WO2012137538A1 - 細胞傷害性ｔ細胞誘導用組成物 - Google Patents

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cytotoxic
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人三 長山
成晴 藤田
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    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)

Definitions

  • the present invention relates to a composition for inducing cytotoxic T cells, a pharmaceutical composition containing cytotoxic T cells obtained by exposing the composition for inducing cytotoxic T cells, and a method for producing the pharmaceutical composition And about.
  • antigen-specific cytotoxic T cells are induced by the interaction of hematopoietic stem cell-derived CD8-positive cells with dendritic cells.
  • the interaction involves the association of a fragment of the antigen molecule with the HLA class I molecule on the surface of the dendritic cell and the TCR / CD3 / CD8 complex on the surface of the CD8 positive cell.
  • the CD8-positive cell specifically recognizes a cell in which an HLA class I molecule that matches the compatible type of the HLA class I molecule forms a complex with a fragment of the antigen molecule.
  • Cell to attack The interaction is also facilitated by the association of CD28 molecules on the surface of CD8 positive cells with CD80 / 86 molecules on the surface of dendritic cells.
  • cytotoxic T cells that specifically recognize virus antigens attack virus-infected cells.
  • cytotoxic T cells that recognize tumor-specific antigens attack the tumor cells. Therefore, in tumor immunotherapy, the problem is how to efficiently induce cytotoxic T cells.
  • CD8 positive cells which are precursor cells of cytotoxic T cells, from hematopoietic stem cells such as cord blood, peripheral blood, and bone marrow.
  • CD8 positive cells which are precursor cells of cytotoxic T cells
  • hematopoietic stem cells such as cord blood, peripheral blood, and bone marrow.
  • An example of such an artificial antigen-presenting cell is a technique in which a cell such as fibroblast is transfected with a gene such as an HLA class I molecule, an antigen molecule, or a CD80 / 86 molecule to substitute for a dendritic cell. is there.
  • a complex of an MHC class I molecule tetramer and an antigen peptide (hereinafter referred to as “antigen tetramer”) can bind to a plurality of T cell receptors on the same cell surface.
  • antigen tetramer In addition to detecting T cells recognizing (Non-patent document 1), it is used for antigen-specific T cell activation (Non-patent document 2).
  • CD8 positive cells can be stimulated by using anti-CD3 antibodies with agonist activity instead of a complex of molecular fragments and HLA class I molecules on the surface of dendritic cells.
  • an anti-CD28 antibody having agonist activity is used instead of the CD80 / 86 molecule on the surface of dendritic cells.
  • CD8 positive cells can be stimulated.
  • antigen-specific CTL induction is not possible with anti-CD3 / CD28 beads alone, and in order to induce antigen-specific CTL, it is necessary to use either an antigen-presenting cell derived from a living body or an artificial antigen-presenting cell in combination. It was.
  • the present invention provides a composition for inducing cytotoxic T cells, comprising an anti-CD28 antibody, a solid support on which the anti-CD28 antibody is immobilized, and a soluble peptide capable of binding to MHC class I molecules. .
  • composition for inducing cytotoxic T cells of the present invention may comprise an anti-CD28 antibody, a solid support on which the anti-CD28 antibody is immobilized, and a soluble peptide capable of binding to MHC class I molecules. .
  • the solid support may be a culture vessel or a microbead used for cell culture containing the CD8-positive cells.
  • the soluble peptide capable of binding to the MHC class I molecule is presented as an antigen by the patient's HLA-compatible HLA complex and recognized by the cytotoxic T cell. May be.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating tumors.
  • the pharmaceutical composition for tumor treatment of the present invention comprises the composition for inducing cytotoxic T cells of the present invention, and the soluble peptide capable of binding to the MHC class I molecule is an amino acid sequence of a specific antigen protein of tumor cells. Including the portion, the cytotoxic T cells recognize the tumor cells.
  • the specific antigen protein of the tumor cell may be WT-1.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating viral diseases.
  • the pharmaceutical composition for treating viral diseases of the present invention comprises the composition for inducing cytotoxic T cells of the present invention, wherein the soluble peptide capable of binding to the MHC class I molecule is an amino acid sequence of a virus-specific antigen protein. Including the portion, the cytotoxic T cells recognize the tumor cells.
  • the specific antigen protein of the virus may be a pp65 protein of cytomegalovirus.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is obtained by exposing the composition for inducing cytotoxic T cells of the present invention to CD8 positive cells derived from hematopoietic stem cells, and recognizes a soluble peptide capable of binding to the MHC class I molecule. Includes cytotoxic T cells.
  • the hematopoietic stem cells are any stem cell-derived hematopoietic stem cell selected from the group consisting of embryonic stem cells, adult stem cells and induced pluripotent stem (iPS) cells, and cord blood-derived hematopoietic stem cells.
  • the hematopoietic stem cells, peripheral blood-derived hematopoietic stem cells, and bone marrow blood-derived hematopoietic stem cells may be selected.
  • the present invention provides a method for producing a pharmaceutical composition containing cytotoxic T cells.
  • the method for producing a pharmaceutical composition comprising cytotoxic T cells of the present invention comprises (1) any stem cell-derived one selected from the group consisting of embryonic stem cells, adult stem cells, and induced pluripotent stem (iPS) cells.
  • CD8 positive cells are proliferated predominantly from at least one hematopoietic stem cell selected from the group consisting of hematopoietic stem cells, cord blood-derived hematopoietic stem cells, peripheral blood-derived hematopoietic stem cells, and bone marrow blood-derived hematopoietic stem cells.
  • the soluble peptide capable of binding to the MHC class I molecule comprises an amino acid sequence of human WT-1 protein or cytomegalovirus pp65 protein. There is a case.
  • the present invention provides an immunotherapy comprising the step of transplanting a pharmaceutical composition comprising the cytotoxic T cells of the present invention.
  • the immunotherapy of the present invention includes CD8 positive cells obtained by collecting hematopoietic stem cells including, but not limited to, peripheral blood and bone marrow of a patient, or CD8 differentiated and / or amplified from the obtained hematopoietic stem cells. It may include exposing the positive cells to the cytotoxic T cell-inducing composition of the present invention in vitro and reimplanting the induced cytotoxic T cells into a patient.
  • CD8 positive cells differentiated from a patient's somatic cell-derived adult stem cell or a patient's somatic cell-derived induced pluripotent stem cell are induced in vitro in the cytotoxic T cell of the present invention. Exposing to the composition for use and reimplanting the induced cytotoxic T cells into the patient.
  • the source of the CD8 positive cells of the present invention includes peripheral blood, bone marrow, lymph node, and umbilical cord blood, but may be tissues that are not limited thereto. It is preferable that the dendritic cell or its precursor cell of the present invention is prepared from peripheral blood. However, it may be prepared from hematopoietic stem cells generated from embryonic stem cells, adult stem cells and induced pluripotent stem (iPS) cells.
  • CD8 positive cells In order for CD8 positive cells to be induced in cytotoxic T cells, simultaneously with stimulating CD28 on CD8 positive cells, a complex of MHC class I molecule and antigen epitope molecule and T cell receptor / CD3 / Antigen presentation by association with the CD8 complex needs to occur.
  • CD8 positive cells are induced in cytotoxic T cells using only the immobilized anti-CD28 antibody and soluble antigen peptide, and without using dendritic cells.
  • the composition for inducing cytotoxic T cells of the present invention is assumed by assuming the involvement of cells expressing HLA class I molecules contained in the culture of CD8 positive cells. The mechanism of action can be rationally explained.
  • CD8 positive cell 1 is subjected to CTL induction by soluble peptide 2 and anti-CD28 antibody 4 immobilized on solid support 3 such as magnetic beads.
  • the anti-CD28 antibody 4 immobilized on the solid support 3 reacts with the CD28 molecule 5 on the CD8 positive cell 1, and the CD28 molecule 5 interacts with the CD80 / 86 on the dendritic cell. Stimulation is applied to CD8 positive cells 1.
  • the soluble peptide 2 alone is not recognized by the T cell receptor / CD3 / CD8 complex 6 on the CD8 positive cell 1.
  • soluble peptide 2 binds to HLA class I molecule 7 on cell 8 expressing HLA class I molecule in the culture of said CD8 positive cell 1
  • the T cell receptor / CD3 / CD8 complex on CD8 positive cell 1 6 is presented as an antigen.
  • cytotoxic T that recognizes soluble peptide 2 restricted by HLA class I molecule 7 can be obtained simply by adding soluble peptide 2 and anti-CD28 antibody immobilized on solid support 3 to CD8-positive cell 1.
  • Cell 9 is derived from CD8 positive cell 1. According to the method of the present invention, it is possible to induce CTL against different types of antigens simply by replacing the soluble peptide. Moreover, CTL induction
  • the soluble peptide capable of binding to the MHC class I molecule of the present invention may consist of the amino acid sequences listed in SEQ ID NOs: 1 to 5 in the sequence listing attached to the present specification. Soluble peptides capable of binding to MHC class I molecules of the present invention are not limited to HLA-A restricted epitopes. It has been conventionally known that cytotoxic T cells specific for other antigens can be amplified in vitro, and that clinical effects can be obtained by transplanting such cytotoxic T cells into a patient. For example, Godet, Y. et al. (Cancer Immunol.
  • cytotoxic T cells specific for HLA-B-restricted peptides derived from melanoma-specific cancer antigen tyrosinase obtained cytotoxic T cells specific for HLA-B-restricted peptides derived from melanoma-specific cancer antigen tyrosinase.
  • Straathof, K.M. C. M. (Blood, 105: 1898-1904 (2005)) are HLA-B restricted epitopes of the EB virus-related antigen LMP2, HLA-B restricted epitopes of the EB virus-related antigen EBNA1, and HLA-of the EB virus-related antigen EBNA3.
  • the soluble peptide capable of binding to the MHC class I molecule of the present invention is not only an HLA-A restricted epitope such as a peptide derived from WT-1 protein, but also an HLA-B or HLA-C restricted epitope. Also good.
  • Disease-related antigens expressed by patient cells include WT-1, human telomerase reverse transcriptase (hTERT), survivin, tyrosinase, NY-ESO-1, CEA, NSE, PSA, gp100, MART-1 and MAGE-3.
  • WT-1 human telomerase reverse transcriptase
  • hTERT human telomerase reverse transcriptase
  • survivin tyrosinase
  • tyrosinase NY-ESO-1
  • CEA gp100
  • MART-1 and MAGE-3 Including, but not limited to, tumor-associated antigens, antigens that are (over-expressed) in cancer cells such as EB virus-related antigens such as EBER and LMP-1, and cytomegalovirus pp65 (CMVpp65) protein, etc.
  • CMVpp65 cytomegalovirus pp65
  • an antigen expressed in an infected cell such as a virus-specific antigen such as,
  • the soluble peptide capable of binding to the MHC class I molecule of the present invention may be composed of the same amino acid sequence as that of a natural protein or a partly different amino acid sequence from that of the natural protein. Alternatively, it may be a peptide containing the same amino acid sequence as that of a natural protein or an amino acid sequence that is partially different from that of a natural protein.
  • the soluble peptide has amino acid sequences 126 to 134 of WT-1 protein (SEQ ID NO: 1) and amino acids 235 to 243 of WT-1 protein.
  • Mutant amino acid sequence in which the 236th methionine residue is substituted with a tyrosine residue, amino acid sequence from 461st to 469th of hTERT (SEQ ID NO: 3), and survivin splicing variant It consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence from the 80th to 88th amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of 2B and the amino acid sequence from 341th to 349th amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of CMVpp65 Alternatively, it may contain an amino acid sequence selected from the group.
  • the solid-phased anti-CD28 antibody of the present invention may be any antibody having agonist activity against CD28.
  • any solid support capable of accessing the surface of cultured CD8-positive cells and performing effective CTL induction is used.
  • Preferred solid supports in the present invention include, but are not limited to, latex and other commercially available microparticles and culture vessels.
  • the culture vessel includes, but is not limited to, a dish, a flask, a plate, and a multiwell plate.
  • the anti-CD28 antibody of the present invention may be bound directly to the solid support of the present invention, or may be bound via a specific binding partner that performs a specific interaction such as avidin-biotin.
  • microbeads on which streptavidin is immobilized and biotinylated anti-CD28 antibody are used.
  • the microbeads may have magnetism.
  • anti-CD28 antibody immobilized on microbeads by specific interaction between biotin and streptavidin may be referred to as anti-CD28 immunobeads.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier any solution capable of suspending living cells, such as physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), medium, serum, and the like.
  • the schematic diagram which shows the hypothesis regarding the action mechanism of the composition for cytotoxic T cell induction
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • APC allophycocyanin
  • FIG. 3 is a diagram showing the result of two-dimensional flow cytometry analysis in which the intensity at the fluorescence wavelength of PE and APC is measured among cells that have been stained and passed through the CD3 + gate.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of two-dimensional flow cytometry analysis in which the intensity of PE and APC at the fluorescence wavelength is measured among cells that have passed through the CD3 + gate.
  • FITC-labeled anti-CD3 antibody and APC-labeled anti-CD8 antibody for umbilical cord blood-derived CD8-positive cells cultured after WT-1 peptide-specific CTL induction by WT-1 mutant peptide-added allogeneic peripheral blood-derived dendritic cells
  • FIG. 3 is a diagram showing the result of two-dimensional flow cytometry analysis in which the intensity at the fluorescence wavelength of PE and APC is measured among cells that have been stained with the CD8 antibody and passed through the CD3 + gate.
  • Umbilical cord blood-derived CD8-positive cells cultured without CTL induction treatment stained with FITC-labeled anti-CD3 antibody and APC-labeled anti-CD8 antibody, and of the cells passing through the CD3 + gate, fluorescence of PE and APC
  • Umbilical cord blood-derived CD8 positive cells cultured without CTL induction treatment, with FITC-labeled anti-CD3 antibody, PE-labeled HLA-A * 24: 02WT-1 (mu) -tetramer, and APC-labeled anti-CD8 antibody FIG.
