR3 or H
  • a compound as defined above is a derivative of Naproxen of Formula (L):
  • a compound as defined above is a derivative of Naproxen of formula (F) and hereinafter called “derivative of Naproxen A” or "Naproxen”
  • a compound as defined above is a derivative of Naproxen of formula (G) and hereinafter called “derivative of Naproxen CO” or “Naproxen CO”:
  • a compound as defined above is triazole ule (C) or a derivative thereof of formula (D) or (E) with:
  • - R5 a phenyl carboxylate or sulphate or sulphonate -Ph (CH2) nCOOH or
  • a compound as defined above is chosen from a triazole derivative of formula (H), (I), (J) or (K) respectively named compound L410, compound 59, compound 72 and compound 88 with: Formula (J) - 72
  • the invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of a viral infection by an Orthomyxovirus in a subject, which composition comprises a compound having the property of acting as an inhibitor of the fixation of the Viral RNA to the nucleoprotein of Orthomyxoviruses, said compound having the property of binding to the binding domain of the viral RNA on the nucleoprotein of said viruses as defined above.
  • Orthomyxoviruses are the family of single-stranded RNA viruses Orthomyxoviridae. This family includes the five types of Influenza virus type A, type B and type C, Isoviruses and Thogotoviruses. Influenza viruses are at the origin of influenza infections of vertebrates, said type A viruses infecting humans and other mammals and birds, Influenza B viruses being responsible for the infection of humans and seals, and Influenza type C viruses being the origin of the infection of humans and pigs. As for Isoviruses, these are responsible for salmon infections while Thogotoviruses infect vertebrates as well as invertebrates such as fish parasites or mosquitoes.
  • subject is meant here a mammal, preferably a human, infected with a virus belonging to the family Orthomyvoviridae.
  • a compound in a pharmaceutical composition intended for the treatment of a viral infection by an Orthomyxovirus according to the invention is not a nitro derivative of Naproxen as described in PCT application WO 2005/030224 A1 (NICOX) line 1, page 2 to line 14, page 17 incorporated herein by reference.
  • a compound according to the invention in a pharmaceutical composition intended for the treatment of a viral infection by an Orthomyxovirus is not a triazole derivative as described in PCT International Application WO 2007134678 A2 (MERCK) line 4, page 19 to line 20, page 39 and line 19, page 45 to line 31, page 50 incorporated herein by reference.
  • a compound according to the invention in a pharmaceutical composition intended for the treatment of a viral infection by an Orthomyxovirus is the Naproxen compound of formula (A) or a derivative thereof of formula (B) as defined above.
  • a compound according to the invention in a pharmaceutical composition intended for the treatment of a viral infection by an Orthomyxovirus is a derivative of Naproxen of formula (L).
  • a compound according to the invention in a pharmaceutical composition intended for the treatment of a viral infection by an Orthomyxovirus is the derivative of Naproxen of formula (F).
  • a compound according to the invention in a pharmaceutical composition intended for the treatment of a viral infection by an Orthomyxovirus is the derivative of Naproxen of formula (G).
  • a compound according to the invention in a pharmaceutical composition intended for the treatment of a viral infection by an Orthomyxovirus is a triazole of formula (C) or one of its derivatives of formulas (D) or (E) such that previously defined.
  • a compound according to the invention in a pharmaceutical composition intended for the treatment of a viral infection by an orthomyxovirus is a triazole derivative chosen from the compounds of formulas (II), (I), (J) and ( K).
  • the pharmaceutical composition for treating a viral infection with an Orthomyxovirus is intended for treating a viral Influenza virus infection in a subject.
  • a subject according to the invention is a mammal, more preferably a human, infected with an influenza virus.
  • a pharmaceutical composition according to the invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable refers to molecular entities or compositions being physiologically tolerable and not typically producing an allergic reaction or similar unsupportable reaction, such as intestinal disturbance or vertigo, when administered to the subject.
  • pharmaceutically acceptable means approved by a regulatory agency of a federal government or state or listed in the US Pharmacopoeia or other pharmacopoeia generally recognized for use in animals, and more especially in humans.
  • carrier refers to a diluent, adjuvant, excipient or vehicle with which the compound of the invention is administered.
  • Such pharmaceutical carriers may be sterile liquids, such as water or oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic, such as peanut, soy, mineral or sesame. Water or any aqueous solution, saline solution or aqueous dextrose or glycerol solution are preferably used as carriers, and more particularly for injectable solutions.
  • the composition may include emulsions, microemulsions, oil-in-water emulsions, anhydrous lipids and water-in-oil emulsions, or other types of emulsions.
  • Pharmaceutically acceptable carriers are described in "Remington's Pharmaceutical Sciences” by E. W. Martin.
  • composition according to the invention may further comprise one or more additives such as diluents, excipients, stabilizers and preservatives.
  • additives such as diluents, excipients, stabilizers and preservatives.
  • additives are well known to those skilled in the art and are described in particular in Ullmann's Encyclopedia. of Industrial Chemistry, 6th Ed. “(different editors, 1989-1998, Marcel Dekker); and in “Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery System” (ANSEL et al., 1994, WILLIAMS & WILKINS).
  • composition according to the invention may be in a parenterally administrable form, in particular intravenously, intraperitoneally, intradermally, subcutaneously or intra-arterially or in an orally or pulmonally or nasally administrable form.
  • parenterally administrable form in particular intravenously, intraperitoneally, intradermally, subcutaneously or intra-arterially or in an orally or pulmonally or nasally administrable form.
  • said composition is intended for parenteral administration.
  • said composition is intended for oral administration.
  • the dosage of the inhibiting compound in the pharmaceutical composition according to the invention will be adjusted according to the type of administration of the composition.
  • the invention relates to a compound having the property of acting as an inhibitor of the binding of viral RNA to the nucleoprotein of Influenza A viruses, said compound having the property of binding to the binding domain of the viral RNA on the nucleoprotein of influenza A viruses as defined above, and characterized in that it is neither a triazole derivative as described in PCT International Application WO 2007134678 A2 (MERCK ) of line 4, page 19 to line 20, page 39 and line 19, page 45 to line 31, page 50 incorporated herein by reference, nor a nitro derivative of Naproxen as described in PCT application WO 2005 / 030224 A1 (ICOX) line 1, page 2 to line 14, page 17 incorporated herein by reference.
  • a triazole derivative as described in PCT International Application WO 2007134678 A2 (MERCK ) of line 4, page 19 to line 20, page 39 and line 19, page 45 to line 31, page 50 incorporated herein by reference, nor a nitro derivative of Naproxen as described in PCT application WO 2005 / 030224 A1 (
  • a compound according to the invention is the Naproxen compound of formula (A) or a derivative thereof of formula (B) as defined above.
  • a compound according to the invention is a derivative of Naproxen of formula (L).
  • a compound according to the invention is the derivative of Naproxen of formula (F). Even more preferably, a compound according to the invention is the derivative of Naproxen of formula (G).
  • a compound according to the invention is a triazole of formula (C) or a derivative thereof of formulas (D) or (E) as defined above.
  • a compound according to the invention is a triazole derivative chosen from compounds of formulas (H), (I), (J) and ().
  • the invention relates to a method of treating an infection with an Orthomyxovirus, preferably an Influenza virus or Influenza A virus, in a subject, which method comprises administering a therapeutically effective of a composition as described above said subject.
  • an Orthomyxovirus preferably an Influenza virus or Influenza A virus
  • the term "subject” means a mammal, preferably said subject is a human, infected with an Orthomyxovirus, preferably an Influenza virus or Influenza A virus.
  • the inventors have in fact demonstrated that the use of a compound capable of binding at the level of the groove in which the viral RNA is housed at the level of the nucleoprotein of the Influenza A viruses prevents the attachment of the viral RNA at the level of said nucleoprotein.
  • the inventors have also demonstrated that the absence of binding of the viral RNA to the nucleoprotein resulted in the absence of oligomerization of said protein.
  • the use of a compound according to the invention makes it possible not only to inhibit the binding of the viral RNA to the nucleoprotein but also to inhibit the oligomerization of said protein, these two inhibitions having the consequence of inhibit viral replication.
  • terapéuticaally effective amount is meant an amount sufficient to achieve the desired biological effect, in this case a decrease in the viral titer resulting from infection with influenza A virus type A.
  • the compound according to the invention can be administered in one or more times, the amount of said compound then being adjusted according to the number of administrations envisaged.
  • the amount of compound to be administered for the treatment of Influenza A virus infection type A according to the invention can be in the range of 0.1 milligrams (mg) to 2000 mg per day.
  • the invention relates to a method for identifying a compound having the property of binding at the level of the viral RNA binding domain on the nucleoprotein of Influenza A viruses, said method comprising the Next Steps: a) Model the three-dimensional (3D) structure of the nucleoprotein of an Influenza A virus;
  • Said domain comprising the amino acids Arg65, Gln 149, Tyr148, Argl50, Argl52, Argl56, Argl74, Argl75, Argl95, Argl99, Arg213, Arg214, Arg221, Arg236, Pro354, Arg355, Lys357, Arg361, Arg391, Lysl84, Lysl98. , Gly212, Ile217, Ala2 8, Lys227, Lys229, Lys273 and Val353 of a sequence comprising the sequence SEQ ID No. 1, preferably any amino acid located at a distance of less than 5 angstroms from said amino acids, and
  • Said domain being delimited by two loops, the first loop comprising the amino acid residues Glu73 to Lys90 and the second loop comprising the amino acid residues Gly200 to Arg214 of a sequence comprising the sequence SEQ ID No. 1.
  • a sequence comprising the sequence SEQ ID No. 1 is the sequence SEQ ID No. 2.
  • the binding domain of the viral RNA on the nucleoprotein of an Influenza virus type A as defined previously has the form of a groove housed in the center of the nucleoprotein as represented in FIG. 2.
  • the term "three-dimensional structure (3D)" refers to a protein the conformation of said protein in the space obtained from the primary sequence of this protein consisting of linear succession of amino acids.
  • Modeling the structure of the nucleoprotein of influenza A viruses in three dimensions (3D) from the primary sequence of said protein is a method known to those skilled in the art that will be able to reproduce with them. methods at its disposal and known in the field.
  • the modeling of the 3D structure of said nucleoprotein can in particular be reproduced from the structure of the nucleoprotein of an Influenza virus such as that of the strain H1N1 accessible under the references PDB ID: 2IQH or MMDB ID: 43435 (Ye Q. , Krug RM et al, December 21, 2006, Nature, vol.444 (7122), pp: 1078-82).
  • the 3D modeling of the binding domain consists in designing, using modeling software, the three-dimensional structure of said domain by adding, subtracting or modifying its constituents, for example amino acids, from the crystal structure of the nucleoprotein as defined above.
  • screen defines the method of testing multiple compounds with the viral RNA binding domain on the nucleoprotein of influenza A viruses in three dimensions in order to identify a compound capable of binding to said domain as well as his activity.
  • the identification method according to the invention comprises a complementary step e) consisting in testing in vitro the capacity of a compound identified according to step d) to inhibit the binding of the viral RNA to nucleoprotein as well as viral replication.
  • the identification method according to the invention further comprises a step (f) of selecting such a compound as an inhibitor of viral replication.
  • the screening according to the invention comprises several stages, all carried out in silico by molecular modeling and detailed below. This screening makes it possible to identify potentially inhibitory molecules for the binding of viral RNA to NP. These molecules are extracted from commercial libraries, in this case the chemical library used was the Sigma catalog.
  • the modeling is based on the crystallographic structure of the nucleoprotein (NP) of references PDB ID: 2IQH or MMDB ID: 43435 (Ye Q., Krug RM et al, December 21, 2006, Nature, vol.444 (7122), pp : 1078-82) and to which the missing residues were added.
  • This structure was minimized before screening using the Discovery Studio commercial software available at: http://accelrys.com/products/discovery-studio/structure-based-design.html, using the Sigma catalog (2008 version) as a chemical library.
  • the provided 2D coordinates have been transformed into 3D coordinates needed by the software.
  • the sequence of the nucleoprotein corresponds to the sequence SEQ ID No. 1.
  • the targeted region in NP is a sphere of radius 12 centered on the residue Y148.
  • Y148 makes it possible to "dock" the inhibitor by ⁇ - ⁇ type stacking interactions.
  • This sphere further comprises the charged residues R361 and RI 52 forming electrostatic bonds or H bonds with the inhibitor, in some cases the residues RI 50 and Q149 are also involved in H bonds.
  • NP molecular dynamics simulations and two of its R416A, R361A mutants were made using NAMD software (Phillips, J.C. et al (2005), Journal of Computational Chemistry, vol.26, pp: 1781-1802) using the strength of the CHARMM27 program (MacKerell, A.D. et al., Biopolymers, vol 56, pp: 257-265) based on the published structure of the H1N1 nucleoprotein (2IQH).
  • Missing portions in this crystallographic structure were generated using SWISS-MODEL.
  • the solvent was explicitly treated by the model (TIP3P) for water molecules (Jorgensen, W. L et al, 1983, Journal of Chemical Physics, 79, pp: 926-935).
  • NP monomer A was centered in a water cube of 155.4 A side.
  • the electrostatic interactions were calculated without being truncated by the Ewald algorithm and the system was neutralized by the addition of 16 chloride ions (Darden, T., et al, 1993, Journal of Chemical Physics, Vol 98, pp: 10089-10092). Van der Waals interactions were progressively canceled between 10.0 ⁇ and 12.0 ⁇ .
  • the hydrogen atoms were generated by the SHAKE algorithm (Ryckaert, J. P et al, 1977, Journal of Computational Chemistry, Vol 23, pp. 327-341), iterations of the equations of motion in steps of 2 fs were produced by Verlet integration of speeds.
  • An energy gradient minimization algorithm was used and the solute molecules (protein) were restricted to their initial position by a force of 50.0 kcal / mol / ⁇ 2, so as to generate a potential energy gradient RMS of 0.2 kcal / mol / ⁇ . These stresses were canceled and the potential energy minimized until the gradient was less than 0.1 kcal / mol / ⁇ .
  • the system was heated to 300 K in 60 ps.
  • Molecular dynamics simulations were used to balance the system for 1ns, then five trajectories of 10 ns each generated the structures of NP WT (dark) and its R.361 A mutant (clear) ( Figure 1).
  • Molecular modeling was used to define and analyze the structure of the monomeric form of NP, based on the structure obtained by crystallography. In this structure, the position of the flexible parts is not solved and modeling has added these missing flexible loops generated using SWISS-MODEL.
  • the mutated R416A and R361A proteins were created from the wild-type (wt) structure.
  • the molecular dynamics of each of the three proteins, wt, R416A and R361A, were simulated in five independent trajectories for 10 ns (10 " s) in 2 fs (10 " s) increments to understand how long-range interactions are governed. in NP and inducing modifications of RNA association in R361 A and R416 A mutants.
  • the dynamics of these proteins placed in explicit solvent boxes was analyzed by calculating mean R416A (root mean squared fluctuations) fluctuations. RMSF)) of the protein skeleton during all the trajectories during 50 ns.
  • Figure 3 shows the existence of 3 flexible regions with high dynamics and therefore a flexible RMSF significantly higher than the rest of the protein. These are three flexible loops, the first two circling the RNA binding groove on one of the faces of NP, Glu73 to Lys90 (Loop 1) and Gly200-Arg214 (Loop 2). The third loop is on the other side of NP and corresponds to the oligomerization domain (402- 428) of a monomer penetrating the neighboring monomer within the trimer in the crystallographic structure. It is interesting to note the significant decrease in the average fluctuation of the R416A and R361A mutant 2 loop compared to that of NP.
  • Figure 1 shows a representative structure of the wild-type NP (in dark): the amino acids wt: the R361 and R416 are in the fixation groove of RNA and in the oligomerization loop 3 respectively. Loops 1, 2 and 3 of mutant R361A are superimposed in clear. It is clear that the loop 1 mutant R361A is very close to the loop 2, this proximity is stabilized by a salt bridge between Glu80 and Arg208, in agreement with the lower RMSF loop 2 of R361A. This contrasts with the wide and open cavity observed in the wild-type protein, which can readily accommodate RNA. These observations are also observed in the trimer of NP (16). Loops 1 and 2 of NP WT could therefore help to catch the RNA and guide it towards its fixation groove.
  • FIG. 4 shows the binding of naproxen in the nucleoprotein RNA fixation groove (representation indicating the electrostatic potential, the dark blue zones being positively charged and thus allowing the attachment of the RNA); the zoom in the right part shows the residues involved in the interaction, both by formation of electrostatic bonds with R361 (R355) or polar (N149) and hydrophobic with Y148, F489.
  • the first test carried out to demonstrate the binding of Naproxen in competition with the viral RNA on the nucleoprotein of sequence SEQ ID No. 2 is a surface plasmon resonance test (BIACORE 3000). The manipulation was carried out according to the indications of the manufacturer (BIACORE SA).
