WO2012060120A1 - 脂肪滴に特異的局在性を示すタンパク質 - Google Patents

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WO2012060120A1
WO2012060120A1 PCT/JP2011/057818 JP2011057818W WO2012060120A1 WO 2012060120 A1 WO2012060120 A1 WO 2012060120A1 JP 2011057818 W JP2011057818 W JP 2011057818W WO 2012060120 A1 WO2012060120 A1 WO 2012060120A1
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寅彦 田中
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学校法人日本大学
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    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K2319/00Fusion polypeptide
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    • C07K2319/20Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011Details
    • C12N2770/24011Flaviviridae
    • C12N2770/24211Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a novel protein exhibiting specific localization in lipid droplets.
  • a lipid droplet is one of the organelles in the cell, and is a spherical structure that includes lipid inside and is covered with a phospholipid monolayer (see Non-Patent Document 1).
  • Internal lipids are mainly triglycerides and sterol esters, and contain small amounts of other neutral lipids. The size varies and ranges from 1 ⁇ m or less to about 100 ⁇ m. The most extreme example is a fat cell, and fat droplets occupying most of the cell body are occupied. In other cells, hepatocytes contain many lipid droplets, but any type of cell has the ability to form lipid droplets.
  • the fat droplets of fat cells function as a lipid storage and become an individual energy source. Depending on the energy environment, such as starvation and overnutrition, the amount of lipid droplets is regulated by hormones and increases or decreases.
  • lipid droplets of other cells function as cell energy sources and also interact with cell membranes and intracellular organelles (endoplasmic reticulum (ER), mitochondria, peroxosomes, endosomes, etc.). It also functions as a source of lipid to the bilayer. In order to fulfill these functions, the size and localization of lipid droplets change during cell activity and proliferation. It is also considered that lipid droplets are responsible for lipid supply when secretory lipoprotein (VLDL) is formed in hepatocytes and the like.
  • VLDL secretory lipoprotein
  • ADRP adipocyte differentiation-related protein
  • perilipin adipocyte differentiation-related protein
  • Tip47 adipocyte
  • lipases lipid synthases
  • lipid droplets in hepatocytes are enlarged.
  • Foamed macrophages that form the core of the pathological state due to atherosclerosis also show a foam-like morphology due to extremely enlarged fat droplets inside the macrophages.
  • lipid droplets are closely related to lipid-related diseases and metabolic syndrome, studies on their dynamics and control are important.
  • Sudan® III red pigment
  • Oil® Red® O red pigment
  • Nile® Red yellow fluorescent pigment
  • Bodipy493 / 503 green fluorescent pigment
  • Non-Patent Document 2 Nile Red and Bodipy 493/503 can be used in an aqueous solution, but Bodipy493 / 503 is relatively superior in lipid droplet specificity.
  • Bodipy493 / 503 and its derivatives with slightly different chemical structures have been developed, and there are also red fluorescent dyes that have affinity for lipid droplets (for example, Bodipy558 / 568C12, LD540, etc.). These pigments utilize affinity for neutral fats such as triglycerides and do not necessarily act specifically on lipid droplets in principle. It has been discovered that Bodipy493 / 503, which is currently most widely used, emits red fluorescence depending on conditions, and may cause problems in multicolor fluorescence observation (see Non-Patent Document 3).
  • ADRP a fusion of ADRP and fluorescent protein
  • EGFP-ADRP fluorescent protein
  • Non-Patent Document 10 In the method of visualizing lipid droplets using antibodies, anti-ADRP antibodies are widely used. In the case of antibody staining, the shape of lipid droplets and lipid droplet membranes often changes in the process of fixation and permeabilization, and cellular antigens are not necessarily uniformly present in all lipid droplet membranes. It is difficult to completely and uniformly dye all lipid droplet films (see Non-Patent Document 10).
  • An object of the present invention is to provide a technique for visualizing (imaging) intracellular lipid droplets that can solve the above-described problems in the prior art. Specifically, an object of the present invention is to provide a technique for specifically visualizing only lipid droplets in a cell as an accurate image. At the same time, an object of the present invention is to provide a technique for specifically visualizing only the fat droplets without changing the original cell state and the original fat droplet state in the cell.
  • Patent Document 1 discloses a polypeptide consisting of amino acids 50 to 74 on the N-terminal side of non-structural protein 4B (NS4B) of hepatitis C virus, and amino acids 40 to 63 on the N-terminal side of NS4B. The polypeptide is described. However, the technique described in Patent Document 1 is not related to a technique for visualizing fat droplets.
  • Non-Patent Document 11 describes that when the C-terminal region of NS4B was expressed in Huh7 cells, a punctate structure was observed, and that the C-terminal region of NS4B would be related to the membrane. Has been suggested. However, Non-Patent Document 11 describes that the C-terminal region of NS4B was not localized in lipid droplets. Therefore, the technique described in Non-Patent Document 11 is not related to a technique for visualizing fat droplets.
  • Non-Patent Document 12 describes that when a protein (NS4B-EGFP) in which EGFP was fused to the C-terminal side of NS4B was expressed in cells, NS4B-EGFP was observed to be localized in the ER. Yes. Non-Patent Document 12 does not describe knowledge relating to a technique for visualizing fat droplets.
  • Non-Patent Document 13 describes that NS4B exhibited a spot-like pattern across the cytoplasm. Non-Patent Document 13 does not describe knowledge relating to the technique for visualizing fat droplets.
  • N-terminal region and the C-terminal region of non-structural protein 4B (NS4B) of hepatitis C virus (HCV) was found to be localized specifically in lipid droplets.
  • HCV hepatitis C virus
  • the present invention relates to the following.
  • [1] The amino acid sequence from the 50th to the 73rd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence represented by X 1 n that binds to the N-terminus thereof (with 0 ⁇ n ⁇ 49 And when n is 2 or more, X 1 may be the same or different from each other) at the C-terminus of the polypeptide (a), The amino acid sequence from No. 218 to No.
  • X 2 may be the same or different from each other), and is a protein formed by binding the N-terminus of the polypeptide (b), which shows specific localization to lipid droplets;
  • the protein defined in (A) lacks one or several amino acids in the region of the amino acid sequence from the 50th to 73rd amino acids and / or the amino acid sequence from the 218th to 261st amino acids.
  • X 2 may be the same or different from each other), and is a protein formed by binding the N-terminus of the polypeptide (b), which shows specific localization to lipid droplets;
  • B In the protein defined in (A), one or several amino acids are missing in the region of the amino acid sequence from the 50th to 73rd amino acids and / or the amino acid sequence from the 229th to 261st amino acids.
  • Any amino acid sequence represented by X 1 n is selected from amino acid sequences Nos. 1 to 49 of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23 Whether the amino acid sequence of the number n (1 ⁇ n ⁇ 49) (provided that the second and eighth amino acids “Xaa” in SEQ ID NO: 21 and the sixth amino acid “Xaa” in SEQ ID NO: 23 are: Or any number n selected from the amino acid sequences from No. 1 to No. 48 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, wherein the amino acid sequence represented by X 1 n is The protein according to [1] or [2], which is an amino acid sequence of (1 ⁇ n ⁇ 48).
  • the amino acid sequence represented by X 2 m is any amino acid sequence selected from the amino acid sequences from 192 to 217 of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23 Arbitrary number selected from amino acid sequence of number 192 to number 228 of amino acid sequence of number m (1 ⁇ m ⁇ 26) or amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23 m (1 ⁇ m ⁇ 37); or the amino acid sequence represented by X 2 m is derived from the amino acid sequence of No. 191 to No. 216 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • Arbitrary number m (1 ⁇ m ⁇ 26) of amino acid sequences selected or Arbitrary number m (1 ⁇ m) selected from amino acid sequences No. 191 to No. 227 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 m ⁇ 3 ) Is the amino acid sequence of the protein according to any one of [1] to [3].
  • the amino acid sequence represented by X 1 n is the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23, Nos. 1 to 49, Nos. 26 to 49, Whether it is the amino acid sequence from No. 40 to No. 49, or No. 43 to No. 49 (provided that the second and eighth amino acids “Xaa” in SEQ ID NO: 21 and the sixth amino acid in SEQ ID NO: 23)
  • the amino acid “Xaa” is any amino acid.
  • Or the amino acid sequence represented by X 1 n is from No. 1 to No. 48 and No. 26 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • the amino acid sequence represented by X 2 m is the amino acid sequence from No. 192 to No. 217 of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID Nos. 2 to 10 and 12 to 23, or SEQ ID Nos. 2 to 10 and The amino acid sequence of No. 192 to No. 228 of the amino acid sequence represented by any of 12 to 23; or the amino acid sequence of X 2 m is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11
  • the amino acid sequence represented by X 1 n is the amino acid sequence of No. 1 to No. 49 or No. 26 to No. 49 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and X 2 m
  • the amino acid sequence represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence from the 192th to the 217th amino acid sequence, or the amino acid sequence represented by the SEQ ID NO: 2 is the 192th to 228th amino acid sequence.
  • the protein according to any one of [1] to [6].
  • the protein comprises an amino acid sequence having at least 70% sequence homology with the amino acid sequence of the protein defined in (A), and exhibits specific localization in lipid droplets.
  • the protein according to [11], wherein the substance to be introduced is a fluorescent compound.
  • [13] A nucleic acid encoding the protein according to any one of [1] to [10].
  • [14] An expression vector comprising the nucleic acid according to [13].
  • [15] A transformant transformed with the expression vector according to [14].
  • [16] The expression vector according to [13] for use in visualization of lipid droplets in mammalian cells.
  • the protein according to any one of [1] to [12] for use in visualization of lipid droplets in mammalian cells.
  • the protein of the present invention shows specific localization to lipid droplets, which are intracellular organelles.
  • lipid droplets can be specifically visualized (imaging) in living cells or fixed cells.
  • only lipid droplets in cells can be specifically visualized as an accurate image.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence encoding the NS4B protein of the type 1b HCV-O strain used in the examples.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of NS4B protein of the HCV-O strain of type 1b.
  • FIG. 3 shows the results of comparison (alignment analysis) of the amino acid sequence of NS4B protein among various HCV subtypes.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the structure (three regions) of the NS4B protein.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of the protein of the present invention (4BNC showing specific localization to lipid droplets) produced in the examples.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence encoding the NS4B protein of the type 1b HCV-O strain used in the examples.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of NS4B protein of the HCV-O strain of type 1b.
  • FIG. 3 shows the results of comparison (alignment analysis) of the amino acid sequence of NS4B protein among various HCV
  • 4BNC is a protein created by linking two lipid droplet localization sequences (4BN and 4BC), and the protein was found to be localized in the lipid droplet membrane with extremely high specificity. did.
  • Cherry-4BNC indicates the structure of a protein obtained by fusing the 4BNC with the fluorescent protein mCherry.
  • EGFP-4BNC shows the structure of the protein obtained by fusing the 4BNC with the fluorescent protein EGFP.
  • FIG. 6 shows the result of analyzing the interaction between Cherry-4BN produced in the example and lipid droplets.
  • FIG. 7 shows the result of analyzing the interaction between Cherry-4BC produced in Example and lipid droplets.
  • FIG. 8 shows the results of analyzing the interaction between Cherry-4TM produced in the Examples and fat droplets.
  • FIG. 9 shows the results of analysis of the interaction between Cherry-4BNC (an example of the protein of the present invention) produced in the Examples and lipid droplets (imaging of lipid droplets).
  • FIG. 10 shows the results of analysis of the interaction between EGFP-4BNC (an example of the protein of the present invention) produced in Example and lipid droplets (imaging of lipid droplets).
  • FIG. 11 shows the results of visualization (imaging) of lipid droplets in human HEK293 cells (human-derived cultured cells) with few lipid droplets using the above Cherry-4BNC (an example of the protein of the present invention).
  • fatty acids stearic acid, 50 ⁇ M
  • FIG. 12 is a diagram showing structures of various NS4B fusion proteins (constructs) produced in Examples.
  • FIG. 13 shows the results of analyzing the interaction between Cherry-4Bfull (NS4B full length) produced in the Examples and fat droplets.
  • FIG. 14 shows the results of analyzing the interaction between various NS4B fusion proteins and lipid droplets.
  • FIG. 12 is a diagram showing structures of various NS4B fusion proteins (constructs) produced in Examples.
  • FIG. 13 shows the results of analyzing the interaction between Cherry-4Bfull (NS4B full length) produced in the Examples and fat droplets.
  • FIG. 14 shows the results of analyzing the interaction between various NS4B fusion proteins and lipid drop
  • FIG. 15 is a diagram showing the position of amphipathic ⁇ -helix existing in NS4B.
  • FIG. 16 is a view showing amino acid arrangements as viewed from the long axis direction of NS4B amphipathic ⁇ -helix.
  • FIG. 17 is a diagram illustrating various mutants of NS4B produced in Examples.
  • FIG. 18 is a diagram for explaining various mutants of NS4B produced in Examples.
  • FIG. 19 shows the result of comparing amino acids important for interaction with lipid droplets in NS4B among various HCV subtypes.
  • the first aspect of the present invention is: “(A) the amino acid sequence of amino acid sequence Nos. 50 to 73 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence represented by X 1 n binding to the N-terminus thereof (0 ⁇ n ⁇ 49, when n is 2 or more, X 1 may be the same or different from each other) at the C-terminus of the polypeptide (a), The amino acid sequence from No. 218 to No.
  • X 2 may be the same or different from each other), and is a protein formed by binding the N-terminus of the polypeptide (b), which shows specific localization to lipid droplets;
  • B In the protein defined in (A), one or several amino acids are missing in the region of the amino acid sequence from the 50th to 73rd amino acids and / or the amino acid sequence from the 218th to 261st amino acids.
  • the present invention relates to a protein consisting of an amino acid sequence having sequence homology and showing specific localization to lipid droplets.
  • a protein has “specific localization in lipid droplets” means that an Oc cell is transformed with an expression vector for a mammalian cell including a region encoding a fusion protein of a fluorescent protein, mCherry, and a target protein.
  • an Oc cell is transformed with an expression vector for a mammalian cell including a region encoding a fusion protein of a fluorescent protein, mCherry, and a target protein.
  • the number of cells in which the fusion protein is localized only in the lipid droplet membrane is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, particularly preferably 70% or more, most preferably 80% or more, 90% or more, 95%. That's it.
  • the protein defined in (A) has the following structure.
  • X 1 n -WAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGN-X 2 m -VSPTHYVPESDAAARVTQILSSLTITQLLKRLHQWINEDCSTPC In the above structure, X 1 n -WAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGN corresponds to the polypeptide (a).
  • X 2 m -VSPTHYVPESDAAARVTQILSSLTITQLLKRLHQWINEDCSTPC corresponds to the polypeptide (b).
  • n 5
  • the X 1 5, as a "AASSW" may contain identical or different amino acids from each other.
  • X 2 5 may contain the same or different amino acids as each other like “AASSW”.
  • the protein defined in (A) is a protein formed by binding the N-terminus of the polypeptide (b) to the C-terminus of the polypeptide (a).
