WO2012139526A1

WO2012139526A1 - 一种配位金属的气味化合物的探测方法

Info

Publication number: WO2012139526A1
Application number: PCT/CN2012/074025
Authority: WO
Inventors: 庄寒异; 松波宏明; 艾力克•布劳克
Original assignee: 上海交通大学医学院; 杜克大学; 纽约州立大学研究基金会
Priority date: 2011-04-14
Filing date: 2012-04-13
Publication date: 2012-10-18
Also published as: CN103608674A; CN103608674B

Description

一种配位金属的气味化合物的探测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学，更具体的讲，涉及一种配位金属的气味化合物的探测方法。背景技术

硫醇的特征是具有硫-氢键，人类对硫醇类气味非常敏感，例如 2 -甲基 - 2 -丙硫醇在十亿分之 0.3的浓度就可以被感觉到，所以通常用作天然气中的增味剂。蜘蛛猿对乙硫醇的敏感程度则可以达到一兆分之一。硫类和胺类等具有强烈气味的化合物是蛋白质降解的主要产物，通常产生于腐败的食物中。因此，为了避免毒素的摄入，硫醇气味的敏锐辨识可能是非常重要的，然而硫醇感知的分子机制还有待阐明。

由于具有强烈味道的挥发性气体通常是金属配位中的优良配体，一些研究提示了一种可能，那就是气味受体在介导气味感知的过程中可能是发挥一种"金属蛋白"的作用，这意味着 Zn²⁺、 Ni²⁺、 Cu²⁺和 Cu⁺等过渡金属在一些种类的气味（如硫醇类，胺类以及碳原子数为 5、 6或 7的羧酸类）激活气味受体的过程中可能是必须的。有一些详细的证据，比如对于具有空间位阻以致无法键合金属的胺类闻起来要比无位阻的同系物弱得多。而且一些高张力的且有强烈的臭味的烯烃，如 bicyclo[3.3.1]non-l-ene和跨环辛烯（trans-cyclooctene), 要比那些没有气味的的类似物往往更加容易与过渡金属形成复合物。 2003年的研究证明一个合成的对应于小鼠嗅觉受体（OR) 面向胞外的环状结构保守序列五肽 HACKE可以有效地与金属离子结合并呈现出构象变化，于是提出可能在这种结合的基础上被硫醇刺激的 OR 才能灵敏地产生激活作用。然而 OR蛋白与金属离子结合仍未有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种配位金属的气味化合物的探测方法。

为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：一种配位金属的气味化合物的探测方法，利用以 HEK293T以及其衍生细胞系为基础的哺乳动物嗅觉受体的异源表达系统，表达嗅觉受体，在所述异源表达的嗅觉受体中加入气味化合物的同时加入铜离子，所述衍生细胞系是指以 HEK293T细胞为基础的 Hana3A细胞系。

所述嗅觉受体是指小鼠嗅觉受体 MOR244-3。

作为一个优选，一种配位金属的气味化合物的探测方法，利用穿孔膜片钳技术测定鼻中隔器中的嗅觉神经元的电信号，在所述穿孔膜片钳技术系统中加入气味化合物的同时加入铜离子或铜离子螯合剂。

所述气味化合物是指可配位金属的气味化合物，包括甲硫基甲硫醇、以 RX(CH₂)_nS为通式的化合物或者跨环辛烯中的一种或几种，其中 RX(CH₂)_nS中 X为 S或 Se， n为 1-3中的任一， R为甲基或乙基。

所述铜离子的浓度为 0.7μΜ -60μΜ, 优选为 30μΜ。

所述衍生细胞系是指以 ΗΕΚ293Τ细胞为基础的 Hana3A细胞系，具体为 HEK293T细胞稳定表达 RTP1、 RTP2和 G。_lf等蛋白。

本发明的优点在于：本发明运用一个嗅觉受体的异源表达系统达到高通量的嗅觉受体的筛选，成功地发现了相对硫类和其它挥发性化合物的哺乳动物嗅觉受体。我们发现只有在加入铜离子而非其他化合物的情况下才能达到嗅觉受体的高效激活，首次揭示了铜离子在硫类及其它可螯合金属的化合物的探测及感知中的关键作用。现有技术无法在异源表达嗅觉受体的细胞系统中反应相对各硫类化合物的受体活化，通过加入铜离子，我们达到了高灵敏度的硫类及其它可螯合金属的化合物的探测。

本发明中利用结合铜离子的细胞及其它平台可达到高灵敏度的探测及鉴别硫类及其它可螯合金属的化合物的目的，可被应用到工业及农业的一些领域，比如天然气泄漏检测、动物跟踪等。

附图说明

图 1为 MOR244-3选择性地被 MTMT和其它含硫气味激活。 MOR244-3对 MTMT和 a) 一系列含硫气味，包括 8种 MTMT类似物和 22种其它含硫化合物以及 b) 87种不同的气味的反应。除了在观察气味造成的细胞毒性时，我们所用的所有气味的浓度都是 30 μΜ。对于那些有细胞毒性的气体我们选择使用细胞的最大耐受量，例如 (methylthio)ethanethiol 是 0.3 μΜ, 2-mercaptobenzothiazole禾口 2-mercaptopyridine是 10 μΜ。对于所有的数据，标准化的荧光酶活性显示为平均值士平均数标准误差。

