WO2012128662A1 - Способ получения зрелого интерферона альфа-2 человека с использованием дрожжей saccharomyces cerevisiae и штамм - продуцент интерферона альфа-2 человека (варианты) - Google Patents

Способ получения зрелого интерферона альфа-2 человека с использованием дрожжей saccharomyces cerevisiae и штамм - продуцент интерферона альфа-2 человека (варианты) Download PDF

Info

Publication number
WO2012128662A1
WO2012128662A1 PCT/RU2011/000557 RU2011000557W WO2012128662A1 WO 2012128662 A1 WO2012128662 A1 WO 2012128662A1 RU 2011000557 W RU2011000557 W RU 2011000557W WO 2012128662 A1 WO2012128662 A1 WO 2012128662A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
interferon alpha
yeast
pro
human interferon
saccharomyces cerevisiae
Prior art date
Application number
PCT/RU2011/000557
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Дмитрий Георгиевич КОЗЛОВ
Андрей Романович ЯКОВЕНКО
Владимир Адольфович ТЕЗОВ
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Фармапарк"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Фармапарк" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Фармапарк"
Publication of WO2012128662A1 publication Critical patent/WO2012128662A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence

Definitions

  • the invention relates to the field of biotechnology and relates to a method for increasing the secretion of recombinant proteins by Saccharomyces cerevisiae yeast cells.
  • secreted proteins such soluble target proteins whose biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae yeast cells is accompanied by their excretion into the extracellular medium. Under the secretion of protein is understood such a combination of intracellular processes that lead to the excretion of the synthesized protein in the extracellular environment.
  • leader polypeptides leader regions
  • Essential part of a leader polypeptide is a signal peptide (pre-region), additional is a pro-region.
  • the main function of the signal peptide is to facilitate the process of protein translocation, i.e. the secreted protein intersects the membrane layer separating the region of the cell in which the protein is synthesized from the region of the reticulum, in which the secreted protein is folded and its post-translational modification.
  • the signal peptide is removed from the composition of the secreted protein directly in the process of translocation.
  • the pro-region can fulfill a twofold function: on the one hand, the pro-region provides an elongation of proteins, especially short proteins, affecting their translocation.
  • the second known function of the pro-region is realized at the stage of protein transport from the reticulum and consists in the interaction of the sequence of the pro-region with transport receptors, which mediate the incorporation of secreted proteins into secretory granules in which secreted proteins move within the cell.
  • transport receptors which mediate the incorporation of secreted proteins into secretory granules in which secreted proteins move within the cell.
  • One of the final stages of intracellular transport in the Golgi complex is the enzymatic cleavage (processing) of the pro-region from the mature part of the secreted protein, which is then sent to the plasma membrane and exits the cell.
  • leader regions of yeast secreted proteins are commonly used as leader regions.
  • leader regions of yeast origin used for the secretion of heterologous proteins in S. cerevisiae cells is the leader pre-pro region of the a-factor precursor (MFa-1), a sex factor secreted by ⁇ -type mating yeast cells.
  • leader region has been demonstrated many times, including in relation to the secretion of proteins such as insulin-like growth factor I [Waupe et al., 1988, Gene, 66: 235-244], granulocyte colony-stimulating human factor [Ernst, 1988, DNA, 7 : 355-360], human and chicken lysozymes [Oka et al, 1999, Biosci. Biotechnol. Biochem., 63: 1977-1983; Hashimoto et al., 1998, Protein Engineering, 1 1: 75-77].
  • Another well-known secretory leader of yeast origin is the pre-pro-region of the S.
  • HSP150 glycoprotein whose positive effect on the secretion of heterologous proteins in yeast cells has been established, for example, for ⁇ -lactamase [Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269 : 13887-92] and the extracellular domain of rat nerve growth factor receptor [Simonen et al., 1996, Yeast, 12: 457-66].
  • sequence of artificial origin that effectively performs the functions of a leader polypeptide in yeast cells is a fragment of the interleukin-1-beta protein [Lee J et al., 1999, Biotechnol Prog, 15: 884-890].
  • the human interferon alpha-2 includes two allelic variants of interferon alpha-2b and interferon alpha-2a, which differ in the coding region by a single nucleotide substitution at position 137 (2a: A, 2b: G).
  • IFN-2 The human interferon alpha-2
  • the human interferon alpha-2 includes two allelic variants of interferon alpha-2b and interferon alpha-2a, which differ in the coding region by a single nucleotide substitution at position 137 (2a: A, 2b: G).
  • Human alpha-2 interferons belong to the class of cytokines with antiviral activity and are members of the alpha interferon family secreted by almost all types of virus-infected human cells [Pfeffer et al, 1998, Cancer Research, 58: 2489-2499].
  • IFN-2 Recombinant IFN-2 is used to treat viral and tumor diseases [Samuel, 2001, Clinical Microbiology Reviews, 14: 778-809; Vogeldorf et al, 2009, Annals of Oncology, 20 (Supplement 6): vi41-vi50; Pfeffer et al, 1998, Cancer Research, 58: 2489-2499], including for the treatment of solid tumors such as bladder cancer, kidney cancer, HIV-induced Kaposi’s sarcoma et al. [Torti et al, 1988, J Clin Oncol, 6: 476-483; Vugrin et al, 1985, Cancer Treat Rep, 69: 817-820; Rios et al, 1985, J Clin Oncol, 3: 506-512].
  • IFN-a2 are the main therapeutic agents used to treat chronic forms of hepatitis B and C [Clark & Nelson, 2009, Clin Liver Dis, 13: 351-363].
  • the objective of the claimed group of inventions is to expand the arsenal of leader polypeptides directing the secretion of target proteins in Saccharomyces cerevisiae yeast into the culture medium, and the construction of strains of Saccharomyces cerevisiae yeast, producers of secreted human interferon alpha-2, with increased production of these proteins.