  • Polypeptide (a) has the amino acid sequence from the 50th to the 73rd amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in its C-terminal region. This is because the region of the amino acid sequence from No. 50 to No. 73 includes a region in which the protein of the present invention functions to exhibit specific localization to lipid droplets.
  • polypeptide (b) has the amino acid sequence from No. 218 to No. 261 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in its C-terminal region. This is because the above amino acid sequences from No. 218 to No. 261 also include a region in which the protein of the present invention functions to exhibit specific localization to lipid droplets.
  • the N-terminal region of the polypeptide (a) is composed of an amino acid sequence represented by X 1 n , and the number (n) of the amino acid residues is in the range of 0 to 49 as described above, preferably 7 to It is in the range of 49, more preferably in the range of 10 to 49, still more preferably in the range of 24 to 49.
  • the type of amino acid constituting the amino acid sequence X 1 n is not particularly limited.
  • the amino acid sequence X 1 n is an arbitrary number n (1 ⁇ 1) selected from amino acid sequences Nos.
  • amino acid sequence X 1 n is an arbitrary number n (1 ⁇ n ⁇ 48) of amino acid sequences selected from the amino acid sequences of Nos. 1 to 48 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11. May be.
  • the amino acid sequence X 1 n is represented by amino acids 43 to 49 of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23.
  • the amino acid sequence is up to the 49th amino acid sequence (provided that the second and eighth amino acids “Xaa” in SEQ ID NO: 21 and the sixth amino acid in SEQ ID NO: 23).
  • the noic acid “Xaa” can take any amino acid as long as the protein of the present invention exhibits specific localization to lipid droplets).
  • the amino acid sequence X 1 n is the amino acid sequence from the 43rd to the 48th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or the 40th to the 48th amino acid sequence represented by the SEQ ID NO: 11
  • the amino acid sequence of No. 26 to No. 48 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, or No. 1 to No. 48 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 The amino acid sequence is preferably This is because when the amino acid sequence X 1 n is such an amino acid sequence, the specific localization of the protein of the present invention with respect to lipid droplets is enhanced.
  • the N-terminal region of polypeptide (b) is composed of amino acid sequence X 2 m , and the number (m) of amino acid residues is 0 to 26 as described above.
  • Types of amino acids constituting the amino acid sequence X 2 m is not particularly limited.
  • the amino acid sequence X 2 m is an arbitrary number m selected from amino acid sequences 192 to 217 of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23 (1 ⁇ The amino acid sequence may be m ⁇ 26).
  • amino acid sequence X 2 m is an arbitrary number m (1 ⁇ m ⁇ 26) of amino acid sequences selected from the amino acid sequences from the 191st to the 216th amino acid sequence represented by the SEQ ID NO: 11. May be.
  • the amino acid sequence X 2 m is represented by amino acids Nos. 192 to 217 of any one of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23.
  • the amino acid sequence up to the number is preferred.
  • the amino acid sequence X 2 m is preferably an amino acid sequence from No. 191 to No. 216 of the amino acid sequence represented by SEQ ID No. 11. This is because when the amino acid sequence X 2 m is such an amino acid sequence, the specific localization of the protein of the present invention with respect to lipid droplets is enhanced.
  • the second aspect of the present invention is “(A) the amino acid sequence of amino acid sequence Nos. 50 to 73 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence represented by X 1 n binding to the N-terminus thereof (0 ⁇ n ⁇ 49, when n is 2 or more, X 1 may be the same or different from each other) at the C-terminus of the polypeptide (a), The amino acid sequence from No. 229 to No.
  • X 2 may be the same or different from each other), and is a protein formed by binding the N-terminus of the polypeptide (b), which shows specific localization to lipid droplets;
  • B In the protein defined in (A), one or several amino acids are missing in the region of the amino acid sequence from the 50th to 73rd amino acids and / or the amino acid sequence from the 229th to 261st amino acids.
  • the present invention relates to a protein consisting of an amino acid sequence having sequence homology and showing specific localization to lipid droplets.
  • the protein defined in (A) has the following structure.
  • X 1 n -WAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGN corresponds to the polypeptide (a).
  • X 2 m -AAARVTQILSSLTITQLLKRLHQWINEDCSTPC corresponds to the polypeptide (b).
  • n 5
  • the X 1 5, as a "AASSW” may contain identical or different amino acids from each other.
  • X 2 5 may contain the same or different amino acids as each other like “AASSW”.
  • the protein defined in (A) is a protein formed by binding the N-terminus of the polypeptide (b) to the C-terminus of the polypeptide (a).
  • Polypeptide (a) has the amino acid sequence from the 50th to the 73rd amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in its C-terminal region. This is because the region of the amino acid sequence from No. 50 to No. 73 includes a region in which the protein of the present invention functions to exhibit specific localization to lipid droplets.
  • polypeptide (b) has the amino acid sequence from No. 229 to No. 261 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in its C-terminal region. This is because the amino acid sequences from No. 229 to No. 261 also include a region in which the protein of the present invention functions to exhibit specific localization to lipid droplets.
  • the N-terminal region of the polypeptide (a) is composed of an amino acid sequence represented by X 1 n , and the number (n) of the amino acid residues is in the range of 0 to 49 as described above, preferably 7 to It is in the range of 49, more preferably in the range of 10 to 49, still more preferably in the range of 24 to 49.
  • the type of amino acid constituting the amino acid sequence X 1 n is not particularly limited.
  • the amino acid sequence X 1 n is an arbitrary number n (1 ⁇ 1) selected from amino acid sequences Nos.
  • amino acid sequence X 1 n is an arbitrary number n (1 ⁇ n ⁇ 48) of amino acid sequences selected from the amino acid sequences of Nos. 1 to 48 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11. May be.
  • the amino acid sequence X 1 n is represented by amino acids 43 to 49 of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23.
  • the amino acid sequence is up to the 49th amino acid sequence (provided that the second and eighth amino acids “Xaa” in SEQ ID NO: 21 and the sixth amino acid in SEQ ID NO: 23).
  • the noic acid “Xaa” can take any amino acid as long as the protein of the present invention exhibits specific localization to lipid droplets).
  • the amino acid sequence X 1 n is the amino acid sequence from the 43rd to the 48th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or the 40th to the 48th amino acid sequence represented by the SEQ ID NO: 11
  • the amino acid sequence of No. 26 to No. 48 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, or No. 1 to No. 48 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 The amino acid sequence is preferably This is because when the amino acid sequence X 1 n is such an amino acid sequence, the protein of the present invention is localized more specifically in the lipid droplet.
  • the N-terminal region of polypeptide (b) is composed of amino acid sequence X 2 m , and the number (m) of amino acid residues is 0 to 37 as described above.
  • Types of amino acids constituting the amino acid sequence X 2 m is not particularly limited.
  • the amino acid sequence X 2 m is an arbitrary number m selected from amino acid sequences 192 to 228 of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23 (1 ⁇ The amino acid sequence may be m ⁇ 37).
  • the amino acid sequence X 2 m is an amino acid sequence of an arbitrary number m (1 ⁇ m ⁇ 26) selected from the amino acid sequences of Nos. 191 to 227 of the amino acid sequence represented by SEQ ID No. 11. May be.
  • the amino acid sequence X 2 m is represented by amino acid sequence Nos. 192 to 228 of any one of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23.
  • the amino acid sequence up to the number is preferred.
  • the amino acid sequence X 2 m is preferably an amino acid sequence from No. 191 to No. 227 of the amino acid sequence represented by SEQ ID No. 11. This is because when the amino acid sequence X 2 m is such an amino acid sequence, the protein of the present invention is localized more specifically in the lipid droplet.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a non-structural protein 4B of HCV-O strain (genome base sequence GenBank Accession number: AB19133, polyprotein amino acid sequence Accession number: BAD91386) whose genotype is type 1b.
  • NS4B amino acid sequence.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate H) (accession number of polyprotein amino acid sequence: P27958) whose genotype is type 1a.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is the NS4B amino acid sequence of the HCV (isolate HC-G9) genotype 1c (genome base sequence Accession53number: ⁇ ⁇ D14853, polyprotein amino acid sequence Accession number: BAA03581). is there.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 is the NS4B amino acid sequence of HCV (Accession number: AY746460 of the base sequence of the polyprotein cds region and Accession number: AAU89634 of the polyprotein amino acid sequence) of genotype 2a.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is the NS4B amino acid sequence of HCV (strain MD2b-1) genotype 2b (genome base sequence Accession number: ⁇ ⁇ AF238486, polyprotein amino acid sequence Accession ⁇ ⁇ number: AAF59945). is there.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate BEBE1) (genome base sequence Accession ⁇ ⁇ ⁇ number: D50409, polyprotein amino acid sequence Accession number: Q68749) whose genotype is 2c type.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate VAT96) genotype 2k (genome base sequence Accession03number: AB031663, polyprotein amino acid sequence Accession number: BAA88057).
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 is the NS4B amino acid of HCV (isolate HCV-K3a / 650) genotype 3a (genome base sequence Accession number: D28917, polyprotein amino acid sequence Accession ⁇ ⁇ number: Q81495) Is an array.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate Tr Kj) (genome base sequence Accession number: D49374, polyprotein amino acid sequence Accession number: BAA08372) whose genotype is 3b. .
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 is NS4B of HCV (isolate 02-42) genotype 4a (polyprotein cds region base sequence Accession number: DQ418783, polyprotein amino acid sequence Accession number: ABD75825) Is the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 is the NS4B amino acid sequence of HCV (Accession number of polyprotein amino acid sequence: ABD75828) whose genotype is 4d type.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 is the NS4B amino acid of HCV (isolate EUH1480) genotype 5a (polyprotein coding region base sequence Accession number: Y13184, polyprotein amino acid sequence Accession number: CAA73640) Is an array.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 is the NS4B amino acid of HCV (isolate EUHK2) genotype 6a (polyprotein coding region base sequence Accession number: ⁇ ⁇ Y12083, polyprotein amino acid sequence Accession number: ⁇ ⁇ CAA72801) Is an array.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate Th580) (genome base sequence Accession (number: D84262, polyprotein amino acid sequence Accession number: BAA32664) whose genotype is 6b.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate C-0044) genotype 6f (genome base sequence Accession number: ⁇ ⁇ DQ835760, polyprotein amino acid sequence Accession ⁇ ⁇ number: ABI36963). is there.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate JK046) (genome base sequence Accession number: D63822, polyprotein amino acid sequence Accession number: BAA09891) whose genotype is 6g.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate VN004) (Accession number of genome base sequence: D84265, Accession number of polyprotein amino acid sequence: BAA32667) whose genotype is 6h.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate C-0159) genotype 6i (genome base sequence Accession number: DQ835762, polyprotein amino acid sequence Accession number: ABI36965). is there.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate VN405) (genome base sequence Accession number: D84264, polyprotein amino acid sequence Accession number: BAA32666) whose genotype is 6k.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate 537796) (Accession number of genomic base sequence: EF424628, Accession ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ number of polyprotein amino acid sequence: ⁇ ⁇ ABP88847) whose genotype is 61.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate C-0208) (genome base sequence Accession number: DQ835763, polyprotein amino acid sequence Accession number: ABI36966) whose genotype is 6m. is there.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate QC227) (genome base sequence Accession number: EF424627, polyprotein amino acid sequence Accession number: ABP88846) whose genotype is 6o.
  • FIG. 3 shows the results of alignment analysis performed on the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 23.
  • the sequence shown in FIG. 3 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 3, 2, 4 to 23 in order from the top.
  • the amino acid sequence of NS4B shown in SEQ ID NOs: 2 to 23 is derived from a specific HCV of the above genotype (subtype), but there are many HCVs of genotypes (subtypes) other than the above.
  • amino acid sequence of the protein of the present invention may be designed based on SEQ ID NOs: 2 to 23, but may be designed based on other known amino acid sequences of NS4B.
  • the protein defined in (B) is the protein defined in (A) and is present in the region of the amino acid sequence from the 50th to 73rd amino acids in SEQ ID NO: 2 (polypeptide (a) And / or one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the region of the amino acid sequence from No. 218 to No. 261 (region existing in the polypeptide (b)). It is a protein that has a specific amino acid sequence and shows specific localization to lipid droplets.
  • the range of “one or several” is not particularly limited as long as the protein of the present invention exhibits specific localization to lipid droplets.
  • region of the amino acid sequence from the 50th to the 73rd region existing in the polypeptide (a)
  • 1 to 20, preferably 1 to 9, more preferably 1 to 5 Particularly preferably, it can be 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or 1.
  • region of the amino acid sequence from No. 218 to No. 261 region existing in the polypeptide (b)
  • 1 to 40 preferably 1 to 30, more preferably 1 to The number may be 20, preferably 1 to 9, particularly preferably 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, and 1.
  • amino acid sequence from the 50th to the 73rd amino acid sequence and / or the amino acid sequence from the 218th to 261st amino acid sequence have such amino acids.
  • preferred sequences of the amino acid sequences X 1 n and X 2 m are as described for the protein (A) above.
  • the protein defined in (B) is, for example, the 51st alanine in the region of the amino acid sequence from the 50th to the 70th in SEQ ID NO: 2.
  • (A) is replaced with histidine (H), glutamine (Q), arginine (R), tyrosine (Y) or threonine (T); the 52nd lysine (K) is replaced with glutamine (Q); 53rd histidine (H) is replaced with glutamine (Q); 54th methionine (M) is replaced with leucine (L); 58th isoleucine (I) is replaced with valine (V); And / or 73rd asparagine (N) is substituted with serine (S).
  • the protein defined in (B) is, for example, in the region of the amino acid sequence from the 218th to 261st amino acids in SEQ ID NO: 2 in the 218th valine.
  • V is replaced with glycine (G); 219th serine (S) is replaced with alanine (A); 221th threonine (T) is replaced with alanine (A); 225th Proline (P) is replaced with threonine (T) or alanine (A); 227th serine (S) is replaced with threonine (T); 229th alanine is replaced with threonine (T); 230th alanine (A) is replaced by serine (S); 231st alanine (A) is valine (V), glutamine (Q), lysine (K), asparagine (N Or arginine (R) is substituted; 232nd arginine (R) is substituted with
  • the protein defined in (C) comprises an amino acid sequence having at least 60% sequence homology with the amino acid sequence of the protein defined in (A) above, and is specific for lipid droplets. It is a protein showing localization.
  • the protein defined in (C) is a protein exhibiting specific localization in lipid droplets, and is preferably 70% or more, more preferably with respect to the amino acid sequence of the protein defined in (A) above. 80% or higher, more preferably 90% or higher, 91% or higher, 92% or higher, 93% or higher, 94% or higher, 95% or higher, 96% or higher, 97% or higher, 98% or higher, 99% or higher.
  • sequence homology refers to the degree of identity of two or more amino acid sequences to each other. Therefore, the higher the homology between two amino acid sequences, the higher the identity or similarity between those sequences. Whether or not two kinds of amino acid sequences have homology can be analyzed by direct comparison of the sequences. Specifically, it can be analyzed using commercially available sequence analysis software or the like.
  • the protein of the present invention includes a fusion protein of the protein (A), (B) or (C) with a labeled protein and / or an affinity tag.
  • the labeled protein and / or the affinity tag can be located on the N-terminal side and / or C-terminal side of the protein (A), (B) or (C).