图 2为 Cu²⁺增强 MOR244-3对 MTMT的反应。 a) MOR244-3对 30 μΜ MTMT在加入各种逐渐升高的金属离子浓度的量效曲线。 b) MOR244-3在各种金属离子浓度都控制在 30 μΜ (除了 PtCl^B AgN0₃，分别为 10 μΜ和 5 μΜ) 的情况下对逐渐升高的 MTMT浓度的的量效曲线。 c)用 GloSensor检测法实时测量 MOR244-3在 30μΜ Cu²⁺禾口 /或 30 μΜ MTMT 的情况下在加入气味 30分钟内的活性。箭头指示气味的加入。 d) 当 MOR244-3 用 30 μΜ MTMT和浓度逐渐升高的 Cu²⁺和 TEPA刺激时 cAMP水平的变化。在 GloSensor实验中， y 轴表示化学发光，以平均值士平均数标准误差的方式来表示。

图 3为直接测量 MOR244-3活化后 cAMP水平的变化。 a) 在加入 30 μΜ铜和不加入铜的情况下用各剂量的 MTMT刺激 MOR244-3。 b) 在加入逐步加大剂量的铜离子和 TEPA 的情况下用 30 μΜ MTMT刺激 MOR244-3。 y轴表示 cAMP水平变化，以平均值士平均数标准误差的方式来表示（n=6)。

图 4为 MOR244-3的铜离子增强效应的结构需求。 a) MTMT及其类似物的气味结构关系。用实线框出的气味为在加入铜的情况下有明显反应的，用虚线框起来的气味是反应比较弱的，我们定义比较弱为小于 MTMT 反应强度的 50%。没有被框起来的气味不引发 MOR244-3反应。 b) MOR244-3对代表性的含硫化合物在加入和不加入铜离子情况下的反应。当不加铜的曲线的顶值超过 0.32时，加入 30 μΜ TEPA的曲线也同时显示。各剂量反应曲线图的左上角标出各配体的化学结构。我们用 F-test来比较各组剂量反应曲线的 EC50 值、顶值和 Hill slope的最佳拟合值。星号代表 Bonferonni校正后代表显著差异的 p值。

图 5为铜离子增强嗅觉受体活化的功能特异性地见于 MOR244-3。在加铜不加铜的情况下， MOR244-3对 a)更多的含硫化合物、 b) 具高张力的烯烃， trans-cyclooctene, 和其无张力的异构体 ci_S-_Cy_Cl₀₀ct_ene、 c)其它不含硫的化合物以及 d)其它已知受体 -配体的组合的量效曲线。各化合物的化学结构见左上角。我们用 F-test来比较各组剂量反应曲线的 EC50值、顶值和 Hill slope的最佳拟合值。星号代表 Bonferonni校正后代表显著差异的 p值。

图 6为突变分析揭示 MOR244-3中的候选铜离子结合位点。 a) MOR244-3受体的蛇状模型，其中标出突变被突变的蛋氨酸 (M)、组胺酸 (H)和半胱胺酸 (C)残基。粗线圈出的残基为在（b) 中的荧光酶检测中缺失功能。 b)候选铜离子结合位点的突变体在加铜和不加铜的情况下对三个 MTMT浓度的反应。下划线代表同一位点的不同突变方式。

图 7为 MTMT-Cu聚合体与 MOR244-3结合的模型。 a) 上图，野生型 MOR244-3和 H105K变异体在加入 30 μΜ铜离子时对 MTMT和 cineole的反应；下图，野生型 MOR244-3 和 H105K变异体在加入和不加入 30 μΜ铜离子时对 dimethyl sulfide的反应； b) MOR244-3 的同源模型，其中加号代表预测的配体结合口袋，显示的残基侧链为 H105。 c) 以 Cu²⁺为辅因子的 OR激活模型，其中 Cu²⁺与配体结合形成 Cu²⁺-气味复合体并引发复合体与 OR的后续结合。

图 8为铜离子参与 MTMT活化 SO中 OSNs的生理过程。 a) —个非 SRI细胞被 MTMT以不同脉冲时间（从 0.025s至 0.5s)刺激所引起的内向电流，很好的量效关系表明此方法的稳定可靠。 b) 6个细胞在 MTMT以不同脉冲时间刺激下的内向电流的校正量效曲线。每个细胞的被一个脉冲活化的峰值电流都以它的最大反应值为标准 1来统一校正。 c) 30 μΜ Cu²⁺能增强一些细胞对 10 μΜ MTMT的刺激反应。 d) 30 μΜ TEPA能削弱一些细胞对 10 μΜ MTMT的刺激反应。在（c) 和（d) 中，粗线的数值是同样条件下的三次独立实验（细线）所得的平均值。所有的电生理实验都以电压钳模型在恒定电压 -60 mV的条件中进行。

