WO2012104355A1

WO2012104355A1 - Antivirales mittel enthaltend rekombinante mistellektine

Info

Publication number: WO2012104355A1
Application number: PCT/EP2012/051708
Authority: WO
Inventors: Hans Lentzen; Klaus Witthohn
Original assignee: Cytavis Biopharma Gmbh
Priority date: 2011-02-01
Filing date: 2012-02-01
Publication date: 2012-08-09
Also published as: DE102011003478A1; DK2670420T3; EP2670420B8; US20140128317A1; US10413586B2; ES2599171T3; EP2670420B1; PL2670420T3; US9839669B2; EP2670420A1; US20180085430A1; US20160175390A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein antivirales Mittel enthaltend rekombinante Mistellektine zur Behandlung von Virusinfektionen, sowie ein Arzneimittel und / oder pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Virusinfektionen.

Description

Antivirales Mittel enthaltend rekombinante Mistellektine

Bei einer Virusinfektion dringen Viren in einen Organismus ein und vermehren sich dort. Die in der Regel darauf folgende Reaktion des Organismus kann sich in einer Infektionskrankheit äußern. Beim Menschen können eine Vielzahl von Krankheiten durch Viren verursacht werden. Nur gegen eine begrenzte Anzahl von Virusinfektionen sind gegenwärtig zur Vorbeuge schützende Impfungen möglich. Da Viren im Gegensatz zu Bakterien keine Zellen sind, können sie auch nicht wie solche abgetötet werden. Es ist lediglich möglich, eine virale Infektion und die Virusvermehrung zu behindern oder zu verhindern.

Im Folgenden wird beispielhaft für die Vielzahl von möglichen Viruserkrankungen eine Infektion mit Herpes-simplex-Viren näher erläutert.

Herpes-simplex-Viren sind weltweit verbreitet und der Mensch ist für sie als Reservoir der einzige natürliche Wirt. In Deutschland konnten bei 84 bis 92% der Personen einer altersnormalisierten Stichprobenuntersuchung Antikörper gegen Herpes-simplex-Viren nachgewiesen werden. Durch das Herpes-simplex-Virus verursachte Erkrankungen, gehören zu den häufigsten Infektionskrankheiten der Haut. Die meisten Infektionen treten im Gesicht und im Genitalbereich auf. Es ist allgemein bekannt, dass das Herpes-simplex-Virus eine rekurrente Virusinfektion ist, welche durch das Erscheinungsbild entweder von einzelnen oder mehreren Ansammlungen von kleinen Vesikeln auf der Haut oder Schleimhautmembranen gekennzeichnet ist.

Es gibt zwei primäre Typen des Herpes-simplex-Virus (HSV) - HSV 1 und HSV 2. Sie unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Krankheitsbilder und der Krankheitslokalisation geringfügig. Nach dem Auftreten und der Lokalisation der Krankheitssymptome unterscheidet man klinisch verschiedene HSV-Infektionen, deren wichtigste der Herpes Simplex labialis (Lippenherpes) und der Herpes Simplex genitalis darstellen. Nach einer Erstinfektion verbleibt das Virus in einem Ruhezustand (Latenz) stets lebenslang im Organismus, was man als persistierende Infektion bezeichnet. Die Therapie von HSV- Infektionen vermag diese Persistenz nicht zu beenden, sondern sie versucht die Vermehrung des Virus nach einer erfolgten Reaktivierung aus dem Ruhestadium zu verhindern.

Zur Behandlung von Virusinfektionen werden u.a. Wirkstoffe angewandt, die unter der Bezeichnung Virostatika subsummiert werden. Diese Arzneimittel greifen an unterschiedlichen Stellen in die Virusvermehrung ein und verhindern so ein weiteres Ausbreiten des Erregers. Die zur Bekämpfung von Herpes simplex-Viren bei Lippenherpes häufig angewandten Virostatika gehören zur Gruppe der sog. Nukleosidanaloga. Sie hemmen die DNA-Synthese und damit die Virusvermehrung. Da Nukleosidanaloga immer in die Virusvermehrung eingreifen, funktionieren sie nur bei sich aktiv reproduzierenden Viren. Unter diesen Nukleosidanaloga hat sich die als Aciclovir bekannte Verbindung als wirksam erwiesen, die jedoch auch einige Nebenwirkungen aufweist. Die Ausscheidung von Aciclovir findet über die Niere statt. Es sind Nierenprobleme bekannt geworden bei großen, schnell und intravenös verabreichten Dosen, weil dann Aciclovir in den Nieren auskristallisieren kann. Ferner kann Aciclovir auch in die zelluläre DNA eingebaut werden und stellt somit ein chromosomales Mutagen dar. Au ßerdem können sich Resistenzen entwickeln.