  • FIG. 3 is a diagram showing the result of two-dimensional flow cytometry analysis in which the intensity at the fluorescence wavelength of PE and APC is measured among cells that have been stained and passed through the CD3 + gate.
  • FITC-labeled anti-CD3 antibody For peripheral CD8-positive cells cultured after stimulation with hTERT soluble peptide and anti-CD28 immunobeads, FITC-labeled anti-CD3 antibody, PE-labeled HLA-A * 24: 02hTERT-tetramer, and APC-labeled anti-CD8 antibody
  • the intensity at the fluorescence wavelength of PE and APC was measured among the cells that were stained with and passed through the CD3 + gate.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of two-dimensional flow cytometry analysis in which the intensity at the fluorescence wavelength of PE and APC is measured among cells that have been stained with CD3 and passed through the CD3 + gate.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of two-dimensional flow cytometry analysis in which the intensity at the fluorescence wavelength of PE and APC was measured among cells that were stained with 02hTERT-tetramer and an APC-labeled anti-CD8 antibody and passed through a CD3 + gate.
  • PE and APC fluorescence wavelengths of cells that passed through the CD3 + gate in a sample stained by mixing FITC-labeled anti-CD3 antibody and APC-labeled anti-CD8 antibody without mixing PE-labeled survivin-2B peptide-tetramer The result figure of the two-dimensional flow cytometry analysis in which the intensity
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of two-dimensional flow cytometry analysis in which the intensity of PE and APC at the fluorescence wavelength is measured among cells that have passed through the CD3 + gate.
  • Two-dimensional flow cytometry in which the intensity at the fluorescence wavelength of PE and APC of cells passing through a CD3 + gate was measured with a sample stained by mixing a FITC-labeled anti-CD3 antibody and an APC-labeled anti-CD8 antibody. Analysis result diagram.
  • WT-1 peptide-specific CTL induction from umbilical cord blood (1) 1. Materials and Methods (1) Human umbilical cord blood Human umbilical cord blood samples were collected after obtaining the informed consent signature of the mother and stored frozen in a liquid nitrogen system in RIKEN BioResource Center. Blood collection methods are described in Rubinstein, P. et al. (Blood, 81: 1679-1690 (1993)) and the cryopreservation method is described in Rubinstein, P. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 10119-10122 (1995)).
  • the amino acid sequence (CYTWNQMNL) of the peptide is listed as SEQ ID NO: 2 in the attached sequence listing.
  • a biotinylated anti-human CD28 mouse monoclonal antibody (clone CD28.2, BioLegend Japan Co., Ltd.) is a magnetic bead (Dynabeads TM M-280 Streptavidin, Life Technologies Japan Co., Ltd.). And then incubated at room temperature for 30 minutes and then used after binding by biotin-avidin reaction.
  • the anti-CD28 antibody bound to the magnetic beads is referred to as a complex of biotinylated CD28 antibody and beads or a solid-phased anti-CD28 antibody.
  • Umbilical cord blood obtained from RIKEN (ID No .: HCB00747, HLA-A locus compatible type: 24:02 and 02:06) 25 mL is 37 ° C
  • PBS supplemented with 5% final concentration of dextostane 40 (Terumo Japan) and 2.5% human serum albumin (Japanese Red Cross).
  • the obtained leukocytes were further washed 3 times with PBS supplemented with 5 mM EDTA and 2% human serum albumin.
  • the isolated CD14-positive monocytes were suspended at a concentration of 10 6 cells / mL in X-VIVO TM 15 medium supplemented with 5% human AB serum, and a 35 mm petri dish (EZ-BindShut TM, Asahi Glass Co., Ltd.). ), And then 50 ng / mL recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF, Peprotech) and 50 ng / mL recombinant human interleukin-4 (IL-4, Peprotech) was added and cultured.
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • IL-4 human interleukin-4
  • prostaglandin E2 (Daiichi Fine Chemical Co., Ltd.) and picibanil (OK432, Roche Chugai Pharmaceutical) with a final concentration of 10 ⁇ g / mL were added.
  • the cells were further cultured for 1 day to obtain mature dendritic cells.
  • CD4 positive cells the magnetic particle separator after being removed using (DynaMag-15), new Dynabeads (TM), Tcell Expander CD3 / CD28 (TM, Life Technologies Japan Ltd.) is mononuclear per 10 7 After adding 25 ⁇ L and stirring for 30 minutes on ice or at 4 ° C., CD3 / CD28 positive cells were concentrated using a magnetic particle separator (DynaMag-15).
  • the CD8 positive cells are suspended in a suspension of 10 6 cells / mL in X-VIVO TM 15 medium supplemented with 5% human AB type serum and 300 ng / mL recombinant human IL-15 (Peprotech). It was done.
  • the medium to which the cytokine was added was changed every 2 to 3 days after the start of the culture. At that time, the number of viable cells was measured using trypan blue staining, and a fresh medium supplemented with 300 ng / mL of IL-15 was added so that the cell concentration was 10 6 cells / mL.
  • the CD3 / CD28 positive cells were stimulated with soluble peptides and anti-CD28 immunobeads according to the procedure described below when the total number of cells reached 1 ⁇ 10 6 .
  • X-VIVO with 5% human AB serum and 10 ng / mL recombinant human IL-7 (Peprotech) added for the first week ( (Trademark) was cultured in 15 medium. On the 7th day and after, IL-7 was switched to 300 ng / mL recombinant human IL-15 (Peprotech), and the same results were obtained even when cultured for a minimum of 19 days.
  • the second centrifugation was performed under conditions of 500 ⁇ g and room temperature for 5 minutes. The supernatant was removed and the pellet was suspended in 30 mL of the diluent.
  • the third centrifugation was performed under conditions of 500 ⁇ g and room temperature for 5 minutes. The supernatant was removed, and the pellet was suspended in PBS supplemented with 2 mM EDTA and 0.1% human serum albumin so that the cell concentration was 1 ⁇ 10 7 cells / mL (hereinafter, “ Mononuclear cell suspension ").
  • Dynal (trademark) immunomagnetic beads CD14 (Life Technologies Japan, Inc.) was added to the mononuclear cell suspension by 25 ⁇ L per 10 8 mononuclear cells, and stirred at 4 ° C. for 30 minutes. After the reaction, CD14 positive monocytes were separated using a magnetic particle separator (DynaMag-15), and these monocytes were separated from 50 ng / mL GM-CSF, 50 ng / mL IL-4, and 5% human AB. Cultured in X-VIVO TM 15 medium supplemented with type serum. During the culture period of 6 days, no medium was exchanged. On the sixth day of culture, 50 ng / mL prostaglandin E2 and 10 ⁇ g / mL picibanil were added, followed by further culturing for one day to obtain mature dendritic cells.
  • HLA-A * 24: 02WT-1 (mu) CYTWNQMNL (HLA-A * 24 : 02 for donor) or HLA-a * 02: 01WT- 1 RMFPNAPYL ( for HLA-a * 02:01 donor) was added and stirred for 3 hours at 37 ° C, the peptide wherein the dendritic on the cell Of HLA class I molecules.
  • the mature dendritic cells and the CD8 positive cells were mixed in a 12-well plate at a ratio of 1: 5 to 1: 6.7, and further co-cultured for 12 days after the initial stimulation.
  • the anti-CD28 antibody used for induction is also biotinylated and immobilized on avidin-bound beads. Therefore, if the immobilized anti-CD28 antibody used for induction remains in the sample of flow cytometry analysis for detection of WT-1 peptide-specific CTL, PE-labeled HLA-A * 24: 02WT.
  • the tetramer of PE-labeled WT-1 peptide biotinylated on a part of the beads of -1 (mu) -tetramer is dropped and replaced with a biotinylated anti-CD28 antibody.
  • cells expressing CD28 also react upon detection of WT-1 peptide-specific CTL. Therefore, the possibility of such dropout / replacement was verified by the following experiment.
  • CD3 / CD28 positive cells were obtained from two HLA-A * 24 : 02 positive cord blood samples by the procedure described in section (4). The cells were cultured for 42 days in X-VIVO TM 15 supplemented with 1,500 IU / mL IL-2, 300 ng / mL IL-15, and 5% human AB serum. . Also, CD3 / CD28 positive cells were isolated from HLA-A * 0201 positive healthy volunteers according to the procedure described in section 7.3, and 300 IU / mL IL-2, 300 ng / mL IL-15, 5 Cultured in X-VIVO TM 15 supplemented with% human AB serum for 21 days.
  • Biotinylated anti-human CD28 mouse monoclonal antibody (clone CD28.2, BioLegend Japan Co., Ltd.) was added to the human umbilical cord blood or normal human peripheral blood-derived CD3 / CD28 positive cells at 20 ⁇ L per 10 6 cells, 0 ° C to Stir at 4 ° C for 30 minutes.
  • HLA-A * 24: 02WT- 1 (mu) CYTWNQMNL tetramer (for HLA-A * 24:02 donor) or, PE-labeled HLA-A * 02: 01WT- 1 RMFPNAPYL tetramer (HLA-A * 02:01 donor) was added and incubated at room temperature for 20 minutes to bind the tetramer on the T cell receptor of the cells.
  • 20 ⁇ L of APC-labeled anti-mouse IgG donkey monoclonal antibody (eBioscience), which is a secondary antibody for verifying that the anti-human CD28 mouse monoclonal antibody was bound to the cell surface, was added, and 0 ° C. to 4 ° C. For 20 minutes, and the binding of biotinylated CD28 antibody on the cells was verified by flow cytometry.
  • FIGS. 2A to 2H show the initial stimulation when the total number of cells reached 1 ⁇ 10 6 in any of the above three procedures, the second stimulation on the seventh day from the initial stimulation, and the two WT ⁇ Regarding cord blood-derived CD8-positive cells that have been induced to induce 1 peptide-specific CTL, HLA-A * 24: 02WT-1 (mu) ⁇ of the cells that passed the CD3 + gate on the 12th day after the initial stimulation It is a result figure of the two-dimensional flow cytometry analysis of the cell which recognizes a tetramer specifically (henceforth "tetramer positive cell").
  • FIGS. 2A to H the vertical axis represents the fluorescence intensity of the PE label, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity of the APC label.
  • the samples of FIGS. 2A and 2B are X-VIVO TM 15 medium supplemented with 5% human AB type serum and 300 ng / mL recombinant human IL-15 without any of the above three induction treatments.
  • the cord blood-derived CD8-positive cells cultured for the same number of days as in the experiments of FIGS. 2C and 2D with medium exchange alone.
  • FIGS. 1C and D show WT-1 peptide-specific CTL induction with soluble WT-1 peptide and anti-CD28 immunobeads at a stage where the total number of cells reached 1 ⁇ 10 6 , and 7 It is umbilical cord blood-derived CD8 positive cells cultured until the 12th day after the first stimulation after being performed twice with the second stimulation on the day.
  • FIGS. 1C and D show WT-1 peptide-specific CTL induction with soluble WT-1 peptide and anti-CD28 immunobeads at a stage where the total number of cells reached 1 ⁇ 10 6 , and 7 It is umbilical cord blood-derived CD8 positive cells cultured until the 12th day after the first stimulation after being performed twice with the second stimulation on the day.
  • FIGS. 1E and 2F show WT-1 peptide-specific CTL induction by WT-1 mutant peptide-added allogeneic peripheral blood-derived dendritic cells at the time when the total number of cells reached 1 ⁇ 10 6 , and after initial stimulation It is umbilical cord blood-derived CD8-positive cells cultured twice after the second stimulation on the seventh day and then until the 12th day after the first stimulation.
  • FIGS. 1-10 show WT-1 peptide-specific CTL induction by WT-1 mutant peptide-added allogeneic peripheral blood-derived dendritic cells at the time when the total number of cells reached 1 ⁇ 10 6 , and after initial stimulation It is umbilical cord blood-derived CD8-positive cells cultured twice after the second stimulation on the seventh day and then until the 12th day after the first stimulation.
  • 2G and H show initial stimulation at the stage when WT-1 peptide-specific CTL induction by WT-1 mutant peptide-added autologous cord blood monocyte-derived dendritic cells reaches a total cell number of 1 ⁇ 10 6 ,
  • the cord blood-derived CD8-positive cells cultured twice after the second stimulation on the seventh day after stimulation and then cultured until the 12th day after the first stimulation.
  • 2A, C, E and G result samples were stained by mixing FITC-labeled anti-CD3 antibody and APC-labeled anti-CD8 antibody.
  • soluble WT-1 peptides and anti-CD28 immunobead by WT-1 peptide-specific CTL induced from umbilical cord blood that has been subjected to CD3 / CD28 positive about 8 cells passing through the CD3 + gate of the cell.
  • WT-1-specific cytotoxic T cells react with lymphoma and other malignant cells that overexpress WT-1, but are not known to attack normal cells that express only a relatively small amount of WT-1. (Gao, L.
  • HLA-a * 24:02 allyl context in cancer antigen is a peptide HLA-a * 24: 02WT- 1 (mu) did not specifically recognize the CYTWNQMNL.
  • FIG. 1 shows that
  • HLA-A * Peptide HLA-A a cancer antigen, in the context of 24:02 allele * 24: 02WT-1 (mu) CYTWNQMNL was not specifically recognized.
  • FIG. 2A, C, E, and G the sample stained without mixing with PE-labeled HLA-A * 24: 02WT-1 (mu) -tetramer and mixed with only the APC-labeled anti-CD8 antibody.
  • the number of cells exhibiting fluorescence at the emission wavelength of PE was 0.1% or less.
  • the WT-1 peptide-specific CTL induction treatment with soluble WT-1 peptide and anti-CD28 immunobeads is as follows. Compared with the induction treatment using the other two types of dendritic cells, CTLs that recognize the WT-1 peptide were induced much more.
