WO2012126131A1 - Sistema y método para evaluar cualitativa y cuantitativamente la toxicidad de fármacos, productos y contaminantes químicos, en forma de gases y aerosoles en una muestra de interés - Google Patents

Sistema y método para evaluar cualitativa y cuantitativamente la toxicidad de fármacos, productos y contaminantes químicos, en forma de gases y aerosoles en una muestra de interés Download PDF

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WO2012126131A1
WO2012126131A1 PCT/CL2011/000021 CL2011000021W WO2012126131A1 WO 2012126131 A1 WO2012126131 A1 WO 2012126131A1 CL 2011000021 W CL2011000021 W CL 2011000021W WO 2012126131 A1 WO2012126131 A1 WO 2012126131A1
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WO
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air
controlled exposure
clean air
biological
ambient air
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PCT/CL2011/000021
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Francisco Javier Cereceda Balic
Daniel Enrique Rodriguez Schulz
Ximena Mónica FADIC RUIZ
Victor Juvenal Vidal Cortez
Original Assignee
Universidad Tecnica Federico Santa Maria
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/0098—Plants or trees
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility

Definitions

  • the present invention relates to the toxicological evaluation of drugs, chemicals, chemical contaminants, among others, present in the form of gases and aerosols in a sample of interest. More specifically to a system and method to assess qualitatively and quantitatively the toxicity of drugs, chemicals, chemical contaminants, among others, present in the form of gases and aerosols in a sample of interest.
  • the traditional analysis of toxicity assessment of a sample based on chemical analysis consists in the use of the so-called equivalent toxicity factors (FTE), which results from the extrapolation of the toxicity that a compound usually presents within a family of contaminants similar to which a factor equal to one has been consensually assigned for its greater toxicity.
  • FTE equivalent toxicity factors
  • the other pollutants in this family will have proportional values to this pattern and a defined unit risk value will finally be calculated to assess the health risk of the population defined by the World Health Organization (WHO).
  • WHO World Health Organization
  • the apparatus includes the environmental chambers in which a biological sample is mounted for analysis.
  • the atmosphere inside the chambers can be controlled by providing a specific gas inside the chambers such as a polluted environment or an air pollutant.
  • the physiological activity or the responses of a biological sample to a selected gas or to the manually administered drugs of the chemicals are measured by the apparatus.
  • the collection trays prevent vertical fluidic communication and the perforated shelves allow the animal's waste to pass into the collection tray, thereby preventing the animals from coming into contact with their own waste and preventing the waste from falling on the animals located under a cage.
  • a vertical solution is proposed to the animals available for study.
  • the chamber is capable of: providing a uniform horizontal laminar flow of contaminants, providing a uniform concentration of contaminants, eliminating fecal matter, facilitating the cleaning and repair of the chamber.
  • modular test chambers include the means to generate a
  • a concrete hexagonal geometry is used in tubular test chambers to provide the most advantageous volume in relation to the transport surface of the aerosols through the chambers.
  • the hexagonal chambers are of a flexibility that allows them to be easily stackable at the research site.
  • Experimental animals are kept in the chamber where they can be exposed to fluidized aerosol particles that pass through it. Proposal that solves the issue of homogeneous distribution of aerosols and handling in the use of a large number of animals simultaneously.
  • the present invention relates to the toxicological evaluation of drugs, chemicals, chemical pollutants, among others, present in the form of gases and aerosols in a sample of interest in order to assess their degree of toxicity. It consists of a system and method to evaluate in a qualitative and quantitative way the chemical, physical and / or toxicological quality of a representative sample of: indoor or outdoor environments, drugs, chemicals, Chemical contaminants, among others, present in the form of gases and aerosols. On the other hand, and given the capabilities of this integrated system, it is possible to carry out different practical experiences, both in the laboratory and in the field.
  • Laboratory experiences consist of incorporating into known controlled exposure chambers for toxicological tests a known concentration of an individual chemical compound or complex mixtures of various chemical compounds present: in indoor or outdoor environments, drugs, chemicals, chemical contaminants, among others, in the form of gases or aerosols allowing exposure to increasing levels of concentration or proportions, electronically controlled and reproducible, a biological monitor that reacts sensitively to the toxic chemical compounds to be evaluated and whose specific response can be quantify and relate to a specific dose or concentration for each chemical compound under study. Additionally, within each controlled exposure chamber there will be a chemical monitoring device, for example, an ATD tube, which will allow the actual concentration of the chemical compounds that entered the exposure chamber to be determined qualitatively and quantitatively in situ.
  • a chemical monitoring device for example, an ATD tube
  • field experiences can be evaluated, for this the integrated system must be moved to the place of interest, for example to evaluate the ambient air of an industry or that of a polluted city, and in situ make the corresponding dilutions of the polluted air, with clean air, exposing the biological monitor in the same way to increasing concentrations, electronically controlled and reproducibly, the mixture or mixtures of toxic chemical compounds whose toxicological potential is to be evaluated.
  • Another possibility of this system is the use in the field of a series of additional devices that aim to determine the specific effects of the different physical characteristics, such as humidity, temperature, level of establishment, etc., and / or chemical, as presence of particulate material, ozone, SO 2 , NOx, selected pollutants, etc., specific to a given sample, for example of ambient air, either indoor and / or outdoor, and its effects on a biological monitor, studying these characteristics in a way isolated or synergistic
  • a device that eliminates any of the contaminants to be studied is installed in each of the controlled exposure chambers, for example, presence of material particulate, ozone, SO 2 , NOx, VOCs, COSVs, etc., in order to experience the toxicity effect of all the complexity of the real air sample of a given environment by subtracting the effect of the pollutant to be studied.
  • a first objective of the present invention is a system for qualitatively and quantitatively assessing the toxicity of drugs, chemicals, chemical contaminants, among others, present in the form of gases and aerosols in a sample of interest, comprising a system for qualitatively and quantitatively assessing the toxicity of drugs, chemicals, chemical contaminants, among others, present in the form of gases and aerosols in a sample of interest, comprising a plurality of controlled exposure chambers, an air compressor oil-free clean, an ambient air injection pump containing the chemical compound to be evaluated, a clean air dispenser, a control and operation processor of the plurality of controlled exposure chambers for toxicological tests, a data entry module and a support box for said data entry module and ATD adsorbent tube suction pumps, a sopo rte for ATD adsorbent tube suction pumps, the entire system of controlled exposure chambers for toxicological tests is supported by different mobile structures that allow grouping parts of the system of controlled exposure chambers for toxicological tests according to the place of performance of Toxicological tests
  • each contains a biological monitor, arranged on a platform, which is covered by a controlled exposure camera cover fitted with an o-ring that allows the biological monitor to be isolated from the environment; where the interior of the controlled exposure chamber produces a controlled environment to expose said biological monitor; where the controlled environment is produced through an air mixing inlet to the controlled exposure chamber which is supported by a hollow air mixing inlet bolt; and to take a sample of the indoor air mixture
  • the controlled exposure chamber has an ATD adsorbent tube that is connected to a suction pump by means of a hollow ATD tube bolt that supports the ATD adsorbent tube; an internal pressure sensor is connected by a hollow bolt to the interior of the controlled exposure chamber; and a hollow mixed air outlet bolt allows the circulation of the air mixture that enters through the air mixture inlet.
  • the biological monitor can be any sensitive organism, to drugs, chemical products, chemical contaminants, among others, present in the form of gases and aerosols that will be injected into the system of controlled exposure chambers for toxicological tests and whose specific response can be quantified and It is related to a specific dose for each contaminant under study, such as the Tradescantia biological monitor, which is a superior plant sensitive to genotoxic or mutagenic contaminants, such as some inorganic compounds, heavy metals, volatile organic compounds (VOCs) or semi-volatile ( COSVs), among others, which may be present in real samples of drugs, chemicals, chemical contaminants, among others.
  • VOCs volatile organic compounds
  • COSVs semi-volatile
  • the controlled exposure chamber is fed by a mixture of air through a mixer of ambient air and clean air that is fed by two branches, one of clean air and another of ambient air that contains the chemical compounds to be evaluated, where the Clean air is obtained through an air intake tube, from outside, to the oil-free clean air compressor that feeds a clean air dispenser that is connected to a clean air pressure regulator that delivers a clean air flow to a proportional clean air control valve which is connected to a clean air flow meter that determines the air inlet flow to one of the inputs of the ambient air and clean air mixer; the outside ambient air enters through a tube that feeds the ambient air injector pump containing the chemical compound to be evaluated, which is connected to an ambient air pressure regulator that delivers a flow of ambient air to a proportional air control valve ambient which is connected to an ambient air flow meter that determines the air inlet flow to one of the inputs of the ambient air and clean air mixer; the clean air that feeds a branch of the ambient air and clean air mixer is processed in the clean air dispenser, since only outside air
  • each controlled exposure chamber is carried out by the control and operation processor that sends control signals to the media that make up the controlled exposure chamber; by the clean air branch, it delivers a control signal to the clean air compressor, a control signal to the clean air dispenser, a control signal to a proportional control valve of clean air; a control signal to a clean air flow meter; by the branch of ambient air, the control and operation processor, delivers a control signal to the ambient air injector pump, a control signal to a proportional control valve of ambient air, a control signal to a flow meter of ambient air; In addition, the control and operation processor delivers an internal pressure control signal to an internal pressure sensor, located in each controlled exposure chamber.
  • the plurality of controlled exposure chambers are connected to the outlet of a clean air pressure regulator by means of a clean air distributor that feeds each proportional control valve of clean air; and at the outlet of the ambient air pressure regulator it is connected by an ambient air distributor that feeds each proportional control valve of ambient air; wherein each circuit of the plurality of controlled exposure cameras has its own control and operation signals delivered by the control and operation processor.
  • a second object of the present invention is a method to assess qualitatively and quantitatively 'the toxicity of drugs, chemicals, chemical contaminants, etc., present as gases and aerosols in a sample of interest, comprising comprising the steps of configuring a controlled exposure camera system for toxicological tests with a plurality of biological monitor cameras and respective ATD adsorbent tubes located in each of said controlled exposure cameras and configuring a controlled exposure camera without its controlled exposure camera cover ; where, the ambient air containing the chemical compound to be evaluated, in established and configured proportions, at a constant and proportional concentration of pollutants in the air in a normal way, it will enter the different controlled exposure chambers at a constant flow constantly controlled by a control and operation processor; and when there is a positive internal pressure, the excess air will exit through an outlet, in this way the air will be renewed periodically during the duration of the exposure; initiate sampling for a predetermined time, to evaluate genotoxic compounds; analyze the biological monitors to determine and quantify the changes they suffered when they were exposed to the mixture of ambient air containing the chemical compound
  • the biological monitor is a Tradescantia plant, which is a superior plant sensitive to genotoxic or mutagenic contaminants, such as some inorganic compounds, heavy metals, volatile organic compounds (VOCs) or semi-volatile compounds (COSVs), among others, which may be present in real samples of drugs, chemicals, chemical contaminants, among others.
  • VOCs volatile organic compounds
  • COSVs semi-volatile compounds
  • the stage of analyzing the biological monitors comprises the sub-stages of performing dose response type curves to characterize the response of the biological monitor to a given environment; estimate the level of toxicity of an air sample at different concentration levels from the respective ATD adsorbent tubes; and compare the physical characteristics (humidity, temperature, level of radiation, etc.) and / or chemical (presence of particulate material, ozone, SO 2 , NOx, selected pollutants, etc.) specific to a given sample of air and its effects on a biological monitor
  • the dose response curve is prepared by plotting the response of the Tradescantia biological monitor versus the concentration of contaminants detected in the contaminated ambient air mixture, expressed in number of mutations / 1000 stamen hairs, or number of micronuclei / 100 tetrads; wherein volatile organic compounds are expressed in units of concentration, i.e.