Obwohl die Nukleosidanaloga einen großen Wert besitzen, bleibt das Bedürfnis an verbesserten Medikationen bestehen, um die Symptome, die durch die Ausbrüche von Virusinfektionen auftreten, besser behandeln zu können.

Ferner gibt es einige Viren, die die Entstehung von Krebs begünstigen, wenn sie über lange Zeit eine latente Infektion verursachen. So wurden beispielsweise Papillomviren mit dem Zervixkarzinom in Verbindung gebracht, Epstein-Barr-Virus mit dem Nasopharynxkarzinom.

Mistelextrakte werden seit Jahrhunderten therapeutisch genutzt. Insbesondere in der Krebstherapie sind Mistelpräparate mit unterschiedlichem Erfolg eingesetzt worden (Bocci V 1993 J Biol Regulators and Homeostatic Agents 7(1 ): 1 - 6; Gabius H-J, Gabius S, Joshi S S et al. 1993 Planta Med 60: 2 - 7; Gabius H-J & Gabius S 1994 PZ 139: 9 - 16; Ganguly C & Das S 1994 Chemotherapy 40: 272 - 278, Hajto T, Hostanska K, Gabius H_J 1989 Cancer Res 49: 4803 - 4808, Hajto T, Hostanska K, Frei K et al. 1990 Cancer Res. 50: 3322 - 3326). Es zeigte sich, dass die therapeutischen Effekte insbesondere durch sogenannte Mistellektine (Viscumine, Viscum album Agglutinine, VAA) vermittelt werden. Den Mistellektinen wird dabei neben einer zytotoxischen Wirkung auch eine unspezifische Immunstimulation zugesprochen, deren positive Effekte zur Therapie von Tumorpatienten genutzt werden. Verschiedene Untersuchungen mit Mistellektinen in vitro (Hajto et al., 1990 (supra); Männel D N, Becker H, Gundt A et al. 1991 Cancer Immunol Immunother 33: 177 - 182; Beuth J, Ko K L, Tunggal L et al. 1993 Drug Res 43: 166 - 169) und in vivo (Hajto T 1986 Oncology 43 suppl 1 : 51 - 65; Hajto et al., 1989 (supra), Beuth J, Ko H L, Gabius H-J et al. 1991 In Vivo 5: 29 - 32; Beuth J, Ko H L, Gabius H-J et al. 1992 J Clin Invest 70: 658 - 661 ), sowie klinische Studien (Beuth et al., 1992 (supra)) zeigten eine erhöhte Freisetzung von inflammmatorischen Zytokinen (TNF-alpha, IL-1 , IL-6) und eine Aktivierung von zellulären Komponenten des Immunsystems (TH -Zellen, NK-Zellen). Nur wenige Studien haben bisher die antivirale Wirksamkeit von nativen Mistellektinen untersucht, die jedoch Extrakte aus Mistellektinen darstellen. Karagöz et al. (Phytother. Res. 17, 560-562, 2003) haben bisher die antivirale Wirksamkeit von Extrakten der Europäischen Mistel (Viscum album L.) untersucht. Karagöz et al erforschten, ob verschiedene Mistelextrakte eine antivirale Wirksamkeit auf das humane Parainfluenzavirus Typ 2 (HPIV- 2) aufweisen. Dabei wurden die folgenden Mistellextrakte untersucht: ein wässriger Extrakt, ein Ethanol-Extrakt, ein Petroleum-Ether-Extrakt, ein Chloroform-Extrakt und ein Aceton- Extrakt. Das Testsystem bestand aus Vero-Zellen, dem humanen HPIV-2 und den verschiedenen Mistellextrakten. Es wurden Zytotoxititätstests und Plaque-Assays durchgeführt. Es zeigte sich, dass der wässrige Extrakt eine signifikante Wirkung gegen die HPIV-2-Replikation aufwies, während der Chloroform-Extrakt eine moderate Aktivität besaß. Die restlichen Extrakte zeigten keine signifikante Wirkung auf die HPIV-2-Replikation.