  • WT-1 peptide-specific CTL induction from umbilical cord blood (2) 1. Materials and Methods CD8 positive cells derived from umbilical cord blood (ID number: HCB00751, HLA-A locus compatible type: 24:02 and 33:03) different from Example 1 were subjected to the same three types of induction treatment as in Example 1. And subjected to flow cytometry analysis of tetramer positive cells.
  • FIG. 3 shows the initial stimulation when the total number of cells reached 1 ⁇ 10 6 with soluble WT-1 peptide and anti-CD28 immunobeads, the second stimulation on the seventh day from the initial stimulation, and the two WT- Results of two-dimensional flow cytometry analysis of tetramer positive cells out of cells that passed the CD3 + gate on the 12th day after initial stimulation for cord blood-derived CD8 positive cells subjected to the induction treatment of 1 peptide-specific CTL
  • FIG. The vertical axis of the results in FIG. 3 is the fluorescence intensity of the PE label, and the horizontal axis is the fluorescence intensity of the APC label.
  • FIG. 3 shows the initial stimulation at the stage where the total number of cells reached 1 ⁇ 10 6 by soluble WT-1 peptide and anti-CD28 immunobeads, and 7 days after the initial stimulation.
  • umbilical cord blood-derived CD3 / CD28 which was subjected to WT-1 peptide-specific CTL induction by soluble WT-1 peptide and anti-CD28 immunobeads also in cord blood-derived CD8 positive cells different from Example 1.
  • About 9.43% of the positive cells that passed the CD3 + gate were tetramer positive.
  • the same umbilical cord blood was subjected to WT-1 peptide-specific CTL induction by autologous umbilical cord blood-derived dendritic cells, and WT-1 peptide-specific CTL induction by allogeneic HLA-matched peripheral blood-derived dendritic cells.
  • X-VIVO TM 15 medium supplemented with 5% human type AB serum and 300 ng / mL IL-15, a complex of biotinylated CD28 antibody and beads, and cancer antigen WT-1 specific CD3 / CD28 thawed in a medium supplemented with the genetically mutated soluble peptide HLA-A * 24: 02WT-1 (mu) CYTWNQMNL or CMVpp65 specific peptide HLA-A * 24: 02CMVpp65 QYDPVAALF (SEQ ID NO: 5) Positive cells were cultured for 10 days.
  • the cells on day 10 is recovered in PBS, PE-labeled HLA-A * 24: 02WT- 1 (mu) CYTWNQMNL or tetramer, PE-labeled HLA-A * 24: 02CMVpp65 QYDPVAALF tetramer or not 106 cells per 20 ⁇ L added And after standing at room temperature for 20 minutes, FITC-labeled anti-human CD3 monoclonal mouse IgG2a antibody (clone HIT3a, BioLegend Japan) and APC-labeled anti-CD8 antibody (clone RPA-T8, BioLegend Japan) 20 ⁇ L each was added and stirred at 0 ° C. to 4 ° C. for 20 minutes before being subjected to flow cytometry analysis.
  • CD3 + gate Among the cells that passed through, CMVpp65 peptide tetramer positive cells were about 3.39% (not shown). In a sample in which cord blood-derived CD3 positive cells in a control experiment in which peptide-specific CTL induction was not performed were stained with a mixture of PE-labeled WT-1 peptide tetramer and PE-labeled CMVpp65 peptide tetramer, a CD3 + gate was used.
  • Cord blood-derived CD3 positive cells subjected to CMVpp65 peptide-specific CTL induction passed through CD3 + gate in samples stained with only APC-labeled anti-CD8 antibody without mixing PE-labeled CMVpp65 peptide tetramer Among the cells, 0.27% showed fluorescence at the fluorescence wavelength of PE (not shown).
  • Umbilical cord blood-derived CD3 positive cells in a control experiment in which peptide-specific CTL induction was not performed were mixed with only APC-labeled anti-CD8 antibody without mixing PE-labeled WT-1 peptide tetramer or PE-labeled CMVpp65 peptide tetramer. Of the cells that passed through the CD3 + gate, 0.14% of the cells showed fluorescence at the fluorescence wavelength of PE (not shown).
  • the amino acid sequence of a peptide presented as an antigen is determined according to the HLA compatible type of the patient, this treatment induces many cytotoxic T cells regardless of whether they are tumor antigens or viral antigens. It is possible to do.
  • the antigen can be easily changed even when tumor cells or viruses are mutated to cause an escape mutation that acquires vaccine resistance.
  • CTL induction was effective once, it can be expected that it can be performed with a simpler culture protocol than the conventional CTL induction method.
  • Example 1 WT-1 peptide-specific CTL induction from peripheral blood Materials and Methods
  • Peripheral blood was collected from the same healthy volunteer subjects as in Example 1 (7.1) (HLA-A locus adapted: HLA-A * 24:02 and 26:01). Blood was collected in the same procedure as in Example 1 (7.1), a mononuclear cell suspension was prepared in the same procedure as in Example 1 (7.2), and CD14 positive monocytes were removed from the mononuclear cell suspension. It was. CD8 positive cells were purified from the remaining CD14 negative fraction using a flow comp CD8 kit (Life Technologies Japan). Specifically, biotinylated anti-CD8 antibody and human peripheral blood mononuclear cell suspension CD14 negative fraction were reacted on ice (0 ° C.
  • the reaction was performed at (0 ° C. to 4 ° C.) for 15 minutes, and CD8 positive cells were separated using a magnetic particle separator (DynaMag-15). Thereafter, a release buffer was added at room temperature and incubated for 10 minutes to release the avidin-conjugated magnetic immunobeads from CD8 positive lymphocytes.
  • the recovered CD8-positive cells were cultured in X-VIVO TM 15 medium supplemented with 5% human AB type serum and 300 ng / mL IL-15 at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • First stimulation was performed in a medium supplemented with CD28 immunobeads, and the same stimulation was performed on the 7th day after the initial stimulation, and the culture was continued until the 11th day after the initial stimulation. Every 2-3 days, the cells were diluted with fresh medium supplemented with IL-15 to a cell concentration of 10 6 cells / mL. On the 11th day after the initial stimulation, the tetramer positive rate was analyzed by flow cytometry.
  • WT-1 peptide tetramer positive cells accounted for about 0.15% of the cells that passed the CD3 + gate on the 11th day of culture. (Not shown).
  • peripheral blood-derived CD8-positive cells were stimulated twice with the CMVpp65 soluble peptide and anti-CD28 immunobeads on the first day of culture and the seventh day, cells that passed the CD3 + gate on the first day of culture Of these, WT-1 peptide tetramer positive cells accounted for about 4.53% (not shown).
  • the fluorescence wavelength of PE among the cells that passed through the CD3 + gate The number of cells exhibiting fluorescence was 0.13% or less (not shown).
  • telomerase hTERT-derived peptide-specific CTL induction from umbilical cord blood Materials and Methods From different umbilical cord blood (ID number: HCB01100, HLA-A locus adapted type: 24:02 and 26:01) that were confirmed to be HLA-A * 24: 02 positive, Example 1 ( According to the procedure described in 3), CD14 negative CD4 negative CD3 / CD28 positive cells were separated using magnetic immunobeads. The cells were diluted to a concentration of 10 6 cells / mL and added at 37 ° C., 5 ° C. in X-VIVO TM 15 medium supplemented with 10 ng / mL IL-7 and 5% human type AB serum.
  • X-VIVO TM 15 medium supplemented with 300 ng / mL IL-15 and 5% human AB type serum from the 7th day after amplification for the first week after culturing at% CO 2 concentration.
  • the cells were diluted once every 2 to 3 days so that the optimal cell concentration was 10 6 cells / mL.
  • initial stimulation is performed with a medium supplemented with hTERT-derived soluble peptide HLA-A * 24: 02 VYGFVRACL (SEQ ID NO: 3) and CD28 immunobeads, and further 7 days after the initial stimulation After similar stimulation to the eyes, the cells were cultured until the 14th day after the initial stimulation.
  • the complex of biotinylated CD28 antibody and beads was added at a bead: cell ratio of 4: 1.
  • Cells were harvested with PBS on day 14 post-priming, PE-labeled HLA-A * 24 of 10 6 cells per 20 ⁇ L: 02hTERT VYGFVRACL tetramer is added, after being allowed to stand at room temperature for 20 minutes, FITC-labeled anti-human 20 ⁇ L each of CD3 monoclonal mouse IgG2a antibody (clone HIT3a, BioLegend Japan) and APC-labeled anti-CD8 antibody (clone RPA-T8, BioLegend Japan) were added and stirred at 0 ° C. to 4 ° C. for 20 minutes. And subjected to flow cytometry analysis.
  • FIGS. 4A to 4D are results of two-dimensional flow cytometry analysis using FITC-labeled anti-CD3 antibody, PE-labeled HLA-A * 24: 02hTERT VYGFVRACL tetramer, and APC-labeled human anti-CD8 antibody.
  • the vertical axis represents the fluorescence intensity of the PE label
  • the horizontal axis represents the fluorescence intensity of the APC label.
  • cord blood-derived CD8-positive cells that had been subjected to induction of hTERT-derived peptide-specific CTL in a medium supplemented with hTERT soluble peptide HLA-A * 24: 02VYGFVRRACL and CD28 immunobeads, CD3 on the 14th day after initial stimulation.
  • hTERT peptide tetramer positive cells were about 0.74% (FIG. 4C).
  • the cord blood-derived CD3 positive cells in the control experiment in which peptide-specific CTL induction was not performed of the cells that passed the CD3 + gate on the 11th day of the start of culture, hTERT peptide tetramer positive cells were about 0.06%.
  • FIG. 4B PE-labeled hTERT peptide-tetramer is not mixed with cord blood-derived CD8-positive cells that have been subjected to hTERT-derived peptide-specific CTL induction treatment in a medium supplemented with hTERT soluble peptide HLA-A * 24: 02VYGFVRRACL and CD28 immunobeads
  • HLA-A * 24: 02VYGFVRRACL 02VYGFVRRACL and CD28 immunobeads
  • 0.08 cells showed fluorescence at the emission wavelength of PE. % Or less (FIG. 4D).
  • the X-VIVO TM 15 medium supplemented with 300 ng / mL IL-15 and 5% human AB serum was amplified for the first week after culturing at the CO 2 concentration.
  • the cells were diluted once every 2-3 days so that the appropriate cell concentration was 10 6 cells / mL.
  • first stimulation is performed with a medium supplemented with survivin-2B-derived soluble peptide HLA-A * 24: 02 survivin-2B AYACNTSTL (SEQ ID NO: 4) and CD28 immunobeads, The same stimulation was performed on the 7th day after the initial stimulation, and then cultured until the 10th day after the initial stimulation.
  • a complex of biotinylated CD28 antibody and beads was added at a bead: cell ratio of 4: 1.
  • PE-labeled HLA-A * 24:02 survivin-2B AYACNTSTL tetramer 106 cells per 20 ⁇ L was added and allowed to stand at room temperature for 20 minutes, FITC 20 ⁇ L of labeled anti-human CD3 monoclonal mouse IgG2a antibody (clone HIT3a, BioLegend Japan) and APC-labeled anti-CD8 antibody (clone RPA-T8, BioLegend Japan) were added at 0 ° C to 4 ° C. Stirred for 20 minutes and subjected to flow cytometry analysis.
  • FIGS. 5A to 5D show that among the cells that stained with FITC-labeled anti-CD3 antibody, PE-labeled HLA-A * 24: 02 survivin-2B AYACNTSTL tetramer and APC-labeled anti-CD8 antibody, and passed through the CD3 + gate, PE and It is a result figure of the two-dimensional flow cytometry analysis by APC. 5A to 5D, the vertical axis represents the fluorescence intensity of the PE label, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity of the APC label.
  • HLA-A * 24 02 survivin-2B AYACNTSTL soluble peptide and anti-CD28 immunobeads were used for initial stimulation when the total number of cells reached 1 ⁇ 10 6 cells, and after the same stimulation on day 7 after the initial stimulation
  • the cord blood-derived CD8 positive cells cultured until the 10th day after the initial stimulation were stained with FITC-labeled anti-CD3 antibody, PE-labeled HLA-A * 24: 02hTERT-tetramer, and APC-labeled anti-CD8 antibody, and CD3 + Among the cells that passed through the gate, survivin-2B peptide tetramer positive cells were about 1.16% (FIG. 5C).
  • priming was performed in a medium supplemented with the following four peptides restricted to HLA-A * 24 : 02 and CD28 immunobeads.
  • the added peptides were (1) WT-1 specific mutant peptide CYTWNQMNL, (2) CMVpp65 peptide QYDPVAALF, (3) hTERT specific peptide VYGFVRACL, and (4) survivin-2B specific peptide AYACNTSTL. Met.
  • the same stimulation was performed on the 7th day after the initial stimulation, the cells were cultured until the 12th day after the initial stimulation.
  • a complex of biotinylated CD28 antibody and beads was added at a concentration of 4: 1 bead: cell ratio.
  • the cells were cultured and amplified for 12 days from the initial stimulation while being diluted once every 2 to 3 days so that the optimal cell concentration was 10 6 cells / mL.
  • the cells were collected in PBS and either PE-labeled HLA-A * 24: 02WT-1 (mu) -tetramer, PE-labeled HLA-A * 24: 02CMVpp65 tetramer, or PE-labeled HLA-A * 24: 02hTERT or tetramer, PE-labeled HLA-A * 24: 02survivin- 2B or tetramer, are added cells 10 per six 20 [mu] L, after being allowed to stand at room temperature for 20 minutes, FITC-labeled anti-human CD3 monoclonal mouse IgG2a antibody (clone HIT3a BioLegend Japan Co., Ltd.) and APC-labeled anti-CD8 antibody (clone RPA-T8, BioLegend Japan Co., Ltd.) were added in an amount of 20 ⁇ L each and stirred at 0 ° C. to 4 ° C. for 20 minutes for flow cytometry analysis. It was done.
