DE102012022233A1 - A process for purifying a (blood) plasma proteins - Google Patents

A process for purifying a (blood) plasma proteins

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DE102012022233A1 DE201210022233 DE102012022233A DE102012022233A1 DE 102012022233 A1 DE102012022233 A1 DE 102012022233A1 DE 201210022233 DE201210022233 DE 201210022233 DE 102012022233 A DE102012022233 A DE 102012022233A DE 102012022233 A1 DE102012022233 A1 DE 102012022233A1
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein einstufiges Verfahren zur Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins aus einer Mischung, die dieses (Blut)Plasmaprotein enthält, umfassend das Aufbringen des (Blut)Plasmaproteins auf ein Sorbenz, umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzopyrrol-Resten und 3-Azepyrrolresten funktionalisiert ist, und das Eluieren des (Blut)Plasmaproteins von dem Sorbenz. The invention relates to a one-step method of purifying a (blood) plasma protein from a mixture containing this (blood) plasma protein, comprising applying the (blood) plasma protein on a Sorbenz comprising a solid support material whose surface with benzopyrrole residues and 3 -Azepyrrolresten is functionalized, and eluting the (blood) plasma protein from the Sorbenz. Das Verfahren eignet sich insbesondere zur Abtrennung von Blutbestandteilen, wie IgA, IgM sowie Faktor XI und Faktor XIa, die an das Sorbenz gebunden werden, während das zu reinigende (Blut)Plasmaprotein nicht oder nur geringfügig an das Sorbenz bindet. The method is particularly suitable for the separation of blood components, such as IgA, IgM, as well as factor XI and factor XIa, which are bound to the Sorbenz while the to be cleaned (blood) plasma protein is not or only slightly binds to the Sorbenz. Damit ist es möglich, das Produkt in einem einfachen Flow through-Schritt zu reinigen, wobei hohe Ausbeuten und Reinheiten bei hohen Beladungskapazitäten erzielt werden. This makes it possible to purify the product in a simple flow through by-step, with high yields and purities are achieved at high loading capacities.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein einstufiges Verfahren zur Reinigung eines (Blut)plasmaproteins aus einer Mischung, die dieses (Blut)plasmaprotein enthält, umfassend das Aufbringen des (Blut)plasmaproteins auf ein Sorbenz, umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzopyrolresten und 3-Azopyrolresten funktionalisiert ist, und das Eluieren des (Blut)plasmaproteins von dem Sorbenz. The present invention relates to a one-step method of purifying a (blood) plasma proteins from a mixture containing this (blood) plasma protein, comprising applying the (blood) plasma protein on a Sorbenz comprising a solid support material whose surface with Benzopyrolresten and 3- Azopyrolresten is functionalized, and eluting the (blood) from the plasma proteins Sorbenz. Das Verfahren kann zweckmäßig zur Abtrennung von Blutbestandteilen, wie insbesondere Faktor XI und/oder Blutfaktor XIa, verwendet werden. The process may be conveniently used for the separation of blood components, in particular factor XI and / or blood factor XIa. Die (Blut)plasmaproteine umfassen dabei insbesondere Immunoglobulin G. The (blood) plasma proteins include in particular immunoglobulin G.
  • Hintergrund der Erfindung Background of the Invention
  • Der Faktor XI (auch als Rosentalfaktor oder Plasma Thromboplasmin Antecedent bezeichnet) ist ein an der Blutgerinnung beteiligtes Enzym in Form einer Serinproteinase. Factor XI (also called Rosental factor or plasma thromboplastin antecedent) is an enzyme involved in blood clotting in the form of a serine proteinase. Dieses Enzym wird von der Leber produziert und liegt im Blutplasma in seiner inaktiven Form als Homodimer vor, in dem zwei Einheiten über eine Disulphitbrücke miteinander verbunden sind. This enzyme is produced by the liver and is present in plasma in its inactive form as a homodimer in which two units are connected to each other via a Disulphitbrücke. Das Monomer besitzt eine Molekülmasse von 800 kDa. The monomer has a molecular weight of 800 kDa. Der Faktor XI wird durch den aktivierten Hageman-Faktor (Faktor XIIa) oder durch Thrombin aktiviert und dann als Faktor XIa bezeichnet. The Factor XI is activated by Hageman factor (factor XIIa) or activated by thrombin and then described as factor XIa. Es gehört zum intrinsischen Pfad der Blutgerinnung, die in Aktion tritt, wenn der Hageman-Faktor und andere Bestandteile auf negativ geladenes Collagen unter dem Endothel der Gefäßwand trifft. It is part of the intrinsic pathway of blood coagulation, which comes into action when the Hageman factor and other ingredients encounters negatively charged collagen under the endothelium of the vessel wall. Der Faktor XIa aktiviert in der Gerinnungskaskade den Christmas-Faktor (Faktor IX) zu Faktor IXa. The factor XIa activates the coagulation cascade the Christmas factor (factor IX) to factor IXa.
  • Ein erhöhtes Faktor XI-Niveau im Blut wird heute mit der Verursachung von Thrombosen in Verbindung gebracht. An increased factor XI level in the blood is associated today with the causation of thrombosis. In der jüngeren Vergangenheit wurde daher bei Blutplasmaproteinpräparaten starker Wert darauf gelegt, dass die enthaltenen Präparate möglichst frei von Faktor XI oder Faktor XIa sind, damit sich bei Gabe entsprechender Blutpräparate an Patienten bei diesen das Thromboserisiko nicht erhöht. Therefore, in recent years a strong emphasis was placed on the case of blood plasma protein preparations that the preparations contained as possible of factor XI or factor XIa are so does not increase in patients with these risk of thrombosis on administration of appropriate blood products.