  • the claimed group of inventions is based on the fact established by the authors that the amplification (doubling, tripling, etc.) of the pro-region of the yeast ⁇ -factor in the leader polypeptide that directs the secretion of the target protein in S. cerevisiae cells leads to increase the secretion of this target protein.
  • the method is as follows.
  • combination is meant the multiplication of a unique pro-region of the yeast ⁇ -factor.
  • the new leader polypeptides at the C-terminus contain a unique recognition site for the processing protein kinase KEX2;
  • Stage 2 - design variants of expression vectors each of which contains a gene encoding a target protein, precision fused with one of the variants of new leader polypeptides containing its composition is a combination of pro-areas.
  • the KEX2 proteinase recognition site is localized, which allows enzymatic processing of the fusion protein with the participation of intracellular KEX2 proteinase to release a mature target protein containing the correct rastierial amino acid residue;
  • Stage 3 recipient strains of S. cerevisiae yeast are transformed with the obtained variants of expression vectors, after which, analyzing the secretory activity of the obtained transformants under suitable conditions, choose the variant variant with the new leader polypeptide that shows the highest secretion efficiency of the target protein;
  • Stage 4 using the selected strain of yeast and fermentation equipment in optimized conditions, the biosynthesis of the target protein is carried out.
  • strains SCR-2b-FF, a producer of mature human interferon alpha-2b, and SCR-2a-FF, a producer of mature human interferon alpha-2a are obtained.
  • the secretion of mature human alpha-2 interferons in cells of the SCR-2b-FF and SCR-2a-FF strains is directed by the leader polypeptide containing the doubled pro-region of S. cerevisiae yeast ⁇ -factor.
  • agarized YPD medium of the following composition (in wt.%): Peptone-2, yeast extract -1, glucose-2, agar-2, water - the rest, cells of the claimed strains of Saccharomyces cerevisiae have an oval shape, 3 to 7 microns in diameter. Cells are budded. The budding is true, many-sided. True mycelium is not formed.
  • Colonies are as follows:
  • Assimilation of carbon sources All claimed strains ferment glucose, fructose, maltose, sucrose, dextrins, starch. Do not ferment lactose, galactose, inulin, xylose, arabinose.
  • Pathogenicity The inventive strains of Saccharomyces cerevisiae are non-pathogenic.
  • the strains are stored at a temperature of -70 ° C in a 20% aqueous solution of glycerol. Storage on an agarized rich medium with glucose is possible for 3 months at + 4 ° C. Stability: Stability of the claimed strains is maintained at 20 successive transfers in agarized YPD medium at a temperature of 28 ° C.
  • FIG. 1 Electrophoregram of samples of the culture fluid obtained by culturing the producer strains of human interferon alpha-2: SCR-2a-F (dor. 1), SCR-2b-F (dor. 2), SCR-2a-FF (dor. 3), SCR-2b-FF (extension 4), SCR-2a-FFF (extension 5) and SCR-2b-FFF (extension 6).
  • a protein of 5 ⁇ l of culture fluid was applied to the tracks.
  • the electrophoregram presents molecular weight markers (d. M, on the left are the molecular weight values of protein markers (in kDa)).
  • the upper part of the electrophoregram shows the measurement data for interferon alpha-2 in the corresponding samples of the culture fluid obtained using analytical high performance liquid chromatography (mg / l).
  • Example 1 Construction of a leader polypeptide gene containing a doubled pro-region of S. cerevisiae yeast a-factor
  • the construction of a gene encoding a leader polypeptide containing the doubled pro-region of S. cerevisiae yeast ⁇ -factor is carried out using the plasmid pUC18x-GALlppI-IFN2b.
  • the human interferon alpha-2b gene is amplified by PCR using primers N466 (ataccatggaaaagagatgtgatctgcctcaaacccacagcctaggtagccgt) and N467 (atctcgagtcattctttacttcttaaggattgcaagttt).
  • the matrix is pSX50 plasma DNA [RU2319502].
  • the result is the plasmid pUC18x-GALlppI-IFN2b.
  • Plasmid pUC 18x-GALlppI-IFN2b was digested at the Ncol and Xhol sites.
  • fragment 1 The larger of the resulting DNA fragments, containing the vector part of the plasmid and the sequence encoding the pre-pro region of the yeast a-factor, fused to the sequence encoding the promoter region of the yeast GAL1 gene, is called fragment 1.
  • N449 primers for PCR (5 '-atatagatctccagtcaacactacaa) and standard reverse pUC a primer called N169 (5'-gagcggataacaatttcacacagg) amplifies the DNA fragment of the plasmid pUC 18x-GAL 1 ppI-IFN2b, comprising the sequence of the pro-region of the yeast ⁇ -factor and the interferon gene fused to it.
  • the amplified DNA fragment is cleaved at the unique terminal sites of Bglll and Xhol and is called fragment-2. Then, as a result of annealing one another of two synthetic oligonucleotides N573 (5'-catgttggaattcg) and N 74 (5'-gatccgaattccaa), a synthetic adapter called fragment-3 is obtained. As a result of co-ligation of the three obtained DNA fragments, plasmid pUC 18x-GAL lpFF-IFN2b is obtained.
  • the resulting plasmid pUC18x-GALlpFF-IFN2b contains the human interferon alpha-2b gene fused to a DNA fragment encoding a leader polypeptide, containing doubled pro-region of yeast a-factor.
  • Example 2 Construction of a leader polypeptide gene containing a triple pro-region of S. cerevisiae yeast a-factor
  • the construction of the leader polypeptide gene containing the triple pro-region of S. cerevisiae yeast ⁇ -factor is carried out using the plasmid pUC18x-GALlpFF-IFN2b (Example 1).
  • plasmid pUC 18x-GALlpFF-IFN2b is cleaved at the Ncol and Xhol sites.
  • the largest of the resulting DNA fragments, comprising the vector part of the plasmid and the sequence of the promoter region of the yeast GAL1 gene, fused to the leader polypeptide containing the doubled pro-region of the yeast ⁇ -factor, is called fragment-4.
