WO2012080422A1 - Method for separating, concentrating or purifying a (blood) plasma protein or viral component from a mixture - Google Patents

Method for separating, concentrating or purifying a (blood) plasma protein or viral component from a mixture Download PDF

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WO2012080422A1
WO2012080422A1 PCT/EP2011/072967 EP2011072967W WO2012080422A1 WO 2012080422 A1 WO2012080422 A1 WO 2012080422A1 EP 2011072967 W EP2011072967 W EP 2011072967W WO 2012080422 A1 WO2012080422 A1 WO 2012080422A1
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plasma protein
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Dirk MÜLLER
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Previpharma Ag
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    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation

Definitions

  • the present invention relates to a method for separating, concentrating or purifying a (blood) plasma protein or viral component from a mixture containing this (blood) plasma protein or viral component from a mixture using sorbents whose surface is functionalized with at least two receptor molecules wherein the sorbents are used as chromatography material and wherein the method involves virus inactivation.
  • the solvent-detergent method has been used successfully for many years. This method is based on the fact that many viruses, such as HIV or hepatitis B, have a lipid envelope that can be destroyed by the addition of a "soap".
  • the soap consists for the most common method from a mixture of organic phosphate triester, especially tri-N-butyl phosphate and a nonionic soap such as p-tert-(octylphenoxy) polyethoxy ethanol (Triton ® X-100). By treatment with these two reagents all viruses can be inactivated, which have a lipid envelope.
  • the reagents can be removed mechanically and chromatographically to obtain virus-free plasmas suitable for transfusion.
  • the mechanical removal especially of the organic phosphate is achieved by extraction by means of an oil, while the nonionic soap can be separated by means of reversed-phase silica gel or ion exchange resin.
  • Methods for carrying out solvent-detergent processes are described, for example, by P. Horowitz et al., Blood, 79, 826-831 (1992) or M. Pourmokhtar, DARU J. Pharm. Volume 11, no. 2 (2003).
  • CA 1 201 063 describes the preparation of IgG which is suitable for intravenous administration, wherein a plasma fraction is subjected to a two-stage separation process with two different anion exchange phases. At each stage, the buffer used to equilibrate the anion exchange resin is also used to elute the IgG-containing fraction from the resin. From US 4,983,722 the use of anion exchange chromatography for the purification of antibody preparations is known. In this method, a solution containing antibody and contaminating protein A is contacted with an anion exchange resin, the antibodies being eluted from the resin under conditions of increasing ionic strength.
  • DE 698 23 931 describes a method which combines a viral inactivation with a purification and separation of gamma globulins, and with which these gamma globulins can be obtained in a purity of greater than 99%.
  • viral inactivation is achieved by treatment with caprylic acid at a pH of between 3.8 and 4.9.
  • the caprylic acid used acts analogously to an organic phosphate / nonionic soap mixture which attacks the lipid envelope of viruses.
  • the process described in DE 698 23 931 is based on the purification of Gamma globulins by means of ion exchange chromatography, wherein a strong anion exchanger and then a weak anion exchanger for cleaning are used. In the purification of Cohn II + III fractions, this process achieves a total yield of 69% of the paste, which is significantly increased compared to the washing process with alcohol (yield 48%).
  • the technical problem addressed by the present invention is therefore to provide a novel separation, concentration and / or purification method for (blood) plasma proteins or viral components involving virus inactivation without the drawbacks of the previously known method indicated in the preceding section must be accepted.
  • This means that the method allows the isolation of the desired (blood) plasma proteins or viral components in high purity and at the same time inactivating existing viruses and a high yield is to be achieved.
  • the functional integrity of the (blood) plasma proteins or viral components should not be impaired and the use of expensive materials should be kept to a minimum.
  • the new process should allow the use of standard cleaning and sterilization protocols of the equipment during use, thus ensuring the approval of the process for the manufacture of pharmaceutical products by the relevant authorities.
  • the object of the present invention is to provide the desired (blood) plasma proteins or viral components in an economically favorable manner and in a quality suitable for pharmaceutical products.
  • This technical problem is solved by a method for separating, concentrating and / or purifying a (blood) plasma protein or viral component from a mixture containing this (blood) plasma protein or viral component, the mixture containing the (blood) plasma protein or the viral component natural human or animal blood, or an intermediate or finished product of natural human or animal blood, in particular blood plasma or proteinaceous precipitate obtained from a blood plasma fractionation process
  • step (iv) filtering the mixture obtained from step (iii) via a sorbent 2, wherein the sorbents 1 and 2 are solid support materials whose surfaces are each functionalized with at least two receptor molecules, the surface of the sorbent 1 with pyridine-4-carboxyamido Residues and 3-carboxymidopropionic acid residues and the surface of sorbent 2 is functionalized with benzopyrrole residues and 3-azapyrrole residues.
  • the method described above can be advantageously developed further in that, following the binding of the (blood) plasma protein or the viral component to the sorbent 1 in step (i), the sorbent is washed with a further ability.
  • the method described above can be improved by washing and / or regenerating the sorbent with another liquid following dissolution of the (blood) plasma protein or viral component from the sorbent 1 in step (ii).
  • the method can also be developed in such a way that, before the binding of the (blood) plasma protein or viral component to the sorbent in the Step (i) and / or (iv) the sorbent is equilibrated with another liquid.
  • the (blood) plasma proteins or viral components are preferably antibodies, and more preferably immunoglobulins. Of these, especially IgG, IgA and IgM are particularly interesting for the method described. In addition to antibodies, fragments or compounds of natural antibodies, genetically engineered variants of viral components can be effectively purified by the described method.
  • the mixture containing the (blood) plasma protein or the viral component may be a natural or synthetic mixture, in particular the mixture may consist of blood plasma or an intermediate or end product of blood plasma.
  • the method is performed using blood plasma or a proteinaceous precipitate obtained by a blood plasma fractionation method.
  • Cohn precipitates are commercially available as A + 1, II + III or I + II + III pastes.
  • the blood is of natural human or animal origin, however the use of human blood is preferred.
  • the sorbents 1 and 2 used in the process are each a solid support material whose surface is functionalized with at least two receptor molecules.
  • the support material particularly preferably consists of a porous base material which is initially coated with this amine compound for incorporation and crosslinking of a polyamine compound and is subsequently functionalized with the formation of covalent bonds between the receptor molecules and the polyamine with the attachment of functionalized receptor molecules.
  • the porous base material is suitably a porous polystyrene.
  • the polyamine compound the use of polyvinylamine has been found to be particularly useful.
  • the carrier material is made by adding a crosslinking agent, such as diepoxide, crosslinked.
  • the preparation of support materials which are coated with polyvinylamine has already been described in the prior art, for example in EP 1 141 038 and EP 1 232 018.
  • the resulting polyamine-coated sorbent is functionalized with two organic radicals.
  • the use of acid-functionalized receptor molecules or derivatives thereof in which amide linkages are formed after reaction with the polyvinylamine has proven to be particularly useful.
  • receptor molecules can be substituted by a pyridine ring (-C 5 H 4 N) whose hydrogen atoms and carboxyl groups (-COOH) lead to particularly selective sorbents. Both the pyridine ring and the carboxyl group can be connected via a covalently bound linker with the polyamine material.
  • the pyrrole radical may in particular be a 3-azapyrrole radical and particularly preferably a 4-imidazolacryliamide radical.
  • the benzopyrrole residue is preferably a 3-indolpropionamide residue, with the combination of said specific residues having been found to be particularly effective.
  • the benzene-pyrrole and pyrrole radicals can also be linked to the polyamine compound in the solid support material via a linker, as described above for the sorbent 1.
  • the method can be further advantageously characterized in that the liquids 1 in step (i) is a buffer.
  • the buffer preferably has a concentration in the range of 1 to 100 mM, especially 2 to 20 mM. Irrespective of the concentration, the pH of the liquid is expediently close to the isoelectric point p1 of the bound protein or peptide, in particular in a pH range of about 4.0 to 6.0.
  • ratio of the (blood) plasma protein or viral component in the mixture to the volume of the sorbent there are no particular limitations on the ratio of the (blood) plasma protein or viral component in the mixture to the volume of the sorbent. However, it has proven to be expedient to choose a ratio of 2-20, in particular 8-16 mg / ml.
  • the ratio of liquid 1 to the mixture containing the protein or peptide in step (i) is also not particularly limited. For this, a ratio range of 5: 1 to 15: 1, in particular 8: 1 to 10: 1 based on the weight of liquid to protein has been found to be particularly suitable.
  • the buffer used as liquid 1 in step (i) is preferably a substance which has a pKa value in the range from 4.0 to 6.0, since this ensures the highest possible buffer capacity.
  • the buffer of the liquid 1 of carbonic acid / silicate buffers, acetic acid buffers, citrate Buffers, phosphate buffers and / or 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) buffers selected.
  • the liquid 2 used in step (ii) may also be a buffer having a higher concentration than the buffer used in step (i), in particular a concentration in the range of 50-200 mM and preferably 80-120 mM.
  • the pH of the liquid 2 is suitably in the region of the isoelectric point p1 of the protein or peptide, or in the range of 6.5-8.5.
  • the isoelectric point of the protein or peptide is within this range.
  • Buffers are also used whose pKa is within this pH interval, such as carbonate buffer, ammonia buffer, TRIS buffer, HEPES, HEPPS or phosphate buffer.