  • the concentration is expressed as the sum of all determined pollutants, for example total VOCs, or as individual compounds, and the dose response curve It is obtained by drawing a graph of two inputs, where the horizontal axis or x-axis represents the Biomonitor response, number of mutations, and on the vertical axis or axis and represents the concentration of the chemical compound detected in the chemical analysis.
  • Biological monitors in the controlled exposure camera system for toxicological tests should be prepared with the following steps of collecting the organisms or biological structures sensitive to contamination in a number that allows statistically ensuring the quality of the results, for example, of 15 to 20 young inflorescences per controlled exposure chamber, for the Tradescantia biological monitor; to condition the biological organisms or structures that have been separated from their breeding or cultivation conditions and that must be subjected to a conditioning period, for example in the case of vegetables, the inflorescences of Tradescantia are conditioned prior to exposure for 12-24 hours leaving them in aerated nutrient solution, under laboratory conditions; and locating the biological monitors between the different controlled exposure cameras, for example, five biological monitors located in each of the controlled exposure cameras, and a sixth biological monitor that is inside a controlled exposure camera without its corresponding camera cover controlled exposure, this last biological monitor being exposed directly to the ambient air of the place to be evaluated, where the biological monitors must remain in the proper medium to ensure their optimal condition during the test, for example in the case of vegetables, in
  • Figure 1 schematically shows the front perspective view of a controlled exposure camera system for testing as an embodiment of the invention.
  • Figure 2 schematically shows the rear perspective view of a controlled exposure camera system for testing as an embodiment of the invention.
  • Figure 3 shows a schematic of the air flow circuit of a controlled exposure chamber of the invention.
  • Figure 4 shows a diagram of the control signals of a controlled exposure chamber of the invention.
  • Figure 5 shows a controlled exposure camera of the invention with its biological monitor.
  • Figure 6 shows a controlled exposure chamber of the invention with its biological monitor, with the detail of its components in explosion.
  • Figure 7 shows a diagram of the control signals of a plurality of controlled exposure cameras of the invention.
  • the invention relates to a controlled exposure camera system for toxicological tests (100), wherein a preferred constructive embodiment is shown in Figures 1 and 2.
  • the controlled exposure camera system for toxicological tests (100) is composed of a plurality controlled exposure chambers (1 0), an oil-free clean air compressor (200), an ambient air injector pump containing the chemical compound to be evaluated (240), a clean air dispenser (210), a processor of control and operation (300) of the controlled exposure camera system for toxicological tests (100), a data entry module (360) and a support box (361) for said data entry module (360) and pumps suction (150) of ATD adsorbent tubes (140), a support (370) for suction pumps (150) of ATD adsorbent tubes (140), the entire system of controlled exposure chambers for toxicological tests (100) is carried by different mobile structures that allow the grouping of the parts of the controlled exposure camera system for toxicological tests (100) according to the location of the toxicological tests.
  • the controlled exposure chamber (1 10) shown in Figures 5 and 6, contains a biological monitor (120), on a platform (170), which is covered by an adjusted controlled exposure chamber lid (115) with an o-ring (160) which allows the biological monitor (120) to be isolated from the environment;
  • the interior of the controlled exposure chamber (1 10) produces a controlled environment to expose to the biological monitor (120).
  • the controlled environment is produced through an air mixing inlet (130) to the controlled exposure chamber (1 10) which is supported by a hollow air mixing inlet bolt (131);
  • an ATD adsorbent tube (140) is connected to a suction pump (150) by means of a hollow ATD tube bolt (141 ) which supports the ATD adsorbent tube (140).
  • An internal pressure sensor (280) is connected by a hollow bolt (281) to the interior of the controlled exposure chamber (1 10);
  • a hollow mixed air outlet bolt (270) allows the circulation of the air mixture entering through the air mixture inlet (130).
  • the biological monitor (120) can be any organism sensitive to drugs, chemicals, chemical contaminants, among others, present in the form of gases and aerosols that will be injected into the system of controlled exposure chambers for toxicological tests (100) and whose Specific response can be quantified and related to a specific dose for each pollutant under study, in this case the Tradescantia biological monitor has been used, which is a superior plant sensitive to genotoxic or mutagenic contaminants, such as some inorganic compounds, metals heavy, volatile organic compounds (VOCs) or semi-volatile (COSVs), among others, which may be present in real samples of drugs, chemicals, chemical contaminants, among others.
  • VOCs volatile organic compounds
  • COSVs semi-volatile
  • the controlled exposure chamber (1 10), as shown in Figure 3, is fed by a mixture of air through a mixer of ambient air and clean air (265) which is fed by two branches, one of clean air and another of ambient air that contains the chemical compounds to evaluate.
  • the clean air is obtained by an air intake tube (205), from outside, to the oil-free clean air compressor (200) that feeds a clean air dispenser (210) that is connected to an air pressure regulator clean (246) that delivers a clean air flow to a proportional clean air control valve (221) which is connected to a clean air flow meter (231) that determines the flow of air inlet to one of the entrances of the ambient air and clean air mixer (265).
  • Outside ambient air enters through a tube (241) that feeds the oil-free ambient air injector pump (240) that is connected to an ambient air pressure regulator (245) that delivers a flow of ambient air to a valve proportional control of ambient air (220) which is connected to an ambient air flow meter (230) that determines the air inlet flow to one of the inputs of the ambient air and clean air mixer (265).
  • a tube 241 that feeds the oil-free ambient air injector pump (240) that is connected to an ambient air pressure regulator (245) that delivers a flow of ambient air to a valve proportional control of ambient air (220) which is connected to an ambient air flow meter (230) that determines the air inlet flow to one of the inputs of the ambient air and clean air mixer (265).
  • the clean air that feeds a branch of the ambient air and clean air mixer (265) is processed in the clean air dispenser (210), since only the outside air enters it, whereby this clean air doser (210 ) has filters necessary to produce pure air by cleaning the air delivered to it by the clean air compressor (200) that is only supplied from outside;
  • Another alternative is to replace the section consisting of the air intake tube (205), the clean air compressor (200) and the clean air dispenser (210), with a bottle of synthetic or pure air, and feeding directly to the regulator of clean air pressure (246).
  • the control and operation processor (300) of the controlled exposure camera system for toxicological tests (100), allows the control and operation of the different means that make up the controlled exposure camera system for toxicological tests (100).
  • each controlled exposure chamber (10), as shown in Figure 4 is carried out by control signals of the means that comprise the controlled exposure chamber (1 10); the control and operation processor (300), by the clean air branch, delivers a control signal (310) to the clean air compressor (200), a control signal (320) to the clean air dispenser (210), a control signal (345) to the proportional control valve of clean air (221); a control signal (355) to the clean air flow meter (231).
  • the control and operation processor (300) delivers a control signal (325) to the ambient air injector pump (240), a control signal (340) to the proportional control valve of ambient air (220), a control signal (350) to the ambient air flow meter (230).
  • the control and operation processor (300) delivers an internal pressure control signal (330) to the internal pressure sensor (280), located in each controlled exposure chamber (1 10).
  • the clean air supply branch has a pair of stopcocks (225) before and after the clean air doser (210), for handling said clean air doser (210).
  • the outlet of the clean air pressure regulator (246) is connected to a clean air distributor (250) which feeds each proportional control valve of clean air (221); and the outlet of the ambient air pressure regulator (245) is connected to an ambient air distributor (260) that feeds each proportional ambient air control valve (220).
  • Each circuit has its own control and operation signals delivered by the control and operation processor (300).
  • the controlled exposure camera system for toxicological tests allows the toxicological evaluation of a given environment by identifying and quantifying the chemical compounds present in the ambient air mixture to which each of the biological monitors is exposed (120) , through a chemical analysis, for example, using ATD adsorbent tubes (140), which contain a series of specific adsorbent polymers to determine classes of VOCs present in the ambient air mixture.
  • ATD adsorbent tubes 140
  • the operation of the controlled exposure camera system for toxicological tests (100) requires an operational preparation, a toxicological evaluation and an analysis of the results.
  • all units that are part of it must be prepared, that is, the equipment itself, the biological monitors that will react to the air to evaluate and the devices to evaluate the chemical quality of the air.
  • Biological monitors are organisms sensitive to toxic chemical compounds that want to be evaluated in ambient (contaminated) air that will be injected into the controlled exposure camera system for toxicological tests (100) and whose specific response is quantified and related at a given dose for each chemical compound under study.
  • the way in which the Tradescantia plants are analyzed in this case is through two types of tests. The first, called the micro nucleus assay or Trad-MCN, is based on the detection and quantification of micro nuclei in the primary tetrads of pollen grains in the final phase of meiosis.
  • the second trial called stadminal hair or TradD-SH, consists in the analysis of the staminal hair cells of the flower, and is based on the fact that the cells of the seminal hairs of Tradescantia plants are heterozygous for their color, and therefore it is possible to detect mutations based on the change in color that they present when they have been exposed to the effects of contamination.
  • the color of these cells changes from a blue color (dominant or normal) to a pink one (recessive or mutant).
  • biological monitors (120) For the use of biological monitors (120) in the controlled exposure camera system for toxicological tests (100), they must be available in abundance for use, which implies that they must be cultivated (plants or microorganisms) and / or reared (in the case of animals) under strict environmental conditions that ensure the absence of polluting substances to which they react.
  • the biological monitors (120) thus cultivated and / or raised, will act as control organisrrjios for all purposes of comparison with those organisms exposed in the system of controlled exposure cameras for toxicological tests (100), both in clean air and in ambient air contaminated.
  • To use the biological monitors (120) in the controlled exposure camera system for toxicological tests (100) the following steps must be followed:
  • the organisms or biological structures sensitive to contamination should be collected in a number that allows statistically ensuring the quality of the results (eg in the case of plants, 15 to 20 young inflorescences per controlled exposure chamber (1 10), for the biological monitor Tradescantia).
  • Biological monitors (120) Preconditioned biological organisms or structures are distributed among the different controlled exposure cameras (1 10), for example, five biological monitors (120) located in each of the controlled exposure cameras (1 10), and a sixth biological monitor (120) that is inside a controlled exposure chamber (1 10) without its corresponding controlled exposure chamber lid (1 15), the latter biological monitor (120) being exposed directly to the air environment of the place to be evaluated.
  • the biological monitors (120) must remain in the proper medium to ensure their optimal condition during the test, for example in the case of vegetables, in a glass containing nutritive solution for the correct maintenance of the tradescantia inflorescences located inside each chamber Controlled exposure (1 10). Subsequently, the tightness of each of the five controlled exposure chambers (10) must be closed and secured.
  • Toxicological evaluation of a complex mixture of drugs, chemicals, chemical contaminants, among others, present in the form of gases and aerosols in a sample of interest using the controlled exposure camera system for toxicological tests (100) involves the identification and quantification of the chemical compounds present in the ambient air mixture to which the biological monitor (120) will be exposed, through a chemical analysis, for example using ATD adsorbent tubes (140), which contain a series of specific adsorbent polymers for certain kinds of VOCs.
  • ATD adsorbent tubes which contain a series of specific adsorbent polymers for certain kinds of VOCs.
  • Within each of the controlled exposure chambers (1 10) of the controlled exposure chambers system for toxicological tests (100) is located one of these ATD adsorbent tubes (140), through which the air mixture it contains the controlled exposure chamber (1 10) corresponding to a constant and predetermined flow, during the entire exposure period.
  • the controlled exposure chamber system for toxicological tests (100) has suction pumps (150) associated with each of the ATD adsorbent tubes (140).
  • the compounds of interest in this case, for example, VOCs, are adsorbed and retained in the polymers of each ATD adsorbent tube (140).
  • each ATD adsorbent tube (140) is analyzed through the technique of "Automatic Thermal Desorption coupled to Gas Chromatography with Mass Spectrometry Detection" (ATD-GC-MS).
