WO2012108675A2 - 금속 분리 가능한 pna 앱타머 - Google Patents

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    • C12N2310/16—Aptamers
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3181—Peptide nucleic acid, PNA

Definitions

  • the present invention provides a method for separating a target metal using a single-stranded PNA aptamer having a specific three-dimensional structure by complementary binding of bases, a method for preparing the PNA aptamer, and a PNA aptamer specifically binding to a target metal. It is about a method.
  • the method for preparing PNA aptamer may include a first step of designing a nucleotide sequence of PNA aptamer so that two or more complementary bonds of bases may be formed; And a second step of synthesizing the PNA aptamer designed according to the first step, wherein the method for separating the target metal comprises contacting a sample containing the target metal with a PNA aptamer specific to the target metal; Separating the target metal-PNA aptamer complex from the sample; And recovering the target metal.
  • uranium is a tricarbonato complex of uranium ions, mainly in seawater, present at a concentration of about 3 ppb, about 4 billion tonnes of nuclear power available around 60,000 years worldwide.
  • seawater Along with the selective extraction of uranium from seawater, importantly, there are rare metals in seawater, such as indium (0.1 to 2.0 pM) or palladium (about 2.1 pM). Selective extraction of rare metals from seawater, such as indium, is not only in demand of existing applications in the high-tech industry, but also in various research and development such as semiconductor (InP), LCD (ITO), and solar cells related to new high-tech materials.
  • semiconductor (InP), LCD (ITO), and solar cells related to new high-tech materials As the possibility of practical use continues to expand, and the recent instability of supply and demand of indium due to the explosive increase in demand of the Hi-Tech industry caused a sharp price increase, the IT and NT industries secure resources for stable supply of indium. It's very important in that it's entering before.
  • indium In other words, the demand for indium was reported to be less than about 100 tons by 1987, as shown in the statistics on indium consumption (Roskill Information Services; Carlin, 2006), but it increased significantly to about 220 tons in 2000 and about 920 tons in 2005.
  • the development of various materials for LCDs since 2003 has led to a sharp increase in demand.
  • the price of indium metal is about $ 1000 to 800 / kg of indium, which is about twice as high as that of silver in 2006 (about $ 400 / kg).
  • palladium is required for the manufacture of electronic components, fuel cells, exhaust gas purification catalysts, etc. in that it can change the properties of the material with only a slight addition to other materials. Therefore, demand in the high-tech industry is continuously increasing.
  • Aptamers are non-naturally occurring structured oligonucleotides that can specifically bind to DNA, RNA, small molecules, peptides, proteins, and the like.
  • aptamers are screened by an in vitro selection process known as systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX), and are used in many applications such as specific detection and target-specific delivery of proteins, metal ions and small molecules. It is used for bioanalyses.
  • PNA peptide nucleic acid
  • DNA or RNA having a sugar backbone the backbone has repeating N- (2-aminoethyl) -glycine units linked by peptide bonds, and has the same various purine and pyrimidine bases in the side chain as DNA or RNA.
  • PNAs have similar properties to DNA or RNA, but are more stable to stimulation such as heat or pH.
  • it cannot be produced naturally and can only be manufactured synthetically it has a disadvantage that the cost is high and it is not widely commercialized yet.
  • DNA or RNA aptamers have been widely used as biochips with specific target molecule recognition ability, while PNA molecules as aptamers have not been reported.
  • the present inventors have been intensively searching for a method for effectively extracting metals including uranium, indium, palladium, etc. from seawater. It was the first time that it could be combined so that it could function as an aptamer. Furthermore, this suggests that PNA aptamers can form a three-dimensional structure similar to DNA aptamers having the same base sequence. Therefore, by devising a method for separating the target metal ion using a PNA aptamer capable of binding with high specificity to the metal ion and completed the present invention.
  • One object of the present invention is to provide a single-stranded PNA aptamer having a specific three-dimensional structure by complementary binding of bases.
  • Another object of the present invention is to enable two or more complementary linkages of bases to be formed
  • a second step of synthesizing the PNA aptamer designed according to the first step and provides a method for preparing a single-stranded PNA aptamer having a specific three-dimensional structure by complementary binding of the base.
  • Another object of the present invention is to contact a sample containing a target metal with a PNA aptamer specific for the target metal; Separating the target metal-PNA aptamer complex from the sample; And recovering the target metal, using the PNA aptamer specifically binding to the target metal.
  • the present invention provides a single-stranded PNA aptamer having a specific three-dimensional structure by complementary bonding of bases.
  • the inventors have disclosed DNA aptamers and their base sequences that specifically bind to uranil ions.
  • DNA may not be sufficiently stable in a natural environment in which various microorganisms exist (Appl. Environ. Microbiol., 1987, 53: 170-179)
  • the DNA aptamer separates uranium ions from seawater and recovers uranium. It may not be suitable for use for such purposes.
  • the PNA has similar characteristics to DNA but has excellent stability against heat, pH, and the like, and is not affected by hydrolysis by enzymes such as DNase.
  • PNA having the same nucleotide sequence as that of the uranil ion-specific DNA aptamer To specifically bind to uranyl ions.
  • Cys-PNA 1 (N terminal-Cys-CTGCA GAATT CTAAT ACGAC TCACT ATAGG AAGAG ATGGC GACAT CTCTG CAGTC GGGTA GTTAA ACCGA CCTTC AGACA TAGGC AGGCG TATAT) having a cysteine at the N-terminus
  • the CTTGT GACGG TAAGC TTGGC AC-C terminal was bound to the solid support 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate-aminopolystyrene resin and was used to specific the uranyl ion in the uranyl ion solution. The resolution was confirmed.
  • the PNA of the present invention can be separated by binding with uranil ions at a high ratio (FIG. 3). That is, for the first time, it was confirmed that a PNA having the same sequence as a DNA aptamer for a specific target material could also act as an aptamer of the target material. It was also first identified that the PNA of SEQ ID NO: 1 having the same sequence as the uranil ion specific DNA aptamer of SEQ ID NO: 1 is a uranyl ion specific PNA aptamer.
  • the uranil ion-specific PNA aptamer of SEQ ID NO: 1 of the present invention not only binds specifically to uranil ions, but also has stability to PNA characteristic temperature, pH, salts and various degradation enzymes in seawater.
  • Uranyl ions may be recovered and used as resources. In addition, it may be used repeatedly through the washing process after recovery of uranil ions to the stability to pH.