  • Die Abtrennung bzw. Aufreinigung von Faktor XI oder XIa wurde beispielsweise bereits in der The separation or purification of factor XI or XIa for example, was already in the US 5,252,217 US 5,252,217 beschrieben, wobei der Faktor säulenchromatographisch mit Hilfe von ”Sulphat-Sepharose-Gelen” isoliert wurde. described, in which the factor was isolated by column chromatography using "Sulphate-Sepharose gels". Problematisch an diesem Verfahren ist allerdings, dass diese Gele nur mit einer relativ geringen Beladung (dh, einem geringen Verhältnis von zu reinigender Substanz zu Chromatographie Material) betrieben werden können. The problem with this method is that these gels only at a relatively low loading (ie, a low ratio of cleanable substance chromatography material), however, can be operated. Damit sind diese Verfahren zur Abtrennung von Faktor XI und/oder XIa aus großen Mengen an (Blut)plasmaproteinen relativ zeitaufwändig und kostspielig. In order for this process for the separation of factor XI and / or XIa of large amounts of (blood) are plasma proteins relatively time-consuming and costly.
  • In der In the WO 2005/049070 WO 2005/049070 sind Verfahren zur Abtrennung von Faktor XI beschrieben, die auf Affinitätschromatographie beruhen. A process for separating Factor XI are described that are based on affinity chromatography. Dabei werden mit Faktor XI-Antikörpern modifizierte Säulenmaterialien oder mit Heparin, L-Arginin oder Benzamidin-modifizierte Materialien vorgeschlagen. In this modified column materials or with heparin, L-arginine or benzamidine-modified materials are proposed with factor XI antibodies. Weitere Verfahren zur Abtrennung von Faktor IX basieren auf Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlusschromatographie, elektrophoretischen Verfahren oder unterschiedlicher Löslichkeit der Faktoren in den Präparaten. Other methods for the separation of factor IX is based on ion exchange chromatography, size exclusion chromatography, electrophoretic methods or solubility of the factors in the preparations. Die The WO 2005/0949070 WO 2005/0949070 beschreibt zudem ein sequentielles Chromatographieverfahren, umfassend eine Kationaustauschchromatographie, eine hydrophobe Wechselwirkungschromatographie und eine abschließenden Behandlung mit Hydroxylapatit, wobei sehr reiner Faktor XI erhalten werden soll. also describes a sequential chromatographic methods, comprising a cation exchange chromatography, an hydrophobic interaction chromatography and a final treatment with hydroxyapatite, with very pure factor XI to be obtained.
  • In der In the EP 2 102 335 A2 EP 2102335 A2 ist schließlich für die Aufreinigung von Faktor XI ein hydrophobes Ladungsinduktionschromatographiematerial beschrieben, das ua einen Pyridinring aufweist. Finally for the purification of factor XI a hydrophobic Ladungsinduktionschromatographiematerial described comprising, inter alia, a pyridine ring. Dabei wird Faktor IX zunächst bei neutralem pH (wobei der Pyridinring ungeladen vorliegt) an das Chromatographiematerial gebunden. In this case, factor IX is first at neutral pH (where the pyridine ring is present uncharged) bound to the chromatography material. Nach Erhöhung des pHs auf etwa 4, was zur Protonierung des Pyridinrings führt, wird der Antikörper anschließend wieder freigesetzt. After raising the pH to about 4, resulting in the protonation of the pyridine ring, the antibody is then released again.
  • Die beschriebenen Verfahren zielen jedoch allesamt auf die Reinigung von Faktor XI ab, und beschäftigen sich nicht mit der Abtrennung des Faktors aus (Blut)plasmaproteingemischen, bei denen eine möglichst reine (Blut)plasmaproteinfraktion erhalten werden soll. However, the processes described aim all to the purification of factor XI from, and not deal with the separation of the factor from (blood) plasma protein mixtures in which a pure as possible (blood) plasma protein fraction to be obtained. Demzufolge ist unklar ob diese Verfahren mit Ausgangsprodukten durchgeführt werden können, bei denen der Faktor XI nur in gegenüber den übrigen Proteinen geringen Anteilen vorhanden ist. Consequently, it is unclear whether this process can be carried out with starting materials in which the Factor XI is only available in relation to the other proteins low levels.
  • Ein weiteres in (Blut)Plasmaproteinpräparaten unerwünschtes Nebenprodukt ist das Immunoglobulin A, welches Allergien in Patienten verursachen kann. Another undesirable in (blood) plasma protein preparations by-product is the immunoglobulin A, which may cause allergic reactions in patients.
  • Es besteht daher ein Bedarf für ein einfaches Verfahren zur Reinigung eines (Blut)plasmaproteins aus einer Mischung, die dieses (Blut)plasmaprotein enthält, wobei dieses Verfahren insbesondere zur schnellen und einfachen Abtrennung von Immunoglobulin A und M, sowie Faktor XI bzw. und/oder Faktor XIa aus dem (Blut)plasma-Proteingemisch geeignet sein sollte. There is therefore a need for a simple process for purifying a (blood) plasma proteins from a mixture containing this (blood) plasma protein, said method in particular for fast and easy separation of immunoglobulin A and M, as well as factor XI, respectively, and / or factor XI a plasma protein mixture should be suitable from the (blood). Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem. The present invention solves this problem.