  • the fusion protein of the present invention may also contain a plurality of types of labeled proteins and / or affinity tags as long as the protein has a specific localization in lipid droplets.
  • the protein (A), (B) or (C) may be directly linked to the labeled protein and / or the affinity tag, or may be linked via various linkers. .
  • Examples of the labeled protein include fluorescent proteins, and specific examples thereof include GFP, EBFP, EGFP, EYFP, ECFP, RFP, mWasabi, AmCyan, ZsGreen, ZsYellow, DsRed, AsRed, HcRed, JRed, mCherry, mRuby, Examples include mStrawberry, mPlum, mOrange, mBana, Dendra2, E2-Crimson, mRasbury, tdTomato, and the like.
  • affinity tag examples include His tag, HA tag, myc tag, FLAG tag, glutathione-S-transferase (GST), maltose binding protein (MBP), E tag, S tag, HSV tag, Halo tag and the like. It is done.
  • the protein of the present invention includes the protein (A), (B) or (C), or a product obtained by modifying the fusion protein with a substance to be introduced.
  • a desired substance to be introduced can be localized in the lipid droplet in the target cell.
  • Specific examples of the substance to be introduced include substances that decompose fat (for example, various lipases), protein labeling compounds such as biotin, fluorescent compounds, and the like.
  • As a use of the protein of the present invention modified with a substance capable of decomposing fat for example, treatment or prevention of obesity is assumed.
  • As a use of the protein of the present invention labeled with a fluorescent compound visualization (imaging) of lipid droplets in cells is assumed.
  • Specific examples of the fluorescent compound include fluorescein, rhodamine, Cy dye (for example, Cy3, Cy 5), Alexa dye, and the like.
  • the protein of the present invention may be produced by various known genetic engineering techniques or may be produced by chemical synthesis.
  • the present inventor has developed a plasmid pON / C-5B / KE (Ikeda M. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 329) containing the full length of the HCV-0 strain of type 1b. 2005) 1350-1359) as a template DNA, the N-terminal region and the C-terminal region of the NS4B coding region were amplified by PCR, and the fragments were ligated by overlap PCR. Then, the ligated fragments were introduced into various expression vectors, whereby a mammalian expression plasmid encoding a protein as an example of the present invention was prepared.
  • the starting material is not limited to the above plasmid, and the specific method for constructing the expression system is not limited to the above method.
  • the nucleic acid (DNA or RNA) encoding the above protein (A), (B) or (C) or the above fusion protein is prepared and incorporated into various known expression vectors to express the protein of the present invention. Can do.
  • amino acid deletion, substitution and / or addition can be performed by, for example, error-prone PCR, DNA shuffling, various site-specific mutagenesis methods, etc. Any base deletion, substitution and / or insertion can be made.
  • the type of expression vector used in the present invention is not particularly limited, and microorganisms such as bacteria (for example, Escherichia coli , Bacillus subtilis ), fungi (for example, yeast), plants, insect cells, Various expression vectors that allow protein expression in a host such as a mammalian cell can be used, and they may be viral vectors (including phage vectors) or plasmid vectors.
  • the protein of the present invention can also be produced using a cell-free protein synthesis system using rabbit reticulocyte lysate, wheat germ lysate, E. coli lysate or the like.
  • a plasmid vector or a viral vector for expressing the mammalian cell.
  • the expressed protein of the present invention is specifically localized in intracellular lipid droplets. Therefore, when the nucleic acid encoding the protein of the present invention is incorporated into a plasmid vector or viral vector for mammalian cell expression, and the plasmid vector or viral vector is transformed in a mammalian cell, the protein of the present invention is directly expressed in the mammalian cell.
  • the expressed protein of the present invention is specifically localized in the lipid droplets in the cells, and the lipid droplets of mammalian cells can be observed or analyzed.
  • Lipid droplets are known to exist not only in mammalian cells but also in eukaryotes (including plants) and prokaryotes (eg, bacteria) (Murphy DJ: Prog. Lipid Res. 40, 325-438, 2001).
  • the species of the present invention may be expressed using a biological species having lipid droplets in the cell as a host and using various protein expression vectors corresponding to the biological species.
  • the protein of the present invention expressed in various biological species is localized in intracellular lipid droplets, and the lipid droplets of these biological species can be observed or analyzed.
  • the fusion protein of the protein (A), (B) or (C) and a fluorescent protein is expressed in a desired mammalian cell, lipid droplets can be visualized directly.
  • the fusion protein of the protein (A), (B) or (C) and the affinity tag is expressed by genetic engineering, the protein of the present invention can be purified by various affinity purification methods. It becomes.
  • the protein of the present invention can also be used for analysis of lipid droplets by directly expressing it in desired mammalian cells.
  • the protein of the present invention purified by various known methods can also be used for analysis of lipid droplets in desired mammalian cells. Specifically, analysis of intracellular lipid droplets and the like can be performed by introducing the purified protein of the present invention into a desired mammalian cell.
  • a lipid-based protein introduction reagent can be used.
  • Such a protein introduction reagent is available from a reagent manufacturer (for example, LSin (PPU); Pro-DeliverIN (OZB); BioPORTER Protein Delivery Reagent (GTS); Apa Carry 1 (CLG); Ab -DeliverIN (OZB Company)).
  • the protein of the present invention shows specific localization in intracellular lipid droplets, it can be used as a lipid droplet visualization (imaging) tool in living cells or fixed cells. Specifically, if an antibody against the protein (A), (B) or (C), or a labeled protein to be fused to it or an antibody against an affinity tag is immunostained, a cell into which the protein of the present invention has been introduced is stained. Fat droplets can be visualized. As a method of immunostaining, a known method can be used. In addition, if the protein of the present invention fused with a fluorescent protein is expressed in cells and the cells are observed using a confocal laser microscope or the like, fine imaging of intracellular lipid droplets becomes possible. Further, by introducing the protein of the present invention modified with a fluorescent compound or the like into a cell, it is possible to similarly perform fine imaging of intracellular lipid droplets.
  • the protein of the present invention has a specific binding ability to intracellular lipid droplets
  • the protein of the present invention modified with a substance to be introduced such as a lipolytic substance (for example, lipase) is used as a target cell such as an adipocyte.
  • a lipolytic substance for example, lipase
  • the protein of the present invention can be used as a visualization tool for intracellular lipid droplets, a drug delivery tool for delivering a substance to be introduced containing a drug to lipid droplets, and the like.
  • Another aspect of the present invention relates to the following protein: (1) In the amino acid sequences from No. 1 to No. 73 of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID Nos. 2 to 10 and 12 to 23, At least one of amino acids 43, 46, 50, 57, 61 and 64 is independently alanine, glycine, serine, threonine, cysteine, methionine, histidine, arginine, Proteins mutated to lysine, glutamine, asparagine, glutamic acid, aspartic acid or proline; or the amino acid sequence from No. 1 to No. 72 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, No. 43, No. 49, No.
  • At least one of amino acids 56, 60 and 63 is independently alanine, glycine, Protein mutated to serine, threonine, cysteine, methionine, histidine, arginine, lysine, glutamine, asparagine, glutamic acid, aspartic acid or proline.
  • at least one amino acid of the 241st, 245th, 248th and 252nd amino acids is independently alanine, glycine, Serine, threonine, cysteine, methionine, histidine , Arginine, lysine, glutamine, asparagine, glutamic acid, mutated proteins to aspartic acid or proline.
  • 253 is independently alanine, glycine, serine, threonine, cysteine, methionine, histidine, arginine, lysine, glutamine , A protein mutated to asparagine, glutamic acid, aspartic acid, or proline; or Nos. 1 to 72 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 In the amino acid sequence in which the N terminus of the amino acid sequence of No. 191 to No. 260 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 is linked to the C terminus of the amino acid sequence of No. 43, No. 49, No. 56, No. 60, No. 63, No. 241, No. 245, No. 248, No.
  • 252 amino acid is independently alanine, glycine, serine, threonine, cysteine, methionine , Histidine, arginine, lysine, glutamine, asparagine, glutamic acid, aspartic acid or proline mutated protein.
  • the 43rd, 46th and 50th (49th) amino acids are independently alanine, glycine, serine, threonine, cysteine, methionine, histidine, arginine, lysine, glutamine.
  • Asparagine, glutamic acid, aspartic acid or proline may be substituted, and 57th (56th), 61st (60th) and 64th (63th) are independently alanine and glycine.
  • the amino acids of No. 242 (No. 241), No. 246 (No. 245), No. 249 (No. 248) and No. 253 (No. 252) are independently alanine.
  • Glycine, serine, threonine, cysteine, methionine, histidine, arginine, lysine, glutamine, asparagine, glutamic acid, aspartic acid or proline may be substituted.
  • the 63rd amino acid may be independently substituted with alanine, glycine, serine, threonine, cysteine, methionine, histidine, arginine, lysine, glutamine, asparagine, glutamic acid, aspartic acid, or proline.
  • 252 are independently alanine, glycine, serine, threonine, cysteine, methionine, histidine, argin , Lysine, glutamine, asparagine, glutamic acid, aspartic acid or proline may be substituted, or 43rd, 46th, 50th (49th), 242nd (241st) 246 (No. 245), No. 249 (No. 248) and No. 253 (No. 252) are independently alanine, glycine, serine, threonine, cysteine, methionine, histidine, arginine, lysine, glutamine , Asparagine, glutamic acid, aspartic acid or proline may be substituted.
  • the amino acid sequence serving as each reference is preferably selected from SEQ ID NO: 2. Furthermore, in the proteins (1), (2) and (3), the amino acid mutation described above is preferably an alanine mutation.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding the protein (1), (2) or (3).
  • the present invention relates to an expression vector containing the nucleic acid.
  • the present invention also relates to a transformant using the expression vector.
  • NS4B is a protein encoded by nucleotide numbers 5475-6257 of this sequence and consists of 261 amino acids.
  • the nucleotide sequence of HCV-O strain NS4B is shown in FIG.
  • the amino acid sequence of HCV-O strain NS4B is shown in FIG. 2 and SEQ ID NO: 2.
  • NS4B functional domain (domain) NS4B is a membrane protein localized in the endoplasmic reticulum (ER), the central part of which is embedded in the ER membrane, part of the N-terminal side and one of the C-terminal side. The part is thought to be on the cytoplasm side. That is, NS4B proteins can be classified into three regions: an N-terminal cytoplasmic domain (4BN), a transmembrane domain (4BTM), and a C-terminal cytoplasmic domain (4BC) (see FIG. 4).
  • ER endoplasmic reticulum
  • 4BTM has amino acid residues 74 to 191 and 4BC has amino acid residues 192 to 261 (Jones et al, J. Virol. 83, 2163- 2177, 2009).
  • a fusion protein of each of these regions and a fluorescent protein was created as described below.
  • 4Bfull consisting of the full-length amino acid sequence of NS4B (amino acid residues 1 to 261), 4B1 consisting of amino acid residues 1 to 25 (part of 4BN), 4B2 consisting of amino acid residues 26 to 49 (part of 4BN) 4B3 consisting of amino acid residues 50 to 73 (part of 4BN), 4B1-2 consisting of amino acid residues 1 to 49 (part of 4BN), 4B2-3 consisting of amino acid residues 26 to 73 (one of 4BN) Part), 4B9 consisting of amino acid residues 192 to 217 (part of 4BC), 4B10 consisting of amino acid residues 218 to 239 (part of 4BC), 4B11 consisting of amino acid residues 240 to 261 (part of 4BC) 4B9-10 consisting of amino acid residues 192 to 239 (part of 4BC) and 4B10-11 consisting of amino acid residues 218 to 261 (part of 4BC) It was also produced a fusion protein of the same fluorescent protein
  • 4B9 primer U side 4BC U side primer R side: 5'-TTTGAATTCTTAATGGTTACCCCGCGAAGCG-3 '(SEQ ID NO: 34) Template: Cherry-4BC plasmid
  • composition of reaction solution PS buffer 10 ⁇ L, dNTP (2.5 mM each) 4 ⁇ L, U-side primer (0.1 mM) 0.4 ⁇ L, R-side primer (0.1 mM) 0.4 ⁇ L, template plasmid 10 ng, PS 0.5 ⁇ L, and the remainder as ultrapure water, PCR reaction was performed with a final volume of 50 ⁇ L.
  • PCR reaction Prepare the above reaction solution containing each primer pair (for 4Bfull, 4BN, 4BTM, 4BC, 4B1, 4B2, 4B3, 4B1-2, 4B2-3, 4B9, 4B10 4B11 use, 4B9-10 use, 4B10-11 use), and 98 ° C. for 10 seconds, followed by 25 cycles of ⁇ 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, 72 ° C. for 30 seconds ⁇ .
  • primer pair for 4Bfull, 4BN, 4BTM, 4BC, 4B1, 4B2, 4B3, 4B1-2, 4B2-3, 4B9, 4B10 4B11 use, 4B9-10 use, 4B10-11 use
  • Preparation of gene fragment encoding 4BNC 4BNC is a sequence in which 4BN and 4BC are linked (see FIG. 5). If two fragments whose sequences partially overlap on the 3 ′ side of 4BN and the 5 ′ side of 4BC are prepared, the two fragments can be directly ligated by PCR. These two fragments were prepared by PCR using the primers shown below.
  • a 4BN side fragment and a 4BC side fragment are respectively prepared by PCR.
  • the reaction solution composition and reaction conditions were the same as those described in 3. above, except that the primers shown above were used. It is based on.
  • the reaction product was purified using a MARLIGEN® Rapid® PCR® purification® system kit. Next, ligation PCR of each fragment was performed.
  • PCR reaction was performed with 10 ⁇ L of PS buffer, 4 ⁇ L of dNTP (2.5 mM each), 4 ng of 4BN-side purified fragment, 200 ng of 4BC-side purified fragment, 200 ng of PS, and 0.5 ⁇ L of PS, and a final volume of 50 ⁇ L with ultrapure water.
  • the vector was digested with Bgl II and Eco RI by a conventional method, then treated with Calf intestine alkaline phosphatase (TOYOBO), further agarose gel electrophoresis was performed, the vector DNA was excised from the gel, and purified by QIAGEN MinElute gel extraction kit. The DNA concentration was adjusted to 50 ng / ⁇ L with TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 7.4, 1 mM mM EDTA).
  • PCR products (4Bfull, 4BN, 4BTM, 4BC, 4B1, 4B2, 4B3, 4B1-2, 4B2-3, 4B9, 4B10, 4B11, 4B9-10, 4B10-11, 4BNC) Purified with purification system kit.
  • each PCR product was digested with BglII and EcoRI by a conventional method, further subjected to agarose gel electrophoresis, and the DNA was excised and purified by QIAGEN MinElute gel extraction kit. Adjust the DNA concentration to 50 ng / ⁇ l with TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 7.4, 1 mM mM EDTA).
  • the ligated DNA was transformed into TG1 strain E. coli by electroporation (Tanaka et al, Nihon Univ. J. Med, 47, 43-56, 2005).
  • the transformed cells were selected on an LB plate containing kanamycin 25 ⁇ g / mL, the obtained colonies were cultured on a 1 ml scale, and the plasmid DNA was extracted by Rapid-plasmid-miniprep-system of Marligen.