Bei den im Stand der Technik beschriebenen Mistelextrakten handelt es sich um Vielstoffgemische pflanzlichen Ursprungs, deren Inhaltsstoffe nicht beschrieben und auch nicht charakterisiert sind. Somit bleibt mit den Untersuchungen von Karagöz et al. ungeklärt, welche Substanzen in dem wässrigen Extrakt die Aktivität gegen die HPIV-2-Replikation aufwiesen. Pflanzliche Extrakte sind heterogen in der Zusammensetzung ihrer Inhaltsstoffe. Aus diesem Grund bestehen Schwierigkeiten Extrakte hinsichtlich einer pharmakologischen Wirkung auf bestimmte Konzentrationen eines oder mehrerer Inhaltsstoffe einzustellen.

Durch Analysen des Mistelextraktes konnten bisher drei Mistellektine (ML-I, ML-II, ML-III) mit unterschiedlichen Molekulargewichten und Zuckerbindungsspezifitäten identifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass der immunstimulierende Effekt des Mistelextrakts auf das ML-I zurückzuführen ist. Das ML-I-Lektin besteht aus jeweils zwei glykosylierten A- und B- Ketten (MLA bzw. MLB). Die A-Kette ist für eine enzymatische Inaktivierung von Ribosomen (Endo et al., 1988) verantwortlich ist, während die B-Kette bei der Carbohydratbindung beteiligt ist. Die beiden Ketten sind durch Disulfidbrücken miteinander verknüpft. Die resultierenden Mistellektin-Monomere können sich unter Ausbildung von nicht kovalenten Bindungen zu Dimeren zusammenlagern.

Mittlerweile ist es möglich, das biologisch aktive Mistellektin auch rekombinant herzustellen. EP 0 751 221 beschreibt die Reindarstellung von Mistellektin-Polypeptiden als strukturell homogene Substanz, wobei ausgehend von den Gensequenzen des Mistellektins rekombinante, hochreine Einzelketten (A-Kette, B-Kette) hergestellt werden, die in vitro reassoziiert werden können und so ein rekombinantes Mistellektin-Holoprotein ergeben, das proteinchemisch, enzymatisch und strukturell homogen ist, sogenanntes Aviscumin. Gemäß EP 0751221 ist das rekombinante Mistellektin-Polypeptid sowohl als Holoprotein, als Teilkette und in Form von Subfragmenten für therapeutische Zwecke geeignet und erfindungsgemäß mitumfasst.

Bisher wurden rekombinante Mistellektine insbesondere in der Behandlung von Tumorerkrankungen eingesetzt. In EP 0 751 221 wird zwar erwähnt, dass rekombinante Mistellektine auch für die Behandlung von Infektionserkrankungen denkbar wären, jedoch werden keinerlei Hinweise offenbart, dass eine Behandlung von Virusinfektionen mit rekombinanten Mistellektinen wirksam ist. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, antivirale Mittel bereitzustellen mit denen Virusinfektionen wirksam behandelt werden können. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Arzneimittels sowie pharmazeutischer Zusammensetzungen für die Behandlung von Virusinfektionen. Die Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines antiviralen Mittels samt Bereitstellung eines Arzneimittels sowie einer pharmazeutischen Zusammensetzung gelöst, wobei diese rekombinante Mistellektine zur Behandlung und Prophylaxe von Virusinfektionen enthalten, wobei die rekombinanten Mistellektine die folgenden Aminosäuresequenzen umfassen.

Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße antivirale Mittel die Mistellektin-A-Kette (MLA) beziehungsweise die Mistellektin-B-Kette (MLB), jeweils einzeln oder zusammen, auch in Form von Dimeren (Siehe z.B. EP 0 751 221 oder EP 1 051 495).

Das rekombinante Mistellektin-Polypeptid der Mistellektin-A Kette umfasst die folgenden Sequenzen: SEQ ID No. 1 - 3, einschließlich deren Isoformen oder ein funktionelles Fragment davon.

