WO2012140304A2

WO2012140304A2 - Cepas de trichoderma útiles para el tratamiento y/o prevención de infecciones provocadas por microorganismos fitopatógenos

Info

Publication number: WO2012140304A2
Application number: PCT/ES2012/070252
Authority: WO
Inventors: Juan Bautista BARROSO ALBARRACÍN; Alfonso CARRERAS EGAÑA; Raquel VALDERRAMA RODRÍGUEZ; Mounira CHAKI; Juan Carlos BEGARA MORALES; Jesús MERCADO BLANCO; Encarnación PÉREZ ARTÉS; Ana María RINCÓN ROMERO; Antonio CARBALLO CODÓN; Tahía BENÍTEZ FERNÁNDEZ; Antonio VALVERDE CORREDOR; Felipe GUEVARA PEZOA; María Jesús RODRÍGUEZ PALERO; Rafael DUEÑAS SÁNCHEZ; Jesús FIERRO RISCO; Antonio Alejandro LÓPEZ GARCÍA
Original assignee: Fundacion Citoliva; Nutesca S L; Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad de Sevilla; Universidad de Jaen
Current assignee: Fundacion Citoliva; Nutesca S L; Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad de Sevilla; Universidad de Jaen
Priority date: 2011-04-15
Filing date: 2012-04-16
Publication date: 2012-10-18
Anticipated expiration: 2013-10-15
Also published as: WO2012140304A3

Abstract

La invención se refiere al uso de cepas de hongos Trichoderma para la prevención y/o tratamiento de infecciones de plantas y/o suelos provocadas por hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticillium. Además, la invención se refiere a nuevas cepas de hongos perteneciente a las especies Trichoderma harzianum y Trichoderma atroviride que son también resistentes a cobre capaces de inhibir el crecimiento de otros microorganismos, preferiblemente hongos, fitopatógenos. Por ello, se propone su uso como fertilizante y para la prevención y/o tratamiento de infecciones de plantas y/o suelos provocadas por microorganismos fitopatógenos, preferiblemente por los patotipos defoliante o no defoliante de Verticillium dahliae, agente causante de la verticilosis del olivo.

Description

CEPAS DE TRICHODERMA ÚTILES PARA EL TRATAMIENTO Y/O PREVENCIÓN DE INFECCIONES PROVOCADAS POR MICROORGANISMOS FITOPATÓGENOS

La presente invención se encuadra en el campo de la agricultura, la microbiología y los productos fitosanitarios, y específicamente se refiere a unas nuevas cepas de hongos pertenecientes a las especies Trichoderma atroviride y Trichoderma harzianum resistentes a cobre capaz de inhibir el crecimiento de otros microorganismos, preferiblemente hongos, fitopatógenos. La invención también se refiere a una composición que comprende dichas cepas, así como al uso de estas cepas y de esta composición como fertilizantes y para la prevención y/o tratamiento de infecciones de plantas y/o suelos provocadas por microorganismos, preferiblemente hongos, fitopatógenos. Además la presente invención se refiere al uso de la cepas Trichoderma harzianum CECT 2413, Trichoderma harzianum PF1 , Trichoderma atroviride IMI 206040 o cualquiera de sus combinaciones, entre si o con las nuevas cepas anteriores, para la prevención y/o tratamiento de infecciones de plantas y/o suelos provocadas por hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticillium, más preferiblemente por Verticillium dahliae, agente causante de las verticilosis. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Las verticilosis o marchitez vascular son enfermedades causadas por el hongo hifomiceto Verticillium dahliae Kleb. que puede atacar a una amplia gama de cultivos, tanto leñosos como herbáceos, entre ellos frutales, legumbres, hortícolas, forestales, ornamentales y malas hierbas. Así, los ataques de verticilosis constituyen un serio problema en diversos cultivos como alcachofa, algodón, melón, tomate, patata u olivo.

Actualmente, en cultivos como el olivo, la verticilosis está considerada como uno de los problemas fitopatológicos más grave y amenazador, causante de importantes pérdidas económicas. La verticilosis del olivo (VO) es una enfermedad en preocupante expansión en países donde el olivar es un cultivo relevante, afectando severamente tanto a olivares adultos como a las plantaciones jóvenes, posiblemente como consecuencia, entre otras causas, del establecimiento de plantaciones intensivas en suelos infestados por el patógeno y/o de la utilización de material de plantación infectado. Los aislados de Verticillium dahliae que infectan olivos pueden ser diferenciados por su virulencia sobre la planta y clasificarse así en los patotipos defoliante (D) o no defoliante (ND) por su capacidad o no de originar la caída generalizada de las hojas verdes de ramos infectados, respectivamente. La VO puede llegar a producir la muerte de árboles enteros o la seca de ramas ocasionando un retraso en el crecimiento y mermas de producción.

En general, las verticilosis son enfermedades de difícil control, a lo cual contribuyen factores tales como la capacidad del patógeno de sobrevivir prolongadamente en el suelo (más de 15 años), la amplia gama de plantas susceptibles a la infección por éste, la dificultad de llegar hasta el hongo, ya que se encuentra en el xilema de la planta y enterrado en el suelo (entre 10 y 30 cm de profundidad), y la ineficacia de los tratamientos químicos hasta ahora explorados para combatir al hongo durante su fase parasítica en el xilema. Como sucede con otras verticilosis de plantas leñosas, el control eficiente de la VO requiere la aplicación de una estrategia de manejo integrado de la enfermedad (López-Escudero and Mercado-Blanco, 201 1 , Plant and Soil, 344, pp. 1 -50).

Las medidas de control de las enfermedades fúngicas del olivo han sido en muchos casos indirectas (eliminación de plantas enfermas, utilización de abonos potásicos, etc.). No obstante, desde la perspectiva de una agricultura sostenible y en una estrategia de control integrado de las enfermedades, una de las posibles medidas de control a aplicar es el uso de antagonistas microbianos con potencial como agentes de control biológico (ACBs) de la enfermedad. El control biológico de los organismos fitopatógenos constituye una alternativa más atractiva que la de los productos químicos, ya que estos ACBs son menos perjudiciales para el medio ambiente que los compuestos químicos habitualmente utilizados. Sin embargo, el uso de dichos ACBs se ha visto limitado por diferentes causas, entre ellas, una inadecuada identificación de los mismos. Algunas cepas del hongo filamentoso Trichoderma, como por ejemplo cepas pertenecientes a la especie Trichoderma harzianum, han sido utilizadas como agentes de control biológico contra hongos patógenos de plantas, debido a su capacidad protectora tanto contra hongos del suelo que infectan las raíces como contra los que producen enfermedades en las partes aéreas. Algunas de estas cepas tienen también un efecto fertilizante sobre las plantas, estimulando su vigor, crecimiento y mecanismos de defensa.

Las cepas de Trichoderma emplean distintos mecanismos para atacar a los hongos. Se han descrito relaciones de micoparasitismo entre Trichoderma harzianum y Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii o Pythium, donde las enzimas líticas juegan un papel primordial, y relaciones de competición entre Trichoderma harzianum y Botrytis cinérea (en vid) o Fusarium (en algodón). Así, cepas de Trichoderma harzianum, Trichoderma virens y Trichoderma viride (Hermosa et al., 2000, Applied and Environmental Microbiology, 66:5, pp. 1890-1898), y otras de Trichoderma asperellum, Trichoderma atroviride y Trichoderma inhamatum (ES2200602 A1 ), han sido utilizadas en combinación como ACBs en composiciones contra diferentes hongos patógenos de plantas. Un ejemplo de composición sinérgica de este tipo es aquella que comprende diferentes cepas de Trichoderma harzianum (aquellas con número de acceso en la colección NRRL 30595, 30596 y 30597) que posee capacidad controladora de hongos fitopatógenos, es tolerante al estrés abiótico, estimula el crecimiento de la planta así como su contenido en fenoles e induce resistencia sistémica a enfermedades causadas por organismos fitopatógenos (WO20071 10686 A2).

En el caso del patógeno Verticillium dahliae, se han caracterizado una amplia gama de antagonistas del mismo, entre los que se encuentran diferentes cepas de Trichoderma (Berg et al., 2005, Applied and Environmental Microbiology, 71 :8, pp. 4203-4213). De hecho, uno de los métodos propuestos para el control biológico de este hongo fitopatógeno en el olivo se basa en la aplicación de esporas de Trichoderma harzianum, lo que además favorece la biofertilización (WO2009083819 A1 ). Los criterios a utilizar para la elección de las cepas de Trichoderma adecuadas para su empleo como ACBs presentan como principales características: 1 ) producción de enzimas líticos y 2) buen desarrollo en condiciones de competición. Esto último también depende de: 3) las condiciones de producción y preparación del inoculo y de 4) factores ambientales, incluyendo la presencia de fungicidas y/o pesticidas. En este sentido, se ha desarrollado una cepa muíante de Trichoderma harzianum CECT 2413, la cepa Trichoderma harzianum PF1 , que posee una capacidad de producción de enzimas líticos superior a la de la cepa salvaje, y se ha ensayado su efecto en el crecimiento de agentes fitopatógenos como Rhizoctonia solani o Botrytis cinérea, demostrándose que efectivamente su actividad antifúngica se encuentra incrementada con respecto a la de la cepa de la que procede (Rey et al., 2001 , Applied Microbiology and Biotechnology, 55, pp. 604-608).

En cuanto a la mejora de la capacidad de competición de las cepas en el entorno, éste es un proceso complejo pero en algunas aproximaciones experimentales se ha intentado la obtención de cepas mejoradas, más adaptables al entorno (aumento de los mecanismos de resistencia a la sequedad, a la presencia de metales, a la producción de enzimas o sustancias tóxicas por parte de los patógenos, capacidad de colonizar suelos con pHs extremos, etc.). Sobre todo, serían de interés cepas resistentes a fungicidas, lo que permitiría una mejor adaptación a un entorno tratado con estos compuestos y la posibilidad de un tratamiento integrado que combine pequeñas dosis de fungicidas a las que los patógenos sean sensibles combinadas con las cepas de Trichoderma resistentes. El efecto combinado permitiría un mejor control y una mayor protección que el simple tratamiento químico o biológico. Por otro lado, la competencia de las cepas de Trichoderma en el suelo podría optimizarse aplicando de forma óptima el ACB.