  • the transformant was cultured at a culture scale of 50 ml, and the plasmid was extracted using the Macchery-Nagel Nucleobond PC500 kit.
  • the obtained plasmid was subjected to phenol extraction, chloroform extraction and ethanol precipitation by a conventional method, and dissolved in TE buffer to a concentration of 1 ⁇ g / ⁇ L.
  • Oc cells (Ikeda et al., Biochem. Bios. Res. Comm. 329, 1350-1359, 2005) with abundant lipid droplets were used in the experiment.
  • Oc cells are seeded in a 24-well plate (EZView culture plate LB glass bottom, IWAKI) that can be observed with a fluorescence microscope so as to be 70-80% confluent, and according to the protocol using Lipofectamin 2000 (Invitrogen) according to the protocol.
  • the plasmid was transfected. 1.6 ⁇ g of plasmin per well and 4.0 ⁇ L of Lipofectamin 2000 were used. Each Oc cell was observed 24 or 48 hours after transfection.
  • lipid droplets were stained with Bodipy493 / 503tro (Invitrogen) for 20 minutes (Ohsaki et al, Histochem. Cell Biol. 124, 445-452, 2005).
  • the lipid droplet membrane was stained with an anti-ADRP antibody. After fixation, it was incubated with 0.01% digitonin / TBS for 30 minutes and blocked with 1% BSA / TBS for 1 hour. Incubate for 1 hour with anti-ADRP antibody (Acris) / 1% TBSA / TBS (final antibody concentration 5 ⁇ g / mL), then antimouse IgG-AlexaFluor 647 (Invitrogen) 1000-fold diluted / 1% BSA as secondary antibody Incubated with / TBS for 30 minutes.
  • the nuclei were stained with Hechst 33333 dye (final concentration 5 ⁇ g / mL TBS) for 20 minutes.
  • the cells were microscopically examined in sequential scan mode using a confocal laser scanning microscope (FV1000, Olympus).
  • Each sample was subjected to 10-20 visual field microscopy and all cells expressing the Cherry fusion protein were judged according to the following criteria.
  • Category A Cherry fusion protein is localized only in the lipid droplet membrane.
  • Category B Cherry fusion protein is localized in the lipid droplet membrane and other sites (eg, cytoplasm, ER, etc.).
  • Category C Cherry fusion protein is not localized in the lipid droplet film, but is localized in other sites.
  • the images taken with a confocal microscope were taken and analyzed with a PLAPO® 100X® OTIRFM® objective lens as an image of one field of view (1024 ⁇ 1024 ⁇ pixel) at 126.852 ⁇ m ⁇ 126.852 ⁇ m.
  • the confocal microscope has four types of excitation lasers (405 nm, 488 nm, 543 nm, and 633 nm; each for blue fluorescence, green fluorescence, red fluorescence, and infrared fluorescence) and is excited by each laser beam. Each fluorescence emitted from the sample is imaged independently. After imaging, each fluorescent image was created by a computer.
  • a color image can select a color suitably and can draw a colored image.
  • each fusion protein is localized in a lipid droplet was determined by comparing a red fluorescent image, a green fluorescent image, and a merge image (composite image) of both on a computer image. .
  • the Cherry fusion protein When the Cherry fusion protein is expressed, the Cherry fusion protein is localized in the lipid droplet membrane when a ring-shaped red fluorescence image is obtained that borders the circular green fluorescence by Bodipy that stains the inside of the lipid droplet. Judged to be a thing.
  • the green fluorescence of EGFP and the green fluorescence of Bodipy cannot be distinguished. Therefore, after staining the lipid droplet membrane with an anti-ADRP antibody and a rhodamine (red fluorescence) labeled secondary antibody, imaging of the fluorescence is performed. went. In this case, when the ring-shaped structure shown as an EGFP-derived green fluorescent image matches the ring-shaped red fluorescent image of the lipid droplet membrane stained with the anti-ADRP antibody, the EGFP fusion protein becomes the lipid droplet membrane. It was determined to be localized in
  • Fig. 7 shows the observed typical cell image of Cherry-4BC in red, Bodipy493 / 503 in green, and a red and green image superimposed on a computer (merge image) with nuclear staining (blue). It was. Similar to Cherry-4BN, Cherry-4BC accumulated around the lipid droplets, but also distributed in the cytoplasm and cytoplasmic network (estimated ER). Similar results were obtained with EGFP-4BC (data not shown). Like 4BN, 4BC is presumed to have affinity for the lipid droplet membrane and ER.
  • FIG. 8 shows the typical cell images observed, with Cherry-4BTM in red, Bodipy493 / 503 in green, and a red and green image superimposed on a computer (merge image) with nuclear staining (blue). It was. Cherry-4BTM showed a ring-shaped structure in the cytoplasm, but this visualized ring-shaped structure was completely unrelated to the fat droplets shown in green. Similar results were obtained with EGFP-4BTM (data not shown). Although the localization site of 4BTM cannot be accurately identified, it is presumed that it is probably an ER that has undergone shape change by 4BTM.
  • FIG. 9 shows the observed typical cell image of Cherry-4BNC in red, Bodipy493 / 503 in green, and a red and green image superimposed on a computer (merge image) with nuclear staining (blue). It was. Cherry-4BNC was depicted in a ring shape, and its position completely coincided with the fat droplets shown in green. There was almost no distribution of Cherry-4BNC in other parts of the cell. Cherry-4BNC was found to be localized around the lipid droplets, that is, to bind highly specifically to the lipid droplet membrane.
  • FIG. 10 shows the observed typical cell images in green for EGFP-4BNC and magenta for ADRP. The distributions of EGFP-4BNC and ADRP were almost completely consistent, indicating that EGFP-4BNC bound to the lipid droplet membrane, and that EGFP-4BNC depicted the lipid droplet membrane more clearly than the ADFP antibody.
  • fatty acid stearic acid 50 ⁇ M
  • Fig. 11 shows the observed typical cell image with Cherry-4BNC in red, Bodipy493 / 503 in green, and a red and green image superimposed on a computer (merge image) with nuclear staining (blue). It was.
  • FIG. 13 shows a typical cell image observed, in which Cherry-4Bfull is red, Bodipy493 / 503 is green, and a red and green image superimposed on a computer (merge image) with nuclear staining (blue) added. It was.
  • hydrophobic residues that may interact with the lipid droplet membrane in the above two amphipathic ⁇ -helix were selected with reference to the amino acid arrangement diagram (Fig. 16) seen from the long axis direction and replaced with alanine.
  • a mutant was prepared.
  • the selected amino acid residues were 43W, 46L, 50W, 57F, 61I, 64L, 242I, 246L, 249L, 253I, a total of 10 residues.
  • the alanine substitution performed was all of W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A, or the first half to the latter half, and in the 4B10-11 region, I242A, L246A, L249A, I253A is there.
  • Cherry-4BC mutation 1 (Cherry-4BC with mutations I242A, L246A, L249A, I253A) Category A: 0 (number of cells) 0 (%) Category B: 0 0 Category C: 65 100
  • Cherry-4BNC mutation 1 (Cherry-4BNC with W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A mutations) Category A: 9 (number of cells) 17 (%) Category B: 41 77 Category C: 3 6
  • Cherry-4BNC mutation 2 (Cherry-4BNC with mutations W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A, I242A, L246A, L249A, I253A) Category A: 0 (number of cells) 0 (%) Category B: 5 8 Category C: 54 92
  • Cherry-4BNC mutation 3 (Cherry-4BNC with mutations W43A, L46A, W50A, I242A, L246A, L249A, I253A) Category A: 15 (number of cells) 20.3 (%) Category B: 55 74.3 Category C: 4 5.4
  • Cherry-4BC is weaker than Cherry-4BN, but shows localization to fat droplets.
  • Cherry-4BC mutation 1 in which mutations I242A, L246A, L249A, and I253A were added to Cherry-4BC did not show any localization to lipid droplets.
  • the Cherry-4BNC according to the present invention shows specific localization to fat droplets.
  • Cherry-4BNC mutation 1 in which W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, and L64A mutations were added to Cherry-4BNC showed relatively strong localization to fat droplets.
  • Cherry-4BN that is, Cherry4BN mutation 1
  • the localization was greatly weakened
  • Cherry-4BNC the effect was small. That is, it was speculated that the C-terminal region (4B10-11) has a fairly strong action.
  • Cherry-4BNC mutation 2 in which 4 residues in the C-terminal region were also mutated (Cherry-4BNC was changed to W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, I64A, I242A, L246A, L249A, I253A (Mutation with mutation) was created and analyzed, and the localization to lipid droplets was almost completely lost.
  • Cherry-4BNC mutation 3 with mutations in the first 3 residues of the N-terminal region and 4 residues of the C-terminal region (Cherry-4BNC mutations W43A, L46A, W50A, I242A, L246A, L249A, I253A)
  • localization to lipid droplets was relatively strong (that is, localization to lipid droplets was not completely inhibited by mutation).
  • 57F, 61A, 64L clusters and 242I, 246L, 249L, and 253I clusters are considered not to have strong localization ability to fat droplets.
  • Cherry-4BNC the ability to localize to lipid droplets is not lost unless all three clusters are mutated. Therefore, these clusters (57F, 61A, 64L and 242I, 246L, 249L, which do not have strong action alone) , 253I) is considered to exhibit extremely strong localization of fat droplets as a whole by acting cooperatively with clusters consisting of 43W, 46L, and 50W.
  • amino acid residues identified as described above are highly conserved among the HCV subtypes (see FIG. 19). Although substitution is seen in some subtypes, the appearing amino acid residues are limited to hydrophobic amino acids with similar properties. Therefore, it is presumed that the interaction between NS4B and lipid droplets mediated by these residues (localization of NS4B to the lipid droplet membrane) plays an extremely important role in the process of HCV growth. . On the contrary, this suggests that if these amino acid residues are targeted and a method for inhibiting localization to lipid droplets is taken, the growth of HCV can be suppressed.
  • ⁇ Mutant production method> As a codon for an alanine residue, GCC having the highest codon usage in eukaryotic cells was used. An appropriate PCR fragment was prepared using a primer containing a nucleotide mutation at a predetermined position, and the fragments were further linked by PCR using the overlapping portion as described above to produce the target DNA fragment. . Thereafter, the fragment was inserted into the pmCherry-C1 vector after treatment such as restriction enzyme digestion according to the method described above to obtain a completed construct. For all constructs, the plasmid was purified and DNA sequencing was performed to confirm that the given mutation was successful.
  • the following describes how to construct each construct fragment.
  • the underlined portion of the primer sequence represents a site corresponding to an alanine substitution mutation.
  • Cherry-4BN mutation 1 (W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A) -Fragment A (amino acids 1-48) production PCR
  • U side U side primer for 4BN
  • R side 5'-GGCCTC GGC GGCTTG GGC CTTGGACTCCACCACGGG-3 '(SEQ ID NO: 44)
  • a reaction of ⁇ 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, 72 ° C. for 30 seconds ⁇ was repeated 28 cycles.
  • the reaction product was purified using a Rapid PCR purification system kit manufactured by MARLIGEN.
  • Fragment A, B ligation and amplification Fragment A (10 ⁇ L), Fragment B (4 ⁇ L), PS buffer 10 ⁇ L, dNTP (2.5 mM each), PS 0.5 ⁇ L, and reaction solution adjusted to 50 ⁇ L with ultrapure water 10 ° C. After the denaturation reaction for 2 seconds, the PCR reaction of ⁇ 98 ° C. for 10 seconds, 50 ° C. for 20 seconds, 72 ° C. for 30 seconds ⁇ was repeated 10 cycles, and fragments A and B were ligated.
  • the PCR reaction After the denaturation reaction at 98 ° C. for 10 seconds, the PCR reaction of ⁇ 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, 72 ° C. for 30 seconds ⁇ was repeated 20 cycles. After the reaction, the reaction product was purified using MARLIGEN Rapid® PCR® purification® system kit.
  • the pcDNA4BFLAG plasmid is a plasmid in which a full-length NS4B sequence and a sequence with the amino acid sequence DYKDDDDK (FLAG tag) added to the C-terminal site are inserted into a pcDNA3.1 (+) vector (Invitrogen).
  • Fragment C D ligation and amplification Fragment C (10 ⁇ L), Fragment D (5 ⁇ L), PS buffer 10 ⁇ L, dNTP (2.5 mM each), PS 0.5 ⁇ L, and reaction solution adjusted to 50 ⁇ L with ultrapure water at 98 ° C. for 10 seconds After the denaturation reaction, the PCR reaction of ⁇ 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 20 seconds, 72 ° C. for 60 seconds ⁇ was repeated 10 cycles, and fragments C and D were linked.
  • PCR reaction ⁇ 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 5 seconds, 72 ° C for 45 seconds ⁇ was repeated 30 cycles after a denaturation reaction at 98 ° C for 10 seconds. After the reaction, the reaction product was purified using MARLIGEN Rapid® PCR® purification® system kit.
  • Fragment E, F ligation and amplification Fragment E (5 ⁇ L), Fragment F (5 ⁇ L), PS buffer 10 ⁇ L, dNTP (2.5 mM each), PS 0.5 ⁇ L, and reaction solution made 50 ⁇ l with ultrapure water at 98 ° C. After the denaturation reaction for 2 seconds, the PCR reaction of ⁇ 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 20 seconds, 72 ° C. for 60 seconds ⁇ was repeated 10 cycles, and fragments E and F were ligated. After the ligation reaction, 0.4 ⁇ L of the next primer (0.1 mM) was added to the reaction solution and amplified by PCR.
  • U side U side primer for 4BN
  • R side R side primer for 4BN 98 ° C for 10 seconds, followed by 10 cycles of PCR reaction of ⁇ 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 5 seconds, 72 ° C for 60 seconds ⁇
  • the reaction product was purified using a Rapid PCR purification system kit from MARLIGEN.
  • Cherry-4BNC mutation 1 (W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A) -Fragment H (amino acid 1-73) production PCR U side: 4BNU side primer R side: 5'-GTTCCCAGGCAGAGTGGACAA-3 '(SEQ ID NO: 52)
  • U side U primer for 4BN
  • R side R side primer for 4BC
  • a denaturation reaction at 98 ° C. for 10 seconds a PCR reaction of ⁇ 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, 72 ° C. for 60 seconds ⁇ is performed for 8 cycles, The reaction product was purified using a Rapid PCR purification system kit from MARLIGEN.
  • Cherry-4BNC mutation 2 (W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A, I242A, L246A, L249A, I253A) -Fragment J (amino acids 1-73 and 192-261) production PCR
  • U side primer U side primer for 4BN
  • R side primer R side primer for fragment G
  • 10 ng of Cherry-4BNC mutation 1 plasmid as a template, 98 ° C for 10 seconds, ⁇ 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 20 seconds Second, 72 ° C. 60 seconds ⁇ was performed 27 cycles, and the reaction product was purified using a Rapid PCR purification system kit manufactured by MARLIGEN.
