DE102012022233A1 - Process for purifying a (blood) plasma protein - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein einstufiges Verfahren zur Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins aus einer Mischung, die dieses (Blut)Plasmaprotein enthält, umfassend das Aufbringen des (Blut)Plasmaproteins auf ein Sorbenz, umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzopyrrol-Resten und 3-Azepyrrolresten funktionalisiert ist, und das Eluieren des (Blut)Plasmaproteins von dem Sorbenz. Das Verfahren eignet sich insbesondere zur Abtrennung von Blutbestandteilen, wie IgA, IgM sowie Faktor XI und Faktor XIa, die an das Sorbenz gebunden werden, während das zu reinigende (Blut)Plasmaprotein nicht oder nur geringfügig an das Sorbenz bindet. Damit ist es möglich, das Produkt in einem einfachen Flow through-Schritt zu reinigen, wobei hohe Ausbeuten und Reinheiten bei hohen Beladungskapazitäten erzielt werden.The invention relates to a one-step process for the purification of a (blood) plasma protein from a mixture which contains this (blood) plasma protein, comprising the application of the (blood) plasma protein to a sorbent, comprising a solid carrier material, the surface of which contains benzopyrrole residues and 3 -Azepyrrole residues is functionalized, and the elution of the (blood) plasma protein from the sorbent. The method is particularly suitable for the separation of blood components, such as IgA, IgM and factor XI and factor XIa, which are bound to the sorbent, while the (blood) plasma protein to be purified does not bind to the sorbent, or only to a minor extent. This makes it possible to clean the product in a simple flow-through step, whereby high yields and purities are achieved with high loading capacities.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein einstufiges Verfahren zur Reinigung eines (Blut)plasmaproteins aus einer Mischung, die dieses (Blut)plasmaprotein enthält, umfassend das Aufbringen des (Blut)plasmaproteins auf ein Sorbenz, umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzopyrolresten und 3-Azopyrolresten funktionalisiert ist, und das Eluieren des (Blut)plasmaproteins von dem Sorbenz. Das Verfahren kann zweckmäßig zur Abtrennung von Blutbestandteilen, wie insbesondere Faktor XI und/oder Blutfaktor XIa, verwendet werden. Die (Blut)plasmaproteine umfassen dabei insbesondere Immunoglobulin G.The present invention relates to a one-step process for purifying a (blood) plasma protein from a mixture containing this (blood) plasma protein, comprising applying the (blood) plasma protein to a sorbent comprising a solid support material whose surface is covered with benzopyrene residues and 3- Azopyrene radicals is functionalized, and the elution of the (blood) plasma protein from the sorbent. The method can be suitably used for the separation of blood constituents, in particular factor XI and / or blood factor XIa. In particular, the (blood) plasma proteins comprise immunoglobulin G.

Hintergrund der ErfindungBackground of the invention

Der Faktor XI (auch als Rosentalfaktor oder Plasma Thromboplasmin Antecedent bezeichnet) ist ein an der Blutgerinnung beteiligtes Enzym in Form einer Serinproteinase. Dieses Enzym wird von der Leber produziert und liegt im Blutplasma in seiner inaktiven Form als Homodimer vor, in dem zwei Einheiten über eine Disulphitbrücke miteinander verbunden sind. Das Monomer besitzt eine Molekülmasse von 800 kDa. Der Faktor XI wird durch den aktivierten Hageman-Faktor (Faktor XIIa) oder durch Thrombin aktiviert und dann als Faktor XIa bezeichnet. Es gehört zum intrinsischen Pfad der Blutgerinnung, die in Aktion tritt, wenn der Hageman-Faktor und andere Bestandteile auf negativ geladenes Collagen unter dem Endothel der Gefäßwand trifft. Der Faktor XIa aktiviert in der Gerinnungskaskade den Christmas-Faktor (Faktor IX) zu Faktor IXa.Factor XI (also referred to as rosemary factor or plasma thromboplasmin antecedent) is an enzyme involved in blood coagulation in the form of a serine proteinase. This enzyme is produced by the liver and is present in the blood plasma in its inactive form as a homodimer, in which two units are connected by a disulphite bridge. The monomer has a molecular weight of 800 kDa. The factor XI is activated by the activated Hageman factor (factor XIIa) or by thrombin and then designated as factor XIa. It is part of the intrinsic pathway of blood clotting that occurs when the Hageman factor and other components strike negatively charged collagen under the endothelium of the vessel wall. The factor XIa activates the Christmas factor (factor IX) to factor IXa in the coagulation cascade.

Ein erhöhtes Faktor XI-Niveau im Blut wird heute mit der Verursachung von Thrombosen in Verbindung gebracht. In der jüngeren Vergangenheit wurde daher bei Blutplasmaproteinpräparaten starker Wert darauf gelegt, dass die enthaltenen Präparate möglichst frei von Faktor XI oder Faktor XIa sind, damit sich bei Gabe entsprechender Blutpräparate an Patienten bei diesen das Thromboserisiko nicht erhöht.An elevated blood XI level in the blood today is associated with the cause of thrombosis. In the recent past, therefore, in blood plasma protein preparations, great importance has been attached to the fact that the preparations contained are as free as possible of factor XI or factor XIa, so that the risk of thrombosis does not increase with the administration of appropriate blood preparations to patients.