  • the method provides excellent separation lines when the pH of the liquid 1 is in the range of 4.0 to 6.0 and the pH of the liquid 2 is in the range of 6.5 to 8.5.
  • the process can be further advantageously characterized in that the mixture obtained in step (ii) is concentrated before the solvent-detergent process in step (iii). This concentration may conveniently be carried out by ultrafiltration. Furthermore, the liquid 2 should be exchanged with the liquid 3 before carrying out the solvent-detergent process, which can be carried out in an efficient and cost-effective manner, in particular by means of diafiltration.
  • the solvent-detergent process is usually carried out with the addition of a nonionic soap and an organic phosphate, wherein as organic phosphate appropriately tri-N-butyl phosphate is selected, as nonionic soap, however, a p-tert-octylphenol derivative with a Polyethylenglycolrisekette (available for For example under the trade name Triton ® -X-100), or a Polyo- xyethylensorbitanmonooleat monolaurate or in the form of polysorbate 20 and polysorbate 80 (available for example under the trade names Tween ® 20 and Tween ® 80).
  • the respective soap is used in concentrations in the range of 0.2 to 5%, in particular 0.5 to 2%, while for the organophosphate a Concentration of preferably 0.01 to 5%, particularly preferably 0.1 to 0.5%, is selected.
  • viruses present are preferably inactivated by treatment for a period of 4 to 16 hours.
  • the mixture obtained from the solvent-detergent process can be used directly without removal of the reagents by extraction with an oil.
  • the liquid 3 used in step (iv) is preferably also a water-based liquid, in particular a buffer.
  • This expediently has a pH in the range from 3.0 to 6.5.
  • the buffer should further have a concentration (of the buffer) in the range of 50 to 400 mM, especially 150 to 250 mM.
  • the buffer used as liquid 3 is expediently based on an acid whose pKa is in the range of the preferred pH of the buffer, ie in the range from 3.0 to 6.5.
  • acetic acid, citrate, phosphate and / or 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) can be selected as the buffer base.
  • a buffer is preferably used which has a higher concentration than the liquids 1 and / or 3.
  • the buffer it has proven to be expedient for the buffer to have a concentration in the range from 250 to 3000 mM.
  • a buffer from the same acid / salt system, as it is used as liquid 1 and having the same pH as the liquid used thereafter 1.
  • the sorbent 1 before the application of the mixture in Step (i) are additionally rinsed with the liquid 1.
  • step (iv) as the liquid used for equilibration, it is preferable to use an acid solution, especially acetic acid solution. This should have a concentration in the range of 200 to 600 mM.
  • step (iv) the sorbent 2 is rinsed with the liquid 3 to adjust the pH of the sorbent to the liquid 3 used to apply the mixtures obtained from the solvent-detergent process.
  • step (i) the liquid used in step (i) is expediently used.
  • Both sorbents 1 and 2 can be regenerated by rinsing with strongly basic solution and cleaned of remaining on the sorbents residual protein or viral components.
  • the pH of the basic solution is advantageously at least 9, more preferably a pH of about 10 is used. Any commercially available base may be used as the base, but for reasons of cost it is advisable to use sodium or potassium hydroxide.
  • the sorbent Before the regeneration, in particular of the sorbent 2, the sorbent can additionally be rinsed with an acid solution, in particular with a concentration of between 250 and 1000 mM.
  • the sorbent 2 For the separation of the components present in the mixture of organic phosphate and ionic soap, the sorbent 2 with a high loading of up to 100 mg / ml to isolated (blood) plasma protein or virus component, preferably in the range of 25 to 75 mg / ml, be loaded.
  • the reagents added in the solvent-detergent process can be washed from the column by treatment with 70% isopropanol in water or 70% ethanol in water ,
  • (blood) plasma proteins and viral components in particular immunoglobulins, such as IgG, IgM and IgA, can be purified inexpensively in a few steps, whereby viruses present in the starting material can be effectively inactivated.
  • immunoglobulins such as IgG, IgM and IgA
  • the sorbent 1 is rinsed with 500 mM citrate buffer (pH 5.0) and then equilibrated with the same amount of 10 mM citrate buffer (pH 5.0). Subsequently, a commercial A + 1 paste as a 10% solution in 10 mM citrate buffer at pH 5 is applied to the sorbent and rinsed with the same buffer. In the fractions obtained first, albumin and transferrin (yield quantitative, purity about 90%) are obtained, which can be purified in further purification stages (ion exchangers). After collecting the albumin / transferin fractions, the column was rinsed with additional 10mM citrate buffer at pH (5.0).
  • IgG pre-purified IgG was eluted from the acid by rinsing with 100 mM phosphate buffer at pH 7.4.
  • the IgG thus obtained had a purity of> 80% and was obtained in a yield of> 98%.
  • the product was free of albumin and transferrin.
  • the intermediate obtained was first concentrated by ultrafiltration to about 50 mg / ml IgG. Thereafter, the phosphate buffer was exchanged by diafiltration with an acetate buffer having a concentration of 200 mM and a pH of 4.3 to 4.5. Subsequently, the mixture was subjected to a solvent-detergent treatment by mixing 1% Triton X-100 and 0.3% tri-N-butyl phosphate and allowing it to stand for 8 to 16 hours. Prior to applying this intermediate to sorbent 2, the sorbent was also first equilibrated by rinsing with 400 mM acetic acid solution followed by rinsing with 200 mM acetate buffer at pH 4.3 to 4.5.
  • the intermediate dissolved in acetate buffer was applied to the sorbent with a loading in the range of between 25 and 75 mg / ml of product / sorbent volume.
  • Pure IgG was eluted from the column by rinsing with 200 mM acetate buffer at pH 4.3 to 4.5.
  • the sorbent was rinsed with 500 mM acetic acid and IgA and IgM were recovered with a yield of> 90% in high purity.
  • the IgG thus obtained as a solution with a content of 5% has the following properties: Purity:> 99.5%
  • IgG activity 95-105%
  • IgA 10 - 30 mg / ml ( ⁇ 0.01%)
  • Albonine 50-100 ⁇ g / ml ( ⁇ 0.05%)
  • Residual proteins fibrinogen, haptoglobin, 2-macrogloboline, apolipoprotein A and B and IgD (all below the limit of dedication ⁇ 0.01%)
  • the sorbent 1 used was a support material functionalized with pyridine-4-carboxyamide radicals and 3-carboxamidopropionic acid radicals
  • sorbent 2 was a support material functionalized with 3-indolepropionamide radicals and 4-imidazolacrylamide radicals.
  • the commercial A + 1 paste had the following composition: IgG: 77%; IgA: 7%; IgM: 3%; Albumin 12%; Transferrin 1%; Total protein content: 75%.

Abstract

The invention relates to a method for separating, concentrating and/or purifying a (blood) plasma protein or viral component from a mixture which comprises said (blood) plasma protein or the viral component, where the mixture comprising the (blood) plasma protein or the viral component is natural human or animal blood or an intermediate or finished natural human or animal blood product, in particular blood plasma or proteinaceous precipitate obtained from blood plasma by a fractionation method. Said process comprises a chromatography step, a filtration via a chromatographic material and a virus inactivation step. The sorbents used for the chromatography and the filtration are in each case solid carriers whose surfaces are functionalized with at least two receptor molecules. In particular, the invention relates to an improved process for the purification of IgG type (blood) plasma proteins from human plasma.

Description

Verfahren zur Trennung, Aufkonzentration oder Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins oder Virenbestandteils aus einer Mischung  A method of separating, concentrating or purifying a (blood) plasma protein or viral component from a mixture
Beschreibung description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung, Aufkonzentration oder Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins oder Virenbestandteils aus einer Mischung, die dieses (Blut)plasmaprotein oder den Virusbestandteil enthält, aus einer Mischung unter Verwendung von Sorbentien, deren Oberfläche mit mindestens zwei Rezeptormolekülen funktionalisiert sind, wobei die Sorbentien als Chromatographiematerial eingesetzt werden und wobei das Verfahren eine Virus- inaktivierung einbezieht. The present invention relates to a method for separating, concentrating or purifying a (blood) plasma protein or viral component from a mixture containing this (blood) plasma protein or viral component from a mixture using sorbents whose surface is functionalized with at least two receptor molecules wherein the sorbents are used as chromatography material and wherein the method involves virus inactivation.