  • the resulting plasmid pUC 18x-GAL 1 pFFF-IFN2b contains the human interferon alpha-2b gene fused to a DNA fragment encoding a leader polypeptide containing the triple pro-region of yeast a-factor.
  • Example 3 Construction of yeast expression vectors carrying the alpha-2b gene of human interferon
  • Construction was performed using the laboratory vector pPDX3, which differs from the vector pPDX2 by a single substitution in the Ncol site sequence (ccatgg changed to ccatga), localized in the region of the URA3 structural gene and not leading to inactivation of this gene.
  • the design is as follows.
  • the Hindlll / Xhol DNA fragment of the vector pPDX3 is ligated with the Hindlll / Xhol DNA fragment of the plasmid pUC18x-GALlppI-IFN2b or pUC18x-GALlpFF-IFN2b or pUC18x-GALlpFFF-IFN2b, which contains the sequences of the GAL1 promoter and the human interferon alpha 2 genome interferon gene .
  • the result is expression vectors pPDX3-F-2b or pPDX3-FF-2b or pPDX3-FFF-2b, respectively.
  • the resulting expression vectors contain a gene encoding mature human interferon alpha-2b fused to sequences of leader polypeptides containing single, doubled or tripled pro-regions of the yeast factor, respectively.
  • Example 4 Construction of yeast expression vectors carrying the gene of human alpha-2a interferon
  • the source of the human interferon alpha-2a gene is the plasmid pUC18x-GALlppI-IFN2a, constructed similarly to pUC 18x-GAL 1 pFFF-IFN2b, but instead of primer N466, N617 (agcctaggtagccgtcggtaccttgatgctcctctcctagtgctgctgtagctgctgctagtgctcctagtgctgctctagtgctcctagtgctgctctagtgctgctctagtgctgctctagtgctgctgctagtgctcctagtgctgctgctgctgctagtgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgct) is used.
  • the human interferon alpha-2b gene is replaced with the human interferon alpha-2a gene.
  • a unique Ncol / Xhol DNA fragment including the human interferon alpha-2b gene is excised from the vector pPDX3-F-2b or pPDX3-FF-2b or pPDX3-FFF-2b, and the remaining vector part is ligated with the Ncol / Xhol plasmid DNA fragment pUC18x-GALlppI-IFN2a encoding the human interferon alpha-2a gene.
  • AT the result is expression vectors pPDX3-F-2a or pPDX3-FF-2a or pPDX3-FFF-2a, respectively.
  • the resulting expression vectors contain the mature human interferon alpha-2a gene fused to sequences of leader polypeptides containing single, double or triple yeast pro-factor pro-regions, respectively.
  • Example 5 Construction of strains of yeast S. cerevisiae - producers of secreted alpha-2 human interferon
  • the producers of secreted human interferon alpha-2 are constructed on the basis of the S. cerevisiae VKPM Y-3550 strain. For this, first the cells of the VKPM strain Y-3550 are freed from the episomal vector located in them. The resulting plasmid-free strain is called SCR-8G1.
  • Cells of the plasmid-free recipient strain SCR-8G1 are transformed with the plasmid pPDX3-F-2b, or pPDX3-FF-2b, or pPDX3-FFF-2b, or pPDX3-F-2a, or pPDX3-FF-2a, or pPDX3-FFF.
  • the result is a strain of SCR-2b-F, or SCR-2b-FF, or SCR-2b-FFF, or SCR-2a-F, or SCR-2a-FF, or SCR-2a-FF, or SCR-2a-FFF, respectively.
  • cells of the obtained strains are cultured on YPD medium. Further, using the method of electrophoresis in SDS page and the standard ELISA protocol.
  • strain D721W / pPDX2 is used as a negative control.
  • cells of the obtained strains SCR-F-2b, SCR-2b-FF, SCR-2b-FFF, SCR-2a-F, SCR-2a-FF and SCR-2a-FFF are cultured on medium YPD of the following composition (in wt.%): Peptone-2, yeast extract -1, glucose - 2, agar -2, water - the rest, for 44 hours at 28 ° C on a rotary shaker at a speed of 250 rpm.
  • the accumulation of interferon in the culture fluid was analyzed using a PAGE electrophoresis method and analytical reverse phase high performance liquid chromatography method as described in the patent application.
  • SCR-2b-FF and SCR-2a-FF the secretion of interferon alpha-2 in which is directed by new leader polypeptides containing the doubled pro-region a- yeast factor, as well as strains SCR-2b-FFF and SCR-2a- FFF, the secretion of interferon alpha-2 in which is directed by new leader polypeptides containing the triple pro-region of the ⁇ -factor of yeast, outperform the strains SCR-2b -F and SCR- 2a-F, which are analogues of the prototype strains In PM Y-3550 and VKPM Y-3564, the secretion of interferon alpha-2 in which is directed by the standard pre-pro region of the yeast a-factor, 1.3 and 1.2 times, respectively .
  • VKPM Industrial Microorganisms
  • Example 6 Microbiological synthesis of human interferon alpha-2b using strain VKPM Y-3582 To obtain seed, strain VKPM Y-3582 is grown in YPD medium on a shaker (250 rpm) at a temperature of 28 ° C for 20-24 hours
  • 50 ml of seed is used for sowing 3 l of Anglicon fermenter containing 950 ml of YPD medium. Fermentation is carried out at a temperature of 28 ° C, aeration of 1 l / min and a stirring speed of 1000 rpm. 24 hours after sowing the fermenter begin feeding 50% solution glucose at a rate of 2 ml / h and set the pH-start of the culture at pH6.8 using 10% sulfuric acid and 10% NaOH solutions for subtraction. The total fermentation time is 72 hours
  • the production of mature secreted interferon alpha-2b human strain VKPM Y-3582 is at least 550 mg / L. This level of production is not less than 20%, exceeds the level of synthesis of interferon by the strain prototype VKPM Y-3550.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа увеличения секреции рекомбинантных белков клетками дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Разработан способ увеличения секреции рекомбинантных белков в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae, основанный на использовании новых лидерных полипептидов, заключающих в своем составе вместо уникальной про-области комбинацию про-областей, которая представляет собой последовательность двух или более про- областей α-фактора дрожжей S.cerevisiae. С использованием разработанного способа сконструированы штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae - продуценты секретируемого интерферона альфа-2b и альфа-2а человека. Продуктивность полученных штаммов составляет не менее 550 мг/л интерферона альфа-2 при использовании ферментационного оборудования.