  • Beschreibung description
  • Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft demzufolge ein einstufiges Verfahren zur Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins aus einer Mischung, die dieses (Blut)Plasmaprotein enthält, umfassend das Aufbringen des (Blut)Plasmaproteins auf ein Sorbenz, umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzolpyrolresten und 3-Azapyrrolresten funktionalisiert ist und das Eluieren des (Blut)Plasmaproteins von dem Sorbenz. Accordingly, a first aspect of the present invention relates to a one-step method of purifying a (blood) plasma protein from a mixture containing this (blood) plasma protein, comprising applying the (blood) plasma protein on a Sorbenz comprising a solid support material whose surface with Benzolpyrolresten and 3-Azapyrrolresten is functionalized and eluting the (blood) plasma protein from the Sorbenz.
  • Wenn im Vorstehenden von einem einstufigen Verfahren die Rede ist, bezieht sich die Bezeichnung ”einstufig” nur auf die Schritte zur Behandlung des (Blut)Plasmaproteins an sich, dh, das Verfahren kann dennoch weitere Schritte oder Stufen umfassen, die sich mit der Vor- oder Nachbehandlung des Sorbenzes befassen. When in the foregoing of a one-step method is mentioned, the term refers "single stage" only to the steps of treatment of the (blood) plasma protein per se, that is, the method may nevertheless include other steps or stages, with the pre- deal or post-treatment of Sorbenzes. Das einstufige Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst jedoch nicht mehr als einen Behandlungsschritt für das (Blut)Plasmaprotein. However, the one-step method according to the present invention no longer comprises, as a processing step for the (blood) plasma protein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Benzopyrrolresten des festen Trägermaterials um 3-Indolpropionamidreste. In a preferred embodiment, in the Benzopyrrolresten the solid support material by 3-Indolpropionamidreste. Alternativ oder zusätzlich dazu ist es bevorzugt, wenn die 3-Azapyrrolreste in Form 4-Imidazolacrylamidresten vorliegen. Alternatively or additionally, it is preferred if the 3-Azapyrrolreste be in the form 4-Imidazolacrylamidresten.
  • Im Rahmen des vorstehend beschriebenen Verfahrens ist es weiterhin bevorzugt, wenn das Sorbenz das zu reinigende (Blut)Plasmaprotein im Wesentlichen nicht bindet oder absorbiert. In the process described above, it is further preferred if the Sorbenz to be cleaned (blood) plasma protein does not bind substantially or absorbed. Das heißt, dass sich nach dem Auftragen oder Aufbringen des (Blut)Plasmaproteins auf das Sorbens das zu reinigende (Blut)plasmaprotein im Wesentlichen mit der Fließmittelfront durch das Sorbenz bewegt, und mit dieser von der Säule zurückgewonnen werden kann. That is, after applying or depositing the (blood) plasma protein on the sorbent to be cleaned (blood) plasma protein substantially with the solvent front moved through the Sorbenz, and can be recovered from the column with this. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es demzufolge bevorzugt, wenn das (Blut)Plasmaprotein nach Zugabe der fünffachen Menge, vorzugsweise der dreifachen Menge, und besonders bevorzugt der zweifachen Menge an Fließmittel, bezogen auf das Sorbenzvolumen, auf das Sorbenz im Wesentlichen vollständig, dh, zu mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90% und besonders bevorzugt mindestens 93% von dem Sorbenz zurückgewonnen werden kann. In the present invention, it is therefore preferred if the (blood) plasma protein after addition of the five-fold amount, preferably three times the amount, and more preferably completely twice the amount of flow agent, based on the Sorbenzvolumen to which Sorbenz substantially, ie, at least 80%, preferably can be recovered from the Sorbenz least 90% and particularly preferably at least 93%. Die Elutionsgeschwindigkeit kann jedoch von unterschiedlichen Faktoren abhängen, sodass das Sorbenz so lange mit dem Puffer gespült werden sollte, bis das zu reinigende (Blut)Plasmaprotein im Wesentlichen vollständig vom Sorbenz heruntergewaschen wurde. However, the elution rate may depend on various factors, so that the Sorbenz should be rinsed with the buffer until such time as the to be cleaned (blood) Plasma protein was substantially completely washed down from the Sorbenz.
  • In der vorstehenden Ausführungsform absorbiert das Sorbenz demzufolge im Wesentlichen die Verunreinigungen des Blutplasmaproteins. In the above embodiment, the Sorbenz absorbed accordingly substantially the impurities in the blood plasma protein. Bei den Verunreinigungen, die an das Sorbenz gebunden werden, handelt es sich vorzugsweise um IgA, IgM, sowie Faktor XI und Faktor XIa. The impurities that are bound to the Sorbenz, it is preferably IgA, IgM, and factor XI and factor XIa. Wie sich aus dem Vorstehenden ergibt, sind als (Blut)Plasmaproteine insbesondere solche (Blut)Plasmaproteine im Rahmen der Erfindung zu reinigen, die selbst nicht an das Sorbenz binden. As is apparent from the foregoing, as are (blood) plasma proteins, in particular those (blood) to purify plasma proteins within the scope of the invention which do not bind themselves to the Sorbenz. Bei dem (Blut)plasmaprotein handelt es sich vorzugsweise um ein Immunoglobulin, besonders bevorzugt um Immunoglobulin G, und am meisten bevorzugt um menschliches Immunoglobulin G. In the (blood) plasma protein is preferably an immunoglobulin, more preferably immunoglobulin G, and most preferably human immunoglobulin G.