  • PNA peptide nucleic acid
  • DNA and RNA each have a deoxyribose and ribose sugar backbone containing a phosphate group, whereas the backbone of PNA consists of repeating N- (2-aminoethyl) -glycine units linked by peptide bonds.
  • various purine and pyrimidine bases can be bound to the backbone by methylene carbonyl bonds.
  • PNAs are shown as peptides, with the N-terminus on the left and the C-terminus on the right.
  • the PNA backbone does not contain a negatively charged phosphate group, and thus there is no electrostatic repulsion between the strands, so that the binding between the PNA / DNA strands is stronger than that of the DNA / DNA strands.
  • Mixed base PNA molecules are true mimics of DNA molecules in terms of base pair recognition. These synthetic PNA oligomers are used for molecular biological processes, diagnostic assays, and antisense therapies due to their superior binding power.
  • PNAs also have high specificity for DNA of complementary sequences. This makes PNA / DNA double strands more sensitive to base mismatches than DNA / DNA double strands. The binding and sequence specific recognition powers also apply to PNA / RNA double strands.
  • PNA protein binds to a wide range of proteins. It is not easily recognized by nucleases or proteases and therefore is stable from degradation by these enzymes. It is also stable over a wide range of pH ranges. However, due to the hydrophobic skeleton, it is not easy to penetrate into cells when applied to the human body, but this can be improved by adding modifications such as covalently binding cell-penetrating peptides.
  • aptamer refers to a special kind of single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified) which has its own stable tertiary structure and is capable of binding with high affinity and specificity to a target molecule.
  • Aptamers can be obtained through a process of systematic evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX), a nucleic acid library with a random sequence.
  • SELEX Exponential Enrichment
  • the molecules that can specifically bind to aptamers are small molecules, proteins, Numerous variations in nucleic acids, cells, tissues, etc. Although currently considered a good alternative to antibodies, metal ions and even small chemical molecules are known to bind specifically to have dissociation constants at the nanomolar to picomolar levels. .
  • base refers to a purine or pyrimidine base that appears repeatedly on the side branches of the sugar backbone of DNA or RNA.
  • complementary binding means sequence specific binding of the above-mentioned bases. That is, adenine binds to thymine or uracil of the corresponding strand, and guanine binds to cytosine, respectively, and the inverse pairs thereof are also established. In other words, for example, adenine does not bind with another adenine, guanine or cytosine.
  • sequence specific binding is due to hydrogen bonding between pairs of bases to hydrogen bonds, and by such complementary binding, DNA or RNA can form a double-stranded structure despite the electrostatic repulsion between negatively charged backbones.
  • complementary bonds are not limited to double-stranded structures but include, but are not limited to, combinations of the corresponding bases, ie, adenine and thymine or uracil, guanine and cytosine, or a reverse combination thereof.
  • the term "specific three-dimensional structure" of the present invention means a specific three-dimensional structure according to the sequence formed by complementary binding between bases in a single strand of nucleic acid or nucleic acid analog (DNA, RNA, PNA, etc.)
  • the specific three-dimensional structure can specifically recognize the target molecule.
  • Complementary bases which are not located in close proximity on a sequence on a single stranded nucleic acid, ie separated by one or more bases, are paired to form a specific three-dimensional structure.
  • Such structures can be repeatedly combined and loosened depending on the environment, and identical sequences form the same structure reproducibly in the same environment. That is, sequence specificity.
  • the single-stranded PNA of the present invention can specifically bind to small molecules, proteins, nucleic acids, cells, tissues, and the like, but is not limited thereto.
  • it can bind specifically to a metal, More preferably, it can bind to uranium, More preferably, it can bind to uranyl ions.
  • the base sequence of the aptamer may be selected from random base sequences through the SELEX process, but preferably, the uranil ion-specific PNA aptamer of the present invention may have a base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the PNA aptamer may be linked to a solid support, preferably the solid support may be an aminopolystyrene resin, more preferably 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate-aminopolystyrene resin Can be.
  • the present invention is a method for preparing a single-stranded PNA aptamer having a specific three-dimensional structure by complementary binding of the base, so that two or more complementary bonds of the base can be formed of the PNA aptamer
  • the first step is to enable the PNA of the present invention to form a sequence-specific three-dimensional structure that is characteristic of an aptamer, and has the same sequence by having a sequence capable of forming complementary bonds in two or more molecules.
  • PNAs with can be determined to have a unique three-dimensional structure reproducibly in the same environment. The higher the number of bases that form complementary bonds, the higher the binding capacity, but the less essential the elements. Any sequence capable of reproducibly forming a sequence specific three-dimensional structure to recognize a specific target molecule can be used without limitation.
  • the term "design" of the present invention means determining the order of base sequence so that the PNA can form an appropriate three-dimensional structure according to the purpose.
  • the nucleotide sequence of the PNA aptamer may be designed to be identical or complementary to the nucleotide sequence of a known DNA aptamer.
  • the second step is a step of synthesizing the PNA multimer of the desired sequence from the PNA monomer according to the base sequence designed in the first step.
  • the term "synthesis" of the present invention refers to a process of preparing a multimer by combining PNA monomers in sequence. It can be synthesized by a known method. Panazine Co., Ltd. has disclosed a PNA monomer and a method for preparing the same, and a method for preparing a PNA multimer, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for preparing a target metal, comprising contacting a sample containing a target metal with a PNA aptamer specific for the target metal; Separating the target metal-PNA aptamer complex from the sample; And recovering the target metal.
  • the PNA aptamer may then be linked to a solid support for separation and recovery.
  • the solid support may be an aminopolystyrene resin, more preferably 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate-aminopolystyrene resin.
  • Separating the target metal-PNA aptamer complex may be performed by washing with an acid solution.
  • an aqueous hydrochloric acid solution may be used, and more preferably, an aqueous hydrochloric acid solution of 1 N concentration may be used, but is not limited thereto.
  • the complex formation between the binding site (BS) of the uranil ion and the PNA aptamer used in the specific example of the present invention can be described as follows.
  • K f Is the equilibrium constant for the exchange reaction represented by equation 3, which is a combination of K ex k One Of k -One )
  • K f end K ex And K f carb (10 21.54
  • [BS], [BS] 0 , And [UO 2 2+ BS] is BS and UO 2 2+
  • concentration of BS obtainable when the BS is assumed to dissolve, the concentration initially added in the BS, and the UO 2 2+ Each concentration of BS is shown.