En resumen, sería deseable disponer de cepas de Trichoderma que proporcionasen un efecto paliativo mejorado frente a la infección por microorganismos, preferiblemente hongos, fitopatógenos, concretamente frente a los patotipos ND y D de Verticillium dahliae en variedades de plantas susceptibles de ser infectadas por el mismo, como por ejemplo, el olivo. Para ello, es fundamental que dichas cepas con actividad como ACBs presenten una mejor capacidad de adaptación al medio, de manera que así puedan afrontar con éxito la competencia biológica que tiene lugar en el entorno a tratar. Además, sería interesante que estas cepas permitieran llevar a cabo un tratamiento combinado con fungicidas de naturaleza química.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona nuevas cepas de hongos, perteneciente a las especies Trichoderma atroviride y Trichoderma harzianum, capaces de inhibir el crecimiento de otros microorganismos, preferiblemente hongos, fitopatogenos. Por ello, se propone su uso como ACBs frente a los mismos, preferiblemente frente a Verticillium, más preferiblemente frente a los patotipos D y ND de Verticillium dahliae, agente causante de las verticilosis.

Además, la presente invención proporciona el uso de otras cepas de hongos como son Trichoderma harzianum PF1 , Trichoderma atroviride IMI 206040 o Trichoderma harzianum CECT 2413 para la prevención y/o tratamiento de infecciones de plantas y/o suelos provocadas por hongos fitopatogenos pertenecientes al género Verticillium, más preferiblemente por los patotipos D o ND de Verticillium dahliae, agente causante de las verticilosis.

Los ejemplos de la presente invención demuestran que estas nuevas cepas, pertenecientes a Trichoderma atroviride y Trichoderma harzianum, presentan una capacidad de inhibir el crecimiento del hongo fitopatógeno Verticillium dahliae mejorada con respecto a otras cepas de su mismo género. Además, esta capacidad antifúngica se observa en aislados del patógeno, tanto sensibles como resistentes, a hongos del género Trichoderma. Por tanto, las cepas descritas en la presente invención poseen un elevado valor paliativo frente a la infección de plantas y/o suelos provocada por microorganismos, preferiblemente hongos, fitopatogenos, más preferiblemente por Verticillium, aun más preferiblemente por Verticillium dahliae, siendo aplicable tanto en condiciones de vivero como de campo. Además, las cepas descritas en la presente invención son resistentes a cobre, por lo que presentan la ventaja de que, en comparación con otras cepas de su mismo género y especie, posee una mejor capacidad de adaptación a medios caracterizados por la presencia de contaminantes metálicos. Estos contaminantes metálicos son empleados comúnmente como antifúngicos y, entre ellos, el cobre es ampliamente utilizado en el sector del olivar. Así, la resistencia a cobre de dichas cepas permite sus usos de manera combinada con agentes antifúngicos químicos, lo que deriva en un mejor control y una mayor protección de la planta y/o el suelo frente a microorganismos, preferiblemente hongos, fitopatógenos en comparación con el simple tratamiento químico o biológico.

Los ejemplos de la presente invención demuestran que la cepa Trichoderma harzianum PF1 presenta una capacidad de inhibir el crecimiento del hongo fitopatógeno Verticillium dahliae mejorada con respecto a la cepa de la que procede, Trichoderma harzianum CECT 2413, en aislados del patógeno tanto sensibles como resistentes a hongos del género Trichoderma. Esta capacidad es debida a su actividad superexcretora de enzimas hidrolíticas, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, glucanasas, proteasas y/o quitinasas. Por tanto, la cepa de hongos Trichoderma harzianum PF1 posee un elevado valor paliativo y preventivo frente a la infección de plantas y/o suelos provocada por hongos fitopatógenos del género Verticillium, más preferiblemente por Verticillium dahliae, siendo aplicable tanto en condiciones de vivero como de campo.

Además, la actividad superexcretora de enzimas hidrolíticas de Trichoderma harzianum PF1 proporciona a esta cepa la ventaja de que, en comparación con otras cepas de su mismo género y especie, puede afrontar mejor la competencia biológica que tiene lugar en el entorno radicular de la planta a tratar.

Los ejemplos de la presente invención demuestran que la cepa Trichoderma atroviride IMI 206040 presenta una capacidad de inhibir el crecimiento del hongo fitopatógeno Verticillium dahliae mejorada con respecto a otras cepas de su mismo género, y esta inhibición se observa tanto en aislados del patógeno del patotipo D como del patotipo ND, y tanto sensibles como resistentes a hongos del género Trichoderma. Por tanto, la cepa de hongos Trichoderma atroviride IMI 206040 posee un elevado valor paliativo y preventivo frente a la infección de plantas y/o suelos provocada por hongos fitopatógenos del género Verticillium, más preferiblemente por Verticillium dahliae, siendo aplicable tanto en condiciones de vivero como de campo.

Los ejemplos de la presente invención demuestran que la cepa Trichoderma harzianum CECT 2413 es capaz de inhibir el crecimiento del hongo fitopatógeno Verticillium dahliae, y esta inhibición se observa tanto en aislados del patógeno del patotipo D como del patotipo ND, y tanto sensibles como resistentes a hongos del género Trichoderma. Además, los ejemplos demuestran que esta cepa posee un efecto preventivo frente a la infección de plantas por Verticillium dahliae mejorado con respecto a otras cepas de su mismo género. Por tanto, la cepa de hongos Trichoderma harzianum CECT 2413 posee un elevado valor paliativo y preventivo frente a la infección de plantas y/o suelos provocada por hongos fitopatógenos del género Verticillium, más preferiblemente por Verticillium dahliae, siendo aplicable tanto en condiciones de vivero como de campo.

Por todo ello, un aspecto de la invención se refiere a una cepa de Trichoderma seleccionada de entre la cepa de la especie Trichoderma atroviride depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de depósito 20755 o la cepa de la especie Trichoderma harzianum depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de depósito 20756.

La cepa de hongo de la especie Trichoderma atroviride depositada en la

Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de depósito 20755, de ahora en adelante "primera cepa de la invención" o "RCU1 ", fue depositada en la CECT el 15 de octubre de 2009. Se trata de un muíante espontáneo (no manipulado genéticamente) resistente a cobre, concretamente, aunque sin limitarnos, a 4 mM de CU2SO4, derivado de Trichoderma atroviride IMI 206040. Esta primera cepa de la invención comparte sus características fenotípicas con la cepa de la que procede. Es capaz de crecer in vitro en, por ejemplo, aunque sin limitarnos, los medios de cultivo CECT 54/68, a una temperatura de incubación de, por ejemplo, aunque sin limitarnos, 25°C, durante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, 5 días y en condiciones aerobias.

La cepa de hongo de la especie Trichoderma harzianum depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de depósito 20756, de ahora en adelante "segunda cepa de la invención" o "RCU2", fue depositada en la CECT el 15 de octubre de 2009. Se trata de un muíante espontáneo (no manipulado genéticamente) resistente a cobre, concretamente, aunque sin limitarnos, a 4 mM de CU2SO4, derivado de Trichoderma harzianum CECT 2413. Esta segunda cepa de la invención comparte sus características fenotípicas con la cepa de la que procede. Es capaz de crecer in vitro en, por ejemplo, aunque sin limitarnos, los medios de cultivo CECT 54/68, a una temperatura de incubación de, por ejemplo, aunque sin limitarnos, 25°C, durante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, 5 días y en condiciones aerobias.

En una realización preferida, las cepas de la invención se encuentran en estado esporulado. Se entiende por "estado esporulado" el estadio del hongo en el que éste se encuentra en forma de espora. El término "espora" se refiere a la célula reproductora producida en los esporangios de los hongos, ya sea asexualmente o como resultado de un proceso de reproducción sexual, generalmente haploide y unicelular, que al mismo tiempo permite la dispersión y la supervivencia por largo tiempo (dormancia) en condiciones adversas. La espora produce un nuevo organismo al dividirse por mitosis sin fusión con otra célula, produciendo un gametofito pluricelular. Cuando la espora germina surge de ella una primera hifa, por cuya extensión y ramificación se va constituyendo un micelio.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante "composición de la invención", que comprende un elemento seleccionado de la lista:

a. una de las cepas de la invención o ambas, preferiblemente en estado esporulado,

b. productos del metabolismo de una de las cepas de la invención o ambas, o una combinación de (a) y de (b).

Tal y como se utiliza en la presente invención, el término "productos del metabolismo" o "metabolitos" se refiere a cualquier molécula excretada por la cepa o cepas de la invención al medio, preferiblemente cuando dichas cepas se encuentran creciendo en presencia de medio de cultivo PDA (Agar Patata- Dextrosa). Ejemplos de estos metabolitos son, aunque sin limitarnos, aminoácidos, nucleótidos, vitaminas, ácidos orgánicos, alcoholes, como los polioles, azúcares, como los polisacáridos, antibióticos, enzimas, tales como por ejemplo, aunque sin limitarnos, enzimas hidrolíticas de pared celular, etc.

En los ejemplos de la presente invención se demuestra la eficacia, no solo de las cepas de la invención y de sus productos del metabolismo, sino también de otras cepas de Trichoderma, además de Trichoderma atroviride CECT 20755 y Trichoderma harzianum CECT 20756, en concreto Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma harzianum CECT 2413 y Trichoderma harzianum PF1 , y de los productos del metabolismo de éstas, para inhibir el crecimiento de microorganismos fitopatógenos, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, de Verticillium dahliae. Por ello, en una realización preferida de este aspecto de la invención, la composición de la invención además de cualquiera de las cepas de la invención (Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756 o ambas), comprende al menos una cepa de Trichoderma seleccionada de la lista: Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma harzianum CECT 2413 o Trichoderma harzianum PF1 .

En los ejemplos de la presente invención también se demuestra la eficacia de la composición de la invención que comprende las cinco cepas de Trichoderma: Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 2413, Trichoderma harzianum CECT 20756 y Trichoderma harzianum PF1 , para inhibir el crecimiento de microorganismos fitopatógenos, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, de Verticillium dahliae. Por ello, en una realización más preferida, la composición de la invención comprende un elemento seleccionado de la lista: a. cepas de la invención, es decir, Trichoderma atroviride CECT 20755 y Trichoderma harzianum CECT 20756, preferiblemente en estado esporulado,

b. productos del metabolismo de las cepas de la invención,

o una combinación de (a) y de (b),

y además las cepas de Trichoderma: Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma harzianum CECT 2413 y Trichoderma harzianum PF1 .

En una realización aún más preferida, la composición de la invención comprende: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma harzianum CECT 2413 y Trichoderma harzianum PF1 . Preferiblemente, la proporción de cada cepa en la composición de la invención varía entre un 10% y un 30% del volumen final de la composición (hasta sumar un total de 100% con las cinco cepas); más preferiblemente la proporción de cada cepa en la composición de la invención es de un 20% del volumen final de dicha composición, es decir, las cinco cepas se encuentran en la composición de la invención en la misma proporción (1 :1 :1 :1 :1 ).