  • Cherry-4BNC mutation 3 (W43A, L46A, W50A, I242A, L246A, L249A, I253A) -Fragment K (amino acids 1-73) production PCR
  • U side U side primer for 4BN
  • R side R side primer for fragment H
  • 10 ng of Cherry-4BN mutation 2 plasmid as a template, after a denaturation reaction at 98 ° C. for 10 seconds, ⁇ 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, PCR reaction at 72 ° C. for 30 seconds ⁇ was performed 28 cycles, and the reaction product was purified using a Rapid PCR purification system kit manufactured by MARLIGEN.
  • U side U side primer for 4BN
  • R side R side primer for fragment G
  • PCR reaction ⁇ 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 5 seconds, 72 ° C for 30 seconds ⁇ is performed for 8 cycles.
  • the reaction product was purified using a Rapid PCR purification system kit from MARLIGEN.

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Abstract

 本発明の目的は、脂肪滴に特異的な局在性を示す新規なタンパク質を提供することにある。本発明によれば、(A)配列番号2で表されるアミノ酸配列の第50番から第73番までのアミノ酸配列とそのN末端に結合するX1 nで表されるアミノ酸配列(0≦n≦49であり、nが2以上の場合、X1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド(a)のC末端に、配列番号2で表されるアミノ酸配列の第218番から第261番までのアミノ酸配列とそのN末端に結合するX2 mで表されるアミノ酸配列(0≦m≦26であり、mが2以上の場合、X2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド(b)のN末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質;(B)(A)に規定されるタンパク質において上記第50番から第73番までアミノ酸配列および/または上記第218番から第261番までのアミノ酸配列の領域中に1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質;または(C)(A)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質が提供される。

Description

脂肪滴に特異的局在性を示すタンパク質 関連出願の相互参照
 本出願は、2010年11月5日出願の日本特願2010-248773号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
 本発明は、脂肪滴に特異的な局在性を示す新規なタンパク質に関する。
 脂肪滴は細胞内小器官の一つであり、内部に脂質を含み、表面をリン脂質一重膜に覆われた球状の構造物である(非特許文献1参照)。内部の脂質としてはトリグリセリド、ステロールエステルが主体で、他の中性脂質も少量含む。大きさは様々で、1μm以下から100μm程度のものまである。最も極端な例は、脂肪細胞であり、細胞体の大部分を肥大化した脂肪滴が占めている。その他の細胞では、肝細胞が脂肪滴を多く含むが、どのような種類の細胞でも脂肪滴の形成能力を持つ。
 脂肪細胞の脂肪滴は、脂質の貯蔵庫として機能し、個体のエネルギー源となる。飢餓状態や栄養過多といったエネルギー環境に応じて、脂肪滴量は、ホルモンによる調節を受け、増減する。一方、その他の細胞の脂肪滴は、細胞のエネルギー源として機能する他、細胞膜や細胞内小器官(小胞体(endoplasmic reticulum;ER)、ミトコンドリア、ペルオキソゾーム、エンドゾームなど)とも相互作用し、脂質二重膜への脂質の供給源としても機能する。これらの機能を果たすため、細胞の活動や増殖の際に脂肪滴の大きさや局在が変化する。また、分泌性のリポタンパク(VLDL)が肝細胞などで形成される際に、脂肪滴が脂質の供給を担っているとも考えられている。
 脂肪滴膜には複数のタンパク質が局在しており、最も良く知られているのはADRP (adipocyte differentiation-related protein, 別名adipophilin, ADFP), perilipin, Tip47などであり、リパーゼ類や脂質合成酵素などもある。細胞の種類によって、タンパク質の種類に違いがあり、例えばperilipinは脂肪細胞とステロイド産生性細胞のみに存在する一方、ADRPは広汎な細胞種に存在する。
 現時点では、脂肪滴の正確な形成機構についてはコンセンサスが得られていないが、ERの脂質二重膜の二層の中間に合成された脂質が蓄積し、次第に細胞質側に突出・出芽し、ついにはERと分離して脂質一重膜に覆われた独立した構造物になると推測されている。
 脂肪肝においては、肝細胞内の脂肪滴が肥大する。またアテローム性動脈硬化で病態の中核を成す泡沫化マクロファージも、マクロファージ内部の脂肪滴が極端に肥大化して泡沫状の形態を示したものである。このように脂肪滴は脂質関連疾患やメタボリックシンドロームとも密接に関連するため、その動態や制御についての研究は重要である。
特開2010-213685
Zehmer et al, Proteomics, 9, 914-921, 2009; Beller et al, FEBS Lett. 584, 2176-2182, 2010; Olofsson et al, Biochim. Biophys. Acta, 1791, 448-458, 2009, Thiele et al, Current Opin. Cell Biol. 20, 378-385, 2008 Fukumoto et al, Histochem. Cell Biol. 118, 423-428, 2002 Ohsaki et al, Histochem. Cell Biol. 133, 477-480, 2010 Targett-Adams et al, J. Biol. Chem. 278, 15998-16007, 2003 Bostrom et al, Arterioscler. Thromb. Vas. Biol. 25, 1945-1951, 2005 Pol et al, J. Cell Biol. 152, 1057-1070, 2001 Turro et al, Traffic 7, 1254-1269, 2006 Spandl et al, Traffic 10, 1579-1584, 2009 Brasemle et al, J. Lipid Res. 38, 2249-2263, 1997 Ohsaki et al, Histochem. Cell Biol. 124, 445-452, 2005; Thiele et al, Curr. Opin. Cell Biol. 20, 378-385, 2008 Liefhebber JM, et al., Virology Journal 2009, 6:62: "Hepatitis C virus NS4B carboxy terminal domain is a membrane binding domain." Journal of Virology, May 2003, p. 5428-5438 Arch Virol. 1999;144(2):329-43.
 脂肪滴の染色には従来Sudan III(赤色色素)、Oil Red O(赤色色素)、Nile Red(黄色蛍光色素)、Bodipy493/503(緑色蛍光色素)などが用いられてきた。いずれも脂溶性化合物であり、中性脂肪に親和性が高いため、脂肪滴内部の脂質自体を染色する(顕微鏡観察で円形(三次元であれば球形)の像が得られる)。Sudan IIIや Oil Red Oは70%エタノールなどに溶解して使用するが、実はこのような高濃度のエタノールは脂肪滴を融合させてしまい正しい像が得られないと言う問題がある(非特許文献2参照)。また、グリセロールを含む包埋剤を用いると、アルデヒド類で固定した後でもやはり脂肪滴の融合が見られる(非特許文献2参照)。Nile RedやBodipy 493/503は水系の溶液で使用できるが、Bodipy493/503の方が、相対的に脂肪滴特異性に優れている。
 また、Bodipy493/503と、化学構造の若干異なるその誘導体が開発されており、脂肪滴に親和性のある赤色蛍光色素もある(例えば、Bodipy558/568C12, LD540など)。これらの色素は、トリグリセリドなどの中性脂肪に対する親和性を利用するもので、原理的に必ずしも脂肪滴に特異的に作用するものではない。現在最も汎用されているBodipy493/503は、条件によって赤色の蛍光が出てしまい、多色の蛍光観察に問題を起こしうることが発見された(非特許文献3参照)。
 また、細胞内在性の脂肪滴膜局在タンパク質に蛍光タンパク質を融合させたコンストラクトも多数作製され、脂肪滴の染色(イメージング)に利用されている。しかし、これらは本来的には当該タンパク質の機能を調べる道具であるから、発現させた当該タンパク質の機能が強く現れる可能性があり、脂肪滴が当該タンパク質の影響を受けて細胞内の状態が変化する可能性もある。したがって、これら従来技術では、細胞内における本来の脂肪滴の正確な情報が得られないという問題がある。また、小胞体(ER)など他の部位に局在したり、全部の脂肪滴を均一にイメージングできないという問題がある(非特許文献4~8)。
 上述の従来技術では、ADRPと蛍光タンパク質の融合体(EGFP-ADRP)が脂肪滴のイメージングツールとして優れている(非特許文献4参照)。しかし、ADRPは脂肪滴の成長や動態に密接に関連しているタンパク質であり(非特許文献9参照)、それ自体の強制発現の影響を考慮する必要がある。また、EGFP-ADRPを発現させた場合、本来細胞で発現しているADRPを検出することが手技的に煩雑となり、評価が難しい。
 抗体を用いて脂肪滴を可視化する方法では、抗ADRP抗体が汎用されている。抗体染色の場合、固定や透過処理(permeabilization)の工程において脂肪滴や脂肪滴膜の形態が変化する場合が多いこと、必ずしも細胞性の抗原が全ての脂肪滴膜に均一に存在しないことから、全ての脂肪滴膜を完全に均一に染めだすことは困難である(非特許文献10参照)。
 本発明の課題は、上記従来技術における問題点を解決できる細胞内脂肪滴の可視化(イメージング)技術を提供することにある。具体的には、本発明の課題は、正確な像(イメージ)として、細胞内における脂肪滴のみを特異的に可視化する技術を提供することにある。また、同時に、本発明の課題は、本来の細胞の状態、及び細胞内における本来の脂肪滴の状態を変化させることなく、該脂肪滴のみを特異的に可視化する技術を提供することにある。
 なお、特許文献1には、C型肝炎ウイルスの非構造タンパク質4B(NS4B)のN末端側50番から74番のアミノ酸からなるポリペプチド、及びNS4BのN末端側40番から63番のアミノ酸からなるポリペプチドが記載されている。しかしながら、特許文献1に記載される技術は、脂肪滴の可視化技術に関するものではない。
 非特許文献11には、NS4BのC末端領域をHuh7細胞に発現させた場合、点状の構造が観察されたことが記載され、さらに、NS4BのC末端領域は膜に関係するであろうことが示唆されている。しかしながら、非特許文献11には、NS4BのC末端領域は脂肪滴には局在しなかった事が記載されている。したがって、非特許文献11に記載の技術は、脂肪滴の可視化技術に関するものではない。
 非特許文献12には、NS4BのC末端側にEGFPを融合させたタンパク質(NS4B-EGFP)を細胞で発現させたところ、NS4B-EGFPがERに局在して観察されたことが記載されている。非特許文献12には、脂肪滴の可視化技術に関する知見は記載されていない。
 非特許文献13には、NS4Bは、細胞質に渡って点状のパターン(spot-like pattern)を示したことが記載されている。非特許文献13には、脂肪滴の可視化技術に関する知見は記載されていない。
 本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、C型肝炎ウイルス(hepatitis C Virus;HCV)の非構造タンパク質4B(NS4B)のN末端側領域とC末端側領域を融合させたタンパク質が脂肪滴に特異的に局在することを見出した。本発明は、係る知見により完成されたものである。
 すなわち、本発明は以下に関する。
〔1〕 (A)配列番号2で表されるアミノ酸配列の第50番から第73番までのアミノ酸配列とそのN末端に結合するX1 nで表されるアミノ酸配列(0≦n≦49であり、nが2以上の場合、X1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド(a)のC末端に、
 配列番号2で表されるアミノ酸配列の第218番から第261番までのアミノ酸配列とそのN末端に結合するX2 mで表されるアミノ酸配列(0≦m≦26であり、mが2以上の場合、X2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド(b)のN末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質;
(B)(A)に規定されるタンパク質において上記第50番から第73番までアミノ酸配列および/または上記第218番から第261番までのアミノ酸配列の領域中に1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質;または
(C)(A)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質。
〔2〕 (A)配列番号2で表されるアミノ酸配列の第50番から第73番までのアミノ酸配列とそのN末端に結合するX1 nで表されるアミノ酸配列(0≦n≦49であり、nが2以上の場合、X1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド(a)のC末端に、
 配列番号2で表されるアミノ酸配列の第229番から第261番までのアミノ酸配列とそのN末端に結合するX2 mで表されるアミノ酸配列(0≦m≦37であり、mが2以上の場合、X2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド(b)のN末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質;
(B)(A)に規定されるタンパク質において上記第50番から第73番までアミノ酸配列および/または上記第229番から第261番までのアミノ酸配列の領域中に1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質;または
(C)(A)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質。
〔3〕 X1 nで表されるアミノ酸配列が、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表されるアミノ酸配列の第1番から第49番までのアミノ酸配列から選択される任意の数n(1≦n≦49)のアミノ酸配列であるか(但し、配列番号21における第2番目及び第8番目のアミノ酸「Xaa」、並びに配列番号23における第6番目のアミノ酸「Xaa」は、任意のアミノ酸である。);又は、X1 nで表されるアミノ酸配列が、配列番号11に表されるアミノ酸配列の第1番から第48番までのアミノ酸配列から選択される任意の数n(1≦n≦48)のアミノ酸配列である、〔1〕又は〔2〕に記載のタンパク質。
〔4〕 X2 mで表されるアミノ酸配列が、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表されるアミノ酸配列の第192番から第217番までのアミノ酸配列から選択される任意の数m(1≦m≦26)のアミノ酸配列若しくは配列番号2~10及び12~23のいずれかに表されるアミノ酸配列の第192番から第228番までのアミノ酸配列から選択される任意の数m(1≦m≦37)のアミノ酸配列であるか;又は、X2 mで表されるアミノ酸配列が、配列番号11に表されるアミノ酸配列の第191番から第216番までのアミノ酸配列から選択される任意の数m(1≦m≦26)のアミノ酸配列若しくは配列番号11に表されるアミノ酸配列の第191番から第227番までのアミノ酸配列から選択される任意の数m(1≦m≦37)のアミノ酸配列である、〔1〕~〔3〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔5〕 X1 nで表されるアミノ酸配列が、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表されるアミノ酸配列の第1番から第49番、第26番から第49番、第40番から第49番、または第43番から第49番までのアミノ酸配列であるか(但し、配列番号21における第2番目及び第8番目のアミノ酸「Xaa」、並びに配列番号23における第6番目のアミノ酸「Xaa」は、任意のアミノ酸である。);又は、X1 nで表されるアミノ酸配列が、配列番号11に表されるアミノ酸配列の第1番から第48番、第26番から第48番、第40番から第48番、または第43番から第48番までのアミノ酸配列である、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔6〕 X2 mで表されるアミノ酸配列が、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第192番から第217番までのアミノ酸配列若しくは配列番号2~10及び12~23のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第192番から第228番までのアミノ酸配列であるか;又は、X2 mで表されるアミノ酸配列が、配列番号11で表わされるアミノ酸配列の第191番から第216番までのアミノ酸配列若しくは配列番号11で表わされるアミノ酸配列の第191番から第227番までのアミノ酸配列である、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔7〕 X1 nで表されるアミノ酸配列が配列番号2に表されるアミノ酸配列の第1番から第49番または第26番から第49番までのアミノ酸配列であり、かつ、X2 mで表されるアミノ酸配列が配列番号2で表されるアミノ酸配列の第192番から第217番までのアミノ酸配列または配列番号2で表されるアミノ酸配列の第192番から第228番までのアミノ酸配列である、〔1〕~〔6〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔8〕 前記タンパク質が、(A)に規定されるタンパク質である、〔1〕~〔7〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔9〕 前記タンパク質が、(A)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示す、〔1〕~〔7〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔10〕 標識タンパク質及び/又はアフィニティタグとの融合タンパク質である、〔1〕~〔9〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔11〕 被導入物質により修飾された〔1〕~〔10〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔12〕 被導入物質が、蛍光化合物である、〔11〕に記載のタンパク質。