  • the initially added concentration of uranil ions is [UO 2 2+ ] 0 It is expressed as [HCO 3 - ] >> [UO 2 2+ ] 0 [UO experimentally measured under the conditions of 2 2+ From [BS] and [CO used for measurement 3 2- ], [UO 2 2+ ] 0 , And [BS] 0 From the value of K ex
  • the value of [HCO 3 - ] HCO 3 - ] 0 It can be calculated from Equation 5 based on the assumption that can be approximated with. log for PNA aptamer-MCC-PS in the presence of 21 mM bicarbonate ions at pH 8.01 and 25 ° C. K f The estimate of was 20. K d app Wow K f The difference between the estimates of [UO 2+ ] 0 It is thought to be due to experimental error caused by the relatively inferior sensitivity of ICP-MS in.
  • any PNA aptamer for the target metal ion can be developed practically, it can be separated using the PNA aptamer according to the method of the present invention.
  • the metal present in the present invention is not particularly limited, and any metal in which a specific aptamer can be developed may be stably separated from the sample using a PNA aptamer specific to the metal, and thus, indium present in seawater, Palladium and the like may be effectively separated.
  • the present invention first revealed that PNA molecules can act as aptamers, and in particular also revealed for the first time that PNA aptamers having the same sequence as DNA aptamers of known sequences for a particular target molecule have specificity for the same target molecule.
  • the uranyl ion specific PNA aptamer of SEQ ID NO: 1 may be useful for recovering uranium resources from seawater due to its specificity and its specific stability. It can also be reused, reducing the burden of high costs.
  • 1 is a diagram generalizing the chemical structure of PNA.
  • FIG. 2 is a view showing a method for producing a PNA aptamer-MCC-PS resin.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of binding experiments on uranyl ions of the PNA aptamer-MCC-PS resin.
  • the apparent dissociation constant of the PNA aptamer-MCC-PS resin for the resulting uranyl ions is about 0.5 nM in the presence of 21 mM bicarbonate ions.
  • PNA 1 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 was prepared in the form of Cys-PNA 1 in which cysteine was bound for binding with a polystyrene resin.
  • Aminopolystyrenes were purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA), and uranil acetate dihydrate (UO 2 (CH 3 COO) 2 .2H 2 O, 99.0%) was used from Merck as the source of uranyl ion. .
  • Sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexame-1-carboxylate; sulfo-SMCC, Sigma) was used as a crosslinking agent. .
  • the concentration of PNA was determined by measuring absorbance at 260 nm using an Agilent 8453 UV / VIS spectrophotometer, and the concentration of uranium was measured by inductively coupled plasma-mass spectroscopy (ICP-MS) using the Perkin Elmer ELAN6100 model. It was.
  • PNA aptamer-MCC-PS As shown in FIG. Specifically, an aminopolystyrene (aminoPS) resin used as a solid support, that is, polystyrene-co-vinylbenzylamine-co-divinylbenzene (mesh: 100 to 200, 1.0 mmol N / Gram resin, Sigma) was prepared by modifying the surface with sulfo-SMCC as a crosslinking agent.
  • aminoPS aminopolystyrene
  • the amount of sulfo-SMCC added to aminoPS for surface modification was 5 mol% of the amino groups exposed to react in excess (Zhang et al ., Org. Lett ., 2001, 3: 275-278; Derfus et al. , Bioconjug. Chem ., 2007, 18: 1391-1396).
  • the amount of Cys-PNA 1 linked to the resin was determined to be about 2 nmol / g resin. That is, 0.2 mol% of the amino group formed a covalent bond with Cys-PNA 1.
  • the amount of uranyl ions that can be bound to PNA aptamer-MCC-PS was measured in a fixed amount of aptamer-MCC-PS (FIG. 3).
  • An aminopolystyrene resin with about 20 mg of surface modified and covalently bound PNA aptamer was suspended in 1 ml of uranil acetate solution, NaHCO 3 (21 mM) and HEPES (0.1 M; pH 8.01). The mixture was shaken at 50 ° C. at 25 ° C. for 2 days.
  • the PNA aptamer-MCC-PS reacted with the uranyl solution was collected by filtration and washed three times with 1 ml of a buffer solution (0.55 M NaCl, HEPES 0.01 M, pH 8.01) over 3 hours to give a simple adsorption to the resin.
  • the bound UO 2 (CO 3 ) 3 4- was removed.
  • the uranium species loosely bound by adsorption was sufficiently removed by washing three times with the NaCl solution.
  • the washed PNA Aptamer-MCC-PS was further washed three times with 2 ml of distilled water. Finally, washed with 2 ml of 1 N HCl aqueous solution to recover the uranil ions specifically bound to the PNA aptamer and quantified by ICP-MS.
  • the apparent dissociation constant ( K d app ) of PNA-based aptamers, which linked the surface for uranil ions with the modified aminoPS resin was 21 mM bicarbonate ions at pH 8.01. In the presence of about 0.5 nM, which is about 5 times higher than with DNA aptamer-MCC-PS.
  • the PNA-based aptamers linked to the solid support of the present invention can be used as highly effective fixed uranofils, with high log K f values and stability in seawater environments. It suggests that the economic criteria required for extraction can be met.

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Abstract

본 발명은 염기의 상보적 결합에 의해 특이적인 3차원 구조를 가지는 단일가닥 PNA 앱타머, 상기 PNA 앱타머의 제조 방법 및 표적 금속에 특이적으로 결합하는 PNA 앱타머를 이용하여 표적 금속을 분리하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 PNA 앱타머의 제조 방법은 염기의 상보적 결합이 두 개 이상 형성될 수 있도록 PNA 앱타머의 염기서열을 설계하는 제1단계; 및 상기 제1단계에 따라 설계된 PNA 앱타머를 합성하는 제2단계를 포함하며, 표적 금속을 분리하는 방법은 표적 금속을 함유하는 시료와 표적 금속에 특이적인 PNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 표적 금속-PNA 앱타머 착물을 시료로부터 분리하는 단계; 및 표적 금속을 회수하는 단계를 포함한다.

Description

금속 분리 가능한 PNA 앱타머
본 발명은 염기의 상보적 결합에 의해 특이적인 3차원 구조를 가지는 단일가닥 PNA 앱타머, 상기 PNA 앱타머의 제조 방법 및 표적 금속에 특이적으로 결합하는 PNA 앱타머를 이용하여 표적 금속을 분리하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 PNA 앱타머의 제조 방법은 염기의 상보적 결합이 두 개 이상 형성될 수 있도록 PNA 앱타머의 염기서열을 설계하는 제1단계; 및 상기 제1단계에 따라 설계된 PNA 앱타머를 합성하는 제2단계를 포함하며, 표적 금속을 분리하는 방법은 표적 금속을 함유하는 시료와 표적 금속에 특이적인 PNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 표적 금속-PNA 앱타머 착물을 시료로부터 분리하는 단계; 및 표적 금속을 회수하는 단계를 포함한다.