En otra realización preferida las cepas de Trichoderma: Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma harzianum CECT 2413 y/o Trichoderma harzianum PF1 se encuentran en estado esporulado en la composición de la invención.

En otra realización preferida la composición de la invención además comprende productos del metabolismo de al menos una cepa de Trichoderma seleccionada de la lista: Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma harzianum CECT 2413 o Trichoderma harzianum PF1 .

Las cepas Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma harzianum CECT 2413, y el muíante Trichoderma harzianum PF1 , se encuentran accesibles para un experto en la materia.

Las cepas Trichoderma harzianum CECT 2413 y Trichoderma atroviride

IMI 206040 son identificables tanto por sus características morfológicas, las cuales se pueden encontrar descritas en bases de datos para Trichoderma tales como por ejemplo, pero sin limitarnos, la recogida en http://www.isth.info, como por ciertos marcadores moleculares, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, la secuencia de los espaciadores internos de los genes de rRNA, ITS1 e ITS2. El muíante derivado de Trichoderma harzianum CECT 2413, Trichoderma harzianum PF1 , inducida con nitrosoguanidina, se caracteriza por su capacidad superexcretora de enzimas hidrolíticas (glucanasas, proteasas y/o quitinasas). Esta cepa comparte las características morfológicas de la cepa de la que procede.

Preferiblemente, la composición de la invención además comprende elementos necesarios para el crecimiento y desarrollo de las cepas de la invención y de las cepas de Trichoderma mencionadas en el párrafo anterior. Así, dicha composición puede comprender aunque sin limitarnos, fuentes de carbono, sales minerales y/o nutrientes orgánicos e inorgánicos.

La composición de la invención puede presentarse en cualquier forma de presentación adecuada para su administración o aplicación, por ejemplo, aunque sin limitarse, en forma sólida o líquida. Las formas de presentación líquidas son adecuadas para su pulverización sobre el suelo, la planta o el material vegetal, o bien para crear una solución en la que se sumergen las plantas o el material vegetal, por lo que preferiblemente la composición de la invención se presenta en forma líquida.

Los ejemplos de la presente invención demuestran que cuando se inoculan microorganismos fitopatógenos tales como por ejemplo, aunque sin limitarnos, Verticillium dahliae, en un medio de cultivo donde previamente ha crecido al menos una de las cepas de la invención y excretado toda clase de metabolitos antes de ser retiradas de dicho medio, existe inhibición del crecimiento del microorganismo fitopatógeno. También demuestran dicha inhibición cuando el patógeno se inocula en un medio de cultivo donde previamente han crecido las cepas de Trichoderma: Trichoderma atroviride CECT 20755 Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma harzianum CECT 2413 y/o Trichoderma harzianum PF1 y excretado toda clase de metabolitos antes de ser retiradas de dicho medio. Así, los inventores ponen de manifiesto que tanto el micelio de las cepas de la invención y de estas otras cepas de Trichoderma, como los metabolitos excretados al medio por las mismas, son capaces de inhibir el crecimiento de microorganismos, preferiblemente hongos, fitopatógenos tales como por ejemplo, aunque sin limitarnos, Verticillium dahliae. Por ello, otro aspecto de la invención se refiere al uso de las cepas de la invención, preferiblemente en estado esporulado, y/o de los productos de su metabolismo, o de la composición de la invención, para la prevención y/o tratamiento de infecciones provocadas por microorganismos fitopatógenos.

Una vez excretados, los productos del metabolismo de las cepas de la invención, o de las cepas Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma harzianum CECT 2413 o Trichoderma harzianum PF1 , pueden ser aislados y aplicados, solos o en combinación con dichas cepas, directamente a la planta, tanto a las raíces como a la parte aérea, al material vegetal, incluyendo pero sin limitarnos semillas, hojas o frutos, o al suelo. Cuando los productos del metabolismo son administrados en combinación con las cepas de la invención, o con las cepas Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma harzianum CECT 2413 o Trichoderma harzianum PF1 , el modo de administración puede ser simultáneo o secuencial. O bien, las cepas pueden ser administradas solas tanto a las raíces como a la parte aérea de la planta, al material vegetal, incluyendo pero sin limitarnos semillas, hojas o frutos, o al suelo, de manera que produzcan dichos productos del metabolismo in situ.

El término "tratamiento", tal como se entiende en la presente invención, se refiere a combatir los efectos provocados como consecuencia de una infección causada por microorganismos, preferiblemente hongos, fitopatógenos, más preferiblemente por Verticillium, aun más preferiblemente por Verticillium dahliae, en una planta, en un cultivo o en un suelo. Este término incluye:

(i) inhibir la infección, es decir, detener su desarrollo;

(ii) aliviar los efectos provocados por la infección, es decir, causar su regresión;

(iii) estabilizar los efectos provocados por la infección. El término "prevención", tal como se entiende en la presente invención, consiste en evitar la aparición de daños cuya causa sean las infecciones provocadas por microorganismos, preferiblemente hongos, fitopatogenos, más preferiblemente por Verticillium, aun más preferiblemente por Verticillium dahliae; es decir, evitar que se produzca la infección en una planta, en un cultivo o en un suelo, en particular, cuando dicha planta, cultivo o suelo tienen predisposición a la infección pero aún no se ha diagnosticado que la tengan.

Se entiende por "infección" la colonización de un organismo huésped, por ejemplo, aunque sin limitarnos, una planta, por agentes patógenos, los cuales en el contexto de la presente invención consisten en microorganismos, preferiblemente hongos, fitopatogenos, que invaden el organismo y se multiplican en él, produciendo sustancias tóxicas. El organismo colonizador es perjudicial para el funcionamiento normal y la supervivencia del huésped, por lo que se califica al agente como patógeno o, en el contexto de la presente invención, como fitopatógeno. Dentro del término "infección" se incluyen tanto las infecciones localizadas que afectan a una única área del organismo huésped, como las infecciones generalizadas que afectan a todo el organismo; y tanto las infecciones sintomáticas como asintomáticas. Asimismo, dentro de dicho término se incluyen también las infestaciones de suelos provocadas por microorganismos, preferiblemente hongos, fitopatogenos.

En la presente invención se entiende por "microorganismos fitopatogenos" aquellos microorganismos pertenecientes al reino Fungí o a la clase Oomycetes, capaces de provocar infecciones, y en ocasiones enfermedades, en las plantas. Ejemplos de microorganismos fitopatogenos pertenecientes a la clase Oomycetes son, aunque sin limitarnos, aquellos pertenecientes a los géneros Phytophthora, Plasmopara, Pseudoperonospora o Pythium. Los "hongos fitopatogenos" son aquellos organismos pertenecientes al reino Fungí capaces de provocar infecciones, y en ocasiones enfermedades, en las plantas por medio de alteraciones en su metabolismo, mediante por ejemplo, aunque sin limitarnos, la secreción de enzimas, toxinas, fitoreguladores y otras sustancias y, además, mediante la absorción de nutrientes de la planta para su propio crecimiento. Se engloban dentro de este término los hongos fitopatogenos que causan enfermedades por crecer y multiplicarse en el xilema y/o floema de la planta y, por ende, por bloquear el transporte de agua y nutrientes desde la raíz hacia las hojas o el flujo de savia desde las hojas hacia el resto de la planta. Algunos ejemplos de hongos fitopatogenos son, aunque sin limitarnos, aquellos pertenecientes a los géneros Armillaria, Botrytis, Chondrostereum, Colletotrichum, Cladosporium, Fusarium, Monilia, Nectria, Rhizoctonia, Rhizopus, Sclerotinia, Sclerotium o Verticillium.

La presencia de microorganismos fitopatogenos en las plantas o en el suelo puede detectarse mediante técnicas de biología molecular conocidas en el estado de la técnica para llevar a cabo dicha identificación, como por ejemplo, amplificando mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) o Q-PCR, una región del genoma del microorganismo fitopatógeno presente en una muestra aislada del suelo o de la planta y comparando el producto de amplificación obtenido con las secuencias génicas disponibles en bases de datos tales como, por ejemplo, pero sin limitarnos, GenBank, específicas de organismo para determinar el tipo de patógeno presente en la muestra. La presencia de microorganismos fitopatogenos en las plantas o en el suelo también podría llevarse a cabo mediante técnicas inmunohistoquímicas, como por ejemplo, pero sin limitarnos, ELISA; o bien mediante el crecimiento in vitro de los organismos contenidos en la muestra aislada de suelo o de la planta en medios de cultivo selectivos específicos de patógeno conocidos en el estado de la técnica.

Algunas cepas pertenecientes al género Trichoderma son capaces de ejercer una inhibición del crecimiento no solo sobre un único tipo de microorganismo fitopatógeno sino sobre una amplia variedad de ellos, como es el caso de cepas pertenecientes a las especies Trichoderma atroviride o Trichoderma harzianum. Por ello, aunque los ejemplos de la presente invención demuestren el efecto de las cepas mencionadas y de la composición de la invención en la inhibición del crecimiento del hongo fitopatógeno Verticillium dahliae, dichas cepas y composición también son de utilidad en la prevención y/o tratamiento de infecciones provocadas por otros microorganismos fitopatogenos susceptibles de ser controlados por cepas pertenecientes a las especies Trichoderma atroviride o Trichoderma harzianum.

Por tanto, en una realización preferida de este aspecto de la invención el microorganismo fitopatógeno pertenece a un género seleccionado de la lista que comprende: Armillaria, Botrytis, Chondrostereum, Colletotrichum, Cladosporium, Fusarium, Monilia, Nectria, Phytophthora, Plasmopara, Pseudoperonospora, Pythium, Rhizoctonia, Rhizopus, Sclerotinia, Sclerotium o Verticillium. En una realización más preferida, el microorganismo fitopatógeno pertenece al género Verticillium. En una realización aun más preferida, el microorganismo fitopatógeno es Verticillium dahliae.

El género de hongos Verticillium pertenece a la división o filo Ascomicota, familia Plectosphaerellaceae e incluye diversos grupos que comprenden parásitos y saprofitos de plantas, insectos, nemátodos, huevos de moluscos y otros hongos, por lo que el género tiene un amplio rango de grupos taxonómicos, conteniendo unas 51 especies, entre las que se encuentran, aunque sin limitarnos, Verticillium dahliae, Verticillium alboatrum, Verticillium nubilium, Verticillium nigrescens o Verticillium tricorpus. Las especies de este género son las causantes de las enfermedades conocidas como verticilosis.