  • ATTD-GC-MS Automatic Thermal Desorption coupled to Gas Chromatography with Mass Spectrometry Detection
  • the ATD adsorbent tubes (140) must be packed with specific ad / absorbent polymer resins to retain the analytes of interest, this operation is carried out under strict quality control measures, following a packaging protocol in accordance with EPA recommendations (Method TO-17, Determination of volatile organic compounds in Ambient Air Using Active Sampling Onto Sorbent Tubes).
  • ATD adsorbent tubes (140) before occupying under field conditions, for example ATD adsorbent tubes (140), these must undergo a heating process to eliminate possible traces of volatile organic compounds that may be present, both in the tube and in the ad / absorbent material. This cleaning should be checked by analyzing each of the tubes already conditioned using an automatic thermo desorption system (ATD) attached to a detection system for the compounds under study, such as gas chromatography with mass spectrometry detection (GC-MS).
  • ATD automatic thermo desorption system
  • GC-MS gas chromatography with mass spectrometry detection
  • the identification and quantification of the ambient air pollutant compounds should consider the use of certified standards that allow the identification and quantification of the different compounds under study present in the sample of ambient air to analyze.
  • certified standards that allow the identification and quantification of the different compounds under study present in the sample of ambient air to analyze.
  • An ATD adsorbent tube (140) must be located inside each of the controlled exposure chambers (10) and also one in the location of the controlled exposure chamber (1 10) without the controlled exposure chamber cap (1 15), for process control.
  • the operating conditions (flow) of the suction pumps (150) connected to each of the ATD adsorbent tubes (140) must be defined according to the chemical compounds a analyze and of the previous optimization of the monitoring that has been carried out before its use under field conditions. This implies optimizing, the type and quantity of adsorbent to be used, the operating conditions during monitoring (flow and sampling time), quantity and type of standard, among others.
  • the controlled exposure camera system for toxicological tests (100) is already configured, with the biological monitors (120) and ATD adsorbent tubes (140) located in each of the controlled exposure cameras (1 10) and also in the chamber controlled exposure (1 10) without lid With a controlled exposure chamber (1 15), sampling begins for the predetermined time, for example 8 hours in the case of the use of the Tradescantia biological monitor to evaluate genotoxic compounds.
  • the ambient air containing the chemical compound to be evaluated, in the established and configured proportions, will enter the different controlled exposure chambers (1 10) at a constant flow constantly controlled by the control and operation processor (300).
  • the control and operation processor 300
  • the excess air will exit through an outlet (270), in this way the air will be renewed periodically for the duration of the exposure. It is not a tight test, but in this way it is possible to simulate an exposure of the biological monitor (120) to a constant and proportional concentration of pollutants in the air in a normal way.
  • both the biological monitors (120) and the ATD adsorbent tubes (140) are removed from each of the controlled exposure chambers (1 10) and from the controlled exposure chamber ( 1 10) without the controlled exposure chamber cover (1 15) and taken to the laboratory for further analysis and quantification.
  • the biological monitors (120) must be analyzed to determine and quantify the changes they suffered when they were exposed to the contaminated air mixture, for example, for the Tradescantia plant, two types of evaluation can be carried out:
  • Micro-core bioassay Trad-MCN: the inflorescences are kept in nutrient solution and aerated for 24 hours. Subsequently the flower buds are stored in a solution of acetic acid: alcohol (1: 3) until analysis under a microscope.
  • the buttons In order to identify and quantify the formation of micro nuclei, the buttons must be dissected and stained with a solution that highlights the genetic material of the plant cell, for example, carmine staining. Once a floral button is detected whose primary pollen grains cells are in the tetrad stage they are The identification and counting of micro cores begins. It is necessary to count how many micro cores are in 300 tetrads.
  • Bioassay of state hair (Trad-MCN): the inflorescences are kept in a nutritious and airy solution until the flower buds mature, that is, the flowers open. Every day you should analyze the flowers that opened that day. This procedure is maintained for 7-10 days after the exposure of the biological monitor (120) in the controlled exposure camera system for toxicological tests (100).
  • each of the 6 stamens are carefully separated from each open flower, identifying whether they are stamens associated with a petal or a sepal. They are arranged separately on an object holder, hydrating them with a drop of water. With great care, the stamen hairs of each of them are separated or "combed", in order to facilitate the observation of the cells that compose them and the counting of the number of seminal hairs with a stereoscopic magnifying glass. During the analysis, pink cells are identified and counted, that is, mutated. The results are expressed in number of mutations in one thousand stamen hairs. This bioassay is more recommended when using clones of the vegetable Tradescantia, for example clone KU-20. Analysis of the chemical compounds present in the ambient air mixture
  • the medium used to determine the chemical quality of the ambient air mixture (contaminated) must be analyzed in the laboratory, for example, the ATD adsorbent tubes (140) for the determination and quantification of VOCs.
  • the analysis of the VOC samples (C6-C12) is carried out, for example, with state-of-the-art technology using an automatic thermal desorption equipment called TurboMatrix ATD coupled to a Gas chromatograph for example with Clarus 500 mass spectrometry detection (ATD-GD-MS), Perkin Elmer, USA.
  • the ATD-GC-MS system has the advantage that the analysis is carried out automatically under controlled conditions and the samples do not require a previous stage of treatment which allows the decrease of indeterminate errors associated with any analytical process, the use of chemical reagents, energy savings, time and the final cost of the analysis, generating a much more environmentally friendly procedure.
  • the construction of the dose response curve is prepared by plotting the response of the biological monitor (120) versus the concentration of contaminants detected in the mixture of ambient air (contaminated), for example, for the biological monitor Tradescantia, expressed in number of mutations / 1000 stamenal hairs, if the Trad-SH bioassay was counted, or number of micro nuclei / 100 tetrads, if the Trad-MCN bioassay was counted.
  • Volatile organic compounds are expressed in units of concentration, ie mass / volume of air, for example nanograms of VOCs / cubic meters of air.
  • the concentrations can be expressed as the sum of all the determined pollutants (total VOCs) or as individual compounds, if the chemical analysis is sufficiently sensitive and allows, for example, nanograms of toluene / cubic meters of air.
  • the dose response curve is obtained by drawing a graph of two inputs, where the biomonitor response, number of mutations, and the vertical axis or axis are represented on the horizontal axis or x-axis and the concentration of the chemical compound detected in the Chemical analysis.
  • (100) can be operated in the same way as described in the previous paragraphs either under laboratory conditions or in the field under conditions of exposure to polluted air in indoor or outdoor environments, either for i) conducting curves of the type dose response to characterize the response of the biological monitor (120) to a given environment, ii) estimate the level of toxicity of an air sample at different concentration levels, iii) compare the physical characteristics (humidity, temperature, level of radiation , etc.) and / or chemical (presence of particulate material, ozone, SO2, NOx, selected pollutants, etc.) specific to a specific sample of air and its effects on a biological monitor (120), whether these characteristics are studied in an isolated or synergistic manner.
  • the purpose of the controlled exposure camera system for toxicological tests (100) is to determine the response capacity of the biological monitor (120) to the concentration of a particular pollutant or a group of them in mixture, in a specific environment to be studied. , for example, in a chemical paint industry.
  • the environment to be characterized must first be selected, either indoor and / or outdoor, then the mixing proportions with which the dose-response curve will be carried out, as well as the flow of the ATD adsorbent tube monitoring (140) according to the expected concentration levels for the contaminants under study. Subsequently, the test should be performed as described in the previous paragraphs and obtain both the dose-response curve for the mixture of specific pollutants of that ambient air, and the concentration of pollutants of that mixture to which the monitor was exposed. biological. With this information, it can be determined whether the biological monitor (120) is in a position to be used massively as a standardized system for monitoring the toxicological quality of the ambient air studied.
  • the previous procedure can be repeated until the effective response thresholds of the biological monitor (120) are determined to allow its use as a standardized monitoring system.
  • this study, as well as the standardization and use of the biological monitor (120) as a standardized monitoring system is something absolutely specific for each particular ambient air that you want to study, for example for each type of industry or urban air to be monitored. Additionally, any change in the type or concentration of the pollutant (s) found in the initial characterization, forces to perform again the process of standardization of the biological monitor (120) as an environmental monitoring system.
  • the controlled exposure chamber system for toxicological tests allows to determine the level of toxicity of an air sample, either indoor and / or outdoor, at different concentration levels.
  • the toxicity of a given air sample is given by the chemical quality of a particular pollutant or a group of them in admixture in a specific environment to be studied, for example, a chemical industry or the ambient air of a city.
  • the controlled exposure camera system for toxicological tests allows the use of a series of additional devices that aim to determine the specific effects of different physical characteristics, such as humidity, temperature, level of radiation, etc., and / or chemical , such as the presence of particulate material, ozone, S0 2 , NOx, selected pollutants, etc., specific to a given sample of ambient air, whether indoor and / or outdoor, and its effects on a biological monitor (120), and Whether these characteristics are studied in isolation or synergy.
  • physical characteristics such as humidity, temperature, level of radiation, etc.
  • chemical such as the presence of particulate material, ozone, S0 2 , NOx, selected pollutants, etc.
  • the level of toxicity of an air sample depends among other things on the multiple pollutants that coexist in it, as well as its physical characteristics, so that a systematic and isolated study of each of these characteristics is desirable for Verify its influence and / or impact on toxicity by exposing a biological monitor under controlled conditions (120).
  • the controlled exposure camera system for toxicological tests (100) is installed in situ at the study site, where in each of the controlled exposure cameras (110) there is a device that allows eliminating any of the The pollutants to be studied, for example, presence of particulate material, ozone, S0 2> NOx, VOCs, COSVs, etc., in order to experience the toxicity effect of all the complexity of the real air sample of a given environment subtracting the effect of the contaminant to study.
  • the toxicological impact of this pollutant under study can be estimated, under field conditions and by comparing in parallel the impact of the other pollutants under analysis, as many as controlled exposure chambers (110) are available, in order to obtain the maximum of information on the toxicity of a complex sample of ambient air.
  • This procedure can also be performed by studying critical physical variables such as humidity, temperature, level of location, etc., for the same purpose or even combining physical and chemical variables to obtain more information.
  • the positive control effect is the biological monitor (120) directly exposed to the real ambient air and the negative control effect is the biological monitor (120) exposed inside a chamber of the controlled exposure camera system for toxicological tests ( 100) to which only pure air is delivered during the test.

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Abstract

Sistema y método de cámaras de exposición controlada electrónicamente que permite exponer monitores biológicos y dispositivos de monitoreo químico a niveles de concentración creciente o en proporciones de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros, presentes en forma de gases y aerosoles en una muestra de interés, de manera simultánea y reproducible. En cada una de las cámaras de exposición la respuesta específica de los monitores biológicos se puede cuantificar y relacionar con la dosis o concentración determinada para cada compuesto químico presente dentro de la misma cámara y posteriormente detectado en el análisis químico. La integración de la información obtenida a partir de cada una de las cámaras de exposición de la invención, permite construir una curva dosis-respuesta de la muestra de interés analizada. La invención puede ser transportada y utilizada en diversos ambientes, lo que permite evaluaciones de toxicidad in situ.

Description

SISTEMA Y MÉTODO PARA EVALUAR CUALITATIVA Y CUANTITATIVAMENTE LA TOXICIDAD DE FÁRMACOS, PRODUCTOS Y CONTAMINANTES QUÍMICOS, EN FORMA DE GASES Y AEROSOLES EN UNA MUESTRA DE INTERÉS
CAMPO DE APLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a la evaluación toxicológica de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros, presentes en forma de gases y aerosoles en una muestra de interés. Más específicamente a un sistema y método para evaluar en forma cualitativa y cuantitativa la toxicidad de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros, presentes en forma de gases y aerosoles en una muestra de interés.