Die Abtrennung bzw. Aufreinigung von Faktor XI oder XIa wurde beispielsweise bereits in der US 5,252,217 beschrieben, wobei der Faktor säulenchromatographisch mit Hilfe von ”Sulphat-Sepharose-Gelen” isoliert wurde. Problematisch an diesem Verfahren ist allerdings, dass diese Gele nur mit einer relativ geringen Beladung (d. h., einem geringen Verhältnis von zu reinigender Substanz zu Chromatographie Material) betrieben werden können. Damit sind diese Verfahren zur Abtrennung von Faktor XI und/oder XIa aus großen Mengen an (Blut)plasmaproteinen relativ zeitaufwändig und kostspielig.The separation or purification of factor XI or XIa has already been described, for example, in US Pat US 5,252,217 wherein the factor was isolated by column chromatography using "sulphate-Sepharose gels". However, the problem with this method is that these gels can only be operated with a relatively low loading (ie, a low ratio of substance to be purified to chromatography material). Thus, these methods of separating factor XI and / or XIa from large amounts of (blood) plasma proteins are relatively time consuming and costly.

In der WO 2005/049070 sind Verfahren zur Abtrennung von Faktor XI beschrieben, die auf Affinitätschromatographie beruhen. Dabei werden mit Faktor XI-Antikörpern modifizierte Säulenmaterialien oder mit Heparin, L-Arginin oder Benzamidin-modifizierte Materialien vorgeschlagen. Weitere Verfahren zur Abtrennung von Faktor IX basieren auf Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlusschromatographie, elektrophoretischen Verfahren oder unterschiedlicher Löslichkeit der Faktoren in den Präparaten. Die WO 2005/0949070 beschreibt zudem ein sequentielles Chromatographieverfahren, umfassend eine Kationaustauschchromatographie, eine hydrophobe Wechselwirkungschromatographie und eine abschließenden Behandlung mit Hydroxylapatit, wobei sehr reiner Faktor XI erhalten werden soll.In the WO 2005/049070 describe methods for the separation of factor XI, which are based on affinity chromatography. Here, columnar materials modified with factor XI antibodies or with heparin, L-arginine or benzamidine-modified materials are proposed. Other methods of separating Factor IX are based on ion exchange chromatography, size exclusion chromatography, electrophoretic methods or differential solubility of the factors in the preparations. The WO 2005/0949070 describes also a sequential chromatography method comprising cation exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography and a final treatment with hydroxyapatite to obtain very pure factor XI.

In der EP 2 102 335 A2 ist schließlich für die Aufreinigung von Faktor XI ein hydrophobes Ladungsinduktionschromatographiematerial beschrieben, das u. a. einen Pyridinring aufweist. Dabei wird Faktor IX zunächst bei neutralem pH (wobei der Pyridinring ungeladen vorliegt) an das Chromatographiematerial gebunden. Nach Erhöhung des pHs auf etwa 4, was zur Protonierung des Pyridinrings führt, wird der Antikörper anschließend wieder freigesetzt.In the EP 2 102 335 A2 Finally, for the purification of factor XI a hydrophobic charge-induction chromatography material is described, which has, inter alia, a pyridine ring. Factor IX is first bound to the chromatography material at neutral pH (with the pyridine ring being uncharged). After raising the pH to about 4, which leads to the protonation of the pyridine ring, the antibody is subsequently released again.

Die beschriebenen Verfahren zielen jedoch allesamt auf die Reinigung von Faktor XI ab, und beschäftigen sich nicht mit der Abtrennung des Faktors aus (Blut)plasmaproteingemischen, bei denen eine möglichst reine (Blut)plasmaproteinfraktion erhalten werden soll. Demzufolge ist unklar ob diese Verfahren mit Ausgangsprodukten durchgeführt werden können, bei denen der Faktor XI nur in gegenüber den übrigen Proteinen geringen Anteilen vorhanden ist.However, all of the described methods are directed to the purification of Factor XI, and are not concerned with the separation of the factor from (blood) plasma protein mixtures in which a purest (blood) plasma protein fraction is to be obtained. Consequently, it is unclear whether these processes can be carried out with starting products in which the factor XI is present only in small proportions compared with the other proteins.

Ein weiteres in (Blut)Plasmaproteinpräparaten unerwünschtes Nebenprodukt ist das Immunoglobulin A, welches Allergien in Patienten verursachen kann.Another by-product undesirable in (blood) plasma protein preparations is immunoglobulin A, which can cause allergies in patients.

Es besteht daher ein Bedarf für ein einfaches Verfahren zur Reinigung eines (Blut)plasmaproteins aus einer Mischung, die dieses (Blut)plasmaprotein enthält, wobei dieses Verfahren insbesondere zur schnellen und einfachen Abtrennung von Immunoglobulin A und M, sowie Faktor XI bzw. und/oder Faktor XIa aus dem (Blut)plasma-Proteingemisch geeignet sein sollte. Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem.There is therefore a need for a simple process for purifying a (blood) plasma protein from a mixture containing this (blood) plasma protein, this process in particular for the rapid and simple separation of immunoglobulin A and M, and factor XI and / or / or factor XIa from the (blood) plasma-protein mixture should be suitable. The present invention solves this problem.