图 9为在 SO中表达的 MOR256-17对梯度浓度的 MTMT反应的量效曲线图。反应的数值以同一批实验的 MOR244-3在添加 30μΜ Cu²⁺时被 30μΜ MTMT活化时的平均值为标准 1来统一校正。

图 10为铜离子螯合剂 TEPA特异性地使小鼠缺失对 MTMT的辨别能力。训练的小鼠分为两组，每组 8支，分别让它们吃糖时闻 eugenol或 MTMT。测试时，每组又再分为两小组，每组 4只，麻醉后分别往它们的鼻腔中注入 dH₂0或 30mM TEPA。待它们苏醒并恢复正常运动能力后，测试所有小鼠对两种气味的辨别能力。左图显示，注入 TEPA只特异地使小鼠丧失了对 MTMT的辨别能力，而小鼠对 eugenol的辨别能力没有负面影响。右图显示，随着 TEPA 的代谢，注入 TEPA两天后再测试时，所有小鼠对两种气味的辨别能力都恢复正常。图中， Y轴代表测试的 9分钟内，小鼠对每种气味的探寻时间。所有数值的标准差都被标出来 (n=4)。配对 t-test用来比较两组之间探寻时间的差异（*p < 0.05)。具体实肺式

以下实施例将能使本领域的技术人员更清楚地理解如何实践本发明。应当理解，尽管结合其优选的具体实施方案描述了本发明，但这些实施方案拟阐述，而不是限制本发明的范围。

实施例 1，铜离子在配位金属的气味化合物的感知中关键作用。

一、 MOR244-3选择性地被 MTMT激活。

我们首先对鼠的嗅觉受体用 MTMT进行筛选。筛选实验选用在 HEK293T基础上建立起来的 OR异源表达系统。我们的鼠 OR库包含了一套有代表性的 28个 OR, 这些 OR都是被验证过的。虽然这些样品并不完全，但是它们涵盖了各种各样鼠 OR 的亚家族。进一步对可能有反应的候选 OR作出检测，结果确定 MOR244-3对 MTMT有高反应性。为了确定 MOR244-3对 MTMT的反应特异性，我们测定了它对于一组含硫化合物的反应，其中包括 MTMT和 8个 MTMT 的类似物，还有 22个其它结构不一的含硫化合物（图 la及补充表格 Sl )。此外，我们也检测了一组 87个气味分子，它们具有不同的结构和不同类型的气味 (图 lb及补充表格 S2)。我们发现 MOR244-3在不同结构的化学物质中对 MTMT有强烈的反应，而且它也选择性地对几个与 MTMT结构相似的含硫化合物有反应，包括一些硫醇和二硫化物。我们注意到硫醇基团本身，比如甲硫醇和辛硫醇的情况，并不总能引发 OR 对气味的反应。

二、铜离子增强 MOR244-3对 MTMT的反应。

以 MOR244-3作为模型，我们检测了金属离子对于 OR活化的影响。首先我们把用来做气味稀释的刺激培养液加入不同的金属离子（铜离子的基础水平经测量为 0.7μΜ)，我们发现铜的添加导致 MOR244-3对 30 μΜ MTMT的反应增强。这种效应随着铜离子浓度的增加而增强，直到铜离子的浓度达到 30 μΜ。我们注意到通过电感耦合等离子体质谱法测出的小鼠嗅上皮以及小鼠嗅粘液中总的铜离子浓度也是微摩尔级别的（0-60 μΜ)，这和我们所用的细胞培养系统中的类似。其它受到检测的金属，如 Zn²⁺、 Ni²⁺、 Co²⁺、 Fe³⁺或 Mg+不产生受体的活化（图 2a)。当把铜离子的浓度固定在 30 μΜ时， MOR244-3对于增加的 MTMT 的浓度在 EC50值上可以有 20倍的减小，表明加入铜之后 MOR244-3较高的效能（图 2b)。作为对比，加入 30 μΜ Ni²⁺, Fe³⁺, Co²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺, Au³⁺, 10 μΜ Pt²⁺或者 5 μΜ Ag+相比于对照组来说 OR活化反应并没有出现增强。然后我们用 GloSensor分析法来测量随着配体增加而导致的受体活化所引起的 cAMP的实时水平变化。可以确定的是， MOR244-3只有在 Cu²⁺ 和 MTMT同时存在是才会被强烈地活化，因为只加入 MTMT引起了微弱得多的反应，而只加入 Cu²⁺没有反应，这种结果有效排除了 MOR244-3可能是铜的受体的可能性（图 2c)。最后我们直接测定了受体被 MTMT激活的过程中 cAMP的数量变化，我们仅在浓度 30μΜ 的 Cu²⁺存在时观察到 cAMP浓度的增加（图 3a)。