Hintergrund der Erfindung Background of the invention
Für die Virusinaktivierung von Blutprodukten wird seit vielen Jahren erfolgreich das Solvent-Detergent-Verfahren eingesetzt. Dieses Verfahren beruht darauf, dass viele Viren, beispielsweise HIV oder Hepatitis B, eine Lipidhülle besitzen, die durch Zusatz einer "Seife" zerstört werden kann. Die Seife besteht bei den gängigsten Verfahren aus einer Mischung von organischem Phosphattriester, insbesondere Tri-N-butylphosphat, und einer nichtionischen Seife wie p-tert- (Octylphenoxy)polyethoxy-ethanol (Triton® X-100). Durch die Behandlung mit diesen beiden Reagenzien können alle Viren inaktiviert werden, welche eine Lipidhülle aufweisen. Nach Beendigung des Verfahrens können die Reagenzien mechanisch und chromatographisch entfernt werden und so für Transfusionen geeignete virenfreie Plasmen erhalten werden. Die mechanische Entfernung vor allem des organischen Phosphats wird durch Extraktion mittels eines Öls erreicht, während die nichtionische Seife mit Hilfe von Reversed phase-Kieselgel oder Io- nentauscherharz abgetrennt werden kann. Verfahren zur Durchführung von Sol- vent-Detergent-Verfahren sind beispielsweise durch P. Horowitz et al., Blood, 79, 826-831 (1992) oder M. Pourmokhtar, DARU J. Pharm. Sei. Volume 11, No. 2 (2003) beschrieben. For virus inactivation of blood products, the solvent-detergent method has been used successfully for many years. This method is based on the fact that many viruses, such as HIV or hepatitis B, have a lipid envelope that can be destroyed by the addition of a "soap". The soap consists for the most common method from a mixture of organic phosphate triester, especially tri-N-butyl phosphate and a nonionic soap such as p-tert-(octylphenoxy) polyethoxy ethanol (Triton ® X-100). By treatment with these two reagents all viruses can be inactivated, which have a lipid envelope. After completion of the process, the reagents can be removed mechanically and chromatographically to obtain virus-free plasmas suitable for transfusion. The mechanical removal especially of the organic phosphate is achieved by extraction by means of an oil, while the nonionic soap can be separated by means of reversed-phase silica gel or ion exchange resin. Methods for carrying out solvent-detergent processes are described, for example, by P. Horowitz et al., Blood, 79, 826-831 (1992) or M. Pourmokhtar, DARU J. Pharm. Volume 11, no. 2 (2003).
Ein alternatives Verfahren zur viralen Inaktivierung ist z.B. in US 4,534,972 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird eine Proteinlösung in Kontakt mit einem Übergangsmetall-Komplex, insbesondere mit Kupferphenanthrolin, und mit einem reduzierenden Mittel gebracht, um die Inaktivierung von Viren durchzuführen, ohne dass die Aktivität des Proteins wesentlich beeinflusst wird. Ein weiteres Verfahren, bei dem die Viren durch Inkontaktbringen mit Caprylsäure-enthaltenden Lösungen inaktiviert werden, ist in US 4,939,106 beschrieben. An alternative method of viral inactivation is e.g. in US 4,534,972. In this method, a protein solution is brought into contact with a transition metal complex, especially with copper phenanthroline, and with a reducing agent to effect the inactivation of viruses without significantly affecting the activity of the protein. Another method in which the viruses are inactivated by contacting with caprylic acid-containing solutions is described in US 4,939,106.
Verfahren zur Trennung, Aufkonzentration und/oder Reinigung von (Blut)Plasma- proteinen, wie insbesondere IgG, sind ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt. So beschreibt die CA 1 201 063 die Zubereitung von IgG, das sich zur intravenösen Anwendung eignet, wobei eine Plasmafraktion einem zweistufigen Trennverfahren mit zwei verschiedenen Anionenaustauschphasen unterzogen wird. In jeder Stufe wird der Puffer, der dazu verwendet wird, das Anionaus- tauschharz ins Gleichgewicht zu setzen, auch dazu verwendet, die IgG enthaltene Fraktion aus dem Harz zu eluieren. Aus der US 4,983,722 ist die Anwendung von Anionenaustausch-Chromatographie zur Reinigung von Antikörper-Zubereitungen bekannt. In diesem Verfahren wird eine Lösung, die Antikörper und kontaminierendes Protein A enthält, mit einem Anionaustausch-Harz in Kontakt gebracht, wobei die Antikörper aus dem Harz unter Bedingungen steigender Ionenstärke eluiert werden. Methods for the separation, concentration and / or purification of (blood) plasma proteins, in particular IgG, are also known from the prior art. Thus, CA 1 201 063 describes the preparation of IgG which is suitable for intravenous administration, wherein a plasma fraction is subjected to a two-stage separation process with two different anion exchange phases. At each stage, the buffer used to equilibrate the anion exchange resin is also used to elute the IgG-containing fraction from the resin. From US 4,983,722 the use of anion exchange chromatography for the purification of antibody preparations is known. In this method, a solution containing antibody and contaminating protein A is contacted with an anion exchange resin, the antibodies being eluted from the resin under conditions of increasing ionic strength.
Schließlich ist in der DE 698 23 931 ein Verfahren beschrieben, das eine virale Inaktivierung mit einer Aufreinigung und Trennung von Gammaglobulinen kombiniert, und mit dem diese Gamma-Globuline in einer Reinheit von größer als 99% erhalten werden können. Bei diesem Verfahren wird die virale Inaktivierung durch Behandlung mit Caprylsäure bei einem pH-Wert von zwischen 3,8 und 4,9 erreicht. Die eingesetzte Caprylsäure wirkt dabei analog einem organisches Phosphat/nicht ionische Seife- Gemisch, das die Lipidhülle von Viren angreift. Auch das in DE 698 23 931 beschriebene Verfahren basiert auf der Aufreinigung von Gammaglobulinen mittels Ionen-austauschchromatographie, wobei ein starker Anionenaustauscher und anschließend ein schwacher Anionenaustauscher für die Reinigung zum Einsatz kommen. Bei Aufreinigung von Cohn II + III Fraktionen lässt sich mit diesem Verfahren eine Gesamtausbeute aus der Paste von 69% realisieren, die gegenüber dem Waschverfahren mit Alkohol (Ausbeute 48%) signifikant erhöht ist. Finally, DE 698 23 931 describes a method which combines a viral inactivation with a purification and separation of gamma globulins, and with which these gamma globulins can be obtained in a purity of greater than 99%. In this method, viral inactivation is achieved by treatment with caprylic acid at a pH of between 3.8 and 4.9. The caprylic acid used acts analogously to an organic phosphate / nonionic soap mixture which attacks the lipid envelope of viruses. The process described in DE 698 23 931 is based on the purification of Gamma globulins by means of ion exchange chromatography, wherein a strong anion exchanger and then a weak anion exchanger for cleaning are used. In the purification of Cohn II + III fractions, this process achieves a total yield of 69% of the paste, which is significantly increased compared to the washing process with alcohol (yield 48%).
Trotz der gemachten Fortschritte weisen die bisher verfügbaren Methoden zur Aufreinigung von Plasmaproteinen, insbesondere von Antikörpern, den Nachteil auf, dass sie in der Regel aufwändig und zeitraubend sind, die Verwendung nicht regenerierbarer Reinigungsmaterialien einbeziehen, oder die funktionelle Integrität der Plasmaproteine durch die Aufreinigungsschritte beeinträchtigt wird und somit Plasmaproteine nur in geringer Ausbeute oder Reinheit und Aktivität erhalten werden können. Despite the progress made, the methods available hitherto for the purification of plasma proteins, in particular of antibodies, have the disadvantage that they are generally complicated and time-consuming, involve the use of non-regenerable cleaning materials, or the functional integrity of the plasma proteins is impaired by the purification steps and thus plasma proteins can be obtained only in low yield or purity and activity.