물 속의 금속의 킬레이트화는 환경 보호 및 자원 회수를 위해 중요하다. 특히 금속-특이적 킬레이팅 수지는 금속 킬레이트화에 있어서 단순한 이온 교환 수지보다 훨씬 더 효과적인데, 그 이유는 그들이 표적 금속에 대해 더 높은 선택성과 더 큰 착물화 상수를 나타내며 음용수 또는 폐수 처리 및 해수로부터 표적 금속 이온의 추출과 같은 실용적 용도에서 유용하기 때문이다. 이러한 관점에서, 우라늄은 해수에서 주로 우라닐 이온의 트리카르보나토(tricarbonato) 착물로서 전세계 원전이 약 6만년간 사용할 수 있는 양인 40억 톤 가량이 약 3 ppb의 농도로 존재한다. 따라서, IAEA(국제원자력기구)가 2008년 5월 기준으로 발표한 자료(세계 우라늄 확인매장량 474만 톤, 그리고 추정매장량 1055만 톤으로서 이는 세계 연간 사용량이 6.4만 톤임을 감안할 때 약 70년간 사용할 수 있을 정도의 양)를 고려할 때, 우라닐 이온(UO2 2+)에 대한 효과적인 호스트 분자의 디자인은 해수로부터 우라늄의 선택적 추출의 경제적 중요성과 연결된다. 그러나, 우라닐 이온 결합을 위해 지금까지 개발된 시스템은 다른 금속 이온의 간섭으로 인하여 우라닐 이온에 대해 요구되는 특이성이 결여되는 것으로 밝혀졌다. 그 결과, 크라운 에테르(crown ethers) 및 칼릭사렌(calixarenes)을 포함하는 거대 환식 호스트 분자를 이용한 우라닐 이온의 선택적인 분자 인식에 대한 연구가 이루어졌으나, 이러한 거대 환식 호스트 분자는 합성하기 위해 많은 노동을 필요로하며, 고체 지지체에 연결시키기 어려운 변형 때문에 바람직하지 못하다.
해수로부터 우라늄의 선택적 추출과 함께, 중요하게도, 바닷물 속에는 인듐(0.1 내지 2.0 pM) 또는 팔라듐(약 2.1 pM)과 같은 희소금속이 존재한다. 인듐과 같은 희소금속의 해수로부터의 선택적 추출은 세계적으로 첨단산업분야에서 기존 용도의 수요뿐만 아니라, 신규 첨단 소재와 관련된 반도체(InP), LCD(ITO), 태양전지 등 다양한 연구개발이 진행되고 있어 지속적으로 실용화 가능성이 확대되고 있다는 점에서, 그리고 Hi-Tech 산업계의 폭발적인 수요증가에 기인한 최근의 인듐의 수급 불안정과 함께 급격한 가격상승이 초래됨으로써 IT, NT 산업계에서는 인듐의 안정 공급을 위한 자원 확보전에 접어들고 있다는 점에서 매우 중요하다. 즉, 인듐 소비량에 대한 통계자료(Roskill Information Services; Carlin, 2006)에서 제시된 바와 같이 인듐 수요가 1987년까지 약 100 톤 미만으로 보고되었으나, 2000년 약 220 톤, 2005년에는 약 920 톤으로 대폭 증가하는 추세를 보이고 있으며, 2003년부터의 다양한 LCD 용 소재개발은 급격한 수요확대를 유도하고 있다. 이러한 인듐 금속가격은 2006년도 은(약 $400/kg)과 비교하여 인듐이 약 $1000 내지 800/kg으로서 2배 이상 높은 가격대가 형성되어 있다. 인듐과 함께 팔라듐 역시 다른 재료에 약간만 첨가하여도 물질의 성질을 바꿀 수 있다는 점에서 전자부품이나 연료전지, 배기가스 정화용 촉매제 등의 제조에 필수적이므로 첨단산업분야에서의 수요가 지속적으로 증가하고 있다. 2009년 기준으로 세계 인듐 추정매장량은 약 2700 톤이며, 세계 연간 수요는 약 1200 톤(ITO 수요량: 약 1000 톤)으로, ITO 재활용 과정에서 연간 회수 가능한 약 600 톤을 감안하더라도 이미 공급부족 현상이 나타나고 있으며 2005년부터 급격한 가격변동 양상을 보이고 있다. 팔라듐의 경우 인듐보다는 자원고갈 염려는 덜 하지만, 매장 집중도(98.7%)와 생산 집중도(90.1%)가 모두 높아 공급 불안정성이 매우 높다. 이에 따라 인듐 또는 팔라듐을 더 간단하고 빠르게 찾아내고 회수하는 것이 필요하게 되었다.
한편, 앱타머(aptamer)는 DNA, RNA, 소분자, 펩티드 및 단백질 등에 특이적으로 결합할 수 있는 비-천연 발생의 구조화된 올리고뉴클레오티드이다. 일반적으로, 앱타머는 셀렉스(SELEX; systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라는 시험관 내(in vitro) 선택 과정에 의해 선별되며, 단백질, 금속 이온 및 소분자의 특이적 검출 및 표적-특이적 전달과 같은 많은 생물분석의 용도로 사용되고 있다.
PNA(펩티드 핵산; peptide nucleic acid)는 인공적으로 합성한 DNA 또는 RNA의 유사체이다. 당 골격을 갖는 DNA 또는 RNA와 달리 펩티드 결합에 의해 연결된 반복되는 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위를 골격으로 가지며, DNA 또는 RNA와 동일한 다양한 퓨린 및 피리미딘 염기를 측쇄에 갖는다. 이러한 PNA는 DNA 또는 RNA와 유사한 특성을 가지면서도 열이나 pH 등의 자극에 보다 안정한 것으로 알려져 있다. 그러나 자연적으로 생성될 수 없고 합성으로만 제조될 수 있어 비용이 높다는 단점이 있어서 아직은 널리 상용화되지는 못하고 있다. 또한, DNA 또는 RNA 앱타머는 특이적인 표적 분자 인식 능력으로 바이오 칩 등으로 널리 활용되고 있는 반면 앱타머로서 PNA 분자는 그 활용이 아직 보고된 바 없다.