El método más sencillo para identificar a patógenos del género Verticillium es, por ejemplo, aunque sin limitarnos, el cultivo en un medio selectivo, como por ejemplo, pero sin limitarnos, en medio PDA (Agar Patata- Dextrosa) a temperatura ambiente, donde las colonias crecen de color blanco y el color del fondo de las placas es entre incoloro y amarillento. Algunos cultivos pueden tener un perfil bajo con bordes redondeados y formando curvas. Las especies Verticillium alboatrum, Verticillium dahliae y Verticillium tricorpus presentan colonias postradas y de un color amarillo anaranjado en medio de cultivo PDA, la especie Verticillium nubilium forma clamidosporas globosas y Verticillium nigrescens forma clamidosporas abundantes.

La especie Verticillium dahliae se caracteriza por la producción de conidióforos con fiálidas dispuestas en verticilo y la formación de numerosos microesclerocios, estructuras de resistencia. El hongo se puede encontrar en el suelo en forma de micelio y conidios, aunque preferiblemente se encuentra en forma de microesclerocios. Algunos cultivos infectados por este patógeno pueden ser asintomáticos. En el olivar se distinguen dos tipos de síndromes derivados de esta infección que origina la enfermedad denominada "verticilosis": apoplejía y decaimiento lento. Los síntomas iniciales del primer síndrome consisten en la pérdida de coloración de las hojas, más tarde se produce una seca rápida de brotes y ramas que suele comenzar desde la punta y que puede ocasionar la muerte del árbol. La corteza de las ramas afectadas puede tomar color morado o púrpura y a veces también se observa una coloración marrón en los tejidos del xilema. Los síntomas más típicos del decaimiento lento son la necrosis y momificado de las inflorescencias mientras que las hojas generalmente se desprenden, excepto las del extremo. En el contexto de la presente invención, se incluyen dentro de Verticillium dahliae tanto su patotipo defoliante (D) como su patotipo no defoliante (ND). El patotipo D de Verticillium dahliae se caracteriza por provocar, en olivar y algodonero, la caída generalizada de las hojas verdes de ramos infectados, al contrario que el patotipo ND. El diagnóstico de la infección por uno u otro patotipo de V. dahliae podría llevarse a cabo mediante técnicas de visualización fenotípica en base a la característica sintomática anteriormente mencionada, o bien mediante técnicas moleculares de caracterización de ambos patotipos, como por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante PCR (Mercado-Blanco et al., 2003, Plant Disease, 87, pp. 1487-1494).

Ejemplos de plantas susceptibles a la infección por Verticillium dahliae son, pero sin limitarnos, alcachofa, algodón, melón, tomate, patata u olivo. Por tanto, en otra realización preferida, la planta afectada por el microorganismo fitopatógeno se selecciona de la lista que comprende: alcachofa, algodón, melón, tomate, patata u olivo. En una realización más preferida, la planta es el olivo. Cuando Verticillium dahliae infecta al olivo provoca lo que se denomina "verticilosis del olivo o VO". La presente invención se refiere tanto a las variedades de olivo muy susceptibles al patotipo D, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, Picual o Arbequina, como a las variedades susceptibles al patotipo ND. Como se ha explicado anteriormente, las cepas de la invención son resistentes a cobre, metal utilizado como fungicida principalmente en el sector del olivar. Por tanto, esta capacidad de las cepas de la invención permite sus usos, de manera individual o en conjunto, en un método de tratamiento y/o prevención de infecciones provocadas por microorganismos, preferiblemente hongos, fitopatógenos de manera combinada con otros agentes antifúngicos. Por ello, otra realización preferida se refiere al uso de las cepas de la invención, y/o de los productos de su metabolismo, o de la composición de la invención, en combinación con otros agentes antifúngicos.

El término "agente antifúngico" se refiere a aquellas sustancias, tanto de naturaleza biológica como química, que se emplean para inhibir el crecimiento (fungistáticos) o para matar (fungicidas) a los hongos capaces de provocar infecciones en las plantas y/o suelos, preferiblemente a Verticillium, más preferiblemente a Verticillium dahliae. El término se refiere tanto a agentes antifúngicos protectores o de contacto, que se aplican antes de que se produzca la infección, como a agentes antifúngicos erradicadores o sistemáticos, que se aplican una vez producida la infección, así como a agentes antifúngicos de uso en revestimientos de semillas, de uso para desinfección del suelo, para su aplicación sobre las plantas, etc. Un ejemplo de agente antifúngico de naturaleza biológica son los microorganismos que actúan como ACBs de hongos fitopatógenos, como por ejemplo, pero sin limitarnos, hongos del género Trichoderma distintos a los comprendidos en la composición de la invención, hongos pertenecientes a otros géneros o bacterias, y sus mezclas, siempre y cuando éstos no sean incompatibles con las cepas de la invención y con los hongos comprendidos en la composición de la invención. Algunos tipos de agentes antifúngicos que podrían emplearse en combinación con la cepa de la invención, y/o con los productos de su metabolismo, o con la composición de la invención, son, aunque sin limitarnos, aquellos compuestos por cloruro de cobre, oxicloruro de cobre, óxido cúprico, "caldo bordelés", quinolinolato de cobre-8, carbonato de cobre básico, naftenato de cobre, sulfato de cobre, cromato de cobre u oleato de cobre. Por otro lado, los hongos pertenecientes al género Trichoderma con frecuencia actúan como agentes fertilizantes. Por esta razón, y porque además las cepas aquí mencionadas poseen capacidad para inhibir el crecimiento de microorganismos, preferiblemente hongos, fitopatogenos, los cuales pueden comprometer la viabilidad y el desarrollo de la planta a la que infectan o la idoneidad del suelo de cultivo, otra aplicación de las cepas de la invención es su uso como fertilizante. Así, otro aspecto de la invención se refiere al uso de una de las cepas de la invención o ambas, y/o de los productos de su metabolismo, o de la composición de la invención, como fertilizante. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de una de las cepas de la invención o ambas, y/o de los productos de su metabolismo, o de la composición de la invención, como fertilizante en plantas de olivo.

El término "fertilizante" se refiere a cualquier sustancia o mezcla de sustancias químicas y/o biológicas, de origen natural o sintético, utilizada para suministrar los elementos inorgánicos u orgánicos al suelo con el fin de que la planta los absorba y favorecer así su crecimiento o vigor.

Las cepas de Trichoderma aquí mencionadas, y/o los productos de su metabolismo, o la composición de la invención, pueden administrarse a una planta, a un suelo o al material vegetal, incluyendo pero sin limitarnos semillas, hojas o frutos, en combinación con uno o más agentes antifúngicos y/o fertilizantes de manera simultánea o secuencial.

Las cepas aquí mencionadas, y/o los productos de su metabolismo, así como la composición de la invención, se pueden administrar a, por ejemplo pero sin limitarnos, una planta, tanto a las raíces como a la parte aérea, al material vegetal, incluyendo pero sin limitarnos semillas, hojas o frutos, o al suelo, en una cantidad efectiva para el tratamiento y/o prevención de infecciones provocadas por microorganismos, preferiblemente hongos, fitopatogenos y para provocar la fertilización. En el sentido utilizado en esta descripción, el término "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad suficiente de las cepas, y/o de los productos de su metabolismo, o de la composición de la invención, que permita obtener los resultados deseados. Dicha cantidad efectiva puede administrarse en una sola vez o en varias administraciones. En términos de tratamiento, prevención y fertilización, una "cantidad suficiente" es la cantidad suficiente para evitar, paliar, mejorar, estabilizar, revertir, retardar o retrasar los efectos derivados de las infecciones provocadas por microorganismos, preferiblemente hongos, patógenos de plantas, o para estimular el crecimiento de las mismas. Preferiblemente, la cantidad efectiva a administrar de las cepas en estado esporulado es de entre 10⁴ y 10⁶ esporas/ml de agua de riego, y más preferiblemente de 10⁵ esporas/ml (a partir de 1 ,4 x 10¹¹ unidades formadoras de colonias/g).

El modo de administración de las cepas, y/o de los productos de su metabolismo, así como de la composición de la invención, puede realizarse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante el agua de riego, pulverización, rociado, revestimiento, fumigación, impregnación, mezcla con el sustrato, inmersión de la raíz de la planta en una solución que comprenda las cepas, o esporas de las mismas pregerminadas, y/o los productos de su metabolismo, o la composición de la invención.

El término "género" se refiere a la categoría de la clasificación biológica (categoría taxonómica) que se ubica entre la familia y la especie y que comprende una o más especies morfológicamente similares relacionadas filogenéticamente. Por "categoría taxonómica" se entiende el nivel de jerarquía utilizado para la clasificación de los organismos.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la cepa Trichoderma harzianum PF1 y/o de los productos de su metabolismo para la prevención y/o tratamiento de infecciones provocadas por hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticillium. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere a dicho uso en combinación con al menos una cepa de Trichoderma seleccionada de la lista que comprende: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma atroviride IMI 206040 o Trichoderma harzianum CECT 2413. En una realización más preferida, dicho uso es en combinación con las cepas de Trichoderma Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma atroviride IMI 206040 y Trichoderma harzianum CECT 2413. En una realización aún más preferida, dichas cepas de Trichoderma se encuentran en estado esporulado.

Otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere a dicho uso en combinación con productos del metabolismo de al menos una cepa de Trichoderma seleccionada de la lista que comprende: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma atroviride IMI 206040 o Trichoderma harzianum CECT 2413. Una realización más preferida se refiere a dicho uso en combinación con productos del metabolismo de las cepas de Trichoderma: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma atroviride IMI 206040 y Trichoderma harzianum CECT 2413.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la cepa Trichoderma atroviride IMI 206040 y/o de los productos de su metabolismo para la prevención y/o tratamiento de infecciones provocadas por hongos fitopatogenos pertenecientes al género Verticillium. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere a dicho uso en combinación con al menos una cepa de Trichoderma seleccionada de la lista que comprende: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma harzianum PF1 o Trichoderma harzianum CECT 2413. En una realización más preferida, dicho uso es en combinación con las cepas de Trichoderma Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma harzianum PF1 y Trichoderma harzianum CECT 2413. En una realización aún más preferida, dichas cepas de Trichoderma se encuentran en estado esporulado.

Otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere a dicho uso en combinación con productos del metabolismo de al menos una cepa de Trichoderma seleccionada de la lista que comprende: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma harzianum PF1 o Trichoderma harzianum CECT 2413. Una realización más preferida se refiere a dicho uso en combinación con productos del metabolismo de las cepas de Trichoderma: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma harzianum PF1 y Trichoderma harzianum CECT 2413.