Beschreibungdescription

Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft demzufolge ein einstufiges Verfahren zur Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins aus einer Mischung, die dieses (Blut)Plasmaprotein enthält, umfassend das Aufbringen des (Blut)Plasmaproteins auf ein Sorbenz, umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzolpyrolresten und 3-Azapyrrolresten funktionalisiert ist und das Eluieren des (Blut)Plasmaproteins von dem Sorbenz.A first aspect of the present invention thus relates to a one-step process for purifying a (blood) plasma protein from a mixture containing this (blood) plasma protein, comprising applying the (blood) plasma protein a sorbent comprising a solid support material whose surface is functionalized with benzenepyrene residues and 3-azapyrrole residues and eluting the (blood) plasma protein from the sorbent.

Wenn im Vorstehenden von einem einstufigen Verfahren die Rede ist, bezieht sich die Bezeichnung ”einstufig” nur auf die Schritte zur Behandlung des (Blut)Plasmaproteins an sich, d. h., das Verfahren kann dennoch weitere Schritte oder Stufen umfassen, die sich mit der Vor- oder Nachbehandlung des Sorbenzes befassen. Das einstufige Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst jedoch nicht mehr als einen Behandlungsschritt für das (Blut)Plasmaprotein.When referring to a one-step process in the foregoing, the term "one-step" refers only to the steps of treating the (blood) plasma protein per se; that is, the process may still include other steps or steps related to the pre- or post-treatment of the sorbent. However, the one-step method according to the present invention does not involve more than one treatment step for the (blood) plasma protein.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Benzopyrrolresten des festen Trägermaterials um 3-Indolpropionamidreste. Alternativ oder zusätzlich dazu ist es bevorzugt, wenn die 3-Azapyrrolreste in Form 4-Imidazolacrylamidresten vorliegen.In a preferred embodiment, the benzopyrrole residues of the solid support material are 3-indolopropionamide residues. Alternatively or additionally, it is preferred if the 3-azapyrrole radicals are in the form of 4-imidazolacrylamide radicals.

Im Rahmen des vorstehend beschriebenen Verfahrens ist es weiterhin bevorzugt, wenn das Sorbenz das zu reinigende (Blut)Plasmaprotein im Wesentlichen nicht bindet oder absorbiert. Das heißt, dass sich nach dem Auftragen oder Aufbringen des (Blut)Plasmaproteins auf das Sorbens das zu reinigende (Blut)plasmaprotein im Wesentlichen mit der Fließmittelfront durch das Sorbenz bewegt, und mit dieser von der Säule zurückgewonnen werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es demzufolge bevorzugt, wenn das (Blut)Plasmaprotein nach Zugabe der fünffachen Menge, vorzugsweise der dreifachen Menge, und besonders bevorzugt der zweifachen Menge an Fließmittel, bezogen auf das Sorbenzvolumen, auf das Sorbenz im Wesentlichen vollständig, d. h., zu mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90% und besonders bevorzugt mindestens 93% von dem Sorbenz zurückgewonnen werden kann. Die Elutionsgeschwindigkeit kann jedoch von unterschiedlichen Faktoren abhängen, sodass das Sorbenz so lange mit dem Puffer gespült werden sollte, bis das zu reinigende (Blut)Plasmaprotein im Wesentlichen vollständig vom Sorbenz heruntergewaschen wurde.In the context of the method described above, it is further preferred if the sorbent substantially does not bind or absorb the (blood) plasma protein to be purified. This means that after application or application of the (blood) plasma protein to the sorbent, the (blood) plasma protein that is to be purified moves essentially through the sorbent with the flow agent front, and can be recovered from the column with it. In the context of the present invention, it is therefore preferred if the (blood) plasma protein after addition of the five-fold amount, preferably three times, and particularly preferably twice the amount of superplasticizer, based on the Sorbenzvolumen, on the sorbent substantially completely, d. h., At least 80%, preferably at least 90% and particularly preferably at least 93% of the sorbent can be recovered. However, the rate of elution may vary depending on different factors, so that the sorbent should be flushed with the buffer until the (blood) plasma protein to be purified has been substantially completely washed off the sorbent.

In der vorstehenden Ausführungsform absorbiert das Sorbenz demzufolge im Wesentlichen die Verunreinigungen des Blutplasmaproteins. Bei den Verunreinigungen, die an das Sorbenz gebunden werden, handelt es sich vorzugsweise um IgA, IgM, sowie Faktor XI und Faktor XIa. Wie sich aus dem Vorstehenden ergibt, sind als (Blut)Plasmaproteine insbesondere solche (Blut)Plasmaproteine im Rahmen der Erfindung zu reinigen, die selbst nicht an das Sorbenz binden. Bei dem (Blut)plasmaprotein handelt es sich vorzugsweise um ein Immunoglobulin, besonders bevorzugt um Immunoglobulin G, und am meisten bevorzugt um menschliches Immunoglobulin G.Accordingly, in the foregoing embodiment, the sorbent substantially absorbs the contaminants of the blood plasma protein. The impurities bound to the sorbent are preferably IgA, IgM, and Factor XI and Factor XIa. As can be seen from the above, as (blood) plasma proteins in particular those (blood) plasma proteins are to be purified within the scope of the invention, which themselves do not bind to the sorbent. The (blood) plasma protein is preferably an immunoglobulin, more preferably immunoglobulin G, and most preferably human immunoglobulin G.