Description

Способ получения зрелого интерферона альфа-2 человека с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae и штамм - продуцент интерферона альфа-2 человека (варианты)
Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа увеличения секреции рекомбинантных белков клетками дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Предшествующий уровень техники
Под секретируемыми белками понимаются такие целевые растворимые белки, биосинтез которых в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae сопровождается их экскрецией во внеклеточную среду. Под секрецией белка понимают такую совокупность внутриклеточных процессов, которые приводят к экскреции синтезируемого белка во внеклеточную среду.
Известно, что эффективность секреции в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae зависит от выбора лидерных полипептидов (лидерных областей), направляющих секрецию белков [Romanos et al, 1992, Yeast 8: 423-488]. Необходимой частью лидерного полипептида является сигнальный пептид (пре-область), дополнительной - про-область. Каждая из частей лидерного полипептида, входящих в состав секретируемого белка на этапе его биосинтеза, в процессе секреции удаляется из его состава по мере выполнения своей функции.
Основная функция сигнального пептида заключается в обеспечении процесса транслокации белка, т.е. пересечения секретируемым белком мембранного слоя, отделяющего область клетки, в которой осуществляется синтез белка, от области ретикулума, в которой происходит сворачивание секретируемого белка и его пост-трансляционная модификация. Сигнальный пептид удаляется из состава секретируемого белка непосредственно в процессе транслокации. Про-область может выполнять двоякую функцию: с одной стороны про-область обеспечивает удлинение белков, в особенности коротких белков, влияющее на их транслокацию. Вторая известная функция про-области реализуется на этапе транспорта белков из ретикулума и заключается во взаимодействии последовательности про-области с транспортными рецепторами, которые опосредуют включение секретируемых белков в секреторные гранулы, в которых секретируемые белки перемещаются внутри клетки. На одном из заключительных этапов внутриклеточного транспорта в комплексе Гольджи происходит ферментативное отщепление (процессинг) про-области от зрелой части секретируемого белка, который в дальнейшем направляется к плазматической мембране и выходу из клетки.
В дрожжах S.cerevisiae в качестве лидерных областей обычно используются лидерные области дрожжевых секретируемых белков. Одной из наиболее широко применяемых лидерных областей дрожжевого происхождения, используемых для секреции гетерологичных белков в клетках S.cerevisiae, является лидерная пре-про область предшественника а-фактора (MFa-1) - полового фактора, секретируемого дрожжевыми клетками α-типа спаривания. Эффективность этой лидерной области продемонстрирована многократно, в том числе в отношении секреции таких белков, как инсулиноподобный фактор роста I [Ваупе et al., 1988, Gene, 66: 235-244], гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека [Ernst, 1988, DNA, 7: 355-360], лизоцимы человека и курицы [Ока et al, 1999, Biosci.Biotechnol.Biochem., 63: 1977-1983; Hashimoto et al., 1998, Protein Engineering, 1 1 : 75-77]. Другим известным · секреторным лидером дрожжевого происхождения является пре-про-область гликопротеина HSP150 S. cerevisiae, положительное влияние которой на секрецию гетерологичных белков в клетках дрожжей установлено, например, для β-лактамазы [Simonen et al., 1994, J Biol Chem, 269: 13887-92] и внеклеточного домена рецептора фактора роста нервов крысы [Simonen et al., 1996, Yeast, 12: 457-66].
Примером последовательности искусственного происхождения, эффективно выполняющей в клетках дрожжей функции лидерного полипептида, является фрагмент белка интерлейкина-1-бета [Lee J et al., 1999, Biotechnol Prog, 15: 884-890].
Увеличение эффективности секреции белков в клетках дрожжей является одним из приоритетных направлений исследований в области биотехнологии. Проводимые исследования, в том числе, касаются модификации про- областей лидерных полипептидов, которые обеспечивают улучшение процессинга [Kjeldsen Т. et al., 1996, Gene, 170: 107-112] и секреторной активности [Kjeldsen Т., 2000, Appl Microbiol Biotechnol, 54: 277-286]. В частности некоторые искусственно сконструированные про-пептиды обеспечивают 4-кратное увеличение секреции инсулина человека по сравнению со стандартным вариантом пре-про- области α-фактора дрожжей [Kjeldsen Т., 2000, Appl Microbiol Biotechnol, 54: 277-286].
К интерферону альфа-2 человека (IFN- 2) относятся два аллельных варианта интерферон альфа-2Ь и интерферон альфа-2а, отличающиеся в кодирующей области одиночной нуклеотидной заменой в позиции 137 (2а:А, 2b:G). [Kaluz et al, 1993, Acta Virol, 37: 97-100; Kaluz et al., 1994, Acta Virol, 38: 101-104; Lee et al., 1995, J Interferon Cytokine Res, 15: 341- 349], которая приводит к аминокислотной замене (2а: Lys, 2b:Arg).
Интерфероны альфа-2 человека относятся к классу цитокинов, обладающих антивирусной активностью, и являются представителями семейства альфа-интерферонов, секретируемых практически всеми типами вирус- инфицированных клеток человека [Pfeffer et al, 1998, Cancer Research, 58: 2489-2499].
Рекомбинантные IFN- 2 применяют для терапии вирусных и опухолевых заболеваний [Samuel, 2001 , Clinical Microbiology Reviews, 14: 778-809; Schadendorf et al , 2009, Annals of Oncology, 20 (Supplement 6): vi41-vi50; Pfeffer et al, 1998, Cancer Research, 58: 2489-2499], в том числе для лечения твердых опухолей, таких как рак мочевого пузыря, рак почки, ВИЧ-индуцированная саркома Капоши и др. [Torti et al, 1988, J Clin Oncol, 6: 476-483; Vugrin et al, 1985, Cancer Treat Rep, 69: 817-820; Rios et al, 1985, J Clin Oncol, 3: 506-512]. IFN-a2 являются основными терапевтическими средствами, используемыми для лечения хронических форм гепатитов В и С [Clark & Nelson, 2009, Clin Liver Dis, 13: 351-363].