Y otro aspecto de la invención se refiere al uso de la cepa Trichoderma harzianum CECT 2413 y/o de los productos de su metabolismo para la prevención y/o tratamiento de infecciones provocadas por hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticillium. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere a dicho uso en combinación con al menos una cepa de Trichoderma seleccionada de la lista que comprende: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma atroviride IMI 206040 o Trichoderma harzianum PF1 . En una realización más preferida, dicho uso es en combinación con las cepas de Trichoderma Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma atroviride IMI 206040 y Trichoderma harzianum PF1 . En una realización aún más preferida, dichas cepas de Trichoderma se encuentran en estado esporulado.

Otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere a dicho uso en combinación con productos del metabolismo de al menos una cepa de Trichoderma seleccionada de la lista que comprende: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma atroviride IMI 206040 o Trichoderma harzianum PF1 . Una realización más preferida se refiere a dicho uso en combinación con productos del metabolismo de las cepas de Trichoderma: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma atroviride IMI 206040 y Trichoderma harzianum PF1 .

En una realización preferida, el hongo fitopatógeno es Verticillium dahliae.

En otra realización preferida, la planta afectada por el hongo fitopatógeno se selecciona de la lista que comprende: alcachofa, algodón, melón, tomate, patata u olivo. Más preferiblemente la planta es el olivo.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Muestra los resultados de los ensayos de enfrentamiento directo entre las cepas de Trichoderma y dos aislados de Verticillium dahliae. (A) Placas de Petri en las que se encuentran creciendo en un extremo las cepas Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma atroviride RCU1 o Trichoderma harzianum CECT 2413, y en el extremo opuesto los aislados de Verticillium dahliae 1A-2 ó 2A-12. (B) Placas de Petri en las que se encuentran creciendo en un extremo las cepas Trichoderma harzianum RCU2, Trichoderma harzianum PF1 o una combinación de las cinco cepas formada por 1/5 de cada una (formulación), y en el extremo opuesto los aislados de Verticillium dahliae 1A-2 ó 2A-12. Control: cajas de Petri en las que únicamente se inoculó Verticillium dahliae 1A-2 ó 2A-12. Las imágenes se tomaron tras 18 días de crecimiento.

Fig. 2. Muestra el crecimiento de dos aislados de Verticillium dahliae, 1A-2 (A) y 2A-12 (B), en medios donde habían crecido previamente las cepas de Trichoderma, Trichoderma atroviride IMI 206040 (7. atroviride), Trichoderma atroviride RCU1, Trichoderma harzianum CECT 2413 (7. harzianum), Trichoderma harzianum RCU2 o Trichoderma harzianum PF1 , o una combinación de las cinco cepas formada por 1/5 de cada una (formulación). La figura muestra el crecimiento de dos aislados del patógeno en presencia de metabolitos excretados por las diferentes cepas de Trichoderma. Control: crecimiento de Verticillium dahliae 1A-2 (A) ó 2A-12 (B) en cajas de Petri en las que no había crecido ninguna cepa de Trichoderma previamente.

Fig. 3. Muestra los resultados de los ensayos de enfrentamiento directo entre la cepa Trichoderma atroviride IMI 206040, o una combinación de Trichoderma atroviride IMI 206040 y Trichoderma harzianum CECT 2413, y distintos aislados de Verticillium dahliae. Placas de Petri conteniendo PDA a distintos tiempos de incubación (3 y 15 días) a 22 °C en las que se encuentran creciendo: (A) diferentes aislados de V. dahliae (control), (B) diferentes aislados de V. dahliae en un extremo y Trichoderma atroviride IMI 206040 en otro extremo, (C) diferentes aislados de V. dahliae en un extremo y una combinación de las cepas Trichoderma atroviride IMI 206040 y Trichoderma harzianum CECT 2413 en otro extremo.

Fig. 4. Muestra el crecimiento de distintos aislados de Verticillium dahliae durante los ensayos de enfrentamiento directo con las cepas Trichoderma harzianum CECT 2413 (2413), Trichoderma viride CECT 2423 (2423) o Trichoderma atroviride IMI 206040 (IMI), o combinaciones de las mismas, a los 3 (blanco), 6 (gris) y 15 (negro) días de incubación. (A) Aislado de V. dahliae 1A-2. (B) Aislado de V. dahliae 1A-3. (C) Aislado de V. dahliae 1A-4. (D) Aislado de V. dahliae 2A-12. (E) Aislado de V. dahliae 2A-16. (F) Aislado de V. dahliae 2A-17. (G) Aislado de V. dahliae 4B-31 . (H) Aislado de V. dahliae 4B-34. (I) Aislado de V. dahliae 4B-35.

Fig. 5. Muestra la inhibición del crecimiento (%) en cultivos de diez días de los distintos aislados de Verticillium (1A2, 1A3, 1A4, 2A12, 2A16, 2A17, 4B31 , 4B34, 4B35) por los metabolitos de las cepas T. harzianum CECT 2413 (2413), T. atroviride IMI 206040 (IMI) y T. viride CECT 2423 (VIRIDE) o por los metabolitos de las combinaciones de estas cepas entre sí.

Fig. 6. Muestra los resultados de los ensayos de enfrentamiento directo entre la cepa Trichoderma harzianum CECT 2413, o una combinación de Trichoderma harzianum CECT 2413 y Trichoderma atroviride IMI 206040, y distintos aislados de Verticillium dahliae. Placas de Petri conteniendo PDA a distintos tiempos de incubación (3 y 15 días) a 22 °C en las que se encuentran creciendo: (A) diferentes aislados de V. dahliae (control), (B) diferentes aislados de V. dahliae en un extremo y Trichoderma harzianum CECT 2413 en otro extremo, (C) diferentes aislados de V. dahliae en un extremo y una combinación de las cepas Trichoderma harzianum CECT 2413 y Trichoderma atroviride IMI 206040 en otro extremo. Fig. 7. Muestra la evolución del número total de hojas a lo largo del tiempo en plantas de olivo inoculadas con V. dahliae (vert.) y tratadas previamente con cepas de T. harzianum CECT 2413 (T. Harz.), T. asperellum (T. Asp.) o la mezcla ambas cepas. Cont.+vert.: Control, plantas de olivo tratadas con V. dahliae pero no con Trichoderma.

Fig. 8. Muestra el análisis de la sintomatología de la enfermedad mediante la escala de severidad de daño a lo largo del tiempo en plantas de olivo previamente tratadas con cepas de T. harzianum CECT 2413 (T. Harz.), T. asperellum (T. Asp.) o con la mezcla de ambas cepas, durante el tratamiento con V. dahliae (vert.). Cont.+vert.: Control, plantas de olivo tratadas con V. dahliae pero no con Trichoderma.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad de las cepas y de la composición descritas en la presente invención en la inhibición del crecimiento de aislados representativos de los patotipos D y ND del hongo fitopatógeno Verticillium dahliae. Estos ejemplos específicos que se proporcionan sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención y se incluyen solamente con fines ilustrativos, por lo que no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma. EJEMPLO 1. Ensayos de antagonismo in vitro de distintas cepas de Trichoderma y aislados de Verticillium dahliae.

Se procedió a la realización de un conjunto de ensayos de antagonismo in vitro de distintas cepas de Trichoderma, o combinaciones de cepas, con el objeto de determinar su capacidad antifúngica frente a aislados de Verticillium dahliae suministrados por el Instituto de Agricultura Sostenible (IAS-CSIC- Córdoba). Así, se realizaron dos tipos de ensayos de antagonismo: uno de confrontación directa y otro de capacidad de crecimiento de distintos aislados de Verticillium dahliae en un medio donde Trichoderma había crecido previamente y excretado toda clase de metabolitos (incluidos antibióticos y enzimas hidrolíticas de pared celular). Como se explicará más adelante, los ensayos incluyeron enfrentamiento directo en medio sólido y ensayos con celofanes para ver el efecto de las sustancias secretadas por Trichoderma, siguiendo protocolos habituales en el laboratorio para ensayos con Rhizoctonia y Fusarium.

Además, se procedió al desarrollo y caracterización de mutantes espontáneos resistentes a cobre (a 4 mM de Cu₂S0₄) derivados de Trichoderma harzianum y de Trichoderma atroviride, con el objeto de disponer así de cepas resistentes a los contaminantes metálicos utilizados como antifúngicos, entre los cuales el cobre es ampliamente utilizado en el sector del olivar. Concretamente, dichas cepas mutantes son las que a continuación se detallan y que en la actualidad se encuentran depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT):

-Trichoderma atroviride RCU1 (número de depósito en la CECT 20755), derivado de Trichoderma atroviride IMI 206040, o primera cepa de la invención. -Trichoderma harzianum RCU2 (número de depósito en la CECT 20756), derivado de Trichoderma harzianum CECT 2413, o segunda cepa de la invención.

Además de estas dos cepas, en los ensayos de la presente invención se utilizaron las siguientes cepas de Trichoderma: Trichoderma harzianum CECT 2413, Trichoderma atroviride IMI 206040 y Trichoderma harzianum PF1 . Esta última cepa es un muíante inducido con nitrosoguanidina derivado de Trichoderma harzianum CECT 2413 con una elevada capacidad antifúngica y que se caracteriza como superexcretor de enzimas hidrolíticas (glucanasas, proteasas y quitinasas). Así, se han realizado también ensayos para comprobar la eficacia in vitro de una composición que comprende estas cinco cepas de Trichoderma: Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma atroviride RCU1 , Trichoderma harzianum CECT 2413, Trichoderma harzianum RCU2 y Trichoderma harzianum PF1 . En los experimentos se pretendía, por tanto, establecer la capacidad de distintas cepas del hongo Trichoderma de controlar a aislados de Verticillium dahliae causantes de la verticilosis en el olivo.

En cuanto a los aislados de Verticillium dahliae empleados en los ensayos, se seleccionaron dos aislados con distinta sensibilidad a Trichoderma: el aislado 1A-2, representante del patotipo D, y el aislado 2A-12 (más sensible), caracterizado como patotipo ND.

1 .1 . Ensayos de confrontación directa de distintas cepas de Trichoderma y aislados de Verticillium dahliae.

Los ensayos de confrontación directa consistieron en inocular una porción de micelio de los distintos aislados de V. dahliae a ensayar (1A-2 ó 2A- 12) en un extremo de cajas de Petri conteniendo medio de cultivo nutritivo PDA (puré de patatas 2%, glucosa 2%, agar 2%). Las cajas se incubaron a 22 °C durante 4 días para permitir el crecimiento del patógeno y posteriormente se inocularon, en el extremo opuesto de las cajas, 20 μΙ de esporas de las distintas cepas de Trichoderma a una concentración de 10⁵ esporas/ml. Las cajas continuaron incubándose a 22°C durante 18 días. Como control se inocularon cajas con medio nutritivo PDA con los distintos aislados de V. dahliae en las que no se inoculó Trichoderma.