  • a fragment of viral RNA was attached to a gold chip coated with Dextran with streptavidin which almost irreversibly binds the biotinylated end of the RNA fragment. Fixation of the RNA fragments to the gold chip was performed in PBS. The measurements of the signals were carried out with 300 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl buffer also containing 0.025% surfactant P20 at a pH of 7.4 and a temperature of 25 ° C.
  • the nucleoproteins were injected at concentrations ranging from 4 to 1000 nM. The measurements were carried out at a temperature of 25 ° C. Samples were injected at a rate of 25 ⁇ / min.
  • Binding of the nucleoprotein to the RNA caused a change in refractive index proportional to the molecular weight of the protein and the concentration of the protein to saturation (see Example 4 and Figure 6).
  • a beacon is an oligonucleotide of quasi-palindromic sequence forming a hairpin (hairpin) and whose 5 'and 3' ends are modified by a fluorophore and a quencher.
  • the beacon used here is a beacon of sequence SEQ ID No. 8, the 5 'end of which is grafted by a chromophore Cy5 and the end 3' by a quencher DAPCYL.
  • the fluorescence is extinguished: the fluorophore was close to the quencher when the oligonucleotide is paired.
  • the nucleoprotein preferentially binds to single-stranded RNAs, its binding on the beacon induced the opening of the hairpin, which results in an increase in fluorescence, the two 5 'and 3' ends being found at a distance. one of the other.
  • the surface plasmon resonance test as described in Example 2) was also performed with proteins mutated at amino acids R361A and Y148A. It has been observed that naproxen no longer competes with RNA, as expected by the interactions defined by molecular modeling ( Figure 4). When a mutated protein, in particular R361A and Y148A is used, naproxen no longer competes with RNA. The amino acids R361 and Y148 are therefore essential for the attachment of RNA or naproxen to the nucleoprotein of Influenza A viruses ( Figure 4, Figure 16 A and B and Table 2 page 47).
  • sequence Flul 24-mer of DNA nature corresponds to SEQ ID No. 5:
  • the sequence Flul 24-mer of nature 2'Omethyl RNA corresponds to SEQ ID No. 6 with the modified ribose sugar so that it carries in position 2 'a methyl group.
  • the sequence rU25 25-mer of RNA type corresponds to SEQ ID NO: 7
  • the data represents the average of 3 experiments.
  • the ratio of the signal observed at high protein concentrations to the expected maximum RU value was calculated knowing the molecular weight of NP and that of an oligonucleotide partially complementary to the FLU1 probe immobilized on the chip.
  • Figure 6 compares the signals resulting from the binding of NP to those obtained with the same concentration (300 nM) of R416A and R361A.
  • the rate of binding of NP to RNA and the rate of oligomerization of NP and its 2 mutants in the presence of RNA are well correlated.
  • the formation rate of the 1/1 complex of NP or mutants R416A and R361A is correlated with the apparent rate of oligomerization ( Figure 7).
  • the abnormal association of R416A with RNA is associated with a lack of oligomerization.
  • the reduction in the speed of association of R361 A is also associated with a low oligomerization rate (determined by exponentially adjusting experimental points obtained by apparent size increase light scattering from (6.8 ⁇ 0.5 nm) to (11 ⁇ 1 nm) versus time).
  • NP too as the rate of association with RNA increases, the rate of association of monomeric NP with oligomers increases. This suggests a "crosstalk" between the RNA binding domain and the oligomerization loop.
  • MDCK cells were cultured at 80% confluence at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 and antibiotics in a minimum medium (EMEM, Sigma, L-glutamine, Gibco and NAHCO 3 7.5%). presence of 5% fetal calf serum on 12-well plates (0.32 x 10 6 cells / well) for 24 hours. The cells were rinsed with serum-free medium and Pinoculum (400 ⁇ l) of Influenza A / WSN / 33 virus was adsorbed for one hour on the cells at a multiplicity of infection (MOI) of 10 -3 (kinetic study).
  • MOI multiplicity of infection
  • the results of FIG. 8 show an average of the results on 6 experiments carried out at increasing concentrations of naproxen. Thus, it is observed that the higher the concentration of naproxen used, the higher the viral titre rapidly decreases.
  • A549 cells were cultured for 24 hours on microscope slides deposited at the bottom of wells of P6 plates. The same protocol as above was followed for the immunofluorescence measurements. The cells were fixed with paraformaldehyde at 3 hours or 24 hours post-infection and the primary labeling was carried out by addition of an anti-NP mouse monoclonal antibody. The addition of a fluorescein-labeled anti-mouse secondary antibody (FITC) allowed for direct fluorescence readout. The cells were also treated with DAPI, allowing nuclei to be labeled. This double labeling revealed the nuclear localization of the NP and its possible modification related to the presence of antivirals. As in previous experiments, kinetics were performed at different post-infection times, 3 hours and 24 hours and different MOIs of 1, 5 and 10.
  • the MTT test (based on the use of a tetrazolium salt) is a cell viability test based on mitochondrial activity. This salt is reduced by mitochondrial succinate dehydrogenase from living cells to formazan, which causes a yellow to blue-violet color change that can be quantified by a change in absorbance at 560 nm. We used this test to show the non-toxicity of our compounds in the presence of human lung A549 cells. 30,000 cells per well were seeded on plates 24 hours before the start of the experiment. The antivirals were added at concentrations of 1 to 500 ⁇ to the cells for 24 hours or 48 hours before revelation.
  • the MTT was then freshly dissolved in PBS (5mg / ml) and then added (20 ⁇ l per well) and incubated for one hour at 37 ° C.
  • the cells were rinsed and dried before addition of ⁇ of DMSO per well. The reading was made at 560 nm by subtracting the background noise at 670 nm.
  • Figure 10 shows that naproxen is not toxic to A549 cells after incubation of 48H, and that contrary, it promotes their growth, especially after 24H. 8) In vivo test protocol for the effect of naproxen treatment in mice
  • the antiviral efficacy of naproxen was tested in vivo in 6 week old Balb / C female mice (kept at the pet shop for one week without special treatment). On the day after their arrival, the mice were inoculated or not with 2000 pfu / ml of Influenza A / PR8 / 34 virus (10 mice per condition) intranasally. Potential cytotoxic effects of naproxen were tested by comparing untreated mice (without virus) to mice treated once daily at doses of 1 mg or 3 mg per mouse (in the absence of virus). The virus was inoculated intranasally under anesthesia (ketamine / xylazine). Naproxen was administered immediately after intraperitoneally (1 or, 3, old data) and (1, 3, 4, 8 mg, new data) in 50 ⁇ 1 of physiological saline).
  • the weight curve of each mouse is recorded every day for 7 days.
  • the weight curves are shown in Figs. 11A and 12 and have been reported to the weight measured on the day of infection and correspond to weight averages on a sample of 10 to 15 mice.
  • Figure 11A the figure is representative of 3 experiments, performed with a load of 2000 pfu PR8 administered intranasally.
  • Figure 12 is representative of 2 experiments with a viral load of approximately 50 pfu (0.01LD50)
  • the mice were sacrificed after one week without death. Bronchoalveolar lavage was performed prior to removal of the lungs for viral titre determination. A sample of bronchoalveolar washes was slide-loaded by centrifugation using a cytospin on a slide.
  • A3 corresponds to lungs of infected mice
  • F2 corresponds to uninfected mouse lungs
  • the number present under the indication of the type of mouse analyzed in FIG. 13 corresponds to the index explaining the weight loss.
  • El mice, for example, have a weight loss of 19% (indices of 0.79) while A3 mice have a weight loss of 31% (index 0.69) compared to a mouse whose lungs are not. infected (index 1, 01 is 101% of the initial weight).
  • Naproxen derivative A (formerly referred to in the "Naproxen A derivative” or “Naproxen A” application for the purpose of increasing the affinity for NP by addition of a negatively charged grouping (fragment-based design).
  • the Naproxen A derivative was then modified into Naproxen B, cO, cl, c2 and c3 derivatives.
  • the last three compounds correspond to a change in the OCH3 group (methoxy group of Naproxen).
  • the in silico results of the Naproxenes B, cl, c2 and c3 derivatives are not presented here.
  • Figure 14 compares Naproxen compounds derived from Naproxen A and Co at the end of the 10 ns of MD.
  • the NP residues involved in the interaction with Naproxen A and Co derivatives are: R355, RI 52, N149, weaker interaction with Y148 or R361, in contrast to Naproxen.
  • Naproxen A is synthesized in three steps according to Scheme 1.
  • Commercially available 2-bromo-6-methoxynaphthalene 1 is lithiated by n-BuLi and treated with DMF to give 6-methoxy-2-naphthaldehyde 2 with a 90% yield.
  • the 3-naphthalenyl-substituted glutaric acid 3, or naproxen A is then obtained in a 65% yield in two stages by reacting the naphthaldehyde 2 with two equivalents of ethyl acetoacetate and a catalytic amount of piperidine, followed by hydrolysis in the presence of aqueous potassium hydroxide in EtOH.
  • Naproxen competes with the combination of RNA to NP, this competition is evidenced by the decline in the signal of the NP-RNA complex, Panel A. This is not observed in the presence of mutated proteins in residues involved in the NP - naproxen interaction, R361A (or Y148A), because the interaction of Naproxen with R361A is abolished by mutation (Panel B), consistent with modeling.
  • Panel C shows the direct binding of Naproxen to NP bound to the surface but not to R361A, the 2 immobilized proteins remaining active and capable of binding RNA. However, the signals are too weak for a quantitative determination of d.
  • the R152A mutation has no effect on Naproxen while it reduces the affinity of Naproxen A and Co derivatives (Table 2).
  • R361 A abolishes the binding of all derivatives, which is anticipated for Naproxen.
  • Naproxen does not bind to the mutant R416A, known to be an inactive monomer.
  • the fluorescence measurements were carried out using a Jasco fluorimeter equipped with a sample holder thermostated at 20 ° C.
  • a stem-looping sequence was used: 5 'AU GAC AUC AU G AU 3' (SEQ ID NO: 9), the underlined bases being engaged in a pairing and forming the stem.
  • the binding of NP induces the opening of the stem-loop, away from R of Q, resulting in an exaltation of fluorescence.
  • R is excited at 525 nm, the fluorescence is collected between 535 and 650 nm.
  • the wild-type NP proteins or its mutants were injected at concentrations of 100 to 500 nM in the presence or absence of 50 nM and 20 ⁇ antiviral, up to 300 ⁇ in some cases.
  • the samples were injected at a flow rate of 25 ⁇ 1 / ⁇ .
  • the NP-L410 interaction was evaluated by two indirect competition methods where the L410-NP complex is formed in competition with the NP-RNA complex.
  • the viral titers of the clarified cell supernatants are determined on crystal violet plates at 24, 48 and 72 hours post-infection. The experiments are done in triplicate and repeated at least twice.
  • the said selected compounds are the following:
  • Table 7 Tests carried out on infected MDCK cells, 24h and 48h viral titre post-infection (MOI) measurements, the concentration of the compounds Naproxen and triazole derivatives and the corresponding ICI 0 and IC50 for each of these compounds.
  • the triazole compounds L410, 59 and 72 are antivirals approximately 2 times more effective than Naproxen, without cellular toxicity.

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Abstract

L'invention porte sur une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une infection virale par un virus Influenza de type A chez un sujet, laquelle composition comprend un composé ayant la propriété d'agir en tant qu'inhibiteur de la fixation de l'ARN viral à la nucléoprotéine des virus Influenza de type A, ledit composé ayant la propriété de se lier au domaine de liaison de l'ARN viral sur ladite nucléoprotéine. L'invention porte également sur une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une infection virale par un Orthomyxo virus chez un sujet, laquelle composition comprend un composé ayant la propriété d'agir en tant qu'inhibiteur de la fixation de l'ARN viral à la nucléoprotéine des Orthomyxovirus, ledit composé ayant la propriété de se lier au domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine desdits virus. L'invention porte en outre sur un composé ayant la propriété d'agir en tant qu'inhibiteur de la fixation de l'ARN viral à la nucléoprotéine des virus Influenza de type A, ledit composé ayant la propriété de se lier au domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine des virus Influenza de type A et sur un procédé d'identification d'un composé ayant la propriété de se lier au niveau du domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine des virus Influenza de type A.

Description

COMPOSITIONS ANTIVIRALES DIRIGEES CONTRE LA NUCLEOPROTEINE
DES VIRUS INFLUENZA
La présente demande de brevet revendique la priorité de la demande de brevet français FR1 1/01253 déposée le 21 avril 201 1 dont le contenu est incorporé ici par référence.
Art antérieur
La présente invention concerne des compositions pharmaceutiques comprenant des composés inhibiteurs de la fixation de TARN viral aux nucléoprotéines des virus Influenza A, l'utilisation desdites compositions pour le traitement d'infection par un virus Influenza de type A ainsi qu'une méthode d'identification de tels composés inhibiteurs.
Les virus de la grippe, à savoir les virus Influenza, sont responsables chaque année de nombreuses infections touchant les voies respiratoires et allant jusqu'à tuer entre 250 000 et 500 000 personnes dans le monde. Outre les souches saisonnières, de nouvelles souches ont émergé au cours de ces dernières années : le virus Influenza A H1N1 qui a émergé chez le porc a provoqué une pandémie relativement importante en 2009 entraînant toutefois une faible mortalité. La souche Influenza A H5N1, plus communément connu sous le nom de « grippe aviaire », ayant émergé chez les races animales aviaires, est apparue particulièrement pathogène, l'infection s'étendant aux humains avec un taux de mortalité atteignant les 60%.
Les virus Influenza responsables de la grippe sont des virus à ARN simple brin appartenant à la famille des Orthomyxovirideae et constituant le genre Influenza virus. Ce genre est réparti en trois types de virus Influenza A, B ou C, le type dépendant des caractéristiques antigéniques de certaines protéines desdits virus et n'infectant pas les mêmes hôtes.
Les virus Influenza de type A ont la capacité d'infecter différentes espèces animales, notamment les mammifères et les oiseaux, et possèdent un fort pouvoir pathogène. Ils présentent la particularité d'être subdivisés en différents sous-types dépendant des protéines de surface hémagglutinines (HA) et neuraminidases (NA) qu'ils présentent. A ce jour, 16 hémagglutinines (Hl à H 16) et 9 neuraminidases (NI à N9) ont été identifiées.
Ces virus sont structuralement constitués de 8 segments d'ARN simple brin de polarité négative dans une capside virale elle-même protégée par une enveloppe phospholipidique. Ces 8 segments d'ARN codent pour les différentes protéines virales nécessaires à la transcription des segments d'ARN à polarité négative en fragments d'ARN à polarité positive mais aussi nécessaires à la réplication virale, à savoir les nucléoprotéines qui s'associeront chacune à un fragment d'ARN ainsi que les protéines PA, PBl et PB2 formant un complexe polymérase ribonucléoprotéique. Sont également encodés par ces derniers les protéines structurales du virus telles que les protéines de l'enveloppe (neuraminidase et hémagglutinine) mais aussi les protéines Ml et M2 se situant sous ou dans l'enveloppe virale pour maintenir la structure des virus ainsi que les protéines non structurales NS I et NS2.
Les fragments ARN des virus Influenza ayant une polarité négative, ils doivent être transcrits en des fragments d'ARN messagers à polarité positive par des enzymes virales ARN polymérase ARN-dépendante en vue d'une réplication virale. Les fragments ARN à polarité positive servent alors d'ARN messagers nécessaires à la traduction protéique.
L'infection de cellules hôtes par virus Influenza A et la propagation des virions produits par lesdites cellules est assurée par l'activité de deux protéines de l'enveloppe virale: Γ hémagglutinine et la neuraminidase.
L'hémagglutinine HA est une glycoprotéine trimérique constituée de deux sous-unités HAÏ et HA2 possédant des sites de fixation spécifiques à certains récepteurs pour l'attachement du virus à la cellule hôte et la libération du génome viral dans le cytoplasme de ladite cellule hôte. L'hémagglutinine est en effet responsable de l'attachement du virus à la cellule cible au niveau de l'acide sialique, également appelé acide N-acétyl-neuraminique, terminal des chaînes des glycoprotéines ou glycolipides des récepteurs membranaires de la cellule hôte permettant ainsi l'entrée du virus dans la cellule par endocytose. Une fois que le virus a fusionné avec la membrane de la cellule hôte, le génome viral contenu dans la capside est libéré dans le cytoplasme de la cellule hôte.
La neuraminidase est également une protéine de surface des virus Influenza A. Bien que présente en moins grande quantité que l'hémagglutinine, son rôle n'en est pas moins complémentaire. En effet, la neuraminidase possède une activité enzymatique responsable du clivage des liaisons osidiques formées entre l'hémagglutinine à la surface des virions et les résidus d'acide sialique de la membrane de la cellule hôte. Les virions nouvellement formés et attachés à la membrane de la cellule infectée peuvent donc être libérés, ceci évitant leur agrégation au niveau de la cellule hôte. Cette activité enzymatique facilite également le détachement des virions du mucus riche en acide sialique et présent au niveau de Pépithélium respiratoire. Face à la virulence de certaines souches de virus Influenza A, telles que la souche H5N1, mais également face au grand nombre d'infections provoqués par les virus Influenza A responsables des grippes saisonnières entraînant un taux de mortalité non négligeable, il apparaît comme étant de plus en plus nécessaire de mettre au point des inhibiteurs de ces virus en vue d'une meilleure protection et d'un meilleur traitement de la population.