为了进一步确证 MOR244-3对 MTMT反应中的铜效应，我们接下来验证铜的减少是否会减弱受体的活化。我们在刺激培养液中加入了膜通透性的高亲和力铜螯合剂四乙撑五胺 (TEPA), 当 Cu²⁺的浓度被定在 10 μΜ时，增加螯合剂的浓度会减弱 MOR244-3对 10 μΜ MTMT的反应。值得注意的是，向培养液中加入 10 μΜ的 ΤΕΡΑ而不加入任何外源性的 Cu²⁺ 会完全消除 MOR244-3对 30 μΜ ΜΤΜΤ的反应（图 2d)。这也提示我们刺激培养液中基础水平的铜含量在 MOR244-3被 MTMT激活的反应中是必需的。更进一步，当 TEPA的浓度被定在 10 μΜ时，通过加入铜离子 MOR244-3的活性得到恢复，证明过量的铜中和了 ΤΕΡΑ 的活性（图 2d)。这更增加了铜离子在受体活性增加中所起作用的可信性。更加直接的对于 cAMP的测定更加确证了 TEPA的作用（图 3b)。

三、 Cu²⁺对 OR活化的增强作用是 MOR244-3特异性的。

我们设计了一个实验测试 MOR244-3与 8种 MTMT的类似物的反应，以研究 Cu²⁺增强效应所需要的结构基础（图 4及补充表格 Sl )。由于 MTMT结构简单，只可以改造出有限数量的化学类似物。可以是 MTMT的同分异构体，可以加上一个或两个碳原子（附带上与碳原子结合的氢），或者加上两个氧（通过加入磺基），或者是减少两个氢原子，再或者是用硒取代硫醚键中的硫。异构化，原子的增加、减少或取代，可能改变巯基和硫醚基的数量，也可能改变硫原子的位阻拥挤，进而改变由此引入的大量的铜离子，改变配体的"咬入角"，改变 S-H的酸度，同时也改变了硫醚电子对的可用性，影响化合物的亲脂性，当然也会潜在地改变对应的铜螯合物和它对接蛋白质的能力。我们发现，将 MTMT中的硫醚甲基基团以乙基取代（如图 4中 2所示）对活性没有影响，而在硫原子之间加入甲基（如图 4 中 17所示），或者同时加入如图 4中 2所示的乙基和 17所示的甲基（如图 4中 5所示），再或者是以叔丁基取代甲基（如图 4中 6所示）都会减弱活性（空间位阻效应越明显，亲脂性就越强）。将 5环化得到 8，脱去了两个氢原子，导致活性有略微的丧失（形状改变）。有意义的是， 8更进一步的脱去四个氢原子之后导致了完全的活性丧失。导致这一现象出现的原因可能是由于噻吩的 p型孤电子对（如图 4中展示的那样）无法发挥成键作用，以及它牵涉到环的芳香性（为了清楚明了起见，第二个未结合的孤对电子 sp²被省略）。由于磺基和铜不能形成配位键，所以从 1到 10的转变也会导致 OR活性的部分丧失，即使在此过程中巯基的酸性是增加的。另一方面，当 7 中的硫醚的硫原子被硒原子置换时，还有当 1 去掉两个氢原子形成双硫酯 3时，大部分的活性被保持下来。另外 trithiocarbonate 12也保持了很好的活性。硫醇 -硫醚 13表现出比 MTMT更强的 OR激活性，但是它的铜螯合物的结构却最可能不同于 1 的铜螯合物。虽然在高浓度的时候会表现出细胞毒性，硫醇 -硫醚 4 也是有活性的。另外，巯基的甲基化作用、硫醚甲基基团的失去或者是同分异构化为二硫化物 14或二巯 15也会导致 OR的活性丧失。对于二硫化物 8和 20， 8的前体可以在雄性老鼠的尿液中提取出来， 20是 MTMT的氧化产物。它们可以引发受体强的反应。这种观察结果与文献中报道的铜可以还原 S-S键是一致的。综合这些来看，最具活性的螯合物应该是与类型为 RX(CH2)nS (X = S or Se; n = 1-3; R = 甲基或乙基）的含硫化合物形成的。这种类型的含硫化合物只有一个终端的硫醇盐或硫代羰基的硫原子。

另外的一些亚硫化合物，例如甲硫醇（16，图 4b)，还有一些含有氮元素的，例如半胱胺（cysteamine)禾 B trimethylthiazoline (TMT, 图 5a)，它们在不加铜的时候不能引发反应，而在加入铜之后则会引发很显著的反应。特别是我们发现 tmns-cyclooctene有具有很强的铜效应，尽管此实验必须在黑暗条件下进行以防止 trans到 cis的异构化（图 5b)。此外我们还发现，对更多种类的气味的筛选中，在加入 Cu²⁺之后涌现出了很多与 MTMT结构和功能不同的配体，只是它们的反应要弱一些。这些化合物包括庚醛（hept_anal)、铃兰醛（lyml)、桉树脑（cineole) 和苯乙醛（phenylethanal), 它们代表了不同结构的化合物，主要包含的官能团是醛基和醚基。对于所有的这些配体，我们总结出随它们剂量增加的 OR 反应曲线图，确定它们其中的八个毫无疑问是 MOR244-3的配体（图 5c)。所有这些非硫醇气味都显示出在受体激活时的 Cu²⁺增强效应。