  • FIGS. 6A to 6D show cells stained with FITC-labeled anti-CD3 antibody, PE-labeled HLA-A * 24: 02WT-1 (mu) -tetramer, and APC-labeled anti-CD8 antibody, and passed through the CD3 + gate. Among these, it is a result figure of the two-dimensional flow cytometry analysis by PE and APC. 6A to 6D, the vertical axis represents the fluorescence intensity of the PE label, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity of the APC label.
  • priming is performed with WT-1-specific mutant peptide CYTWNQMNL and anti-CD28 immunobeads, and the same stimulation is performed on the 7th day after the priming, Umbilical cord blood-derived CD8-positive cells cultured until the 12th day after the initial stimulation were stained with FITC-labeled anti-CD3 antibody-derived PE-labeled HLA-A * WT-1-tetramer and APC-labeled anti-CD8 antibody. . Of the cells that passed the CD3 + gate, WT-1 peptide-specific tetramer positive cells accounted for about 0.89% (FIG. 6A).
  • WT1 peptide-specific tetramer positive cells were about 0.58% (FIG. 6E).
  • the fluorescence at the emission wavelength of PE was 0.05% (FIG. 6F).
  • WT-1 peptide-specific CTL induction with soluble WT-1 peptide and anti-CD28 immunobeads is applicable not only to CD8 positive cells derived from cord blood but also to CD8 positive cells derived from peripheral blood at least. It has been shown. Similarly, it was shown that WT-1 peptide-specific CTL induction by soluble CMVpp65 peptide and anti-CD28 immunobeads can be applied not only to CD8-positive cells derived from cord blood but also to CD8-positive cells derived from at least peripheral blood.
  • this technique is not limited to WT-1 and CMVpp65, and it has been shown that this technique can be used for a wide variety of other cancer antigens such as hTERT and survivin-2B.
  • the composition for inducing cytotoxic T cells of the present invention using a soluble peptide and an immobilized anti-CD28 antibody in combination is applicable to any hematopoietic stem cell-derived CD8-positive cell.
  • composition for inducing cytotoxic T cells of the present invention can be used for in vivo hematopoietic stem cells other than peripheral blood, for example, CD8 positive cells derived from bone marrow, lymph node and other tissue-derived hematopoietic stem cells, embryonic stem cells, It can also be applied to CD8 positive cells derived from hematopoietic stem cells differentiated from adult stem cells and induced pluripotent stem (iPS) cells.
  • iPS induced pluripotent stem

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Abstract

　任意の抗原について、簡便に抗原特異的なＣＴＬ誘導を行うことができる新規技術を開発する。　本発明は、抗ＣＤ２８抗体と、該抗ＣＤ２８抗体が固相化された固体支持体と、ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドとを含む、細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物を提供する。本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物において、前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、患者のＨＬＡ適合型のＨＬＡ複合体によって抗原として提示され、前記細胞傷害性Ｔ細胞に認識される場合がある。本発明は腫瘍治療用医薬品組成物を提供する。本発明の腫瘍治療用医薬品組成物は、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物を含み、前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、腫瘍細胞の特異的抗原タンパク質のアミノ酸配列の一部を含み、前記細胞傷害性Ｔ細胞は前記腫瘍細胞を認識する。前記腫瘍細胞の特異的抗原タンパク質はＷＴ－１の場合がある。

Description

細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物
　本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物と、該細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物を曝露して得られる細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬品組成物と、該医薬品組成物の製造方法とに関する。
　生体内において、抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（以下、「ＣＴＬ」ともいう。）は、造血幹細胞由来のＣＤ８陽性細胞が樹状細胞との相互作用によって誘導される。前記相互作用には、抗原分子の断片と樹状細胞の表面のＨＬＡクラスＩ分子との複合体と、ＣＤ８陽性細胞の表面のＴＣＲ／ＣＤ３／ＣＤ８複合体との会合が関与する。そして、前記相互作用の結果、前記ＣＤ８陽性細胞は、前記ＨＬＡクラスＩ分子の適合型と一致するＨＬＡクラスＩ分子が前記抗原分子の断片と複合体を形成している細胞を特異的に認識して攻撃する細胞になる。前記相互作用は、他に、ＣＤ８陽性細胞の表面のＣＤ２８分子と、樹状細胞の表面のＣＤ８０／８６分子との会合によって促進される。
　ウイルス感染の場合には、ウイルス抗原を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞がウイルス感染細胞を攻撃する。腫瘍細胞の場合には、腫瘍特異的な抗原を認識する細胞傷害性Ｔ細胞が腫瘍細胞を攻撃する。そこで、腫瘍の免疫療法では、細胞傷害性Ｔ細胞を如何にして効率的に誘導するかが問題となる。
　サイトカインの研究の進歩によって、臍帯血、末梢血、骨髄等の造血幹細胞から細胞傷害性Ｔ細胞の前駆細胞であるＣＤ８陽性細胞を分化・増殖させる技術は比較的容易になった。しかし、樹状細胞を生体から大量に単離精製することは困難である。そこで、人工的に樹状細胞の機能を模倣する技術が開発されてきた。かかる人工抗原提示細胞の例には、線維芽細胞のような培養細胞に、ＨＬＡクラスＩ分子、抗原分子、ＣＤ８０／８６分子等の遺伝子をトランスフェクションさせて、樹状細胞の代行をさせる技術がある。また、ＭＨＣクラスＩ分子４量体と抗原ペプチドとの複合体（以下、「抗原テトラマー」という。）は、同一細胞表面の複数のＴ細胞レセプターと結合できるので、解離定数が高く、特定の抗原を認識するＴ細胞を検出する（非特許文献１）他、抗原特異的なＴ細胞活性化に用いられている（非特許文献２）。そして、フィコエリスリン（以下、「ＰＥ」という。）で標識された抗原テトラマーと、ＰＥで標識された抗ＣＤ２８抗体とが、ビオチン化された抗ＰＥ抗体とアビジンとを介して結合された蛍光標識常磁性ビーズ粒子は、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導できる（非特許文献３）。これは生物とはいえないが、人工抗原提示細胞の一種とされる。
　ビーズ、微粒子等の表面に、ＣＤ８陽性細胞で発現する分子に対する抗体を結合させて、樹状細胞の代わりにＣＤ８陽性細胞を刺激する技術もある。かかる固相化抗体による技術では、アゴニスト活性を有する抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を同一のビーズ粒子に結合させた、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズが知られている（特許文献１）。ＣＴＬを誘導する相互作用のうち、抗原分子の断片と樹状細胞の表面のＨＬＡクラスＩ分子との複合体と、ＣＤ８陽性細胞の表面のＴＣＲ／ＣＤ３／ＣＤ８複合体との会合については、抗原分子の断片と樹状細胞の表面のＨＬＡクラスＩ分子との複合体の代わりに、アゴニスト活性を有する抗ＣＤ３抗体を用いることによって、ＣＤ８陽性細胞を刺激することができる。また、ＣＤ８陽性細胞の表面のＣＤ２８分子と、樹状細胞の表面のＣＤ８０／８６分子との会合については、樹状細胞の表面のＣＤ８０／８６分子の代わりに、アゴニスト活性を有する抗ＣＤ２８抗体を用いることによって、ＣＤ８陽性細胞を刺激することができる。しかしながら、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズだけでは抗原特異的なＣＴＬ誘導はできず、抗原特異的なＣＴＬ誘導を行うためには、生体由来の抗原提示細胞か、人工抗原提示細胞かを併用する必要があった。
国際公開第ＷＯ２００４／１０４１８５号パンフレット
Ａｌｔｍａｎ、Ｊ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：９４（１９９６） Ｄａｎｉｅｌｓ、Ｍ．Ａ．及びＪａｍｅｓｏｎ、Ｓ．Ｃ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９１：３３５（２０００） Ｏｅｌｋｅ、Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、９：６１９（２００３）
　しかし、従来の抗原提示細胞又は人工抗原提示細胞を作成するのは、時間及び労力を要する。したがって、任意の抗原について、簡便に抗原特異的なＣＴＬ誘導を行うことができる新規技術を開発する必要がある。
　本発明は、抗ＣＤ２８抗体と、該抗ＣＤ２８抗体が固相化された固体支持体と、ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドとを含む、細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物を提供する。
　本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物は、抗ＣＤ２８抗体と、該抗ＣＤ２８抗体が固相化された固体支持体と、ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドとからなる場合がある。
　本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物において、前記固体支持体は、前記ＣＤ８陽性細胞を含む細胞培養に用いられる培養容器か、マイクロビーズかの場合がある。
　本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物において、前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、患者のＨＬＡ適合型のＨＬＡ複合体によって抗原として提示され、前記細胞傷害性Ｔ細胞に認識される場合がある。
　本発明は腫瘍治療用医薬品組成物を提供する。本発明の腫瘍治療用医薬品組成物は、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物を含み、前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、腫瘍細胞の特異的抗原タンパク質のアミノ酸配列の一部を含み、前記細胞傷害性Ｔ細胞は前記腫瘍細胞を認識する。
　本発明の腫瘍治療用医薬品組成物において、前記腫瘍細胞の特異的抗原タンパク質はＷＴ－１の場合がある。
　本発明はウイルス疾患治療用医薬品組成物を提供する。本発明のウイルス疾患治療用医薬品組成物は、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物を含み、前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、ウイルスの特異的抗原タンパク質のアミノ酸配列の一部を含み、前記細胞傷害性Ｔ細胞は前記腫瘍細胞を認識する。
　本発明のウイルス疾患治療用医薬品組成物において、前記ウイルスの特異的抗原タンパク質はサイトメガロウイルスのｐｐ６５タンパク質の場合がある。
　本発明は医薬品組成物を提供する。本発明の医薬品組成物は、造血幹細胞由来のＣＤ８陽性細胞に本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物を曝露して得られ、前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドを認識する細胞傷害性Ｔ細胞を含む。
　本発明の医薬品組成物において、前記造血幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞からなるグループから選択されるいずれかの幹細胞由来の造血幹細胞と、臍帯血由来の造血幹細胞と、末梢血由来の造血幹細胞と、骨髄血由来の造血幹細胞とからなるグループから選択される場合がある。
　本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬品組成物の製造方法を提供する。本発明の細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬品組成物の製造方法は、（１）胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞からなるグループから選択されるいずれかの幹細胞由来の造血幹細胞と、臍帯血由来の造血幹細胞と、末梢血由来の造血幹細胞と、骨髄血由来の造血幹細胞とからなるグループから選択される少なくとも１種類の造血幹細胞からＣＤ８陽性細胞を優占的に増殖させるステップと、（２）前記ＣＤ８陽性細胞に、請求項１に記載の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物を曝露させるステップと、（３）前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドを認識する細胞傷害性Ｔ細胞を培養するステップとを含む。
　本発明の細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬品組成物の製造方法において、前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、ヒトＷＴ－１タンパク質か、サイトメガロウイルスのｐｐ６５タンパク質かのアミノ酸配列を含む場合がある。
　本発明は、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬品組成物を移植するステップを含む、免疫療法を提供する。
　本発明の免疫療法は、患者の末梢血及び骨髄を含むが、これらに限定されない造血幹細胞を採取して得られるＣＤ８陽性細胞か、あるいは、得られた造血幹細胞から分化及び／又は増幅されるＣＤ８陽性細胞かを、試験管内で本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物に曝露するステップと、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞を患者に再移植するステップとを含む場合がある。
　本発明の免疫療法は、患者の体細胞由来の成体幹細胞か、患者の体細胞由来の人工多能性幹細胞かから分化されるＣＤ８陽性細胞を、試験管内で本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物に曝露するステップと、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞を患者に再移植するステップとを含む場合がある。
　本発明のＣＤ８陽性細胞の出所は、末梢血と骨髄とリンパ節と臍帯血とを含むが、これらに限定されない組織の場合がある。本発明の樹状細胞又はその前駆細胞は末梢血から調製されることが好ましい。しかし、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から生成される造血幹細胞から調製されてもかまわない。
　ＣＤ８陽性細胞が細胞傷害性Ｔ細胞に誘導されるためには、ＣＤ８陽性細胞上のＣＤ２８を刺激するのと同時に、ＭＨＣクラスＩ分子及び抗原エピトープ分子との複合体と、Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３／ＣＤ８複合体との会合による抗原提示が起こる必要がある。本発明によると、固相化された抗ＣＤ２８抗体と、可溶性抗原ペプチドとだけを用いて、樹状細胞を用いないで、ＣＤ８陽性細胞が細胞傷害性Ｔ細胞に誘導される。その作用機序について理論的に拘泥するわけではないが、ＣＤ８陽性細胞の培養に含まれるＨＬＡクラスＩ分子を発現する細胞の関与を想定することによって本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物の作用機序は合理的に説明することができる。図１は本発明の作用機序を説明するための模式図である。図１を参照して、ＣＤ８陽性細胞１は、可溶性ペプチド２と、磁気ビーズのような固体支持体３に固定化された抗ＣＤ２８抗体４とによるＣＴＬ誘導に供される。ここで固体支持体３に固定化された抗ＣＤ２８抗体４は、ＣＤ８陽性細胞１上のＣＤ２８分子５と反応して、ＣＤ２８分子５が樹状細胞上のＣＤ８０／８６と相互作用したのと同じ刺激をＣＤ８陽性細胞１に与える。一方、可溶性ペプチド２だけでは、ＣＤ８陽性細胞１上のＴ細胞レセプター／ＣＤ３／ＣＤ８複合体６に認識されない。しかし可溶性ペプチド２は、前記ＣＤ８陽性細胞１の培養中のＨＬＡクラスＩ分子を発現する細胞８上のＨＬＡクラスＩ分子７と結合すると、ＣＤ８陽性細胞１上のＴ細胞レセプター／ＣＤ３／ＣＤ８複合体６に抗原として提示される。こうして、可溶性ペプチド２と、固体支持体３に固定化された抗ＣＤ２８抗体とをＣＤ８陽性細胞１に添加するだけで、ＨＬＡクラスＩ分子７で制限された可溶性ペプチド２を認識する細胞傷害性Ｔ細胞９がＣＤ８陽性細胞１から誘導される。本発明の方法によると、可溶性ペプチドを取り替えるだけで、異なる種類の抗原に対するＣＴＬ誘導を行うことができる。また、同時に２種類又は３種類以上の抗原に対するＣＴＬ誘導を行うこともできる。
　本発明のＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、本明細書に添付される配列表の配列番号１ないし５に列挙されるアミノ酸配列からなる場合がある。本発明のＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、ＨＬＡ－Ａ拘束性エピトープに限定されない。試験管内でその他の抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を増幅できること、及び、かかる細胞傷害性Ｔ細胞を患者に移植すると臨床効果が得られることは従来から知られている。例えば、Ｇｏｄｅｔ、Ｙ．ら、（Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５８：　２７１－２８０（２００９））は、メラノーマに特異的な癌抗原チロシナーゼ由来のＨＬＡ－Ｂ拘束性ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を得た。Ｓｔｒａａｔｈｏｆ、Ｋ．　Ｃ．　Ｍ．ら、（Ｂｌｏｏｄ、１０５：　１８９８－１９０４（２００５））は、ＥＢウイルス関連抗原ＬＭＰ２のＨＬＡ－Ｂ拘束性エピトープ、ＥＢウイルス関連抗原ＥＢＮＡ１のＨＬＡ－Ｂ拘束性エピトープ、ＥＢウイルス関連抗原ＥＢＮＡ３のＨＬＡ－Ｂ拘束性エピトープ、ＥＢウイルス関連抗原ＢＺＬＦ１のＨＬＡ－Ｂ拘束性エピトープ等に特異的なＣＴＬを、ＥＢウイルス関連鼻咽頭癌患者に移植して臨床効果を得た。Ｗａｌｔｅｒ、Ｅ．　Ａ．　ら、（Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．、３３３：　１０３８－４４（１９９５））はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的ＣＴＬを、白血病治療のためにＣＭＶ陽性血縁者から骨髄移植を受けた後、免疫抑制剤を投与されている間にＣＭＶが再活性化した患者に移植して臨床効果を得た。なお、Ｂｉｏｌｅｙ　Ｇ．ら（Ｃｌｉｎ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　１５：　２９９－３０６（２００９））によると、癌抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１をワクチン接種した患者から当該抗原由来のＨＬＡ－Ｂ又はＨＬＡ－Ｃ拘束性ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が得られた。そこで、本発明のＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、ＷＴ－１タンパク質由来のペプチドのようなＨＬＡ－Ａ拘束性エピトープだけでなく、ＨＬＡ－Ｂ又はＨＬＡ－Ｃ拘束性エピトープであってもよい。