Al cabo del tiempo, los hongos entraron en contacto y podían darse dos situaciones distintas: que ambos parasen su crecimiento en la zona de contacto o que uno de ellos provocase una lisis del micelio del otro y acabase creciendo por encima de éste. De hecho, el efecto antagonista se comprobó viendo el sobrecrecimiento de Trichoderma y la posible muerte del patógeno al microscopio y por siembra en medio selectivo para el patógeno (crecimiento en presencia de tóxicos en el que Trichoderma no podía crecer pero al que el patógeno era resistente).

En la figura 1 se aprecian los resultados de los enfrentamientos con los diferentes aislados de Verticillium. Se observó que las cepas de Trichoderma empleadas sobrecrecen al patógeno, reduciendo el área ocupada por el mismo. Como se puede observar en esta figura, la composición de las cinco cepas de Trichoderma (formulación) es más eficaz frente a los dos aislados de Verticillium dahliae ensayados que la mayoría de las cepas que la componen por separado, salvo en el caso de Trichoderma atroviride IMI 206040 y de su cepa derivada, RCU1 , que presentan una capacidad similar.

1 .2. Ensayos de capacidad de crecimiento de distintos aislados de Verticillium dahliae en presencia de metabolitos excretados por

Trichoderma.

Se realizaron ensayos de capacidad de crecimiento del patógeno en presencia de metabolitos excretados por Trichoderma mediante el cultivo de las cepas de Trichoderma sobre un disco de celofán permeable a metabolitos extracelulares (hidrolasas, antibióticos, etc.) colocado a su vez sobre el medio de cultivo PDA de una caja de Petri, a 22 °C. A los cuatro días de crecimiento, se retiró el celofán y con él el micelio desarrollado y un trozo de micelio del patógeno se colocó en el centro de las cajas. Para analizar cuantitativamente los resultados obtenidos en este ensayo con celofanes, a los diez días se midió el área de crecimiento de los distintos aislados de V. dahliae y se comparó el diámetro de crecimiento del patógeno en cajas control con el crecimiento en cajas donde Trichoderma había crecido sobre un celofán y que previamente había sido retirado antes de inocular el patógeno.

Los resultados obtenidos se representan en la figura 2 a diferentes tiempos de incubación (días). En este sentido, en ensayos para determinar la capacidad de inhibir el crecimiento de V. dahliae que tienen los metabolitos excretados por las diferentes cepas de Trichoderma ensayadas, se observaron resultados similares a los anteriores aunque diferentes según la cepa del patógeno. La formulación (combinación de las cinco cepas) fue tan eficaz como las cepas que la componían contra el aislado más sensible del patógeno (2A- 12, patotipo ND) pero fue intermedia contra el aislado más resistente (1A-2, patotipo D). Esto último puede deberse a un efecto de dilución de los metabolitos que intervienen en esta interacción debido a que en la formulación las cepas iban en una proporción 1/5 cada una.

En resumen, estos resultados determinan la capacidad específica de las cepas de Trichoderma propuestas en la presente invención de controlar e impedir in vitro el desarrollo del patógeno Verticillium dahliae. EJEMPLO 2. Ensayos de antagonismo in vitro de distintas cepas de Trichoderma y aislados de Verticillium dahliae.

Las cepas de Trichoderma utilizadas en los ensayos fueron: Trichoderma harzianum CECT 2413, Trichoderma viride CECT 2423 y Trichoderma atroviride IMI 206040, así como las siguientes combinaciones de las mismas: T. atroviride IMI 206040 + T viride CECT 2423, T harzianum CECT 2413 + T. atroviride IMI 206040, y T harzianum CECT 2413 + T viride CECT 2423, y en combinación con los aislados de Verticillium 1A-2, 1A-3, 1A-4, caracterizados como patotipo D, y 2A-12, 2A-16, 2A-17,4B-31 , 4B-34, 4B-35, del patotipo ND.

-Trichoderma atroviride RCU1 (número de depósito en la CECT 20755), derivado de Trichoderma atroviride IMI 206040. -Trichoderma harzianum RCU2 (número de depósito en la CECT 20756), derivado de Trichoderma harzianum CECT 2413.

Además, en los ensayos de la presente invención se incluyó también la cepa Trichoderma harzianum PF1 , muíante inducido con nitrosoguanidina derivado de Trichoderma harzianum CECT 2413 con una elevada capacidad antifúngica y que se caracteriza como superexcretor de enzimas hidrolíticas (glucanasas, proteasas y quitinasas).

Se han realizado también ensayos para comprobar la eficacia in vitro de una composición que comprende cinco cepas de Trichoderma: Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma atroviride RCU1 , Trichoderma harzianum CECT 2413, Trichoderma harzianum RCU2 y Trichoderma harzianum PF1 .

En los experimentos se pretendía, por tanto, establecer la capacidad de distintas cepas del hongo Trichoderma de controlar a aislados de Verticillium dahliae causantes de la verticilosis en el olivo.

2.1 . Ensayos de confrontación directa de distintas cepas de Trichoderma y aislados de Verticillium dahliae.

Los ensayos de confrontación directa consistieron en inocular una porción de micelio de los distintos aislados de V. dahliae a ensayar en un extremo de cajas de Petri conteniendo medio de cultivo nutritivo PDA (puré de patatas 2%, glucosa 2%, agar 2%). Las cajas se incubaron a 22 °C durante 4 días para permitir el crecimiento del patógeno y posteriormente se inocularon, en el extremo opuesto de las cajas, 20 μΙ de esporas de las distintas cepas de Trichoderma a una concentración de 10⁵ esporas/ml. Las cajas continuaron incubándose a 22 °C durante 18 días. Como control se inocularon cajas con medio nutritivo PDA con los distintos aislados de V. dahliae en las que no se inoculó Trichoderma.

En la figura 3 se aprecian los resultados de los enfrentamientos de la cepa T. atroviride IMI 206040 (Fig. 3B), o de la combinación de cepas T. atroviride IMI 206040 y T harzianum CECT 2413 (Fig. 3C), con diferentes aislados de Verticillium. Así, se observó que la cepa T. atroviride IMI 206040 y la combinación de cepas T. atroviride IMI 206040 y T. harzianum CECT 2413 sobrecrecían al patógeno, reduciendo el área ocupada por el mismo.

Para analizar cuantitativamente los resultados obtenidos se midió el área de crecimiento de las distintas cepas de Verticillium en los diferentes ensayos de enfrentamiento con Trichoderma. Los resultados obtenidos se representan en la figura 4 A-l a diferentes tiempos de incubación (3, 6, y 15 días). Se observó que en la mayoría de los casos las cepas de Trichoderma empleadas sobrecrecían al patógeno, aunque en algunos casos las cepas sólo consiguieron parar su crecimiento (véase el caso de T. harzianum CECT 2413 contra V. dahliae 1A-3 y 1A-4). La cepa más eficiente fue T. atroviride IMI 206040, capaz de reducir el crecimiento del patógeno en el 100% de los casos, y sólo contra la cepa de Verticillium 2A-17 una combinación de T. atroviride IMI 206040 con T. viride CECT 2423 mejoró la capacidad antagonista de IMI de manera individual (Fig. 4).

Por tanto, el análisis de estos resultados mostró un efecto inhibidor del crecimiento, tanto de aislados de Verticillium dahliae D como ND, fundamentalmente en el caso de Trichoderma atroviride IMI 206040, sola o en combinación con T. viride CECT 2423 y T. harzianum CECT 2413, y con una clara tendencia que se hizo patente tras 15 días de incubación, anulando por completo el crecimiento del patógeno Verticillium.

En la figura 1 se aprecian los resultados de los enfrentamientos de las cepas T atroviride IMI 206040, T atroviride RCU1 , T harzianum CECT 2413, T. harzianum RCU2, T. harzianum PF1 , o una combinación de estas cinco cepas (formulación), con los aislados de Verticillium 1A-2, representante del patotipo D, o 2A-12, aislado más sensible a cepas del género Trichoderma representante del patotipo ND. Como se puede observar, la composición de estas cinco cepas de Trichoderma (formulación) fue más eficaz frente a los dos aislados de Verticillium dahliae ensayados que la mayoría de las cepas que la componen por separado, salvo en el caso de Trichoderma atroviride IMI 206040 y de su cepa derivada, RCU1 , que presentan una capacidad similar.

2.2. Ensayos de capacidad de crecimiento de distintos aislados de Verticillium dahliae en presencia de metabolitos excretados por Trichoderma.

En la figura 5 se representan los resultados de inhibición de crecimiento obtenidos para aislados del patógeno cultivados en medios conteniendo metabolitos de las cepas T. harzianum CECT 2413, T. viride CECT 2423, T. atroviride IMI 206040, o metabolitos secretados por combinaciones de estas cepas. Como puede observarse en esta figura todos los aislados de Verticillium ensayados presentaron una alta sensibilidad a los metabolitos producidos por estas tres cepas de Trichoderma, siendo inhibido su crecimiento en alrededor de un 90%. Aunque las diferencias entre cepas no fueron muy elevadas, parece que la combinación 7. harzianum CECT 2413/7. atroviride IMI 206040 posee un ligero incremento en la capacidad de inhibir el crecimiento de todos los aislados del patógeno en general.

En la figura 2 se representan los resultados obtenidos con los metabolitos de las cepas Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma atroviride CECT 20755 o RCU1 , Trichoderma harzianum CECT 20756 o RCU2, Trichoderma harzianum PF1 o Trichoderma harzianum CECT 2413, o con los metabolitos secretados por una combinación de estas cinco cepas (formulación), sobre el crecimiento de un aislado del patógeno sensible a cepas de Trichoderma (2A- 12, patotipo ND) o de un aislado más resistente (1A-2, patotipo D), a diferentes tiempos de incubación (días). En este sentido, en ensayos para determinar la capacidad de inhibir el crecimiento de V. dahliae que tienen los metabolitos excretados por estas cepas de Trichoderma, se observaron resultados similares a los anteriores aunque diferentes según la cepa del patógeno. La formulación (combinación de estas cinco cepas) fue tan eficaz como las cepas que la componían contra el aislado más sensible del patógeno (2A-12, patotipo ND) pero fue intermedia contra el aislado más resistente (1A-2, patotipo D). Esto último puede deberse a un efecto de dilución de los metabolitos que intervienen en esta interacción debido a que en la formulación las cepas iban en una proporción 1/5 cada una.