最后，我们也测试了一些随机的 OR-配体组合，包括已知的人类 OR与一种硫醇的反应，所有这些都未显示出加铜与不加铜的区别（图 5d)。上述的结果共同证明了一个结论：虽然 MOR244-3是一个广反应谱的 OR，但是 Cu²⁺的增强效应在它被特定结构类型的硫醇所活化时才特异地表现出来。这也提示了一种可能： MOR244-3 的活化中 Cu²⁺起到了一个中枢作用。

四、基于铜结合位点的 MOR244-3与其配体相互作用的模型。

铜在生物体中是一个必需的微量元素，它是很多酶的辅助因子。在 MOR244-3的活化中起到作用的铜有两种可能的来源，一种是来自细胞内，在蛋白质合成阶段被装配到 OR 上去；另一种可能是来自细胞外，它可能结合到细胞表面的受体上，或者在 OR活化反应前与配体结合。如果一个 OR需要依靠 Cu²⁺作为活化的辅助因子，这个 Cu²⁺可能结合在 OR 本身和 /或它的配体上。为了证实这个观点，我们把定向突变的方法与一个 MOR244-3同源模型结合起来，以检测这个受体与它的配体反应的基准点。首先，为了解释 MOR244-3 的 Cu²⁺效应的机制，我们尝试去标记了此 OR所有潜在的铜结合位点。 Wang等提出了一个金属结合位点，这个位点由金属结合氨基酸（组氨酸和半胱氨酸）组成，位于 OR 的第二个细胞外环上，共有序列结构为 HXXC[DE]，其中 X可以为任意一种氨基酸。然而， MOR244-3 的胞外二结构区域缺少这个序列，它以 SYFCD序列代替。由于一些氨基酸残基如组氨酸，半胱氨酸和蛋氨酸在含铜蛋白中经常与铜形成配位键，而且在一级结构中相距很远的氨基酸可能在实际的空间结构中彼此密切相关，因此我们建立了一系列的单核苷酸突变，在保证结构和进化保守性的基础上将 MOR244-3 中所有的蛋氨酸变成丙氨酸，所有的组氨酸变成精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺和 /或丙氨酸，所有的半胱氨酸变成丝氨酸、缬氨酸和 /或苯丙氨酸，然后看一下在荧光酶分析中这些突变如何影响 MTMT对 MOR244-3的激活（图 6a-b)。其中的一些突变在用三个浓度的 MTMT刺激时没有很明显地影响铜离子效应，可以排除这些这些位点是铜 -配体结合位点的可能性。但是这些突变位点中的一些却在加铜和不加铜的情况下都减弱了反应强度。剩下的位点，包括 C97、 H105、 H155、 C169、 C179和 H243，在突变时却能完全废止与 MTMT的反应，即使加入 Cu²⁺也无济于事。我们推测是因为这些突变要么是破坏了与铜 /配体的结合，要么是导致了完全的受体缺陷 --- -可能是因为它破坏了下游的信号转导或者是受体合成时的蛋白质折叠。我们注意到这些完全失去功能的突变代表性地位于胞外一、跨膜三、跨膜四和胞外二区域。有意思的是，在这六种氨基酸中，只有 H105K突变体保持了与不含硫配体（如 cineole) 及无铜效应配体（如 dimethyl sulfide) 的反应性，提示我们这个残基可能在 MTMT和铜结合面上（图 7a)。

然后，我们以最接近 MOR244-3结构的火鸡 βΐ肾上腺素受体作为基础建立了 MOR244-3 的模型。我们应用 POCASA (http://altair.sci.hokudai.ac.jp/g6/service/pocasa/) 搜索一些可供配体结合的袋状区域，它预测出一个由环状结构和面向胞外的跨膜区域组成的，这和 ORs 上可能的配体结合位置是一致的。通过检测这些可能的配体结合袋状结构，我们发现 H105 位于第二到第五个靠近胞外的跨膜结构域上，表明这是一个高度可能的铜结合残基（图 7b)。因此， MTMT和铜离子有可能在此区域共享一个结合位点，或者，此口袋可包含别构的铜结合位点，并以此进一步影响配体结合。

早在数十年前我们就已已知特定的金属离子可以调节细胞表面受体的活性。研究显示了在蛋白质和配体的结合界面上有金属离子存在，这些蛋白质包括 CXCR4, MC1 和 MC₄ 等含有锌离子的 G蛋白偶联受体。拟南芥中的乙烯受体 ETR1在跨膜区就含有 Cu²⁺，而它的拮抗剂，例如跨环辛烯则对于 Cu²⁺有比乙烯强的亲和力。 Cu²⁺是如何增强 MOR244-3受体活性的呢？其结果与我们前面建立的模型符合，即配体可能先和 Cu²⁺形成螯合物以便于它与 OR的结合（图 7c)。然而，我们不能排除其它在受体活化中可能同时存在的机制，例如铜可能别构结合以引发 OR的构象变化，使它更加适合配体结合。我们假设铜-配体复合物比不含铜配体会更加稳定地与 OR结合。