  • Im Rahmen des Reinigungsverfahrens wird weiterhin vorzugsweise vorgereinigtes (Blut)plasmaprotein, besonders bevorzugt vorgereinigtes Immunoglobulin G, eingesetzt, in dem das (Blut)plasmaprotein bzw. das Immunoglobulin G vorzugsweise mindestens 80 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 85 Gew.-%, noch mehr bevorzugt mindestens 90 Gew.-%, und am meisten bevorzugt 92 bis 98 Gew.-% des (Blut)Plasmaproteingemisches, jeweils bezogen auf das Trockengewicht des Gemischs, ausmacht. In the context of the purification process is preferably further pre-purified (blood) plasma protein, more preferably pre-purified immunoglobulin G used in which the (blood) plasma protein and the immunoglobulin G preferably at least 80 wt .-%, more preferably at least 85 wt .-%, even more preferably at least 90 wt .-%, and most preferably 92 to 98 wt .-% of the (blood) plasma protein mixture, in each case based on the dry weight of the mixture, by weight. Eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugte (Blut)Plasmaproteinmischung ist eine vorgereinigte Immunoglobulin G-Lösung mit einem Immunoglobulin G Gehalt (bezogen auf das Trockengewicht der (Blut)Plasmaproteinmischung) von 92 bis 98 Gew.-%. A particularly preferred in the present invention (blood) plasma protein mixture is a pre-purified immunoglobulin G solution with an Immunoglobulin G content (based on the dry weight of the (blood) plasma protein mixture) 92-98 wt .-%.
  • Bei dem im Verfahren verwendeten Sorbenz handelt es sich um ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit mindestens zwei Rezeptormolekülen funktionalisiert ist. In the method used in Sorbenz is a solid support material whose surface is functionalized with at least two receptor molecules. Besonders bevorzugt besteht das Trägermaterial aus einem porösen Grundmaterial, das zur Einlagerung und Vernetzung einer Polyaminverbindung zunächst mit mindestens einer Lage dieser Aminverbindung überzogen wird und anschließend unter Anknüpfung von funktionalisierten Rezeptormolekülen unter Ausbildung kovalenter Bindungen zwischen den Rezeptormolekülen und dem Polyamin funktionalisiert wird. More preferably, the support material of a porous base material is first subjected to intercalation and crosslinking of a polyamine compound having at least one layer of this amine compound and is subsequently functionalized by attachment of functionalized receptor molecules to form covalent bonds between the receptor molecules and the polyamine. Bei dem porösen Grundmaterial handelt es sich zweckmäßig um ein poröses Polystrol. In the porous base material is suitably a porous polystyrene. Als Polyaminverbindung hat sich die Verwendung von Polyvinylamin als besonders zweckmäßig erwiesen. As polyamine compound, the use of polyvinyl has proven particularly useful. Das Trägermaterial wird durch Zugabe eines Vernetzungsmittels, beispielsweise einem Diepoxid, vernetzt. The carrier material is crosslinked by adding a crosslinking agent, such as a diepoxide. Die Herstellung des Trägermaterials kann durch Beschichtung des porösen Grundmaterials mit einer Schicht einer Polyaminverbindung erfolgen, es ist jedoch auch möglich, das Grundmaterial mit zwei oder mehreren Schichten zu überziehen. The preparation of the carrier material can be effected by coating the porous base material with a layer of a polyamine compound, but it is also possible to coat the base material having two or more layers. Vor dem Aufbringen der jeweils weiteren Schicht erfolgt zweckmäßig eine Vernetzung der aufgebrachten Polyaminverbindung, beispielsweise mit einem Vernetzungsmittel, wie vorstehend beschrieben. Before the application of each additional layer are expediently crosslinking the applied polyamine compound as described above, for example, with a crosslinking agent.
  • Die Herstellung von Trägermaterialien die mit Polyvinylamin überzogen sind, ist bereits im Stand der Technik, zum Beispiel in The preparation of support materials which are coated with polyvinyl amine, is already in the prior art, for example in EP 1 141 038 EP 1141038 und and EP 1 232 018 EP 1232018 beschrieben worden. been described.
  • Anschließend wird das so erhaltene mit Polyamin beschichtete Sorbenz mit zwei organischen Resten funktionalisiert. Subsequently, the thus obtained coated polyamine Sorbenz is functionalized with two organic radicals. Dabei hat sich insbesondere die Verwendung von Säure-funktionalisierten Rezeptormolekülen oder Derivaten davon, bei denen nach Umsetzung mit dem Polyvinylamin Amid-Verknüpfungen ausgebildet werden, als besonders zweckmäßig erwiesen. In this case, in particular the use of acid-functionalized receptor molecules or derivatives thereof may be formed in which, after reaction with the polyvinyl amide linkages, has proven particularly expedient.
  • Es ist möglich, die im Sorbenz vorhandenen Amingruppen vollständig mit organischen Resten zu funktionalisieren. It is possible to functionalize the present in Sorbenz amine groups entirely by organic radicals. In der Praxis der vorliegenden Erfindung ist es aber erwünscht, dass nur etwa 25 bis 98% der freien Amingruppen des Polyamins mit Rezeptormolekülen umgesetzt werden. but in the practice of the present invention, it is desired that only about 25 to 98% of the free amine groups of the polyamine are reacted with receptor molecules.