DESCRIPCIÓN DEL ARTE PREVIO
Las evaluaciones de la calidad del aire que actualmente se realizan en Chile y en el mundo en general, se hacen tomando como base el cumplimiento de la normativa existente, la cual cuando mucho considera la identificación y cuantificación de las especies químicas (contaminantes) en forma individual, ya sea en el aire o en otras matrices ambientales, como suelo, agua o biota. Cuando se desea realizar la evaluación toxicológica de un ambiente determinado, se vuelve a cometer el error de determinar contaminantes en forma individual, sin tomar en cuenta los sinergismos o antagonismos que se pudieran producir entre los distintos compuestos químicos presentes en una muestra ambiental. El análisis tradicional de evaluación de la toxicidad de una muestra basado en el análisis químico consiste en la utilización de los denominados factores de toxicidad equivalente (FTE), que resulta de la extrapolación de la toxicidad que presenta generalmente un compuesto dentro de una familia de contaminantes similares a los cuales se le ha asignado consensuadamente por su mayor toxicidad un factor igual a uno. De esta forma los demás contaminantes de esta familia tendrán valores proporcionales a este patrón y se calculará finalmente un valor de riesgo unitario definido para evaluar el riesgo sobre la salud de la población definido por la Organización Mundial de la Salud (OMS). Esta aproximación a la toxicidad de una mezcla compleja de contaminantes obviamente adolece de múltiples deficiencias y aproximaciones, pero es al menos una primera evaluación cuantitativa al problema. Desde este punto de vista y tratándose de una cuestión tan importante como la evaluación de la salud de la población, sería deseable desarrollar nuevos métodos o tecnologías para realizar una evaluación toxicológica más apropiada y confiable, que pudiera dar cuenta en forma efectiva, in situ e in vivo de la toxicidad real de una mezcla compleja de contaminantes en un determinado lugar o para un determinado compartimiento ambiental deseado.
La patente de invención US 3,703, 101 , de fecha 21 .1 1 .1972, titulada
"Apparatus For Sensitive Measurement And Recording Of Physiological Activity", de Roy Pence, describe un aparato para la medición sensible y grabación de las respuestas y actividad en una muestra biológica útil para la investigación toxicológica y farmacológica de fármacos, de productos químicos y de ambientes gaseosos. El aparato incluye las cámaras ambientales en las cuales una muestra biológica se monta para el análisis. La atmósfera dentro de las cámaras puede ser controlada proporcionando un gas concreto dentro de las cámaras tales como un entorno contaminado o un contaminante del aire. La actividad fisiológica o las respuestas de una muestra biológica a un gas seleccionado o a los fármacos manualmente administrados de los productos químicos son medidas por el aparato.
Es un aparato capaz de detectar y registrar las respuestas fisiológicas de especímenes expuestos a determinados gases, utilizando un transductor piezoeléctrico.
La solicitud de patente de invención US 4,305,347, de fecha 15.12.1981 , titulada "Inhalation Toxicology Chamber", de D. Hemenway y Linwood Stedman, describe un sistema de cámaras de niveles múltiples para la investigación de la toxicología de la inhalación de un animal. Tiene un recinto estanco encerrado que define un recinto central vertical con un orificio de entrada y un orificio de salida en sus extremos opuestos. Una pluralidad de estantes perforados horizontalmente que están dispuestos verticalmente espaciados con bandejas de recolección para las jaulas portadoras del animal de laboratorio en una pluralidad de niveles. El aire se distribuye por el orificio de entrada al orificio de salida a través de las jaulas de los animales en dirección horizontal. Las bandejas de la recolección impiden la comunicación fluídica vertical y los estantes perforados permiten el paso de los residuos del animal en la bandeja de recolección, de tal modo impidiendo que los animales entren en contacto con sus propios residuos e impiden que los residuos caigan sobre los animales localizados debajo de una jaula. Se propone una solución vertical a la disposición de los animales en estudio. La cámara es capaz de: proveer un flujo laminar horizontal uniforme de contaminantes, proveer una concentración uniforme de contaminantes, eliminar las materias fecales, facilitar las labores de limpieza y reparación de la cámara.
La patente de invención US 4,781 , 146, de fecha 01 .1 1 .1988, titulada "Aerosol
Testing Chamber For Experimental Animáis", de Charles Spengler, describe un aparato y método para el ensayo de aerosoles en animales experimentales. En una disposición, cámaras modulares del ensayo incluyen los medios para generar un
I
lecho fluido de las partículas del aerosol como método más confiable y el aparato para evaluar los efectos de aerosoles ambientales. Una geometría hexagonal concreta se emplea en cámaras tubulares del ensayo para proporcionar el volumen más ventajoso en relación a la superficie de transporte de los aerosoles a través de las cámaras. Las cámaras hexagonales son de una flexibilidad que posibilita que sean fácilmente apilable en el sitio de la investigación. Los animales experimentales son mantenidos en la cámara donde pueden ser expuestos a partículas de aerosol fluidizadas que pasan a través de ella. Propuesta que soluciona el tema de la distribución homogénea de aerosoles y del manejo en la utilización de un gran número de animales simultáneamente.
La patente de invención US 6,904,912, de fecha 14.06.2005, titulada "Automatered Inhalation Toxicolpgy Exposure System", de Chad Roy y Justin Hartings, describe un sistema diseñado para hacer más reproducible los experimentos toxicológicos de inhalación con animales, por la vía de calcular la dosis recibida por el animal. Sensa y controla, sin especificar cómo, parámetros físicos, flujos, concentraciones, etc.. Se trata de una propuesta más bien de tipo conceptual de cómo debiera diseñarse un sistema integral para realizar estudios toxicológicos vía inhalación con animales. Los documentos citados no describen ni resuelven el trabajo de multicámaras con muestras reales de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros, presentes en forma de gases y aerosoles, tanto en ambientes de exterior como interior, con un control automático en el manejo de los flujos de entrada a las cámaras empleando biomonitores, con distintas dosis de muestras reales de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, todo en paralelo y con un monitoreo cuantitativo y cualitativo de dichas muestras reales de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos y de lo que sucede en cada cámara, verificando el funcionamiento correcto de parámetros de control durante el experimento, empleando biomonitores vegetales.
Es justamente esta necesidad la que ha motivado el desarrollo de una técnica de evaluación toxicológica de muestras de gases y aerosoles, de forma cualitativa y cuantitativa a través de la utilización de organismos vivos sensibles a compuestos químicos presentes en muestras reales de fármacos, productos químicos industriales, contaminantes químicos tóxicos, denominados biomonitores, como por ejemplo vegetales superiores como Tradescantia pallida, los cuales son capaces de reaccionar ante una mezcla compleja de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros, presentes en forma de gases y aerosoles en una muestra. Con esta tecnología se evita la evaluación del potencial toxicológico de estos contaminantes en forma separada y desagregada, y poder determinar finalmente in situ e in vivo en forma apropiada y confiable el riesgo de exposición a contaminantes tóxicos presentes en muestras reales de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos sobre la salud de la población.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a la evaluación toxicológica de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros, presentes en forma de gases y aerosoles en una muestra de interés con la finalidad de evaluar su grado de toxicidad. Consiste en un sistema y método para evaluar en forma cualitativa y cuantitativa la calidad química, física y/o toxicológica de una muestra representativa de: ambientes de interior o de exterior, fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros, presentes en forma de gases y aerosoles. Por otra parte, y dadas las capacidades de este sistema integrado, es posible realizar en él distintas experiencias prácticas, tanto de laboratorio como en terreno. Las experiencias de laboratorio consisten en incorporar dentro de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos una concentración conocida de un compuesto químico individual o mezclas complejas de varios compuestos químicos presentes: en ambientes de interior o de exterior, fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros, en la forma de gases o aerosoles permitiendo exponer a niveles de concentración creciente o en proporciones, controladas electrónicamente y en forma reproducible, un monitor biológico que reacciona en forma sensible a los compuestos químicos tóxicos que se quieren evaluar y cuya respuesta específica se puede cuantificar y relacionar a una dosis o concentración determinada para cada compuesto químico en estudio. Adicionalmente, dentro de cada cámara de exposición controlada existirá un dispositivo de monitoreo químico, por ejemplo, un tubo de ATD, que permitirá determinar y corroborar cualitativa y cuantitativamente in situ la concentración real de los compuestos químicos que ingresaron a la cámara de exposición. Alternativamente, se pueden evaluar experiencias en terreno, para esto se debe trasladar el sistema integrado al lugar de interés, por ejemplo para evaluar el aire ambiente de una industria o el de una ciudad contaminada, e in situ realizar las correspondientes diluciones del aire contaminado, con aire limpio logrando exponer de igual manera el monitor biológico a concentraciones crecientes, controladas electrónicamente y en forma reproducible el o las mezclas de compuestos químicos tóxicos cuyo potencial toxicológico se desea evaluar. Otra posibilidad de este sistema es la utilización en terreno de una serie de dispositivos adicionales que tienen por objetivo determinar los efectos específicos de las distintas características física, como humedad, temperatura, nivel de radicación, etc., y/o químicas, como presencia de material particulado, ozono, SO2, NOx, contaminantes seleccionados, etc., específicas de una muestra determinada, por ejemplo de aire ambiente, ya sea de interior y/o exterior, y sus efectos sobre un monitor biológico, estudiándose estas características de forma aislada o sinérgica. Para esto, se instala en cada una de las cámara de exposición controlada un dispositivo que permite eliminar alguno de los contaminantes a estudiar, por ejemplo, presencia de material particulado, ozono, SO2, NOx, COVs, COSVs, etc, de forma tal de experimentar el efecto de la toxicidad de toda la complejidad de la muestra de aire real de un ambiente determinado sustrayendo el efecto del contaminante a estudiar. De este modo, se puede estimar el impacto toxicológico de este contaminante en estudio, bajo condiciones de campo y en forma asilada, permitiendo evaluar su potencial toxicológico in situ y sobre un ser vivo, aspecto muy importante para poder sacar conclusiones de los efectos sobre la salud y seguridad de las personas.
Por lo tanto, un primer objetivo de la presente invención es un sistema para evaluar en forma cualitativa y cuantitativa la toxicidad de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros, presentes en forma de gases y aerosoles en una muestra de interés, que comprende un sistema para evaluar en forma cualitativa y cuantitativa la toxicidad de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros, presentes en forma de gases y aerosoles en una muestra de interés, que comprende una pluralidad de cámaras de exposición controlada, un compresor de aire limpio libre de aceite, una bomba inyectora de aire ambiente conteniendo el compuesto químico a evaluar, un dosificador para aire limpio, un procesador de control y operación de la pluralidad de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos, un módulo de ingreso de datos y una caja soporte para dicho módulo de ingreso de datos y bombas de aspiración de tubos adsorbentes ATD, un soporte para bombas de aspiración de tubo adsorbentes ATD, todo el sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos está soportado por distintas estructuras móviles que permiten agrupar las partes del sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos de acuerdo con el lugar de realización de los ensayos toxicológicos.