Im Rahmen des Reinigungsverfahrens wird weiterhin vorzugsweise vorgereinigtes (Blut)plasmaprotein, besonders bevorzugt vorgereinigtes Immunoglobulin G, eingesetzt, in dem das (Blut)plasmaprotein bzw. das Immunoglobulin G vorzugsweise mindestens 80 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 85 Gew.-%, noch mehr bevorzugt mindestens 90 Gew.-%, und am meisten bevorzugt 92 bis 98 Gew.-% des (Blut)Plasmaproteingemisches, jeweils bezogen auf das Trockengewicht des Gemischs, ausmacht. Eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugte (Blut)Plasmaproteinmischung ist eine vorgereinigte Immunoglobulin G-Lösung mit einem Immunoglobulin G Gehalt (bezogen auf das Trockengewicht der (Blut)Plasmaproteinmischung) von 92 bis 98 Gew.-%.In the context of the purification process it is further preferred to use prepurified (blood) plasma protein, particularly preferably prepurified immunoglobulin G, in which the (blood) plasma protein or immunoglobulin G is preferably at least 80% by weight, particularly preferably at least 85% by weight. even more preferably at least 90% by weight, and most preferably from 92 to 98% by weight of the (blood) plasma protein mixture, based in each case on the dry weight of the mixture. A (blood) plasma protein mixture which is particularly preferred for the purposes of the present invention is a prepurified immunoglobulin G solution with an immunoglobulin G content (based on the dry weight of the (blood) plasma protein mixture) of 92 to 98% by weight.

Bei dem im Verfahren verwendeten Sorbenz handelt es sich um ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit mindestens zwei Rezeptormolekülen funktionalisiert ist. Besonders bevorzugt besteht das Trägermaterial aus einem porösen Grundmaterial, das zur Einlagerung und Vernetzung einer Polyaminverbindung zunächst mit mindestens einer Lage dieser Aminverbindung überzogen wird und anschließend unter Anknüpfung von funktionalisierten Rezeptormolekülen unter Ausbildung kovalenter Bindungen zwischen den Rezeptormolekülen und dem Polyamin funktionalisiert wird. Bei dem porösen Grundmaterial handelt es sich zweckmäßig um ein poröses Polystrol. Als Polyaminverbindung hat sich die Verwendung von Polyvinylamin als besonders zweckmäßig erwiesen. Das Trägermaterial wird durch Zugabe eines Vernetzungsmittels, beispielsweise einem Diepoxid, vernetzt. Die Herstellung des Trägermaterials kann durch Beschichtung des porösen Grundmaterials mit einer Schicht einer Polyaminverbindung erfolgen, es ist jedoch auch möglich, das Grundmaterial mit zwei oder mehreren Schichten zu überziehen. Vor dem Aufbringen der jeweils weiteren Schicht erfolgt zweckmäßig eine Vernetzung der aufgebrachten Polyaminverbindung, beispielsweise mit einem Vernetzungsmittel, wie vorstehend beschrieben.The sorbent used in the process is a solid support material whose surface is functionalized with at least two receptor molecules. Particularly preferably, the carrier material consists of a porous base material, which is initially coated for incorporation and crosslinking of a polyamine compound with at least one layer of this amine compound and then functionalized with the attachment of functionalized receptor molecules to form covalent bonds between the receptor molecules and the polyamine. The porous base material is suitably a porous polystyrene. As a polyamine compound, the use of polyvinylamine has been found to be particularly useful. The support material is crosslinked by addition of a crosslinking agent, for example a diepoxide. The preparation of the support material can be done by coating the porous base material with a layer of a polyamine compound, but it is also possible to coat the base material with two or more layers. Before applying the respective further layer, it is expedient to crosslink the applied polyamine compound, for example with a crosslinking agent, as described above.

Die Herstellung von Trägermaterialien die mit Polyvinylamin überzogen sind, ist bereits im Stand der Technik, zum Beispiel in EP 1 141 038 und EP 1 232 018 beschrieben worden.The preparation of support materials which are coated with polyvinylamine, is already in the art, for example in EP 1 141 038 and EP 1 232 018 been described.

Anschließend wird das so erhaltene mit Polyamin beschichtete Sorbenz mit zwei organischen Resten funktionalisiert. Dabei hat sich insbesondere die Verwendung von Säure-funktionalisierten Rezeptormolekülen oder Derivaten davon, bei denen nach Umsetzung mit dem Polyvinylamin Amid-Verknüpfungen ausgebildet werden, als besonders zweckmäßig erwiesen.Subsequently, the polyamine-coated sorbent thus obtained is functionalized with two organic radicals. In particular, the use of acid-functionalized receptor molecules or derivatives thereof in which amide linkages are formed after reaction with the polyvinylamine has proven to be particularly useful.

Es ist möglich, die im Sorbenz vorhandenen Amingruppen vollständig mit organischen Resten zu funktionalisieren. In der Praxis der vorliegenden Erfindung ist es aber erwünscht, dass nur etwa 25 bis 98% der freien Amingruppen des Polyamins mit Rezeptormolekülen umgesetzt werden. It is possible to completely functionalize the amine groups present in the sorbent with organic radicals. However, in the practice of the present invention, it is desirable that only about 25 to 98% of the free amine groups of the polyamine be reacted with receptor molecules.