Das rekombinante Mistellektin-Polypeptid der Mistellektin-B Kette umfasst die folgenden Sequenzen SEQ ID No. 4 - 12, einschließlich deren Isoformen oder ein funktionelles Fragment davon.

(nachstehend allesamt„rekombinante Mistellektine")

Weiterhin bevorzugt ist Aviscumin eine Heterodimer bestehend aus den Sequenzen SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 4.

Die Erfindung betrifft ein antivirales Mittel enthaltend rekombinantes Mistellektin zur Anwendung bei Virusinfektionen oder um Virusinfektionen vorzubeugen, wobei das rekombinante Mistellektin ausgewählt ist aus der Gruppe der Aminosäuresequenzen SEQ ID No. 1 - 12 oder Teile und Fragmente davon umfasst oder eine Kombination davon.

Der Begriff "funktionelles Fragment" definiert im Zusammenhang mit dieser Erfindung Fragmente der genannten Polypeptide, welche die gleiche biologische Funktion besitzen, wie das mit der jeweiligen Aminosäuresequenz oben dargestellte Polypeptid.

Der Begriff "gleiche biologische Funktion" beschreibt in diesem Zusammenhang beispielsweise, dass Fragmente oder Derivate der Polypeptide die gleichen Signale in einer Zelle induzieren, wie die genannten Peptide. Beispiele für Fragmente sind Peptiddomänen mit definierten Funktionen. Die "gleiche biologische Funktion" umfassen auch die Zytotoxizität, Immunstimmulation (sowohl des nativen, als auch des adaptiven Immunsysterns), Stimulation der Freisetzung von Zytokinen, Antigenität, die Induktion der Expression oder die Aktivierung von Oberflächenmarkern, die Induktion von Apoptose oder Endorphin-Stimulation.

Unter "biologischer Aktivität des rekombinanten Mistellektins" wird hier jede biologische Aktivität aus dem Spektrum der gesamten biologischen Aktivitäten des rekombinanten Mistellektins verstanden. Eine derartige Funktion ist z.B. die pharmakologische Wirkung des rekombinanten Mistellektins.

Untersuchungen von ML-I-Monomeren ergaben 25 verschiedene Isoformen, die auf unterschiedliche Kombinationen verschiedener A- und B-Ketten sowie unterschiedliche Glykosylierungszustände der Ketten zurückzuführen sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher ebenfalls ein Mistellektin-Polypeptid oder ein Fragment davon, welches die Sequenzvariabilität der verschiedenen MLA- und MLB-Ketten zu den Sequenzen SEQ ID No. 1 - 12 erfindungsgemäß umfasst. Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäße antivirale Mittel ein rekombinantes Mistellektin- Polypeptid mit den Sequenzen SEQ ID No. 1 - 12 oder einem funktionellen Fragment davon oder eine beliebige Kombination davon.

Wie oben bereits erwähnt, werden rekombinante Mistellektine bisher in erster Linie bei der Behandlung von Tumorerkrankungen verwendet. Bis heute ist jedoch nicht aufgezeigt worden, dass rekombinante Mistellektine eine Wirkung auf Virusinfektionen haben. Überraschender Weise hat die Erfindung gezeigt, dass rekombinante Mistellektine wirksam gegen Virusinfektionen eingesetzt werden können, wie in den Beispielen eindrucksvoll gezeigt. Die erfindungsgemäßen Sequenzen, insbesondere Aviscumin, weisen bereits eine Zytotoxizität von 0,5 ng/PIaque auf.

Besonders vorteilhaft weisen die rekombinanten Mistellektine gegenüber den Mistellektinen im Stand der Technik keine Verunreinigungen auf, so dass eine geringere Dosis bereits eine erhöhte Wirksamkeit aufweist. Ferner wird durch rekombinante Mistellektine eine hohe Dosiergenauigkeit erreicht, so dass eine erfolgreiche (lokal)spezifische antivirale Behandlung erlaubt ist. Das erfindungsgemäße antivirale Mittel wird daher für die Behandlung von einer der folgenden Virusinfektionen verwendet: Herpes-simplex-Virusinfektion, Adenovirusinfektion, Poliovirusinfektion, Pockenvirusinfektion, Parvovirusinfektion, Papovavirusinfektion, Hepadnavirusinfektion, Orthomyovirusinfektion, Papillomavirusinfektion,

Paramyxovirusinfektion, Coronavirusinfektion, Picornavirusinfektion, Reovirusinfektion, Togavirusinfektion, Flavivirusinfektion, Arenavirusinfektion, Rhabdovirusinfektion, Retrovirusinfektion.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Behandlung von Hautviruswarzen, Anogenitale Warzen, Schleimhautwarzen und maligne Tumore wie Zervixkarzinom, Penis- und Vulvakarzinom, insbesondere im Zuge einer Papillomavirusinfektion (HPV).