Donde la pluralidad de cámaras de exposición controlada, cada una, contiene un monitor biológico, dispuesto sobre una plataforma , que está cubierta por una tapa de cámara de exposición controlada ajustada con un o-ring que permite aislar al monitor biológico del medio ambiente; donde el interior de la cámara de exposición controlada produce un ambiente controlado para exponer a dicho monitor biológico; donde el ambiente controlado se produce a través de una entrada de mezcla de aire a la cámara de exposición controlada el cual está soportado por un perno hueco de entrada de mezcla de aire; y para tomar una muestra de la mezcla de aire al interior de la cámara de exposición controlada se dispone de un tubo adsorbente ATD que se conecta a una bomba de aspiración mediante un perno hueco tubo ATD que soporta al tubo adsorbentes ATD; un sensor de presión interna se conecta mediante un perno hueco al interior de la cámara de exposición controlada; y un perno hueco de salida de aire mezclado permite la circulación de la mezcla de aire que ingresa por la entrada de mezcla de aire. El monitor biológico puede ser cualquier organismo sensible, a fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros, presentes en forma de gases y aerosoles que serán inyectados en el sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos y cuya respuesta específica se puede cuantificar y se relaciona a una dosis determinada para cada contaminante en estudio, como por ejemplo, el monitor biológico Tradescantia, que es un vegetal superior sensible a contaminantes genotoxicos o mutagénicos, como algunos compuestos inorgánicos, metales pesados, compuestos orgánicos volátiles (COVs) o semivolátiles (COSVs), entre otros, los cuales pueden estar presentes en muestras reales de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros. La cámara de exposición controlada es alimentada por una mezcla de aire a través de un mezclador de aire ambiente y aire limpio que es alimentado por dos ramas, una de aire limpio y otra de aire ambiente que contiene los compuestos químicos a evaluar, en donde el aire limpio se obtiene mediante un tubo de ingreso de aire, del exterior, al compresor de aire limpio libre de aceite que alimenta un dosificador de aire limpio que está conectado a un regulador de presión de aire limpio que entrega un flujo de aire limpio a una válvula de control proporcional de aire limpio el que está conectado a un medidor de flujo de aire limpio que determina el flujo de entrada de aire hasta una de las entradas del mezclador de aire ambiente y aire limpio; el aire ambiente del exterior ingresa por un tubo que alimenta la bomba inyectora de aire ambiente conteniendo el compuesto químico a evaluar, que está conectado a un regulador de presión de aire ambiente que entrega un flujo de aire ambiente a una válvula de control proporcional de aire ambiente el que está conectado a un medidor de flujo de aire ambiente que determina el flujo de entrada de aire hasta una de las entradas del mezclador de aire ambiente y aire limpio; el aire limpio que alimenta una rama del mezclador de aire ambiente y aire limpio es procesado en el dosificador de aire limpio, ya que sólo le ingresa el aire del exterior, por lo cual este dosificador de aire limpio cuenta con filtros necesarios para producir aire puro limpiando el aire que le entrega el compresor de aire limpio que sólo es alimentado del exterior o por una botella de aire sintético o puro, alimentando directamente al regulador de presión de aire limpio. El control y operación de cada cámara de exposición controlada, es llevado a cabo por el procesador de control y operación que envía señales de control a los medios que componen la cámara de exposición controlada; por la rama de aire limpio, entrega una señal de control al compresor de aire limpio, una señal de control al dosificador de aire limpio, una señal de control a una válvula de control proporcional de aire limpio; una señal de control a un medidor de flujo de aire limpio; por la rama de aire ambiente, el procesador de control y operación, entrega una señal de control a la bomba inyectora de aire ambiente, una señal de control a una válvula de control proporcional de aire ambiente, una señal de control a un medidor de flujo de aire ambiente; además, el procesador de control y operación entrega una señal de control de presión interna a un sensor de presión interna, ubicado en cada cámara de exposición controlada. La pluralidad de las cámaras de exposición controlada, están conectadas a la salida de un regulador de presión de aire limpio mediante un distribuidor de aire limpio que alimenta a cada válvula de control proporcional de aire limpio; y en la salida del regulador de presión de aire ambiente está conectado mediante un distribuidor de aire ambiente que alimenta cada válvula de control proporcional de aire ambiente; en donde cada circuito de la pluralidad de las cámaras de exposición controlada tiene sus propias señales de control y operación entregadas por el procesador de control y operación.
Un segundo objetivo de la presente invención es un método para evaluar en forma cualitativa y cuantitativa ' la toxicidad de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros, presentes en forma de gases y aerosoles en una muestra de interés, que comprende porque comprende las etapas de configurar un sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos con una pluralidad de cámaras monitores biológicos y respectivos tubos adsorbentes ATD ubicados en cada una de dichas cámaras de exposición controlada y configurar una cámara de exposición controlada sin su tapa de cámara de exposición controlada; en donde, el aire ambiente conteniendo el compuesto químico a evaluar, en proporciones establecidas y configuradas, a una concentración constante y proporcional de contaminantes en el aire en forma normal, irá ingresando a las distintas cámaras de exposición controlada a un flujo constante controlado constantemente por un procesador de control y operación; y cuando haya una presión interna positiva, el exceso de aire saldrá por una salida, de esta manera el aire se irá renovando periódicamente mientras dure la exposición; iniciar un muestreo por un tiempo predeterminado, para evaluar compuestos genotóxicos; analizar los monitores biológicos para determinar y cuantificar los cambios que sufrieron al estar expuestos a la mezcla de aire ambiente conteniendo el compuesto químico a evaluar; y analizar los respectivos tubos adsorbentes ATD. Donde el monitor biológico es una planta Tradescantia, que es un vegetal superior sensible a contaminantes genotóxicos o mutagénicos, como algunos compuestos inorgánicos, metales pesados, compuestos orgánicos volátiles (COVs) o semivolátiles (COSVs), entre otros, los cuales pueden estar presentes en muestras reales de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros. La etapa de analizar los monitores biológicos comprende las subetapas de realizar curvas del tipo dosis respuesta para caracterizar la respuesta del monitor biológico a un ambiente determinado; estimar el nivel de toxicidad de una muestra de aire en diferentes niveles de concentración a partir de los respectivos tubos adsorbentes ATD; y comparar las características físicas (humedad, temperatura, nivel de radicación, etc) y/o químicas (presencia de material particulado, ozono, SO2, NOx, contaminantes seleccionados, etc) específicas de una muestra determinadas de aire y sus efectos sobre un monitor biológico. La curva dosis respuesta se elabora graficando la respuesta del monitor biológico Tradescantia versus la concentración de contaminantes detectados en la mezcla de aire ambiente contaminado, expresada en número de mutaciones/1000 pelos estaminales, o número de micronúcleos /100 tétradas; en donde los compuestos orgánicos volátiles se expresan en unidades de concentración, es decir masa/volumen de aire, y la concentración se expresa como la suma de todos los contaminantes determinados, por ejemplo COVs totales, o como compuestos individuales, y la curva dosis respuesta se obtiene dibujando un gráfico de dos entradas, donde en el eje horizontal o eje x se representa la respuesta del biomonitor, número de mutaciones, y en el eje vertical o eje y se representa la concentración del compuesto químico detectado en el análisis químico.
Los monitores biológicos en el sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos deben prepararse con los siguientes pasos de recolectar los organismos o las estructuras biológicas sensibles a la contaminación en un número tal que permita asegurar estadísticamente la calidad de los resultados, por ejemplo, de 15 a 20 inflorescencias jóvenes por cámara de exposición controlada, para el monitor biológico Tradescantia; acondicionar los organismos o estructuras biológicas que han sido separadas de sus condiciones de crianza o cultivo y que deben ser sometidos a un período de acondicionamiento, por ejemplo en el caso de vegetales, las inflorescencias de Tradescantia se acondicionan previo a la exposición durante 12-24 horas dejándolas en solución nutritiva aireada, en condiciones de laboratorio; y ubicar los monitores biológicos entre las distintas cámara de exposición controlada, por ejemplo, cinco monitores biológicos ubicados en cada una de las cámara de exposición controlada, y un sexto monitor biológico que está dentro de una cámara de exposición controlada sin su correspondiente tapa de cámara de exposición controlada, quedando este último monitor biológico expuesto directamente al aire ambiente del lugar que se va a evaluar, en donde, los monitores biológicos deben permanecer en el medio adecuado para asegurar su óptima condición mientras dure el ensayo, por ejemplo en el caso de vegetales, en un vaso conteniendo solución nutritiva para la correcta mantención de las inflorescencias de Tradescantia ubicado dentro de cada cámara de exposición controlada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La figura 1 muestra esquemáticamente la vista frontal en perspectiva de un sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos como una realización de la invención.
En la figura 2 muestra esquemáticamente la vista trasera en perspectiva de un sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos como una realización de la invención. La figura 3 muestra un esquema del circuito de flujos de aire de una cámara de exposición controlada de la invención.
En la figura 4 muestra un diagrama de las señales de control de una cámara de exposición controlada de la invención.
La figura 5 muestra una cámara de exposición controlada de la invención con su monitor biológico.
La figura 6 muestra una cámara de exposición controlada de la invención con su monitor biológico, con el detalle de sus componentes en explosión.
La figura 7 muestra un diagrama de las señales de control de una pluralidad de cámaras de exposición controlada de la invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a un sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100), en donde una realización constructiva preferida se muestra en las figuras 1 y 2. El sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) se compone de una pluralidad cámaras de exposición controlada (1 0), un compresor de aire limpio libre de aceite (200), una bomba inyectora de aire ambiente conteniendo el compuesto químico a evaluar (240), un dosificador para aire limpio (210), un procesador de control y operación (300) del sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100), un módulo de ingreso de datos (360) y una caja soporte (361) para dicho módulo de ingreso de datos (360) y bombas de aspiración (150) de tubos adsorbentes ATD (140), un soporte (370) para bombas de aspiración (150) de tubo adsorbentes ATD (140), todo el sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) está soportado por distintas estructuras móviles que permiten agrupar las partes del sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) de acuerdo con el lugar de realización de los ensayos toxicológicos.
La cámara de exposición controlada (1 10), que se enseña en las figuras 5 y 6, contiene un monitor biológico (120), sobre una plataforma (170), que está cubierta por una tapa de cámara de exposición controlada (115) ajustada con un o-ring (160) que permite aislar al monitor biológico (120) del medio ambiente; el interior de la cámara de exposición controlada (1 10) produce un ambiente controlado para exponer al monitor biológico (120). El ambiente controlado se produce a través de una entrada de mezcla de aire (130) a la cámara de exposición controlada (1 10) el cual está soportado por un perno hueco de entrada de mezcla de aire (131 ); para tomar una muestra de la mezcla de aire al interior de la cámara de exposición controlada (1 10) se dispone de un tubo adsorbentes ATD (140) que se conecta a una bomba de aspiración (150) mediante un perno hueco tubo ATD (141 ) que soporta al tubo adsorbentes ATD (140). Un sensor de presión interna (280) se conecta mediante un perno hueco (281 ) al interior de la cámara de exposición controlada (1 10); un perno hueco de salida de aire mezclado (270) permite la circulación de la mezcla de aire que ingresa por la entrada de mezcla de aire (130).
El monitor biológico (120) puede ser cualquier organismo sensible, a fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros, presentes en forma de gases y aerosoles que serán inyectados en el sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) y cuya respuesta específica se puede cuantificar y se relaciona a una dosis determinada para cada contaminante en estudio, en este caso se ha empleado el monitor biológico Tradescantia, que es un vegetal superior sensible a contaminantes genotóxicos o mutagénicos, como por ejemplo, algunos compuestos inorgánicos, metales pesados, compuestos orgánicos volátiles (COVs) o semivolátiles (COSVs), entre otros, los cuales pueden estar presentes en muestras reales de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros.