В недавних работах [Shi et al, 2007, Protein Expr Purif, 54: 220-6; Ghosalkar et al, 2008, Protein Expr Purif, 60: 103- 109; Salunkhe et al, 2010, Protein Expr Purif, 71 : 139-46] показано, что пре-про область α-фактора дрожжей эффективно направляет секрецию зрелого интерферона альфа-2Ь в клетках дрожжей Pichia pastoris. Уровень накопления биологически активного интерферона в среде культивирования составляет до 300 мг/л. В условиях высокоплотного культивирования P. pastoris получают до 600 мг/л зрелого IFN-oc2 [Ayed et al, 2008, Enzyme Microb Technol, 42: 173-180].
Возможность использования дрожжей S.cerevisiae для получения до 280 мг/л биологически активного интерферона альфа-2а показана в работе Chu et al [2003]. Раскрытие изобретения
Задача заявляемой группы изобретений является расширение арсенала лидерных полипептидов, направляющих секрецию целевых белков в дрожжах Saccharomyces cerevisiae в культуральную среду, и конструирование штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae - продуцентов секретируемого интерферона альфа-2 человека, обладающих повышенной продукцией этих белков.
Задача решена путем:
- конструирования генов, кодирующих новые лидерные полипептиды, в состав которых вместо уникальной про- области α-фактора дрожжей вводят две или более последовательностей про-областей α-фактора дрожжей;
- конструирования векторов, несущих гены зрелого интерферона альфа-2 человека, слитые в одной рамке считывания с генами новых лидерных полипептидов;
- конструирования штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3582 и ВКПМ Y-3581 - продуцентов зрелого интерферона альфа-2Ь человека или зрелого интерферона альфа-2а человека, соответственно, секреция которых направляется лидерным полипептидом, сконструированным на основе удвоенной про-области а- фактора дрожжей S. cerevisiae.
В основу заявляемой группы изобретений положен установленный авторами факт, заключающийся в том, что амплификация (удвоение, утроение и т.д.) последовательности про-области α-фактора дрожжей в составе лидерного полипептида, направляющего секрецию целевого белка в клетках S. cerevisiae, приводит к увеличению секреции этого целевого белка.
Способ осуществляют следующим образом.
Этап 1 - конструируют варианты генов, кодирующих новые лидерные полипептиды, заключающих в своем составе последовательности, кодирующие эффективный сигнальный пептид и комбинацию про-областей а-фактора дрожжей. Под комбинацией понимают мультипликацию уникальной про-области α-фактора дрожжей. Новые лидерные полипептиды на С-конце содержат уникальный сайт узнавания процессирующей протеиназы КЕХ2;
Этап 2 - конструируют варианты экспрессионных векторов, каждый из которых содержит в своем составе ген, кодирующий целевой белок, прецизионно слитый с одним из вариантов новых лидерных полипептидов, содержащих в своем составе комбинацию про-областей. При этом в области слияния целевого белка и лидерного полипептида локализован сайт узнавания протеиназы КЕХ2, что позволяет в ходе секреции в результате ферментативного процессинга слитого белка с участием внутриклеточной протеиназы КЕХ2 высвобождать из его состава зрелый целевой белок, содержащий корректный Ν-концевой аминокислотный остаток;
Этап 3 - полученными вариантами экспрессионных векторов трансформируют реципиентные штаммы дрожжей S. cerevisiae, после чего, анализируя в подходящих условиях секреторную активность полученных трансформантов, выбирают тот вариант штамма с новым лидерным полипептидом, который демонстрирует наибольшую эффективность секреции целевого белка;
Этап 4 - с использованием выбранного штамма дрожжей и ферментационного оборудования в оптимизированных условиях проводят биосинтез целевого белка.
Заявляемые штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae
- продуценты зрелого интерферона альфа-2Ь человека или зрелого интерферона альфа-2а человека, соответственно, получают согласно описанному выше способу с использованием генов зрелого интерферона альфа-2Ь человека или зрелого интерферона альфа-2а человека, соответственно. В результате осуществления способа получают штаммы SCR-2b-FF - продуцент зрелого интерферона альфа-2Ь человека и SCR-2a-FF - продуцент зрелого интерферона альфа-2а человека. Секреция зрелых интерферонов альфа-2 человека в клетках штаммов SCR-2b- FF и SCR-2a-FF направляется лидерным полипептидом, содержащим удвоенную про-область α-фактора дрожжей S. cerevisiae. Полученные штаммы депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как штаммы Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y- 3582 и ВКПМ Y-3581, соответственно. Характеристика заявляемых штаммов
Генотип заявляемых штаммов
SCR-2b-FF (a/α Ieu2lleu2 игаЗ/игаЗ trpl/trpl pgkl::URA3/pgkl :URA3 gal80::LEU2lgal80: LEU2 lys7ILYS7 Ms3/HIS3 his4/HIS4 ypslwTRPl/yps lv.TRPl ATHl/athl::{ADHl-G418, GAL1-KEX2B) STA2/STA2 suc°ISUC2) /pPDX3-FF-IFN2b
SCR-2a-FF (a/a Ieu2lleu2 игаЗ/игаЗ trplltrpl pgkl URA3/pgkl::URA3
Figure imgf000011_0001
lys7ILYS7 his3/HIS3 his4/HIS4 ypsl : TRPl/ypsl : : TRP1
Figure imgf000012_0001
suc°ISUC2) /pPDX3-FF-IFN2a Все заявляемые штаммы характеризуются следующими культурально- морфологическими и физиолого- биохимическими признаками:
Морфологические признаки:
При культивировании при температуре 28°С в течение 48 часов на агаризованной среде YPD следующего состава (в мас.%): пептон-2, дрожжевой экстракт -1, глюкоза - 2, агар - 2, вода - остальное, клетки заявляемых штаммов Saccharomyces cerevisiae имеют овальную форму, 3 - 7 мкм в диаметре. Клетки почкуются. Почкование истинное, многостороннее. Истинного мицелия не образуют.
Колонии имеют следующий вид:
1) на агаризованной среде YPD колонии белого цвета с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и сметанообразной консистенцией;
2) на агаризованной среде с крахмалом (состав в мас.%: пептон-2, дрожжевой экстракт -1, крахмал - 1 , агар -2, вода - остальное) колонии белого цвета с узорчатым краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и крупчатой консистенцией.
Рост в жидкой среде с крахмалом: при 28°С в течение первых 24 ч культивирования - жидкость мутная, осадок белый, не комкуется, пристеночных пленок не образует.
Физико-химические признаки: Все заявляемые штаммы - факультативные анаэробы. Температура роста - 20-33°С (оптимум - 28°С). рН культивирования - 3,8-7,4 (оптимум - 5,0).