Für die Verknüpfung der Rezeptormoleküle mit dem festen Trägermaterial kommen alle bekannten Verfahren zur Verknüpfung von Aminen mit anderen funktionellen Gruppen in Betracht, insbesondere Verfahren zur Bildung von Amidverbindungen, Sulfonamidbindungen oder die Umsetzung der Amine mit Aldehyden unter reduktiven Bedingungen. Wird eine Säurefunktionalität zur Verknüpfung mit den Aminresten des Trägermaterials verwendet, wird nach der Umsetzung in der Regel eine Amidfunktionalität erhalten mit der das Rezeptormolekül an das Trägermaterial gebunden ist. Zur Bildung solcher Amidverknüpfungen kommen alle im Stand der Technik beschriebenen Reaktionsarten in Betracht, die dem Fachmann geläufig sind.For the linkage of the receptor molecules with the solid support material, all known methods for linking amines with other functional groups are suitable, in particular processes for the formation of amide compounds, sulfonamide bonds or the reaction of the amines with aldehydes under reductive conditions. If an acid functionality is used for linking with the amine radicals of the support material, an amide functionality is generally obtained after the reaction with which the receptor molecule is bound to the support material. For the formation of such amide linkages, all reaction types described in the prior art are considered, which are familiar to the person skilled in the art.

Auch die Bindung von Rezeptormolekülen an Trägermaterialien wie sie vorstehend beschrieben sind, wurde bereits im Stand der Technik, insbesondere in WO 2004/085046 , beschrieben.The binding of receptor molecules to support materials as described above has also been described in the prior art, in particular in US Pat WO 2004/085046 , described.

Für das Verfahren hat es sich als zweckmäßig herausgestellt, wenn das (Blut)Plasmaprotein als Lösung in einem Puffer auf das Sorbenz aufgebracht wird. Für den Puffer kommen vorzugsweise Puffer mit einem pKa-Wert im Bereich von 4,0 bis 6,5 in Betracht. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Puffer um einen Puffer, ausgewählt aus Kohlensäure/Silikatpuffern, Essigsäurepuffern, Citratpuffern, Phosphatpuffern, Glycinpuffern und/oder 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) Puffern. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Puffer um einen Glycinpuffer.For the method, it has proved to be useful when the (blood) plasma protein is applied as a solution in a buffer on the sorbent. For the buffer are preferably buffers having a pKa in the range of 4.0 to 6.5 into consideration. Preferably, the buffer is a buffer selected from carbonic acid / silicate buffers, acetic acid buffers, citrate buffers, phosphate buffers, glycine buffers, and / or 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) buffers. In a particularly preferred embodiment, the buffer is a glycine buffer.

Der verwendete Puffer weist zweckmäßig eine Konzentration im Bereich von 50 bis 500 mmol, bevorzugt im Bereich von 200 bis 400 mmol, und besonders bevorzugt im Bereich von 250 bis 350 mmol auf.The buffer used expediently has a concentration in the range from 50 to 500 mmol, preferably in the range from 200 to 400 mmol, and particularly preferably in the range from 250 to 350 mmol.

Hinsichtlich der Beladungsmenge unterliegt die vorliegende Erfindung keinen relevanten Beschränkungen. So kann das Sorbenz sowohl mit sehr geringen Mengen, wie beispielsweise 10 g/l Sorbenzvolumen, aber auch mit sehr hohen Beladungsmengen von bis zu 750 g/l Sorbenzvolumen, auf das Sorbenz aufgetragen werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es jedoch bevorzugt, wenn das (Blut)Plasmaprotein in einer Menge von mehr als 100 g/l Sorbenzvolumen auf das Sorbenz aufgetragen wird. Besonders bevorzugt ist es, wenn das Blutplasmaprotein in einer Menge im Bereich von 120 bis 250 mg/ml Sorbenzvolumen auf das Sorbenz aufgetragen wird. Diese Mengen stellen einen guten Kompromiss zwischen festgestellter Reinigungsleistung und Zeitaufwand für die Trennung der zu reinigenden (Blut)Plasmaproteine dar.With regard to the loading amount, the present invention is not subject to any relevant restrictions. Thus, the sorbent can be applied to the sorbent both with very small amounts, such as, for example, 10 g / l of sorbent volume, but also with very high loading quantities of up to 750 g / l of sorbent volume. In the context of the present invention, however, it is preferred if the (blood) plasma protein is applied to the sorbent in an amount of more than 100 g / l sorbent volume. It is particularly preferred if the blood plasma protein is applied to the sorbent in an amount in the range from 120 to 250 mg / ml sorbent volume. These amounts represent a good compromise between observed cleaning performance and time required for the separation of the (blood) plasma proteins to be purified.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es weiterhin zweckmäßig, das Sorbenz vor dem Aufbringen des (Blut)Plasmaproteins zu equilibrieren. Dazu wird zweckmäßig eine weitere Flüssigkeit verwendet. Diese Flüssigkeit sollte ebenfalls einen pH-Wert im Bereich von 4 bis 6,5 aufweisen, so dass der pH-Wert bereits vor dem Auftragen des (Blut)Plasmaproteins auf den pH-Wert eingestellt ist, den die (Blut)Plasmaprotein-Lösung aufweist. Weiterhin ist es bevorzugt, wenn die Flüssigkeit zum equilibrieren ein Puffer ist, der eine Konzentration im Bereich von 0,5 bis 2 Mol/l, vorzugsweise im Bereich von 0,8 bis 1,2 Mol/l, aufweist.In the context of the present invention, it is furthermore expedient to equilibrate the sorbent prior to the application of the (blood) plasma protein. For this purpose, a further liquid is suitably used. This liquid should also have a pH in the range of 4 to 6.5 so that the pH is adjusted to the pH that the (blood) plasma protein solution already has before applying the (blood) plasma protein , Further, it is preferable that the equilibration liquid is a buffer having a concentration in the range of 0.5 to 2 mol / l, preferably in the range of 0.8 to 1.2 mol / l.