En resumen, estos resultados determinan la capacidad específica de las cepas de Trichoderma propuestas en la presente invención de controlar e impedir in vitro el desarrollo del patógeno Verticillium dahliae.

EJEMPLO 3. Ensayos de antagonismo in vitro de distintas cepas de Trichoderma y aislados de Verticillium dahliae.

Las cepas de Trichoderma utilizadas en los ensayos fueron: Trichoderma harzianum CECT 2413, Trichoderma viride CECT 2423 y Trichoderma atroviride IMI 206040, así como las siguientes combinaciones de las mismas: T atroviride IMI 206040 + T viride CECT 2423, T harzianum CECT 2413 + T. atroviride IMI 206040, y T harzianum CECT 2413 + T viride CECT 2423, y en combinación con los aislados de Verticillium 1A-2, 1A-3, 1A-4, caracterizados como patotipos defoliantes, y 2A-12, 2A-16, 2A-17,4B-31 , 4B-34 y 4B-35, con capacidad no defoliante.

Además, se procedió al desarrollo y caracterización de mutantes espontáneos resistentes a cobre (a 4 mM de CU2SO4) derivados de Trichoderma harzianum y de Trichoderma atroviride, con el objeto de disponer así de cepas resistentes a los contaminantes metálicos utilizados como antifúngicos, entre los cuales el cobre es ampliamente utilizado en el sector del olivar. Concretamente, dichas cepas mutantes son las que a continuación se detallan y que en la actualidad se encuentran depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT):

-Trichoderma atroviride RCU1 (número de depósito en la CECT 20755), derivado de Trichoderma atroviride IMI 206040.

-Trichoderma harzianum RCU2 (número de depósito en la CECT 20756), derivado de Trichoderma harzianum CECT 2413.

3.1 . Ensayos de confrontación directa de distintas cepas de Trichoderma y aislados de Verticillium dahliae.

Al cabo del tiempo, los hongos entraron en contacto y podían darse dos situaciones distintas: que ambos parasen su crecimiento en la zona de contacto o que uno de ellos provocase una lisis del micelio del otro y acabase creciendo por encima de éste. De hecho, el efecto antagonista se comprobó viendo el sobrecrecimiento de Trichoderma y la posible muerte del patógeno al microscopio y por siembra en medio selectivo para el patógeno (crecimiento en presencia de tóxicos en el que Trichoderma no podía crecer pero al que el patógeno era resistente). En la figura 6 se aprecian los resultados de los enfrentamientos de la cepa Trichoderma harzianum CECT 2413 (Fig. 6B), o de la combinación de cepas T harzianum CECT 2413 y T atroviride IMI 206040 (Fig. 6C), con diferentes aislados de Verticillium. Así, se observó que la cepa Trichoderma harzianum CECT 2413 y la combinación de cepas T. harzianum CECT 2413 y T. atroviride IMI 206040 sobrecrecían al patógeno, reduciendo el área ocupada por el mismo.

Para analizar cuantitativamente los resultados obtenidos se midió el área de crecimiento de las distintas cepas de Verticillium en los diferentes ensayos de enfrentamiento con Trichoderma. Los resultados obtenidos se representan en la figura 2 A-l a diferentes tiempos de incubación (3, 6, y 15 días). Se observó que en la mayoría de los casos las cepas de Trichoderma empleadas sobrecrecían al patógeno, aunque en algunos casos las cepas sólo consiguieron parar su crecimiento (véase el caso de T. harzianum CECT 2413 contra V. dahliae 1A-3 y 1A-4).

Por tanto, el análisis de estos resultados mostró un efecto inhibidor del crecimiento, tanto de aislados de Verticillium dahliae D como ND, en el caso de Trichoderma harzianum CECT 2413, sola o en combinación con T. atroviride IMI 206040, y con una clara tendencia que se hizo patente tras 15 días de incubación.

En la figura 1 se aprecian los resultados de los enfrentamientos de las cepas T atroviride IMI 206040, T atroviride RCU1 , T harzianum CECT 2413, T. harzianum RCU2, T. harzianum PF1 , o una combinación de estas cinco cepas (formulación), con los aislados de Verticillium 1A-2, representante del patotipo D, o 2A-12, aislado más sensible a cepas del género Trichoderma representante del patotipo ND. Como se puede observar, la composición de estas cinco cepas de Trichoderma (formulación) fue más eficaz frente a los dos aislados de Verticillium dahliae ensayados que la mayoría de las cepas que la componen por separado. 3.2. Ensayos de capacidad de crecimiento de distintos aislados de Verticillium dahliae en presencia de metabolitos excretados por Trichoderma. Se realizaron ensayos de capacidad de crecimiento del patógeno en presencia de metabolitos excretados por Trichoderma mediante el cultivo de las cepas de Trichoderma sobre un disco de celofán permeable a metabolitos extracelulares (hidrolasas, antibióticos, etc.) colocado a su vez sobre el medio de cultivo PDA de una caja de Petri, a 22 °C. A los cuatro días de crecimiento, se retiró el celofán y con él el micelio desarrollado y un trozo de micelio del patógeno se colocó en el centro de las cajas. Para analizar cuantitativamente los resultados obtenidos en este ensayo con celofanes, a los diez días se midió el área de crecimiento de los distintos aislados de V. dahliae y se comparó el diámetro de crecimiento del patógeno en cajas control con el crecimiento en cajas donde Trichoderma había crecido sobre un celofán y que previamente había sido retirado antes de inocular el patógeno.

En la figura 5 se representan los resultados de inhibición de crecimiento obtenidos para aislados del patógeno cultivados en medios conteniendo metabolitos de las cepas T. harzianum CECT 2413, T. viride CECT 2423, T. atroviride IMI 206040, o metabolitos secretados por combinaciones de estas cepas. Como puede observarse en esta figura todos los aislados de Verticillium ensayados presentaron una alta sensibilidad a los metabolitos producidos por estas tres cepas de Trichoderma, siendo inhibido su crecimiento en alrededor de un 90%. Aunque las diferencias entre cepas no fueron muy elevadas, parece que la combinación T harzianum CECT 2413/7. atroviride IMI 206040 posee un ligero incremento en la capacidad de inhibir el crecimiento de todos los aislados del patógeno en general.

EJEMPLO 4. Ensayos in vitro de protección de plantas de olivo frente a la infección por Verticillium dahliae mediante el tratamiento con Trichoderma harzianum CECT 2413.

Se procedió a realizar ensayos de protección con un número significativo de plántulas de olivo de la variedad Picual -susceptible a la VO-, con objeto de comprobar la eficacia de las distintas cepas de Trichoderma utilizadas en la protección de la infección provocada por el hongo patógeno V. dahliae.

Para la realización de estos ensayos se emplearon las cepas de T harzianum CECT 2413 y T asperellum (esta última también denominada "cepa olivo" por ser autóctona de la raíz de esta planta), cepas que presentan un alto antagonismo frente al patógeno y que además se vio que desarrollaban la mayor capacidad de colonización de la raíz del olivo de entre todas las cepas analizadas. También se empleó la combinación de ambas cepas.

Los ensayos se realizaron adicionando una preparación estandarizada de esporas de Trichoderma mediante tratamiento por agua de riego, ya que previamente se había visto que no existían diferencias significativas entre este tratamiento y el tratamiento por inmersión en cultivos hidropónicos, y además las plantas así tratadas presentaban una menor manipulación y se asemejaba a las condiciones de cultivo en campo. Para ello, se realizaron cuatro aplicaciones de las distintas preparaciones de Trichoderma a una concentración de 10⁵ esporas cepa/ml de agua de riego, y un volumen de 35 mi por planta (determinado previamente, y que aseguraba un contacto permanente y sin pérdidas de la disolución de Trichoderma con el sustrato sobre el que se añade) durante un periodo de 32 días, y en condiciones experimentales basadas en un fotoperiodo de 12h/12h, intensidad luminosa (luz fluorescente) de 360 μΕ m^-2- s^-1, temperatura 22-24°C día/noche y humedad 70-80%.

A continuación, y una vez tratadas las plantas con las distintas cepas de Trichoderma, se procedió a realizar la infección con un aislado del patotipo D de V. dahliae para establecer la capacidad de protección de estas cepas frente al desarrollo de la enfermedad.

Para llevar a cabo esta aproximación experimental, se realizaron los tratamientos que se describen a continuación (n=20 plantas / tratamiento): 1 ) Control (de tratamientos y manipulación),

2) Plantas tratadas con Trichoderma harzianum CECT 2413 (control, posible influencia de esta cepa de Trichoderma sobre la planta, por ejemplo, estimulación del crecimiento vegetal, posibles efectos deletéreos, etc.),

3) Plantas tratadas con Trichoderma asperellum [cepa de olivo] (control, posible influencia de esta cepa de Trichoderma sobre la planta, por ejemplo, estimulación del crecimiento vegetal, posibles efectos deletéreos, etc.),

4) Plantas tratadas con T. harzianum CECT 2413+T. asperellum (control, posible influencia de esta combinación de cepas de Trichoderma sobre la planta, por ejemplo, estimulación del crecimiento vegetal, posibles efectos deletéreos, etc.),

5) Plantas inoculadas con V. dahliae (VCG1A-3, patotipo D) (control de enfermedad), 6) Plantas tratadas con Trichoderma harzianum CECT 2413 e inoculadas con V. dahliae (VCG1A-3, patotipo D) (tratamiento biocontrol de la enfermedad),

7) Plantas tratadas con Trichoderma asperellum e inoculadas con V. dahliae (VCG1A-3, patotipo D) (tratamiento biocontrol de la enfermedad), y

8) Plantas tratadas con la combinación de T. harzianum CECT 2413 y T. asperellum e inoculadas con V. dahliae (VCG1A-3, patotipo D) (tratamiento biocontrol de la enfermedad).

Los tratamientos n°1 , n°2, n°3 y n°4 permitieron el establecimiento de efectos comparativos entre sí, por ejemplo, posible estimulación del crecimiento vegetal mediada por las cepas de Trichoderma (tratamientos n°2, n°3 y n°4) con respecto a la ausencia de las mismas (tratamiento n°1 ). El tratamiento n°1 sólo recibió las manipulaciones que tuvieron lugar en los otros tratamientos, por ejemplo, aplicación del mismo número de riegos (volumen, vehículo, etc.) que se realizó para los tratamientos con Trichoderma, así como las manipulaciones que soportaron las plantas del resto de tratamientos (trasplantes, etc.). En cuanto al tratamiento n°5 fue el referente para el control de enfermedad y los tratamientos n°6, n°7 y n°8 fueron los tratamientos problema para el biocontrol de la enfermedad.