  • Für die Verknüpfung der Rezeptormoleküle mit dem festen Trägermaterial kommen alle bekannten Verfahren zur Verknüpfung von Aminen mit anderen funktionellen Gruppen in Betracht, insbesondere Verfahren zur Bildung von Amidverbindungen, Sulfonamidbindungen oder die Umsetzung der Amine mit Aldehyden unter reduktiven Bedingungen. For the linkage of the receptor molecules to the solid support material are all known methods for the linking of amines with other functional groups come into consideration, in particular processes for the formation of amide, sulfonamide, or the reaction of the amines with aldehydes under reductive conditions. Wird eine Säurefunktionalität zur Verknüpfung mit den Aminresten des Trägermaterials verwendet, wird nach der Umsetzung in der Regel eine Amidfunktionalität erhalten mit der das Rezeptormolekül an das Trägermaterial gebunden ist. Is an acid functionality for linking used with the amine groups of the carrier material, an amide functionality is obtained with which the receptor molecule is bound to the support material after the reaction generally. Zur Bildung solcher Amidverknüpfungen kommen alle im Stand der Technik beschriebenen Reaktionsarten in Betracht, die dem Fachmann geläufig sind. To form such amide linkages are all kinds of reactions described in the prior art into consideration, which are known to the expert.
  • Auch die Bindung von Rezeptormolekülen an Trägermaterialien wie sie vorstehend beschrieben sind, wurde bereits im Stand der Technik, insbesondere in Also the binding of receptor molecules to carrier materials as described above, has already been in the prior art, in particular in WO 2004/085046 WO 2004/085046 , beschrieben. Described.
  • Für das Verfahren hat es sich als zweckmäßig herausgestellt, wenn das (Blut)Plasmaprotein als Lösung in einem Puffer auf das Sorbenz aufgebracht wird. For the method it has proved to be expedient if the (blood) as a plasma protein solution is applied in a buffer on the Sorbenz. Für den Puffer kommen vorzugsweise Puffer mit einem pKa-Wert im Bereich von 4,0 bis 6,5 in Betracht. For the buffer preferably come buffer with a pKa in the range from 4.0 to 6.5 in consideration. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Puffer um einen Puffer, ausgewählt aus Kohlensäure/Silikatpuffern, Essigsäurepuffern, Citratpuffern, Phosphatpuffern, Glycinpuffern und/oder 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) Puffern. Preferably, the buffer is a buffer selected from carbonic acid / silicate buffers, acetic acid buffers, citrate buffers, phosphate buffers, glycine buffers and / or 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) buffers. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Puffer um einen Glycinpuffer. In a particularly preferred embodiment, the buffer is a glycine buffer.
  • Der verwendete Puffer weist zweckmäßig eine Konzentration im Bereich von 50 bis 500 mmol, bevorzugt im Bereich von 200 bis 400 mmol, und besonders bevorzugt im Bereich von 250 bis 350 mmol auf. The buffer used suitably has a concentration in the range of 50 to 500 mmol, preferably in the range of 200 to 400 mmol, and particularly preferably in the range of 250 to 350 mmol on.
  • Hinsichtlich der Beladungsmenge unterliegt die vorliegende Erfindung keinen relevanten Beschränkungen. With regard to the load size, the present invention is subject to any relevant restrictions. So kann das Sorbenz sowohl mit sehr geringen Mengen, wie beispielsweise 10 g/l Sorbenzvolumen, aber auch mit sehr hohen Beladungsmengen von bis zu 750 g/l Sorbenzvolumen, auf das Sorbenz aufgetragen werden. Thus, the Sorbenz can be used both with very small amounts such as 10 g / l Sorbenzvolumen, but also with very high loading levels of up to 750 g / l Sorbenzvolumen, be applied to the Sorbenz. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es jedoch bevorzugt, wenn das (Blut)Plasmaprotein in einer Menge von mehr als 100 g/l Sorbenzvolumen auf das Sorbenz aufgetragen wird. In the present invention, it is preferred if the (blood) plasma protein is applied in an amount of more than 100 g / l Sorbenzvolumen the Sorbenz. Besonders bevorzugt ist es, wenn das Blutplasmaprotein in einer Menge im Bereich von 120 bis 250 mg/ml Sorbenzvolumen auf das Sorbenz aufgetragen wird. It is particularly preferred if the blood plasma protein is applied in an amount in the range of 120 to 250 mg / ml Sorbenzvolumen the Sorbenz is. Diese Mengen stellen einen guten Kompromiss zwischen festgestellter Reinigungsleistung und Zeitaufwand für die Trennung der zu reinigenden (Blut)Plasmaproteine dar. These amounts represent a good compromise between detected cleaning performance and time required for the separation to be cleaned (blood) plasma proteins.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es weiterhin zweckmäßig, das Sorbenz vor dem Aufbringen des (Blut)Plasmaproteins zu equilibrieren. In the present invention, it is advantageous to equilibrate the Sorbenz prior to applying the (blood) plasma protein. Dazu wird zweckmäßig eine weitere Flüssigkeit verwendet. To another liquid is used appropriately. Diese Flüssigkeit sollte ebenfalls einen pH-Wert im Bereich von 4 bis 6,5 aufweisen, so dass der pH-Wert bereits vor dem Auftragen des (Blut)Plasmaproteins auf den pH-Wert eingestellt ist, den die (Blut)Plasmaprotein-Lösung aufweist. This liquid should also have a pH in the range of 4 to 6.5, so that the pH value is adjusted to the pH value before the application of the (blood) plasma protein that has the (blood) plasma protein solution , Weiterhin ist es bevorzugt, wenn die Flüssigkeit zum equilibrieren ein Puffer ist, der eine Konzentration im Bereich von 0,5 bis 2 Mol/l, vorzugsweise im Bereich von 0,8 bis 1,2 Mol/l, aufweist. Furthermore, it is preferred if the liquid to equilibrate is a buffer having a concentration ranging from 0.5 to 2 mol / l, preferably in the range of 0.8 to 1.2 mol / l.