La cámara de exposición controlada (1 10), como se muestra en la figura 3, es alimentada por una mezcla de aire a través de un mezclador de aire ambiente y aire limpio (265) que es alimentado por dos ramas, una de aire limpio y otra de aire ambiente que contiene los compuestos químicos a evaluar. El aire limpio se obtiene mediante un tubo de ingreso de aire (205), del exterior, al compresor de aire limpio libre de aceite (200) que alimenta un dosificador de aire limpio (210) que está conectado a un regulador de presión de aire limpio (246) que entrega un flujo de aire limpio a una válvula de control proporcional de aire limpio (221 ) el que está conectado a un medidor de flujo de aire limpio (231 ) que determina el flujo de entrada de aire hasta una de las entradas del mezclador de aire ambiente y aire limpio (265). El aire ambiente del exterior ingresa por un tubo (241) que alimenta la bomba inyectora de aire ambiente libre de aceite (240) que está conectado a un regulador de presión de aire ambiente (245) que entrega un flujo de aire ambiente a una válvula de control proporcional de aire ambiente (220) el que está conectado a un medidor de flujo de aire ambiente (230) que determina el flujo de entrada de aire hasta una de las entradas del mezclador de aire ambiente y aire limpio (265). El aire limpio que alimenta una rama del mezclador de aire ambiente y aire limpio (265) es procesado en el dosificador de aire limpio (210), ya que sólo le ingresa el aire del exterior, por lo cual este dosificador de aire limpio (210) cuenta con filtros necesarios para producir aire puro limpiando el aire que le entrega el compresor de aire limpio (200) que sólo es alimentado del exterior; otra alternativa es reemplazar la sección compuesta por el tubo de ingreso de aire (205), el compresor de aire limpio (200) y el dosificador de aire limpio (210), por una botella de aire sintético o puro, y alimentando directamente al regulador de presión de aire limpio (246).
El procesador de control y operación (300) del sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100), permite el control y operación de los diferentes medios que componen el sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100).
El control y operación de cada cámara de exposición controlada ( 10), como se muestra en la figura 4, es llevado a cabo por señales de control de los medios que componen la cámara de exposición controlada (1 10); el procesador de control y operación (300), por la rama de aire limpio, entrega una señal de control (310) al compresor de aire limpio (200), una señal de control (320) al dosificador de aire limpio (210), una señal de control (345) a la válvula de control proporcional de aire limpio (221 ); una señal de control (355) al medidor de flujo de aire limpio (231 ). Por la rama de aire ambiente, el procesador de control y operación (300), entrega una señal de control (325) a la bomba inyectora de aire ambiente (240), una señal de control (340) a la válvula de control proporcional de aire ambiente (220), una señal de control (350) al medidor de flujo de aire ambiente (230). Además, el procesador de control y operación (300) entrega una señal de control de presión interna (330) al sensor de presión interna (280), ubicado en cada cámara de exposición controlada (1 10).
La rama de alimentación de aire limpio tiene antes y después del dosificador de aire limpio (210), una par de llaves de paso (225), para la manipulación de dicho dosificador de aire limpio (210).
En la conexión operativa de la pluralidad de las cámaras de exposición controlada (1 10), que se muestra en la figura 7, la salida del regulador de presión de aire limpio (246) está conectado a un distribuidor de aire limpio (250) que alimenta a cada válvula de control proporcional de aire limpio (221 ); y la salida del regulador de presión de aire ambiente (245) está conectado a un distribuidor de aire ambiente (260) que alimenta cada válvula de control proporcional de aire ambiente (220). Cada circuito tiene sus propias señales de control y operación entregadas por el procesador de control y operación (300).
El sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100), permite la evaluación toxicológica de un ambiente determinado identificando y cuantificando los compuestos químicos presentes en la mezcla de aire de ambiente a la cual es expuesto cada uno de los monitores biológicos (120), a través de un análisis químico, por ejemplo, utilizando tubos adsorbentes ATD (140), que contienen una serie de polímeros adsorbentes específicos para determinar clases de COVs presentes en la mezcla de aire de ambiente. Para lo anterior, hay que considerar que la puesta en operación del sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100), requiere de una preparación operativa, una evaluación toxicóloga y un análisis de los resultados. Antes de iniciar un ensayo de evaluación toxicológica con el sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos ( 00), se deben preparar todas las unidades que forman parte del mismo, es decir, el equipo en sí, los monitores biológicos que reaccionarán al aire a evaluar y los dispositivos para evaluar la calidad química del aire.
Preparación del sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100)
Se entiende en esta etapa el chequeo del funcionamiento general del sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) y de cada componente, incluyendo el encendido, revisar la hermeticidad, calibración de los circuitos de distribución de gases y establecimiento de las condiciones de evaluación o porcentajes de dilución para cada cámara de exposición controlada (1 10), y duración de la experiencia.
Preparación de los monitores biológicos (120)
Los monitores biológicos (120) son organismos sensibles a los compuestos químicos tóxicos que se quieren evaluar en el aire ambiente (contaminado) que será inyectado al sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) y cuya respuesta específica se cuantifica y se relaciona a una dosis determinada para cada compuestos químicos en estudio. La forma en que se analizan en este caso, las plantas de Tradescantia, es a través de dos tipos ensayos. El primero, llamado ensayo de micro núcleos o Trad-MCN, se basa en la detección y cuantificación de micro núcleos en las tétradas primordiales de los granos de polen en la fase final de la meiosis. El segundo ensayo, llamado del pelo estaminal o TradD-SH, consiste en el análisis de las células del pelo estaminal de la flor, y se basa en el hecho de que las células de los pelos estaminales de las plantas de Tradescantia son heterocigotas para su color, y por ello es posible detectar mutaciones en base al cambio de color que presentan cuando han sido expuestas a los efectos de la contaminación. El color de estas células cambia de un color azul (dominante o normal) a uno rosado (recesivo o muíante).
Para la utilización de los monitores biológicos (120) en el sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100), éstos deben estar disponibles en abundancia para su uso lo que implica que deben ser cultivados (plantas o microorganismos) y/o criados (en el caso de animales) bajo estrictas condiciones ambientales que aseguren la ausencia de sustancias contaminantes a los cuales ellos reaccionan. Los monitores biológicos (120) así cultivados y/o criados, actuarán como organisrrjios control para todos los efectos de comparación con aquellos organismos expuestos en el sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100), tanto a aire limpio como al aire ambiente contaminado. Para utilizar los monitores biológicos (120) en el sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) deben seguirse los siguientes pasos:
Recolección: Se deben recolectar los organismos o las estructuras biológicas sensibles a la contaminación en un número tal que permita asegurar estadísticamente la calidad de los resultados (p. ej. en el caso de vegetales, de 15 a 20 inflorescencias jóvenes por cámara de exposición controlada (1 10), para el monitor biológico Tradescantia).
Acondicionamiento: Los organismos o estructuras biológicas que han sido separadas de sus condiciones de crianza o cultivo deben ser sometidos a un período de acondicionamiento, por ejemplo en el caso de vegetales, las inflorescencias de Tradescantia se acondicionan previo a la exposición durante 12-24 horas dejándolas en solución nutritiva aireada, en condiciones de laboratorio.
Ubicación de los monitores biológicos (120): Se distribuyen los organismos o estructuras biológicas preacondicionadas entre las distintas cámara de exposición controlada (1 10), por ejemplo, cinco monitores biológicos (120) ubicados en cada una de las cámara de exposición controlada (1 10), y un sexto monitor biológico (120) que está dentro de una cámara de exposición controlada (1 10) sin su correspondiente tapa de cámara de exposición controlada (1 15), quedando este último monitor biológico (120) expuesto directamente al aire ambiente del lugar que se va a evaluar. Los monitores biológicos (120) deben permanecer en el medio adecuado para asegurar su óptima condición mientras dure el ensayo, por ejemplo en el caso de vegetales, en un vaso conteniendo solución nutritiva para la correcta mantención de las inflorescencias de Tradescantia ubicado dentro de cada cámara de exposición controlada (1 10), Posteriormente se debe cerrar y asegurar la hermeticidad de cada una de las cinco cámaras de exposición controlada ( 10).
Análisis químico de la calidad del aire
La evaluación toxicológica de una mezcla compleja de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros, presentes en forma de gases y aerosoles en una muestra de interés utilizando el sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) involucra la identificación y cuantificación de los compuestos químicos presentes en la mezcla de aire del ambiente al cual será expuesto el monitor biológico (120), a través de un análisis químico, por ejemplo utilizando tubos adsorbentes ATD (140), los cuales contienen una serie de polímeros adsorbentes específicos para determinadas clases de COVs. Dentro de cada una de las cámaras de exposición controlada (1 10) del sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) se ubica uno de estos tubos adsorbentes ATD (140), por los cuales se hace pasar la mezcla de aire que contiene la cámara de exposición controlada (1 10) respectiva a un flujo constante y predeterminado, durante todo el período de exposición. Para lograr este objetivo el sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) cuenta con bombas de aspiración (150) asociadas a cada uno de los tubos adsorbentes ATD (140). Es así como los compuestos de interés, en este caso por ejemplo los COVs, son adsorbidos y retenidos en los polímeros de cada tubo adsorbente ATD (140). Posteriormente cada tubo adsorbente ATD (140) es analizado través de la técnica de "Desorción Térmica Automática acoplada a Cromatografía Gaseosa con detección de Espectrometría de Masas" (ATD-GC-MS). Para el correcto funcionamiento del análisis químico de la calidad del aire, se deben cumplir al menos con los siguientes pasos:
Llenado de los tubos: Los tubos adsorbentes ATD (140) deben ser empacados con resinas poliméricas ad/absorbentes específicas para retener los analitos de interés, esta operación se realiza bajo estrictas medidas de control de calidad, siguiendo un protocolo de empacado acorde con recomendaciones EPA (Método TO-17, Determination of volatile organic compounds in Ambient Air Using Active Sampling Onto Sorbent Tubes).
Acondicionamiento y limpieza de los tubos adsorbentes ATD (140): antes de ocupar bajo condiciones de campo, por ejemplo los tubos adsorbentes ATD (140), éstos se deben someter a un proceso de calentamiento para eliminar posibles trazas de compuestos orgánicos volátiles que puedan estar presentes, tanto en el tubo como en el material ad/absorbente. Esta limpieza se debe comprobar haciendo un análisis de cada uno de los tubos ya acondicionados utilizando un sistema de termo desorción automático (ATD) unido a un sistema de detección para los compuestos en estudio, como por ej. cromatografía gaseosa con detección de espectrometría de masas (GC-MS).
Carga del material de referencia o estándar para la cuantificación de los contaminantes en estudio: La identificación y cuantificación de los compuestos contaminantes del aire ambiente debe considerar el uso de estándares certificados que permita la identificación y cuantificación de los distintos compuestos en estudio presentes en la muestra de aire ambiente a analizar. Por ejemplo, en el caso de los tubos adsorbentes ATD (140), se utiliza una cantidad conocida y certificada de un estándar gaseoso de COVs con el cual se carga inicialmente cada uno de los tubos adsorbentes ATD (140) y con el cual se realizará la identificación, cuantificación, así como el control y aseguramiento de la calidad de los datos. Se debe ubicar un tubo adsorbente ATD (140) al interior de cada una de las cámaras de exposición controlada ( 10) y también uno en la ubicación de la cámara de exposición controlada (1 10) sin la tapa de cámara de exposición controlada (1 15), para el control del proceso.
Condiciones de monitoreo: Se deben definir las condiciones de operación (flujo) de las bombas de aspiración (150) conectadas a cada uno de los tubos adsorbentes ATD (140) (p. ej 100 ml/min) en función de los compuestos químicos a analizar y de la optimización previa del monitoreo que se haya realizado antes de su utilización bajo condiciones de campo. Esto implica optimizar, el tipo y cantidad de adsorbente a utilizar, las condiciones de operación durante el monitoreo (flujo y tiempo de muestreo), cantidad y tipo de estándar, entre otros.
Análisis de los compuestos químicos a estudiar: para esto se deben optimizar desde las condiciones de operación del sistema ATD hasta el sistema cromatográfico junto al sistema de detección seleccionado para esta aplicación analítica, entre otros.
Evaluación toxicológica
Estando el sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) ya configurado, con los monitores biológicos (120) y tubos adsorbentes ATD (140) ubicados en cada una de las cámaras de exposición controlada (1 10) y también en la cámara de exposición controlada (1 10) sin la tapa de cámara de exposición controlada (1 15), se inicia así el muestreo por el tiempo predeterminado, por ejemplo 8 horas para el caso del uso del monitor biológico Tradescantia para evaluar compuestos genotóxicos.