Die Erfindung betrifft außerdem ein Arzneimittel für die Behandlung von Virusinfektionen, welches das rekombinante Mistellektin-Polypeptid, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält. Beispiele für besonders geeignete pharmakologisch verträgliche Träger sind dem Fachmann bekannt und umfassen gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen wie z.B. Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Detergenzien, sterile Lösungen, etc. Arzneimittel, die solche Träger umfassen, können mittels bekannter konventioneller Methoden formuliert werden. Diese Arzneimittel können einem Individuum in einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Die Verabreichung kann lokal, oral oder parenteral erfolgen, z.B. intravenös, intraperitoneal, subcutan, intramuskulär, lokal, intranasal, intrabronchial oder intradermal, oder über einen Katheter an einer Stelle in einer Arterie. Die Art der Dosierung wird vom behandelnden Arzt entsprechend den klinischen Faktoren bestimmt. Es ist dem Fachmann bekannt, dass die Art der Dosierung von verschiedenen Faktoren abhängig ist, wie z.B. der Körpergröße bzw. dem Gewicht, der Körperoberfläche, dem Alter, dem Geschlecht oder der allgemeinen Gesundheit des Patienten, aber auch von dem speziell zu verabreichenden Mittel, der Dauer und Art der Verabreichung, und von anderen Medikamenten, die möglicherweise parallel verabreicht werden. Die Erfindung betrifft au ßerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche die erfindungsgemäßen rekombinanten Mistellektin-Polypeptide umfasst. Die Zusammensetzung kann lokal oder systemisch verabreicht werden. Präparate für eine parenterale Verabreichung umfassen sterile wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht-wäßrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle wie z.B. Olivenöl, und organische Esterverbindungen wie z.B. Ethyloleat, die für Injektionen geeignet sind. Wäßrige Träger umfassen Wasser, alkoholisch-wäßrige Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Salzlösungen und gepufferte Medien. Parenterale Träger umfassen Natriumchlorid-Lösungen, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Ringer-Laktat und gebundene Öle. Intravenöse Träger umfassen z.B. Flüssigkeits-, Nährstoff- und Elektrolyt-Ergänzungsmittel (wie z.B. solche, die auf Ringer- Dextrose basieren).

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann au ßerdem Konservierungsmittel und andere Zusätze umfassen, wie z.B. antimikrobielle Verbindungen, Antioxidantien und Komplexbildner. Des Weiteren können Verbindungen wie z.B. Interleukine, Interferone, oder ein unspezifisches immunmodulatorisches Agens enthalten sein. Ebenso können Zytostatika, Antibiotika und Kombinationen davon enthalten sein. Die pharmazeutische Zusammensetzung wird erfindungsgemäß bei der Behandlung der oben genannten Virusinfektionen verwendet.

Vorzugsweise liegt die erfindungsgemäße Zusammensetzung als Lösung, Gel oder Creme vor.

Die Erfindung betrifft des Weiteren die Verwendung eines rekombinanten Mistellektins zur Herstellung eines antiviralen Mittels zur Behandlung von oben genannten Virusinfektionen. Vorzugsweise umfasst die Behandlung das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge des rekombinanten Mistellektins an einen Menschen, welcher an einer Infektion erkrankt ist oder voraussichtlich erkranken wird.