Les traitements actuels de la grippe consistent majoritairement en des antiviraux dirigés contre les protéines des virus influenza A.
L'Amantadine, distribué sous le nom MANTADIX®, permet d'inhiber la réplication du virus par fixation à la protéine M2, protéine-canal ionique de la capside des virus. Il permet également d'inhiber la fusion entre ladite capside et la membrane plasmique de la cellule hôte ainsi que le relargage du matériel génétique viral dans le cytoplasme de la cellule hôte.
La Rimantadine présente également une action d'inhibition de la fusion de la capside virale avec la membrane de la cellule hôte par inactivation de la protéine M2.
La neuraminidase est également une des cibles antivirales existantes avec notamment l'oseltamivir (sous le nom commercial TAMIFLU ®) et le zanamivir (RELENZA ®) inhibiteurs de ladite protéine présente en surface des virus.
D'autres inhibiteurs des virus Influenza et dirigés contre les ARN polymérases ARN- dépendante restent potentiellement utilisables mais interfèrent fréquemment avec les fonctions cellulaires de l'hôte et sont très peu spécifiques des virus Influenza. La Ribavirin est un de ces inhibiteurs. Outre le traitement des virus Influenza, elle est également utilisée pour le traitement d'infections au virus syncytial respiratoire ou le traitement de l'hépatite C.
Malheureusement, les virus Influenza développent de plus en plus de résistance à ces traitements antiviraux. Ces phénomènes de résistance sont dus à la grande plasticité génique que présentent les virus Influenza. Deux phénomènes sont impliqués dans l'apparition d'une forte variation du génome des virus : les glissements antigéniques, causés par des variations mineurs du génome résultant de substitution d'un ou plusieurs acides aminés sur une ou deux protéines (HA ou NA), ainsi que les sauts antigéniques, résultant de l'infection mixte de deux virus de type A différents dont les fragments sont recombinés.
Au cours de l'épidémie de grippe de 2008-2009, la quasi-totalité des virus saisonniers
H 1N1 circulant aux Etats-Unis s'est avérée résistante au TAMIFLU® et toutes les souches isolées de H3N2 étaient résistantes aux amantadines. Il a également été noté que la moitié des individus infectés par le virus H5N1 sont morts malgré un traitement avec les deux classes d'antiviraux dirigés contre les protéines de surface des virus Influenza A. Il apparaît donc comme étant nécessaire de mettre au point au plus vite de nouveaux inhibiteurs des virus Influenza A capables de traiter les infections auxdits virus tout en étant moins sensibles aux phénomènes de variations géniques de ceux-ci.
Résumé de l'invention
Dans cette optique, les inventeurs ont identifié de nouveaux antiviraux ciblant la nucléoprotéine (NP) des virus Influenza A, laquelle protéine s'associe avec l'ARN viral ainsi qu'une AR polymérase virale pour former le complexe ribonucléoprotéique responsable de la transcription et de la réplication virale.
Constitutive de la structure des virus, la nucléoprotéine des virus Influenza de type A est une protéine interne synthétisée à partir de l'ARN messager viral dans la cellule hôte, ce qui lui confère un taux de mutation nettement inférieur à celui des protéines de surface sujettes aux sauts et glissements antigéniques tels que décrits précédemment. Il a en effet été observé que les nucléoprotéines des virus de type Hl et H5 présentent un très fort taux d'identité (97%). Par ailleurs, la nucléoprotéine présente également l'avantage de ne pas être présente dans les cellules hôtes infectées par des virus. Ainsi, tout composé destiné à agir spécifiquement au niveau de la nucléoprotéine n'entraînera pas à priori d'interférence avec les mécanismes cellulaires ou les protéines de la cellule hôte.
Les inventeurs ont donc identifié des composés capables de se lier spécifiquement au niveau du domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine des virus Influenza de type A. La fixation de l'ARN viral sur la nucléoprotéine desdits virus n'est pas spécifiquement dépendante d'une séquence particulière. C'est la structure même de la protéine qui permet à l'ARN viral de se loger dans un sillon formé au niveau du centre de la nucléoprotéine pour former le complexe nucléoprotéique auquel se fixera l'ARN polymérase pour former le complexe ribonucléoprotéique.
Les inventeurs ont en effet démontré que l'utilisation de composés capables de se lier au niveau dudit domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine des virus Influenza de type A empêche la fixation dudit ARN sur la nucléoprotéine, et ce de manière compétitive. L'absence de fixation de l'ARN viral à la nucléoprotéine inhibe la formation du complexe ribonucléoprotéique avec TARN polymérase, complexe nécessaire à la transcription et à la réplication virales.
En analysant la structure du domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine des virus Influenza ainsi que les portions protéiques à proximité dudit domaine, les inventeurs ont également mis en évidence une corrélation entre la fixation de l'ARN et l'oligomérisation de la nucléoprotéine ; ceci implique que des inhibiteurs capables d'empêcher la fixation de l'ARN viral à la nucléoprotéine des virus Influenza de type A entraîneront aussi une déficience au niveau de l'oligomérisation de la nucléoprotéine, étape nécessaire à la réplication virale.
L'utilisation de composés capable de se lier au domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine permet donc d'inhiber la réplication virale à deux niveaux par inhibition de la formation du complexe ribonucléoprotéique ainsi que par inhibition de l'oligomérisation de la nucléoprotéine.
Les antiviraux selon l'invention sont donc destinés à traiter des sujets infectés par un virus Influenza, notamment de type A grâce à un mécanisme d'action spécifique associé au site de fixation de l'ARN viral sur la nucléoprotéine dudit virus.
Par ailleurs, les antiviraux actuellement disponibles pour lutter contre les infections par certaines souches de virus Influenza de type A sont soumis aux contraintes de variabilité desdites souches du fait de mutations fréquentes au niveau des protéines de surface desdits virus. En plus d'être soumis à ces phénomènes de mutation entraînant la mise au point d'antiviraux capables d'agir contre les virus mutés, l'utilisation des antiviraux actuellement disponibles est également limitée au traitement spécifique d'infections par certaines souches de virus Influenza de type A, lesdites souches étant dépendantes des types de protéines cibles présentes à la surface des virus.
Au contraire, les antiviraux selon l'invention ne ciblent pas les protéines de surface des virus Influenza, notamment de type A, mais sont destinés à se fixer au niveau du domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine desdits virus.
La nucléoprotéine des virus Influenza constitue une protéine interne non sujette aux phénomènes fréquents de mutation tels qu'observés chez les protéines de surface de ces virus. Ainsi, même les souches de virus Influenza, notamment de type A, qui présenteront des mutations notamment au niveau de leurs protéines de surface resteront des cibles des antiviraux selon l'invention. En outre, la nucléoprotéine constitue également une protéine majoritairement conservée au sein des différentes souches de virus Influenza de type A et des autres types. Outre la conservation de la séquence de la nucléoprotéine au sein des souches de virus Influenza (supérieure à 90%), il a été démontré que le sillon fixant l'ARN en particulier au niveau de ladite nucléoprotéine ne varie pas au niveau structural entre un virus HlNl et H5N1 (Ye et al, 2006, Ng et al, 2008). Ainsi, en plus de s'astreindre des problèmes de variabilité de la nucléoprotéine, les antiviraux selon l'invention présentent l'avantage de pouvoir être utilisés pour traiter un large spectre d'infections par des virus Influenza de type A et ce, sans spécificité de souches, contrairement aux antiviraux actuellement sur le marché.
L'invention porte donc sur de nouveaux composés ayant la propriété d'agir en tant qu'inhibiteur de la fixation de l'ARN viral à la nucléoprotéine des virus Influenza de type A en se liant au domaine de liaison de l'ARN viral sur ladite nucléoprotéine, inhibant ainsi la réplication virale.
Un premier aspect de l'invention porte donc sur une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une infection virale par un virus Influenza de type A chez un sujet, laquelle composition comprend un composé ayant la propriété d'agir en tant qu'inhibiteur de la fixation de l'ARN viral à la nucléoprotéine des virus Influenza de type A, ledit composé ayant la propriété de se lier dans un site formant une sphère d'au moins 12 ângstrôms (Â) de diamètre centrée sur le résidu TYR148 appartenant au domaine de liaison de l'ARN viral sur ladite nucléoprotéine, ledit domaine : comprenant les acides aminés Arg65, Gin 149, Tyrl48, Argl50, Argl52, Argl56, Argl74, Argl 75, Argl95, Argl99, Arg213, Arg214, Arg221, Arg236, Pro354, Arg355, Lys357, Arg361 , Arg391 , Lysl 84, Lysl98, Gly212, Ile217, Ala218, Lys227, Lys229, Lys273 et Val353 d'une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l , de préférence tout acide aminé situé à une distance de moins de 5 ângstrôms desdits acides aminés, et
étant délimité de deux boucles, la première boucle comprenant les résidus acides aminés Glu73 à Lys90 et la deuxième boucle comprenant les résidus acides aminés Gly200 à Arg214 d'une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l . et caractérisée en ce que ledit composé est choisi parmi :
• un composé Naproxène de formule (A) ou un de ses dérivés de formule (B) avec : Formule (A)
Figure imgf000008_0001
Formule (B)
Figure imgf000008_0002
Avec :
Rl= -Ph(COOH)2 ou -Ph(COOH)2-X-Ar avec X = CH2 ou O et Ar = Ph ou PhOH ou PhOMe ou PhNH2 ou imidazole ou pyrrole
Ou RI =-CHR5R6 avec :
R5 = -(CH2)nCOOH ou -(CH2)nS03H avec n = 0-3 ou -(CH2)nPhCOOH ou -Ph(COOH)2 ou -(CH2)nPhS03H
Et R6 = H, -CH3 ou tout groupement aliphatique linéaire ou -(CH2)nOH avec n = 1- 3 ou CONH2 ou Cl ou F ou R6 = R5
R2 = F, Cl ou R2 = R3
R3 = H, -CH3 ou tout groupement aliphatique linéaire ou équivalents ramifiés ou - (CH2)nOH avec n = 0-4 ou -(CH2)nNH2 avec n = 0-4 ou -(CH2)nCONH2 avec n = 0-3
R4 = OH ou OR3 ou H le triazole de formule (C) ou un de ses dérivés de formule (D) ou (E) avec :
Figure imgf000009_0001
Formule (E)
Figure imgf000010_0001
Avec :
- Rl= (CH2)n(COOH)m ou (CH2)n(S03H)m avec n=0-3, m=l ou N02,
- R2 = H, F, Cl, ou SH
- R3= CH3 ou tout groupement aliphatique ou -(CH2)n-OH n=0-4 ou -(CH2)n- NH2 ou OCH3 ou 0(CH2)nCH3 ou 0(CH2)nNH2
- R4 = H, F, Cl
avec pour la formule E :
- R5 = un phenyl carboxylate ou sulfate ou sulfonate -Ph(CH2)nCOOH ou Ph(CH2)nS03H ou R5= H, F, Cl et
- R6 = R5 ou R6= -Ph-(OH)m (m = 0 -4) ou -Ph-(OCH3) ou R6= H, F, Cl
De manière préférée, ladite composition selon l'invention est caractérisée en ce que ladite séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l correspondant à la séquence SEQ ID N°2.
De manière préférée, ladite composition selon l'invention est caractérisée en ce que ledit domaine de liaison comprenant plus de 10% de résidus acides aminés arginines, préférentiellement plus de 20% de résidus acides aminés arginine.
De manière préférée, ladite composition selon l'invention est caractérisée en ce que ledit composé n'est pas un dérivé nitré du Naproxène tel que décrit dans la demande internationale PCT WO 2005/030224 Al de ligne 1 , page 2 à la ligne 14, page 17. De manière préférée, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que le sujet est un mammifère, de préférence un humain, infecté par un virus Influenza de type A.
Selon un autre aspect, l'invention porte sur une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une infection virale par un Orthomyxovirus chez un sujet, laquelle composition comprend un composé tel que défini dans la revendication 1.
De manière préférée, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que ledit composé n'est pas un dérivé nitré du Naproxène tel que décrit dans la demande PCT WO 2005/030224 Al (NICOX) de la ligne 1, page 2 à la ligne 14, page 17.
De manière préférée, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que ledit composé n'est pas un dérivé du triazole tel que décrit dans la demande internationale PCT WO 2007134678 A2 (MERCK) de la ligne 4, page 19 à la ligne 20, page 39 et de la ligne 19, page 45 à la ligne 31, page 50.
De manière préférée, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que ledit composé est le composé Naproxène de formule (A) ou un de ses dérivés de formule (B) tels que définis dans la revendication 1.
De manière préférée, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que ledit composé est un dérivé du Naproxène de Formule (L)
Formule (L)
Figure imgf000011_0001
Avec :
- Rl= -Ph(COOH)2 ou -Ph(COOH)2-X-Ar avec X = CH2 ou O et Ar = Ph ou PhOH ou PhOMe ou PhNH2 ou imidazole ou pyrrole
Ou RI = -CHR5R6 avec :
R5 = -<CH2)nCOOH ou -(CH2)nS03H avec n = 0-3 ou -(CH2)nPhCOOH ou -Ph(COOH)2 ou -(CH2)nPhS03H Et R6 = H, -CH3 ou tout groupement aliphatique linéaire ou -(CH2)nOH avec n = 1 -3 ou CONH2 ou Cl ou F ou R6 = R5
- R2 = R3
- R3 = H
- R4 = H
De manière encore plus préférée, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que ledit composé est le composé dérivé du Naproxène de formule (F) ou le composé dérivé du Naproxène de formule (G) :
Formule (F)
Figure imgf000012_0001
Formule (G)
Figure imgf000012_0002
De manière préférée, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que ledit composé est un triazole de formule (C) ou un de ses dérivés de formules (D) ou (E) tels que définis précédemment.
De manière préférée, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que le sujet est un mammifère, plus préférentiellement un humain, infecté par un Orthomyxo virus.
De manière préférée, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que ladite composition est destinée au traitement d'une infection virale par un virus Influenza chez un sujet. De manière préférée, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que le sujet est un mammifère, plus préférentiellement un humain, infecté par un virus Influenza.
De manière préférée, la composition selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle peut comprendre un support pharmaceutiquement acceptable.