  • Vor dem Equilibrieren kann das Sorbenz ebenfalls noch mit einer basische Lösung, vorzugsweise mit einem pH-Wert von mindesten 10, bevorzugt etwa 14, gewaschen werden, um eventuell noch vorhandene Verunreinigungen vom Sorbenz zu entfernen. Before the equilibrating the Sorbenz may also even with a basic solution, preferably with a pH value of at least 10, preferably about 14, are washed to remove any remaining impurities present from Sorbenz. Als Base können vorzugsweise Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid verwendet werden. As the base, preferably sodium hydroxide or potassium hydroxide can be used. Damit sich beim Equilibrieren möglichst schnell ein pH-Wert im Bereich von etwa 4 bis 6,5 einstellt, kann es zudem zweckmäßig sein, nach dem Waschen mit der basischen Lösung das Sorbenz mit einer schwach sauren Lösung zu behandeln, wobei zweckmäßig Essigsäure, vorzugsweise mit einer Konzentration im Bereich von 200 bis 1000 mMol/l, zum Einsatz kommt. Thus, as soon as possible, a pH value in the range of about 4 to 6.5 is adjusted in the equilibration, it also may be appropriate, after washing with the basic solution, the Sorbenz be treated with a weakly acidic solution, suitably acetic acid, preferably, with a concentration ranging from 200 to 1000 mmol / l, is used.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es weiterhin möglich, wenn nach dem Isolieren des zu reinigenden (Blut)Plasmaproteins das Sorbenz nachgeschalteten Waschschritten unterzogen wird. In the present invention, it is possible if the Sorbenz subsequent washing steps is subjected after isolating the to be cleaned (blood) plasma protein. Schließlich ist es möglich, das Sorbenz nach Abschluss des Waschens mit einer stark basischen Lösung zu regenerieren und von den auf dem Sorbenz verbleibenden (Blut)Plasmaproteinresten zu reinigen. Finally, it is possible to regenerate the Sorbenz after completion of washing with a strongly basic solution and purify plasma protein residues from remaining on the Sorbenz (blood). Dabei beträgt der pH-Wert der stark basischen Lösung vorteilhaft mindestens 10, besonders bevorzugt wird ein pH-Wert von etwa 14 verwendet. The pH value of the strongly basic solution advantageously is at least 10, more preferably a pH of about 14 is used. Als Base kann jede kommerziell erhältliche Base verwendet werden, aus Kostengründen empfiehlt es sich aber, Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid zu verwenden. As the base, any commercially available base may be used, but for cost reasons it is advisable to use sodium hydroxide or potassium hydroxide. Zusätzlich dazu kann das Sorbenz vor der Behandlung mit der basischen Lösung noch mit Essigsäure, vorzugsweise einer Konzentration von 200 mMol/l bis 600 mMol/l, gewaschen werden. Additionally, the Sorbenz prior to treatment with the basic solution or with acetic acid, preferably a concentration of 200 mmol / l to 600 mmol / l, to be washed.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines wie vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Abtrennung von einem oder mehreren, ausgewählt aus Immunoglobulin A, Immunoglobulin M, Faktor XI und Faktor XIa, aus (Blut)Plasmaproteinen, bevorzugt aus Immunoglobulin G. Darüber hinaus können mit Hilfe dieses Verfahrens auch Verunreinigungen, wie beispielsweise IgA und IgM, aus (Blut)plasmaproteinen entfernt werden, wobei es sich bei den (Blut)plasmaproteinen vorzugsweise um Immunoglobulin G, und insbesondere menschliches Immunoglobulin G handelt. Another aspect of the present invention relates to the use of a method as described above for the separation of one or more selected from immunoglobulin A, immunoglobulin M, factor XI and factor XIa, from (blood) plasma proteins, preferably selected from the immunoglobulin G. Moreover, with Using this method, impurities, such as IgA and IgM, from (blood) plasma proteins are removed, wherein the (blood) plasma proteins, preferably immunoglobulin G, and particularly human immunoglobulin G is.
  • Schließlich betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Sorbenzes, umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzopyrrolresten und 3-Azapyrrolresten funktionalisiert ist, und einen Aufbau aufweist, der wie vorstehend beschrieben ist, zur Abtrennung von einem oder mehreren, ausgewählt aus Immunoglobulin A, Immunoglobulin M, Faktor XI und Faktor XIa, aus (Blut)Plasmaproteinen, bevorzugt aus Immunoglobulin G, und besonders bevorzugt aus menschlichem Immunoglobulin G. Finally, a further aspect of the present invention relates to the use of a Sorbenzes comprising a solid support material whose surface is functionalized with Benzopyrrolresten and 3-Azapyrrolresten, and having a structure as described above, for the separation of one or more selected from immunoglobulin A, immunoglobulin M, factor XI and factor XIa, from (blood) plasma proteins, preferably from immunoglobulin G, and particularly preferably from human immunoglobulin G.