　患者の細胞が発現する疾患関連抗原は、ＷＴ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、サバイビン、チロシナーゼ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＰＳＡ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１及びＭＡＧＥ－３を含むが、これらに限られない腫瘍関連抗原と、ＥＢＥＲ、ＬＭＰ－１等のＥＢウイルス関連抗原のように癌細胞で（過剰に）発現する抗原の場合と、サイトメガロウイルスｐｐ６５（ＣＭＶｐｐ６５）タンパク質等のサイトメガロウイルス特異抗原、ＨＩＶｇｐ１６０等のエイズウイルス特異抗原を含むが、これらに限られないウイルス特異抗原のように感染細胞で発現する抗原の場合とがある。したがって本発明の医薬品組成物は、癌治療に用いられる場合と、感染症治療に用いられる場合とがある。本発明のＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドはこれらの抗原のエピトープであってもよい。
　本発明のＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、天然のタンパク質と同一のアミノ酸配列か、天然のタンパク質のアミノ酸とは一部異なるアミノ酸配列かからなる場合がある。あるいは、天然のタンパク質と同一のアミノ酸配列か、天然のタンパク質のアミノ酸とは一部異なるアミノ酸配列かを含むペプチドの場合がある。例えば、前記可溶性ペプチドは、ＷＴ－１タンパク質の第１２６番目から第１３４番目までのアミノ酸配列（配列番号１）と、ＷＴ－１タンパク質の第２３５番目から第２４３番目までのアミノ酸配列のうち、第２３６番目のメチオニン残基がチロシン残基に置換された突然変異体型アミノ酸配列（配列番号２）と、ｈＴＥＲＴの第４６１番目から第４６９番目までのアミノ酸配列（配列番号３）と、サバイビンのスプライシングバリアント２Ｂの第８０番目から第８８番目までのアミノ酸配列（配列番号４）と、ＣＭＶｐｐ６５の第３４１番目から第３４９番目までのアミノ酸配列（配列番号５）とからなるグループから選択されるアミノ酸配列からなるか、あるいは、該グループから選択されるアミノ酸配列を含む場合がある。
　本発明の固相化された抗ＣＤ２８抗体は、ＣＤ２８に対してアゴニスト活性を有するいずれかの抗体であればよい。固相化には、培養ＣＤ８陽性細胞の表面にアクセスして、有効なＣＴＬ誘導を行うことができるいずれかの固体支持体が用いられる。本発明において好ましい固体支持体は、ラテックスその他の商業的に入手可能な微粒子及び培養容器を含むが、これらに限定されない。前記培養容器は、ディッシュ、フラスコ、プレート、マルチウェルプレートを含むが、これらに限定されない。本発明の抗ＣＤ２８抗体は、本発明の固体支持体に直接的に結合されてもよいが、アビジン－ビオチンのような特異的相互作用を行う特異的結合パートナーを介して結合されてもよい。ストレプトアビジンが固定化されたマイクロビーズと、ビオチン化された抗ＣＤ２８抗体とが用いられる場合がある。前記マイクロビーズは、磁性を有する場合がある。以下では、ビオチンとストレプトアビジンとの特異的相互作用によりマイクロビーズに固定化された抗ＣＤ２８抗体を抗ＣＤ２８免疫ビーズという場合がある。
　本発明の医薬品組成物は、医薬品として許容される担体を含む場合がある。生細胞を懸濁することができるいずれかの溶液、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地、血清等が代表例である。
本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物の作用機序に関する仮説を示す模式図。 ＣＴＬ誘導処理を施さないで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ＣＤ３抗体及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識抗ＣＤ８抗体で染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 ＣＴＬ誘導処理を施さないで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）－テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 可溶性ＷＴ－１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を行った後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 可溶性ＷＴ－１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を行った後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）－テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 ＷＴ－１変異ペプチド添加同種末梢血由来樹状細胞によるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を行った後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 ＷＴ－１変異ペプチド添加同種末梢血由来樹状細胞によるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を行った後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）－テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 ＷＴ－１変異ペプチド添加自家臍帯血単球由来樹状細胞によるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を行った後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 ＷＴ－１変異ペプチド添加自家臍帯血単球由来樹状細胞によるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を行った後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）－テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 可溶性ＷＴ－１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによってＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬの誘導処理が施された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）－テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 ＣＴＬ誘導処理を施さないで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 ＣＴＬ誘導処理を施さないで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）－テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 ｈＴＥＲＴ可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって刺激された後、培養された末梢血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ｈＴＥＲＴ－テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 ＰＥ標識ｈＴＥＲＴペプチド－テトラマーを混合しないで、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とを混合して染色されたサンプルで、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 ＣＴＬ誘導処理を施さないで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 ＣＴＬ誘導処理を施さないで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）－２Ｂ－テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２　ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ　ＡＹＡＣＮＴＳＴＬ可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって刺激された後、培養された末梢血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ｈＴＥＲＴ－テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 ＰＥ標識ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド－テトラマーを混合しないで、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とを混合して染色されたサンプルで、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 ＷＴ－１変異ペプチド、ＣＭＶｐｐ６５ペプチド、ｈＴＥＲＴ可溶性ペプチド、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって刺激された後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）－テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 ＷＴ－１変異ペプチド、ＣＭＶｐｐ６５ペプチド、ｈＴＥＲＴ可溶性ペプチド、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって刺激された後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＣＭＶｐｐ６５－テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 ＷＴ－１変異ペプチド、ＣＭＶｐｐ６５ペプチド、ｈＴＥＲＴ可溶性ペプチド、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって刺激された後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ｈＴＥＲＴ－テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 ＷＴ－１変異ペプチド、ＣＭＶｐｐ６５ペプチド、ｈＴＥＲＴ可溶性ペプチド、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって刺激された後、培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ－テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 ＣＴＬ誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞についてＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）－テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色され、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。 ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とを混合して染色されたサンプルで、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のＰＥ及びＡＰＣの蛍光波長での強度が測定された２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図。
　１　　ＣＤ８陽性細胞
　２　　可溶性ペプチド
　３　　固体支持体
　４　　抗ＣＤ２８抗体
　５　　ＣＤ２８分子
　６　　Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３／ＣＤ８複合体
　７　　ＨＬＡクラスＩ分子
　８　　ＨＬＡクラスＩ分子を発現する細胞
　９　　ＨＬＡクラスＩ分子７で制限された可溶性ペプチド２を認識する細胞傷害性Ｔ細胞
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
　臍帯血からのＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導（１）
　１．材料及び方法
　（１）ヒト臍帯血
　ヒト臍帯血試料は、母親のインフォームド・コンセント署名を得た後に採血され、理化学研究所バイオリソースセンター内の液体窒素システムで凍結保存された。採血方法はＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｐ．ら（Ｂｌｏｏｄ，８１：１６７９－１６９０（１９９３））に説明され、凍結保存方法はＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｐ．ら（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９２：１０１１９－１０１２２（１９９５））に説明される。
　（２）培地及び試薬
　培地としてＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５（タカラバイオ株式会社、滋賀）が使用された。一部の実験では最終濃度０ないし５％のヒトＡＢ型血清（Ｌｏｎｚａ、ロンザジャパン株式会社）が添加された。組換えヒトＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、東洋紡績株式会社）と、ＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、東洋紡績株式会社）とが、それぞれ、０ないし１０ｎｇ／ｍＬと、０ないし３００ｎｇ／ｍＬとの最終濃度で添加された。可溶性ペプチドとしては、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬが用いられた。当該ペプチドのアミノ酸配列（ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ）は、添付される配列表に配列番号２として列挙される。固相化された抗ＣＤ２８抗体としては、ビオチン化抗ヒトＣＤ２８マウスモノクローナル抗体（クローンＣＤ２８．２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　Ｊａｐａｎ株式会社）が磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）　Ｍ－２８０　ストレプトアビジン、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）と室温で３０分間インキュベーションされ、ビオチン・アビジン反応により結合されてから用いられた。前記磁気ビーズに結合された抗ＣＤ２８抗体は、以下、ビオチン化ＣＤ２８抗体とビーズとの複合体、又は、固相化抗ＣＤ２８抗体という。
　（３）自家臍帯血由来樹状細胞の精製及び増幅
　理化学研究所から入手した臍帯血（ＩＤ番号：ＨＣＢ００７４７、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の適合型：２４：０２及び０２：０６）２５ｍＬは３７°Ｃの温水浴で解凍され、終濃度５％デキストセラン４０（テルモ・ジャパン社）と終濃度２．５％ヒト血清アルブミン（日本赤十字社）が添加されたＰＢＳ中に浮遊された。得られた白血球は、５ｍＭ　ＥＤＴＡ及び２％ヒト血清アルブミンが添加されたＰＢＳでさらに３回洗浄された。その後、前記白血球懸濁液に細胞１０８個あたり２５μＬのＤｙｎａｌ（商標）免疫磁気ビーズＣＤ１４（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が添加され、室温２０°Ｃで１０分間以上攪拌された。ＣＤ１４陽性細胞と、ビーズを貪食した単球マクロファージとが磁気粒子分離器（ＤｙｎａＭａｇ－１５、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて分離された。ＣＤ１４陰性細胞の分画は以下の（４）節のとおり、ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞の精製及び増幅に用いられた。分離されたＣＤ１４陽性単球は、５％ヒトＡＢ型血清が添加されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地に１０６個／ｍＬの濃度で浮遊され、３５ｍｍシャーレ（ＥＺ－ＢｉｎｄＳｈｕｔ（商標）、旭硝子株式会社）に移された後に、５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）と、５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－４（ＩＬ－４、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とが添加され、培養された。培養６日目に、５０ｎｇ／ｍＬのプロスタグランジンＥ２（第一ファインケミカル株式会社）と、終濃度１０μｇ／ｍＬのピシバニル（ＯＫ４３２、ロシュ中外製薬）とが添加された。さらに１日間培養され、成熟樹状細胞が得られた。
　（４）臍帯血由来ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞の精製及び増幅
　（３）節で分離されたＣＤ１４陰性細胞分画からさらにＣＤ４陽性細胞を除去するため、細胞２×１０７個あたり２５μＬのＤｙｎａｌ（商標）免疫磁気ビーズＣＤ４（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が添加され、室温２０°Ｃで１０分間以上攪拌された。ＣＤ４陽性細胞が磁気粒子分離器（ＤｙｎａＭａｇ－１５）を用いて除去された後、新たにＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）、Ｔｃｅｌｌ　Ｅｘｐａｎｄｅｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８（商標、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が単核球１０７個あたり２５μＬ添加され、氷上又は４°Ｃで３０分間攪拌された後、ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞が磁気粒子分離器（ＤｙｎａＭａｇ－１５）を用いて濃縮された。前記ＣＤ８陽性細胞は、５％ヒトＡＢ型血清と、３００ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とが添加されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地に１０６個／ｍＬの濃度で浮遊培養された。培養開始後２ないし３日毎にサイトカインが添加された培地の交換が行われた。その際には、トリパンブルー染色を用いて生細胞数が測定され、１０６個／ｍＬの細胞濃度になるように、ＩＬ－１５が３００ｎｇ／ｍＬ添加された新鮮な培地が添加された。前記ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞は、総細胞数が１×１０６個に達した段階で以下に説明する手順で可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズにより刺激された。
　なお、ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞の増殖が速い場合には、最初の１週間は、５％ヒトＡＢ型血清と、１０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とが添加されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地で培養された。７日目以降は、ＩＬ－７を３００ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）に切り替えて、最短１９日間の培養でも同様の結果が得られた。
　（５）可溶性ＷＴ－１ペプチド及び固相化抗ＣＤ２８抗体によるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導
　ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞が総細胞数１×１０６個に達した段階で、初回刺激が固相化抗ＣＤ２８抗体及び可溶性ペプチドにより実施され、２回目の刺激は初回刺激から７日目に実施された。５％ヒトＡＢ型血清と３００ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－１５とが添加されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地に、最終濃度１０μｇ／ｍＬの可溶性ペプチドＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬと、固相化抗ＣＤ２８抗体とが添加された培地がＣＴＬ誘導のために用いられた。この際、磁気免疫ビーズ数とＴ細胞との比が４：１になるようビーズ濃度が調整され、その後の培地交換の際にビーズは細胞とともに希釈された。
　（６）ＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導後の増幅