본 발명자들은 해수로부터 우라늄, 인듐, 팔라듐 등을 비롯한 금속을 효과적으로 추출하기 위한 방법을 찾기 위해 예의 연구하던 중, DNA 앱타머와 동일한 염기서열을 갖는 PNA가 DNA 앱타머와 같이 금속 이온에 특이적으로 결합할 수 있음을 처음으로 확인하여 앱타머로서의 기능을 할 수 있음을 밝혔다. 나아가 이로부터 PNA 앱타머가 동일한 염기서열을 갖는 DNA 앱타머와 유사한 3차원 구조를 형성할 수 있음을 제시하였다. 이에 금속 이온에 높은 특이성을 가지고 결합할 수 있는 PNA 앱타머를 이용하여 표적 금속이온을 분리할 수 있는 방법을 고안하고 이에 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 염기의 상보적 결합에 의해 특이적인 3차원 구조를 가지는 단일가닥 PNA 앱타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 염기의 상보적 결합이 두 개 이상 형성될 수 있도록 PNA 앱타머의 염기서열을 설계하는 제1단계; 및 상기 제1단계에 따라 설계된 PNA 앱타머를 합성하는 제2단계를 포함하는 상기 염기의 상보적 결합에 의해 특이적인 3차원 구조를 가지는 단일가닥 PNA 앱타머의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 표적 금속을 함유하는 시료와 표적 금속에 특이적인 PNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 표적 금속-PNA 앱타머 착물을 시료로부터 분리하는 단계; 및 표적 금속을 회수하는 단계를 포함하는, 표적 금속에 특이적으로 결합하는 PNA 앱타머를 이용하여 표적 금속을 분리하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 자세히 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 염기의 상보적 결합에 의해 특이적인 3차원 구조를 가지는 단일가닥 PNA 앱타머를 제공한다.
본 발명자들은 우라닐 이온에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 염기서열을 개시한 바 있다. 그러나 DNA는 다양한 미생물 등이 존재하는 자연 환경하에서 충분히 안정하지 않을 수 있으므로(Appl. Environ. Microbiol., 1987, 53: 170-179), 상기 DNA 앱타머는 해수로부터 우라닐 이온을 분리하여 우라늄을 회수하는 등의 목적에 사용되기에 적합하지 못할 수 있다. 이에 PNA가 DNA와 유사한 특성을 가지면서도 열, pH 등에 대한 안정성이 뛰어나고, DNase 등의 효소에 의한 가수분해의 영향을 받지 않으므로, 상기 우라닐 이온 특이적 DNA 앱타머와 동일한 염기서열을 갖는 PNA를 이용하여 우라닐 이온에 특이적으로 결합하는지 확인하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, N-말단에 시스테인을 도입한 서열번호 1의 Cys-PNA 1(N terminal-Cys-CTGCA GAATT CTAAT ACGAC TCACT ATAGG AAGAG ATGGC GACAT CTCTG CAGTC GGGTA GTTAA ACCGA CCTTC AGACA TAGGC AGGCG TATAT CTTGT GACGG TAAGC TTGGC AC-C terminal)을 고형 지지체인 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트-아미노폴리스티렌 수지에 결합시키고 이를 이용하여 우라닐 이온 용액에서 우라닐 이온 특이적 분리능을 확인하였다. 그 결과 상기 본 발명의 PNA는 우라닐 이온과 높은 비율로 결합하여 분리해 낼 수 있음을 확인하였다(도 3). 즉, 특정 표적 물질에 대한 DNA 앱타머와 동일한 서열의 PNA도 해당 표적 물질의 앱타머로 작용할 수 있음을 처음으로 확인하였다. 또한 서열번호 1의 우라닐 이온 특이적 DNA 앱타머와 동일한 서열을 갖는 서열번호 1의 PNA는 우라닐 이온 특이적 PNA 앱타머임을 또한 최초로 확인하였다. 따라서, 상기 본 발명의 서열번호 1의 우라닐 이온 특이적 PNA 앱타머는 우라닐 이온에 특이적으로 결합할 뿐 아니라, PNA 특징적인 온도, pH, 염 및 각종 분해효소에 대한 안정성을 가지므로 해수에서 우라닐 이온을 분리 회수하여 자원으로 활용하는데 이용될 수 있을 것이다. 또한 pH에 대한 안정성으로 우라닐 이온 회수 후 세척과정을 통해 반복하여 사용할 수 있을 것이다.
본 발명의 용어 "PNA(peptide nucleic acid; 펩티드 핵산)"는 DNA 또는 RNA와 유사하게 인공적으로 합성된 중합체이다. 그러나 이름과는 달리 산이 아니다. DNA 및 RNA는 각각 인산기를 포함하는 데옥시리보오스 및 리보오스 당 골격을 갖는 반면, PNA의 골격은 펩티드 결합에 의해 연결된 반복되는 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로 이루어 진다. 도 1에 나타난 바와 같이 다양한 퓨린 및 피리미딘 염기가 메틸렌 카보닐 결합에 의해 골격에 결합할 수 있다. PNA는 펩티드처럼 도시되어, N-말단이 좌측에, 그리고 C-말단이 우측에 표시된다. DNA 또는 RNA와는 달리 PNA 골격은 음으로 하전된 인산기(phosphate group)를 함유하지 않으므로 가닥 사이의 정전기적 반발력이 부재하므로 PNA/DNA 가닥 간의 결합이 DNA/DNA 가닥의 결합보다 강한 것으로 알려져 있다. 혼합 염기 PNA 분자는 염기쌍 인식 면에서 DNA 분자의 진정한 모사체이다. 이러한 합성 PNA 소중합체는 뛰어난 결합력으로 인해 분자 생물학적 과정, 진단 분석, 및 안티센스 치료에 사용되고 있다. 또한 PNA는 상보적인 염기서열의 DNA에 대한 높은 특이성을 갖는다. 이로 인해 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥 보다 염기 불일치에 보다 민감하게 반응한다. 상기 결합력과 서열 특이적 인식력은 PNA/RNA 이중가닥에도 적용된다. 또 다른 PNA의 장점은 핵산분해효소 또는 단백질분해효소에 의해 쉽게 인식되지 못하므로 이들 효소에 의한 분해로부터 안정하다는 것이다. 더불어 넓은 범위의 pH 영역에 대해서도 안정하다. 다만 소수성 골격으로 인해 인체에 적용시 세포 내 침투가 용이하지 않다는 것이 단점이나 이는 세포투과성 펩타이드를 공유결합시키는 등의 변형을 가하여 개선할 수 있다.