El aire ambiente conteniendo el compuesto químico a evaluar, en las proporciones establecidas y configuradas, irá ingresando a las distintas cámaras de exposición controlada (1 10) a un flujo constante controlado constantemente por el procesador de control y operación (300). Cuando haya una presión interna positiva, el exceso de aire saldrá por una salida (270), de esta manera el aire se irá renovando periódicamente mientras dure la exposición. No es un ensayo estanco, pero de esta forma se logra simular una exposición del monitor biológico (120) a una concentración constante y proporcional de contaminantes en el aire en forma normal. I
Luego de transcurrido el tiempo definido para el funcionamiento del equipo, tanto los monitores biológicos (120) como los tubos adsorbentes ATD (140) son retirados de cada una de las cámaras de exposición controlada (1 10) y de la cámara de exposición controlada (1 10) sin la tapa de cámara de exposición controlada (1 15) y llevados al laboratorio para su posterior análisis y cuantificación.
Análisis de los monitores biológicos (120) y de los tubos adsorbentes ATD (140) Monitores biológicos (120):
Una vez en laboratorio los monitores biológicos (120) deben ser analizados para determinar y cuantificar los cambios que sufrieron al estar expuestos a la mezcla de aire contaminado, por ejemplo, para el vegetal Tradescantia se pueden realizar dos tipos de evaluación:
1 . Bioensayo de micro núcleos (Trad-MCN): las inflorescencias son mantenidas en solución nutritiva y aireada por 24 horas. Posteriormente los botones florales son almacenados en una solución de ácido acético: alcohol (1 :3) hasta su análisis bajo microscopio. Para poder identificar y cuantificar la formación de micro núcleos, los botones deben ser diseccionados y teñidos con alguna solución que resalte el material genético de la célula vegetal, por ejemplo, tinción carmín. Una vez que se detecte un botón floral cuyas células primordiales de granos de polen se encuentren en etapa de tétrada se comienza la identificación y conteo de micro núcleos. Es necesario contabilizar cuántos micro núcleos hay en 300 tétradas. Este procedimiento se realiza para cada uno de los botones florales recolectados por cada cámara de exposición controlada (1 10), es decir 15-20. Los resultados finalmente se expresan como frecuencia (o número) de micro núcleos en 100 tétradas. Este bioensayo es más recomendado cuando se utiliza el vegetal Tradescantia pallida var purpurea.
Bioensayo de pelo estaminal (Trad-MCN): las inflorescencias son mantenidas en solución nutritiva y aireada hasta que los botones florales maduren, es decir las flores abran. Cada día se deben analizar las flores que abrieron ese día. Este procedimiento se mantiene por 7-10 días luego de terminada la exposición del monitor biológico (120) en el sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100).
De cada flor abierta se separan cuidadosamente cada uno de los 6 estambres, identificando si se trata de estambres asociados a un pétalo o a un sépalo. Se disponen separadamente sobre un porta objeto, hidratándolos con una gota de agua. Con mucho cuidado se separan o "peinan" los pelos estaminales de cada uno de ellos, de manera de facilitar la observación de las células que los componen y el conteo del número pelos estaminales con una lupa estereoscópica. Durante el análisis se identifican y contabilizan las células rosadas, es decir, mutadas. Los resultados se expresan en número de mutaciones en mil pelos estaminales. Este bioensayo es más recomendado cuando se utilizan clones del vegetal Tradescantia, por ejemplo clon KU-20. Análisis de los compuestos químicos presentes en la mezcla de aire ambiente
Terminada la experiencia de exposición en el sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) el medio utilizado para determinar la calidad química de la mezcla de aire ambiente (contaminado) debe ser analizado en el laboratorio, por ejemplo, los tubos adsorbentes ATD (140) para la determinación y cuantificación de COVs. El análisis de las muestras de COVs (C6- C12) se realiza por ejemplo con una tecnología de punta utilizando un equipo de desorción térmica automática denominado TurboMatrix ATD acoplado a un cromatógrafo de gases por ejemplo con detección de espectrometría de masas Clarus 500 (ATD-GD-MS), Perkin Elmer, USA. El sistema ATD-GC-MS posee la ventaja de que el análisis se realiza en forma automática en condiciones controladas y las muestras no requieren de una etapa previa de tratamiento lo que permite la disminución de los errores indeterminados asociados a todo proceso analítico, la utilización de reactivos químicos, ahorro de energía, el tiempo y el costo final de los análisis, generando un procedimiento mucho más amigable con el medio ambiente.
Elaboración de la curva dosis respuesta
La construcción de la curva dosis respuesta se elabora graficando la respuesta del monitor biológico (120) versus la concentración de contaminantes detectados en la mezcla de aire ambiente (contaminado), por ejemplo, para el monitor biológico Tradescantia, expresada en número de mutaciones/1000 pelos estaminales, si se contabilizó con el bioensayo Trad-SH, o número de micro núcleos /100 tétradas, si se contabilizó con el bioensayo Trad-MCN. Los compuestos orgánicos volátiles se expresan en unidades de concentración, es decir masa/volumen de aire, por ejemplo nanogramos de COVs/metros cúbicos de aire. Los concentración puede expresarse como la suma de todos los contaminantes determinados (COVs totales) o como compuestos individuales, si es que el análisis químico es suficientemente sensible y permite especiar, por ejemplo, nanogramos de tolueno/metros cúbicos de aire. La curva dosis respuesta se obtiene dibujando un gráfico de dos entradas, donde en el eje horizontal o eje x se representa la respuesta del biomonitor, número de mutaciones, y en el eje vertical o eje y se representa la concentración del compuesto químico detectado en el análisis químico.
El sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos
(100) puede ser operado de la misma forma como se ha descrito en los párrafos anteriores ya sea bajo condiciones de laboratorio o en terreno bajo condiciones de exposición a aire contaminado en ambientes interiores o exteriores, ya sea para i) la realización de curvas del tipo dosis respuesta para caracterizar la respuesta del monitor biológico (120) a un ambiente determinado, ii) estimar el nivel de toxicidad de una muestra de aire en diferentes niveles de concentración, iii) comparar las características físicas (humedad, temperatura, nivel de radicación, etc) y/o químicas (presencia de material particulado, ozono, SO2, NOx, contaminantes seleccionados, etc) específicas de una muestra determinadas de aire y sus efectos sobre un monitor biológico (120), ya sea que estas características se estudien de forma aislada o sinérgica.
Realización de curvas del tipo dosis respuesta para caracterizar la respuesta del monitor biológico (120) a un ambiente determinado
El sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) tienen por objetivo determinar la capacidad de respuesta que tiene el monitor biológico (120) a la concentración de un determinado contaminante o un grupo de ellos en mezcla, en un ambiente específico a estudiar, por ejemplo, en una industria química de pinturas. Una vez realizado un estudio preliminar se puede saber con exactitud a que contaminantes y en qué nivel de concentración específico es capaz de reaccionar el monitor biológico (120), mediante la definición de umbrales de respuesta, para posteriormente usar el monitor biológico (120) como un sistema estandarizado de monitoreo de la calidad toxicológica del aire ambiente estudiado. Para la realización de este estudio primero se debe seleccionar el ambiente que se quiere caracterizar, ya sea de interior y/o exterior, luego se deben definir las proporciones de mezcla con que se realizará la curva de dosis-respuesta, así como los flujos del monitoreo de tubos adsorbentes ATD (140) según los niveles de concentración esperados para los contaminantes en estudio. Posteriormente, se debe realizar el ensayo como se describió en los párrafos anteriores y obtener tanto la curva de dosis-respuesta para la mezcla de contaminantes específicos de ese aire ambiente, como la concentración de los contaminantes de esa mezcla a la que estuvo expuesto el monitor biológico. Con esta información se puede determinar si el monitor biológico (120) está en condiciones de ser usado en forma masiva como un sistema estandarizado de monitoreo de la calidad toxicológica del aire ambiente estudiado. En caso de no ser así, se puede volver a repetir el procedimiento anterior hasta llegar a determinar los umbrales de respuesta efectivos del monitor biológico (120) que permitan su uso como sistema estandarizado de monitoreo. En cualquier caso este estudio, así como la estandarización y uso del monitor biológico (120) como sistema estandarizado de monitoreo es algo absolutamente específico para cada aire ambiente particular que se quiera estudiar, por ejemplo para cada tipo de industria o aire urbano a monitorear. Adicionalmente cualquier cambio en el tipo o concentración del o los contaminantes encontrados en la caracterización inicial, obligan a realizar nuevamente el proceso de estandarización del monitor biológico (120) como un sistema de monitoreo ambiental.
Estimar el nivel de toxicidad de una muestra de aire en diferentes niveles de concentración
El sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) permite determinar el nivel de toxicidad de una muestra de aire, ya sea de interior y/o exterior, en diferentes niveles de concentración. La toxicidad de una determinada muestra de aire está dada por la calidad química de un determinado contaminante o un grupo de ellos en mezcla en un ambiente específico a estudiar, por ejemplo, una industria química o el aire ambiente de una ciudad. Se podría entonces estudiar en el laboratorio la respuesta que experimente el monitor biológico (120) a la concentración de un determinado contaminante puro o un grupo de ellos en mezcla en diluciones sucesivas con aire puro antes descrito, en el cual en cada una de las cámaras de exposición estaría además del monitor biológico (120), un tubo adsorbente ATD (140) en el cual quedaría adsorbido el contaminante en estudio para luego determinar y corroborar exactamente el nivel de concentración al que estuvo expuesto el monitor biológico (120). La información obtenida de este estudio preliminar se puede comprar con estudios realizados directamente en terreno bajo condiciones reales, en los cuales se desarrolla el mismo procedimiento antes descrito pero sometiendo al monitor biológico (120) a concentraciones reales de contaminantes en el aire, en donde se encontrarán tanto los contaminantes estudiados como otros cientos de compuestos adicionales. Esto permite comparar la respuesta del monitor biológico (120) bajo condiciones de laboratorio con aquella bajo condiciones de campo, con la finalidad de evaluar la influencia de los demás contaminantes químicos sobre la respuesta de los compuestos específicos estudiados. Esto permite por un lado verificar bajo condiciones de laboratorio la toxicidad de un determinado contaminantes puro o un grupo de ellos en mezcla y complementariamente ver los efectos sinérgicos de las múltiples mezclas de contaminantes, así como la influencia de los demás componentes de una muestra real.