我们首先进行对文献的详尽搜索，以求找到与可能与 MTMT和铜复合物结构类似的铜 -硫复合物。我们注意到， Black等曾鉴定了一个 Cu²⁺和 MTMT类似物 bis(methylthio)methane 的结晶复合物， bis(methylthio)methane在我们的系统中可以引发一个较弱的铜效应。这个铜 - bis(methylthio)methane复合物包括两个与双硫醚分子配位的铜离子，以椅式构象形成一个八元环。在 MOR244-3的其它配体中， 2-mercaptomethylpyridine与铜形成复合物，而半胱胺可与铜形成二聚体复合物。这些复合物的结构启示我们，可以设计一个实验置换 MTMT 的甲基来鉴别铜 -MTMT复合物究竟是那种结构。

铜 -配体复合物究竟是怎样与 MOR244-3结合的？这里提出的这个模型中铜联合与 OR 蛋白序列以及通式为 MeX(CH₂)_nSH的气味的硫醇类、硫醇盐类、硫醚类或硒醚类结合。这个模型有点类似于在蓝铜蛋白中铜联合与半胱氨酸和蛋氨酸（或硒蛋氨酸）结合。来自绿脓杆菌的蓝铜蛋白的活性中心有一个不规则的四面体结构，这个结构包括一个短的铜到半胱氨酸的硫键和两个铜到组氨酸的硫键，这些键都在赤道面上。此外，这些蓝铜蛋白包括一个弱的轴性的铜到蛋氨酸的硫键，在绿脓杆菌蔚兰体中这个键可以被一个铜到硒蛋氨酸的硒键置换，这样一来，绿脓杆菌蔚兰体就替代了蛋氨酸活性位点。确切的铜 -硫复合物的结构需要进行更加精确的分子模型研究。

最后，在已经知道 OR活化中 Cu²⁺所起的作用的基础上，我们提出结论： Cu²⁺在鼻粘膜对于含硫化合物的灵敏感知是必须的，改变鼻粘膜中 Cu²⁺的浓度可能会改变嗅觉的灵敏程度。即配位金属的气味化合物的探测方法为利用以 HEK293T以及其衍生细胞系为基础的哺乳动物嗅觉受体的异源表达系统，高效表达诸如小鼠嗅觉受体 MOR244-3等一系列嗅觉受体，在加入气味化合物的同时在体系中另外加入铜离子，利用双荧光酶或 Glosensor等测量受体活化后所产生的 cAMP的方法检测嗅觉受体的激活，铜离子可以特异性地增强嗅觉受体的反应，达到高效的受体活化，且这种增强作用未见于其它金属离子。

五、 MTMT活化鼻中隔器中的嗅觉神经元

为了验证原位的 OSNs对 MTMT的反应性，我们采用穿孔膜片钳技术来测定高表达 SR1 和 MOR244-3 (图 8) 的鼻中隔器（septal organ, SO) 中的 OSNs的电信号。因为铜是存在于鼻粘液中的，所以我们期望能观察到 MTMT活化非 SR1细胞 (其中包含表达有 MOR244-3 的细胞）的现象。在我们记录的 132个细胞中，有 76个细胞，即 58%的非 SR1细胞对 MTMT 刺激的反应有量效关系（图 8a)。这个比率高于 SO中 MOR244-3细胞在非 SR1细胞中的比率（27%)，表明除了 MOR244-3, SO中还有其他受体对 MTMT也有反应。为了验证这个猜想，我们又采用体外实验，筛查 SO中其他受体对 MTMT的反应性，结果发现确实还有一个受体， MOR256-17也能被 MTMT强烈的活化（图 9)。不过有意思的是，添加铜离子并不能增加 MTMT对 MOR256-17的活化程度。这些结果表明，就是在 SO中，对 MTMT 响应的细胞在受体的选择和被铜离子调节的作用上存在多样性。同时，为了研究铜离子在体内对感知 MTMT的作用，我们试图观察到添加铜离子，在 MTMT活化细胞过程中调节机制的不同情况。我们发现在用加有铜离子的 MTMT刺激液刺激的 32个测试细胞中，对 MTMT反应增强的细胞有 12个（占 38%) (图 8c)，没有变化的有 15个（占 47% )，还有有 5个细胞（占 16% ) 加入铜离子反而降低了对 MTMT的反应性。类似的， TEPA在调节 MTMT对 SO细胞的活化中也有多样性：在 50个细胞中， TEPA降低了其中 36%的细胞对 MTMT的反应性（图 8d)，而对 64%的细胞没有影响。

整体而言，膜片钳技术的数据显示，在没有外源铜离子加入的情况下， SO中有过半的细胞能被 MTMT活化。这在一定程度上说明了小鼠能稳定探测尿液中的这类化合物。此外，我们的实验还表明，取决于嗅上皮中嗅觉受体的种类，以及内源性铜离子的浓度，这些体内的细胞能被铜离子及其螯合剂多样性的调节，这亦证明在生理学的层面，铜离子参与了动物对硫醇类气味分子 MTMT的嗅觉感知过程。