Un autre aspect de l'invention concerne un composé ayant la propriété d'agir en tant qu'inhibiteur de la fixation de l'ARN viral à la nucléoprotéine des virus Influenza de type A, ledit composé ayant la propriété de se lier dans un site formant une sphère d'au moins 12 ângstrôms (Â) de diamètre centrée sur le résidu TYR148 appartenant au domaine de liaison de l'ARN viral sur ladite nucléoprotéine, ledit domaine :
- comprenant les acides aminés Arg65, Gin 149, Tyrl48, Argl 50, Argl52, Argl56, Argl74, Argl 75, Argl95, Argl99, Arg213, Arg214, Arg221, Arg236, Pro354, Arg355, Lys357, Arg361 , Arg391, Lysl 84, Lysl98, Gly212, Ile217, Ala218, Lys227, Lys229, Lys273 et Val353 d'une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l, de préférence tout acide aminé situé à une distance de moins de 5 ângstrôms desdits acides aminés, et
étant délimité de deux boucles, la première boucle comprenant les résidus acides aminés Glu73 à Lys90 et la deuxième boucle comprenant les résidus acides aminés Gly200 à Arg214 d'une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l. et caractérisée en ce que ledit composé est choisi parmi :
• un composé Naproxène de formule (A) ou un de ses dérivés de formule (B) avec :
Formule (A)
Figure imgf000013_0001
Formule (B)
Figure imgf000014_0001
Avec :
- Rl= -Ph(COOH)2 ou -Ph(COOH)2-X-Ar avec X = CH2 ou O et Ar = Ph ou PhOH ou PhOMe ou PhNH2 ou imidazole ou pyrrole
Ou RI = -CHR5R6 avec :
R5 = -(CH2)nCOOH ou -(CH2)nS03H avec n = 0-3 ou -(CH2)nPhCOOH ou -Ph(COOH)2 ou -(CH2)nPhS03H
Et R6 = H, -CH3 ou tout groupement aliphatique linéaire ou -(CH2)nOH avec n = 1-3 ou CONH2 ou Cl ou F ou R6 = R5
- R2 = F, Cl ou R2 = R3
R3 = H, -CH3 ou tout groupement aliphatique linéaire ou équivalents ramifiés ou - (CH2)nOH avec n = 0-4 ou -(CH2)nNH2 avec n = 0-4 ou -(CH2)nCONH2 avec n = 0-3
- R4 = OH ou OR3 ou H
• le triazole de formule (C) ou un de ses dérivés de formule (D) ou (E) avec :
Formule (C)
Formule (D)
Figure imgf000015_0001
Formule (E)
Figure imgf000015_0002
Avec :
- Rl= (CH2)n(COOH)m ou (CH2)n(S03H)m avec n=0-3, m=l ou N02,
- R2 = H, F, Cl, ou SH
- R3= CH3 ou tout groupement aliphatique ou -(CH2)n-OH n=0-4 ou -(CH2)n- NH2 ou OCH3 ou 0(CH2)nCH3 ou 0(CH2)nNH2
- R4 = H, F, Cl
avec pour la formule E :
R5 = un phenyl carboxylate ou sulfate ou sulfonate Ph(CH2)nCOOH ou Ph(CH2)nS03H ou R5= H, F, Cl et - R6 = R5 ou R6= Ph-(OH)m (m = 0 -4) ou Ph-(OCH3) ou R6= H, F, Cl
et caractérisé en ce qu'il n'est ni un dérivé du triazole tel que décrit dans la demande internationale PCT WO 2007134678 A2 (MERCK) de la ligne 4, page 19 à la ligne 20, page 39 et de la ligne 19, page 45 à la ligne 31, page 50, ni un dérivé nitré du Naproxène tel que décrit dans la demande PCT WO 2005/030224 Al (NICOX) de la ligne 1, page 2 à la ligne 14, page 17.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé d'identification d'un composé ayant la propriété de se lier au niveau du domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine des virus Influenza de type A, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) Modéliser la structure en trois dimensions (3D) de la nucléoprotéine d'un virus Influenza de type A ;
b) Générer un modèle en 3 dimensions (3D) du domaine de liaison de l'ARN viral sur ladite nucléoprotéine à partir de la structure obtenue en a):
- Ledit domaine comprenant les acides aminés Arg65, Glnl49, Tyrl48, Argl 50, Argl 52, Argl 56, Argl 74, Argl 75, Argl 95, Argl 99, Arg213, Arg214, Arg221, Arg236, Pro354, Arg355, Lys357, Arg361 , Arg391 , Lysl 84, Lysl98, Gly212, Ile217,
Ala218, Lys227, Lys229, Lys273 et Val353 d'une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l , de préférence tout acide aminé situé à une distance de moins de 5 ângstrôms desdits acides aminés, et
- Ledit domaine étant délimité par deux boucles, la première boucle comprenant les résidus acides aminés Glu 73 à Lys 90 et la deuxième boucle comprenant les résidus acides aminés Gly 200 à Arg 214 d'une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l .
c) Cribler un ou plusieurs composés sur le modèle en 3D dans un site du domaine de liaison de l'AR selon b) formé par une sphère d'au moins 12 ângstrôms (Â) de diamètre centrée sur le résidu Tyr 148;
d) Identifier un composé capable de se lier audit domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine, ledit composé étant susceptible d'inhiber la fixation de l'ARN à la nucléoprotéine des virus Influenza de type A et pouvant donc potentiellement être utilisé comme un inhibiteur de la réplication virale.
De manière préférée, ledit procédé est caractérisé en ce qu'une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l est la séquence SEQ ID N°2.
De manière préférée, ledit procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape complémentaire e) consistant à tester in vitro la capacité d'un composé identifié selon l'étape d) à inhiber la fixation de l'ARN viral sur la nucléoprotéine ainsi que la réplication virale.
De manière préférée, ledit procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une étape (f) consistant à sélectionner un tel composé comme étant un inhibiteur de la réplication virale.
Description des figures
Figure 1 : Structure représentative de la de la Nucléoprotéine sauvage de virus Influenza de type A.
Figure 2 : Structure cristalline de la Nucléoprotéine de virus Influenza de type A montrant un large sillon central destiné à la fixation de l'ARN.
Figure 3 : Root Mean Square Fluctuation (RMSF) de la nucléoprotéine NP et des mutants R361A et R416A.
Figure 4 : Fixation du naproxène dans le sillon de fixation de l'ARN de la nucléoprotéine et résidus impliqués dans l'interaction, à la fois par formation de liaisons électrostatiques avec R361 (R355) ou polaire (N149) et hydrophobes avec Y148, F489.
Figure 5 : Nucléoprotéine de virus Influenza de type A dont les acides aminés correspondant au sillon destiné à la fixation de l'ARN sont représentés en foncé. Figure 6 : Détection de signaux résultant de la fixation de NP ou des mutants R416A et R361 A à des ARN simples brins.
Figure 7 : Corrélation entre la vitesse de formation du complexe de NP ou des mutants R416Aet R361 A avec la vitesse apparente d'oligomérisation
Figure 8 Décroissance du titre viral de cellules MDC infectées par un virus Influenza de type A/WSN avec une multiplicité d'infection (MOI) de 10"3 en présence de naproxène ajouté à t=0.
Figure 9 : Comparaison de l'effet du naproxène - tamiflu sur des cellules MDCK infectées par un virus Influenza A /WSN.
Figure 10 : Test de viabilité cellulaire MTT sur des cellules A549 avec du naproxène
Figure 1 1 : Effet d'un traitement au naproxène chez la souris. A : perte de poids normalisée au poids initial au jour de l'infection ; B : titre viral des poumons de souris 7 jours après infection. Résultats représentatifs de 3 expériences, 7 à 10 souris sont utilisées pour chaque concentration de naproxen et pour le témpoin dans chaque expérience; infection intranasale avec 2000 pfu par le virus A/PR8 (H1N1)
Figure 12 Comparaison de la perte de poids moyenne par un virus Influenza de type A/PR8 à 50 pfu/ml sans et avec injection IP 2 mg de naproxène/souris/jour ou 0.2 mg tamiflu/ souris/jour.
Figure 13 : Observation de cellules pulmonaires de cellules infectées (A), infectées et traitées (B), non infectées (C).
Figure 14 : Docking du Naproxène A et cO dans la nucléoprotéine du virus Influenza
A
Figure 15 : Structure des composés d'intérêt Naproxène A et Naproxène cO
Figure 16: Compétition du Naproxène avec l'association de l'ARN à NP
Figure 17 : Résultats du test par résonance à plasmon de surface pour le Naproxène et le Naproxène cO
Figure 18 : Schéma du test de fluorescence
Figure 19 : Mesure du titre viral en présence de différents inhibiteurs : composé 59, composé 72 et naproxène.
Description détaillée de l'invention Selon un premier aspect, l'invention porte sur une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une infection virale par un virus Influenza de type A chez un sujet, laquelle composition comprend un composé ayant la propriété d'agir en tant qu'inhibiteur de la fixation de l'ARN viral à la nucléoprotéine des virus Influenza de type A, ledit composé ayant la propriété de se lier dans un site formant une sphère d'au moins 12 ângstrôms (Â) de diamètre centrée sur le résidu Tyr 148, appartenant au domaine de liaison de l'ARN viral sur ladite nucléoprotéine, ledit domaine :
comprenant les acides aminés Arg65, Glnl49, Tyrl48, Argl 50, Argl52, Argl56, Argl74, Argl 75, Argl95, Argl99, Arg213, Arg214, Arg221 , Arg236, Pro354, Arg355, Lys357, Arg361 , Arg391, Lysl84, Lysl98, Gly212, Ile217, Ala218, Lys227,
Lys229, Lys273 et Val353 d'une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l, de préférence tout acide aminé situé à une distance de moins de 5 ângstrôms desdits acides aminés, et
étant délimité par deux boucles, la première boucle comprenant les résidus acides aminés Glu73 à Lys90 et la deuxième boucle comprenant les résidus acides aminés
Gly200 à Arg214 d'une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l .
On entend par « nucléoprotéine des virus Influenza de type A» la protéine virale destinée à s'associer avec un fragment nucléique virale ainsi qu'une ARN polymérase en vue de former le complexe ribonucléoprotéique responsable de la transcription ainsi que de la réplication virale. Les nucléoprotéines sont des protéines connues de l'Homme de l'art et peuvent présenter des variations selon les souches dont elles sont issues. Des exemples de séquences protéiques de nucléoprotéines de virus Influenza de type A sont les suivants :
SEQ ID N°2, nucléoprotéine de la souche H1N1 du virus Influenza de type A/WSN/1933, numéro d'accession GenBank CY034135,
- SEQ ID N°3, nucléoprotéine de la souche A/Brevig Mission/1/1918(H IN 1), numéro d'accession GenBank AY744935,
- SEQ ID N°4, nucléoprotéine de la souche A/HongKong/483/97(H5Nl), numéro d'accession GenBank AF084277.
De manière préférée, une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l est la séquence SEQ ID N°2.
Un composé selon l'invention est capable de se lier à la nucléoprotéine des virus influenza de type A au niveau du domaine de liaison de l'ARN viral empêchant ainsi la liaison de ce dernier à la nucléoprotéine. L'inhibition de la fixation de l'ARN viral sur la nucléoprotéine a deux conséquences qui restent toutefois corrélées : d'une part, le complexe ribonucléoprotéique, composé de la nucléoprotéine, l'ARN viral et l'ARN polymérase, ne peut se former, d'autre part les inventeurs ont démontré que la fixation de l'ARN viral sur la nucléoprotéine jouait un rôle dans l'oligomérisation de la nucléoprotéine, étape nécessaire à la réplication virale. Ainsi, l'absence de fixation de l'ARN viral à la nucléoprotéine empêche non seulement la formation du complexe ribonucléoprotéique mais aussi l'oligomérisation de la protéine, ceci entraînant une absence de réplication virale.
Du fait du mécanisme d'action des composés selon l'invention au niveau du domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine des virus Influenza de type A, la composition pharmaceutique selon l'invention permet de traiter tout sujet infecté par un virus Influenza de type A sans spécificité de souches et en l'absence de problématique en lien avec la variabilité de la nucléoprotéine.
On entend par « domaine de liaison » en référence à la nucléoprotéine de virus Influenza de type A le domaine protéique auquel se fixe l'ARN viral pour former le complexe nucléoprotéique.
Le site de liaison des composés est centré autour d'un résidu acide aminé Tyrosine en position 148. Cet acide aminé est conservé dans les nucléoprotéines des différents types de virus Influenza de type A mais également dans les nucléoprotéines des virus Influenza de type B et C et est directement impliqué dans la formation de liaisons entre l'ARN viral et la nucléoprotéine.
Le domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine des virus Influenza de type A forme un sillon central distinct dans la structure de la nucléoprotéine comme on peut l'observer sur la figure 2. Ledit domaine constitue une région riche en acides aminés basiques Arginines et lysines favorisant la liaison avec une molécule inhibitrice ou un acide nucléique.
De manière préférée, ledit domaine de liaison comprend plus de 10% de résidus acides aminés arginines, préférentiellement plus de 15% de résidus acides aminés arginine.
De manière toujours préférée, ledit domaine de liaison comprend les résidus acides aminés arginines suivants : Arg65, Argl 50, Argl 52, Argl 56, Argl 74, Argl 75, Argl95, Argl 99, Arg213, Arg214, Arg221 , Arg236, Arg355, Arg361 , Arg391.
Toujours de manière préférée, ledit domaine de liaison comprend les résidus acides aminés lysines suivants : Lys357, Lysl 84, Lysl98, Lys227, Lys229 et Lys273. Les inventeurs ont également mis en évidence que le domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine des virus Influenza de type A est délimité par plusieurs boucles protéiques présentant un rôle dans l'activité de la nucléoprotéine. Ainsi, deux boucles ont été identifiées comme participant à la fixation de l'ARN viral sur la nucléoprotéine : la première boucle comprend les résidus acides aminés Glu73 à Lys90 et la deuxième boucle comprend les résidus Gly200 à Arg214. Ces boucles (également appelées « loop ») sont visibles sur la figure 1.
On entend par « sujet » un mammifère, de préférence un humain, infecté par un virus Influenza de type A.
De manière préférée, un composé tel que défini précédemment n'est pas un dérivé nitré du Naproxène tel que décrit dans la demande internationale PCT WO 2005/030224 Aide la ligne 30 page 2 à la page 17 incorporées ici par référence.
Le Naproxène, également « naproxen », est un anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) de formule (A) :
Formule (A)
Figure imgf000021_0001
De manière préférée, un composé tel que défini précédemment est un composé Naproxène de formule (A) ou un de ses dérivés de formule (B) avec :
Formule (A)
Figure imgf000021_0002
Formule (B)
Figure imgf000022_0001
Avec :
Rl= -Ph(COOH)2 ou -Ph(COOH)2-X-Ar avec X = CH2 ou O et Ar = Ph ou PhOH ou PhOMe ou PhNH2 ou imidazole ou pyrrole
Ou RI = -CHR5R6 avec :
R5 = -(CH2)nCOOH ou -(CH2)nS03H avec n = 0-3 ou -(CH2)nPhCOOH ou -Ph(COOH)2 ou -(CH2)nPhS03H
Et R6 = H, -CH3 ou tout groupement aliphatique linéaire ou -(CH2)nOH avec n = 1 -3 ou CONH2 ou Cl ou F ou R6 = R5
R2 = F, Cl ou R2 = R3
R3 = H, -CH3 ou tout groupement aliphatique linéaire ou équivalents ramifiés ou - (CH2)nOH avec n = 0-4 ou -(CH2)nNH2 avec n = 0-4 ou -(CH2)nCONH2 avec n = 0-3
R4 = OH ou OR3 ou H
Selon un autre mode de réalisation préféré, un composé tel que défini précédemment composé Naproxène de formule (A) ou un de ses dérivés de formule (B) avec :
Formule (A)
CH3 Formule (B)
Figure imgf000023_0001
Avec :
- Rl= -(CH2)n(COOH)m ou -(CH2)n(S03H)m avec n=0-3, m=l, phenyl carboxylate ou sulfate ou sulfonate -Ph(CH2)nCOOH ou -Ph(COOH)2 ou -Ph(CH2)n(S03H)2
- R2 = H, F, Cl, ou
- R3= -CH3 ou tout groupement aliphatique CH3 -(CH2)n- ou -(CH2)n -OH avec n=0- 4 ou -(CH2)n- NH2 ou -(CH2)nCONH2
- R3' = OH ou OR3 ou H
- R4= -CH3 ou tout groupement aliphatique CH3 -(CH2)n- ou -(CH2)n -OH n=0-3 ou CONH-R3 ou H, F, Cl ou R3=R2.
Toujours de manière préférée, un composé tel que défini précédemment est un dérivé du Naproxène de Formule (L) :
Formule (L)
Figure imgf000023_0002
Avec :
- Rl= -Ph(COOH)2 ou -Ph(COOH)2-X-Ar avec X = CH2 ou O et Ar = Ph ou PhOH ou PhOMe ou PhNH2 ou imidazole ou pyrrole
Ou RI = -CHR5R6 avec :
R5 = -(CH2)nCOOH ou -(CH2)nS03H avec n = 0-3 ou -(CH2)nPhCOOH ou -Ph(COOH)2 ou -(CH2)nPhS03H
Et R6 = H, -CH3 ou tout groupement aliphatique linéaire ou -(CH2)nOH avec n = 1-3 ou CONH2 ou Cl ou F ou R6 = R5
- R2 = R3
- R3 = H
- R4 = H
Toujours de manière préférée, un composé tel que défini précédemment est un dérivé de Naproxène de formule (F) et ci-après appelé « dérivé du Naproxène A » ou « Naproxène
A » :
Formule (F)
Figure imgf000024_0001
De manière encore plus préférée, un composé tel que défini précédemment est un dérivé de Naproxène de formule (G) et ci-après appelé « dérivé du Naproxène cO » ou « Naproxène cO » :
Formule (G)
Figure imgf000024_0002
Toujours de manière préférée, un composé tel que défini précédemment est le triazole ule (C) ou un de ses dérivés de formule (D) ou (E) avec :
Formule (C)
Figure imgf000025_0001
Formule (E)
Figure imgf000026_0001
Avec :
- Rl= (CH2)n(COOH)m ou (CH2)n(S03H)m avec n=0-3, m=l , ou N02
- R2 = H, F, Cl, ou SH
- R3= CH3 ou tout groupement aliphatique ou -(CH2)n-OH n=0-4 ou - (CH2)n-NH2 ou OCH3 ou 0(CH2)nCH3 ou 0(CH2)nNH2
- R4 = H, F, Cl
avec pour la formule E :
- R5 = un phenyl carboxylate ou sulfate ou sulfonate -Ph(CH2)nCOOH ou
-Ph(CH2)nS03H ou R5= H, F, Cl et
- R6 = R5 ou R6= Ph-(OH)m (m = 0 -4) ou Ph-(OCH3) ou R6= H, F, Cl
Toujours de manière préférée, un composé tel que défini précédemment est choisi parmi un dérivé du triazole de formule (H), (I), (J) ou (K) respectivement nommés composé L410, composé 59, composé 72 et composé 88 avec :
Figure imgf000027_0001
Formule (J) - 72
Figure imgf000028_0001
Formule (K) - 88
Figure imgf000028_0002
Selon un second aspect, l'invention porte sur une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une infection virale par un Orthomyxovirus chez un sujet, laquelle composition comprend un composé ayant la propriété d'agir en tant qu'inhibiteur de la fixation de l'ARN viral à la nucléoprotéine des Orthomyxovirus, ledit composé ayant la propriété de se lier au domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine desdits virus tel que défini précédemment.