Ассимиляция источников углерода: Все заявляемые штаммы сбраживают глюкозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, декстрины, крахмал. Не сбраживают лактозу, галактозу, инулин, ксилозу, арабинозу.
Ассимиляция источников азота: Все заявляемые штаммы усваивают аминокислоты, сернокислый аммоний, азотнокислый аммоний.
Патогенностъ: Заявляемые штаммы Saccharomyces cerevisiae непатогененны.
Хранение: Штаммы хранят при температуре -70°С в 20% водном растворе глицерина. Возможно хранение на агаризованной богатой среде с глюкозой в течение 3 месяцев при +4°С. Стабильность: Стабильность заявляемых штаммов сохраняется при 20 последовательных пересевах на агаризованной среде YPD при температуре 28°С.
Продукция интерферона альфа-2: При выращивании в ферментере клетки заявляемых штаммов Saccharomyces cerevisiae SCR-2b-FF и SCR-2a-FF продуцируют зрелый интерферон IFN-oc2.
Краткое описание фигур чертежей
Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами:
Фиг. 1. Электрофореграмма образцов культуральной жидкости, полученных в результате культивирования штаммов-продуцентов интерферона альфа-2 человека: SCR- 2a-F (дор. 1), SCR-2b-F (дор. 2), SCR-2a-FF (дор. 3), SCR-2b- FF (дор. 4), SCR-2a-FFF (дор. 5) и SCR-2b-FFF (дор. 6). На дорожки нанесен белок из 5 мкл культуральной жидкости. На элекрофореграмме представлены маркеры молекулярного веса (дор. М, слева приведены значения молекулярного веса белковых маркеров (в кДа)). В верхней части электрофореграммы приведены данные измерений содержания интерферона альфа-2 в соответствующих образцах культуральной жидкости, полученные с помощью аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии (мг/л).
Лучший пример осуществления изобретения
Пример 1. Конструирование гена лидерного полипептида, содержащего удвоенную про-область а- фактора дрожжей S. cerevisiae
Конструирование гена, кодирующего лидерный полипептид, содержащий удвоенную про-область а-фактора дрожжей S. cerevisiae, проводят с использованием плазмиды pUC18x-GALlppI-IFN2b. Ген интерферона альфа-2Ь человека амплифицируют в реакции ПЦР с использованием праймеров N466 (ataccatggaaaagagatgtgatctgcctcaaacccacagcctaggtagccgt) и N467 (atctcgagtcattctttacttcttaaggattgcaagttt). Матрицей служит ДНК плазмы pSX50[RU2319502]. Полученный в результате амплификации фрагмент ДНК размером 510 п.о. элюируют из агарозного геля с использованием набора Qiagen (Qiagen, cat.N° 28706), обрабатывают рестриктазами Ncol и Xhol и клонируют в лабораторной плазмиде pUC 18x-GALlppI. В результате получают плазмиду pUC18x-GALlppI-IFN2b. Плазмиду pUC 18x-GALlppI-IFN2b расщепляют по сайтам Ncol и Xhol. Больший из образовавшихся фрагментов ДНК, заключающий векторную часть плазмиды и последовательность, кодирующую пре-про область а- фактора дрожжей, слитую с последовательностью, кодирующей промоторную область гена GAL1 дрожжей, называют фрагментом- 1. Затем, используя для ПЦР праймеры N449 (5 '-atatagatctccagtcaacactacaa) и стандартный обратный pUC-праймер, называемый N169 (5'- gagcggataacaatttcacacagg), амплифицируют фрагмент ДНК плазмиды pUC 18x-GAL 1 ppI-IFN2b, заключающий последовательность про-области α-фактора дрожжей и слитый с ней ген интерферона. Амплифицированный фрагмент ДНК расщепляют по уникальным концевым сайтам Bglll и Xhol и называют фрагментом-2. Затем в результате отжига друг на друга двух синтетических олигонуклеотидов N573 (5'-catgttggaattcg) и N 74 (5'- gatccgaattccaa) получают синтетический адаптер, называемый фрагментом-3. В результате совместного лигирования трех полученных фрагментов ДНК получают плазмиду pUC 18x-GAL lpFF-IFN2b.
Полученная плазмида pUC18x-GALlpFF-IFN2b содержит ген интерферона альфа-2Ь человека, слитый с фрагментом ДНК, кодирующим лидерный полипептид, содержащий в своем составе удвоенную про-область а- фактора дрожжей.
Пример 2. Конструирование гена лидерного полипептида, содержащего утроенную про-область а- фактора дрожжей S. cerevisiae
Конструирование гена лидерного полипептида, содержащего утроенную про-область α-фактора дрожжей S. cerevisiae, проводят с использованием плазмиды pUC18x- GALlpFF-IFN2b (пример 1). Для этого плазмиду pUC 18x- GALlpFF-IFN2b расщепляют по сайтам Ncol и Xhol. Больший из образовавшихся фрагментов ДНК, заключающий векторную часть плазмиды и последовательность промоторной области гена GAL1 дрожжей, слитую с лидерным полипептидом, заключающим удвоенную про-область α-фактора дрожжей, называют фрагментом-4. В результате совместного лигирования трех фрагментов ДНК, фрагментов 2 и 3 (пример 1) и фрагмента- 4 получают плазмиду pUC18x-GALlpFFF-IFN2b.
Полученная плазмида pUC 18x-GAL 1 pFFF-IFN2b содержит ген интерферона альфа-2Ь человека, слитый с фрагментом ДНК, кодирующим лидерный полипептид, содержащий в своем составе утроенную про-область а- фактора дрожжей. Пример 3. Конструирование дрожжевых экспрессионных векторов, несущих ген альфа-2Ь интерферона человека
Конструирование проводят с использованием лабораторного вектора pPDX3, отличающегося от вектора pPDX2 одиночной заменой в последовательности сайта Ncol (ccatgg изменен на ccatga), локализованной в области структурного гена URA3 и не приводящей к инактивации этого гена. Конструирование проводят следующим образом. Hindlll/Xhol фрагмент ДНК вектора pPDX3 лигируют с Hindlll/Xhol фрагментом ДНК плазмиды pUC18x-GALlppI- IFN2b или pUC18x-GALlpFF-IFN2b или pUC18x- GALlpFFF-IFN2b, заключающим последовательности промотора GAL1 и гена интерферона альфа-2Ь человека, слитого с соответствующим лидерным полипептидом. В результате получают экспрессионные вектора pPDX3-F-2b или pPDX3-FF-2b или pPDX3-FFF-2b, соответственно.
Полученные экспрессионные вектора несут в своем составе ген, кодирующий зрелый интерферон альфа-2Ь человека, слитый с последовательностями лидерных полипептидов, заключающих в своем составе одиночную, удвоенную или утроенную про-области -фактора дрожжей, соответственно. Пример 4. Конструирование дрожжевых экспрессионных векторов, несущих ген альфа-2а интерферона человека