Comparar las características físicas v/o químicas específicas de una muestra determinadas de aire y sus efectos sobre un monitor biológico (120)
El sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) permite utilizar una serie de dispositivos adicionales que tienen por objetivo determinar los efectos específicos de las distintas características física, como humedad, temperatura, nivel de radicación, etc., y/o químicas, como presencia de material particulado, ozono, S02, NOx, contaminantes seleccionados, etc., específicas de una muestra determinada de aire ambiente, ya sea de interior y/o exterior, y sus efectos sobre un monitor biológico (120), ya sea que estas características se estudien de forma aislada o sinérgica. Es sabido que el nivel de toxicidad de una muestra de aire depende entre otras cosas de los múltiples contaminantes que coexisten en él, así como de sus características físicas, por lo que se hace deseable un estudio sistemático y aislado de cada una de estas característica para verificar su influencia y/o impacto sobre la toxicidad al exponer en condiciones controladas un monitor biológico (120). Para esto se instala in situ en el lugar de estudio el sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100), en donde en, cada una de las cámara de exposición controlada (110) se dispone de un dispositivo que permite eliminar alguno de los contaminantes a estudiar, por ejemplo, presencia de material particulado, ozono, S02> NOx, COVs, COSVs, etc, de forma tal de experimentar el efecto de la toxicidad de toda la complejidad de la muestra de aire real de un ambiente determinado sustrayendo el efecto del contaminante a estudiar. De este modo se puede estimar el impacto toxicológico de este contaminante en estudio, bajo condiciones de campo y comparando en paralelo el impacto de los demás contaminantes bajo análisis, tantos como cámaras de exposición controlada (110) se dispongan, de forma de obtener el máximo de información sobre la toxicidad de una muestra compleja de aire ambiente. Este procedimiento se puede realizar también estudiando variables físicas críticas como humedad, temperatura, nivel de radicación, etc, con la misma finalidad o incluso combinando variables físicas y química para obtener mayor información. En ambos casos el efecto control positivo es el monitor biológico (120) expuesto directamente al aire ambiente real y el efecto control negativo es el monitor biológico (120) expuesto en el interior de una cámara del sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) al cual se le hace llegar solamente aire puro durante la prueba.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Un sistema para evaluar en forma cualitativa y cuantitativa la toxicidad de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros, presentes en forma de gases y aerosoles en una muestra de interés, CARACTERIZADO porque comprende una pluralidad de cámaras de exposición controlada (1 10), un compresor de aire limpio libre de aceite (200), una bomba inyectora de aire ambiente conteniendo el compuesto químico a evaluar (240), un dosificador para aire limpio (210), un procesador de control y operación (300) de la pluralidad de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100), un módulo de ingreso de datos (360) y una caja soporte (361 ) para dicho módulo de ingreso de datos (360) y bombas de aspiración (150) de tubos adsorbentes ATD (140), un soporte (370) para bombas de aspiración (150) de tubo adsorbentes ATD (140), todo el sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) está soportado por distintas estructuras móviles que permiten agrupar las partes del sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) de acuerdo con el lugar de realización de los ensayos toxicológicos.
2 - El sistema de acuerdo con la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque la pluralidad de cámaras de exposición controlada (1 10), cada una, contiene un monitor biológico (120), dispuesto sobre una plataforma (170), que está cubierta por una tapa de cámara de exposición controlada (1 15) ajustada con un o-ring (160) que permite aislar al monitor biológico (120) del medio ambiente; donde el interior de la cámara de exposición controlada (1 10) produce un ambiente controlado para exponer a dicho monitor biológico (120); donde el ambiente controlado se produce a través de una entrada de mezcla de aire (130) a la cámara de exposición controlada (1 10) el cual está soportado por un perno hueco de entrada de mezcla de aire (131 ); y para tomar una muestra de la mezcla de aire al interior de la cámara de exposición controlada (1 10) se dispone de un tubo adsorbente ATD (140) que se conecta a una bomba de aspiración (150) mediante un perno hueco tubo ATD (141 ) que soporta al tubo adsorbentes ATD (140); un sensor de presión interna (280) se conecta mediante un perno hueco (281 ) al interior de la cámara de exposición controlada (110); y un perno hueco de salida de aire mezclado (270) permite la circulación de la mezcla de aire que ingresa por la entrada de mezcla de aire (130).
3. - El sistema de acuerdo con la reivindicación 2, CARACTERIZADO porque el monitor biológico (120) puede ser cualquier organismo sensible, a fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros, presentes en forma de gases y aerosoles que serán inyectados en el sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) y cuya respuesta específica se puede cuantificar y se relaciona a una dosis determinada para cada contaminante en estudio, como por ejemplo, el monitor biológico Tradescantia, que es un vegetal superior sensible a contaminantes genotóxicos o mutagénicos, como algunos compuestos inorgánicos, metales pesados, compuestos orgánicos volátiles (COVs) o semivolátiles (COSVs), entre otros, los cuales pueden estar presentes en muestras reales de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros.
4. - El sistema de acuerdo ^on la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque la cámara de exposición controlada (1 0) es alimentada por una mezcla de aire a través de un mezclador de aire ambiente y aire limpio (265) que es alimentado por dos ramas, una de aire limpio y otra de aire ambiente que contiene los compuestos químicos a evaluar, en donde el aire limpio se obtiene mediante un tubo de ingreso de aire (205), del exterior, al compresor de aire limpio libre de aceite (200) que alimenta un dosificador de aire limpio (210) que está conectado a un regulador de presión de aire limpio (246) que entrega un flujo de aire limpio a una válvula de control proporcional de aire limpio (221) el que está conectado a un medidor de flujo de aire limpio (231) que determina el flujo de entrada de aire hasta una de las entradas del mezclador de aire ambiente y aire limpio (265); el aire ambiente del exterior ingresa por un tubo (241) que alimenta la bomba inyectora de aire ambiente conteniendo el compuesto químico a evaluar (240), que está conectado a un regulador de presión de aire ambiente (245) que entrega un flujo de aire ambiente a una válvula de control proporcional de aire ambiente (220) el que está conectado a un medidor de flujo de aire ambiente (230) que determina el flujo de entrada de aire hasta una de las entradas del mezclador de aire ambiente y aire limpio (265); el aire limpio que alimenta una rama del mezclador de aire ambiente y aire limpio (265) es procesado en el dosificador de aire limpio (210), ya que sólo le ingresa el aire del exterior, por lo cual este dosificador de aire limpio (210) cuenta con filtros necesarios para producir aire puro limpiando el aire que le entrega el compresor de aire limpio (200) que sólo es alimentado del exterior o por una botella de aire sintético o puro, alimentando directamente al regulador de presión de aire limpio (246).
5. - El sistema de acuerdo con la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque el control y operación de cada cámara de exposición controlada (1 10), es llevado a cabo por el procesador de control y operación (300) que envía señales de control a los medios que componen la cámara de exposición controlada ( 10); por la rama de aire limpio, entrega una señal de control (310) al compresor de aire limpio (200), una señal de control (320) al dosificador de aire limpio (210), una señal de control (345) a una válvula de control proporcional de aire limpio (221 ); una señal de control (355) a un medidor de flujo de aire limpio (231 ); por la rama de aire ambiente, el procesador de control y operación (300), entrega una señal de control (325) a la bomba inyectora de aire ambiente (240), una señal de control (340) a una válvula de control proporcional de aire ambiente (220), una señal de control (350) a un medidor de flujo de aire ambiente (230); además, el procesador de control y operación (300) entrega una señal de control de presión interna (330) a un sensor de presión interna (280), ubicado en cada cámara de exposición controlada (1 10).
6. - El sistema de acuerdo con la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque la pluralidad de las cámaras de exposición controlada (1 10), están conectadas a la salida de un regulador de presión de aire limpio (246) mediante un distribuidor de aire limpio (250) que alimenta a cada válvula de control proporcional de aire limpio (221 ); y en la salida del regulador de presión de aire ambiente (245) está conectado mediante un distribuidor de aire ambiente (260) que alimenta cada válvula de control proporcional de aire ambiente (220); en donde cada circuito de la pluralidad de las cámaras de exposición controlada (1 10) tiene sus propias señales de control y operación entregadas por el procesador de control y operación (300).
7. - Un método para evaluar en forma cualitativa y cuantitativa la toxicidad de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros, presentes en forma de gases y aerosoles en una muestra de interés, CARACTERIZADO porque comprende las etapas de:
configurar un sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) con una pluralidad de cámaras monitores biológicos (120) y respectivos tubos adsorbentes ATD (140) ubicados en cada una de dichas cámaras de exposición controlada (1 10) y configurar una cámara de exposición controlada ( 10) sin su tapa de cámara de exposición controlada (115); en donde, el aire ambiente conteniendo el compuesto químico a evaluar, en proporciones establecidas y configuradas, a una concentración constante y proporcional de contaminantes en el aire en forma normal, irá ingresando a las distintas cámaras de exposición controlada (1 10) a un flujo constante controlado constantemente por un procesador de control y operación (300); y cuando haya una presión interna positiva, el exceso de aire saldrá por una salida (270), de esta manera el aire se irá renovando periódicamente mientras dure la exposición;
iniciar un muestreo por un tiempo predeterminado, para evaluar compuestos genotóxicos;
analizar los monitores biológicos (120) para determinar y cuantificar los cambios que sufrieron al estar expuestos a la mezcla de aire ambiente conteniendo el compuesto químico a evaluar; y
analizar los respectivos tubos adsorbentes ATD (140).
8. - El método de acuerdo pon la reivindicación 7, CARACTERIZADO porque el monitor biológico (120) es una planta Tradescantia, que es un vegetal superior sensible a contaminantes genotóxicos o mutagénicos, como algunos compuestos inorgánicos, metales pesados, compuestos orgánicos volátiles (COVs) o semivolátiles (COSVs), entre otros, los cuales pueden estar presentes en muestras reales de fármacos, productos químicos, contaminantes químicos, entre otros.
9. - El método de acuerdo con la reivindicación 7, CARACTERIZADO porque la etapa de analizar los monitores biológicos (120) comprende las subetapas de: i) realizar curvas del tipo dosis respuesta para caracterizar la respuesta del monitor biológico (120) a un ambiente determinado;
ii) estimar el nivel de toxicidad de una muestra de aire en diferentes niveles de concentración a partir de los los respectivos tubos adsorbentes ATD (140) ; y
iii) comparar las características físicas (humedad, temperatura, nivel de radicación, etc) y/o químicas (presencia de material particulado, ozono, SO2, NOx, contaminantes seleccionados, etc) específicas de una muestra determinadas de aire y sus efectos sobre un monitor biológico (120).
10. - El método de acuerdo con la reivindicaciones 8 y 9, CARACTERIZADO porque la curva dosis respuesta se elabora graficando la respuesta del monitor biológico Tradescantia versus la concentración de contaminantes detectados en la mezcla de aire ambiente contaminado, expresada en número de mutaciones/1000 pelos estaminales, o número de micro núcleos / 00 tetradas; en donde los compuestos orgánicos volátiles se expresan en unidades de concentración, es decir masa/volumen de aire, y la concentración se expresa como la suma de todos los contaminantes determinados, por ejemplo COVs totales, o como compuestos individuales, y la curva dosis respuesta se obtiene dibujando un gráfico de dos entradas, donde en el eje horizontal o eje x se representa la respuesta del biomonitor, número de mutaciones, y en el eje vertical o eje y se representa la concentración del compuesto químico detectado en el análisis químico.
1 1. - El método de acuerdo con la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque los monitores biológicos (120) en el sistema de cámaras de exposición controlada para ensayos toxicológicos (100) deben prepararse con los siguientes pasos:
recolectar los organismos o las estructuras biológicas sensibles a la contaminación en un número tal que permita asegurar estadísticamente la calidad de los resultados, por ejemplo, de 15 a 20 inflorescencias jóvenes por cámara de exposición controlada (1 10), para el monitor biológico Tradescantia;
acondicionar los organismos o estructuras biológicas que han sido separadas de sus condiciones de crianza o cultivo y que deben ser sometidos a un período de acondicionamiento, por ejemplo en el caso de vegetales, las inflorescencias de Tradescantia se acondicionan previo a la exposición durante 12-24 horas dejándolas en solución nutritiva aireada, en condiciones de laboratorio; y
ubicar los monitores biológicos (120) entre las distintas cámara de exposición controlada (110), por ejemplo, cinco monitores biológicos (120) ubicados en cada una de las cámara de exposición controlada (110), y un sexto monitor biológico (120) que está dentro de una cámara de exposición controlada (110) sin su correspondiente tapa de cámara de exposición controlada ( 15), quedando este último monitor biológico (120) expuesto directamente al aire ambiente del lugar que se va a evaluar, en donde, los monitores biológicos (120) deben permanecer en el medio adecuado para ¡ asegurar su óptima condición mientras dure el ensayo, por ejemplo en el caso de vegetales, en un vaso conteniendo solución nutritiva para la correcta mantención de las inflorescencias de Tradescantia ubicado dentro de cada cámara de exposición controlada (110).
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