Beschreibung description
Das technische Problem, mit dem sich die vorliegende Erfindung befasst, ist daher das Zurverfügungstellen eines neuen Trennungs-, Aufkonzentrationsund/oder Reinigungsverfahrens für (Blut)Plasmaproteine oder Virenbestandteile, das eine Virusinaktivierung einbezieht, ohne dass die im vorangehenden Abschnitt aufgezeigten Nachteile des bisher bekannten Verfahrens in Kauf genommen werden müssen. Dies bedeutet, dass das Verfahren die Isolation der gewünschten (Blut)Plasmaproteine oder Virenbestandteile in hoher Reinheit erlaubt und gleichzeitig vorhandene Viren inaktiviert werden und eine hohe Ausbeute erzielt werden soll. Gleichzeitig soll die funktionelle Integrität der (Blut)Plasmaproteine oder Virenbestandteile nicht beeinträchtigt werden und die Verwendung von teuren Ma- terialen auf ein Minimum beschränkt werden. Ebenso soll das neue Verfahren die Verwendung von Standard-Reinigungs- und Sterilisierungsprotokollen des Equip- ments während der Verwendung erlauben und so die Zulassung des Verfahrens zur Herstellung von pharmazeutischen Produkten durch die entsprechenden Behörden gewährleisten. Mit anderen Worten ist Ziel der vorliegenden Erfindung das zur Verfügung stellen der gewünschten (Blut)Plasmaproteine oder Virenbestandteile in wirtschaftlich günstiger Weise und in einer für pharmazeutische Produkte geeigneten Qualität. Dieses technische Problem wird gelöst durch ein Verfahren zur Trennung, Aufkonzentration und/oder Reinigung eines (Blut)plasmaproteins oder Virenbestandteils aus einer Mischung, die dieses (Blut)plasmaprotein oder den Virenbestandteil enthält, wobei die das (Blut)Plasmaprotein oder den Virenbestandteil enthaltende Mischung natürliches menschliches oder tierisches Blut oder ein Zwischen- oder fertiges Produkt von natürlichem menschlichen oder tierischen Blut ist, insbesondere Blutplasma oder proteinhaltiges Fällungsprodukt, das nach einem Fraktionie- rungsverfahren aus Blutplasma erhalten wurde, umfassend The technical problem addressed by the present invention is therefore to provide a novel separation, concentration and / or purification method for (blood) plasma proteins or viral components involving virus inactivation without the drawbacks of the previously known method indicated in the preceding section must be accepted. This means that the method allows the isolation of the desired (blood) plasma proteins or viral components in high purity and at the same time inactivating existing viruses and a high yield is to be achieved. At the same time, the functional integrity of the (blood) plasma proteins or viral components should not be impaired and the use of expensive materials should be kept to a minimum. Similarly, the new process should allow the use of standard cleaning and sterilization protocols of the equipment during use, thus ensuring the approval of the process for the manufacture of pharmaceutical products by the relevant authorities. In other words, the object of the present invention is to provide the desired (blood) plasma proteins or viral components in an economically favorable manner and in a quality suitable for pharmaceutical products. This technical problem is solved by a method for separating, concentrating and / or purifying a (blood) plasma protein or viral component from a mixture containing this (blood) plasma protein or viral component, the mixture containing the (blood) plasma protein or the viral component natural human or animal blood, or an intermediate or finished product of natural human or animal blood, in particular blood plasma or proteinaceous precipitate obtained from a blood plasma fractionation process
(i) das Inkontaktbringen der Mischung, die in einer Flüssigkeit 1 gelöst oder suspendiert ist, mit einem Sorbens 1 für einen ausreichenden Zeitraum, um das (Blut)plasmaprotein oder den Virenbestandteil an das Sorbens 1 zu binden,  (i) contacting the mixture dissolved or suspended in a liquid 1 with a sorbent 1 for a time sufficient to bind the (blood) plasma protein or viral component to the sorbent 1,
(ii) das Inkontaktbringen des Sorbenzes 1 mit dem daran gebundenen (Blut)plasmaprotein oder Virenbestandteil mit einer Flüssigkeit 2 für einen ausreichenden Zeitraum, um das (Blut)plasmaprotein oder den Virenbestandteil von dem Sorbens 1 zu lösen,  (ii) contacting the sorbent 1 with the blood plasma protein or virus component bound thereto with a liquid 2 for a sufficient time to dissolve the (blood) plasma protein or virus component from the sorbent 1;
(iii) das Durchführen eines Solvent-Detergent-Verfahrens mit dem vorgereinigten (Blut)plasmaprotein oder Virenbestandteil,  (iii) performing a solvent-detergent process with the pre-purified (blood) plasma protein or viral component,
(iv) das Filtrieren der aus Schritt (iii) enthaltenen Mischung über ein Sorbens 2, wobei die Sorbenzien 1 und 2 feste Trägermaterialien sind, deren Oberflächen jeweils mit mindestens zwei Rezeptormolekülen funktionalisiert sind, wobei die Oberfläche des Sorbens 1 mit Pyridin-4-Carboxyamido-Resten und 3- Carboxymidopropionsäure-Resten und die Oberfläche des Sorbens 2 mit Benzo- pyrrol-Resten und 3-Azapyrrol-Resten funktionalisiert ist.  (iv) filtering the mixture obtained from step (iii) via a sorbent 2, wherein the sorbents 1 and 2 are solid support materials whose surfaces are each functionalized with at least two receptor molecules, the surface of the sorbent 1 with pyridine-4-carboxyamido Residues and 3-carboxymidopropionic acid residues and the surface of sorbent 2 is functionalized with benzopyrrole residues and 3-azapyrrole residues.
Das vorstehend dargestellte Verfahren kann dadurch vorteilhaft weitergebildet werden, dass im Anschluss an das Binden des (Blut)Plasmaproteins oder des Virenbestandteils an das Sorbens 1 in Schritt (i) das Sorbens mit einer weiteren Fähigkeit gewaschen wird. Alternativ oder zusätzlich dazu kann das oben beschriebene Verfahren verbessert werden, indem im Anschluss an das Lösen des (Blut)Plasmaproteins oder Virenbestandteils vom Sorbens 1 im Schritt (ii) das Sorbens mit einer weiteren Flüssigkeit gewaschen und/oder regeneriert wird. Schließlich kann das Verfahren auch dergestalt weitergebildet werden, dass vor dem Binden des (Blut)Plasmaproteins oder Virenbestandteils an das Sorbens im Schritt (i) und/oder (iv) das Sorbens mit einer weiteren Flüssigkeit equilibriert wird. The method described above can be advantageously developed further in that, following the binding of the (blood) plasma protein or the viral component to the sorbent 1 in step (i), the sorbent is washed with a further ability. Alternatively or additionally, the method described above can be improved by washing and / or regenerating the sorbent with another liquid following dissolution of the (blood) plasma protein or viral component from the sorbent 1 in step (ii). Finally, the method can also be developed in such a way that, before the binding of the (blood) plasma protein or viral component to the sorbent in the Step (i) and / or (iv) the sorbent is equilibrated with another liquid.
Hinsichtlich der Eigenschaften der zu reinigenden (Blut)Plasmaproteine oder Virenbestandteile bestehen keine besonderen Einschränkungen. Es hat sich jedoch als vorteilhaft erwiesen, wenn (Blut)Plasmaproteine oder Virenbestandteile aufgereinigt werden, deren isoelektrischer Punkt pl im Bereich von 5,5 bis 8,5 liegt, und die ein Molekulargewicht im Bereich von 100 bis 500.000 da aufweisen. Die (Blut)Plasmaproteine oder Virenbestandteile sind vorzugsweise Antikörper, und besonders bevorzugt Immunoglobuline. Von diesen sind vor allem IgG, IgA und IgM für das beschriebene Verfahren besonders interessant. Neben Antikörpern können auch Fragmente oder Verbindungen von natürlichen Antikörpern, genetisch hergestellte Varianten von Virenbestandteilen mit dem beschriebenen Verfahren effektiv gereinigt werden. There are no particular restrictions on the properties of the (blood) plasma proteins or viral components to be purified. However, it has proved to be advantageous to purify (blood) plasma proteins or viral components whose isoelectric point pl is in the range of 5.5 to 8.5 and which have a molecular weight in the range of 100 to 500,000 da. The (blood) plasma proteins or viral components are preferably antibodies, and more preferably immunoglobulins. Of these, especially IgG, IgA and IgM are particularly interesting for the method described. In addition to antibodies, fragments or compounds of natural antibodies, genetically engineered variants of viral components can be effectively purified by the described method.
Die das (Blut)Plasmaprotein oder den Virenbestandteil enthaltene Mischung kann eine natürliche oder synthetische Mischung sein, insbesondere kann die Mischung aus Blutplasma oder einem Zwischen- oder Endprodukt aus Blutplasma bestehen. Besonders bevorzugt wird das Verfahren unter Verwendung von Blutplasma oder einem proteinhaltigem Fällungsprodukt, das nach einem Fraktionierungsverfahren von Blutplasma erhalten wurde, durchgeführt. Zum Beispiel sind Cohn- Fällungsprodukte als A + 1, II + III oder I + II + III Pasten kommerziell erhältlich. Das Blut ist natürlichen menschlichen oder tierischen Ursprungs, allerdings ist die Verwendung von menschlichem Blut bevorzugt. The mixture containing the (blood) plasma protein or the viral component may be a natural or synthetic mixture, in particular the mixture may consist of blood plasma or an intermediate or end product of blood plasma. Most preferably, the method is performed using blood plasma or a proteinaceous precipitate obtained by a blood plasma fractionation method. For example, Cohn precipitates are commercially available as A + 1, II + III or I + II + III pastes. The blood is of natural human or animal origin, however the use of human blood is preferred.
Bei den im Verfahren verwendeten Sorbentien 1 und 2 handelt es sich jeweils um ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit mindestens zwei Rezeptormolekülen funktionalisiert ist. Besonders bevorzugt besteht das Trägermaterial aus einem porösen Grundmaterial, das zur Einlagerung und Vernetzung einer Polyamin- verbindung zunächst mit dieser Aminverbindung überzogen wird und anschließend unter Anknüpfung von funktionalisierten Rezeptormolekülen unter Ausbildung ko- valenter Bindungen zwischen den Rezeptormolekülen und dem Polyamin funktionalisiert wird. Bei dem porösen Grundmaterial handelt es sich zweckmäßig um ein poröses Polystrol.Als Polyaminverbindung hat sich die Verwendung von Polyviny- lamin als besonders zweckmäßig erwiesen. Das Trägermaterial wird durch Zugabe eines Vernetzungsmittels, beispielsweise Diepoxid, vernetzt. Die Herstellung von Trägermaterialien die mit Polyvinylamin überzogen sind, ist bereits im Stand der Technik, zum Beispiel in EP 1 141 038 und EP 1 232 018 beschrieben worden. The sorbents 1 and 2 used in the process are each a solid support material whose surface is functionalized with at least two receptor molecules. The support material particularly preferably consists of a porous base material which is initially coated with this amine compound for incorporation and crosslinking of a polyamine compound and is subsequently functionalized with the formation of covalent bonds between the receptor molecules and the polyamine with the attachment of functionalized receptor molecules. The porous base material is suitably a porous polystyrene. As the polyamine compound, the use of polyvinylamine has been found to be particularly useful. The carrier material is made by adding a crosslinking agent, such as diepoxide, crosslinked. The preparation of support materials which are coated with polyvinylamine has already been described in the prior art, for example in EP 1 141 038 and EP 1 232 018.
Anschließend wird das so erhaltene Polyamin beschichtete Sorbens mit zwei organischen Resten funktionalisiert. Dabei hat sich insbesondere die Verwendung von Säure-funktionalisierten Rezeptormolekülen oder Derivaten davon, bei denen nach Umsetzung mit dem Polyvinylamin Amid-Verknüpfungen ausgebildet werden, als besonders zweckmäßig erwiesen. Subsequently, the resulting polyamine-coated sorbent is functionalized with two organic radicals. In particular, the use of acid-functionalized receptor molecules or derivatives thereof in which amide linkages are formed after reaction with the polyvinylamine has proven to be particularly useful.