Les Orthomyxovirus constituent la famille des virus à ARN simple brin Orthomyxoviridae. Cette famille inclue notamment les cinq genres de virus Influenza de type A, de type B et de type C, les Isovirus ainsi que les Thogotovirus. Les virus Influenza sont notamment à l'origine des infections grippales des vertébrés, lesdits virus de type A infectant les humains ainsi que d'autres mammifères et oiseaux, les virus Influenza de type B étant responsable de l'infection des humains et des phoques et les virus Influenza de type C étant à l'origine de l'infection des humains et des porcs. Concernant les Isovirus, ceux-ci sont responsables des infections de saumons tandis que les Thogotovirus infectent des vertébrés ainsi que des invertébrés tels que les parasites du poisson ou les moustiques.
On entend ici par « sujet » un mammifère, de préférence un humain, infecté par un virus appartenant à la famille des Orthomyvoviridae.
De manière préférée, un composé dans une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une infection virale par un Orthomyxovirus selon l'invention n'est pas un dérivé nitré du Naproxène tel que décrit dans la demande PCT WO 2005/030224 Al (NICOX) de la ligne 1, page 2 à la ligne 14, page 17 incorporées ici par référence.
Toujours de manière préférée, un composé selon l'invention dans une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une infection virale par un Orthomyxovirus n'est pas un dérivé du triazole tel que décrit dans la demande internationale PCT WO 2007134678 A2 (MERCK) de la ligne 4, page 19 à la ligne 20, page 39 et de la ligne 19, page 45 à la ligne 31 , page 50 incorporées ici par référence.
De manière préférée, un composé selon l'invention dans une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une infection virale par un Orthomyxovirus est le composé Naproxène de formule (A) ou un de ses dérivés de formule (B) tels que définis précédemment.
De manière encore plus préférée, un composé selon l'invention dans une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une infection virale par un Orthomyxovirus est un dérivé de Naproxène de formule (L).
De manière encore plus préférée, un composé selon l'invention dans une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une infection virale par un Orthomyxovirus est le dérivé de Naproxène de formule (F).
De manière encore plus préférée, un composé selon l'invention dans une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une infection virale par un Orthomyxovirus est le dérivé de Naproxène de formule (G).
Toujours de manière préférée, un composé selon l'invention dans une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une infection virale par un Orthomyxovirus est un triazole de formule (C) ou un de ses dérivés de formules (D) ou (E) tels que définis précédemment. Toujours de manière préférée, un composé selon l'invention dans une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une infection virale par un Orthomyxovirus est un dérivé du triazole choisie parmi les composés de formules (H), (I), (J) et (K).
De manière préférée, la composition pharmaceutique destinée au traitement d'une infection virale par un Orthomyxovirus est destinée au traitement d'une infection virale par virus Influenza chez un sujet.
De préférence, un sujet selon l'invention est un mammifère, plus préférentiellement un humain, infecté par un virus Influenza.
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut en outre comprendre un support pharmaceutiquement acceptable.
Le terme « pharmaceutiquement acceptable » se réfère à des entités moléculaires ou compositions étant physiologiquement tolérables et ne produisant pas typiquement de réaction allergique ou réaction similaire non supportable, tels qu'un dérangement intestinal ou des vertiges, lors de son administration chez le sujet. De manière préférée, le terme « pharmaceutiquement acceptable » utilisée ici signifie approuvé par une agence réglementaire d'un gouvernement fédéral ou d'un état ou listé dans la pharmacopée américaine ou toute autre pharmacopée généralement reconnue pour l'utilisation chez les animaux, et plus particulièrement chez les humains.
Le terme « support » se réfère à un diluant, adjuvant, excipient ou véhicule avec lequel le composé selon l'invention est administré. De tels supports pharmaceutiques peuvent être des liquides stériles, tels que l'eau ou des huiles, incluant ceux d'origines pétrolières, animale, végétale ou encore synthétique, telles que les huiles de cacahuète, soja, minérale ou encore de sésame. L'eau ou toute solution aqueuse, solution saline ou encore solution aqueuse de dextrose ou glycérol sont employées de manière préférée en tant que supports, et plus particulièrement pour des solutions injectables. À titre d'exemple, la composition peut comprendre des émulsions, des microémulsions, des émulsions huile dans l'eau, des lipides anhydres et des émulsions eau dans l'huile, ou d'autres types d'émulsions. Des supports pharmaceutiquement acceptables sont décrits dans l'ouvrage "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin.
La composition selon l'invention peut comprendre en outre un ou plusieurs additifs tels que les diluants, les excipients, les stabilisateurs et les conservateurs. De tels additifs sont bien connus de l'homme du métier et sont décrits notamment dans « Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th Ed. » (différents éditeurs, 1989-1998, Marcel Dekker); et dans "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery System"s (ANSEL et al., 1994, WILLIAMS & WILKINS).
La composition selon l'invention pourra se trouver sous une forme administrable par voie parentérale, notamment par voie intraveineuse, intra-péritonéale, intradermique, sous- cutanée ou encore intra-artérielle ou sous une forme administrable par voie orale ou par voie pulmonaire ou nasale. Le choix de la voie d'administration de la composition selon l'invention dépendra de la forme de la composition à administrer, des supports pharmaceutiquement acceptables choisis ou encore de la rapidité d'efficacité voulue. L'homme du métier sera à même au regard de ses connaissances dans le domaine de choisir la voie d'administration la mieux adaptée.
Selon un mode de réalisation préféré, ladite composition est destinée à une administration par voie parentérale.
Selon un autre mode de réalisation préféré, ladite composition est destinée à une administration par voie orale.
Le dosage du composé inhibiteur dans la composition pharmaceutique selon l'invention sera ajusté selon le type d'administration de la composition.
Selon un troisième aspect, l'invention porte sur un composé ayant la propriété d'agir en tant qu'inhibiteur de la fixation de l'ARN viral à la nucléoprotéine des virus Influenza de type A, ledit composé ayant la propriété de se lier au domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine des virus Influenza de type A tel que défini précédemment, et caractérisé en ce qu'il n'est ni un dérivé du triazole tel que décrit dans la demande internationale PCT WO 2007134678 A2 (MERCK)de la ligne 4, page 19 à la ligne 20, page 39 et de la ligne 19, page 45 à la ligne 31 , page 50 incorporées ici par référence, ni un dérivé nitré du Naproxène tel que décrit dans la demande PCT WO 2005/030224 Al ( ICOX) de la ligne 1 , page 2 à la ligne 14, page 17 incorporées ici par référence.
De manière préférée, un composé selon l'invention est le composé Naproxène de formule (A) ou un de ses dérivés de formule (B) tels que définis précédemment.
De manière encore plus préférée, un composé selon l'invention est un dérivé de Naproxène de formule (L).
De manière encore plus préférée, un composé selon l'invention est le dérivé de Naproxène de formule (F). De manière encore plus préférée, un composé selon l'invention est le dérivé de Naproxène de formule (G).
Toujours de manière préférée, un composé selon l'invention est un triazole de formule (C) ou un de ses dérivés de formules (D) ou (E) tels que définis précédemment.
Toujours de manière préférée, un composé selon l'invention est un dérivé du triazole choisie parmi les composés de formules (H), (I), (J) et ( ).
Selon un quatrième aspect, l'invention porte sur une méthode de traitement d'une infection par un Orthomyxovirus, de préférence un virus Influenza ou un virus Influenza de type A, chez un sujet, laquelle méthode comprend l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition telle que décrite précédemment audit sujet.
Tel qu'utilisé pour la présente méthode de traitement, le terme « sujet » correspond à un mammifère, de préférence ledit sujet est un humain, infecté par un Orthomyxovirus, de préférence un virus Influenza ou un virus Influenza de type A.
Les inventeurs ont en effet démontré que l'utilisation d'un composé capable de se lier au niveau du sillon dans lequel se loge l'ARN viral au niveau de la nucléoprotéine des virus Influenza A empêchait la fixation de l'ARN viral au niveau de ladite nucléoprotéine. Les inventeurs ont également démontré que l'absence de fixation de l'ARN viral à la nucléoprotéine aboutissait à l'absence d'oligomérisation de ladite protéine. Ainsi, l'utilisation d'un composé selon l'invention permet non seulement d'inhiber la fixation de l'ARN viral à la nucléoprotéine mais en outre d'inhiber l'oligomérisation de ladite protéine, ces deux inhibitions ayant pour conséquence d'inhiber la réplication virale.
Par « quantité thérapeutiquement efficace », on entend une quantité suffisante pour aboutir à l'effet biologique désirée, dans le présent cas une diminution du titre viral résultant d'une infection par un virus Influenza de type A.
Le composé selon l'invention peut être administré en une ou plusieurs fois, la quantité dudit composé étant alors ajustée en fonction du nombre d'administrations envisagées. Ainsi, la quantité de composé à administrer pour le traitement d'une infection par un virus Influenza de type A selon l'invention peut être comprise en 0, 1 milligrammes (mg) et 2000 mg par jour.
L'homme du métier sera à même de déterminer ladite quantité thérapeutiquement efficace au regard de ses connaissances générales (voir par exemple e.g., Berkow (1987), infra, Goodman (1990), infra, Avery (1987), infra, Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, Mass. (1985), and Katsung (1992), infra) et/ou à l'aide de simples expériences de routine.
Selon un cinquième aspect, l'invention porte sur un procédé d'identification d'un composé ayant la propriété de se lier au niveau du domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine des virus Influenza de type A, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) Modéliser la structure en trois dimensions (3D) de la nucléoprotéine d'un virus Influenza de type A ;
b) Générer un modèle en 3 dimensions (3D) dudit domaine de liaison de l'ARN viral (Figure 5) sur ladite nucléoprotéine à partir de la structure obtenue en a):
Ledit domaine comprenant les acides aminés Arg65, Gin 149, Tyrl48, Argl50, Argl52, Argl56, Argl 74, Argl75, Argl95, Argl99, Arg213, Arg214, Arg221, Arg236, Pro354, Arg355, Lys357, Arg361 , Arg391, Lysl 84, Lysl98, Gly212, Ile217, Ala2 8, Lys227, Lys229, Lys273 et Val353 d'une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l de préférence tout acide aminé situé à une distance de moins de 5 ângstrôms desdits acides aminés, et
Ledit domaine étant délimité par deux boucles, la première boucle comprenant les résidus acides aminés Glu73 à Lys90 et la deuxième boucle comprenant les résidus acides aminés Gly200 à Arg214 d'une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l .
c) Cribler un ou plusieurs composés sur le modèle en 3D du domaine de liaison selon b) ; d) Identifier un composé capable de se lier dans un site formant une sphère d'au moins 12 ângstrôms (Â) de diamètre centrée sur le résidu Tyr 148, appartenant audit domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine, ledit composé étant susceptible d'inhiber la fixation de l'ARN à la nucléoprotéine des virus Influenza de type A et pouvant donc potentiellement être utilisé comme un inhibiteur de la réplication virale.
De manière préférée, une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l est la séquence SEQ ID N°2.
De préférence, le domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine d'un virus Influenza de type A tel que défini précédemment a la forme d'un sillon logé au centre de la nucléoprotéine tel que représenté sur la figure 2. On entend par « structure en trois dimensions (3D) » en référence à une protéine la conformation de ladite protéine dans l'espace obtenue à partir de la séquence primaire de cette protéine consistant en succession linéaire d'acides aminés.
La modélisation de la structure de la nucléoprotéine des virus Influenza de type A en trois dimensions (3D) à partir de la séquence primaire de ladite protéine est une méthode connue de l'Homme de l'art qui sera à même de la reproduire avec les méthodes à sa disposition et connues dans le domaine. La modélisation de la structure 3D de ladite nucléoprotéine peut notamment être reproduite à partir de la structure de la nucléoprotéine d'un virus Influenza telle que celle de la souche H1N1 accessible sous les références PDB ID:2IQH ou MMDB ID : 43435 (Ye Q., Krug R.M. et al, 21 décembre 2006, Nature, vol.444 (7122), pp:1078-82).
La modélisation en 3D du domaine de liaison selon l'invention consiste à concevoir à l'aide d'un logiciel de modélisation la structure tridimensionnelle dudit domaine par ajout, soustraction ou modification de ses constituants, par exemple les acides aminés, à partir de la structure cristalline de la nucléoprotéine telle que définie précédemment.
Le terme « cribler » définit la méthode qui consiste à tester plusieurs composés avec le domaine de liaison de Γ ARN viral sur la nucléoprotéine des virus Influenza de type A en trois dimensions en vue d'identifier un composé capable de se fixer audit domaine ainsi que son activité.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé d'identification selon l'invention comprend une étape complémentaire e) consistant à tester in vitro la capacité d'un composé identifié selon l'étape d) à inhiber la fixation de l'ARN viral sur la nucléoprotéine ainsi que la réplication virale.
Des tests in vitro en vue de déterminer la capacité d'un composé à inhiber la fixation de l'ARN viral sur la nucléoprotéine ainsi que l'efficacité de traitement d'une infection virale par un virus Influenza de type A sont exemplifiés ci-après dans la présente demande et sont connus de l'Homme de l'art.
De manière préférée, le procédé d'identification selon l'invention comprend en outre une étape (f) consistant à sélectionner un tel composé comme étant un inhibiteur de la réplication virale.
Les exemples suivants détaillent l'invention en faisant référence à diverses méthodes. Aucune limitation de l'invention ne doit être considérée au regard du détail de ces exemples. L'invention comprend tout mode de réalisation qui comprendrait des détails non mentionnés de manière explicite dans les exemples suivants, mais que l'Homme de l'art sera capable de trouver sans effort déraisonnable.
EXEMPLES
1) Méthode d'identification de composés capable de se lier au domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine de virus Influenza A
Le criblage selon l'invention comprend plusieurs étapes, toutes effectuées in silico par modélisation moléculaire et détaillées ci-dessous. Ce criblage permet d'identifier des molécules potentiellement inhibitnces de la fixation de l'ARN viral à NP. Ces molécules sont extraites de chimiothèques commerciales, dans le cas présent, la chimiothèque utilisée était le catalogue Sigma.
La modélisation est basée sur la structure cristallographique de la nucléoprotéine (NP) de références PDB ID:2IQH ou MMDB ID : 43435 (Ye Q., Krug RM. et al, 21 décembre 2006, Nature, vol.444 (7122), pp : 1078-82) et à laquelle les résidus manquants ont été rajoutés. Cette structure a été minimisée avant le criblage effectué à l'aide du logiciel commercial Discovery Studio accessible à l'adresse suivante : http://accelrys.com/products/discovery-studio/structure-based-design.html, en utilisant le catalogue Sigma (version 2008) en tant que chimiothèque. Les coordonnées 2D fournies ont été transformé en coordonnées 3D nécessaires au logiciel. La séquence de la nucléoprotéine correspond à la séquence SEQ ID N°l .
La région ciblée dans NP est constituée par une sphère de rayon 12Â centrée sur le résidu Y148. Y148 permet de « docker » l'inhibiteur par des interactions d'empilement de type π-π. Cette sphère comprend de plus les résidus chargés R361 et RI 52 formant des liaisons électrostatiques ou des liaisons H avec l'inhibiteur, dans certains cas, les résidus RI 50 et Q149 sont aussi engagés dans des liaisons H. Les simulations de dynamique moléculaire de NP et de deux de ses mutants R416A, R361A ont été réalisées à l'aide du logiciel NAMD (Phillips, J. C et al (2005), Journal of Computational Chemistry, vol.26, pp : 1781-1802) utilisant le champ de force du programme CHARMM27 (MacKerell, A. D et al, Biopolymers , vol. 56, pp : 257-265) basées sur la structure publiée de la nucléoprotéine de H1N1 (2IQH).