Vor dem Equilibrieren kann das Sorbenz ebenfalls noch mit einer basische Lösung, vorzugsweise mit einem pH-Wert von mindesten 10, bevorzugt etwa 14, gewaschen werden, um eventuell noch vorhandene Verunreinigungen vom Sorbenz zu entfernen. Als Base können vorzugsweise Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid verwendet werden. Damit sich beim Equilibrieren möglichst schnell ein pH-Wert im Bereich von etwa 4 bis 6,5 einstellt, kann es zudem zweckmäßig sein, nach dem Waschen mit der basischen Lösung das Sorbenz mit einer schwach sauren Lösung zu behandeln, wobei zweckmäßig Essigsäure, vorzugsweise mit einer Konzentration im Bereich von 200 bis 1000 mMol/l, zum Einsatz kommt.Before equilibration, the sorbent can also be washed with a basic solution, preferably with a pH of at least 10, preferably about 14, to remove any remaining impurities from the sorbent. As the base, sodium hydroxide or potassium hydroxide may preferably be used. In order to adjust the equilibrium as quickly as possible a pH in the range of about 4 to 6.5, it may also be appropriate to treat the sorbent after washing with the basic solution with a weakly acidic solution, where appropriate acetic acid, preferably with a concentration in the range of 200 to 1000 mmol / l, is used.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es weiterhin möglich, wenn nach dem Isolieren des zu reinigenden (Blut)Plasmaproteins das Sorbenz nachgeschalteten Waschschritten unterzogen wird. Schließlich ist es möglich, das Sorbenz nach Abschluss des Waschens mit einer stark basischen Lösung zu regenerieren und von den auf dem Sorbenz verbleibenden (Blut)Plasmaproteinresten zu reinigen. Dabei beträgt der pH-Wert der stark basischen Lösung vorteilhaft mindestens 10, besonders bevorzugt wird ein pH-Wert von etwa 14 verwendet. Als Base kann jede kommerziell erhältliche Base verwendet werden, aus Kostengründen empfiehlt es sich aber, Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid zu verwenden. Zusätzlich dazu kann das Sorbenz vor der Behandlung mit der basischen Lösung noch mit Essigsäure, vorzugsweise einer Konzentration von 200 mMol/l bis 600 mMol/l, gewaschen werden.In the context of the present invention, it is furthermore possible if, after isolation of the (blood) plasma protein to be purified, the sorbent is subjected to subsequent washing steps. Finally, after completion of the washing, it is possible to regenerate the sorbent with a strongly basic solution and to clean it of the (blood) plasma protein residues remaining on the sorbent. The pH of the strongly basic solution is advantageously at least 10, more preferably a pH of about 14 is used. Any commercially available base can be used as the base, but for reasons of cost it is advisable to use sodium hydroxide or potassium hydroxide. In addition, the sorbent may be washed with acetic acid, preferably at a concentration of from 200 mmol / l to 600 mmol / l, prior to treatment with the basic solution.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines wie vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Abtrennung von einem oder mehreren, ausgewählt aus Immunoglobulin A, Immunoglobulin M, Faktor XI und Faktor XIa, aus (Blut)Plasmaproteinen, bevorzugt aus Immunoglobulin G. Darüber hinaus können mit Hilfe dieses Verfahrens auch Verunreinigungen, wie beispielsweise IgA und IgM, aus (Blut)plasmaproteinen entfernt werden, wobei es sich bei den (Blut)plasmaproteinen vorzugsweise um Immunoglobulin G, und insbesondere menschliches Immunoglobulin G handelt.A further aspect of the present invention relates to the use of a method as described above for the separation of one or more selected from immunoglobulin A, immunoglobulin M, factor XI and factor XIa from (blood) plasma proteins, preferably from Immunoglobulin G. In addition, by means of this method also impurities, such as IgA and IgM, can be removed from (blood) plasma proteins, the (blood) plasma proteins preferably being immunoglobulin G, and in particular human immunoglobulin G.

Schließlich betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Sorbenzes, umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzopyrrolresten und 3-Azapyrrolresten funktionalisiert ist, und einen Aufbau aufweist, der wie vorstehend beschrieben ist, zur Abtrennung von einem oder mehreren, ausgewählt aus Immunoglobulin A, Immunoglobulin M, Faktor XI und Faktor XIa, aus (Blut)Plasmaproteinen, bevorzugt aus Immunoglobulin G, und besonders bevorzugt aus menschlichem Immunoglobulin G.Finally, another aspect of the present invention relates to the use of a sorbent comprising a solid support material whose surface is functionalized with benzopyrrole residues and 3-azapyrrole residues and having a structure as described above for the separation of one or more selected from immunoglobulin A, immunoglobulin M, factor XI and factor XIa, from (blood) plasma proteins, preferably from immunoglobulin G, and more preferably from human immunoglobulin G.