〔13〕 〔1〕~〔10〕のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする核酸。
〔14〕 〔13〕に記載の核酸を含む、発現用ベクター。
〔15〕 〔14〕に記載の発現用ベクターにより形質転換された、形質転換体。
〔16〕 哺乳細胞において脂肪滴の可視化に用いるための、〔13〕に記載の発現用ベクター。
〔17〕 哺乳細胞において脂肪滴の可視化に用いるための、〔1〕~〔12〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔18〕 〔1〕~〔12〕のいずれかに記載のタンパク質に対する抗体。
 本発明のタンパク質は、細胞内小器官である脂肪滴への特異的局在性を示す。また、本発明のタンパク質によれば、生細胞又は固定細胞において脂肪滴を特異的に可視化(イメージング)することが可能となる。さらに、本発明のタンパク質によれば、正確な像として、細胞内における脂肪滴のみを特異的に可視化することができる。同時に、本発明のタンパク質によれば、本来の細胞の状態、及び細胞内における本来の脂肪滴の状態を変化させることなく、該脂肪滴のみを特異的に可視化することが可能となる。
図1は、実施例で用いた1b型のHCV-O株のNS4Bタンパク質をコードする塩基配列を示す。 図2は、上記1b型のHCV-O株のNS4Bタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図3は、各種HCVサブタイプ間で、NS4Bタンパク質のアミノ酸配列を比較(アライメント解析)した結果を示す。 図4は、NS4Bタンパク質の構造(三つの領域)を示す模式図である。 図5は、実施例で製造した本発明のタンパク質(脂肪滴への特異的局在性を示す4BNC)の模式図である。図5において、4BNCは、二ヶ所の脂肪滴局在性の配列(4BN及び4BC)を連結して作成したタンパク質であり、該タンパク質は極めて高い特異性で脂肪滴膜に局在することが判明した。図5において、Cherry-4BNCは、上記4BNCを蛍光タンパク質mCherryと融合させて得られるタンパク質の構造を示す。図5において、EGFP-4BNCは、上記4BNCを蛍光タンパク質EGFPと融合させて得られるタンパク質の構造を示す。これら異なる蛍光タンパク質を4BNCに連結しても脂肪滴膜への局在性に変化はなく、4BNCを蛍光タンパク質と連結して細胞に発現させると、脂肪滴の膜が描出され、Bodipy493/503などの従来の脂肪滴染色試薬とは異なる、新しい脂肪滴のイメージングが可能になった。 図6は、実施例で製造したCherry-4BNと脂肪滴との相互作用を解析した結果を示す。 図7は、実施例で製造したCherry-4BCと脂肪滴との相互作用を解析した結果を示す。 図8は、実施例で製造したCherry-4TMと脂肪滴との相互作用を解析した結果を示す。 図9は、実施例で製造したCherry-4BNC(本発明のタンパク質の一例)と脂肪滴との相互作用を解析した結果(脂肪滴のイメージング)を示す。 図10は、実施例で製造したEGFP-4BNC(本発明のタンパク質の一例)と脂肪滴との相互作用を解析した結果(脂肪滴のイメージング)を示す。 図11は、上記Cherry-4BNC(本発明のタンパク質の一例)を用いて、脂肪滴の少ないヒトHEK293細胞(ヒト由来培養細胞)において脂肪滴の可視化(イメージング)を行った結果を示す。脂肪滴を誘導するために脂肪酸(stearic acid, 50μM)を添加してある。 図12は、実施例で製造した各種NS4B融合タンパク質(コンストラクト)の構造を示す図である。 図13は、実施例で製造したCherry-4Bfull(NS4B全長)と脂肪滴との相互作用を解析した結果を示す。 図14は、各種NS4B融合タンパク質と脂肪滴との相互作用を解析した結果を示す。 図15は、NS4Bに存在するamphipathic α-helixの位置を示す図である。 図16は、NS4Bのamphipathic α-helixの長軸方向から見たアミノ酸配置を示す図である。 図17は、実施例で製造したNS4Bの各種変異体を説明する図である。 図18は、実施例で製造したNS4Bの各種変異体を説明する図である。 図19は、各種HCVサブタイプ間で、NS4Bにおける脂肪滴との相互作用に重要なアミノ酸を比較した結果を示す
 本発明の第一の態様は、
「(A)配列番号2で表されるアミノ酸配列の第50番から第73番までのアミノ酸配列とそのN末端に結合するX1 nで表されるアミノ酸配列(0≦n≦49であり、nが2以上の場合、X1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド(a)のC末端に、
 配列番号2で表されるアミノ酸配列の第218番から第261番までのアミノ酸配列とそのN末端に結合するX2 mで表されるアミノ酸配列(0≦m≦26であり、mが2以上の場合、X2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド(b)のN末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質;
(B)(A)に規定されるタンパク質において上記第50番から第73番までアミノ酸配列および/又は上記第218番から第261番までのアミノ酸配列の領域中に1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質;または
(C)(A)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質」に関する。
 本発明において、タンパク質が「脂肪滴への特異的局在性」を有するとは、蛍光タンパク質であるmCherryと対象タンパク質との融合タンパク質をコードする領域を含む哺乳細胞用発現ベクターでOc細胞を形質転換(トランスフェクション)し、蛍光顕微鏡により該細胞を観察した場合に、融合タンパク質が脂肪滴膜にのみ局在する細胞数が50%を超え、該融合タンパク質が脂肪滴膜及び細胞内の他の部位(例えば、細胞質、ER等の細胞小器官)に局在する細胞数が50%未満であり、かつ該融合タンパク質が脂肪滴には局在せず細胞内の他の部位に局在する細胞数が0%であることを意味する。形質転換(トランスフェクション)及び蛍光顕微鏡による観察の具体的な方法は、実施例に記載する通りである。該融合タンパク質が脂肪滴膜にのみ局在する細胞の数は、好ましくは50%以上、より好ましくは60%以上、特に好ましくは70%以上、最も好ましくは80%以上、90%以上、95%以上である。
 本発明の第一の態様において、(A)に規定されるタンパク質は、以下の構造からなる。
1 n-WAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGN-X2 m-VSPTHYVPESDAAARVTQILSSLTITQLLKRLHQWINEDCSTPC
 上記の構造において、X1 n-WAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGNは、ポリペプチド(a)に相当する。X2 m-VSPTHYVPESDAAARVTQILSSLTITQLLKRLHQWINEDCSTPCは、ポリペプチド(b)に相当する。ここで、例えば、n=5である場合には、X1 5は、「AASSW」のように、相互に同一又は異なるアミノ酸を含み得る。また、例えば、m=5である場合には、X2 5は、「AASSW」のように、相互に同一又は異なるアミノ酸を含み得る。
 上記の通り、(A)に規定されるタンパク質は、上記ポリペプチド(a)のC末端に上記ポリペプチド(b)のN末端が結合してなるタンパク質である。ポリペプチド(a)は、配列番号2で表わされるアミノ酸配列の第50番から第73番までのアミノ酸配列をそのC末端領域に有する。第50番から第73番までの上記アミノ酸配列の領域は、この領域の中に、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示すために機能する領域を含むからである。一方、ポリペプチド(b)は、配列番号2で表わされるアミノ酸配列の第218番から第261番までのアミノ酸配列をそのC末端領域に有する。第218番から第261番までの上記アミノ酸配列も、この領域の中に、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示すために機能する領域を含むからである。
 ポリペプチド(a)のN末端領域は、X1 nで表わされるアミノ酸配列で構成され、そのアミノ酸残基の数(n)は、上記の通り、0~49の範囲であり、好ましくは7~49の範囲、より好ましくは10~49の範囲、さらに好ましくは24~49の範囲である。本発明のタンパク質が脂肪滴に特異的な局在性を示す限り、アミノ酸配列X1 nを構成するアミノ酸の種類は特に限定されるものではない。例えば、アミノ酸配列X1 nは、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表されるアミノ酸配列の第1番から第49番までのアミノ酸配列から選択される任意の数n(1≦n≦49)のアミノ酸配列であってもよい(但し、配列番号21における第2番目及び第8番目のアミノ酸「Xaa」、並びに配列番号23における第6番目のアミノ酸「Xaa」は、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示す限り、任意のアミノ酸を取り得る)。或いは、アミノ酸配列X1 nは、配列番号11に表されるアミノ酸配列の第1番から第48番までのアミノ酸配列から選択される任意の数n(1≦n≦48)のアミノ酸配列であってもよい。
 脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質を提供するという観点から、アミノ酸配列X1 nは、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第43番から第49番までのアミノ酸配列であるか、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第40番から第49番までのアミノ酸配列であるか、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第26番から第49番までのアミノ酸配列であるか、または、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第1番から第49番までのアミノ酸配列であることが好ましい(但し、配列番号21における第2番目及び第8番目のアミノ酸「Xaa」、並びに配列番号23における第6番目のアミノ酸「Xaa」は、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示す限り、任意のアミノ酸を取り得る)。或いは、アミノ酸配列X1 nは、配列番号11に表わされるアミノ酸配列の第43番から第48番までのアミノ酸配列であるか、配列番号11に表わされるアミノ酸配列の第40番から第48番までのアミノ酸配列であるか、配列番号11に表わされるアミノ酸配列の第26番から第48番までのアミノ酸配列であるか、または、配列番号11に表わされるアミノ酸配列の第1番から第48番までのアミノ酸配列であることが好ましい。アミノ酸配列X1 nが、これらのアミノ酸配列である場合には、本発明のタンパク質が有する脂肪滴に対する特異的局在性が強まるからである。
 一方、ポリペプチド(b)のN末端領域は、アミノ酸配列X2 mで構成され、そのアミノ酸残基の数(m)は、上記の通り、0~26である。アミノ酸配列X2 mを構成するアミノ酸の種類は特に限定されるものではない。例えば、アミノ酸配列X2 mは、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表されるアミノ酸配列の第192番から第217番までのアミノ酸配列から選択される任意の数m(1≦m≦26)のアミノ酸配列であってもよい。或いは、アミノ酸配列X2 mは、配列番号11に表されるアミノ酸配列の第191番から第216番までのアミノ酸配列から選択される任意の数m(1≦m≦26)のアミノ酸配列であってもよい。
 脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質を提供するという観点から、アミノ酸配列X2 mは、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第192番から第217番までのアミノ酸配列であることが好ましい。或いは、アミノ酸配列X2 mは、配列番号11で表わされるアミノ酸配列の第191番から第216番までのアミノ酸配列であることが好ましい。アミノ酸配列X2 mが、これらのアミノ酸配列である場合には、本発明のタンパク質が有する脂肪滴に対する特異的局在性が強まるからである。
 また、本発明の第二の態様は、
「(A)配列番号2で表されるアミノ酸配列の第50番から第73番までのアミノ酸配列とそのN末端に結合するX1 nで表されるアミノ酸配列(0≦n≦49であり、nが2以上の場合、X1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド(a)のC末端に、
 配列番号2で表されるアミノ酸配列の第229番から第261番までのアミノ酸配列とそのN末端に結合するX2 mで表されるアミノ酸配列(0≦m≦37であり、mが2以上の場合、X2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド(b)のN末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質;
(B)(A)に規定されるタンパク質において上記第50番から第73番までアミノ酸配列および/または上記第229番から第261番までのアミノ酸配列の領域中に1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質;または
(C)(A)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質」に関する。
 本発明の第二の態様において、(A)に規定されるタンパク質は、以下の構造からなる。
1 n-WAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGN-X2 m-AAARVTQILSSLTITQLLKRLHQWINEDCSTPC
 上記の構造において、X1 n-WAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGNは、ポリペプチド(a)に相当する。X2 m-AAARVTQILSSLTITQLLKRLHQWINEDCSTPCは、ポリペプチド(b)に相当する。ここで、例えば、n=5である場合には、X1 5は、「AASSW」のように、相互に同一又は異なるアミノ酸を含み得る。また、例えば、m=5である場合には、X2 5は、「AASSW」のように、相互に同一又は異なるアミノ酸を含み得る。
 上記の通り、(A)に規定されるタンパク質は、上記ポリペプチド(a)のC末端に上記ポリペプチド(b)のN末端が結合してなるタンパク質である。ポリペプチド(a)は、配列番号2で表わされるアミノ酸配列の第50番から第73番までのアミノ酸配列をそのC末端領域に有する。第50番から第73番までの上記アミノ酸配列の領域は、この領域の中に、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示すために機能する領域を含むからである。一方、ポリペプチド(b)は、配列番号2で表わされるアミノ酸配列の第229番から第261番までのアミノ酸配列をそのC末端領域に有する。第229番から第261番までの上記アミノ酸配列も、この領域の中に、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示すために機能する領域を含むからである。
 ポリペプチド(a)のN末端領域は、X1 nで表わされるアミノ酸配列で構成され、そのアミノ酸残基の数(n)は、上記の通り、0~49の範囲であり、好ましくは7~49の範囲、より好ましくは10~49の範囲、さらに好ましくは24~49の範囲である。本発明のタンパク質が脂肪滴に特異的な局在性を示す限り、アミノ酸配列X1 nを構成するアミノ酸の種類は特に限定されるものではない。例えば、アミノ酸配列X1 nは、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表されるアミノ酸配列の第1番から第49番までのアミノ酸配列から選択される任意の数n(1≦n≦49)のアミノ酸配列であってもよい(但し、配列番号21における第2番目及び第8番目のアミノ酸「Xaa」、並びに配列番号23における第6番目のアミノ酸「Xaa」は、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示す限り、任意のアミノ酸を取り得る)。或いは、アミノ酸配列X1 nは、配列番号11に表されるアミノ酸配列の第1番から第48番までのアミノ酸配列から選択される任意の数n(1≦n≦48)のアミノ酸配列であってもよい。
 脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質を提供するという観点から、アミノ酸配列X1 nは、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第43番から第49番までのアミノ酸配列であるか、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第40番から第49番までのアミノ酸配列であるか、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第26番から第49番までのアミノ酸配列であるか、または、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第1番から第49番までのアミノ酸配列であることが好ましい(但し、配列番号21における第2番目及び第8番目のアミノ酸「Xaa」、並びに配列番号23における第6番目のアミノ酸「Xaa」は、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示す限り、任意のアミノ酸を取り得る)。或いは、アミノ酸配列X1 nは、配列番号11に表わされるアミノ酸配列の第43番から第48番までのアミノ酸配列であるか、配列番号11に表わされるアミノ酸配列の第40番から第48番までのアミノ酸配列であるか、配列番号11に表わされるアミノ酸配列の第26番から第48番までのアミノ酸配列であるか、または、配列番号11に表わされるアミノ酸配列の第1番から第48番までのアミノ酸配列であることが好ましい。アミノ酸配列X1 nが、これらのアミノ酸配列である場合には、本発明のタンパク質が脂肪滴により特異的に局在するからである。
 一方、ポリペプチド(b)のN末端領域は、アミノ酸配列X2 mで構成され、そのアミノ酸残基の数(m)は、上記の通り、0~37である。アミノ酸配列X2 mを構成するアミノ酸の種類は特に限定されるものではない。例えば、アミノ酸配列X2 mは、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表されるアミノ酸配列の第192番から第228番までのアミノ酸配列から選択される任意の数m(1≦m≦37)のアミノ酸配列であってもよい。或いは、アミノ酸配列X2 mは、配列番号11に表されるアミノ酸配列の第191番から第227番までのアミノ酸配列から選択される任意の数m(1≦m≦26)のアミノ酸配列であってもよい。
 脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質を提供するという観点から、アミノ酸配列X2 mは、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第192番から第228番までのアミノ酸配列であることが好ましい。或いは、アミノ酸配列X2 mは、配列番号11で表わされるアミノ酸配列の第191番から第227番までのアミノ酸配列であることが好ましい。アミノ酸配列X2 mが、これらのアミノ酸配列である場合には、本発明のタンパク質が脂肪滴により特異的に局在するからである。
