WO2012133575A1 - 間葉系幹細胞の細胞死抑制方法 - Google Patents

Abstract

　本発明は、間葉系幹細胞のインビトロ継代方法であって、タンパク質分解酵素処理により細胞培養容器から剥離した間葉系幹細胞を、トレハロースを含有する生理的水溶液で洗浄することを含む、方法を提供する。更に本発明は、トレハロースを含有する生理的水溶液を含む、間葉系幹細胞のインビトロ継代において、タンパク質分解酵素処理により細胞培養容器から剥離した間葉系幹細胞を洗浄するための剤を提供する。

Description

間葉系幹細胞の細胞死抑制方法

　本発明は、間葉系幹細胞の細胞死を抑制しながら継代する方法、およびそれに用いる剤に関する。

　間葉系幹細胞は、哺乳類の骨髄等に存在し、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞等に分化する幹細胞として知られている。間葉系幹細胞は、その多分化能故に、多くの組織の再生医療のための移植材料として注目されている。すなわち、間葉系幹細胞を用いて、従来の治療方法では再生しなかった、疾病や障害により失った組織を再生し、機能を回復させる「細胞移植による再生医療」である。具体的には、例えば、下肢虚血（ビュルガー病）患者に対する骨髄間葉系幹細胞の移植、歯周病患部への骨髄間葉系幹細胞の移植、変形性関節症患者に対する骨髄間葉系幹細胞の移植等の治療が開始または計画されている。

　しかしながら、間葉系幹細胞のポピュレーションは、極めて小さく、ひとつの個体から採取できる量は僅かである。従って、再生医療を実施するのに十分な数の間葉系幹細胞を提供するためには、これを安定的に、生存率の高い状態で維持培養して、増殖する必要がある。

　一方、トレハロースはグルコースが１，１－グリコシド結合してできた二糖の一種である。トレハロースは甘味を呈し、高い保水力を持つため、種々の食品や化粧品に用いられている。また、トレハロースは細胞膜を安定化し、細胞傷害を抑制する性質を有するため、臓器を移植する際の臓器保護液の有効成分として用いられている。ＥＴ－Ｋｙｏｔｏ液やＮｅｗ　ＥＴ－Ｋｙｏｔｏ液等のトレハロースを含有する優れた臓器保存液が開発されている（特許文献１及び２、非特許文献１）。

特許第３２５３１３１号公報 国際公開第２００７／０４３６９８号

Yonsei Medical Journal, vol.45, No.6, p.1107-1114, 2004

　間葉系幹細胞は接着細胞であるため、これを継代する際には、まずトリプシンにより細胞をプレートから剥離し、血清やトリプシンインヒビターなどを添加した培地や溶液によりトリプシンによるタンパク質分解を停止した後で、遠心分離により剥離した細胞を回収し、これをさらにＰＢＳ（－）や生理食塩水により洗浄することによって残存する不活化トリプシンや夾雑物を除去した後で、新鮮な培地に懸濁し、新たなプレートに播いていた。本発明者らは、この継代操作の前後における細胞生存率を詳細に解析した結果、トリプシン処理の後に行われる洗浄操作において間葉系幹細胞の生存率が大きく低下する問題点があることを見出した。

　本発明は、間葉系幹細胞の細胞死を抑制しながらこれを継代する技術及び移植に必要な大量の生細胞を回収する技術を提供することを目的とする。

　本発明者らは、鋭意検討の結果、間葉系幹細胞を洗浄する際にトレハロースを含有する生理的水溶液を用いると、間葉系幹細胞の細胞死が抑制されることを見出した。この知見に基づき、更に検討を加えた結果、本発明を完成させた。

　即ち、本発明は以下に関する。
[１] 間葉系幹細胞のインビトロ継代方法であって、タンパク質分解酵素処理により細胞培養容器から剥離した間葉系幹細胞を、トレハロースを含有する生理的水溶液で洗浄することを含む、方法。
[２] 生理的水溶液中のトレハロース濃度が３～１０（ｗ／ｖ）％である、[１]記載の方法。
[３] 生理的水溶液中のトレハロース濃度が３～６（ｗ／ｖ）％である、[１]記載の方法。
[４] トレハロースを含有する生理的水溶液を含む、間葉系幹細胞のインビトロ継代において、タンパク質分解酵素処理により細胞培養容器から剥離した間葉系幹細胞を洗浄するための剤。
[５] 生理的水溶液中のトレハロース濃度が３～１０（ｗ／ｖ）％である、[４]記載の剤。
[６] 生理的水溶液中のトレハロース濃度が３～６（ｗ／ｖ）％である、[４]記載の剤。