Es ist möglich, die im Sorbens vorhandenen Amingruppen vollständig mit organischen Resten zu funktionalisieren. In der Praxis der vorliegenden Erfindung ist es aber erwünscht, dass nur etwa 25 bis 98 %der freien Amingruppen des Po- lyamins mit Rezeptormolekülen umgesetzt werden. It is possible to completely functionalize the amine groups present in the sorbent with organic radicals. In the practice of the present invention, however, it is desirable that only about 25 to 98% of the free amine groups of the polyamine be reacted with receptor molecules.
Für das Sorbens 1 hat es sich gezeigt, dass zum einen Rezeptormoleküle einem Pyridinring (-C5H4N) deren Wasserstoffatome substituiert sein können und Carbo- xylgruppen (-COOH) zu besonders selektiven Sorbentien führen. Dabei können sowohl der Pyridinring als auch die Carboxylgruppe über einen kovalent gebundenen Linker mit dem Polyaminmaterial verbunden sein. For the sorbent 1, it has been found that, on the one hand, receptor molecules can be substituted by a pyridine ring (-C 5 H 4 N) whose hydrogen atoms and carboxyl groups (-COOH) lead to particularly selective sorbents. Both the pyridine ring and the carboxyl group can be connected via a covalently bound linker with the polyamine material.
Für das Sorbens 2 führt hingegen die Verwendung von Benzopyrrolresten in Kombination mit Pyrrolresten zu besonders effizienten Trennungs- und Reinigungsergebnissen. Der Pyrrolrest kann insbesondere ein 3-Azapyrrolrest und besonders bevorzugt ein 4-Imidazolacryliamidrest sein. Der Benzopyrrolrest ist vorzugsweise ein 3-Indolpropion-amidrest, wobei sich die Kombination der genannten speziellen Reste als besonders effektiv herausgestellt hat. Auch die Benzolpyrrol- und Pyr- rolreste können über einen Linker, wie er vorstehend für das Sorbenz 1 beschrieben ist, mit der Polyaminverbindung im festen Trägermaterial verbunden sein. For sorbent 2, on the other hand, the use of benzopyrrole residues in combination with pyrrole residues leads to particularly efficient separation and purification results. The pyrrole radical may in particular be a 3-azapyrrole radical and particularly preferably a 4-imidazolacryliamide radical. The benzopyrrole residue is preferably a 3-indolpropionamide residue, with the combination of said specific residues having been found to be particularly effective. The benzene-pyrrole and pyrrole radicals can also be linked to the polyamine compound in the solid support material via a linker, as described above for the sorbent 1.
Für die Verknüpfung der Rezeptormoleküle mit dem festen Trägermaterial kommen alle bekannten Verfahren zur Verknüpfung von Aminen mit anderen funktionellen Gruppen in Betracht, insbesondere Verfahren zur Bildung von Amidverbin- düngen, Sulfonamidbindungen oder die Umsetzung der Amine mit Aldehyden unter reduktiven Bedingungen. Wird eine Säurefunktionalität zur Verknüpfung mit den Aminresten des Trägermaterials verwendet, wird nach der Umsetzung in der Regel eine Amidfunktionalität erhalten mit der das Rezeptormolekül an das Trägermaterial gebunden ist. Zur Bildung solcher Amidverknüpfungen kommen alle im Stand der Technik beschriebenen Reaktionsarten in Betracht, die dem Fachmann geläufig sind. For the linkage of the receptor molecules with the solid support material, all known methods for linking amines with other functional groups are suitable, in particular processes for the formation of amide compounds. fertilize, Sulfonamidbindungen or the reaction of the amines with aldehydes under reductive conditions. If an acid functionality is used for linking with the amine radicals of the support material, an amide functionality is generally obtained after the reaction with which the receptor molecule is bound to the support material. For the formation of such amide linkages, all reaction types described in the prior art are considered, which are familiar to the person skilled in the art.
Auch die Bindung von Rezeptormolekülen an Trägermaterialien wie sie vorstehend beschrieben sind, wurde bereits im Stand der Technik, insbesondere in The binding of receptor molecules to support materials as described above has also been described in the prior art, in particular in US Pat
WO 2004/085046, beschrieben. WO 2004/085046.
Das Verfahren kann im Weiteren dadurch vorteilhaft ausgestaltet werden, dass die Flüssigkeiten 1 im Schritt (i) ein Puffer ist. Der Puffer hat bevorzugt eine Konzentration im Bereich von 1 bis 100 mM, insbesondere von 2 bis 20 mM. Der pH- Wert der Flüssigkeit liegt unabhängig von der Konzentration zweckmäßigerweise in der Nähe des isoelektrischen Punktes pl des gebundenen Proteins oder Peptids, insbesondere in einem pH-Bereich von etwa 4.0 bis 6.0. The method can be further advantageously characterized in that the liquids 1 in step (i) is a buffer. The buffer preferably has a concentration in the range of 1 to 100 mM, especially 2 to 20 mM. Irrespective of the concentration, the pH of the liquid is expediently close to the isoelectric point p1 of the bound protein or peptide, in particular in a pH range of about 4.0 to 6.0.
Hinsichtlich des Verhältnisses des aufzureinigenden (Blut)Plasmaproteins oder Virenbestandteils in der Mischung zum Volumen des Sorbenzes ergeben sich keine besonderen Beschränkungen. Es hat sich jedoch als zweckmäßig erwiesen, ein Verhältnis von 2 - 20, insbesondere 8 - 16 mg/ml zu wählen. Das Verhältnis von Flüssigkeit 1 zur Mischung enthaltend das Protein oder Peptid im Schritt (i) unterliegt ebenfalls keinen besonderen Einschränkungen. Für dieses hat sich ein Verhältnisbereich von 5 : 1 bis 15 : 1, insbesondere 8 : 1 bis 10 : 1 bezogen auf das Gewicht Flüssigkeit zu Protein als besonders geeignet herausgestellt. There are no particular limitations on the ratio of the (blood) plasma protein or viral component in the mixture to the volume of the sorbent. However, it has proven to be expedient to choose a ratio of 2-20, in particular 8-16 mg / ml. The ratio of liquid 1 to the mixture containing the protein or peptide in step (i) is also not particularly limited. For this, a ratio range of 5: 1 to 15: 1, in particular 8: 1 to 10: 1 based on the weight of liquid to protein has been found to be particularly suitable.
Der in Schritt (i) als Flüssigkeit 1 verwendete Puffer ist vorzugsweise eine Substanz, die einen pKa-Wert im Bereich von 4.0 bis 6.0 aufweist, da dadurch eine möglichst hohe Pufferkapazität gewährleistet werden kann. Vorzugsweise ist der Puffer der Flüssigkeit 1 aus Kohlensäure/Silikatpuffern, Essigsäurepuffern, Citrat- Puffern, Phosphatpuffern und/oder 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) Puffern ausgewählt. The buffer used as liquid 1 in step (i) is preferably a substance which has a pKa value in the range from 4.0 to 6.0, since this ensures the highest possible buffer capacity. Preferably, the buffer of the liquid 1 of carbonic acid / silicate buffers, acetic acid buffers, citrate Buffers, phosphate buffers and / or 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) buffers selected.
Die im Schritt (ii) verwendete Flüssigkeit 2 kann ebenfalls ein Puffer sein, der eine höhere Konzentration als der in Schritt (i) verwendete Puffer aufweist, insbesondere eine Konzentration im Bereich von 50 - 200 mM und bevorzugt 80 - 120 mM. Der pH-Wert der Flüssigkeit 2 liegt zweckmäßig im Bereich des isoelektrischen Punktes pl des Proteins oder Peptids, oder im Bereich von 6.5 - 8.5. Bevorzugt liegt der isoelektrische Punkt des Proteins oder Peptids innerhalb dieses Bereichs. Dabei werden ebenfalls Puffer verwendet, deren pKa innerhalb dieses pH- Intervalls liegt wie zum Beispiel Carbonatpuffer, Ammoniakpuffer, TRIS-Puffer, HEPES-, HEPPS- oder Phosphatpuffer. The liquid 2 used in step (ii) may also be a buffer having a higher concentration than the buffer used in step (i), in particular a concentration in the range of 50-200 mM and preferably 80-120 mM. The pH of the liquid 2 is suitably in the region of the isoelectric point p1 of the protein or peptide, or in the range of 6.5-8.5. Preferably, the isoelectric point of the protein or peptide is within this range. Buffers are also used whose pKa is within this pH interval, such as carbonate buffer, ammonia buffer, TRIS buffer, HEPES, HEPPS or phosphate buffer.
Es hat sich gezeigt, dass das Verfahren hervorragende Trennleitungen liefert, wenn der pH-Wert der Flüssigkeit 1 im Bereich von 4.0 bis 6.0 und der pH-Wert der Flüssigkeit 2 im Bereich von 6.5 bis 8.5 liegt. It has been found that the method provides excellent separation lines when the pH of the liquid 1 is in the range of 4.0 to 6.0 and the pH of the liquid 2 is in the range of 6.5 to 8.5.