Die Wirksamkeit der Erfindung bei der Behandlung von Virusinfektionen wird beispielhaft anhand der folgenden Untersuchung erläutert. Nachfolgende Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne jedoch die Erfindung auf diese Beispiele zu beschränken. Beispiele:

Vero-Zellen (Nierenzellen von African green monkeys) und BGM-Zellen (Nierenzellen von Borgio green monkeys) wurden im Rahmen einer logi₀ Verdünnungsreihe mit Herpes- Simplex- Viren vom Typ 1 (HSV-1 ) für 2 Stunden inkubiert. Nach der Infektion der Zellen wurde das Virus entfernt. Das rekombinante Mistellektin wurde mit Zellkulturmedium verdünnt, das sowohl mit als auch ohne Störsubstanzen verwendet wurde. Als Störsubstanzen wurden 10% fötales Kälberserum und 3% Rinderserumalbumin mit Schaferyth rozyten verwendet. Pro well wurden 200 μΙ der Lösung mit rekombinantem Mistellektin auf die infizierten Zellen aufgebracht. Als Viruskontrolle wurde Zellkulturmedium auf die infizierten Zellen aufgebracht. Als Negativkontrolle gegen HSV-1 wurde Aciclovir (1 ,5 mmol) an Stelle des rekombinanten Mistellektins verwendet. Die Zellen wurden bei 37°C +/- 1 °C für 2-7 Tage inkubiert.

Nach der Inkubation wurden die Zellen mit einem inversen Mikroskop auf cytopathische Effekte (CPE) untersucht und es wurde die 50% infektiöse Dosis bezogen auf eine Zellkultur TCID₅₀/ml (Tissue Culture Infectious Dosis) bestimmt. Sofern keine cytopathischen Effekte sichtbar waren, bedeutete dies, dass die Viren erfolgreich durch das rekombinante Mistellektin inaktiviert worden waren. Um einen detaillierteren Eindruck der Virusreduktion zu erhalten, wurde ein Plaque- Reduktions-Assays durchgeführt, um die antivirale Wirksamkeit des rekombinanten Mistellektins zu bestimmen. Hierfür wurden die Vero-Zellen / BGM-Zellen in 12-well-Platten platziert.

Die semi-adherenten Zellen wurden mit einer logi₀ Verdünnungsreihe des HSV-1 (100 μΙ pro well) für 2 Stunden inkubiert. Nach der Infektion der Zellen wurde das Virus entfernt. Das rekombinante Mistellektin wurde mit Zellkulturmedium (mit und ohne Störsubstanzen) verdünnt und mit warmer Agarose 1 :1 vermischt. Als Störsubstanzen wurde fötales Kälberserum und Schaferythrozyten verwendet

Von der rekombinanten Mistellektin enthaltenden Lösung wurden 2 ml auf die infizierten Zellen aufgebracht. Als Viruskontrolle wurde Zellkulturmedium auf die infizierten Zellen aufgebracht. Als Negativkontrolle gegen HSV-1 wurde Aciclovir (1 ,5 mmol) an Stelle des rekombinanten Mistellektins verwendet. Nach der Gelierung der Agarose wurden die Zellen bei 37°C +/- 1 °C für 7 Tage inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen für 4 Stunden mit Methanol fixiert, das 4% Natriumchlorid enthielt. Danach wurden die Zellen mit Kristallviolett gefärbt. Die virusinduzierten Plaques wurden unter dem Mikroskop gezählt und der TCID₅₀/ml wurde bestimmt. Im Rahmen dieser Untersuchung sind die folgenden Validierungsschritte durchgeführt worden:

- Identifizierung des geeigneten Virustiter mit der entsprechenden Zelllinie.

- Identifizierung der Konzentration an rekombinantem Mistellektin, die von der entsprechenden Zelllinie toleriert wird durch Messung der Zytotxizität und Vitalität.

- Identifizierung der Konzentration an rekombinantem Mistellektin, welche die Zelllinie empfänglich für eine Virusinfektion lässt.

Ergebnisse:

Die Untersuchung zeigte überraschenderweise eine antivirale Wirksamkeit von rekombinantem Mistellektin gegen HSV-1 und gegen Adeno Virus Typ 5. Eine Konzentration von 50 ng/ml von rekombinantem Mistellektin verursachte im Suspensionsassay mit HSV-1 / BGM-Zellen eine Virustiterreduktion von 2,43 log₁₀ ohne Störsubstanzen und ohne die Verwendung von MicroSpin-Säulen (siehe Tabelle 2). Bei einer Konzentration von 500 ng/ml von rekombinantem Mistellektin zeigte sich eine Virustiterreduktion von 2,57 log₁₀ und > 3,29 logio bei einer Verwendung von MicroSpin-Säulen und FCS als Störsubstanz (siehe Tabelle 2).