　本発明を用いれば、細胞死を抑制しながら間葉系幹細胞を継代することが可能である。したがって、本発明は再生医療における良質な間葉系幹細胞の提供に資する。

間葉系幹細胞の生存率に対するトレハロースの効果を示す。a)は直接生存率の測定結果を示す。b)は、剥離直後の生存率を１００％とした場合の相対値を示す。c）は、ＰＢＳ（－）洗浄処理群の生存率を１００％とした場合の相対値を示す。 間葉系幹細胞の生存率に対するトレハロースの効果を示す。a)は、直接生存率を、トレハロース含有群とトレハロース不含群とで比較した結果を示す。b)は、直接生存率を、トレハロース含有量が３～６（ｗ／ｖ）％の群と、６．５～１０（ｗ／ｖ）％の群とで比較した結果を示す。

　本発明は、間葉系幹細胞のインビトロ継代方法であって、タンパク質分解酵素処理により細胞培養容器から剥離した間葉系幹細胞を、トレハロースを含有する生理的水溶液で洗浄することを含む、方法を提供するものである。

　「間葉系幹細胞」とは、未分化の状態で増殖し、骨細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞の全て又はいくつかへの分化が可能な幹細胞又はその前駆細胞の集団を広義に意味する。

　本発明の方法において用いられる間葉系幹細胞は、脊椎動物由来の細胞であれば特に限定されない。該脊椎動物としては、例えば、哺乳動物、鳥、魚、両生動物および爬虫類動物が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、オーストリッチ、エミュ、ダチョウ、ホロホロ鳥、ハト等を挙げることができる。脊椎動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはげっ歯類（ラット等）又は霊長類（ヒト等）である。

　生体においては、間葉系幹細胞は骨髄、末梢血、臍帯血、脂肪組織中に低頻度で存在する。間葉系幹細胞は、これらの組織から公知の方法で単離又は精製することが出来る。「単離または精製」とは、天然に存在する状態とは異なる状態に人為的に置かれること、例えば、天然に存在する状態から、目的とする成分以外の成分を除去する操作が施されていることを意味する。例えば、ヒト間葉系幹細胞は、パーコールグラディエント法により骨髄液から単離することができる（Hum. Cell, vol.10, p.45-50, 1997）。或いは、骨髄穿刺後の造血幹細胞等の培養、継代によりヒト間葉系幹細胞を単離することができる（Journal of Autoimmunity, 30 (2008) 163-171）。

　間葉系幹細胞は、通常、シャーレ、プレート、ボトル等の培養容器中、適切な培地中で、接着培養される。間葉系幹細胞の培養に用いられる培地の基礎培地は、哺乳動物の接着細胞の維持又は培養に一般的に使用されているものを用いることができ、特に限定されないが、例えばＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｆ－１０、Ｍ－１９９等が挙げられる。また、間葉系幹細胞培養用等に改変された培地を用いてもよく、上記基礎培地の混合物を用いてもよい。

　間葉系幹細胞の培養に用いられる培地は血清を含んでいてもよい。血清としては、哺乳動物由来の血清であれば特に限定されないが、好ましくは上記哺乳動物由来の血清（例えばウシ胎児血清、ヒト血清等）である。また血清の代替添加物（例えばKnockout Serum Replacement (KSR)（Invitrogen社製）等）を用いてもよい。血清の濃度は特に限定されないが、通常、０．１～３０（ｖ／ｖ）％の範囲である。

　間葉系幹細胞の培養に用いられる培地は、自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、特に限定されないが、例えば成長因子（例えばインスリン等）、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばＬ－グルタミン等）、還元剤（例えば２－メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、ｄ－ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）等が挙げられる。当該添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。

　培養温度は通常約30～40℃の範囲であり、好ましくは約37℃である。CO₂濃度は通常約1～10％の範囲であり、好ましくは約5％である。湿度は通常約70～100％の範囲であり、好ましくは約95～100％である。

　間葉系幹細胞の継代時には、まず、アスピレーター等により培地を除去する。次に、培地中に含まれるタンパク質は、タンパク質分解酵素の活性を阻害する可能性があるため、タンパク質を含まない生理的水溶液で間葉系幹細胞を洗浄し、残存する培地を除去する。生理的水溶液としては、タンパク質分解酵素の活性を阻害せず、間葉系幹細胞に対して毒性を有していない限り特に制限されないが、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、トリス緩衝化生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水、リンゲル液、５％グルコース水溶液、哺乳動物培養用の液体培地、等張剤（ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、ラクトース、塩化ナトリウム等）の水溶液等の等張水溶液等が挙げられる。好ましくはＰＢＳが用いられる。間葉系幹細胞の剥離を促進するため、生理的水溶液は、カルシウムイオンを含まないことが好ましい。