  • Das vorstehend beschriebene Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass (Blut)plasmaproteine, wie insbesondere IgG, durch einen einfachen Flow through-Schritt aufgereinigt werden können. The method described above is characterized in that (blood) plasma proteins, in particular IgG, through-step may be purified by a simple flow. Zudem erlaubt es das vorstehend beschriebene Verfahren, IgG-Produkte mit sehr hohen Verhältnissen von zu reinigendem Produkt/Sorbenzvolumen zu reinigen, wobei das Produkt dennoch in sehr hoher Ausbeute von > 95% zurückgewonnen werden kann. In addition, it allows the process described above, IgG products with very high ratios to be purified product / Sorbenzvolumen to clean, the product can be recovered still in very high yield of> 95%. Damit stellt das vorstehend beschriebene Verfahren ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Reinigung solcher Blutplasmaproteine dar. Thus, the method described above is a simple and inexpensive process for the purification of such blood plasma proteins.
  • Das beschriebene Verfahren ist ebenfalls dazu geeignet, um Reagenzien wie Triton X-100, Tri-N-butylphosphin oder Polysorbat (Handelsname ”TWEEN”), beispielsweise die in einem vorausgegangenen solvent-detergent Verfahren nicht vollständig abgetrennt wurden, aus dem Produkt zu entfernen. The method described is also adapted to reagents such as Triton X-100, tri-n-butylphosphine or Polysorbate (trade name "TWEEN"), for example which have not been completely severed in a previous solvent-detergent method, to remove from the product. Weiterhin können mit dem Verfahren Albuminreste und Transferinreste aus dem Produkt entfernt werden. Furthermore, can be removed with the method albumin residues and Transferinreste from the product. Es ist ebenfalls möglich, IgA und IgM getrennt von dem Sorbenz zu eluieren und diese somit in ebenfalls gereinigter Form zu erhalten. It is also possible to elute IgA and IgM separated from the Sorbenz and thus to obtain it in a purified form also. Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls die Verwendung eines Sorbenzes, umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzopyrolresten und 3-Azapyrrolresten funktionalisiert ist, und einen Aufbau aufweist, der wie vorstehend beschrieben ist, zur Abtrennung von Triton X-100, Tri-N-butylphosphin, Polysorbat (Handelsname ”TWEEN”), Albuminresten und Transferinresten aus einem (Blut)Plasmaprotein, wobei es sich bei dem (Blut)plasmaprotein vorzugsweise um Immunoglobulin G handelt. Accordingly, the present invention also relates to the use of a Sorbenzes comprising a solid support material whose surface is functionalized with Benzopyrolresten and 3-Azapyrrolresten, and having a structure as described above, for the separation of Triton X-100, tri-N- butylphosphine, polysorbate (trade name "TWEEN"), albumin and Transferinresten residues from a (blood) plasma protein, wherein the plasma protein in the (blood) preferably being immunoglobulin G.
  • Das folgende Beispiel soll zur Illustration der beschriebenen Erfindung dienen und deren Umfang nicht in irgendeiner Weise beschränken. The following example will serve to illustrate the invention described and do not limit its scope in any way.
  • Beispiel 1 example 1
  • Das Sorbenz wird zunächst mit einem Azetatpuffer (pH 4 bis 6) equilibriert und anschließend mit 250 mM Glycinpuffer eines pH-Werts von 5,5 behandelt. The Sorbenz is first equilibrated with acetate buffer (pH 4 to 6) and subsequently treated with 250 mM glycine buffer, pH 5.5. Als Ausgangsprodukt wird eine 5%-ige IgG-Lösung mit Verunreinigungen von IgA (1000 mg/l) und IgM (500 mg/l), Faktor XI (50 U/ml) und Faktor XIa (50 pM/l) verwendet. As starting material, a 5% IgG solution with impurities of IgA (1000 mg / L) and IgM (500 mg / l), factor XI (50 U / ml) and factor XIa used (50 pM / l). Die Feed-Lösung wird in einer Menge, entsprechend einer Beladung von ca. 250 g/l, auf das Sorbenz gegeben. The feed solution is added in an amount corresponding to a loading of about 250 g / l, on the Sorbenz. Das Sorbenz wird anschließend so lange mit 250 mM Glycinpuffer mit pH 5,5 gespült, bis das IgG vollständig vom Sorbenz heruntergewaschen ist. The Sorbenz is then rinsed as long with 250 mM glycine buffer pH 5.5 until the IgG is completely washed down from the Sorbenz. Das Produkt IgG wird in einer Ausbeute von > 99% erhalten, wobei das erhaltene Produkt Verunreinigungen an IgA von < 10 mg/l und an IgM von < 5 mg/l aufweist. The product IgG is obtained in a yield of> 99%, wherein the product obtained has impurities of IgA <10 mg / l IgM and <5 mg / l. Die Menge an Faktor XIa kann auf unter 2 pM reduziert werden, während Faktor XI im erhaltenen Produkt nicht mehr nachweisbar war (0 U/ml). The amount of Factor XIa can be reduced to less than 2 pM, while Factor XI in the product obtained was undetectable (0 U / ml). IgM und IgA kann mit einer Reinheit von >95% und einer Ausbeute > 95% mit einen sauren Puffer (300 mM Acetat Puffer mit pH 3.5) anschließend von der Säule isoliert werden. IgM and IgA can with a purity of> 95% and a yield of> 95% with an acidic buffer (mM acetate buffer, pH 3.5 300) are then isolated from the column.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDED IN THE DESCRIPTION
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Claims (14)

  1. Einstufiges Verfahren zur Reinigung eines (Blut)plasmaproteins aus einer Mischung, die dieses (Blut)plasmaprotein enthält, umfassend das Aufbringen des (Blut)plasmaproteins auf ein Sorbenz umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzopyrrol-Resten und 3-Azapyrrol-Resten funktionalisiert ist und das Eluieren des (Blut)plasmaprotein von dem Sorbenz. Single-stage process for purifying a (blood) plasma proteins from a mixture containing this (blood) plasma protein, comprising applying the (blood) plasma protein on a Sorbenz comprising a solid support functionalized its surface with benzopyrrole residues and 3-Azapyrrol residues and eluting the (blood) from the plasma protein Sorbenz.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Benzopyrrol-Reste in Form von 3-Indolpropionamid-Resten und die 3-Azapyrrolreste in Form von 4-Imidazolacrylamido-Resten vorliegen. A method according to claim 1, characterized in that the benzopyrrole residues in the form of 3-Indolpropionamid residues and the 3-Azapyrrolreste be in the form of 4-Imidazolacrylamido residues.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorbenz das zu reinigende (Blut)plasmaprotein im Wesentlichen nicht absorbiert. A method according to claim 1 or 2, characterized in that the Sorbenz to be cleaned (blood) plasma protein does not substantially absorbed.