본 발명의 용어 "앱타머(aptamer)"는 그 자체로 안정된 3차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산((DNA, RNA 또는 변형핵산) 또는 펩티드이다. 앱타머는 무작위적인 서열을 가지는 핵산 라이브러리인 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 과정을 통해 얻을 수 있다. 상기 앱타머에 특이적으로 결합할 수 있는 분자는 소분자, 단백질, 핵산, 세포, 조직 등으로 매우 다양하다. 현재로서는 항체에 대한 좋은 대안으로 여겨지고 있으나, 금속이온들과 작은 화학 분자들까지도 나노몰 내지 피코몰 수준의 해리상수를 가질 만큼 특이적으로 결합한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어 "염기(base)"는 DNA 또는 RNA의 당 골격의 곁가지에 결합되어 반복적으로 나타나는 퓨린 또는 피리미딘 염기를 의미한다. DNA 분자를 구성하는 아데닌(adenine; A), 시토신(cytosine; C), 구아닌(guanine; G), 및 티민(thymine; T)의 4가지 염기, RNA 분자를 구성하는 상기 아데닌, 시토신, 구아닌과 티민을 대신하는 우라실(uracil; U), 및 이들의 유도체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "상보적 결합"은 상기 언급된 염기들의 서열 특이적 결합을 의미한다. 즉, 아데닌은 대응 가닥의 티민 또는 우라실과, 구아닌은 시토신과 각각 결합하며, 이들의 역쌍의 결합도 성립한다. 바꾸어 말하면, 예를 들어 아데닌은 또 다른 아데닌, 구아닌 또는 시토신과 결합하지 않는다. 이러한 서열 특이적 결합은 수소 결합에 염기 쌍 간의 수소 결합에 의한 것으로 이러한 상보적 결합에 의해 DNA 또는 RNA는 음전하를 띠는 골격 간의 정전기적 반발력에도 불구하고 이중가닥 구조를 형성할 수 있다. 그러나 이러한 상보적 결합은 이중가닥 구조에 한정되는 것이 아니라 상기 대응되는 염기의 조합 즉, 아데닌과 티민 또는 우라실, 구아닌과 시토신 또는 이들의 역조합 간에 형성되는 결합을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "특이적인 3차원 구조"는 단일가닥의 핵산 또는 핵산 유사체(DNA, RNA, PNA 등) 내에서 염기들 간의 상보적 결합에 의해 형성되는 서열에 따른 특이적인 3차원적 구조를 의미하며, 이러한 특이적인 3차원 구조에 의해 표적 분자를 특이적으로 인식할 수 있다. 단일가닥 핵산 상에서 서열상으로 근접하여 위치하지 않은 즉 하나 또는 그 이상의 염기로 분리되어있는 상보적 염기들이 쌍을 이루어 결합하면서 특이적인 3차원적 구조를 형성한다. 이러한 구조는 환경에 따라 결합과 풀림을 반복할 수 있으며, 서열이 동일하면 같은 환경에서는 재현성있게 동일한 구조를 형성한다. 즉, 서열 특이성을 갖는다.
앱타머는 소분자, 단백질, 핵산, 세포, 조직 등과 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 단일가닥 PNA는 소분자, 단백질, 핵산, 세포, 조직 등과 특이적으로 결합할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 금속에 특이적으로 결합할 수 있으며, 보다 바람직하게는 우라늄에 결합할 수 있고, 더욱 바람직하게는 우라닐 이온에 결합할 수 있다.
앱타머의 염기서열은 SELEX 과정을 통해 무작위적 염기서열로부터 선택될 수 있으나, 바람직하게 본 발명의 우라닐 이온 특이적 PNA 앱타머는 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다. 상기 PNA 앱타머는 고형 지지체에 연결된 것일 수 있으며, 바람직하게 고형 지지체는 아미노폴리스티렌 수지일 수 있으며, 보다 바람직하게는 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트-아미노폴리스티렌 수지일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 염기의 상보적 결합에 의해 특이적인 3차원 구조를 가지는 단일가닥 PNA 앱타머의 제조 방법으로서, 염기의 상보적 결합이 두 개 이상 형성될 수 있도록 PNA 앱타머의 염기서열을 설계하는 제1단계; 및 상기 제1단계에 따라 설계된 PNA 앱타머를 합성하는 제2단계를 포함하는 단일가닥 PNA 앱타머의 제조 방법을 제공한다.
상기 제1단계는 본 발명의 PNA가 앱타머의 특징인 서열 특이적 3차원 구조를 형성할 수 있도록 하기 위한 것으로, 두 개 이상의 분자 내 상보적 결합을 형성할 수 있는 서열을 가지도록 하여 동일한 서열을 갖는 PNA는 동일한 환경에서 재현성있게 특이적인 3차원 구조를 갖도록 결정할 수 있다. 상보적 결합을 형성하는 염기의 수가 많을 수록 결합력이 높으나 필수적인 요소는 아니다. 재현성있게 서열 특이적 3차원 구조를 형성하여 특정 표적 분자를 인식할 수 있는 서열이면 제한없이 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 용어 "설계"는 목적에 따라 PNA가 적절한 3차원 구조를 형성할 수 있도록 염기의 배열 순서를 결정하는 것을 의미한다. 바람직하게는 공지된 DNA 앱타머의 염기서열과 동일하게 또는 상보적으로 PNA 앱타머의 염기서열을 설계할 수 있다.
상기 제2단계는 상기 제1단계에서 설계된 염기서열에 따라 PNA 단량체로부터 원하는 서열의 PNA 다량체를 합성하는 단계이다. 본 발명의 용어 "합성"은 PNA 단량체를 차례로 결합시켜 다량체를 제조하는 과정을 의미한다. 공지의 방법으로 합성될 수 있다. 주식회사 파나진은 PNA 단량체 및 이의 제조방법, 및 PNA 다량체의 제조방법을 공개한 바 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 표적 금속을 함유하는 시료와 표적 금속에 특이적인 PNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 표적 금속-PNA 앱타머 착물을 시료로부터 분리하는 단계; 및 표적 금속을 회수하는 단계를 포함하는, 표적 금속 분리 방법을 제공한다.
상기 표적 금속을 함유하는 시료와 표적 금속 특이적인 PNA 앱타머를 접촉시키는 단계는 시료 중 표적 금속만을 PNA 앱타머에 특이적으로 결합시키기 위해 수행된다.