Les portions manquantes dans cette structure cristallographique ont été générées à l'aide de SWISS-MODEL. Le solvant a été traité de façon explicite par le modèle (TIP3P) pour les molécules d'eau (Jorgensen, W. L et al, 1983, Journal of Chemical Physics, vol. 79, pp : 926-935). Le monomère A de NP a été centré dans un cube d'eau de 155.4 Â de côté. Les interactions électrostatiques ont été calculées sans être tronquées par l'algorithme d'Ewald et le système a été neutralisé par l'ajout de 16 ions chlorures (Darden, T., et al, 1993, Journal of Chemical Physics, vol. 98, pp : 10089-10092). Les interactions de van der Waals ont été annulées de façon progressive entre 10.0 Â et 12.0 Â. Les atomes d'hydrogène ont été générés par l'algorithme SHAKE (Ryckaert, J. P et al, 1977, Journal of Computational Chemistry, vol. 23, pp .327-341), des itérations des équations de mouvement par pas de 2 fs ont été produites par intégration Verlet des vitesses. Un algorithme de minimisation du gradient d'énergie a été utilisé et les molécules du soluté (protéine) ont été restreintes à leur position initiale par une force de 50.0 kcal/mol/Â2, de sorte de générer un gradient d'énergie potentielle RMS de 0.2 kcal/mol/Â. Ces contraintes ont été annulées et l'énergie potentielle minimisée jusqu'à ce que le gradient soit inférieur à 0.1 kcal/mol/Â. Le système a été chauffé à 300 K en 60 ps. Les simulations de dynamique moléculaire ont été utilisées pour équilibrer le système pendant 1ns, puis cinq trajectoires de 10 ns chacune ont permis de générer les structures de NP WT (foncées) et son mutant R.361 A (claires) (Figure 1).
La modélisation moléculaire a été utilisée pour définir et analyser la structure de la forme monomérique de NP, se basant sur la structure obtenue par cristallographie. Dans cette structure, la position des parties flexibles n'est pas résolue et la modélisation a rajouté ces boucles flexibles manquantes générées à l'aide de SWISS-MODEL.
Les protéines mutées R416A et R361A ont été crées à partir de la structure de la protéine sauvage (Wild-type ou wt). La dynamique moléculaire de chacune des trois protéines, wt, R416A et R361A a été simulée lors de cinq trajectoires indépendantes pendant 10 ns (10" s) par pas de 2 fs (10" s) pour comprendre comment sont régies les interactions à longue distance dans NP et induisant des modifications de l'association à l'ARN dans les mutants R361 A et R416 A. La dynamique de ces protéines placées dans des boîtes de solvant explicite a été analysée en calculant les fluctuations moyennes R416A (root mean squared fluctuations (RMSF)) du squelette protéique durant l'ensemble des trajectoires durant 50 ns.
La Figure 3 montre l'existence de 3 régions flexibles possédant une grande dynamique et donc un RMSF flexible significativement plus élevé que le reste de la protéine. Il s'agit de trois boucles flexibles, les deux premières encerclant le sillon de fixation de l'ARN sur l'une des faces de NP, Glu73 to Lys90 (boucle 1) et Gly200 -Arg214 (boucle 2). La troisième boucle se trouve sur l'autre face de NP et correspond au domaine d'oligomérisation (402- 428) d'un monomère pénétrant dans le monomère voisin au sein du trimère dans la structure cristallographique. Il est intéressant de constater la baisse significative de la fluctuation moyenne de la boucle 2 des mutants R416A et R361A par rapport à celle de NP. Ces modifications de flexibilité de la boucle 2 sont corrélées avec une faible augmentation des fluctuations de la boucle 1 chez les mutants par rapport à la protéine sauvage. Des modifications de la dynamique de la boucle d'oligomérisation (boucle 3) ont été observées en parallèle, cependant cette région de R416A devient plus mobile que NP, en accord avec l'absence d'oligomérisation de ce mutant. La boucle 3 du mutant R361A devient moins mobile que NP, suggérant une meilleure capacité d'oligomérisation, ce qui corrèle bien avec une proportion accrue de ce mutant en forme dimérique par rapport à la forme monomérique sauvage.
La Figure 1 présente une structure représentative de la NP sauvage (en foncé): les acides aminés wt : the R361 et R416 se trouvent dans le sillon de fixation de TARN et dans la boucle 3 d'oligomérisation respectivement. Les boucles 1, 2 et 3 du mutant R361A sont superposées en clair. On voit clairement que la boucle 1 du mutant R361A est très proche de la boucle 2, cette proximité est stabilisée par un pont salin entre Glu80 et Arg208, en accord avec la baisse de RMSF de la boucle 2 de R361A. Ceci contraste avec la cavité large et ouverte observée dans la protéine sauvage, qui peut aisément accommoder un ARN. Ces observations sont également observées dans le trimère de NP (16). Les boucles 1 et 2 de NP WT pourraient donc aider à accrocher l'ARN et le guider vers son sillon de fixation. Donc, lorsque la distance entre les boucles 1 et 2 devient faible chez R461A et R361A, la pince formée par ces 2 boucles devient trop étroite pour s'adapter à la taille de l'ARN. Ceci a pour conséquence de réduire l'accessibilité de l'ARN à son sillon de fixation chez les mutants comparé à celle de NP sauvage. R416A et R361A présentent en effet une affinité plus faible pour l'ARN que celle de NP et de plus une vitesse d'association plus faible. Les changements constatés dans la structure de la boucle 3 de R361A comparée à celle de NP alors que la mutation est introduite sur l'autre face de la protéine (dans le sillon de fixation de l'ARN) sont en accord avec l'hypothèse d'interactions à longues distances dans NP. Ces données sont publiées dans l'article : Tarus B, Chevalier C, Richard C-A, Delmas B, Di Primo C, et al. (2012) Molecular Dynamics Studies of the Nucleoprotein of Influenza A Virus: Rôle of the Protein Flexibility in RNA Binding. PLoS ONE 7(1): e30038. doi : 10.1371 /joumal.pone.0030038 La figure 4 montre la fixation du naproxène dans le sillon de fixation de l'ARN de la nucléoprotéine (représentation indiquant le potentiel électrostatique, les zones bleues foncées étant positivement chargées et donc permettant la fixation de l'ARN) ; le zoom dans la partie droite montre les résidus impliqués dans l'interaction, à la fois par formation de liaisons électrostatiques avec R361 (R355) ou polaire (N149) et hydrophobes avec Y148, F489.
2) Protocole démontrant la fixation du Naproxène et du triazol à la nucléoprotéine en compétition avec l'ARN viral
a) Test de résonance de plasmon de surface
Le premier test effectué pour démontrer la fixation du Naproxène en compétition avec l'ARN viral sur la nucléoprotéine de séquence SEQ ID N°2 est un test de résonance de plasmon de surface (BIACORE 3000). La manipulation a été effectuée selon les indications du fabricant (BIACORE SA).
Un fragment d'ARN viral a été fixé à une puce d'or recouverte de Dextran avec de la streptavidine qui lie de façon quasi irréversible l'extrémité biotinylée du fragment d'ARN. La fixation des fragments ARN à la puce d'or a été effectuée dans du PBS. Les mesures des signaux ont été effectuées avec 300 mM de NaCl, 20 mM de tampon Tris-HCl contenant également 0.025% de surfactant P20 à un pH de 7.4 et à une température de 25°C.
Les séquences des fragments d'ARN viral utilisés sont listées dans l'exemple 4.
Les nucléoprotéines ont été injectées à des concentrations allant de 4 à 1000 nM. Les mesures ont été effectuées à une température de 25°C. Les échantillons ont été injectés à une vitesse de 25 μΐ/min flow rate.
La liaison de la nucléoprotéine à l'ARN a provoqué un changement d'indice de réfraction proportionnel au poids moléculaire de la protéine et à la concentration de la protéine jusqu'à saturation (voir l'exemple 4 et la figure 6).
En comparant le signal obtenu en présence de NP WT seule au signal obtenu après ajout de Naproxène à la protéine sauvage, on a observé une baisse de signal lié à la présence de naproxène contrairement à l'observation d'une fixation de la nucléoprotéine à l'ARN biotinylé en seule présence de la protéine, la nucléoprotéine ne se fixe plus à l'ARN biotinylé mais a formé un complexe avec le Naproxène, indiquant de ce fait une compétition du Naproxène avec la fixation de la protéine à l'ARN viral (Figure 16A).
b) Test « molecular beacon » Un deuxième test utilisant un oligonucléotide nommé « molecular beacon » a été mis au point pour démontrer la fixation par compétition du Naproxène à la nucléoprotéine de SEQ ID N°2 (voir schéma Figure 18).
Un beacon est un oligonucléotide de séquence quasi-palindromique formant une épingle à cheveux (hairpin) et dont les extrémités 5' et 3' sont modifiées par un fluorophore et un quencher. Le beacon utilisée ici est un beacon de séquence SEQ ID N°8 dont l'extrémité 5' est greffée par un chromophore Cy5 et l'extrémité 3' par un quencher DAPCYL.
En l'absence de protéine, la fluorescence est éteinte : le fluorophore était proche du quencher lorsque l'oligonucléotide est apparié. La nucléoprotéine se fixant préférentiellement sur des ARN simple brin, sa fixation sur le beacon a induit l'ouverture de l'épingle à cheveux, ce qui se traduit par une augmentation de fluorescence, les 2 extrémités 5' et 3' se retrouvant éloignées l'une de l'autre.
Ce test a donc permis de suivre par fluorescence la fixation de la protéine de façon quantitative.
II a été observé qu'en présence de Naproxène, la fluorescence diminue : la nucléoprotéine se fixant au Naproxène et non à l'ARN, les extrémités en épingles à cheveux de ce dernier n'ont pas été écartées par compétition du naproxène empêchant la fixation de la nucléoprotéine à l'ARN
3) Approche de mutagenèse dirigée démontrant que la mutation des résidus de NP nécessaires à la fixation de Naproxène (N) abolit l'inhibition.
Le test de résonance de plasmon de surface tel que décrit dans l'exemple 2) a également été réalisé avec des protéines mutées au niveau des acides aminés R361A et Y148A. Il a été observé que le naproxène n'entre plus en compétition avec l'ARN, comme attendu par les interactions définies par modélisation moléculaire (Figure 4). Lorsqu'on utilise une protéine mutée, en particulier R361 A et Y148A, le naproxène n'entre plus en compétition avec l'ARN. Les acides aminés R361 et Y148 sont donc essentiels pour la fixation de l'ARN ou du naproxène à la nucléoprotéine des virus Influenza A (Figure 4, Figure 16 A et B et Tableau 2 page 47).
4) Caractérisation de l'association de NP à l'ARN et corrélation avec l'oligomérisation de NP
• Cintéiques d'association de NP et des mutants R416A et R361A à des ARN simple brin Les cinétiques d'association de la nucléoprotéine NP et des mutants R416A et R361 A à des ARN simple brin ont été suivies par résonance de plasmon de surface (SPR) tels que décrits dans l'exemple 2. Les vitesses d'association et dissociation de NP à une même séquence d'ADN, ARN et ARN et 2'-0-methyl ont été comparées. Les résultats sont regroupés dans le tableau 1 avec :
- La séquence Flul 24-mer de nature ADN correspond à SEQ ID N°5 :
La séquence Flul 24-mer de nature ARN correspond à SEQ ID N°6 :
- La séquence Flul 24-mer de nature 2'Omethyl RNA correspond à SEQ ID N°6 avec le sucre ribose modifié de telle sorte qu'il porte en position 2' un groupement méthyl La séquence rU25 25-mer de type ARN correspond à SEQ ID N°7
Tableau 1 vitesses d'association et dissociation de NP à une même séquence d'ADN, ARN et ARN et 2'-Q-methyl
Figure imgf000040_0001
Les données représentent la moyenne de 3 expériences. *Le rapport du signal observé à hautes concentrations de protéines sur la valeur de RU maximum attendue a été calculé connaissant le poids moléculaire de NP et celui d'un oligonucléotide partiellement complémentaire à la sonde FLU1 immobilisée sur la puce.
# Les valeurs de k0ffOnt été calculées à partir des valeurs expérimentales de Kd et kon .
Ces résultats montrent la formation de complexes ARN-protéine avec une stcechiométrie de 1/1. Ces protéines monomériques fixent donc d'abord l'ARN et Poligomérisation a lieu ultérieurement. L'association de wt NP résulte en la formation rapide d'un complexe NP-RNA avec une stoechiométrie 1 :1. Le tableau 1 montre une baisse d'un facteur 10 de l'affinité de R361 A compare à celle de NP sauvage.
La Figure 6 compare les signaux résultant de la fixation de NP à ceux obtenus avec une même concentration (300 nM) de R416A et R361A. Le mutant R416A ne se fixe pas à Flul-RNA, mais on peut déterminer une affinité de Kd = 10 ± 3 uM en utilisant des concentrations de R416A 1-100 μΜ. Voir publication : Bogdan Tarus, Olivier Bakowiez, Sylvie Chenavas, Leandro Estrozi, Christophe Chevalier, Christiane Bourdieu, Julie Bernard, Mohammed Moudjou, Bernard Delmas, Carmelo Di Primo, Rob WH Ruigrok and Anny Slama-Schwok : Multiple oligomerization paths of the nucleoprotein from Influenza A virus (2012) Biochimie: 94 776-785. doi.10.1016/j.biochi.201 1.1 1.009)
• Corrélation entre la vitesse d'association de NP à l'ARN et la vitesse apparente d'oligomérisation de NP et de ses mutants.
Des techniques supplémentaires comme la diffusion de lumière (dynamic light scattering, DLS) et la microscopie électronique (EM) ont été utilisées pour suivre le processus lent d'oligomérisation et en vue d'effectuer une corrélation entre la vitesse d'association de NP à l'ARN et la vitesse apparente d'oligomérisation de NP et de ses mutants. L'effet de la longueur de l'oligonucléotide et la nature de l'acide nucléique (DNA vs RNA) sur la cinétique d'oligomérisation de NP ou de son mutant R361A ont été testés. Les images de EM corroborent les échelles de temps dans lesquelles s'effectue l'oligomérisation de NP en présence d'ARN et définissent la forme des oligomères formés RNA en fonction de la longueur de l'ARN.
La vitesse de fixation de NP à l'ARN et la vitesse d'oligomérisation de NP et de ses 2 mutants en présence d'ARN sont bien corrélées. La vitesse de formation du complexe 1/1 de NP ou des mutants R416Aet R361A est corrélée avec la vitesse apparente d'oligomérisation (Figure 7). L'association anormale de R416A à l'ARN est associée à un défaut d'oligomérisation. De même, la réduction de la vitesse d'association de R361 A est aussi associée à une vitesse d'oligomérisation faible (déterminée en ajustant par une exponentielle les points expérimentaux obtenus par diffusion de lumière d'augmentation de taille apparente de (6.8±0.5 nm) à (1 1±1 nm) en fonction du temps). Avec NP aussi, lorsque la vitesse d'association à l'ARN augmente, la vitesse d'association de NP monomère en oligomères augmente. Ceci suggère un "dialogue" (crosstalk) entre le domaine de fixation à l'ARN et la boucle d'oligomérisation.
5) Protocole d'essai in vitro de l'effet antiviral de N sur des cellules MDCK infectées par la souche Influenza A/33AVSN.
Des cellules MDCK ont été mises en culture à 80% de confluence à 37°C en présence de 5% de C02 et d'antibiotiques dans un milieu minimum (EMEM, Sigma, L-glutamine, Gibco et NAHCO3 7.5%) en présence de 5% de sérum de veau foetal sur plaques à 12 puits (0.32 x 106 cellules/puits) pour 24 heures. Les cellules ont été rincées par du milieu sans sérum et Pinoculum (400μ1) de virus Influenza A/WSN/33 a été mis à adsorber une heure sur les cellules à une multiplicité d'infection (MOI) de 10"3 (étude cinétique) ou MOI 1 ou 5 (visualisation de l'effet à 24h et comparaison avec un autre antiviral). Après rinçage de Pinoculum, les cellules ont été mises à incuber avec différentes concentrations de naproxène (1 à 500 μΜ). Des cellules non infectées ont également été soumises à des incubations en parallèle avec des concentrations variables de naproxène. Le virus en se répliquant a été excrété dans le surnageant de culture dont on a prélevé des échantillons à 24, 48 et 72 heures post-infection (Figure 8). Le titre viral de ces prélèvements a été mesuré par la méthode de plage de lyse. Brièvement, des cellules MDCK ont été mises en contact avec des dilutions sériées des surnageants cellulaires et incluses dans de la carboxymethylcellulose. Les plages de lyse générées par le virus ont été révélées par fixation des cellules au formaldéhyde et marquage au cristal violet. Le comptage du nombre de plaques selon la dilution des surnageants cellulaires a permis d'établir le titre viral.
Les résultats de la figure 8 présentent une moyenne des résultats sur 6 expériences réalisées à concentrations croissantes de naproxène. Ainsi, on observe que plus la concentration en naproxène utilisée est grande, plus les titres viraux diminuent rapidement.