Beim PIaque-Reduktions-Assays zeigte sich eine durchschnittliche relative Inhibierung der HSV-1 Infektion von 17,04% bei einer Konzentration von 0,5 ng/ml rekombinante Mistellektin (ohne MicroSpin-Filtration) beziehungsweise eine durchschnittliche relative Inhibierung der HSV-1 Infektion von 7,41 % mit MicroSpin-Filtration (siehe Tabelle 3).

Die durchschnittliche relative Inhibierung der Adeno Virus Typ 5 Infektion im Plaque- Reduktions-Assay betrug 79,7 % bei einer Konzentration von 0.5 ng/ml rekombinantem Mistellektin (ohne MicroSpin-Filtration) beziehungsweise 22,2 % mit Microspin-Filtration (siehe Tabelle 4).

Tabelle 1 : Ergebnisse der Zytotoxizitätstests der Testzellen

Zelllinie Vero Vero BGM BGM

mit microSpin ohne mit microSpin ohne microSpin microSpin 7 Tage Inkubation 7 Tage Inkubation

Rekombinantes Mistellektin zytotoxisch zytotoxisch n.t. n.t.

5000 ng/ml

Rekombinantes Mistellektin zytotoxisch zytotoxisch zytotoxisch zytotoxisch 500 ng/ml

Rekombinantes Mistellektin zytotoxisch zytotoxisch negativ zytotoxisch 50 ng/ml

Rekombinantes Mistellektin negativ zytotoxisch negativ negativ

5 ng/ml

Rekombinantes Mistellektin negativ negativ negativ negativ 0,5 ng/ml

Rekombinantes Mistellektin negativ negativ negativ negativ 0,05 ng/ml

Rekombinantes Mistellektin n.t. n.t. negativ negativ 0,005 ng/ml

Negativkontrolle n.t. negativ n.t. negativ n.t. = nicht geprüft

Tabelle 2: Test auf antivirale Wirksamkeit von rekombinantem Mistellektin bei HSV- 1 , Wirt: BGM-Zellen (Zellsuspension)

Tabelle 3: Test auf antivirale Wirksamkeit von rekombinantem Mistellektin, PIaque-Assay mit

HSV- 1 auf Vero-Zellen

Virusverdünnung Viruskontrolle Aciclovir Rekombinates Mistellektin

(1 ,5mmol) 0,5 ng/ml 0,5 ng/ml 0,5 ng/ml ohne Spin mit Spin mit Spin

Anzahl > 50, > 50, 6 0, 0, 0 > 50, > 50, 1 0, > 50, zytotoxisch Plaques >50 > 50

Mittelwert > 35 0 > 50 > 36

_{1 0}-5,0

StabW n.d. 0 n.d. n.d. n.d. Relative 100 0 100 100 n.d. Infektiosität

Relative 0 100 0 0 n.d. Hemmung

Anzahl 5, 5, 4, 4 0, 0, 0, 0 6, 5, 3, 2 3, 4, 4, 3 zytotoxisch Plaques

Mittelwert 4,5 0 4,0 3,5

_{1 0}-5,48

StabW 0,57 0 1 ,82 0,57 n.d.

Relative 100 0 88,88 77,77 n.d. Infektiosität

Relative 0 100 1 1 ,12 22,23 n.d. Hemmung

Anzahl 2, 3, 3, 2 0, 0, 0, 0 1 , 2, 1 , 2 2, 3, 1 , 4 zytotoxisch Plaques

Mittelwert 2,5 0 1 ,5 2,5

10^"5'⁹⁵ StabW 0,57 0 0,57 1 ,29 n.d.

Relative 100 0 60,0 100 n.d. Infektiosität

Relative 0 100 40,0 0 n.d. Hemmung

Durchschnittliche relative n.a 100 17,04 7,41 n.d. Hemmung

n.d. = nicht detektierbar

n.a. = nicht zu bewerten

Tabelle 4: Test auf antivirale Wirksamkeit von rekombinantem Mistellektin, PIaque-Assay mit

Adeno Virus Typ 5 auf BGM-Zellen

Virusverdünnung Viruskontrolle Rekombinates Mistellektin

0,5 ng/ml 0,5 ng/ml 0,5 ng/ml

ohne Spin mit Spin mit Spin

Anzahl 5, 5, 8 2, 3, 0 1 1 , 8, 8

Plaques zytotoxisch

Mittelwert 6 1 ,66 9

_{1 0}-4,0

StabW 1 ,73 1 ,52 1 ,73. n.d.