Das vorstehend beschriebene Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass (Blut)plasmaproteine, wie insbesondere IgG, durch einen einfachen Flow through-Schritt aufgereinigt werden können. Zudem erlaubt es das vorstehend beschriebene Verfahren, IgG-Produkte mit sehr hohen Verhältnissen von zu reinigendem Produkt/Sorbenzvolumen zu reinigen, wobei das Produkt dennoch in sehr hoher Ausbeute von > 95% zurückgewonnen werden kann. Damit stellt das vorstehend beschriebene Verfahren ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Reinigung solcher Blutplasmaproteine dar.The method described above is characterized in that (blood) plasma proteins, in particular IgG, can be purified by a simple flow through step. In addition, the process described above makes it possible to purify IgG products with very high ratios of product / sorbent volume to be purified, although the product can still be recovered in a very high yield of> 95%. Thus, the method described above represents a simple and inexpensive process for purifying such blood plasma proteins.

Das beschriebene Verfahren ist ebenfalls dazu geeignet, um Reagenzien wie Triton X-100, Tri-N-butylphosphin oder Polysorbat (Handelsname ”TWEEN”), beispielsweise die in einem vorausgegangenen solvent-detergent Verfahren nicht vollständig abgetrennt wurden, aus dem Produkt zu entfernen. Weiterhin können mit dem Verfahren Albuminreste und Transferinreste aus dem Produkt entfernt werden. Es ist ebenfalls möglich, IgA und IgM getrennt von dem Sorbenz zu eluieren und diese somit in ebenfalls gereinigter Form zu erhalten. Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls die Verwendung eines Sorbenzes, umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzopyrolresten und 3-Azapyrrolresten funktionalisiert ist, und einen Aufbau aufweist, der wie vorstehend beschrieben ist, zur Abtrennung von Triton X-100, Tri-N-butylphosphin, Polysorbat (Handelsname ”TWEEN”), Albuminresten und Transferinresten aus einem (Blut)Plasmaprotein, wobei es sich bei dem (Blut)plasmaprotein vorzugsweise um Immunoglobulin G handelt.The method described is also suitable for removing from the product reagents such as Triton X-100, tri-N-butylphosphine or polysorbate (trade name "TWEEN"), for example those not completely separated in a previous solvent-detergent process. Furthermore, with the method albumin residues and transferin residues can be removed from the product. It is also possible to elute IgA and IgM separately from the sorbent and thus to obtain them in likewise purified form. Accordingly, the present invention also relates to the use of a sorbent comprising a solid support material whose surface is functionalized with benzopyrene radicals and 3-azapyrrole radicals and having a structure as described above for the removal of Triton X-100, Tri-N- butylphosphine, polysorbate (trade name "TWEEN"), albumin residues and transferin residues from a (blood) plasma protein, where the (blood) plasma protein is preferably immunoglobulin G.

Das folgende Beispiel soll zur Illustration der beschriebenen Erfindung dienen und deren Umfang nicht in irgendeiner Weise beschränken.The following example is intended to illustrate the invention described and not to limit its scope in any way.

Beispiel 1example 1

Das Sorbenz wird zunächst mit einem Azetatpuffer (pH 4 bis 6) equilibriert und anschließend mit 250 mM Glycinpuffer eines pH-Werts von 5,5 behandelt. Als Ausgangsprodukt wird eine 5%-ige IgG-Lösung mit Verunreinigungen von IgA (1000 mg/l) und IgM (500 mg/l), Faktor XI (50 U/ml) und Faktor XIa (50 pM/l) verwendet. Die Feed-Lösung wird in einer Menge, entsprechend einer Beladung von ca. 250 g/l, auf das Sorbenz gegeben. Das Sorbenz wird anschließend so lange mit 250 mM Glycinpuffer mit pH 5,5 gespült, bis das IgG vollständig vom Sorbenz heruntergewaschen ist. Das Produkt IgG wird in einer Ausbeute von > 99% erhalten, wobei das erhaltene Produkt Verunreinigungen an IgA von < 10 mg/l und an IgM von < 5 mg/l aufweist. Die Menge an Faktor XIa kann auf unter 2 pM reduziert werden, während Faktor XI im erhaltenen Produkt nicht mehr nachweisbar war (0 U/ml). IgM und IgA kann mit einer Reinheit von >95% und einer Ausbeute > 95% mit einen sauren Puffer (300 mM Acetat Puffer mit pH 3.5) anschließend von der Säule isoliert werden.The sorbent is first equilibrated with an acetate buffer (pH 4 to 6) and then treated with 250 mM glycine buffer of pH 5.5. The starting product used is a 5% IgG solution with IgA (1000 mg / l) and IgM (500 mg / l), Factor XI (50 U / ml) and Factor XIa (50 pM / l) impurities. The feed solution is added to the sorbent in an amount corresponding to a loading of about 250 g / l. The sorbent is then rinsed with 250 mM glycine buffer at pH 5.5 until the IgG is completely washed off the sorbent. The product IgG is obtained in a yield of> 99%, the product obtained having impurities of IgA of <10 mg / l and of IgM of <5 mg / l. The amount of factor XIa can be reduced below 2 pM, while factor XI was no longer detectable in the product obtained (0 U / ml). IgM and IgA can be isolated from the column with a purity of> 95% and a yield> 95% with an acidic buffer (300 mM acetate buffer pH 3.5).