六、鼻腔中缺失铜离子的小鼠对 MTMT的辨别能力的特异性丧失。

为了评估铜离子在动物感知 MTMT过程中的作用，我们采用了一种测试嗅觉辨别能力的行为学实验方法。此实验原理为：通过训练限制性进食的小鼠，建立食物奖励与某种特定的气味之间的条件反射，即让小鼠吃糖时闻某种气味，让小鼠形成闻到这种气味就有糖吃的记忆，已达到在测试时让处于微饥饿状态中的小鼠找寻辨别某种气味的目的。在本实验中，训练分两组进行，分别为建立小鼠对 MTMT或 eugenol的偏好型记忆。在测试的那一天，我们往两组中各一半的小鼠两边鼻孔都深度注入 30mM的铜离子螯合剂 TEPA (溶解于 dH₂0中），各自的另一半小鼠则都注入 dH₂0以作为对照。测试时，通过统计它们对气味的探寻时间（investigation time)来评价已经建立各自偏好性记忆而经过不同方式处理（注入 TEPA或 dH₂0) 后的小鼠分别对两种气味的辨别能力。结果我们发现，对于与非硫化合物 eugenol建立吃糖记忆关联的小鼠而言，无论是往鼻孔中注入 TEPA还是 dH₂0，都能很好地辨别出 eugenol, 这在某种程度上也说明注入 TEPA的小鼠的基本的嗅觉功能正常。而对于与 MTMT建立了记忆关联的小鼠，注入 dH₂0的小鼠对 MTMT的辨别能力强，而注入 TEPA的小鼠，则几乎没有对 MTMT进行探寻，即丧失了对 MTMT特异性的辨别能力（图 10左）。测试两天后，对所有小鼠在没有重新训练的情况下进行再测试，以观察 TEPA被代谢后各小鼠对气味的辨别能力如何。很有意思的是，之前对 MTMT丧失辨别能力的那一些小鼠，都完全恢复了对 MTMT的辨别能力（图 10右）。这些行为学的实验结果表明，铜对于动物感知 MTMT是必需的。

方法概述

一、化学物品。除了下面提到的之外，所有的气味都是从 Sigma-Aldrich公司购入。 MTMT 是在实验室或商业化合成得到。 MTMT 的类似物，包括（ethylthio)methanethiol、 2-(methylthio)ethanethiol 、 1 -(ethylthio)ethanethiol 、 thiolane-2-thiol 、

1 -(methylsulfonyl)methanethiol 禾卩 3-(methylthio)- 1 -propanethiol 都是由之前报道过的方法合成。 MT是从 Contech Inc. (British Columbia, Canada)购入。这些化学物质是溶解在 DMSO 或 ethanol中，在实验使用前进行进一步的稀释。所有的我们用到的金属盐中， CuCl₂、 NiCl₂ 和 ZnS0₄是从 Sigma-Aldrich购入， FeCl₃从 Aladdin Reagent Database Inc. ( Shanghai, China) 购入。

二、克隆和突变。我们的鼠 OR库由 28个鼠 OR组成，这些代表了总共 1035个鼠 OR 基因中超过 10%的 OR,而且他们以每个亚家族至少一个的方式涵盖了 228个鼠 OR亚家族中的大部分。我们在这些 OR的 N端用 rhodopsin标记之后，连接进入 pCI哺乳动物表达载体中。 MOR244-3的点突变是用 overlap extension PCR来做的。所有产物的序列都通过了测序来确认。

三、双荧光报告酶、 GloSensor和 cAMP-Glo检测。 HEK293T和它衍生的细胞系 Hana3A 以及包含 ATP7A/B RNAi 的细胞被培养在加入胎牛血清的 Minimum Essential Medium

(Hyclone) (血清比例为 10% ) 中，培养条件是 37°C加 5% C0₂。我们用 Lipofectamine900 (Invitrogen) 来做转染。荧光酶分析实验如前描述。对于 GloSensor和 cAMP-Glo检测， Hana3A被种在 96孔板（Biocoat, Becton Dickinson Biosciences ) 里。 18到 24个小时候， OR和 mRTPIS (在 GloSensor检测中，还要再转染一种 GloSensor质粒）被转染进细胞。转染后 24个小时，我们将气味和金属溶液溶解在 CD293 (Invitrogen) 中，然后将溶液加入刺激细胞。我们用 GloSeneor (Promega) 禾 B cAMP-Glo (Promega) 试剂盒，根据制造商提供的流程来测量化学发光。