　前記ＣＴＬ誘導以後の培地交換には、終濃度１０μｇ／ｍＬとなるよう可溶性ペプチドと、５％ヒトＡＢ型血清と、３００ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－１５とが添加されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地が用いられた。ＣＴＬの増幅のためには、最短で１９日間、長い場合４０日間を要した。
　（７）同種ＨＬＡ一致末梢血由来樹状細胞によるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導
　（7.1）末梢血の採血
　健康なボランティア被検者２名（ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の適合型：ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２及び０２：０７、ＨＬＡ-Ａ＊２４：０２及び２６：０１）から末梢血が採取された。本実験は、東京大学医科学研究所倫理審査委員会の承認（承認番号２０－５６－０２１０、初回承認日：平成２１年２月１０日、変更承認日：平成２２年１１月１９日）を得て実施され、前記ボランティア被検者からは書面による同意が得られている。採血には、２１～２２Ｇ針を取り付けた真空採血管（ＴＥＲＵＭＯ　ベノジェクトＩＩ　ＥＤＴＡ－２Ｎａ）が用いられた。
　（7.2）末梢血からの樹状細胞の調製
　得られた血液は、常温に保たれた希釈液（ＰＢＳ）で２倍希釈され、各遠心管に、希釈血２０ないし３５ｍＬが、１０ないし１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ　Ｐａｑｕｅ（比重１．０７７、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）に重層された。遠心は、５００×ｇ、室温で３０分間行われ、ブレーキをかけずに停止された。遠心上清（血漿部分）は数ｍＬを残して除去され、中間層が回収された。遠心管１ないし２本から回収された前記中間層が１本の新たな遠心管に集められ、前記希釈液により体積が５０ｍＬに調製された。２回目の遠心は、５００×ｇ、室温、５分間の条件で行われた。上清は除去され、ペレットが、前記希釈液３０ｍＬに懸濁された。３回目の遠心は、５００×ｇ、室温、５分間の条件で行われた。上清は除去され、ペレットは、細胞濃度が１×１０７個／ｍＬになるように、２ｍＭ　ＥＤＴＡと、０．１％ヒト血清アルブミンとが添加されたＰＢＳに懸濁された（以下、「単核球懸濁液」という。）。前記単核球懸濁液にＤｙｎａｌ（商標）免疫磁気ビーズＣＤ１４（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を単核球１０８個あたり２５μＬずつ添加し、４°Ｃにて３０分間撹拌した。反応後、磁気粒子分離器（ＤｙｎａＭａｇ－１５）を用いてＣＤ１４陽性単球が分離され、この単球は、５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦと、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４と、５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地にて培養された。６日間の培養期間中、培地交換は行われなかった。培養６日目に５０ｎｇ／ｍＬのプロスタグランジンＥ２と、１０μｇ／ｍＬのピシバニルとが添加された後さらに１日間培養され、成熟樹状細胞が得られた。
　（7.3）ヒト末梢血由来樹状細胞によるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬの誘導
　（４）節で説明された手順で精製及び増幅された臍帯血由来ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞は、５％ヒトＡＢ型血清と、３００ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－１５とが添加されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地中で、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件下培養された。ＣＴＬ誘導は、総細胞数１×１０６個に達した段階での初回刺激と、初回刺激から７日目の第２回刺激との２回行われた。（7.2）節に記載の手順で調製された末梢血由来の成熟樹状細胞の培養液に、１０μｇ／ｍＬの可溶性ペプチドＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ（ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ドナーの場合）又はＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ＷＴ－１　ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ドナーの場合）が添加され、３７°Ｃで３時間撹拌され、前記ペプチドが前記樹状細胞上のＨＬＡクラスＩ分子上に結合された。その後、前記成熟樹状細胞と前記ＣＤ８陽性細胞とが、１：５ないし１：６．７の比で１２穴プレートに混合されて、さらに初回刺激後１２日間共培養された。
　（８）蛍光標識テトラマー試薬の信頼性の検証
　誘導された細胞傷害性Ｔ細胞のうちＷＴ－１ペプチド抗原を認識する細胞の割合を測定するために、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２分子上に突然変異型アミノ酸配列からなるＷＴ－１ペプチド分子４個が固相化され、ＰＥで蛍光標識されたビーズ（以下、「ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）－テトラマー」という。）が用いられた。しかし、このビーズはアビジンが共有結合により結合されており、ビオチン化されたＰＥ標識ＷＴ－１ペプチドのテトラマーとは、アビジン－ビオチンの特異的相互作用によって結合されている。一方、誘導に用いた抗ＣＤ２８抗体もビオチン化され、アビジン結合ビーズに固相化されている。そこで、誘導に用いられた固相化抗ＣＤ２８抗体が、ＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬの検出のためのフロー・サイトメトリー解析のサンプルに残存していると、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）－テトラマーのビーズの一部でビオチン化されたＰＥ標識ＷＴ－１ペプチドのテトラマーが脱落して、ビオチン化された抗ＣＤ２８抗体に置換される可能性がある。かかる脱落・置換が起こると、ＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬの検出の際に、ＣＤ２８を発現する細胞も反応してしまう。そこで、以下の実験によって、かかる脱落・置換の可能性を検証した。
　ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２陽性の臍帯血２検体から、（４）節で説明された手順でＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞が得られた。前記細胞が、１，５００　ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と、３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５と、５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５にて４２日間培養された。またＨＬＡ－Ａ＊０２０１陽性健常人ボランティアから（7.3）節で説明された手順に従ってＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞が分離され、３００　ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と、３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５と、５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５で２１日間培養された。前記ヒト臍帯血又は健常人末梢血由来ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞にビオチン化抗ヒトＣＤ２８マウスモノクローナル抗体（クローンＣＤ２８．２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　Ｊａｐａｎ株式会社）が細胞１０６個あたり２０μＬずつ添加され、０°Ｃないし４°Ｃにて３０分間撹拌された。その後、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬテトラマー（ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ドナーの場合）か、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ＷＴ－１　ＲＭＦＰＮＡＰＹＬテトラマー（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ドナーの場合）かが添加され、室温で２０分間インキュベーションされ、テトラマーが前記細胞のＴ細胞受容体上に結合された。その後、抗ヒトＣＤ２８マウスモノクローナル抗体が細胞表面に結合したことを検証するための２次抗体である、ＡＰＣ標識抗マウスＩｇＧロバモノクローナル抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）が２０μＬ添加され、０°Ｃないし４°Ｃで２０分間撹拌され、フロー・サイトメトリー法で細胞上のビオチン化ＣＤ２８抗体の結合が検証された。
　（９）ＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬの検出
　前記３種類の手順のいずれかでＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬの誘導処理が総細胞数１×１０６個に達した段階での初回刺激と、初回刺激から７日目の第２回刺激と２回施された臍帯血由来ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞は、初回刺激後１２日目に回収され、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナルマウスIｇＧ２ａ抗体（クローンＨＩＴ３ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　Ｊａｐａｎ株式会社）と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）－テトラマーとで三重染色され、フロー・サイトメトリー解析が行われた。
　２．結果
　図２ＡないしＨは、前記３種類の手順のいずれかで総細胞数１×１０６個に達した段階での初回刺激と、初回刺激から７日目の第２回刺激と２回ＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬの誘導処理が施された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、初回刺激後１２日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）－テトラマーを特異的に認識する細胞（以下、「テトラマー陽性細胞」という。）の２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図である。図２ＡないしＨの結果図の縦軸はＰＥ標識の蛍光強度で、横軸はＡＰＣ標識の蛍光強度である。図２Ａ及びＢのサンプルは、前記３種類のいずれの誘導処理も行わずに、５％ヒトＡＢ型血清と、３００ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－１５とを添加したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地だけで培地交換して図２Ｃおよび図２Ｄの実験と同じ日数培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞である。図２Ｃ及びＤのサンプルは、可溶性ＷＴ－１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を総細胞数１×１０６個に達した段階での初回刺激と、初回刺激後７日目の第２回刺激との２回行った後、初回刺激後１２日目まで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞である。図２Ｅ及びＦは、ＷＴ－１変異ペプチド添加同種末梢血由来樹状細胞によるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を総細胞数１×１０６個に達した段階での初回刺激と、初回刺激後７日目の第２回刺激との２回行った後、初回刺激後１２日目まで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞である。図２Ｇ及びＨは、ＷＴ－１変異ペプチド添加自家臍帯血単球由来樹状細胞によるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を総細胞数１×１０６個に達した段階での初回刺激と、初回刺激後７日目の第２回刺激との２回行った後、初回刺激後１２日目まで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞である。図２Ａ、Ｃ、Ｅ及びＧの結果図のサンプルは、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とを混合して染色された。図２Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＨの結果図のサンプルは、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）－テトラマーとを混合して染色された。
　図２Ｄに示すとおり、可溶性ＷＴ－１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施された臍帯血由来ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞のうちＣＤ３＋ゲートを通過した細胞の約８．２１％は、テトラマー陽性、すなわち、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２アリルのコンテキストで癌抗原であるＷＴ－１由来ペプチドを特異的に認識した。ＷＴ－１特異的な細胞傷害性Ｔ細胞は、リンパ腫その他のＷＴ－１を過剰発現する悪性細胞とは反応するが、ＷＴ－１を比較的少量しか発現しない正常細胞を攻撃しないことが知られている（Ｇａｏ，Ｌ．ら、Ｂｌｏｏｄ、９５：２１９８－２２０３（２０００）、Ｏｋａ、Ｙ．ら、Ｃｕｒｒ．　Ｏｐ．　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０：２１１－２２０（２００８））。これに対し、図２Ｆに示すとおり、ＷＴ－１変異ペプチド添加同種末梢血由来樹状細胞によるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞のうちＣＤ３＋ゲートを通過した細胞の約０．２２％しか、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２アリルのコンテキストで癌抗原であるペプチドＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬを特異的に認識しなかった。また、図２Ｈに示すとおり、ＷＴ－１変異ペプチド添加自家臍帯血単球由来樹状細胞によるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施された臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞のうちＣＤ３＋ゲートを通過した細胞の約０．５５％しか、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２アリルのコンテキストで癌抗原であるペプチドＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬを特異的に認識しなかった。なお、図２Ｂに示すとおり、ＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞では、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞の約１．２８％しか、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２アリルのコンテキストで癌抗原であるペプチドＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬを特異的に認識しなかった。図２Ａ、Ｃ、Ｅ及びＧの結果図に示すとおり、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）－テトラマーを混合しないで、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体のみと混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの発光波長での蛍光を示す細胞は０．１％以下であった。以上のとおり、図２ＡないしＨの結果から、前記３種類のＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬの誘導処理のうち、可溶性ＷＴ－１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導処理は、他の２種類の樹状細胞を用いた誘導処理に比べて、ＷＴ－１ペプチドを認識するＣＴＬをはるかに多く誘導した。なお、（８）の実験の結果、ビオチン化ＣＤ２８抗体を添加しても添加しなくてもテトラマー陽性細胞は出現せず、テトラマーが脱ビオチン・アビジン結合により偽陽性となる可能性は極めて低いことが確認された。
　臍帯血からのＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導（２）
　１．材料及び方法
　実施例１と異なる臍帯血（ＩＤ番号：ＨＣＢ００７５１、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の適合型：２４：０２及び３３：０３）由来ＣＤ８陽性細胞が、実施例１と同じ３種類の誘導処理を施され、テトラマー陽性細胞のフロー・サイトメトリー解析に供された。
　２．結果
　図３は、可溶性ＷＴ－１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって総細胞数１×１０６個に達した段階での初回刺激と、初回刺激から７日目の第２回刺激と２回ＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬの誘導処理が施された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、初回刺激後１２日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、テトラマー陽性細胞の２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図である。図３の結果図の縦軸はＰＥ標識の蛍光強度で、横軸はＡＰＣ標識の蛍光強度である。図３のサンプルは、可溶性ＷＴ－１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導を総細胞数１×１０６個に達した段階での初回刺激と、初回刺激から７日目の第２回刺激との２回行った後、初回刺激後１２日目まで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞であり、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）－テトラマーとを混合して染色された。
　図３に示すとおり、実施例１と異なる臍帯血由来のＣＤ８陽性細胞においても、可溶性ＷＴ－１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施された臍帯血由来ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞のうちＣＤ３＋ゲートを通過した細胞の約９．４３％は、テトラマー陽性であった。これに対し、同じ臍帯血について、自家臍帯血由来樹状細胞によるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施された場合と、同種ＨＬＡ一致末梢血由来樹状細胞によるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施された場合とでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうちテトラマー陽性細胞は、それぞれ、０．３６％と、０．３３％とであった（図示されない）。ＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞では、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞の約０．５２％しか、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２アリルのコンテキストで癌抗原であるＷＴ－１由来ペプチドを特異的に認識しなかった。ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）－テトラマーを混合しないで、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とを混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの蛍光波長での蛍光を示す細胞は０．０５％以下であった。