Relative 100 27,7 100 n.d.

Infektiosität

Relative 0 72,3 0 n.d.

Hemmung

Anzahl 3, 4, 2, 3 0, 0, 0, 0 4, 2, 2, 4

Plaques zytotoxisch Mittelwert 3 0 3

_{1 0}-4,48

StabW 0,81 0 1 ,15 n.d.

Relative 100 0 100 n.d. Infektiosität

Relative 0 100 0 n.d. Hemmung

Anzahl 1 , 1 , 2, 2 0, 0, 2, 0 0, 0, 0, 2 Plaques zytotoxisch

Mittelwert 1 ,5 0,5 0,5

_{1 0}-4,95

StabW 0,57 1 ,0 1 ,0 n.d.

Relative 100 33,3 33,3 n.d. Infektiosität

Relative 0 66,7 66,7 n.d. Hemmung

Durchschnittliche relative n.a 79,7 22,2 n.d. Hemmung

n.d. = nicht detektierbar

n.a. = nicht zu bewerten

Claims

Patentansprüche

1 . Antivirales Mittel enthaltend rekombinantes Mistellektin zur Anwendung bei

Virusinfektionen oder um Virusinfektionen vorzubeugen, wobei das rekombinante Mistellektin ausgewählt ist aus der Gruppe der Aminosäuresequenzen SEQ ID No. 1

- 12 oder Teile und Fragmente davon umfasst oder eine Kombination davon.

Antivirales Mittel nach Anspruch 1 , wobei das rekombinante Mistellektin-Polypeptid eine Mistellektin-A-Kette ist, ausgewählt aus der Gruppe der Aminosäuresequenzen SEQ ID No. 1 - 3 oder Teile und Fragmente davon umfasst oder eine Kombination davon.

Antivirales Mittel nach Anspruch 1 , wobei das rekombinante Mistellektin-Polypeptid eine Mistellektin-B-Kette ist, ausgewählt aus der Gruppe der Aminosäuresequenzen SEQ ID No. 4 - 12 oder Teile und Fragmente davon umfasst oder eine Kombination davon.

Antivirales Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Anwendung bei einer der folgenden Virusinfektionen: Herpes-simplex-Virusinfektion, Adenovirusinfektion, Poliovirusinfektion, Pockenvirusinfektion, Parvovirusinfektion, Papovavirusinfektion, Hepadnavirusinfektion, Orthomyovirusinfektion, Papillomavirusinfektion,

Paramyxovirusinfektion, Coronavirusinfektion, Picornavirusinfektion,

Reovirusinfektion, Togavirusinfektion, Flavivirusinfektion, Arenavirusinfektion, Rhabdovirusinfektion, Retrovirusinfektion.

Antivirales Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Anwendung bei

Hautviruswarzen, Anogenitale Warzen, Schleimhautwarzen und maligne Tumore wie Zervixkarzinom, Penis- und Vulvakarzinom.

Arzneimittel enthaltend ein rekombinantes Mistellektin-Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend mindestens ein rekombinantes Mistellektin-Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 umfasst, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder ggfs. weiteren Hilfs- und

Zusatzstoffen. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7 zur Behandlung von einer der folgenden Virusinfektionen: Herpes-simplex-Virusinfektion, Adenovirusinfektion, Poliovirusinfektion, Pockenvirusinfektion, Papillomavirusinfektion, Parvovirusinfektion, Papovavirusinfektion, Hepadnavirusinfektion, Orthomyovirusinfektion,

Paramyxovirusinfektion, Coronavirusinfektion, Picornavirusinfektion,

Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7 oder Anspruch 8 zur

Behandlung von Hautviruswarzen, Anogenitale Warzen, Schleimhautwarzen und maligne Tumore wie Zervixkarzinom, Penis- und Vulvakarzinom.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei di Zusammensetzung in Form einer Lösung, Gel oder Creme vorliegt.