  4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das (Blut)plasmaprotein für das Aufbringen auf das Sorbenz in einem Puffer, vorzugsweise in Glycinpuffer mit einem pH im Bereich von 4 bis 6,5, gelöst wird. A method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the (blood) plasma protein is for application to the Sorbenz in a buffer, preferably in glycine buffer achieved with a pH in the range of 4 to 6.5.
  5. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das das Sorbenz so lange mit dem Puffer gespült wird, bis das zu reinigende (Blut)plasmaprotein im Wesentlichen vollständig von Sorbenz eluiert ist. A method according to any one of the preceding claims, characterized in that the rinsing the Sorbenz as long with the buffer until the to be cleaned (blood) plasma protein is eluted substantially completely of Sorbenz.
  6. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das (Blut)plasmaprotein in einer Menge von mehr als 25 g/l Sorbenzvolumen, bevorzugt im Bereich von 120 bis 250 g/l Sorbenzvolumen, auf das Sorbenz aufgetragen wird. A method according to any one of the preceding claims, characterized in that the (blood) plasma protein is applied in an amount of more than 25 g / l Sorbenzvolumen, preferably in the range of 120 to 250 g / l Sorbenzvolumen to which Sorbenz.
  7. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das es sich bei dem (Blut)plasmaprotein um Immunoglobulin G, vorzugsweise um menschliches Immunoglobulin G, handelt. A method according to any of the preceding claims, characterized in that it is in the (blood) to plasma protein Immunoglobulin G, preferably by human immunoglobulin G, acts.
  8. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorbenz vor dem Aufbringen des (Blut)plasmaproteins auf das Sorbenz mit einer weiteren Flüssigkeit equilibriert wird. A method according to any one of the preceding claims, characterized in that the Sorbenz is equilibrated to the Sorbenz with another liquid before applying the (blood) plasma proteins.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die zum Equilibrieren verwendete Flüssigkeit eine Lösung mit einem pH im Bereich von 4 bis 6,5 ist. A method according to claim 8, characterized in that the liquid used for equilibration is a solution having a pH in the range of 4 to 6.5.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung ein Acetat-Puffer mit einer Konzentration im Bereich von 0,5 bis 2 M, vorzugsweise 0,8 bis 1,2 M ist. A method according to claim 9, characterized in that the solution is an acetate buffer at a concentration in the range of 0.5 to 2 M, preferably 0.8 to 1.2 M.
  11. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorbenz durch Spülen mit einer Lösung, die einen pH von mindestens 9, vorzugsweise im Bereich von etwa 14, aufweist, regeneriert wird. A method according to any one of the preceding claims, characterized in that the Sorbenz is regenerated by rinsing with a solution having a pH of at least 9, preferably in the range of about 14.
  12. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als festes Trägermaterial ein Material verwendet wird, das auf einem porösen Grundmaterial, vorzugsweise aus Polystyrol, beruht, welches mit einem Polymer, vorzugsweise einem Polyaminpolymer, in mindestens einer Lage überzogen, vernetzt und anschließend funktionalisiert wurde. A method according to any of the preceding claims, characterized in that a material is used as a solid carrier material, based on a porous base material, preferably polystyrene, which is preferably functionalized with a polymer, a polyamine polymer, coated, cross-linked and then in at least one layer has been.
  13. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Abtrennung von einem oder mehreren, ausgewählt aus IgA, IgM, Faktor XI und Faktor XIa. Use of a method according to any one of claims 1 to 11 for the separation of one or more selected from IgA, IgM, factor XI and factor XIa.
  14. Verwendung eines Sorbenz umfassend ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit Benzopyrrol-Resten und 3-Azapyrrol-Resten funktionalisiert ist, zur Abtrennung von einem oder mehreren, ausgewählt aus IgA, IgM, Faktor XI und Faktor XIa aus (Blut)plasmaproteinen, bevorzugt aus Immunoglobulin G. Using a Sorbenz comprising plasma proteins, a solid support material whose surface is functionalized with benzopyrrole residues and 3-Azapyrrol residues for the separation of one or more selected from IgA, IgM, factor XI and factor XIa from (blood), preferably from immunoglobulin G.
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