 ところで、配列番号2に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が1b型であるHCV-O株(ゲノム塩基配列のGenBank Accession number: AB19133、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAD91386)の非構造タンパク質4B(NS4B)のアミノ酸配列である。配列番号3に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が1a型であるHCV(isolate H)(ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: P27958)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号4に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が1c型であるHCV(isolate HC-G9)(ゲノム塩基配列のAccession number: D14853、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA03581)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号5に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が2a型であるHCV(ポリプロテインcds領域の塩基配列のAccession number: AY746460、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: AAU89634)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号6に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が2b型であるHCV(strain MD2b-1)(ゲノム塩基配列のAccession number: AF238486、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: AAF59945)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号7に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が2c型であるHCV(isolate BEBE1)(ゲノム塩基配列のAccession number: D50409、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: Q68749)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号8に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が2k型であるHCV(isolate VAT96)(ゲノム塩基配列のAccession number: AB031663、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA88057)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号9に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が3a型であるHCV(isolate HCV-K3a/650)(ゲノム塩基配列のAccession number: D28917、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: Q81495)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号10に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が3b型であるHCV(isolate Tr Kj)(ゲノム塩基配列のAccession number: D49374、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA08372)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号11に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が4a型であるHCV(isolate 02-42)(ポリプロテインcds領域の塩基配列のAccession number: DQ418783、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABD75825)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号12に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が4d型であるHCV(ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABD75828)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号13に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が5a型であるHCV(isolate EUH1480)(ポリプロテイン・コード領域塩基配列のAccession number: Y13184、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: CAA73640)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号14に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が6a型であるHCV(isolate EUHK2)(ポリプロテイン・コード領域塩基配列のAccession number: Y12083、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: CAA72801)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号15に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が6b型であるHCV(isolate Th580)(ゲノム塩基配列のAccession number: D84262、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA32664)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号16に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が6f型であるHCV(isolate C-0044)(ゲノム塩基配列のAccession number: DQ835760、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABI36963)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号17に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が6g型であるHCV(isolate JK046)(ゲノム塩基配列のAccession number: D63822、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA09891)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号18に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が6h型であるHCV(isolate VN004)(ゲノム塩基配列のAccession number: D84265、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA32667)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号19に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が6i型であるHCV(isolate C-0159)(ゲノム塩基配列のAccession number: DQ835762、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABI36965)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号20に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が6k型であるHCV(isolate VN405)(ゲノム塩基配列のAccession number: D84264、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA32666)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号21に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が6l型であるHCV(isolate 537796)(ゲノム塩基配列のAccession number: EF424628、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABP88847)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号22に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が6m型であるHCV(isolate C-0208)(ゲノム塩基配列のAccession number: DQ835763、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABI36966)のNS4Bのアミノ酸配列である。配列番号23に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が6o型であるHCV(isolate QC227)(ゲノム塩基配列のAccession number: EF424627、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABP88846)のNS4Bのアミノ酸配列である。図3に、配列番号2~23に示されるアミノ酸配列について、アライメント解析を行った結果が示されている。図3に示される配列は、上から順に、配列番号3、2、4~23に示すアミノ酸配列である。上記の通り、配列番号2~23に示されるNS4Bのアミノ酸配列は、上記遺伝子型(サブタイプ)の特定のHCVに由来するものであるが、上記以外の遺伝子型(サブタイプ)のHCVが多数存在し、さらに、同じ遺伝子型(サブタイプ)の中でも塩基配列及びアミノ酸配列が異なるものも存在する。本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号2~23に基づいて設計してもよいが、その他公知のNS4Bのアミノ酸配列に基づいて設計してもよい。
 本発明において、(B)に規定されるタンパク質は、(A)に規定されるタンパク質において、配列番号2における上記第50番から第73番までのアミノ酸配列の領域(ポリペプチド(a)に存在する領域)、及び/又は上記第218番から第261番までのアミノ酸配列の領域(ポリペプチド(b)に存在する領域)中に1もしくは数個のアミノ酸が、欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質である。ここで、「1もしくは数個」の範囲は、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示す限り、特に限定されない。例えば、上記第50番から第73番までのアミノ酸配列の領域(ポリペプチド(a)に存在する領域)について言えば、1から20個、好ましくは1から9個、より好ましくは1から5個、特に好ましくは1から4個、1から3個、1から2個、1個とすることができる。一方、上記第218番から第261番までのアミノ酸配列の領域(ポリペプチド(b)に存在する領域)について言えば、例えば、1から40個、好ましくは1から30個、より好ましくは1から20個、さらに好ましくは1から9個、特に好ましくは1から5個、1から4個、1から3個、1から2個、1個とすることができる。さらに、本発明のタンパク質(B)において上記第50番から第73番までのアミノ酸配列の領域、及び/又は上記第218番から第261番までのアミノ酸配列の領域中に、このようなアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加がある場合において、アミノ酸配列X1 n及びX2 mの好ましい配列は、上記タンパク質(A)について記載した通りである。
 さらに、図3のアライメント解析の結果を考慮すると、(B)に規定されるタンパク質は、例えば、配列番号2における上記第50番から第70番までのアミノ酸配列の領域において、第51番目のアラニン(A)がヒスチジン(H)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、チロシン(Y)又はトレオニン(T)に置換され;第52番目のリシン(K)がグルタミン(Q)に置換され;第53番目のヒスチジン(H)がグルタミン(Q)に置換され;第54番目のメチオニン(M)がロイシン(L)に置換され;第58番目のイソロイシン(I)がバリン(V)に置換され;及び/又は第73番目のアスパラギン(N)がセリン(S)に置換されたものが挙げられる。
 また、図3のアライメント解析の結果を考慮すると、(B)に規定されるタンパク質は、例えば、配列番号2における上記第218番から第261番までのアミノ酸配列の領域において、第218番目のバリン(V)がグリシン(G)に置換され;第219番目のセリン(S)がアラニン(A)に置換され;第221番目のトレオニン(T)がアラニン(A)に置換され;第225番目のプロリン(P)がトレオニン(T)又はアラニン(A)に置換され;第227番目のセリン(S)がトレオニン(T)に置換され;第229番目のアラニンがトレオニン(T)に置換され;第230番目のアラニン(A)がセリン(S)に置換され;第231番目のアラニン(A)がバリン(V)、グルタミン(Q)、リシン(K)、アスパラギン(N)又はアルギニン(R)に置換され;第232番目のアルギニン(R)がリシン(K)、アスパラギン(N)、アラニン(A)又はグルタミン(Q)に置換され;第233番目のバリン(V)がイソロイシン(I)に置換され;第234番目のトレオニン(T)がメチオニン(M)に置換され;第235番目のグルタミン(Q)がヒスチジン(H)、アラニン(A)、リシン(K)、アスパラギン(N)、トレオニン(T)又はセリン(S)に置換され;第236番目のイソロイシン(I)がロイシン(L)に置換され;第238番目のセリン(S)がトレオニン(T)又はグリシン(G)に置換され;第242番目のイソロイシン(I)がバリン(V)に置換され;第244番目のグルタミン(Q)がセリン(S)又はアルギニン(R)に置換され;第246番目のロイシン(L)がプロリン(P)に置換され;第247番目のリシン(K)がアルギニン(R)に置換され;第248番目のアルギニン(R)がリシン(K)に置換され;第251番目のグルタミン(Q)がバリン(V)、アスパラギン(N)、アラニン(A)、トレオニン(T)、リシン(K)、グルタミン酸(E)又はヒスチジン(H)に置換され;第253番目のイソロイシン(I)がバリン(V)に置換され;第254番目のアスパラギン(N)がセリン(S)、トレオニン(T)、グリシン(G)又はヒスチジン(H)に置換され;第255番目のグルタミン酸(E)がセリン(S)、グリシン(G)又はトレオニン(T)に置換され;第256番目のアスパラギン酸(D)がグルタミン酸(E)に置換され;第257番目のシステイン(C)がチロシン(Y)、トレオニン(T)又はトリプトファン(W)に置換され;第258番目のセリン(S)がトレオニン(T)、プロリン(P)又はアラニン(A)に置換され;及び/又は第259番目のトレオニン(T)がアラニン(A)、イソロイシン(I)、バリン(V)又はセリン(S)に置換されたものが挙げられる。
 本発明において、(C)に規定されるタンパク質は、上記(A)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質である。(C)に規定されるタンパク質は、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質であって、上記(A)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上の配列相同性を有する。本発明において「配列相同性」という語は、2以上のアミノ酸配列の互いに対する同一性の程度を指す。したがって、ある二つのアミノ酸配列の相同性が高い程、それらの配列の同一性又は類似性は高い。2種類のアミノ酸配列が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較によって解析することが可能であり、具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて解析することができる。
 さらに、本発明のタンパク質は、上記タンパク質(A)、(B)又は(C)と、標識タンパク質及び/又はアフィニティタグとの融合タンパク質を含む。本発明の融合タンパク質において、標識タンパク質及び/又はアフィニティタグは、上記タンパク質(A)、(B)又は(C)のN末端側及び/又はC末端側に位置し得る。また、本発明の融合タンパク質は、当該タンパク質が脂肪滴への特異的局在性を有する限りにおいて、複数種の標識タンパク質及び/又はアフィニティタグも含み得る。本発明の融合タンパク質において、上記タンパク質(A)、(B)又は(C)と標識タンパク質及び/又はアフィニティタグとは直接連結していてもよいし、各種リンカーを介して結合していてもよい。
 上記標識タンパク質としては、蛍光タンパク質が挙げられ、その具体例としては、GFP、EBFP、EGFP、EYFP、ECFP、RFP、mWasabi、AmCyan、ZsGreen、ZsYellow、DsRed、AsRed、HcRed、JRed、mCherry、mRuby、mStrawberry、mPlum、mOrange、mBanana、Dendra2、E2-Crimson、mRasberry、tdTomatoなどが挙げられる。上記アフィニティタグの例としては、Hisタグ、HAタグ、mycタグ、FLAGタグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、Eタグ、Sタグ、HSVタグ、Haloタグ等が挙げられる。
 さらに、本発明のタンパク質は、上記タンパク質(A)、(B)若しくは(C)、又は上記融合タンパク質が被導入物質により修飾されたものを含む。標的細胞において所望の被導入物質を脂肪滴に局在させることが可能となるからである。被導入物質の具体例としては、脂肪を分解する物質(例えば、各種リパーゼ)、ビオチン等のタンパク質標識化合物、蛍光化合物等が挙げられる。脂肪を分解する物質で修飾された本発明のタンパク質の用途としては、例えば、肥満の治療又は予防が想定される。蛍光化合物により標識された本発明のタンパク質の用途としては、細胞内における脂肪滴の可視化(イメージング)が想定される。蛍光化合物の具体例としては、フルオロセイン(fluorescein)、ローダミン(rhodamine)、Cy色素(例えば、Cy3、Cy 5)、アレクサ色素等が挙げられる。
 本発明のタンパク質は、公知の各種遺伝子工学的技術により製造してもよいし、化学合成により製造してもよい。
 本発明者は、後述の実施例に示す通り、1b型であるHCV-O株の全長を含むプラスミドpON/C-5B/KE (Ikeda M. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 329(2005)1350-1359)を鋳型DNAとして、NS4Bコード領域のうち、そのN末端領域及びC末端領域をPCRによりそれぞれ増幅し、オーバーラップPCRにより各断片を連結した。次いで、連結した断片を、各種発現ベクターに増幅断片を導入することにより、本発明の一例であるタンパク質をコードする哺乳動物発現プラスミドを作成した。しかしながら、本発明のタンパク質を遺伝子工学的に作成する上で、出発材料は上記プラスミドに限定されるものでもなく、その具体的な発現系の構築方法も上記方法に限定されるものではない。