이후 분리 및 회수를 위하여 PNA 앱타머는 고형지지체에 연결시킬 수 있다. 바람직하게 고형 지지체는 아미노폴리스티렌 수지일 수 있고, 보다 바람직하게는 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트-아미노폴리스티렌 수지일 수 있다.
상기 표적 금속-PNA 앱타머 착물을 분리하는 단계는 산용액으로 세척하여 수행할 수 있다. 바람직하게 염산 수용액을 이용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 1 N 농도의 염산 수용액을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에 사용된 우라닐 이온과 PNA 앱타머의 결합 자리(binding site; BS) 간의 착물형성을 수식으로 나타내면 하기와 같이 설명될 수 있다.
[반응식 1]
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상기 K d는 해리 상수를 의미한다. 그러나, 우라닐 이온의 불용성 킬레이팅제의 경우, 우라닐 착물의 형성 상수(K f)는 고체 표면에의 기체 흡착을 위한 랑뮈르 등온선을 이용한 유추에 의해 정확하게 k ad/k de (식 2)로 표현될 수 있다. 우라닐 착물 (UO2 2+·BS)을 형성하기 위한 결합 부위(BS)에 의한 우라닐 이온의 착물형성은 후속 결합과 독립적임이, 다시 랑뮈르 등온선을 이용한 유추에 의해 추가로 가정될 수 있다. K f 가 매우 클 때 착물형성되지 않은 우라닐 이온의 평형 농도로부터 직접 K f를 측정하는 것은 가능하지 않다. 대신, K f는 하기 식 2와 식 4의 평형 과정의 조합인 식 3에 의해 나타난 교환 반응을 위한 평형 상수(K ex = k 1/k -1)를 측정함으로써 간접적으로 추정될 수 있으며, 그 이유는 K f가 K ex 및 K f carb (1021.54)로부터 계산될 수 있기 때문이다. 하기 식에서, [BS], [BS]0, 및 [UO2 2+·BS]는 BS 및 UO2 2+·BS가 용해되는 것으로 가정될 때 얻을 수 있는 BS의 농도, BS의 처음에 첨가된 농도, 및 UO2 2+·BS의 농도를 각각 나타낸다. 우라닐 이온의 처음 첨가된 농도는 [UO2 2+]0로 표현된다. [HCO3 -]>>[UO2 2+]0의 조건하에서 실험적으로 측정된 [UO2 2+·BS]로부터, 그리고 측정에 이용된 [CO3 2-], [UO2 2+]0, 및 [BS]0의 값으로부터, K ex의 값은, [HCO3 -]이 [HCO3 -]0와 근사할 수 있다는 가정을 기초로 하기 식 5에서 계산될 수 있다. pH 8.01 및 25℃에서 21 mM 바이카보네이트 이온의 존재하에서 PNA 앱타머-MCC-PS를 위한 logK f의 추정치는 20이었다. K d app와 K f의 추정치 사이의 차이는 저농도의 [UO2 2+]0에서 ICP-MS의 상대적으로 열등한 민감성에 의해 야기된 실험 오차로 인한 것으로 생각된다.
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경제적 용이성을 만족하기 위해서는 하루에 수지 1 그램 당 500 mg 이상의 우라늄의 추출이 필요한 것으로 추정되었다. 또한, 킬레이팅제는 여러번 재사용되어야 한다. 본 발명의 결과는 수지의 표면 상의 Cys-PNA 1의 mol%를 증가시키기 위하여, 앱타머-MCC-PS 수지에서 PNA 앱타머의 함량을 상승시키는 것이 필요하지만, 높은 log K f 값 및 PNA의 안정성으로 인하여 PNA 앱타머를 이용한 우라닐 이온의 분리가 해수 등으로부터 우라늄의 추출에 요구되는 경제적 기준을 충족시킬 수 있음을 잘 보여준다.
또한, 종래의 SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)를 이용하여, 표적 금속 이온을 위한 임의의 PNA 앱타머가 실용적으로 개발될 수 있으므로, 본 발명의 방법에 따라 PNA 앱타머를 이용하여 분리할 수 있는 금속은 특별히 제한되지 않으며, 특이적 앱타머가 개발될 수 있는 금속이라면 어떤 금속이든지 그 금속에 특이적인 PNA 앱타머를 이용하여 시료로부터 안정적으로 분리할 수 있을 것이며, 그에 따라 해수에 존재하는 인듐, 팔라듐 등도 효과적으로 분리할 수 있을 것이다.
본 발명은 PNA 분자가 앱타머로 작용할 수 있음을 최초로 밝혔으며, 특히 특정 표적 분자에 대한 공지의 서열의 DNA 앱타머와 동일한 서열을 갖는 PNA 앱타머는 동일한 표적 분자에 대해 특이성을 가짐을 또한 최초로 밝혔다. 서열번호 1의 우라닐 이온 특이적 PNA 앱타머는 해당 이온에 대한 특이성과 PNA 특유의 안정성으로 인해 해수로부터 우라늄 자원을 회수하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 또한 재사용도 가능하므로 높은 비용에 대한 부담을 줄일 수 있다.
도 1은 PNA의 화학 구조를 일반화하여 나타낸 도이다.
도 2는 PNA 앱타머-MCC-PS 수지의 제조 방법을 나타낸 도이다.
도 3은 PNA 앱타머-MCC-PS 수지의 우라닐 이온에 대한 결합 실험 결과를 나타낸 도이다. 결과로서 계산된 우라닐 이온에 대한 PNA 앱타머-MCC-PS 수지의 겉보기 해리상수는 21 mM 바이카보네이트 이온 존재 하에서 약 0.5 nM이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 아미노PS(amino-polystyrene) 수지와 연결된 PNA-기반 앱타머의 제조
모든 시약은 판매사로부터 구입하여 추가 정제없이 사용하였으며, 모든 실험을 위해 2차 증류수를 사용하였다. 서열번호 1의 염기서열을 가지는 PNA 1의 일 말단에 폴리스티렌 수지와의 결합을 위해 시스테인을 결합시킨 Cys-PNA 1의 형태로 제작하였다. 아미노폴리스티렌은 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)로부터 구입하였으며, 우라닐 이온 공급원으로는 Merck로부터 우라닐 아세테이트 디하이드레이트(UO2(CH3COO)2·2H2O, 99.0%)를 구입하여 사용하였다. 가교결합제로는 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexame-1-carboxylate; sulfo-SMCC, Sigma)를 사용하였다. PNA의 농도는 애질런트(Agilent) 8453 UV/VIS 분광광도계를 이용하여 260 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였고, 우라늄의 농도는 Perkin Elmer ELAN6100 모델을 이용한 ICP-MS(inductively coupled plasma-mass spectroscopy)로 측정하였다.