Das Verfahren kann weiterhin dadurch vorteilhaft ausgestaltet werden, dass die im Schritt (ii) erthaltene Mischung vor dem Solvent-Detergent-Verfahren im Schritt (iii) aufkonzentriert wird. Diese Aufkonzentration kann zweckmäßig mit Hilfe einer Ultrafiltration durchgeführt werden. Weiterhin sollte die Flüssigkeit 2 vor Durchführung des Solvent-Detergent-Verfahrens mit der Flüssigkeit 3 ausgetauscht werden, was insbesondere mittels einer Diafiltration effizient und kostengünstig durchgeführt werden kann. The process can be further advantageously characterized in that the mixture obtained in step (ii) is concentrated before the solvent-detergent process in step (iii). This concentration may conveniently be carried out by ultrafiltration. Furthermore, the liquid 2 should be exchanged with the liquid 3 before carrying out the solvent-detergent process, which can be carried out in an efficient and cost-effective manner, in particular by means of diafiltration.
Das Solvent-Detergent-Verfahren wird in der Regel unter Zugabe einer nichtionischen Seife und eines organischen Phosphats durchgeführt, wobei als organisches Phosphat zweckmäßig Tri-N-butylphosphat gewählt wird, als nichtionische Seife hingegen ein p-tert-Octylphenolderivat mit einer Polyethylenglycolseitenkette (erhältlich zum Beispiel unter dem Handelsnamen Triton®-X-100), oder einem Polyo- xyethylensorbitanmonooleat oder -monolaurat in Form von Polysorbat-20 bzw. Polysorbat 80 (erhältlich z.B. unter den Handelsbezeichnungen Tween® 20 und Tween® 80). Die jeweilige Seife wird in Konzentrationen im Bereich von 0,2 bis 5%, insbesondere 0,5 bis 2% eingesetzt, während für das Organophosphat eine Konzentration von vorzugsweise 0,01 bis 5%, besonders bevorzugt 0,1 bis 0,5%, gewählt wird. The solvent-detergent process is usually carried out with the addition of a nonionic soap and an organic phosphate, wherein as organic phosphate appropriately tri-N-butyl phosphate is selected, as nonionic soap, however, a p-tert-octylphenol derivative with a Polyethylenglycolseitenkette (available for For example under the trade name Triton ® -X-100), or a Polyo- xyethylensorbitanmonooleat monolaurate or in the form of polysorbate 20 and polysorbate 80 (available for example under the trade names Tween ® 20 and Tween ® 80). The respective soap is used in concentrations in the range of 0.2 to 5%, in particular 0.5 to 2%, while for the organophosphate a Concentration of preferably 0.01 to 5%, particularly preferably 0.1 to 0.5%, is selected.
Nach Zugabe der im vorstehenden Abschnitt beschriebenen Reagenzien werden vorhandene Viren durch Behandlung vorzugsweise über einen Zeitraum von 4 bis 16 Stunden inaktiviert. After addition of the reagents described in the previous section, viruses present are preferably inactivated by treatment for a period of 4 to 16 hours.
Die aus dem Solvent-Detergent-Verfahren erhaltene Mischung kann direkt weiterverwendet werden, ohne dass ein Entfernung die Reagenzien durch Extraktion mit einen Öl nötig ist. The mixture obtained from the solvent-detergent process can be used directly without removal of the reagents by extraction with an oil.
Bei der Flüssigkeit 3, die im Schritt (iv) verwendet wird, handelt es sich bevorzugt ebenfalls um eine Flüssigkeit auf Wasserbasis, insbesondere einen Puffer. Dieser weist zweckmäßigerweise einen pH-Wert im Bereich von 3,0 bis 6,5 auf. Der Puffer sollte weiterhin eine Konzentration (des Puffers) im Bereich von 50 bis 400 mM, insbesondere von 150 bis 250 mM aufweisen. Auch der als Flüssigkeit 3 verwendete Puffer basiert zweckmäßigerweise auf eine Säure, deren pKa im Bereich des bevorzugten pH-Werts des Puffers, also im Bereich von 3,0 bis 6,5 liegt. So können wie bei der Flüssigkeit 1 Kohlensäure/Silikat, Essigsäure, Citrat, Phosphat und/oder 2-(N-morpholino)ethansulfonsäure (MES) als Pufferbasis gewählt werden. The liquid 3 used in step (iv) is preferably also a water-based liquid, in particular a buffer. This expediently has a pH in the range from 3.0 to 6.5. The buffer should further have a concentration (of the buffer) in the range of 50 to 400 mM, especially 150 to 250 mM. The buffer used as liquid 3 is expediently based on an acid whose pKa is in the range of the preferred pH of the buffer, ie in the range from 3.0 to 6.5. Thus, as with the liquid 1 carbonic acid / silicate, acetic acid, citrate, phosphate and / or 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) can be selected as the buffer base.
Während des optional vorgeschalteten Equilibrierens der Solvenzien 1 und/oder 2, das den Schritten (i) und/oder (iv) vorgeschaltet sein kann, wird vorzugsweise ein Puffer verwendet, der eine höhere Konzentration aufweist, als die Flüssigkeiten 1 und/oder 3. Für das dem Schritt (i) vorgeschaltete Equilibrieren des Sorbenzes 1 hat es sich als zweckmäßig herausgestellt, wenn der Puffer eine Konzentration im Bereich von 250 bis 3000 mM aufweist. Weiterhin ist es sinnvoll, einen Puffer aus demselben Säure/Salz-System zu wählen, wie er als Flüssigkeit 1 verwendet wird und der denselben pH-Wert aufweist, wie die danach verwendete Flüssigkeit 1. Anschließend kann das Sorbens 1 vor dem Aufbringen der Mischung im Schritt (i) zusätzlich noch mit der Flüssigkeit 1 gespült werden. During the optionally preceding equilibration of the solvents 1 and / or 2, which may be preceded by the steps (i) and / or (iv), a buffer is preferably used which has a higher concentration than the liquids 1 and / or 3. For the equilibration of the sorbent 1 preceding the step (i), it has proven to be expedient for the buffer to have a concentration in the range from 250 to 3000 mM. Furthermore, it makes sense to choose a buffer from the same acid / salt system, as it is used as liquid 1 and having the same pH as the liquid used thereafter 1. Subsequently, the sorbent 1 before the application of the mixture in Step (i) are additionally rinsed with the liquid 1.
Für den Schritt (iv) wird als zum Equilibrieren verwendete Flüssigkeit vorzugsweise eine Säurelösung verwendet, insbesondere Essigsäurelösung . Diese sollte eine Konzentration im Bereich von 200 bis 600 mM aufweisen. Anschließend kann auch vor dem Schritt (iv) das Sorbens 2 mit der Flüssigkeit 3 gespült werden, um den pH-Wert des Sorbenzes auf die zum Auftragen der aus dem Solvent-Detergent- Verfahren erhaltenen Mischungen verwendeten Flüssigkeit 3 einzustellen. For the step (iv), as the liquid used for equilibration, it is preferable to use an acid solution, especially acetic acid solution. This should have a concentration in the range of 200 to 600 mM. Subsequently, too before step (iv), the sorbent 2 is rinsed with the liquid 3 to adjust the pH of the sorbent to the liquid 3 used to apply the mixtures obtained from the solvent-detergent process.
Bei dem optionalen dem Schritt (i) nachgeschalteten Waschschritt des Solvents 1 wird zweckmäßigerweise die im Schritt (i) verwendete Flüssigkeit verwendet. In the optional washing step of the solvent 1 following step (i), the liquid used in step (i) is expediently used.
Beide Sorbenzien 1 und 2 können durch Spülen mit stark basischer Lösung regeneriert und von auf den Sorbenzien verbliebenem Restprotein oder Virenbestandteilen gereinigt werden. Dabei beträgt der pH-Wert der basischen Lösung vorteilhaft mindestens 9, besonders bevorzugt wird ein pH-Wert von etwa 10 verwendet. Als Base kann jede kommerziell erhältliche Base verwendet werden, aus Kostengründen empfiehlt es sich aber, Natrium- oder Kaliumhydroxid zu verwenden. Vor der Regenerierung insbesondere des Sorbenzes 2 kann das Sorbens zusätzlich noch mit einer Säurelösung gespült werden, insbesondere mit einer Konzentration von zwischen 250 und 1000 mM. Both sorbents 1 and 2 can be regenerated by rinsing with strongly basic solution and cleaned of remaining on the sorbents residual protein or viral components. The pH of the basic solution is advantageously at least 9, more preferably a pH of about 10 is used. Any commercially available base may be used as the base, but for reasons of cost it is advisable to use sodium or potassium hydroxide. Before the regeneration, in particular of the sorbent 2, the sorbent can additionally be rinsed with an acid solution, in particular with a concentration of between 250 and 1000 mM.
Für die Abtrennung der in der Mischung vorhandenen Bestandteile an organischem Phosphat und ionischer Seife kann das Sorbens 2 mit einer hohen Beladung von bis zu 100 mg/ml zu isolierendem (Blut)Plasmaprotein oder Virenbestandteil, bevorzugt im Bereich von 25 bis 75 mg/ml, beladen werden. For the separation of the components present in the mixture of organic phosphate and ionic soap, the sorbent 2 with a high loading of up to 100 mg / ml to isolated (blood) plasma protein or virus component, preferably in the range of 25 to 75 mg / ml, be loaded.