Para la inoculación artificial del patógeno V. dahliae en las plantas de olivo se utilizaron suspensiones de conidias del aislado VCG1A-3 (patotipo D) obtenidas de cultivos en caldo de patata dextrosa (CPD) de 7 días de crecimiento a 24°C, 125 rpm, en oscuridad. Dichos cultivos se establecieron de colonias de V. dahliae en PDA de 2-3 semanas de crecimiento a 24°C y oscuridad; tres porciones (-0,5 cm²) tomadas de zonas en crecimiento activo de las colonias se depositaron en matraces con 100 mi de CPD. La suspensión de conidias se obtuvo por filtración de los cultivos líquidos a través de doble gasa estéril. La concentración del inoculo utilizado en los experimentos se ajustó a 5 x 10⁶ conidias-ml^"1 mediante recuento microscópico en cámara Neubauer.

Se realizaron incisiones con bisturí en las cuatro esquinas de las macetas con objeto de romper el sistema radicular para facilitar la penetración del patógeno y evitar la manipulación directa de la planta. Posteriormente, se procedió a la inoculación de las plantas mediante la adición directa al suelo de 35 mi de la suspensión de conidias. Finalmente, las macetas se dispusieron individualmente sobre placas de Petri en las cámaras de cultivo en condiciones controladas de fotoperiodo, intensidad luminosa, temperatura y humedad.

Se establecieron condiciones de inoculación del patógeno que pueden considerarse relativamente naturales, y similares a las que pueden tener lugar en el cultivar de campo.

Tras el comienzo de los experimentos se analizó la evolución de las plantas frente al desarrollo de la enfermedad. Se determinó el número total de hojas como índice de defoliación, tanto de tallo principal como secundarios, y se aplicó una escala de severidad de daño al objeto de establecer la sintomatología del desarrollo de la enfermedad.

Los resultados no mostraron diferencias significativas entre el control de manipulación (tratamiento n°1 ) y las plantas pretratadas con cepas de T. harzianum CECT 2413, T. asperellum y la mezcla de ambas cepas de Trichoderma (tratamientos n°2, n°3 y n°4). Sin embargo, la inoculación con V. dahliae 1A-3 originó una disminución significativa en el número total de hojas a partir del día 58 de tratamiento, en las plantas tratadas previamente con T. asperellum o con la mezcla de ambas cepas de Trichoderma, que fue del 33% y 24,5%, respectivamente. Mientras que en las plantas pretratadas con T. harzianum CECT 2413, el patógeno no produjo cambios significativos en el número total de hojas durante los 91 días de tratamiento (Fig. 7).

En este sentido, al realizar el análisis de la escala de severidad del daño a partir de la sintomatología observada a lo largo del tiempo, tanto en plantas control sometidas a la enfermedad como en plantas tratadas previamente con T. asperellum y con la mezcla de T. asperellum y T. harzianum CECT 2413 e inoculadas con V. dahliae se apreció un incremento significativo del daño, sin que se apreciaran modificaciones significativas en las plantas pretratadas con T. harzianum CECT 2413 e inoculadas con V. dahliae a lo largo del tiempo (Fig. 8). El comportamiento observado tras el análisis de los resultados del ensayo anteriormente descrito de inoculación por riego en plantas dañadas mediante lesiones en raíces por cortes en suelo, sugiere la existencia de protección frente a la enfermedad del 100% en el caso del pretratamiento de las plantas con Trichoderma harzianum CECT 2413, del 45% en el caso del pretratamiento con Trichoderma asperellum y del 60% en el caso del pretratamiento de las plantas con la mezcla de ambas cepas de Trichoderma. Estos resultados perfilan la tendencia al control de la enfermedad para las plantas pretratadas con Trichoderma harzianum CECT 2413, estableciendo además que desarrolla un efecto de protección superior al observado para Trichoderma asperellum y la mezcla de ambas cepas.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Cepa de Trichoderma seleccionada de entre la cepa de la especie Trichoderma atroviride depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de depósito 20755; o la cepa de la especie Trichoderma harzianum depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de depósito 20756.

2. Cepa de la especie Trichoderma atroviride depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de depósito 20755.

3. Cepa de la especie Trichoderma harzianum depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de depósito 20756.

4. Cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en estado esporulado.

5. Composición que comprende un elemento seleccionado de la lista:

a. una de las cepas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o cualquiera de sus combinaciones,

b. productos del metabolismo de una de las cepas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o cualquiera de sus combinaciones, o una combinación de (a) y de (b).

6. Composición según la reivindicación 5 que además comprende al menos una cepa de Trichoderma seleccionada de la lista: Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma harzianum CECT 2413 o Trichoderma harzianum PF1 .

7. Composición según la reivindicación 6 donde las cepas de Trichoderma se encuentran en estado esporulado.

8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 que además comprende productos del metabolismo de al menos una cepa de Trichoderma seleccionada de la lista: Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma harzianum CECT 2413 o Trichoderma harzianum PF1 .

9. Uso de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 para la prevención y/o tratamiento de infecciones provocadas por microorganismos fitopatógenos.

10. Uso de la cepa o de la composición según la reivindicación 9 donde el microorganismo fitopatógeno pertenece a un género seleccionado de la lista que comprende: Armillaria, Botrytis, Chondrostereum, Colletotrichum, Cladosporium, Fusarium, Monilia, Nectria, Phytophthora, Plasmopara, Pseudoperonospora, Pythium, Rhizoctonia, Rhizopus, Sclerotinia, Sclerotium o Verticillium.

1 1 . Uso de la cepa o de la composición según la reivindicación 10 donde el microorganismo fitopatógeno pertenece al género Verticillium.

12. Uso de la cepa o de la composición según la reivindicación 1 1 donde el microorganismo fitopatógeno es Verticillium dahliae.

13. Uso de la cepa o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 1 ó 12 donde la planta afectada por el microorganismo fitopatógeno se selecciona de la lista que comprende: alcachofa, algodón, melón, tomate, patata u olivo.

14. Uso de la cepa o de la composición según la reivindicación 13 donde la planta es el olivo.

15. Uso de la cepa o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 en combinación con otros agentes antifúngicos.

16. Uso de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 como fertilizante.

17. Uso de la cepa o de la composición según la reivindicación 16 como fertilizante en plantas de olivo.

18. Uso de la cepa Trichoderma harzianum PF1 y/o de los productos de su metabolismo para la prevención y/o tratamiento de infecciones provocadas por hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticillium.

19. Uso de la cepa y/o de los productos de su metabolismo según la reivindicación 18 en combinación con al menos una cepa de Trichoderma seleccionada de la lista que comprende: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma atroviride IMI 206040 o Trichoderma harzianum CECT 2413.

20. Uso de la cepa y/o de los productos de su metabolismo según la reivindicación 19, en combinación con las cepas de Trichoderma: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma atroviride IMI 206040 y Trichoderma harzianum CECT 2413.

21 . Uso de la cepa y/o de los productos de su metabolismo según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 donde las cepas de Trichoderma se encuentran en estado esporulado.

22. Uso de la cepa y/o de los productos de su metabolismo según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 en combinación con productos del metabolismo de al menos una cepa de Trichoderma seleccionada de la lista que comprende: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma atroviride IMI 206040 o Trichoderma harzianum CECT 2413.

23. Uso de la cepa y/o de los productos de su metabolismo según la reivindicación 22, en combinación con productos del metabolismo de las cepas de Trichoderma: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma atroviride IMI 206040 y Trichoderma harzianum CECT 2413.

24. Uso de la cepa Trichoderma atroviride IMI 206040 y/o de los productos de su metabolismo para la prevención y/o tratamiento de infecciones provocadas por hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticillium.

25. Uso de la cepa y/o de los productos de su metabolismo según la reivindicación 24 en combinación con al menos una cepa de Trichoderma seleccionada de la lista que comprende: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma harzianum PF1 o Trichoderma harzianum CECT 2413.

26. Uso de la cepa y/o de los productos de su metabolismo según la reivindicación 25, en combinación con las cepas de Trichoderma: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma harzianum PF1 y Trichoderma harzianum CECT 2413.

27. Uso de la cepa y/o de los productos de su metabolismo según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26 donde las cepas de Trichoderma se encuentran en estado esporulado.

28. Uso de la cepa y/o de los productos de su metabolismo según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27 en combinación con productos del metabolismo de al menos una cepa de Trichoderma seleccionada de la lista que comprende: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma harzianum PF1 o Trichoderma harzianum CECT 2413.

29. Uso de la cepa y/o de los productos de su metabolismo según la reivindicación 28, en combinación con productos del metabolismo de las cepas de Trichoderma: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma harzianum PF1 y Trichoderma harzianum CECT 2413.

30. Uso de la cepa Trichoderma harzianum CECT 2413 y/o de los productos de su metabolismo para la prevención y/o tratamiento de infecciones provocadas por hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticillium.

31 . Uso de la cepa y/o de los productos de su metabolismo según la reivindicación 30 en combinación con al menos una cepa de Trichoderma seleccionada de la lista que comprende: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma atroviride IMI 206040 o Trichoderma harzianum PF1 .

32. Uso de la cepa y/o de los productos de su metabolismo según la reivindicación 31 , en combinación con las cepas de Trichoderma: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma atroviride IMI 206040 y Trichoderma harzianum PF1 .

33. Uso de la cepa y/o de los productos de su metabolismo según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32 donde las cepas de Trichoderma se encuentran en estado esporulado.

34. Uso de la cepa y/o de los productos de su metabolismo según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33 en combinación con productos del metabolismo de al menos una cepa de Trichoderma seleccionada de la lista que comprende: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma atroviride IMI 206040 o Trichoderma harzianum PF1 .

35. Uso de la cepa y/o de los productos de su metabolismo según la reivindicación 34, en combinación con productos del metabolismo de las cepas de Trichoderma: Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756, Trichoderma atroviride IMI 206040 y Trichoderma harzianum PF1 .

36. Uso de la cepa y/o de los productos de su metabolismo según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 35 donde el hongo fitopatógeno es Verticillium dahliae.

37. Uso de la cepa y/o de los productos de su metabolismo según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 36 donde la planta afectada por el hongo fitopatógeno se selecciona de la lista que comprende: alcachofa, algodón, melón, tomate, patata u olivo.

38. Uso de la cepa y/o de los productos de su metabolismo según la reivindicación 37 donde la planta es el olivo.