Cys-PNA 1을 이용하여 효과적인 고정된 우라노필(uranophile)을 구축하기 위하여, PNA 앱타머를 고형 지지체에 도입하여, 도 2에 나타낸 바와 같이 PNA 앱타머-MCC-PS를 제조하였다. 구체적으로, 고형 지지체로 사용된 아미노폴리스티렌(aminoPS) 수지 즉, 폴리스티렌-코-비닐벤질아민-코-다이비닐벤젠(polystyrene-co-vinylbenzylamine-co-divinylbenzene, 메쉬: 100 내지 200, 1.0 mmol N/그램 수지, Sigma)를 가교결합제인 sulfo-SMCC로 표면을 개질시켜 제조하였다. 상기 표면 개질을 위하여 아미노PS에 첨가된 sulfo-SMCC의 양은 과량으로 반응하도록 노출되는 아미노기의 5 mol%로 하였다(Zhang et al., Org. Lett., 2001, 3: 275-278; Derfus et al., Bioconjug. Chem., 2007, 18: 1391-1396). 수지와 연결된 Cys-PNA 1의 양은 약 2 nmol/g 수지로 측정되었다. 즉, 0.2 mol%의 아미노기가 Cys-PNA 1과 공유결합을 형성하였다.
실시예 2: 우라닐 이온 결합 실험
PNA 앱타머-MCC-PS에 결합될 수 있는 우라닐 이온의 양은 고정량의 앱타머-MCC-PS에서 측정하였다(도 3). 약 20 mg의 표면을 개질하고 PNA 앱타머를 공유결합시킨 아미노폴리스티렌 수지를 1 ml의 우라닐 아세테이트 용액, NaHCO3(21 mM) 및 HEPES(0.1 M; pH 8.01)에 현탁시켰다. 혼합물을 2일 동안 25℃에서 50 ×g로 진탕시켰다. 상기 우라닐 용액과 반응시킨 PNA 앱타머-MCC-PS를 여과하여 수집하고 3시간에 걸쳐 버퍼용액(0.55 M NaCl, HEPES 0.01 M, pH 8.01) 1 ml로 3회 세척하여 단순 흡착에 의해 수지에 결합된 UO2(CO3)3 4-를 제거하였다. ICP-MS에 의해 확인한 결과, 상기 NaCl 용액으로 3회에 걸쳐 세척하는 과정을 통해 흡착으로 느슨하게 결합된 우라늄 화학종은 충분히 제거되었다. 상기 세척한 PNA 앱타머-MCC-PS를 2 ml의 증류수로 3회 추가 세척하였다. 마지막으로 1 N 농도의 HCl 수용액 2 ml로 세척하여 PNA 앱타머에 특이적으로 결합된 우라닐 이온을 회수하고 ICP-MS로 정량하였다.
그 결과, 1 g의 수지에 약 0.1 마이크로그램의 우라늄이 착물화되었음을 확인하였다. 이는 상기 표면을 개질한 수지에 도입된 모든 PNA 앱타머가 우라닐 이온과 강하게 결합하였음을 의미한다.
또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 우라닐 이온에 대한 표면을 개질한 아미노PS 수지와 연결시킨 PNA-기반 앱타머의 겉보기 해리 상수(K d app)는 pH 8.01의 21 mM 바이카보네이트(bicarbonate) 이온 존재하에서 약 0.5 nM이었으며, 이는 DNA 앱타머-MCC-PS를 이용하였을 때 보다 약 5배 더 높은 값이다. DNA 앱타머가 자연상태에서 충분히 안정하지 못함을 고려할 때, 본 발명의 고형 지지체에 연결시킨 PNA-기반 앱타머는 매우 효과적인 고정된 우라노필로 사용될 수 있으며, 높은 log Kf 값 및 해수 환경에서의 안정성으로 우라늄 추출을 위해 요구되는 경제적 기준을 충족시킬 수 있음을 제시한다.

Claims (19)

  1. 염기의 상보적 결합에 의해 특이적인 3차원 구조를 가지는 단일가닥 PNA 앱타머.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단일가닥 PNA는 금속에 특이적으로 결합하는 것인 PNA 앱타머.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 금속은 우라늄인 것인 PNA 앱타머.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 우라늄은 우라닐 이온의 형태인 것인 PNA 앱타머.
  5. 제1항에 있어서,
    서열번호 1의 염기서열을 갖는 것인 PNA 앱타머.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PNA 앱타머는 고형 지지체에 연결된 것인 PNA 앱타머.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 고형 지지체는 아미노폴리스티렌 수지인 것인 PNA 앱타머.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 아미노폴리스티렌 수지는 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트-아미노폴리스티렌 수지인 것인 PNA 앱타머.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된, 염기의 상보적 결합에 의해 특이적인 3차원 구조를 가지는 단일가닥 PNA 앱타머의 제조 방법으로서,
    염기의 상보적 결합이 두 개 이상 형성될 수 있도록 PNA 앱타머의 염기서열을 설계하는 제1단계; 및
    상기 제1단계에 따라 설계된 PNA 앱타머를 합성하는 제2단계를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 제1단계는 DNA 앱타머의 염기서열과 동일하게 또는 상보적으로 PNA 앱타머의 염기서열을 설계하는 것이 특징인 방법.
  11. 표적 금속을 함유하는 시료와 표적 금속에 특이적인 PNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 표적 금속-PNA 앱타머 착물을 시료로부터 분리하는 단계; 및 표적 금속을 회수하는 단계를 포함하는, 표적 금속 분리 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 PNA 앱타머는 고형 지지체에 연결된 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 고형 지지체는 아미노폴리스티렌 수지인 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 아미노폴리스티렌 수지는 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트-아미노폴리스티렌 수지인 것인 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 금속은 우라늄인 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 표적 금속이 우라늄인 PNA 앱타머는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것인 방법.
  17. 제11항에 있어서,
    상기 표적 금속-PNA 앱타머 착물을 분리하는 단계는 여과하여 수행되는 것인 방법.
  18. 제11항에 있어서,
    상기 표적 금속을 회수하는 단계는 산용액을 이용하여 세척하는 방법으로 수행되는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 산용액은 염산 수용액인 것인 방법.
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