Certaines expériences ont été réalisées en parallèle en présence de naproxène et de tamiflu afin de comparer leur effet antiviral. La figure 9 montre que le titre viral diminue de façon similaire avec un traitement avec du Naproxène qu'avec du tamiflu dans le cas d'une mutliplicté d'infection MOI=l et démontre l'efficacité antiviral du naproxène comparativement au tamiflu. 6) Protocole d'essai in vitro de l'effet antiviral sur des cellules AS49 de poumon humain contre un challenge viral H1N1 souche WSN par immunofluorescence
Les cellules A549 ont été mises en culture pendant 24 heures sur des lamelles de microscope déposées au fond de puits de plaques P6. Le même protocole que ci-dessus a été suivi pour les mesures d' immunofluorescence. Les cellules ont été fixées au paraformaldéhyde à 3 heures ou 24 heures post-infection et l'on a procédé au marquage primaire par rajout d'un anticorps monoclonal de souris anti-NP. L'ajout d'un anticorps secondaire anti-souris marqué à la fluorescéine (FITC) a permis une lecture directe par fluorescence. Les cellules ont également été traitées au DAPI, permettant un marquage des noyaux. Ce double marquage a permis de révéler la localisation nucléaire de la NP et son éventuelle modification liée à la présence d' antiviraux. Comme dans les expériences précédentes, des cinétiques ont été réalisées à différents temps post-infection, 3 heures et 24 heures et différentes MOI de 1, 5 et 10.
Les résultats ont montré que le naproxène n'a pas modifié la localisation de la nucléoprotéine, qui est essentiellement nucléaire à temps t=3 heures alors que l'on a trouvé que la NP diffuse dans le cytoplasme et le noyau à t=24 heures. La présence de naproxène (50 à 100 μΜ) a diminué le nombre et la taille des foyers infectieux dans le tapis cellulaire et le nombre de cellules mortes. On a remarqué que de nombreux noyaux doubles étaient présents dans les cellules traitées à de hautes concentrations de naproxène, en accord avec une augmentation du nombre de cellules en phase S rapportée dans la littérature.
7) Protocole du test de viabilité cellulaire MTT démontrant l'absence de cytotoxicité aux concentrations utilisées
Le test MTT (basé sur l'utilisation d'un sel de tétrazolium) est un test de viabilité cellulaire reposant sur l'activité mitochondriale. Ce sel est réduit par la succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes en formazan, ce qui provoque un changement de couleur du jaune au bleu-violet qui peut être quantifié par un changement d'absorbance à 560 nm. Nous avons utilisé ce test pour montrer la non -toxicité de nos composés mis en présence de cellules A549 de poumon humain. 30 000 cellules par puits ont été ensemencées sur des plaques 24 heures avant le début de l'expérience. Les antiviraux ont été rajoutés à des concentrations de 1 à 500 μΜ aux cellules pendant 24H ou 48H avant révélation. Le MTT a alors été fraîchement dissous dans du PBS (5mg/ml) puis rajouté (20μ1 par puits) et incubé pendant une heure à 37°C. Les cellules ont été rincées et séchées avant ajout de ΙΟΟμΙ de DMSO par puits. La lecture a été faite à 560 nm en soustrayant le bruit de fond à 670 nm.
La figure 10 montre que le naproxène n'est pas toxique pour les cellules A549 après incubation de 48H, et qu'on contraire, il favorise leur croissance, en particulier après 24H. 8) Protocole d'essai in vivo de l'effet d'un traitement avec naproxène chez la souris
L'efficacité antivirale du naproxène a été testée in vivo sur des souris femelles Balb/C de 6 semaines (gardées à l'animalerie une semaine sans traitement particulier). Au jour j+7 de leur arrivée, les souris ont été inoculées ou non par 2000 pfu/ml de virus Influenza A/PR8/34 (10 souris par condition) par voie intranasale. D'éventuels effets cytotoxiques du naproxène ont été testés en comparant des souris non traitées (sans virus) à des souris traitées une fois par jour à des doses de lmg ou 3 mg par souris (en l'absence de virus). Le virus a été inoculé par voie intranasale sous anesthésie (kétamine /xylazine). Le naproxène a été administré juste après par voie intrapéritonéale (1 ou,3,anciennes données) et (1 , 3, 4, 8 mg, nouvelles données) dans 50μ1 de sérum physiologique).
La courbe de poids de chaque souris est enregistrée chaque jour, pendant 7 jours. Les courbes de poids sont représentées sur les figures 1 1 A et 12 et ont été rapportées au poids mesuré au jour de l'infection et correspondent à des moyennes de poids sur un échantillon de 10 à 15 souris. Dans le cas de la figure 11 A, la figure est représentative de 3 expériences, réalisées avec une charge de 2000 pfu PR8 administrée en intra-nasal. La figure 12 est représentative de 2 expériences avec une charge virale d'environ 50 pfu (0.01LD50) Les souris ont été sacrifiées après une semaine sans constat de décès. Un lavage bronchoalvéolaire a été effectué avant prélèvement des poumons pour détermination du titre viral. Un échantillon des lavages broncho alvéolaires a été déposé sur lame par centrifugation à l'aide d'un cytospin sur une lame. Les cellules fixées ont été marquées par coloration de May Grumwald, permettant de déterminer la présence on non d'une inflammation des poumons liée à l'infection virale, en particulier reflétée par un changement du nombre total de cellules. Sur la figure 13, A3 correspond à poumons de souris infectés, F2 correspond à des poumons de souris non infectées El correspond à des souris traitées avec 3 mg de naproxène. Le chiffre présent sous l'indication du type de souris analysé dans la figure 13 correspond à l'indice explicitant la perte de poids. Ainsi, les souris El enregistrent respectivement une perte de poids de 19% (indices de 0,79) tandis que les souris A3 enregistrent une perte de poids de 31% (indice 0,69) comparativement à une souris dont les poumons ne sont pas infectées (indice 1 ,01 soit 101 % du poids initial). Il a également été constaté un changement de populations cellulaires, essentiellement composées de macrophages alvéolaires dans un poumon sain (F2), alors que la présence de neutrophiles et d'éosinophiles ainsi que de globules rouges est caractéristique de poumons sanguinolents infectés par le virus (figure 13).
Les poumons des souris sacrifiées ont été broyés et congelés pour la détermination des titres viraux. Les résultats montrent une baisse d'environ un facteur 100 par administration of 0.2 mg tamiflu et d'un facteur 42 en administrant 2x4 mg naproxen par voie IP du titre viral des souris infectées traitées à 1 mg de naproxène par rapport aux témoins infectés non traités (figure 1 1B).
9) Design de dérivés du Naproxène et docking dans la nucléoprotéine NP de virus Influenza
Une seconde génération de composés dérivés du Naproxène a été construite : Construction du dérivé A du Naproxène, présentement appelé dans la demande « dérivé du Naproxène A » ou « Naproxène A » dans le but d'augmenter l'affinité pour NP par rajout d'un groupement chargé négativement (fragment-based design).
Par la suite, un test de la stabilité du complexe NP-dérivé Naproxène A par simulations MD (10 ns) a été effectué.
Le dérivé Naproxène A a ensuite été modifié en dérivés Naproxène B, cO, cl, c2 et c3. Les trois derniers composés correspondent à un changement du groupement OCH3 (groupement méthoxy du Naproxène). Les résultats in silico des dérivés Naproxènes B, cl, c2 et c3 ne sont pas présentés ici.
La figure 14 compare les composés Naproxène, dérivé du Naproxène A et cO à la fin des 10 ns de MD. Les résidus de NP engagés dans l'interaction avec les dérivés Naproxènes A et cO sont : R355, RI 52, N149, interaction plus faible avec Y148 ou R361 , en contraste avec le Naproxène.
Les formules chimiques des dérivés du Naproxène A et cO sont représentées sur la figure 15.
10) Protocole de synthèse chimique de dérivés du Naproxène : les dérivés Naproxène A et cO
a) Synthèse du naproxène A Le naproxène A est synthétisé en trois étapes selon le Schéma 1. Le 2-bromo-6- méthoxynaphthalène 1, disponible commercialement, est lithié par n-BuLi et traité par du DMF pour donner le 6-méthoxy-2-naphthaldéhyde 2 avec un rendement de 90%. L'acide glutarique 3-naphthalényle-substitué 3, ou naproxène A, est ensuite obtenu avec un rendement de 65% en deux étapes par réaction du naphthaldéhyde 2 avec deux équivalents d'acétoacétate d'éthyle et une quantité catalytique de pipéridine, suivie d'une hydrolyse en présence d'hydroxyde de potassium aqueuse dans l'EtOH.
Figure imgf000046_0001
1 2 3
Schéma 1. Synthèse du Naproxène A (composé 3). Réactifs et conditions: i/ n-BuLi (1.12 equiv.), THF anhydre, -78 °C, 30 min puis DMF (2.15 equiv.), -78 °C à température ambiante; ii/ Ethylacetoacetate (2.0 equiv.), EtOH, pipéridine (catalytique), 0 °C à température ambiante, 3 jours (rendement 70%); iii/ aq. OH (32 equiv., 24 M), EtOH, reflux, 3.5 hrs (rendement 92%). b) Synthèse du naproxène C0
Partant du bromo- w-xylene 4, nous préparons l'intermédiaire 2-bromoisophthalate de diméthyle 6 par oxydation des groupements méthyles par KMn04 dans un mélange tBuOH/H203 suivie de l'estérification du diacide carboxylique obtenu 5 dans le MeOH en présence d'H2S04 concentré (Schéma 2, haut). L'ester diméthylique 8 du naproxène C0 est synthétisé par un couplage de Suzuki entre le 2-bromoisophthalate 6 et l'acide 6-méthoxy-2- naphthalèneboronique 7 disponible commercialement.4 Les conditions utilisées, qui fournissent le composé 8 avec un rendement modeste de 45%, doivent être optimisées. Le Naproxène C0 (composé 9) est finalement obtenu après hydrolyse des fonctions esters dans LiOH aqueux et THF avec un bon rendement (91 %) et une pureté élevée (Schéma 2, bas).
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000047_0002
7 8 9
Schéma 2. Synthèse du Naproxène C0 (composé 9). Réactifs et conditions: il Mn04 (2.0 equiv.), tBuOH/H20 (1/1), reflux, 4 hrs, puis KMn04 (2.0 equiv.), reflux, 16 hrs; ii/ MeOH, conc. H2S04, reflux, 16 hrs; ί ii/ 2-bromoisophthalate de diméthyle 6 (0.92 equiv.), Pd(PPh3)4 (0.03 equiv.), aq. Na2C03 (4.2 equiv., 2 M), DME/EtOH, reflux, 16 hrs; iv/ aq. LiOH (7.2 equiv., 1 M), THF, reflux, 4 hrs.
11) Test réalisés in vitro avec des nucléoprotéines NP de souches sauvages ou des mutants purifiés et le composé Naproxène ainsi que ses dérivés Naproxène A et
Naproxène cO
Méthodes : test de résonance par plasmon de surface (SPR) (voir protocole ci-dessus pour la méthode indirecte avec ARN immobilisé sur une puce streptavidine et injection de NP +/- antiviral).
L'association directe du naproxène à NP a été réalisée à l'aide d'une puce CM5 et NP y a été immobilisée par couplage par les aminés comme indiqué par BiaCore. Les protéines mutées R361A ou Y148A ou R355A ou R152A ont été attachées de la même façon sur une autre piste de la même puce à une unité de résonnance comparable à celle de NP, gardant une piste témoin pour soustraire les effets non spécifiques. Afin de vérifier que des protéines ne sont pas dénaturées par immobilisation sur la surface, de TARN a été injecté dans chaque cas, attestant que ces protéines demeurent au moins en partie actives (Figure 16C)).
Les résultats sont décrits sur les figures 16 et 17 ainsi que dans le tableau 2 ci-dessous.
Le Naproxène entre en compétition avec l'association de TARN à NP, cette compétition est mise en évidence par la baisse du signal du complexe NP-ARN, Panel A. Ceci n'est pas observé en présence de protéines mutées dans des résidus impliqués dans l'interaction NP - naproxène, R361A (ou Y148A), car l'interaction du Naproxène avec R361A est abolie par la mutation (Panel B), en accord avec la modélisation.
Les résultats sont quantifiés, Panel D et tableau 2.
Le Panel C montre la fixation directe du Naproxène à NP liée à la surface mais pas à R361 A, les 2 protéines immobilisées demeurant actives et capables de lier TARN. Cependant, les signaux sont trop faibles pour une détermination quantitative des d.
Les résultats de SPR montrent l'amélioration du Naproxène cO (par rapport au Naproxène) à entrer en compétition avec l'association de l' ARN à NP (Ki plus bas d'environ un ordre de magnitude) (Fig 17 et Tableau 2). Le Naproxène A a un effet biphasique, introduisant une difficulté dans la caractérisation quantitative du Ki.
Comme attendu par la modélisation, la mutation R152A n'a pas d'effet sur le Naproxène tandis qu'elle réduit l'affinité des dérivés Naproxène A et cO (Tableau 2). R361 A abolit la fixation des tous les dérivés, ce qui est anticipé pour le Naproxène. Le Naproxène ne se fixe pas au mutant R416A, connu pour être un monomère inactif.
Tableau 2 : Inhibition in vitro de la liaison de l'ARN viral avec la NP par le Naproxène et ses dérivés (test SPR)
Composé Protéine Gamme de IC50
concentration du
ligand
Naproxen NP WT 50nM -50μΜ 3.3 ± 1 .0 μΜ
Naproxen cO NP WT 50n -50μΜ 0.32± 0.09 μΜ
Naproxen A NP WT 0.2 ± 0.1 μΜ βΪ ~2μΜ
Naproxen R152A 2.5 μΜ
Naproxen cO R152A 1 .2 ± Ο. Ι μΜ
Naproxen A R1 52A ~ 0.4μΜ
Naproxen R361 A Pas de liaison
Naproxen cO R361 A Pas de liaison
Naproxen A R361 A Pas de liaison
Naproxen R416A Pas de liaison
Figure imgf000049_0001
12) Test de toxicité et effet antiviral du Naproxène et de ses dérivés Naproxène A et Naproxène cO réalisés par des tests MTT, mesures du titre viral
Le protocole suivi correspond au protocole de test de toxicité tel que décrit ci-dessus. Tableau 3. Tests effectués sur des cellules MDCK non infectées, mesure de la concentration et de la toxicité des composés Naproxène et de ses dérivés Naproxène A et cO
Figure imgf000049_0002
Tableau 4. Tests effectués sur des cellules MDCK infectées, 48h post- infection à faible multiplicité d'infection (MOI) de virus H1N1 (wsn/33), par le test MTT : mesure de l'effet des composés Naproxène et de ses dérivés Naproxène A et Naproxène cO aux concentrations indiquées sur la viabilité cellulaire et calcul de la protection
Figure imgf000049_0003
Tableau 5. Tests effectués sur des cellules MDCK infectées, 24h post-infection à différents titres viraux (MOI) de virus H3N2 : mesure de la viabilité cellulaire aux concentrations du composé Naproxène indiquées et calcul de la protection Composé Test effectué sur MOI Concentration Protection %
des cellules du composé
MDCK infectées
naproxen MTT 24h A/Udorn / 1 ΙΟΟμΜ 19± 2 %
H3N2 500μΜ 45 ± 2 %
Naproxen MTT 24h A/Udorn / ÎO-1 ΙΟΟμΜ 85± 2 %
Les résultats montrent que le Naproxène a un effet anti viral sur la souche HlNl wsn et H3N2 udorn d'après les tests MTT. Les résultats des déterminations des titres viraux en cellules (wsn, Figure 8) et in vivo (Figures 11 et 12 ) sont déjà résumés sous forme de figure.
13) Docking d'un dérivé du triazole, le composé L410, dans NP
Un docking du composé L410 a été réalisé au niveau de la nucléoprotéine selon le protocole tel que décrit ci-dessus.
La formule du composé L410 dérivé du triazole est la suivante :
Composé L410
Figure imgf000050_0001
Suite à ce docking, il s'avère que les résidus de NP de virus Influenza A impliqués dans l'interaction avec le composé L410 sont les suivants : RI 50, Y148, R361 , Glnl49 . 14) Tests in vitro de l'efficacité du composé dérivé du triazole L410 sur des NP WT purifiées
a) Fluorescence:
Les mesures de fluorescence ont été réalisées à l'aide d'un fluorimètre Jasco équipé d'un porte-échantillon thermostaté à 20°C. Une séquence formant une tige-boucle a été utilisée : 5' AU A UAU AUC GAC AU A G AU AUA UAU 3' (SEQ ID N°9), les bases soulignées étant engagées dans un appariement et formant la tige. Cette tige boucle possède un fluorophore R= Cy3 en 5' et un quencher Q (dabcyl) en 3' (voir figure 18). La fixation de NP induit l'ouverture de la tige-boucle, éloignant R de Q, se traduisant par une exaltation de fluorescence. R est excité à 525 nm, la fluorescence est recueillie entre 535 et 650 nm. Les spectres d'excitation correspondants ont été obtenus à λεπι = 580 nm, Xexc variant entre 440- 570nm. Les échantillons ont été préparés à une concentration de tige-boucle de 100 nM avec et sans NP (50 nM - 3μΜ) dans 20 mM Tris à pH=7.4 contenant 50 mM NaCl. b) Expériences de résonance de plasmon de surface
Les cinétiques d'association des complexes NT-ARN avec et sans antiviral ont été obtenues à l'aide d'un appareil Biacore 3000 en utilisant des puces recouvertes de streptavidin (SA, Biacore) et conditionnées comme recommandé par BiaCore. L'immobilisation des oligonucléotides ARN biotinylés sur la puce streptavidine a été réalisée dans du tampon PBS. Les cinétiques ont été obtenues dans un tampon 20 mM Tris-HCl buffer, pH=7.4 contenant 300 mM NaCl et 0.025% de surfactant P20 (BiaCore) à 20 °C. Avant leur immobilisation, les oligonucléotides ont été dénaturés à 80°C and renaturés à température ambiante pendant une heure. Les protéines NP sauvage ou ses mutants ont été injectés à des concentrations de 100 to 500 nM en présence ou absence de 50 nM and 20 μΜ antiviral, jusqu'à 300μΜ dans certains cas. Les échantillons ont été injectés à une vitesse de flux de 25μ1/πιίη. c) Résultats:
L'interaction NP- L410 a été évaluée par deux méthodes de compétition indirectes où le complexe L410-NP est formé en compétition avec le complexe NP-ARN.