四、膜片钳技术检测小鼠嗅觉细胞的活化。 1，准备完整的嗅觉上皮：小鼠用氯胺酮 ( 90mg/kg) 深度麻醉后取头。取下的鼠首立即放入 4°C的 "Ringer's溶液 2" 中。再把整个的鼻子从中间分成两半，然后分离出粘附在 SO和鼻背中部凹槽的全部嗅觉上皮，保存在氧化的 "Ringer's溶液 2"中。将剥离下来的整个嗅觉上皮转移到记录槽（recording chamber) 中，以粘液层朝上。记录时，氧化的 "Ringer's溶液 2"保持在 25 ± 2 °C的温度以一定的速度不断地灌入。嗅觉感受神经元的树突球通过一个配有 40x水浸物镜的直立红外微差干涉对比显微镜（Olympus BX50WI)观察。 GFP标记的细胞在荧光照度下观察。通过荧光和明视场的叠加成像，可以在明视场中鉴别出没有荧光的（即不表达 SR1蛋白的）细胞，从而指导微电极管（recording pipettes) 的定位。 2，穿孔膜片钳记录和气味刺激：电生理记录的实验中，由一个 EPC-10扩大器和脉冲软件（HEKA Electronic)来控制。微电极管钳住树突球，管中充满的穿孔液中含有 260μΜ的制霉菌素（_ny_Stati_n)。在所有实验中，接头电位都修正为脱机状态时的- 9mV。在静息状态时，电信号首先以 10kHz滤过，然后调为 2.9kHz。在感应气味分子引发电流的状态中，电信号先以 2.9kHz滤过，时间取样信号只为 333Hz。而进一步的滤过则随只有 60Hz，但是没有改变反应的动力学参数和振幅，这表明采样频率已经足够，而无需考虑信号噪音的问题。本实验通过一个脉冲压力灌注系统（picospritzer, Pressure System lie, Toohey Company), 使用一种 7孔的移液管来运输气味溶液。所有的气味分子溶解在 Ringer's溶液中。

五、嗅觉辨别能力测试检验小鼠对气味的分辨能力。整个实验过程都限制性给食，水则在整个实验过程都依然一直保持供应充足。四天后，各小鼠的体重减少至原来它们自由采食时体重的 80~85%，即可开始训练。训练时，气味滴在一张直径约为 25毫米的厚圆滤纸上，滤纸放在一个直径为 60毫米的密封有盖培养皿的底部。培养皿的上盖钻有十来个直径约 2毫米大小的洞，方糖放置在钻洞的上盖上面。训练时，培养皿放置在训练鼠笼的中央，并且置于碎木屑下大概 1 厘米的位置，以让方糖完全掩埋在碎木屑里。训练分成两大组，一大组是 " eugenol加方糖 "或 " MTMT不加方糖"，另一大组是 " eugenol不加方糖" 或 "MTMT加方糖"，分别训练小鼠特异性地辨别 eugenol或 MTMT。每天每组小鼠都训练 4或 6次，每次 10分钟，共训练 6天。训练时，每组的两种情况交叉进行，不同天数的训练随机安排，保证每天两种情况训练的次数一样即可。测试时，先将小鼠用氯胺酮 (90 mg/kg) 和甲苯噻嗪（10 mg/kg) 的混合麻醉药麻醉。大概 5分钟后，待深度麻醉，用一种我们改进过的白色移液管小枪头插入鼻腔大概为 1厘米深，以每个鼻腔约 9ml的量将 30mM TEPA (溶解于 dH₂0中）或 dH₂0注入左右两个鼻孔中。待小鼠舒醒并恢复正常的运动能力后，开始测试。测试在一个测试笼（1380x670x850 mm) 中进行。测试时不放方糖，气味溶液滴在一张滤纸上，滤纸放入一个封闭的小切片盒中。每组测试的两种气味的小切片盒分别放在测试笼的长条边的两侧，并置于碎木屑以下 3厘米的深度。每只小鼠的每次测试，都更换新鲜的测试笼和碎木屑垫料。测试在暗室中进行，小鼠的行为用一个红外视频数字摄像机拍摄记录。测试前，先把小鼠放入测试笼中适应约 2分钟。测试时间为 5分钟，让小鼠自由活动。小鼠对气味的探寻定义为：小鼠的鼻子直接对着气味盒闻，以及用前爪挖，甚至找到后用嘴咬气味盒。以配对 T检测来鉴定小鼠对气味的探寻时间的差异。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

权利要求书

1.一种配位金属的气味化合物的探测方法，其特征在于，利用以 HEK293T以及其衍生细胞系为基础的哺乳动物嗅觉受体的异源表达系统，表达嗅觉受体，在所述异源表达的嗅觉受体系统中加入气味化合物的同时加入铜离子，所述衍生细胞系是指以 HEK293T细胞为基础的 Hana3A细胞系。

2. 根据权利要求 1所述的一种配位金属的气味化合物的探测方法，其特征在于，所述嗅觉受体是指小鼠嗅觉受体 MOR244-3。

3. —种配位金属的气味化合物的探测方法，其特征在于，利用穿孔膜片钳技术测定鼻中隔器中的嗅觉神经元的电信号，在所述穿孔膜片钳技术系统中加入气味化合物的同时加入铜离子或铜离子螯合剂。

4. 根据权利要求 1一 3任一所述的一种配位金属的气味化合物的探测方法，其特征在于，所述气味化合物是指可配位金属的气味化合物，包括甲硫基甲硫醇、以 RX(CH₂)_nS为通式的化合物或者跨环辛烯中的一种或几种，其中 RX(CH₂)_nS中 X为 S或 Se， n为 1-3中的任一， R为甲基或乙基。

5. 根据权利要求 1一 3任一所述的一种配位金属的气味化合物的探测方法，其特征在于，所述铜离子的浓度为 0.7μΜ -60μΜ。

6. 根据权利要求 5所述的一种配位金属的气味化合物的探测方法，其特征在于，所述铜离子的浓度为 30μΜ。