　次に、培養容器表面に接着した間葉系幹細胞をタンパク質分解酵素で処理することにより培養容器表面から剥離する。タンパク質分解酵素による間葉系幹細胞の処理は、タンパク質分解酵素を含有する生理的水溶液に、間葉系幹細胞を接触させることにより行う。タンパク質分解酵素としては、トリプシン、プロナーゼ、ペプシン、エラスターゼ、コラゲナーゼ等を挙げることができるが、好ましくは、トリプシンが用いられる。生理的水溶液としては、上述のものが挙げられるが、好ましくはＰＢＳが用いられる。間葉系幹細胞の剥離を促進するため、生理的水溶液は、カルシウムイオンを含まないことが好ましい。生理的水溶液中のタンパク質分解酵素の濃度は、タンパク質分解酵素の種類に応じて、適宜間葉系幹細胞を剥離するのに十分な濃度を設定することができるが、通常０．１～１（ｗ／ｖ）％の範囲内である。

　タンパク質分解酵素を含有する生理的水溶液に、カルシウムイオンキレーターを更に含有させ、カルシウムイオンを除去することにより、間葉系幹細胞の剥離を促進することができる。カルシウムイオンキレーターとしては、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等を挙げることができるが、好ましくはＥＤＴＡである。カルシウムイオンキレーターの濃度は、通常０．１～２ｍＭの範囲内である。

　タンパク質分解酵素処理時の温度は、通常２０～３７℃の範囲内である。タンパク質分解酵素による処理時間は、細胞を培養容器から剥離するのに十分な時間であれば特に限定されないが、通常１５秒～１５分、好ましくは、３０秒～１０分である。長い時間にわたって間葉系幹細胞をタンパク質分解酵素により処理すると、細胞がダメージを受けて、生存率が低下するおそれがあるので、肉眼や、顕微鏡により細胞の状態を観察しながらタンパク質分解酵素による処理を行い、細胞の剥離が確認できたら、できるだけ短時間のうちに、次の工程に進むことが好ましい。

　タンパク質分解酵素処理により、間葉系幹細胞を培養容器表面から剥離した後に、得られた間葉系幹細胞の懸濁液に、タンパク質分解酵素の活性を抑制するのに十分な量のタンパク質を含有する生理的水溶液を加えることにより、タンパク質分解酵素の活性を抑制する。タンパク質を含有する生理的水溶液としては、例えば、上述の血清を含有する、間葉系幹細胞の培養用の培地を挙げることができる。得られた間葉系幹細胞の懸濁液を、遠心分離に付し、上清を捨てることにより、剥離した間葉系幹細胞を分離する。

　トレハロースを含有する生理的水溶液による、剥離した間葉系幹細胞の洗浄は、トレハロースを含有する生理的水溶液で分離した間葉系幹細胞を懸濁し、得られた懸濁液を遠心分離に付し、上清を捨てることにより行う。生理的水溶液としては、間葉系幹細胞に対して毒性を有していない限り特に制限されないが、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、トリス緩衝化生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水、リンゲル液、５％グルコース水溶液、哺乳動物培養用の液体培地、等張剤（ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、ラクトース、塩化ナトリウム等）の水溶液等の等張水溶液、上述の培地等を挙げることができる。

　生理的水溶液中のトレハロースの含有量は、間葉系幹細胞の生存率を上昇させる限り限定されないが、通常３～１０（ｗ／ｖ）％、好ましくは３～６（ｗ／ｖ）％である。トレハロース濃度が高すぎると、間葉系幹細胞の細胞が小さくなる等の細胞形態に影響する可能性があり、トレハロース濃度が低すぎると、間葉系幹細胞の生存率を上昇させる効果が十分に奏されなくなる可能性がある。

　トレハロースを含有する生理的水溶液の好適な具体例として、ＥＴ－Ｋｙｏｔｏ液（特許第３２５３１３１号）を挙げることができる。ＥＴ－Ｋｙｏｔｏ液は、株式会社大塚製薬工場より市販されている。ＥＴ－Ｋｙｏｔｏ液中のトレハロース含有量は４．５３（ｗ／ｖ）％である。