Источником гена интерферона альфа-2а человека служит плазмида pUC18x-GALlppI-IFN2a, сконструированная аналогично pUC 18x-GAL 1 pFFF-IFN2b, только вместо праймера N466 используют N617 (agcctaggtagccgtcggtaccttgatgctcctggcacagatgcgtaagatctctctttt). Амплифицированный фрагмент ДНК размером 480 п.о. элюируют из агарозного геля, обрабатывают рестриктазами XmaJI и Xhol и клонируют в плазмиде pUC18x-GALlppI- IFN2b, расщеплённой по тем же сайтам. В ходе конструирования в составе экспрессионных векторов pPDX3-F-2b, pPDX3-FF-2b или pPDX3-FFF-2b ген интерферона альфа-2Ь человека замещают на ген интерферона альфа-2а человека. Для этого из состава вектора pPDX3-F-2b или pPDX3-FF-2b или pPDX3-FFF-2b выщепляют уникальный Ncol/Xhol фрагмент ДНК, включающий ген интерферона альфа-2Ь человека, а оставшуюся векторную часть лигируют с Ncol/Xhol фрагментом ДНК плазмиды pUC18x-GALlppI-IFN2a, кодирующим ген интерферона альфа-2а человека. В результате получают экспрессионные вектора pPDX3-F-2a или pPDX3-FF-2a или pPDX3-FFF-2a, соответственно.
Полученные экспрессионные вектора несут в своем составе ген зрелого интерферона альфа-2а человека, слитый с последовательностями лидерных полипептидов, заключающих в своем составе одиночную, удвоенную или утроенную про-области -фактора дрожжей, соответственно.
Пример 5. Конструирование штаммов дрожжей S. cerevisiae - продуцентов секретируемого альфа-2 интерферона человека
Продуценты секретируемого интерферона альфа-2 человека конструируют на базе штамма S. cerevisiae ВКПМ Y-3550. Для этого сначала клетки штамма ВКПМ Y-3550 освобождают от находящегося в них эписомного вектора. Полученный бесплазмидный штамм называют SCR-8G1.
Клетки бесплазмидного реципиентного штамма SCR- 8G1 трансформируют плазмидой pPDX3-F-2b, или pPDX3- FF-2b, или pPDX3-FFF-2b, или pPDX3-F-2a, или pPDX3-FF- 2а, или pPDX3-FFF-2a. В результате получают штамм SCR- 2b-F, или SCR-2b-FF, или SCR-2b-FFF, или SCR-2a-F, или SCR-2a-FF, или SCR-2a-FFF, соответственно. Для анализа уровня секреции соматотропина клетки полученных штаммов культивируют на среде YPD. Далее, используя метод электрофореза в ПААГ и стандартный протокол ИФА.
Анализируют уровень продукции соматотропина, секретированного в среду культивирования дрожжей. В качестве отрицательного контроля используют штамм D721W/pPDX2.
Для анализа уровня секреции интерферона альфа-2 человека клетки полученных штаммов SCR-F-2b, SCR-2b-FF, SCR-2b-FFF, SCR-2a-F, SCR-2a-FF и SCR-2a-FFF культивируют на среде YPD следующего состава (в мас.%): пептон-2, дрожжевой экстракт -1, глюкоза - 2, агар -2, вода - остальное, в течение 44 часов при 28°С на роторной качалке со скоростью 250 об./мин. Накопление интерферона в культуральной жидкости анализируют, используя метод электрофореза в ПААГ и метод аналитической обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано в патентной заявке.
Результаты анализа (Фиг.) показывают, что штаммы
SCR-2b-FF и SCR-2a-FF, секреция интерферона альфа-2 в которых направляется новыми лидерными полипептидами, заключающих в своем составе удвоенную про-область а- фактора дрожжей, а также штаммы SCR-2b-FFF и SCR-2a- FFF, секреция интерферона альфа-2 в которых направляется новыми лидерными полипептидами, заключающих в своем составе утроенную про-область α-фактора дрожжей, превосходят по продуктивности штаммы SCR-2b-F и SCR- 2a-F, являющиеся аналогами штаммов-прототипов В ПМ Y- 3550 и ВКПМ Y-3564, секреция интерферона альфа-2 в которых направляется стандартной пре-про областью а- фактора дрожжей, в 1.3 и 1.2 раза, соответственно.
Штаммы SCR-2b-FF и SCR-2a-FF депонированы во
Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как штаммы Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y- 3582 и ВКПМ Y-3581 , соответственно.
Пример 6. Микробиологический синтез интерферона альфа-2Ь человека с использованием штамма ВКПМ Y-3582 Для получения посевного материала штамм ВКПМ Y- 3582 выращивают в среде YPD на качалке (250 об/мин) при температуре 28°С в течении 20-24 ч.
50 мл посевного материала используют для засева 3 л ферментёра Anglicon, содержащего 950 мл среды YPD. Ферментацию проводят при температуре 28°С, аэрации 1 л/мин и скорости перемешивания 1000 об/мин. Через 24 ч после засева ферментёра начинают подпитку 50% раствором глюкозы со скоростью 2 мл/ч и устанавливают рН- стартирование культуры на уровне рН6.8, используя для подтитровки растворы 10% серной кислоты и 10% NaOH. Общее время ферментации составляет 72 ч.
Промышленная применимость
Продукция зрелого секретируемого интерферона альфа- 2Ь человека штаммом ВКПМ Y-3582 составляет не менее 550 мг/л. Данный уровень продукции не менее чем на 20%, превосходит уровень синтеза интерферона штаммом- прототипом ВКПМ Y-3550.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения зрелого интерферона альфа-2 человека с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae содержащих эффективный сигнальный пептид и про-область, отличающийся тем, что в состав лидерных полипептидов вместо уникальной про-области вводят комбинацию про-областей, представляющую собой последовательность двух или более про-областей а-фактора дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
2. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y- 3582, - продуцент зрелого секретируемого интерферона альфа-2Ь человека, секрецию которого направляет лидерный полипептид, полученный способом по п. 1, включающий удвоенную про-область α-фактора дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
3. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y- 3581, - продуцент зрелого секретируемого интерферона альфа-2а человека, секрецию которого направляет лидерный полипептид, полученный способом по п. 1 , включающий удвоенную про-область α-фактора дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
PCT/RU2011/000557 2011-03-24 2011-07-26 Способ получения зрелого интерферона альфа-2 человека с использованием дрожжей saccharomyces cerevisiae и штамм - продуцент интерферона альфа-2 человека (варианты) WO2012128662A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011111096 2011-03-24
RU2011111096/10A RU2446172C1 (ru) 2011-03-24 2011-03-24 Способ получения зрелого интерферона альфа-2 человека с использованием дрожжей saccharomyces cerevisiae и штамм-продуцент интерферона альфа-2 человека (варианты)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012128662A1 true WO2012128662A1 (ru) 2012-09-27