Nach dem Eluieren der (Blut)Plasmaproteine und/oder Virenbestandteile vom Sorbens 2 können die im Solvent-Detergent-Verfahren zugesetzten Reagenzien durch Behandlung mit 70%-igem iso-Propanol in Wasser oder 70%-igem Ethanol in Wasser von der Säule gewaschen werden. After eluting the (blood) plasma proteins and / or viral components from sorbent 2, the reagents added in the solvent-detergent process can be washed from the column by treatment with 70% isopropanol in water or 70% ethanol in water ,
Mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren und der Vorrichtung lassen sich (Blut)Plasmaproteine und Virenbestandteile, insbesondere Immunoglobuline, wie IgG, IgM und IgA, in wenigen Schritten kostengünstig reinigen, wobei gleichzeitig im Ausgangsmaterial vorhandene Viren effektiv inaktiviert werden können. Das folgende Beispiel soll aber nur zur Illustration der beschriebenen Erfindung dienen und deren Umfang nicht in irgendeiner Weise beschränken. Beispiel 1 With the method and the device described above, (blood) plasma proteins and viral components, in particular immunoglobulins, such as IgG, IgM and IgA, can be purified inexpensively in a few steps, whereby viruses present in the starting material can be effectively inactivated. However, the following example is intended only to illustrate the invention described and not to limit its scope in any way. example 1
Das Sorbenz 1 wird mit 500 mM Citrat-Puffer (pH 5.0) gespült und danach mit der gleichen Menge 10 mM Citrat-Puffer (pH 5.0) equilibriert. Anschließend wird wird eine kommerzielle A+l Paste als 10%ige Lösung in 10 mM Citrat-Puffer bei pH 5 auf das Sorbens aufgebracht und mit demselben Puffer gespült. In den zuerst gewonnenen Fraktionen wird Albumin und Transferrin (Ausbeute quantitativ, Reinheit rund 90 %) erhalten, die in weiteren Reinigungsstufen (Ionentauscher) gereinigt werden können. Nach dem Auffangen der Albumin/ Transferinfraktionen wurde die Säule mit weiterem 10 mM Citrat-Puffer bei pH (5.0) gespült. Anschließend wurde vorgereinigtes IgG durch Spülen mit 100 mM Phosphatpuffer bei pH 7,4 von der Säure eluiert. Das dabei erhaltene IgG hatte Reinheit von > 80 % und wurde in einer Ausbeute von > 98 % erhalten. Das Produkt war Albumin- und Transferrinfrei. The sorbent 1 is rinsed with 500 mM citrate buffer (pH 5.0) and then equilibrated with the same amount of 10 mM citrate buffer (pH 5.0). Subsequently, a commercial A + 1 paste as a 10% solution in 10 mM citrate buffer at pH 5 is applied to the sorbent and rinsed with the same buffer. In the fractions obtained first, albumin and transferrin (yield quantitative, purity about 90%) are obtained, which can be purified in further purification stages (ion exchangers). After collecting the albumin / transferin fractions, the column was rinsed with additional 10mM citrate buffer at pH (5.0). Subsequently, pre-purified IgG was eluted from the acid by rinsing with 100 mM phosphate buffer at pH 7.4. The IgG thus obtained had a purity of> 80% and was obtained in a yield of> 98%. The product was free of albumin and transferrin.
Anschließend wurde das erhaltene Zwischenprodukt zunächst durch Ultrafiltration auf etwa 50 mg/mL IgG aufkonzentriert. Danach wurde der Phosphatpuffer durch Diafiltration gegen einen Acetatpuffer mit einer Konzentration von 200 mM und einem pH-Wert von 4,3 bis 4,5 ausgetauscht. Anschließend wurde die Mischung einer Solvent-Detergent-Behandlung unterzogen, indem 1 % Triton-X-100 und 0,3% Tri-N-Butyl-phosphat zugemischt wurden und für 8 bis 16 Stunden lang stehen gelassen wurde. Vor dem Auftragen dieses Zwischenprodukts auf das Sorbens 2 wurde das Sorbens ebenfalls zunächst durch Spülen mit 400 mM Essigsäurelösung und anschließendem Spülen mit 200 mM Acetatpuffer bei pH 4,3 bis 4,5 equilibriert. Das in Acetatpuffer gelöste Zwischenprodukt wurde auf das Sorbens aufgebracht, wobei eine Beladung im Bereich von zwischen 25 und 75 mg/ml Pro- dukt/Sorbens-Volumen gewählt wurde. Reines IgG wurde durch Spülen mit 200 mM Azetatpuffer bei pH 4,3 bis 4,5 von der Säule eluiert. Schließlich wurde das Sorbens mit 500 mM Essigsäure gespült und IgA und IgM mit einer Ausbeute von > 90% in hoher Reinheit gewonnen. Das so gewonnene IgG als Lösung mit einem Gehalt von 5% weist die folgenden Eigenschaften auf: Reinheit: > 99,5 % Subsequently, the intermediate obtained was first concentrated by ultrafiltration to about 50 mg / ml IgG. Thereafter, the phosphate buffer was exchanged by diafiltration with an acetate buffer having a concentration of 200 mM and a pH of 4.3 to 4.5. Subsequently, the mixture was subjected to a solvent-detergent treatment by mixing 1% Triton X-100 and 0.3% tri-N-butyl phosphate and allowing it to stand for 8 to 16 hours. Prior to applying this intermediate to sorbent 2, the sorbent was also first equilibrated by rinsing with 400 mM acetic acid solution followed by rinsing with 200 mM acetate buffer at pH 4.3 to 4.5. The intermediate dissolved in acetate buffer was applied to the sorbent with a loading in the range of between 25 and 75 mg / ml of product / sorbent volume. Pure IgG was eluted from the column by rinsing with 200 mM acetate buffer at pH 4.3 to 4.5. Finally, the sorbent was rinsed with 500 mM acetic acid and IgA and IgM were recovered with a yield of> 90% in high purity. The IgG thus obtained as a solution with a content of 5% has the following properties: Purity:> 99.5%
Ausbeute: 99 % (über zwei Säulen)  Yield: 99% (over two columns)
IgG-Aktivität: 95 - 105 %  IgG activity: 95-105%
IgA: 10 - 30 Mg/ml (<0.01 %)  IgA: 10 - 30 mg / ml (<0.01%)
IgM : 0.2 bis 0.7 Mg/ml (0.00 %)  IgM: 0.2 to 0.7 mg / ml (0.00%)
Albonin: 50 - 100 Mg/ml (< 0.05 %)  Albonine: 50-100 μg / ml (<0.05%)
Transferrin: 5 - 10 Mg/ml (0.00 %)  Transferrin: 5 - 10 mg / ml (0.00%)
Restproteine: Fibrinogen, Haptoglobolin, 2-Macroglobolin, Apolipoprotein A und B und IgD (alle unter dem Dedektionslimit < 0.01 %) Residual proteins: fibrinogen, haptoglobin, 2-macrogloboline, apolipoprotein A and B and IgD (all below the limit of dedication <0.01%)
SD-Reagenzien: Triton X-100 unter dem Detektionslimit von 5 pg/ml SD reagents: Triton X-100 below the detection limit of 5 pg / ml
TnBP unter dem Detektionslimit von 0,2 pg/ml  TnBP below the detection limit of 0.2 pg / ml
Als Sorbens 1 wurde ein mit Pyridin-4-carboxyamidresten und 3-Carbox- amidopropion-säureresten funktionalisiertes Trägermaterial, als Sorbens 2 ein mit 3-Indolpropion-amidresten und 4-Imidazolacrylamidresten funktionalisiertes Trägermaterial verwendet. Die kommerzielle A+l Paste hatte die folgende Zusammensetzung : IgG: 77%; IgA: 7%; IgM : 3%; Albumin 12%; Transferrin 1 %; Gesamtproteingehalt: 75%. The sorbent 1 used was a support material functionalized with pyridine-4-carboxyamide radicals and 3-carboxamidopropionic acid radicals, and sorbent 2 was a support material functionalized with 3-indolepropionamide radicals and 4-imidazolacrylamide radicals. The commercial A + 1 paste had the following composition: IgG: 77%; IgA: 7%; IgM: 3%; Albumin 12%; Transferrin 1%; Total protein content: 75%.