　以上の結果から、複数の臍帯血を使った実験で、可溶性ＷＴ－１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導処理は、他の２種類の誘導処理に比べて、ＷＴ－１ペプチドを認識するＣＴＬをはるかに多く誘導することが示された。ペプチドワクチンによる癌治療法の臨床試験では、患者体内でワクチン感作を行った場合のテトラマー陽性細胞の比率が報告されている。例えば、Ｏｋａ　Ｙら（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、１０１：１３８８５（２００４））の報告によると、乳癌２名、肺癌１０名、白血病等１４名に対して、野生型又は突然変異型のＨＬＡ－Ａ＊２４：０２制限ＷＴ－１ペプチド（０．３ｍｇ－３０ｍｇ）がフロイント不完全アジュバントとともに２週間間隔で３回感作されたとき、感作前のＷＴ－１テトラマー陽性ＣＤ８陽性細胞の比率が中央値０．２４５％（範囲：０．０８－１．２１％）で、感作後のＷＴ－１テトラマー陽性ＣＤ８陽性細胞の比率は中央値０．３４％（範囲０．１１－６．６１％）であった。また、Ｖａｎ　Ｔｅｎｄｅｌｏｏ　ＶＦら（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、１０７：１３８２４（２０１０））の報告によると、寛解期急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者にＷＴ－１タンパク質のｍＲＮＡが遺伝子導入された自家樹状細胞を皮下接種する臨床試験において、末梢血で検出されたテトラマー陽性細胞は１％未満であった。ＨＬＡクラスＩ分子で制限されたペプチド抗原の用いる試験管内での感作実験でテトラマー陽性細胞の比率が明示された報告は見あたらなかった。
　臍帯血からの単回ＣＴＬ誘導
　１．材料及び方法
　実施例１で説明された手順にしたがって、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２陽性であることが確認できた異なる臍帯血（ＩＤ番号：ＨＣＢ００７５６、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の適合型：２４：０２及び３３：０３）からＣＤ１４陰性ＣＤ４陰性ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞が分離された。前記細胞は最初の１週間は１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７と、５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地中で３７°Ｃ、５％ＣＯ２で増幅され、その後、３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５と、５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地が至適細胞濃度１０６個／ｍＬとなるよう２～３日に１回ずつ追加され、さらに２８日間増幅された。その後前記細胞は、セルバンカー（商標）（十慈フィールド株式会社）に浮遊されて液体窒素中に凍結保存され、用時解凍して以下の実験に用いられた。５％ヒトＡＢ型血清と、３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５とが添加されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地に、さらに、ビオチン化ＣＤ２８抗体とビーズとの複合体と、癌抗原ＷＴ－１特異的変異可溶性ペプチドＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ又はＣＭＶｐｐ６５特異的ペプチドＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＣＭＶｐｐ６５　ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ（配列番号５）とが添加された培地中で、解凍されたＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞が１０日間培養された。１０日目に前記細胞はＰＢＳで回収され、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬテトラマーか、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＣＭＶｐｐ６５　ＱＹＤＰＶＡＡＬＦテトラマーかが細胞１０６個あたり２０μＬ添加され、室温で２０分間静置された後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナルマウスIｇＧ２ａ抗体（クローンＨＩＴ３ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　Ｊａｐａｎ株式会社）と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体（クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　Ｊａｐａｎ株式会社）とが２０μＬずつ添加され、０°Ｃないし４°Ｃで２０分間撹拌されてから、フロー・サイトメトリー解析に供された。
　２．結果
　実施例１及び２と同様のフロー・サイトメトリー解析の結果、最初の培養後１度凍結された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、再解凍後総細胞数１×１０６個に調製した段階で癌抗原ＷＴ－１特異的変異可溶性ペプチドＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬか、ＣＭＶｐｐ６５特異的可溶性ペプチドＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＱＹＤＰＶＡＡＬＦかと、ＣＤ２８免疫ビーズとが添加された培地にて１回刺激が行われた後、刺激後１０日目まで培養された細胞では、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＷＴ－１ペプチドテトラマー陽性細胞は約２．７２％であった（図示されない）。同様に、ＣＭＶｐｐ６５特異的可溶性ペプチドＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ及びＣＤ２８免疫ビーズが添加された培地にて１回刺激が行われた後、刺激後１０日目まで培養された細胞では、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＣＭＶｐｐ６５ペプチドテトラマー陽性細胞は約３．３９％であった（図示されない）。ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞が、ＰＥ標識ＷＴ－１ペプチドテトラマーと、ＰＥ標識ＣＭＶｐｐ６５ペプチドテトラマーとを混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの蛍光波長での蛍光を示す細胞は０．７７％であった（図示されない）。ＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施された臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞が、ＰＥ標識ＷＴ－１ペプチドテトラマーを混合しないで、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体のみと混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの蛍光波長での蛍光を示す細胞は０．１９％であった（図示されない）。ＣＭＶｐｐ６５ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施された臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞が、ＰＥ標識ＣＭＶｐｐ６５ペプチドテトラマーを混合しないで、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体のみと混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの蛍光波長での蛍光を示す細胞は０．２７％であった（図示されない）。ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞が、ＰＥ標識ＷＴ－１ペプチドテトラマー又はＰＥ標識ＣＭＶｐｐ６５ペプチドテトラマーを混合しないで、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体のみと混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの蛍光波長での蛍光を示す細胞は０．１４％であった（図示されない）。
　本実施例の結果から、可溶性ＷＴ－１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導の処理工程は、１回だけでも有効であることが示された。また、可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるペプチド特異的ＣＴＬ誘導は、ＷＴ－１ペプチドに限定されるものではなく、ＣＭＶｐｐ６５ペプチドでも有効であることが示された。そこで、可溶性ペプチドと抗ＣＤ２８免疫ビーズとを併用する本発明のペプチド特異的ＣＴＬ誘導法は、ペプチド抗原の種類の如何に関わらず、実施可能であることが示唆される。これは、患者のＨＬＡ適合型に応じて、抗原として提示されるペプチドのアミノ酸配列が決定されていれば、腫瘍抗原か、ウイルス抗原かに関わらず、細胞傷害性Ｔ細胞を多数誘導して治療することを可能にするものである。また、ペプチド抗原として可溶性ペプチドを使うことにより、腫瘍細胞なり、ウイルスなりが変異して、ワクチン耐性を獲得するエスケープ変異を起こした場合にも、容易に抗原を変更することができる。また、本実施例において１回のＣＴＬ誘導でも有効であったことから、従来のＣＴＬ誘導法より簡便な培養プロトコールで実施できることが期待される。
　末梢血からのＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導
　１．材料及び方法
　実施例１（7.1）と同一の健康なボランティア被検者（ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の適合型：ＨＬＡ-Ａ＊２４：０２及び２６：０１）から末梢血が採取された。実施例１（7.1）と同じ手順で採血が行われ、実施例１（7.2）と同じ手順で単核球懸濁液が調製され、前記単核球懸濁液からＣＤ１４陽性単球が除去された。残りのＣＤ１4陰性分画から、フローコンプＣＤ８キット（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてＣＤ８陽性細胞が精製された。具体的にはビオチン化抗ＣＤ８抗体とヒト末梢血単核球懸濁液ＣＤ１4陰性分画とを氷上（０°Ｃないし４°Ｃ）で１０分間反応させた後、アビジン結合磁気免疫ビーズと氷上（０°Ｃないし４°Ｃ）で１５分間反応させ、磁気粒子分離器（ＤｙｎａＭａｇ－１５）を用いてＣＤ８陽性細胞が分離された。その後、室温でリリースバッファーが添加されて１０分間インキュベーションされて、前記アビジン結合磁気免疫ビーズがＣＤ８陽性リンパ球から遊離された。回収されたＣＤ８陽性細胞は、５％ヒトＡＢ型血清と３００ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－１５とが添加されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地中で３７°Ｃ、５％ＣＯ２条件下培養された。総細胞数１×１０６個に調製後、癌抗原ＷＴ－１特異的変異可溶性ペプチドＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬか、ＣＭＶｐｐ６５特異的ペプチドＨＬＡ－Ａ＊２４：０２　ＱＹＤＰＶＡＡＬＦかと、ＣＤ２８免疫ビーズとが添加された培地にて初回刺激、さらに初回刺激後７日目に同様の刺激が行われた後、初回刺激後１１日目まで培養された。２～３日毎に、ＩＬ－１５が添加された新鮮な培地で細胞濃度が１０６個／ｍＬとなるように希釈された。初回刺激後１１日目にフロー・サイトメトリーによるテトラマー陽性率の解析が行われた。
　２．結果
　実施例１ないし３と同様のフロー・サイトメトリー解析の結果、癌抗原ＷＴ－１特異的変異可溶性ペプチドＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ及びＣＤ２８免疫ビーズが添加された培地にて総細胞数１×１０６個に達した段階で初回刺激、さらに初回刺激後７日目に同様の刺激を行った後、初回刺激後１１日目までペプチド特異的ＣＴＬの誘導処理が施された末梢血由来ＣＤ８陽性細胞について、培養開始１１日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＷＴ－１ペプチドテトラマー陽性細胞は約５．１３％であった（図示されない）。ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施されなかった対照実験の末梢血由来ＣＤ３陽性細胞では、培養開始１１日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＷＴ－１ペプチドテトラマー陽性細胞は約０．１５％であった（図示されない）。同様に末梢血由来ＣＤ８陽性細胞が、ＣＭＶｐｐ６５可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって培養開始初日と７日目との２回刺激された場合には、培養開始１１日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＷＴ－１ペプチドテトラマー陽性細胞は約４．５３％であった（図示されない）。ＰＥ標識ＷＴ－１ペプチド－テトラマーを混合しないで、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とを混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの蛍光波長での蛍光を示す細胞は０．１３％以下であった（図示されない）。
　臍帯血からのヒトテロメラーゼｈＴＥＲＴ由来ペプチド特異的ＣＴＬ誘導
　１．材料及び方法
　ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２陽性であることが確認できた異なる臍帯血（ＩＤ番号：ＨＣＢ０１１００、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の適合型：２４：０２及び２６：０１）から、実施例１（３）で説明された手順に従って、磁気免疫ビーズを用いてＣＤ１４陰性ＣＤ４陰性ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞が分離された。前記細胞は、１０６個／ｍＬの濃度に希釈され、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７と、５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地中で３７°Ｃ、５％ＣＯ２濃度で培養開始後最初の１週間増幅され、その後７日目から、３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５と５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地で、至適細胞濃度が１０６個／ｍＬとなるよう２～３日に１回ずつ希釈された。総細胞数１×１０６個に達した段階でｈＴＥＲＴ由来可溶性ペプチドＨＬＡ－Ａ＊２４：０２　ＶＹＧＦＶＲＡＣＬ（配列番号３）及びＣＤ２８免疫ビーズが添加された培地にて初回刺激、さらに初回刺激後７日目に同様の刺激を行った後、初回刺激後１４日目まで培養された。刺激時には、ビオチン化ＣＤ２８抗体とビーズとの複合体は、ビーズ：細胞の比が４：１の濃度で添加された。初回刺激後１４日目に細胞がＰＢＳで回収され、細胞１０６個あたり２０μＬのＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ｈＴＥＲＴ　ＶＹＧＦＶＲＡＣＬテトラマーが添加され、室温で２０分間静置された後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナルマウスIｇＧ２ａ抗体（クローンＨＩＴ３ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　Ｊａｐａｎ株式会社）と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体（クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　Ｊａｐａｎ株式会社）とが２０μＬずつ添加され、０°Ｃないし４°Ｃで２０分間撹拌され、フロー・サイトメトリー解析に供された。
　２．結果
　図４ＡないしＤは、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ｈＴＥＲＴ　ＶＹＧＦＶＲＡＣＬテトラマーと、ＡＰＣ標識ヒト抗ＣＤ８抗体とを用いる２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図である。図４ＡないしＤの結果図の縦軸はＰＥ標識の蛍光強度で、横軸はＡＰＣ標識の蛍光強度である。ｈＴＥＲＴ可溶性ペプチドＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＶＹＧＦＶＲＡＣＬ及びＣＤ２８免疫ビーズが添加された培地にてｈＴＥＲＴ由来ペプチド特異的ＣＴＬの誘導処理が施された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、初回刺激後１４日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ｈＴＥＲＴペプチドテトラマー陽性細胞は約０．７４％であった（図４Ｃ）。ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞では、培養開始１１日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ｈＴＥＲＴペプチドテトラマー陽性細胞は約０．０６％であった（図４Ｂ）。ｈＴＥＲＴ可溶性ペプチドＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＶＹＧＦＶＲＡＣＬ及びＣＤ２８免疫ビーズが添加された培地にてｈＴＥＲＴ由来ペプチド特異的ＣＴＬの誘導処理が施された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞にＰＥ標識ｈＴＥＲＴペプチド－テトラマーを混合しないで、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とを混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの発光波長での発蛍光を示す細胞は０．０８％以下であった（図４Ｄ）。ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞では、ＰＥ標識ｈＴＥＲＴペプチド－テトラマーを混合しないで、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色されたサンプル中のＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの蛍光波長での蛍光を示す細胞は０．０２％であった（図４Ａ）。
　臍帯血からのｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ特異的ペプチド特異的ＣＴＬ誘導
　１．材料及び方法
　ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２陽性であることが確認できた異なる臍帯血（ＩＤ番号：ＨＣＢ０１１００、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の適合型：２４：０２及び２６：０１）から、実施例１（３）で説明された手順に従って、磁気免疫ビーズを用いてＣＤ１４陰性ＣＤ４陰性ＣＤ３／ＣＤ２８陽性細胞が分離された。前記細胞は１０６個／ｍＬの濃度に希釈され、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７と、５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地中で３７°Ｃ、５％ＣＯ２濃度で培養開始後最初の１週間増幅され、その後７日目から、３００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５と５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地で、至適細胞濃度１０６個／ｍＬとなるよう２～３日に１回ずつ希釈された。総細胞数１×１０６個に達した段階でｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ由来可溶性ペプチドＨＬＡ－Ａ＊２４：０２　ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ　ＡＹＡＣＮＴＳＴＬ（配列番号４）及びＣＤ２８免疫ビーズが添加された培地にて初回刺激、さらに初回刺激後７日目に同様の刺激を行った後、初回刺激後１０日目まで培養された。刺激時には、ビオチン化ＣＤ２８抗体とビーズとの複合体が、ビーズ：細胞の比が４：１の濃度で添加された。刺激後１０日目に前記細胞がＰＢＳで回収され、細胞１０６個あたり２０μＬのＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２　ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ　ＡＹＡＣＮＴＳＴＬテトラマーが添加され、室温で２０分間静置された後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナルマウスIｇＧ２ａ抗体（クローンＨＩＴ３ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　Ｊａｐａｎ株式会社）と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体（クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　Ｊａｐａｎ株式会社）とが２０μＬずつ添加され、０°Ｃないし４°Ｃで２０分間撹拌され、フロー・サイトメトリー解析に供された。
　２．結果