Family

ID=46030867

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2011/000557 WO2012128662A1 (ru) 2011-03-24 2011-07-26 Способ получения зрелого интерферона альфа-2 человека с использованием дрожжей saccharomyces cerevisiae и штамм - продуцент интерферона альфа-2 человека (варианты)

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2446172C1 (ru)
WO (1) WO2012128662A1 (ru)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2092561C1 (ru) * 1981-10-19 1997-10-10 Генентек Инк. Способ получения полипептида со свойствами гамма-интерферона человека

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3428370A1 (de) * 1984-08-01 1986-02-13 Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim Interferon, genetische sequenzen, die hierfuer codieren, und diese produzierende organismen
RU1660388C (ru) * 1989-07-13 1995-05-20 Санкт-Петербургский государственный университет Рекомбинантная плазмидная днк pvgib, кодирующая гамма-интерферон быка, способ ее получения и штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae - продуцент гамма-интерферона быка

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2092561C1 (ru) * 1981-10-19 1997-10-10 Генентек Инк. Способ получения полипептида со свойствами гамма-интерферона человека

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
APPL BIOCHEM BIOTECHNOL, vol. 111, no. 3, December 2003 (2003-12-01), pages 129 - 138 *
DATABASE MEDLINE BAYNE M.L. ET AL.: "Expression, purification and characterization of recombinant human insulin-like growth factor I in yeast", Database accession no. 3049246 *
DATABASE MEDLINE CHU J. ET AL.: "Fermentation process optimization of recombinat Saccharomyces cerevisiae for the production of human interferon-alpha2a", Database accession no. 14665733 *
GENE, vol. 66, no. 2, 30 June 1988 (1988-06-30), pages 235 - 44 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2446172C1 (ru) 2012-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6258559B1 (en) Method for producing proteins in transformed Pichia
JP2018522565A (ja) プロモーター変異体
JP7061234B2 (ja) 組換え宿主細胞内での炭素源調節タンパク質産生
US9012367B2 (en) Rapid screening method of translational fusion partners for producing recombinant proteins and translational fusion partners screened therefrom
JP3366339B2 (ja) 高効率発現ベクターを用いてサッカロミセスセレビジエから再組合蛋白質を製造する方法
US8691530B2 (en) Process for obtaining aspart insulin using a Pichia pastoris yeast strain
RU2446172C1 (ru) Способ получения зрелого интерферона альфа-2 человека с использованием дрожжей saccharomyces cerevisiae и штамм-продуцент интерферона альфа-2 человека (варианты)
RU2427645C1 (ru) СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ЗРЕЛОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2 ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ Saccharomyces cerevisiae - ПРОДУЦЕНТ ЗРЕЛОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2 ЧЕЛОВЕКА (ВАРИАНТЫ)
RU2460795C1 (ru) Способ микробиологического синтеза секретируемого соматотропина человека и штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae - продуцент секретируемого соматотропина человека
US6613547B1 (en) Pichia methanolica glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1 promoter and terminator
CN1049249C (zh) 胰岛素前体基因在酵母中的分泌表达和人胰岛素的制备
US6284520B1 (en) Process for the production of proteins
EP3884037A1 (en) A recombinant yeast cell
US6348331B1 (en) Pichia methanolica glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 2 promoter
RU2203950C1 (ru) Штамм дрожжей pichia pastoris - продуцент лейкоцитарного интерферона-16 человека, рекомбинантная плазмидная днк phin и способ ее конструирования
CN1954083B (zh) 用于生产重组蛋白的翻译融合伙伴的快速筛选方法和由此筛选的翻译融合伙伴
HK40054115A (en) Carbon-source regulated protein production in a recombinant host cell
HK40054115B (en) Carbon-source regulated protein production in a recombinant host cell

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11861439

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11861439

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1