Claims

Patentansprüche claims
Verfahren zur Trennung, Aufkonzentration und/oder Reinigung eines (Blut)plasmaproteins oder Virenbestandteils aus einer Mischung, die dieses (Blut)plasmaprotein oder den Virenbestandteil enthält, wobei die das (Blut)Plasmaprotein oder den Virenbestandteil enthaltende Mischung natürliches menschliches oder tierisches Blut oder ein Zwischen- oder fertiges Produkt von natürlichem menschlichen oder tierischen Blut ist, insbesondere Blutplasma oder proteinhaltiges Fällungsprodukt, das nach einem Frak- tionierungsverfahren aus Blutplasma erhalten wurde, umfassend : A method for separating, concentrating and / or purifying a (blood) plasma protein or viral component from a mixture containing said (blood) plasma protein or the viral component, wherein the mixture containing the (blood) plasma protein or viral component contains natural or human blood Intermediate or finished product of natural human or animal blood, in particular blood plasma or proteinaceous precipitate obtained from a blood plasma fractionation process, comprising:
(i) das Inkontaktbringen der Mischung, die in einer Flüssigkeit 1 gelöst oder suspendiert ist, mit einem Sorbens 1 für einen ausreichenden Zeitraum, um das (Blut)plasmaprotein oder den Virenbestandteil an das Sorbens 1 zu binden;  (i) contacting the mixture dissolved or suspended in a liquid 1 with a sorbent 1 for a time sufficient to bind the (blood) plasma protein or viral component to the sorbent 1;
(ii) das Inkontaktbringen des Sorbenzes 1 mit dem daran gebundenen (Blut)plasmaprotein oder Virenbestandteil mit einer Flüssigkeit 2 für einen ausreichenden Zeitraum, um das (Blut)plasmaprotein oder den Virenbestandteil von dem Sorbens 1 zu lösen;  (ii) contacting the sorbent 1 with the blood plasma protein or virus component bound thereto with a liquid 2 for a sufficient time to dissolve the (blood) plasma protein or virus component from the sorbent 1;
(iii) das Durchführen eines Solvent-Detergent-Verfahrens mit dem vorgereinigten (Blut)plasmaprotein oder Virenbestandteil;  (iii) performing a solvent-detergent process on the prepurified (blood) plasma protein or viral component;
(iv) das Filtrieren der aus Schritt (iii) enthaltenen Mischung über ein Sorbens 2,  (iv) filtering the mixture from step (iii) through a sorbent 2,
wobei die Sorbenzien 1 und 2 feste Trägermaterialien sind, deren Oberflächen jeweils mit mindestens zwei Rezeptormolekülen funktionalisiert sind, wobei die Oberfläche des Sorbens 1 mit Pyridin-4-Carboxyamido-Resten und 3-Carboxymidopropionsäure-Resten und die Oberfläche des Sorbens 2 mit Benzopyrrol-Resten und 3-Azapyrrol-Resten funktionalisiert ist. wherein the sorbents 1 and 2 are solid support materials whose surfaces are each functionalized with at least two receptor molecules, wherein the surface of the sorbent 1 with pyridine-4-carboxyamido residues and 3-carboxymidopropionic acid residues and the surface of the sorbent 2 with benzopyrrole residues and 3-azapyrrole residues is functionalized.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Anschluss an das Binden des (Blut)plasmaproteins oder Virenbestandteils an das Sorbens 1 im Schritt (i) das Sorbens mit einer weiteren Flüssigkeit gewaschen wird. A method according to claim 1, characterized in that following the binding of the (blood) plasma protein or virus component to the sorbent 1 in step (i), the sorbent is washed with another liquid.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Anschluss an das Lösen des (Blut)plasmaproteins oder Virenbestandteils vom Sorbens 1 im Schritt (ii) das Sorbens mit einer weiteren Flüssigkeit gewaschen und/oder regeneriert wird. A method according to claim 1 or 2, characterized in that following the dissolution of the (blood) plasma protein or virus component of Sorbent 1 in step (ii) the sorbent is washed with an additional liquid and / or regenerated.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Binden des (Blut)plasmaproteins oder Virenbestandteils an das Sorbens im Schritt (i) und/oder (iv) das Sorbens mit einer weiteren Flüssigkeit equi- libriert wird. 4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that prior to binding of the (blood) plasma protein or virus component to the sorbent in step (i) and / or (iv) the sorbent is equilibrated with a further liquid.
5. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der Flüssigkeit 2 in der Nähe des isoelektrischen Punktes pl des gebundenen (Blut)plasmaproteins oder Virenbestandteils liegt. 5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the pH of the liquid 2 in the vicinity of the isoelectric point pl of the bound (blood) plasma protein or virus component is located.
6. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der Flüssigkeit 1 im Bereich von 4,0 bis 6,0 und der pH-Wert der Flüssigkeit 2 im Bereich von 6,5 bis 8,5 liegt. 6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the pH of the liquid 1 in the range of 4.0 to 6.0 and the pH of the liquid 2 is in the range of 6.5 to 8.5.
7. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der Flüssigkeit 3 im Bereich von 3,0 bis 6,5 liegt. 7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the pH of the liquid 3 is in the range of 3.0 to 6.5.
8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das (Blut)plasmaprotein oder Virenbestandteil einen isoelektrischen Punkt pl im Bereich von 5,5 bis 8,5 und ein Molekulargewicht von 100 bis 500.000 Da aufweist. 8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the (blood) plasma protein or viral component has an isoelectric point pl in the range of 5.5 to 8.5 and a molecular weight of 100 to 500,000 Da.
9. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das (Blut)plasmaprotein oder Virenbestandteil ein Immunoglobulin (G) oder ein natürlicher Antikörper ist. 9. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the (blood) plasma protein or viral component is an immunoglobulin (G) or a natural antibody.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Benzopyr- rolreste 3-Indolpropionamid-Reste und 3-Azapyrrol-Reste 4-Imidazol- acrylamido-Reste darstellen. 10. The process as claimed in claim 1, wherein the benzopyrrole radicals represent 3-indolepropionamide radicals and 3-azapyrrole radicals represent 4-imidazoleacrylamido radicals.
11. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit 1 im Schritt (i) ein Puffer mit einer Konzentration im Bereich von 1 bis 100, insbesondere 2 bis 20 mM ist. 11. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the liquid 1 in step (i) is a buffer having a concentration in the range of 1 to 100, in particular 2 to 20 mM.
12. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Gewicht des aufzureinigenden (Blut)plasmaproteins oder Virenbestandteils in der Mischung zum Volumen des Sorbenses im Schritt (i) im Bereich von 2 bis 30, insbesondere 5 bis 20 mg/ml liegt. 12. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the ratio of weight of the to be purified (blood) plasma protein or virus component in the mixture to the volume of the sorbent in step (i) in the range of 2 to 30, especially 5 to 20 mg / ml is.
13. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit 2 im Schritt (ii) ein Puffer mit einer Konzentration im Bereich von 50 bis 200, insbesondere 80 bis 120 mM ist. 13. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the liquid 2 in step (ii) is a buffer having a concentration in the range of 50 to 200, in particular 80 to 120 mM.
14. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt (ii) erhaltene Mischung vor dem Solvent- Detergent-Verfahren in Schritt (iii) aufkonzentriert wird. 14. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the mixture obtained in step (ii) is concentrated before the solvent-detergent process in step (iii).
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufkonzentration mit Hilfe einer Ultrafiltration durchgeführt wird. 15. The method according to claim 14, characterized in that the concentration is carried out by means of an ultrafiltration.
16. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit 2 vor Durchführung des Solvent-Detergent- Verfahrens mit der Flüssigkeit 3 ausgetauscht wird. 16. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the liquid 2 is exchanged with the liquid 3 before carrying out the solvent-detergent process.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Austausch der Flüssigkeiten 2 und 3 mittels einer Diafiltration erfolgt. 17. The method according to claim 16, characterized in that the exchange of the liquids 2 and 3 takes place by means of a diafiltration.
18. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Solvent-Detergent-Verfahrens durch Zugabe einer nichtionischen Seife und eines organischen Phosphats durchgeführt wird. 18. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the solvent-detergent process is carried out by adding a nonionic soap and an organic phosphate.
19. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Solvens-Detergent-Verfahrens über einen Zeitraum von 4 bis 16 h durchgeführt wird. 19. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the solvent-detergent process is carried out over a period of 4 to 16 h.
20. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit 3 ein Puffer mit einer Konzentration im Bereich von 50 bis 400, insbesondere 150 bis 250 mM ist. 20. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the liquid 3 is a buffer having a concentration in the range of 50 to 400, in particular 150 to 250 mM.
21. Verfahren nach Anspruch 4 oder einem davon abhängigen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die zum Equilibrieren vor Schritt (i) verwendete Flüssigkeit ein Puffer ist, eine Konzentration im Bereich von 250 bis 3000 mM aufweist. A method according to claim 4 or any claim dependent thereon, characterized in that the liquid used for equilibration prior to step (i) is a buffer having a concentration in the range of from 250 to 3000 mM.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer einen pH-Wert von zwischen 4,0 und 6,0 aufweist. 22. The method according to claim 21, characterized in that the buffer has a pH of between 4.0 and 6.0.
23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Schritt (i) das Sorbens mit Flüssigkeit (1) gespült wird. 23. The method according to claim 21 or 22, characterized in that prior to step (i) the sorbent is rinsed with liquid (1).
24. Verfahren nach Anspruch 4 oder einem davon abhängigen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die zum Equilibrieren vor Schritt (iv) verwendete Flüssigkeit eine Lösung mit einem pH < 5 ist. 24. A method according to claim 4 or any claim dependent thereon, characterized in that the liquid used for equilibration before step (iv) is a solution having a pH <5.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung eine Säure-Konzentration im Bereich von 200 bis 600 mM aufweist. 25. The method according to claim 24, characterized in that the solution has an acid concentration in the range of 200 to 600 mM.
26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Schritt (iv) das Sorbens 2 mit Flüssigkeit 3 gespült wird. 26. The method according to claim 24 or 25, characterized in that prior to step (iv) the sorbent 2 is rinsed with liquid 3.
27. Verfahren nach Anspruch 2 oder einem davon abhängigen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die zum Waschen nach dem Schritt (i) verwendete Flüssigkeit die Flüssigkeit 1 ist. 27. Method according to claim 2 or any claim dependent thereon, characterized in that the liquid used for washing after step (i) is the liquid 1.
28. Verfahren nach Anspruch 3 oder einem davon abhängigen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorbens durch Spülen mit einer Lösung, einen pH von mindestens 9 aufweist, regeneriert wird . 28. The method of claim 3 or any claim dependent thereon, characterized in that the sorbent is regenerated by rinsing with a solution having a pH of at least 9.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die basische Lösung einen pH-Wert von etwa 10 aufweist. 29. The method according to claim 28, characterized in that the basic solution has a pH of about 10.
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