　図５ＡないしＤは、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ　ＡＹＡＣＮＴＳＴＬテトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色し、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣによる２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図である。図５ＡないしＤの結果図の縦軸はＰＥ標識の蛍光強度で、横軸はＡＰＣ標識の蛍光強度である。ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２　ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ　ＡＹＡＣＮＴＳＴＬ可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって総細胞数１×１０６個に達した段階で初回刺激、さらに初回刺激後７日目に同様の刺激を行った後、初回刺激後１０日目まで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ｈＴＥＲＴ－テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色し、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドテトラマー陽性細胞は約１．１６％であった（図５Ｃ）。ＰＥ標識ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド－テトラマーを混合しないで、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの蛍光波長での蛍光を示す細胞は０．００％以下であった（図５Ｄ）。ペプチド特異的ＣＴＬ誘導が施されなかった対照実験の臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞では、培養開始１０日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドテトラマー陽性細胞は約０．０３％であった（図５Ｂ）。ＰＥ標識ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド－テトラマーを混合しないで、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とを混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの蛍光波長での蛍光を示す細胞は０．０３％であった（図５Ａ）。
　４種類のペプチドに特異的なＣＴＬの臍帯血からの同時誘導
　１．材料及び方法
　ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２陽性であることが確認できた異なる臍帯血（ＩＤ番号：ＲＣ２Ｒ１００１０、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の適合型：２４：０２／ブランクおそらく２４：０２ホモザイゴート）から単球が貼り付き法にて除去された後、実施例１で説明された手順にしたがって、磁気免疫ビーズを用いてＣＤ４陰性ＣＤ８陽性細胞が分離された。前記細胞は１０６個／ｍＬの濃度で３００ｎｇ／ｍＬＩＬ－１５と５％ヒトＡＢ型血清とが添加されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地で培養が開始され、総細胞数１×１０６個に調製後、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性の以下の４種のペプチド及びＣＤ２８免疫ビーズが添加された培地にて初回刺激が行われた。添加されたペプチドは、（１）ＷＴ－１特異的変異型ペプチド　ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ、（２）ＣＭＶｐｐ６５ペプチド　ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ、（３）ｈＴＥＲＴ特異的ペプチド　ＶＹＧＦＶＲＡＣＬ、及び、（４）ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ特異的ペプチド　ＡＹＡＣＮＴＳＴＬの４種類であった。さらに初回刺激後７日目に同様の刺激を行った後、初回刺激後１２日目まで培養された。刺激時には、ペプチドに加えて、ビオチン化ＣＤ２８抗体とビーズとの複合体がビーズ：細胞比４：１の濃度で添加された。前記細胞は、至適細胞濃度１０６個／ｍＬとなるよう２～３日に１回ずつ希釈されながら、初回刺激から１２日間培養増幅された。
　１２日目に前記細胞はＰＢＳで回収され、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）－テトラマーか、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＣＭＶｐｐ６５テトラマーか、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ｈＴＥＲＴテトラマーか、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマーかが、細胞１０６個あたり２０μＬ添加され、室温で２０分間静置された後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナルマウスIｇＧ２ａ抗体（クローンＨＩＴ３ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　Ｊａｐａｎ株式会社）と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体（クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　Ｊａｐａｎ株式会社）とが２０μＬずつ添加され、０°Ｃないし４°Ｃで２０分間撹拌されフロー・サイトメトリー解析に供された。
　２．結果
　図６ＡないしＤは、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＷＴ－１（ｍｕ）－テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色し、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥ及びＡＰＣによる２次元フロー・サイトメトリー解析の結果図である。図６ＡないしＤの結果図の縦軸はＰＥ標識の蛍光強度で、横軸はＡＰＣ標識の蛍光強度である。総細胞数が１×１０６個に調製された後、ＷＴ－１特異的変異型ペプチド　ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって初回刺激が行われ、さらに初回刺激後７日目に同様の刺激を行い、初回刺激後１２日目まで培養された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体由来、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ＊ＷＴ－１－テトラマーと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とで染色が行われた。ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＷＴ－１ペプチド特異的テトラマー陽性細胞は約０．８９％であった（図６Ａ）。ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ＣＭＶｐｐ６５ペプチドと抗ＣＤ２８免疫ビーズとによって図６Ａの実験と同じ日数培養され、染色された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、初回刺激後１２日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＣＭＶｐｐ６５特異的テトラマー陽性細胞は約０．６６％であった（図６Ｂ）。ｈＴＥＲＴ由来ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって図６Ａの実験と同じ日数培養され、染色された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞について、初回刺激後１２日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ｈＴＥＲＴ特異的テトラマー陽性細胞は約０．９５％であった（図６Ｃ）。ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ由来可溶性ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによって図６Ａの実験と同じ日数培養され、染色された臍帯末梢血由来ＣＤ８陽性細胞について、培養開始１２日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ特異的テトラマー陽性細胞は約１．１９％であった（図６Ｄ）。ペプチド特異的ＣＴＬ誘導処理が施されずに図６Ａないし図６Ｄの実験と同じ日数培養され、染色された臍帯血由来ＣＤ８陽性細胞では、初回刺激後１２日目にＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＷＴ１ペプチド特異的テトラマー陽性細胞は約０．５８％であった（図６Ｅ）。ＰＥ標識ペプチド－テトラマーを混合しないで、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体と、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とを混合して染色されたサンプルでは、ＣＤ３＋ゲートを通過した細胞のうち、ＰＥの発光波長での蛍光を示す細胞は０．０５％であった（図６Ｆ）。
　実施例の結果から、可溶性ＷＴ－１ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導は、臍帯血由来のＣＤ８陽性細胞に限らず、少なくとも末梢血由来のＣＤ８陽性細胞にも適用できることが示された。同様に、可溶性ＣＭＶｐｐ６５ペプチド及び抗ＣＤ２８免疫ビーズによるＷＴ－１ペプチド特異的ＣＴＬ誘導は、臍帯血由来のＣＤ８陽性細胞に限らず、少なくとも末梢血由来のＣＤ８陽性細胞にも適用できることが示された。さらにＷＴ－１やＣＭＶｐｐ６５に限定されず、ｈＴＥＲＴやｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ等他の幅広い癌抗原にもこの手法が利用可能であることが示された。そこで、可溶性ペプチドと固定化抗ＣＤ２８抗体とを併用する本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物は、いかなる造血幹細胞由来のＣＤ８陽性細胞についても適用可能であることが示唆される。すると、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物は、末梢血以外の生体内の造血幹細胞、例えば、骨髄、リンパ節その他の組織由来の造血幹細胞由来のＣＤ８陽性細胞や、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から分化した造血幹細胞に由来するＣＤ８陽性細胞にも適用できる。

Claims (11)

  1. 　抗ＣＤ２８抗体と、該抗ＣＤ２８抗体が固相化された固体支持体と、ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドとを含むことを特徴とする、細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物。
  2. 　前記固体支持体は細胞培養容器であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物。
  3. 　前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、患者のＨＬＡ適合型のＨＬＡ複合体によって抗原として提示され、前記細胞傷害性Ｔ細胞に認識されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物。
  4. 　請求項３に記載の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物を含み、前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、腫瘍細胞の特異的抗原タンパク質のアミノ酸配列の一部を含み、前記細胞傷害性Ｔ細胞は前記腫瘍細胞を認識することを特徴とする、腫瘍治療用医薬品組成物。
  5. 　前記腫瘍細胞の特異的抗原タンパク質はＷＴ－１であることを特徴とする、請求項４に記載の腫瘍治療用医薬品組成物。
  6. 　請求項３に記載の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物を含み、前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、ウイルスの特異的抗原タンパク質のアミノ酸配列の一部を含み、前記細胞傷害性Ｔ細胞は前記ウイルス感染細胞を認識することを特徴とする、ウイルス疾患治療用医薬品組成物。
  7. 　前記ウイルスの特異的抗原タンパク質はサイトメガロウイルスのｐｐ６５タンパク質であることを特徴とする、請求項６に記載のウイルス疾患治療用医薬品組成物。
  8. 　造血幹細胞由来のＣＤ８陽性細胞に請求項１又は２に記載の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物を曝露して得られる、前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドを認識する細胞傷害性Ｔ細胞を含むことを特徴とする、医薬品組成物。
  9. 　前記造血幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞からなるグループから選択されるいずれかの幹細胞由来の造血幹細胞と、臍帯血由来の造血幹細胞と、末梢血由来の造血幹細胞と、骨髄血由来の造血幹細胞とからなるグループから選択されることを特徴とする、請求項８に記載の医薬品組成物。
  10. 　（１）胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞からなるグループから選択されるいずれかの幹細胞由来の造血幹細胞と、臍帯血由来の造血幹細胞と、末梢血由来の造血幹細胞と、骨髄血由来の造血幹細胞とからなるグループから選択される少なくとも１種類の造血幹細胞からＣＤ８陽性細胞を優占的に増殖させるステップと、
    （２）前記ＣＤ８陽性細胞に、請求項１又は２に記載の細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物を曝露させるステップと、
    （３）前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドを認識する細胞傷害性Ｔ細胞を培養するステップとを含むことを特徴とする、細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬品組成物の製造方法。
  11. 　前記ＭＨＣクラスＩ分子と結合可能な可溶性ペプチドは、ヒトＷＴ－１タンパク質か、サイトメガロウイルスのｐｐ６５タンパク質かのアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬品組成物の製造方法。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021206104A1 (ja) * 2020-04-08 2021-10-14 アステラス製薬株式会社 がんの処置に用いるｐｐ６５含有人工アジュバントベクター細胞
US11866465B2 (en) 2017-04-27 2024-01-09 Juno Therapeutics Gmbh Oligomeric particle reagents and methods of use thereof
US11913024B2 (en) 2015-10-22 2024-02-27 Juno Therapeutics Gmbh Methods for culturing cells and kits and apparatus for same
US12066365B2 (en) 2012-02-23 2024-08-20 Juno Therapeutics Gmbh Chromatographic isolation of cells and other complex biological materials
US12129477B2 (en) 2015-10-22 2024-10-29 Juno Therapeutics Gmbh Methods, kits, agents and apparatuses for transduction
US12516099B2 (en) 2018-08-09 2026-01-06 Juno Therapeutics, Inc. Processes for generating engineered cells and compositions thereof
US12522660B2 (en) 2018-10-31 2026-01-13 C3S2 Gmbh Methods for selection and stimulation of cells and apparatus for same

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106170297A (zh) * 2013-09-20 2016-11-30 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 用于wt‑1‑阳性疾病的组合/辅助疗法
WO2017119484A1 (ja) 2016-01-08 2017-07-13 大鵬薬品工業株式会社 免疫調節剤を含有する抗腫瘍剤及び抗腫瘍効果増強剤
JP2018007599A (ja) * 2016-07-12 2018-01-18 株式会社ガイアバイオメディシン 樹状細胞集団の調製方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006524991A (ja) * 2003-05-08 2006-11-09 エクサイト セラピーズ インコーポレーティッド 抗原特異的ｔ細胞の作製および単離の方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005118788A2 (en) * 2004-05-27 2005-12-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006524991A (ja) * 2003-05-08 2006-11-09 エクサイト セラピーズ インコーポレーティッド 抗原特異的ｔ細胞の作製および単離の方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KIM,YJ ET AL.: "Role of 4-1BB (CD137) in the functional activation of cord blood CD28(-) CD8(+) T cells.", BLOOD, vol. 100, no. 9, 1 November 2002 (2002-11-01), pages 3253 - 3260 *
OELKE,M ET AL.: "HLA-Ig-based artificial antigen-presenting cells: setting the terms of engagement.", CLIN IMMUNOL., vol. 110, no. 3, March 2004 (2004-03-01), pages 243 - 251 *
POSNETT,DN ET AL.: "Differentiation of human CD8 T cells: implications for in vivo persistence of CD8+ CD28- cytotoxic effector clones.", INT IMMUNOL., vol. 11, no. 2, February 1999 (1999-02-01), pages 229 - 241 *
WALTER,S ET AL.: "Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres.", J IMMUNOL., vol. 171, no. 10, 15 November 2003 (2003-11-15), pages 4974 - 4978 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12066365B2 (en) 2012-02-23 2024-08-20 Juno Therapeutics Gmbh Chromatographic isolation of cells and other complex biological materials
US12135265B2 (en) 2012-02-23 2024-11-05 Juno Therapeutics Gmbh Chromatographic isolation of cells and other complex biological materials
US11913024B2 (en) 2015-10-22 2024-02-27 Juno Therapeutics Gmbh Methods for culturing cells and kits and apparatus for same
US12129477B2 (en) 2015-10-22 2024-10-29 Juno Therapeutics Gmbh Methods, kits, agents and apparatuses for transduction
US11866465B2 (en) 2017-04-27 2024-01-09 Juno Therapeutics Gmbh Oligomeric particle reagents and methods of use thereof
US12516099B2 (en) 2018-08-09 2026-01-06 Juno Therapeutics, Inc. Processes for generating engineered cells and compositions thereof
US12522660B2 (en) 2018-10-31 2026-01-13 C3S2 Gmbh Methods for selection and stimulation of cells and apparatus for same
WO2021206104A1 (ja) * 2020-04-08 2021-10-14 アステラス製薬株式会社 がんの処置に用いるｐｐ６５含有人工アジュバントベクター細胞

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