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Claims (14)

Einstufiges Verfahren zur Reinigung eines (Blut)plasmaproteins aus einer Mischung, die dieses (Blut)plasmaprotein enthält, umfassend das Aufbringen des (Blut)plasmaproteins auf ein Sorbenz umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzopyrrol-Resten und 3-Azapyrrol-Resten funktionalisiert ist und das Eluieren des (Blut)plasmaprotein von dem Sorbenz.A one-step process for purifying a (blood) plasma protein from a mixture containing this (blood) plasma protein, comprising applying the (blood) plasma protein to a sorbent comprising a solid support surface functionalized with benzopyrrole residues and 3-azapyrrole residues is and elutes the (blood) plasma protein from the sorbent. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Benzopyrrol-Reste in Form von 3-Indolpropionamid-Resten und die 3-Azapyrrolreste in Form von 4-Imidazolacrylamido-Resten vorliegen.A method according to claim 1, characterized in that the benzopyrrole residues in the form of 3-indolpropionamide residues and the 3-Azapyrrolreste in the form of 4-Imidazolacrylamido residues. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorbenz das zu reinigende (Blut)plasmaprotein im Wesentlichen nicht absorbiert.A method according to claim 1 or 2, characterized in that the sorbent substantially does not absorb the (blood) plasma protein to be purified. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das (Blut)plasmaprotein für das Aufbringen auf das Sorbenz in einem Puffer, vorzugsweise in Glycinpuffer mit einem pH im Bereich von 4 bis 6,5, gelöst wird.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the (blood) plasma protein for application to the sorbent in a buffer, preferably in glycine buffer having a pH in the range of 4 to 6.5, is dissolved. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das das Sorbenz so lange mit dem Puffer gespült wird, bis das zu reinigende (Blut)plasmaprotein im Wesentlichen vollständig von Sorbenz eluiert ist.Method according to one of the preceding claims, characterized in that the sorbent is rinsed with the buffer until the (blood) plasma protein to be purified is substantially completely eluted from sorbent. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das (Blut)plasmaprotein in einer Menge von mehr als 25 g/l Sorbenzvolumen, bevorzugt im Bereich von 120 bis 250 g/l Sorbenzvolumen, auf das Sorbenz aufgetragen wird.Method according to one of the preceding claims, characterized in that the (blood) plasma protein in an amount of more than 25 g / l Sorbenzvolumen, preferably in the range of 120 to 250 g / l Sorbenzvolumen, is applied to the sorbent. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das es sich bei dem (Blut)plasmaprotein um Immunoglobulin G, vorzugsweise um menschliches Immunoglobulin G, handelt.Method according to one of the preceding claims, characterized in that the (blood) plasma protein is immunoglobulin G, preferably human immunoglobulin G. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorbenz vor dem Aufbringen des (Blut)plasmaproteins auf das Sorbenz mit einer weiteren Flüssigkeit equilibriert wird.Method according to one of the preceding claims, characterized in that the sorbent is equilibrated with a further liquid before applying the (blood) plasma protein to the sorbent. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die zum Equilibrieren verwendete Flüssigkeit eine Lösung mit einem pH im Bereich von 4 bis 6,5 ist.A method according to claim 8, characterized in that the liquid used for equilibration is a solution having a pH in the range of 4 to 6.5. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung ein Acetat-Puffer mit einer Konzentration im Bereich von 0,5 bis 2 M, vorzugsweise 0,8 bis 1,2 M ist.A method according to claim 9, characterized in that the solution is an acetate buffer having a concentration in the range of 0.5 to 2 M, preferably 0.8 to 1.2 M. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorbenz durch Spülen mit einer Lösung, die einen pH von mindestens 9, vorzugsweise im Bereich von etwa 14, aufweist, regeneriert wird.Method according to one of the preceding claims, characterized in that the sorbent is regenerated by rinsing with a solution having a pH of at least 9, preferably in the range of about 14. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als festes Trägermaterial ein Material verwendet wird, das auf einem porösen Grundmaterial, vorzugsweise aus Polystyrol, beruht, welches mit einem Polymer, vorzugsweise einem Polyaminpolymer, in mindestens einer Lage überzogen, vernetzt und anschließend funktionalisiert wurde.Method according to one of the preceding claims, characterized in that a material based on a porous base material, preferably polystyrene, which is coated, crosslinked and subsequently functionalized with a polymer, preferably a polyamine polymer, in at least one layer is used as the solid support material has been. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Abtrennung von einem oder mehreren, ausgewählt aus IgA, IgM, Faktor XI und Faktor XIa.Use of a method according to any one of claims 1 to 11 for the separation of one or more selected from IgA, IgM, Factor XI and Factor XIa. Verwendung eines Sorbenz umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzopyrrol-Resten und 3-Azapyrrol-Resten funktionalisiert ist, zur Abtrennung von einem oder mehreren, ausgewählt aus IgA, IgM, Faktor XI und Faktor XIa aus (Blut)plasmaproteinen, bevorzugt aus Immunoglobulin G.Use of a sorbent comprising a solid support material whose surface is functionalized with benzopyrrole residues and 3-azapyrrole residues for the separation of one or more selected from IgA, IgM, Factor XI and Factor XIa from (blood) plasma proteins, preferably from immunoglobulin G.
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