　トレハロースを含有する生理的水溶液による、剥離した間葉系幹細胞の洗浄操作の回数は、１回のみであってもよいし、複数回（たとえば２～４回）行ってもよい。洗浄回数が多すぎると、かえって間葉系幹細胞の生存率が低下してしまうおそれがあるため、洗浄回数は、通常１～２回、好ましくは１回である。

　上記洗浄後の間葉系幹細胞は、新鮮な上述の培地中に適切な濃度に懸濁され、新たな培養容器中に播かれる。

　また、本発明は、上述のトレハロースを含有する生理的水溶液を含む、間葉系幹細胞のインビトロ継代において、タンパク質分解酵素処理により細胞培養容器から剥離した間葉系幹細胞を洗浄するための剤を提供するものである。本発明の剤を用いて、上記本発明の方法により間葉系幹細胞のインビトロ継代を行うことにより、継代の間葉系幹細胞の生存率の低下を最小限に抑制することができる。

　刊行物、特許文献等を含む、本明細書に引用されたすべての参考文献は、引用により、それらが個々に具体的に参考として援用されかつその内容全体が具体的に記載されているのと同程度まで、本明細書に援用される。

　以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。

［実施例１］
　ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（継代数６）（１．３×１０^６個）を培養ディッシュ上で１０（ｗ／ｖ）％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）を含有するαＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。培地を除去し、ＰＢＳにより間葉系幹細胞表面を洗浄した後に、０．２５（ｗ／ｖ）％トリプシン（ＧＩＢＣＯ）をディッシュに滴下し、室温にて静置した。細胞がディッシュから剥離したのを確認した後、直ちに１０（ｗ／ｖ）％ＦＢＳを含有するαＭＥＭを加え、ピペッティングすることにより、トリプシンによる分解を停止し、細胞を回収した。一部をトリパンブルー染色用に取り、残りの細胞懸濁液を１２本の１５ｍｌ遠心チューブに分注し、室温、１０００ｒｐｍにて３分間遠心分離し、上清を除去した。細胞のペレットをほぐし、以下の各洗浄用溶液にて細胞を懸濁した。
　　・　ＰＢＳ（２価イオン不含）
　　・　乳酸リンゲル液
　　・　乳酸リンゲル液中のトレハロース溶液（トレハロース含有量：３～１０（ｗ／ｖ）％）
　細胞懸濁液を、室温、１０００ｒｐｍにて３分間遠心分離し、上清を除去した。細胞のペレットをほぐし、再び、同一の洗浄用溶液にて細胞を懸濁した。細胞の一部を採取し、トリパンブルーにより染色し、生存率を評価した。

　結果を図１および２に示す。乳酸リンゲル液に３～１０（ｗ／ｖ）％のトレハロースを添加することにより、間葉系幹細胞の生存率の低下が抑制された。トレハロース含有量が３～６（ｗ／ｖ）％の範囲内では細胞の形態に大きな変化はなかったが、６．５～１０（ｗ／ｖ）％では、生存率自体は３～６（ｗ／ｖ）％のものとほぼ同一であったが、細胞が全体的に小さくなる傾向が確認された。従って、トレハロースは、少なくとも３～１０（ｗ／ｖ）％の範囲内で間葉系幹細胞の生存率の低下を抑制し、３～６（ｗ／ｖ）％が好ましい濃度範囲であることが示唆された。

　本発明を用いれば、細胞死を抑制しながら間葉系幹細胞を回収及び継代することが可能である。したがって、本発明は再生医療における良質な間葉系幹細胞の提供に資する。

　本出願は日本で出願された特願２０１１－０７２０６８（出願日：２０１１年３月２９日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (6)

1. 　間葉系幹細胞のインビトロ継代方法であって、タンパク質分解酵素処理により細胞培養容器から剥離した間葉系幹細胞を、トレハロースを含有する生理的水溶液で洗浄することを含む、方法。
2. 　生理的水溶液中のトレハロース濃度が３～１０（ｗ／ｖ）％である、請求項１記載の方法。
3. 　生理的水溶液中のトレハロース濃度が３～６（ｗ／ｖ）％である、請求項１記載の方法。
4. 　トレハロースを含有する生理的水溶液を含む、間葉系幹細胞のインビトロ継代において、タンパク質分解酵素処理により細胞培養容器から剥離した間葉系幹細胞を洗浄するための剤。
5. 　生理的水溶液中のトレハロース濃度が３～１０（ｗ／ｖ）％である、請求項４記載の剤。
6. 　生理的水溶液中のトレハロース濃度が３～６（ｗ／ｖ）％である、請求項４記載の剤。

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