Par SPR, on suit la protéine, alors que par fluorescence on suit l'ARN marqué. Ces deux méthodes permettent d'évaluer une concentration à laquelle il y a 50% d'inhibition (50% du complexe NP-ARN est détruit) IC50 = 0.2-0.3 μ .
15) Toxicité cellulaire et effet antiviral de composés dérivés du triazole par test MTT a) Viabilité cellulaire selon le test MTT: Des cellules A549 ou MDC (3xl04cells/puits) ont été mises en culture dans des plaques P-12 à 37 °C pendant un jour dans du milieu MEM. Des dilutions sériées d'antiviral (0.5-50 ou 1-550μΜ) ont été rajoutées aux cellules qui ont été incubées à nouveau 0 37°C pendant 24 ou 48 heures. A la fin de la cinétique, 20 μΐ du réactif MTT (3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, 7.5 mg/ml, Sigma) est ajouté aux cellules et incubé à 37 °C pendant 1 h. Après rinçage des cellules, 100 μΐ de DMSO est rajouté dans chaque puits. L'absorbance est mesurée à 550 nm après soustraction du blanc à 650 nm à l'aide d'un lecteur de plaque (PerkinElmer).
b) Effet antiviral des composés.
Des cellules MDCK (0.32 x 106 cellules/puis) sont mises en culture dans 5% C02 pendant 24 heures jusqu'à environ 80% confluence en milieu minimal (MEM, Sigma) contenant 0.2% NaHC03 (Sigma), amino acides MEM (Gibco), vitamines MEM (Gibco), PSG, en l'absence de sérum de veau foetal. Les cellules sont alors infectées avec le virus A/WSN/33 virus à une multiplicité d'infection MOI= 10"3 (multi cycle growth assay) et l'antiviral ((5 - 500 μΜ) ou Tamiflu (25 μΜ) or le milieu) sont ajoutés aux cellules juste après l'infection. Certaines expériences ont été réalisées à plus forte MOI = 5.
Les titres viraux des surnageants cellulaires clarifiés sont déterminés sur plaques colorées au crystal violet aux temps 24, 48 et 72 heures post-infection. Les expériences sont faites en triplicate et répétées au moins deux fois.
c) Résultats de toxicité :
Afin de réduire les problèmes de solubilité du L410, des composés dérivés ont été sélectionnés de façon à ce que le groupement nitro du L410 soit remplacé par un groupement carboxylate soluble (sous forme de sel de l'acide).
Lesdits composés sélectionnés sont les suivants :
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000054_0001
Ces composés ont été testés sur cellules MDC infectées à MOI 10"3 par titrage du titre viral 24H, 48H et 72H post-infection.
Tableau 6. Mesure de la toxicité cellulaire des composés dérivés du triazole et du Naproxène
Figure imgf000054_0002
Les résultats présentés dans le tableau 6 démontrent que comme dans le cas du Naproxène, les composés dérivés du triazole testés, sauf le composé 88, ne présentent pas de toxicité cellulaire.
Tableau 7. Tests effectués sur des cellules MDCK infectées, mesures 24h et 48h postinfection du titre viral (MOI), de la concentration des composés Naproxène et dérivés du triazole ainsi que des ICI 0 et IC50 correspondantes pour chacun de ces composés.
Figure imgf000055_0001
Les résultats présentés dans le tableau 7 démontrent une diminution du titre viral p les composés Naproxène ainsi que 59 et 72 par rapport au témoin.
Conclusion : les composés dérivés du triazole L410, 59 et 72 sont des antiviraux environ 2 fois plus efficaces que le Naproxène, sans toxicité cellulaire.

Claims

REVENDICATIONS
Une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une infection virale par un virus Influenza de type A chez un sujet, laquelle composition comprend un composé ayant la propriété d'agir en tant qu'inhibiteur de la fixation de TARN viral à la nucléoprotéine des virus Influenza de type A, ledit composé ayant la propriété de se lier dans un site formant une sphère d'au moins 12 ângstrôms (Â) de diamètre centrée sur le résidu Tyr 148, appartenant au domaine de liaison de TARN viral sur ladite nucléoprotéine, ledit domaine : comprenant les acides aminés Arg65, Glnl49, Tyrl48, Argl50, Argl 52, Argl 56, Argl74, Argl75, Argl95, Argl99, Arg213, Arg214, Arg221, Arg236, Pro354, Arg355, Lys357, Arg361, Arg391, Lysl 84, Lysl98, Gly212, Ile217, Ala218, Lys227, Lys229, Lys273 et Val353 d'une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l, de préférence tout acide aminé situé à une distance de moins de 5 ângstrôms desdits acides aminés, et
étant délimité de deux boucles, la première boucle comprenant les résidus acides aminés Glu73 à Lys90 et la deuxième boucle comprenant les résidus acides aminés Gly200 à Arg214 d'une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l .
et caractérisée en ce que ledit composé est choisi parmi :
• un composé Naproxène de formule (A) ou un de ses dérivés de formule (B) avec :
Formule (A)
Formule (B)
Figure imgf000057_0001
Avec :
- Rl= -Ph(COOH)2 ou -Ph(COOH)2-X-Ar avec X = CH2 ou O et Ar = Ph ou PhOH ou PhOMe ou PhNH2 ou imidazole ou pyrrole
Ou Rl = -CHR5R6 avec :
R5 = -(CH2)nCOOH ou -(CH2)nS03H avec n = 0-3 ou -(CH2)nPhCOOH ou -Ph(COOH)2 ou -(CH2)nPhS03H
Et R6 = H, -CH3 ou tout groupement aliphatique linéaire ou -(CH2)nOH avec n = 1-3 ou CONH2 ou Cl ou F ou R6 = R5
- R2 = F, Cl ou R2 = R3
R3 = H, -CH3 ou tout groupement aliphatique linéaire ou équivalents ramifiés ou - (CH2)nOH avec n = 0-4 ou -(CH2)nNH2 avec n = 0-4 ou -(CH2)nCONH2 avec n = 0-3
- R4 = OH ou OR3 ou H
• le triazole de formule (C) ou un de ses dérivés de formule (D) ou (E) avec :
Formule (C)
Figure imgf000058_0001
Figure imgf000058_0002
Figure imgf000058_0003
Avec :
- Rl= (CH2)n(COOH)m ou (CH2)n(S03H)m avec n=0-3, m=l , ou N02
- R2 = H, F, Cl, ou SH
- R3= CH3 ou tout groupement aliphatique ou -(CH2)n-OH n=0-4 ou -(CH2)n-NH2 ou OCH3 ou 0(CH2)nCH3 ou 0(CH2)nNH2
- R4 = H, F, Cl
avec pour la formule E :
R5 = un phenyl carboxylate ou sulfate ou sulfonate -Ph(CH2)nCOOH ou Ph(CH2)nS03H ou R5= H, F, Cl et
- R6 = R5 ou R6= -Ph-(OH)m (m = 0 -4) ou -Ph-(OCH3) ou R6= H, F, Cl
2. Composition selon la revendication 1 , caractérisée en ce que ladite séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l correspondant à la séquence SEQ ID N°2.
3. Composition selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit domaine de liaison comprenant plus de 10% de résidus acides aminés arginines, préférentiellement plus de 20% de résidus acides aminés arginine.
4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit composé n'est pas un dérivé nitré du Naproxène tel que décrit dans la demande internationale PCT WO 2005/030224 Al de ligne 1 , page 2 à la ligne 14, page 17.
5. Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le sujet est un mammifère, de préférence un humain, infecté par un virus Influenza de type A.
6. Une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une infection virale par un Orthomyxovirus chez un sujet, laquelle composition comprend un composé tel que défini dans la revendication 1.
7. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit composé n'est pas un dérivé nitré du Naproxène tel que décrit dans la demande PCT WO 2005/030224 Al
(NICOX) de la ligne 1 , page 2 à la ligne 14, page 17.
8. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit composé n'est pas un dérivé du triazole tel que décrit dans la demande internationale PCT WO 2007134678 A2 (MERCK) de la ligne 4, page 19 à la ligne 20, page 39 et de la ligne 19, page 45 à la ligne 31 , page 50.
. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit composé est le composé Naproxène de formule (A) ou un de ses dérivés de formule (B) tels que définis dans la revendication 1.
10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit composé est un dérivé du Naproxène de Formule (L)
Formule (L)
Figure imgf000060_0001
Avec :
- Rl= -Ph(COOH)2 ou -Ph(COOH)2-X-Ar avec X = CH2 ou O et Ar = Ph ou PhOH ou PhOMe ou PhNH2 ou imidazole ou pyrrole
Ou RI = -CHR5R6 avec :
R5 = -(CH2)nCOOH ou -(CH2)nS03H avec n = 0-3 ou -(CH2)nPhCOOH ou -Ph(COOH)2 ou - CH2)nPhS03H
Et R6 = H, -CH3 ou tout groupement aliphatique linéaire ou -(CH2)nOH avec n = 1-3 ou CONH2 ou Cl ou F ou R6 = R5
- R2 = R3
- R3 = H
- R4 = H
1 1. Composition selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce que ledit composé est choisi parmi le composé dérivé du Naproxène de formule (F) ou le composé dérivé du Naproxène de formule (G) : Formule (F)
Figure imgf000061_0001
Formule (G)
Figure imgf000061_0002
12. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit composé est un tnazole de formule (C) ou un de ses dérivés de formules (D) ou (E) tels que définis dans la revendication 1.
13. Composition selon l'une des revendications 6 à 12, caractérisée en ce que le sujet est un mammifère, plus préférentiellement un humain, infecté par un Orthomyxovirus.
14. Composition selon l'une des revendications 6 à 12, caractérisée en ce que ladite composition est destinée au traitement d'une infection virale par un virus Influenza chez un sujet.
15. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce que le sujet est un mammifère, plus préférentiellement un humain, infecté par un virus Influenza.
16. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce qu'elle peut comprendre un support pharmaceutiquement acceptable.
17. Un composé ayant la propriété d'agir en tant qu'inhibiteur de la fixation de l'ARN viral à la nucléoprotéine des virus Influenza de type A, ledit composé ayant la propriété de se lier dans un site formant une sphère d'au moins 12 ângstrôms (Â) de diamètre centrée sur le résidu Tyr 148, appartenant au domaine de liaison de l'ARN viral sur ladite nucléoprotéine, ledit domaine : - comprenant les acides aminés Arg65, Gin 149, Tyrl48, Argl 50, Argl 52, Argl56, Argl74, Argl75, Argl95, Argl99, Arg213, Arg214, Arg221, Arg236, Pro354, Arg355, Lys357, Arg361 , Arg391 , Lysl 84, Lysl98, Gly212, Ile217, Ala218, Lys227, Lys229, Lys273 et Val353 d'une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l, de préférence tout acide aminé situé à une distance de moins de 5 ângstrôms desdits acides aminés, et
étant délimité de deux boucles, la première boucle comprenant les résidus acides aminés Glu73 à Lys90 et la deuxième boucle comprenant les résidus acides aminés Gly200 à Arg214 d'une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l.
et caractérisée en ce que ledit composé est choisi parmi : un composé Naproxène de formule (A) ou un de ses dérivés de formule (B) avec : Formule (A)
Figure imgf000062_0001
Formule (B)
Figure imgf000062_0002
Avec :
Rl= -Ph(COOH)2 ou -Ph(COOH)2-X-Ar avec X = CH2 ou O et Ar = Ph ou PhOH ou PhOMe ou PhNH2 ou imidazole ou pyrrole
Ou RI = -CHR5R6 avec :
R5 - -(CH2)nCOOH ou -(CH2)nS03H avec n = 0-3 ou -{CH2)nPhCOOH ou -Ph(COOH)2 ou -(CH2)nPhS03H Et R6 = H, -CH3 ou tout groupement aliphatique linéaire ou -(CH2)nOH avec n = 1-3 ou CONH2 ou Cl ou F ou R6 = R5
- R2 = F, Cl ou R2 = R3
R3 = H, -CH3 ou tout groupement aliphatique linéaire ou équivalents ramifiés ou - (CH2)nOH avec n = 0-4 ou -(CH2)nNH2 avec n = 0-4 ou -(CH2)nCONH2 avec n = 0-3
- R4 = OH ou OR3 ou H
• le triazole de formule (C) ou un de ses dérivés de formule (D) ou (E) avec : Formule (C)
Figure imgf000063_0001
Formule (D)
Figure imgf000063_0002
Formule (E)
Figure imgf000064_0001
Avec :
- Rl= (CH2)n(COOH)m ou (CH2)n(S03H)m avec n=0-3, m=l ou N02,
- R2 = H, F, Cl, ou SH
- R3= CH3 ou tout groupement aliphatique ou -(CH2)n -OH n=0-4 ou -(CH2)n- NH2 ou OCH3 ou 0(CH2)n CH3 ou 0(CH2)nNH2
- R4 = H, F, Cl
avec pour la formule E : - R5 par un phenyl carboxylate ou sulfate ou sulfonate Ph(CH2)nCOOH ou
Ph(CH2)nS03H ou R5= H, F, Cl et
- R6 = R5 ou R6= Ph-(OH)m (m = 0 -4) ou Ph-(OCFD) ou R6= H, F, Cl
et caractérisé en ce qu'il n'est ni un dérivé du triazole tel que décrit dans la demande internationale PCT WO 2007134678 A2 (MERCK) de la ligne 4, page 19 à la ligne 20, page 39 et de la ligne 19, page 45 à la ligne 31 , page 50, ni un dérivé nitré du
Naproxène tel que décrit dans la demande PCT WO 2005/030224 Al (NICOX) de la ligne 1 , page 2 à la ligne 14, page 17.
18. Un composé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit composé est choisie parmi les composés de formules (L), (F) et (G).
19. Un procédé d'identification d'un composé ayant la propriété de se lier au niveau du domaine de liaison de TARN viral sur la nucléoprotéine des virus Influenza de type A, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) Modéliser la structure en trois dimensions (3D) de la nucléoprotéine d'un virus Influenza de type A ;
b) Générer un modèle en 3 dimensions (3D) du domaine de liaison de l'ARN viral sur ladite nucléoprotéine à partir de la structure obtenue en a):
Ledit domaine comprenant les acides aminés Arg65, Glnl49, Tyrl48, Argl50, Argl52, Argl56, Argl 74, Argl75, Argl95, Argl99, Arg213, Arg214, Arg221, Arg236, Pro354, Arg355, Lys357, Arg361 , Arg391, Lysl84, Lysl98, Gly212, Ile217, Ala218, Lys227, Lys229, Lys273 et Val353 d'une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l , de préférence tout acide aminé situé à une distance de moins de 5 ângstrôms desdits acides aminés, et
Ledit domaine étant délimité par deux boucles, la première boucle comprenant les résidus acides aminés Glu 73 à Lys 90 et la deuxième boucle comprenant les résidus acides aminés Gly 200 à Arg 214 d'une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l .
c) Cribler un ou plusieurs composés sur le modèle en 3D du domaine de liaison selon b) ;
d) Identifier un composé capable de se lier dans un site formant une sphère d'au moins 12 ângstrôms (Â) de diamètre centrée sur le résidu Tyr 148, appartenant audit domaine de liaison de l'ARN viral sur la nucléoprotéine, ledit composé étant susceptible d'inhiber la fixation de l'ARN à la nucléoprotéine des virus Influenza de type A et pouvant donc potentiellement être utilisé comme un inhibiteur de la réplication virale.
Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'une séquence comprenant la séquence SEQ ID N°l est la séquence SEQ ID N°2.
Procédé selon l'une des revendications 19 ou 20, caractérisé en ce qu'il comprend une étape complémentaire e) consistant à tester in vitro la capacité d'un composé identifié selon l'étape d) à inhiber la fixation de l'ARN viral sur la nucléoprotéine ainsi que la réplication virale.
Procédé selon la revendication 21 , caractérisé en ce qu'il comprend une étape (f) consistant à sélectionner un tel composé comme étant un inhibiteur de la réplication virale.
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