 上述のタンパク質(A)、(B)若しくは(C)、又は上記融合タンパク質をコードする核酸(DNA又はRNA)を作成し、公知の各種発現ベクターに組み込むことにより、本発明のタンパク質を発現させることができる。本発明のタンパク質をコードする核酸を作成する上で、アミノ酸の欠失、置換及び/または付加を施すためには、例えば、エラープローンPCR法、DNAシャッフリング法、各種部位特異的変異導入法などにより、任意の塩基の欠失、置換及び/または挿入を行うことができる。
 本発明において用いられる発現ベクターの種類は特に限定されず、細菌(例えば、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis))、真菌類(例えば、酵母類)等の微生物、植物、昆虫細胞、哺乳細胞などのホストにおいてタンパク質の発現を可能とする各種発現ベクターを用いることができ、ウイルスベクター(ファージベクターを含む)でもプラスミドベクターであってもよい。あるいは、ウサギ網状赤血球ライセート、小麦胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いた無細胞タンパク質合成系を用いて、本発明のタンパク質を製造することもできる。このうち、本発明のタンパク質を用いて哺乳細胞の脂肪滴を観察又は解析する場合には、哺乳細胞発現用のプラスミドベクター又はウイルスベクターを用いることが好ましい。哺乳細胞において本発明のタンパク質を発現させると、発現した本発明のタンパク質は細胞内の脂肪滴に特異的に局在する。したがって、本発明のタンパク質をコードする核酸を哺乳細胞発現用のプラスミドベクター又はウイルスベクターに組み込み、該プラスミドベクター又はウイルスベクターを哺乳細胞で形質転換すれば、本発明のタンパク質を哺乳細胞において直接発現させることが可能であり、発現した本発明のタンパク質は細胞内の脂肪滴に特異的に局在し、哺乳細胞の脂肪滴を観察又は解析することができる。また、脂肪滴は、哺乳細胞だけでなく、広く真核生物(植物を含む)や原核生物(例えば、細菌)にも存在することが知られている(Murphy DJ: Prog. Lipid Res. 40, 325-438, 2001)。細胞内に脂肪滴を有する生物種をホストとして、それらの生物種に応じた各種タンパク質発現ベクターを用い、本発明のタンパク質を発現させてもよい。各種生物種において発現した本発明のタンパク質は、細胞内の脂肪滴に局在し、それら生物種の脂肪滴を観察又は解析することができる。
 また、上記タンパク質(A)、(B)又は(C)と蛍光タンパク質との融合タンパク質を、所望の哺乳細胞において発現させれば、直接的に、脂肪滴を可視化することができる。また、上記タンパク質(A)、(B)又は(C)とアフィニティタグとの融合タンパク質を遺伝子工学的に発現させた場合には、各種アフィニティ精製法により、本発明のタンパク質を精製することが可能となる。
 本発明のタンパク質は、上記の通り、所望の哺乳細胞において直接発現させることにより、脂肪滴の解析等に用いることも可能である。しかしながら、各種公知の方法により精製した本発明のタンパク質を、所望の哺乳細胞における脂肪滴の解析等に用いることもできる。具体的には、精製した本発明のタンパク質を所望の哺乳細胞へ導入することにより、細胞内脂肪滴の解析等を行うことができる。精製した本発明のタンパク質を所望の哺乳細胞へ導入するためには、例えば、脂質ベースのタンパク質導入試薬等を用いることができる。このようなタンパク質導入試薬は、試薬メーカーから入手可能である(例えば、LSin(PPU 社);Pro-DeliverIN(OZB 社);BioPORTER Protein Delivery Reagent(GTS 社);アパキャリー1(CLG 社);Ab-DeliverIN(OZB 社))。
 本発明のタンパク質は、細胞内脂肪滴に特異的な局在性を示すことから、生細胞又は固定細胞において、脂肪滴の可視化(イメージング)ツールとして用いることができる。具体的には、上記タンパク質(A)、(B)若しくは(C)に対する抗体、又はそれに融合させる標識タンパク質若しくはアフィニティタグに対する抗体を用いて、本発明のタンパク質を導入した細胞を免疫染色すれば、脂肪滴を可視化することができる。免疫染色の方法は公知の手法を用いることができる。また、本発明のタンパク質に蛍光タンパク質を融合させたものを細胞で発現させ、共焦点レーザー顕微鏡等を用いて該細胞を観察すれば、細胞内脂肪滴の精彩なイメージングが可能となる。さらに、本発明のタンパク質を蛍光化合物等で修飾したものを細胞に導入することによっても、同様に細胞内脂肪滴の精彩なイメージングが可能となる。
 さらに、本発明のタンパク質は細胞内脂肪滴に特異的な結合能力を有することから、脂肪分解物質(例えば、リパーゼ)等の被導入物質で修飾した本発明のタンパク質を脂肪細胞などの標的細胞に導入し、細胞内脂肪滴を分解することにより、肥満などの疾患の治療又は予防を行うことも可能となる。
 上述の通り、本発明のタンパク質は、細胞内脂肪滴の可視化ツール、薬物を含む被導入物質を脂肪滴に送達させるための薬物送達ツール等として用いることができる。
 また、本発明の別の態様は、以下のタンパク質に関する
 (1)配列番号2~10及び12~23のいずれかに表されるアミノ酸配列の第1番から第73番までのアミノ酸配列において、第43番、第46番、第50番、第57番、第61番及び第64番のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに変異したタンパク質;又は配列番号11に表されるアミノ酸配列の第1番から第72番までのアミノ酸配列において、第43番、第49番、第56番、第60番及び第63番のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに変異したタンパク質。
(2)配列番号2~10及び12~23のいずれかに表されるアミノ酸配列の第192番から第261番までのアミノ酸配列において、第242番、第246番、第249番及び第253番のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに変異したタンパク質;又は配列番号11に表されるアミノ酸配列の第191番から第260番までのアミノ酸配列において、第241番、第245番、第248番及び第252番のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに変異したタンパク質。
(3)配列番号2~10及び12~23のいずれかに表されるアミノ酸配列の第1番から第73番までのアミノ酸配列のC末端に、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表されるアミノ酸配列の第192番から第261番までのアミノ酸配列のN末端が結合してなるアミノ酸配列において、第43番、第46番、第50番、第57番、第61番、第64番、第242番、第246番、第249番及び第253番のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに変異したタンパク質;又は配列番号11に表されるアミノ酸配列の第1番から第72番までのアミノ酸配列のC末端に、配列番号11に表されるアミノ酸配列の第191番から第260番までのアミノ酸配列のN末端が結合してなるアミノ酸配列において、第43番、第49番、第56番、第60番、第63番、第241番、第245番、第248番及び第252番のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに変異したタンパク質。
 上記(1)のタンパク質において、例えば、第43番、第46番及び第50番(第49番)のアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよいし、第57番(第56番)、第61番(第60番)及び第64番(第63番)が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよいし、あるいは、第43番、第46番、第50番(第49番)、第57番(第56番)、第61番(第60番)及び第64番(第63番)のアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよい。
 上記(2)のタンパク質において、例えば、第242番(第241番)、第246番(第245番)、第249番(第248番)及び第253番(252番)のアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよい。
 上記(3)のタンパク質において、例えば、第43番、第46番、第50番(第49番)、第57番(第56番)、第61番(第60番)及び第64番(第63番)のアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよいし、第43番、第46番、第50番(第49番)、第57番(第56番)、第61番(第60番)、第64番(第63番)、第242番(第241番)、第246番(第245番)、第249番(第248番)及び第253番(252番)のアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよいし、あるいは、第43番、第46番、第50番(第49番)、第242番(第241番)、第246番(第245番)、第249番(第248番)及び第253番(252番)のアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよい。
 上記(1)、(2)及び(3)のタンパク質において、各基準となるアミノ酸配列は配列番号2から選ばれることが好ましい。さらに、上記(1)、(2)及び(3)のタンパク質において、上記したアミノ酸の変異は、アラニンによる変異であることが好ましい。
 さらに、本発明は、上記(1)、(2)又は(3)のタンパク質をコードする核酸に関する。
 さらに、本発明は上記核酸を含む、発現用ベクターに関する。また、本発明は、前記発現用ベクターにより形質転換体に関する。
 以下、本発明について、実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
1.C型肝炎ウイルスO株の配列
 本実施例では、1b型のHCV-O株(DDBJ/EMBL/GenBank Accession number, AB191333, Ikeda et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 329, 1350-1359, 2005)の配列を用いた。
 NS4Bはこの配列のヌクレオチド番号5475~6257によってコードされるタンパク質であり、261アミノ酸から成る。HCV-O株NS4Bのヌクレオチド配列を図1及び配列番号1に示す。また、HCV-O株NS4Bのアミノ酸配列を図2及び配列番号2に示す。
2.NS4Bの機能領域(ドメイン)の設定
 NS4Bは小胞体(ER;endoplasmic reticulum)に局在する膜タンパク質であり、その中央部がER膜に埋め込まれ、N末端側の一部とC末端側の一部が細胞質側に出ていると考えられている。つまり、NS4Bタンパク質は、N末端側細胞質ドメイン(4BN)、膜貫通ドメイン(4BTM)、及びC末端側細胞質ドメイン(4BC)の三つの領域に分類することができる(図4参照)。
 現在、NS4Bの結晶構造解析が為されていないため、正確な立体構造は不明である。4BNと4BTMの境界はアミノ酸残基70~75番付近と考えられているが定まっていない。複数のタンパク質二次構造予測プログラムでアミノ酸残基74番からαへリックスが始まることが予測されている(Gouttenoire et al, J. Virol. 83, 6257-6268, 2009)。そこで、このαへリックスを最初の膜貫通αへリックスと考え、アミノ酸残基1~73を4BNとした。4BTMと4BCの境界は配列の特徴からおおむねコンセンサスが得られており、4BTMはアミノ酸残基74~191、4BCはアミノ酸残基192~261とした(Jones et al, J. Virol. 83, 2163-2177, 2009)。下記の通り、これらの各領域と蛍光タンパク質との融合タンパク質を作出した。さらに、NS4Bの全長アミノ配列(アミノ酸残基1~261)からなる4Bfull、アミノ酸残基1~25からなる4B1(4BNの一部)、アミノ酸残基26~49からなる4B2(4BNの一部)、アミノ酸残基50~73からなる4B3(4BNの一部)、アミノ酸残基1~49からなる4B1-2(4BNの一部)、アミノ酸残基26~73からなる4B2-3(4BNの一部)、アミノ酸残基192~217からなる4B9(4BCの一部)、アミノ酸残基218~239からなる4B10(4BCの一部)、アミノ酸残基240~261からなる4B11(4BCの一部)、アミノ酸残基192~239からなる4B9-10(4BCの一部)、アミノ酸残基218~261からなる4B10-11(4BCの一部)についても、同様に蛍光タンパク質との融合タンパク質を作出した。蛍光タンパク質として例えばmCherryを用いる場合、各融合タンパク質は、Cherry-に領域名を付してCherry-4BNなどの名前で表す。
3.4Bfull、4BN、4BTM、4BC、4B1、4B2、4B3、4B1-2、4B2-3、4B9、4B10、4B11、4B9-10、4B10-11をコードする遺伝子断片の作製
 NS4Bの各領域をPCRにより増幅した。各増幅断片を蛍光タンパク質発現ベクターに組み込むために、PCRに用いたプライマーには制限酵素認識配列を付加した(U側:Bgl II サイト, R側:Eco RIサイト)。また、R側プライマーでは4B配列の最後に終止コドンを挿入した。鋳型として、HCV-O株の全長を含むプラスミドpON/C-5B/KE (Ikeda M. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 329(2005)1350-1359)又は以下に示す各プラスミドを用い、DNAポリメラーゼは高フィデリティのPrimeSTAR HS DNA polymerase (タカラバイオ社、以下PSと略す)を用いた。
 以下に、各プライマーの配列を示す。
4Bfull用プライマー
 U側 5'-TTTAGATCTGCCTCGCACCTCCCTTAC-3'(配列番号24)(4BN用U側プライマー)
 R側 5'-TTTGAATTCTTAGCATGGCGTGGAGCAGTC-3'(配列番号29)(4BC用R側プライマー)
4BN用プライマー
 U側   5'-TTTAGATCTGCCTCGCACCTCCCTTAC-3'(配列番号24)
 R側   5'-TTTGAATTCTTAGTTCCCAGGCAGAGTGGA-3'(配列番号25)
4BTM用プライマー
 U側  5'-TTTAGATCTCCCCCGATAGCTTCACTG-3'(配列番号26)
 R側    5'-TTTGAATTCTTACAGTATTGCCGCGCACAC-3'(配列番号27)
4BC用プライマー
 U側  5'-TTTAGATCTCGCCGGCACGTGGGC-3'(配列番号28)
 R側    5'-TTTGAATTCTTAGCATGGCGTGGAGCAGTC-3'(配列番号29)
4B1用プライマー
 U側:4BN用U側プライマー
 R側:5'-TTTGAATTCTTACAGCAACCCGAGCGCCTT-3'(配列番号30)
 鋳型:Cherry-4BNプラスミド
4B2用プライマー
 U側:4B2-3用U側プライマー
 R側:5'-TTTGAATTCTTAAAAGGCCTCAAGGGCTTGC-3'(配列番号31)
 鋳型:Cherry-4BNプラスミド
4B3用プライマー
 U側  5'-TTTAGATCTTGGGCGAAGCACATGTGG-3'(配列番号32)
 R側   4BN用のR側プライマー
4B1-2用プライマー
 U側:4BN用U側プライマー
 R側:4B2用R側プライマー
 鋳型:Cherry-4BNプラスミド
4B2-3用プライマー
 U側  5'-TTTAGATCTCAAGCAGCCACCAAGCAAG-3'(配列番号33)
 R側   4BN用のR側プライマー
4B9用プライマー
 U側:4BC用U側プライマー
 R側:5'-TTTGAATTCTTAATGGTTACCCCGCGAAGCG-3'(配列番号34)
 鋳型:Cherry-4BCプラスミド
4B10用プライマー
 U側:4B10-11用U側プライマー
 R側:5'-TTTGAATTCTTAGCTGGAGAGGATCTGAGTG-3'(配列番号35)
 鋳型:Cherry-4BCプラスミド
4B11用プライマー
 U側:5'-TTTAGATCTCTTACCATCACCCAGCTGTT-3'(配列番号36)
 R側:4BC用R側プライマー
 鋳型:Cherry-4BCプラスミド
4B9-10用プライマー
 U側:4BC用U側プライマー
 R側:4B10用R側プライマー
 鋳型:Cherry-4BCプラスミド
4B10-11用プライマー
 U側  5'-TTTAGATCTGTTTCCCCCACGCACTATG-3'(配列番号37)
 R側   4BC用のR側プライマー
(反応液の組成)
 PSバッファー10μL、dNTP(各2.5 mM)4μL、U側プライマー(0.1 mM)0.4μL、R側プライマー(0.1 mM)0.4μL、鋳型プラスミド10ng、PS 0.5μL、残部を超純水とし、最終容量を50μLとしてPCR反応を行った。
(PCR反応)
 それぞれのプライマーペアを含む上記の反応液を作製し(4Bfull用、4BN用、4BTM用、4BC用、4B1用、4B2用、4B3用、4B1-2用、4B2-3用、4B9用、4B10用、4B11用、4B9-10用、4B10-11用)、98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃5秒、72℃30秒}を25サイクル繰返した。
4.4BNCをコードする遺伝子断片の作製
 4BNCとは、4BNと4BCを連結した配列である(図5参照)。4BNの3’側と4BCの5’側で配列が一部重複するような二つの断片を作製すれば、その二つの断片を直接PCRで連結できる。これら二つの断片を以下に示すプライマーを用いて、PCRにより作成した。
4BN側断片用プライマー
 U側    4BN用のU側プライマー
 R側  5'-CTCCCCCGGGCCCACGTGCCGGCGGTTCCCAGGCAGAGTGGA-3'(配列番号38)
4BC側断片用プライマー
 U側    5'-CGCCGGCACGTGGGCC-3'(配列番号39)
  R側  4BC用のR側プライマー
 まず、4BN側断片と4BC側断片を各々PCRで作成する。上記に示すプライマーを使用した以外、反応液組成及び反応条件は上記3.に準じたものである。PCR反応後、MARLIGEN 社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。次に各断片の連結PCRを行った。
(各断片の連結PCRのための反応液)
 PSバッファー10μL、dNTP(各2.5 mM)4μL、4BN側精製断片200ng、4BC側精製断片200ng、PS 0.5μLとし、超純水で最終容量を50μLとしてPCR反応を行った。
(連結PCRの反応条件)
 98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃20秒、72℃60秒}を6サイクル繰返した。このPCR反応により、4BN側断片と4BC側断片を連結した。
 上記の連結PCRの後、反応液に、直接、以下のプライマーを加え、増幅PCRを行う。
 U側プライマー 4BN用のU側プライマー (0.1 mM) 0.4μL
 R側プライマー 4BC用のR側プライマー (0.1 mM) 0.4μL
(増幅PCRの反応条件)
 98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃5秒、72℃60秒}を8サイクル繰り返した。この反応により、4BNCをコードするDNA断片を得た。
5.各NS4B断片の蛍光タンパク質発現プラスミドへの組み込み
 蛍光タンパク質発現用ベクターは、pmCherry-C1とpEGFP-C1 (いずれもClontech社)とを用いた。
 ベクターは定法によりBgl IIおよびEco RIで消化後、Calf intestine alkaline phosphatase (TOYOBO社)で処理し、さらにアガロースゲル電気泳動を行い、ゲルよりベクターDNAを切り出し、QIAGEN社 MinElute gel extraction kitによって精製した。TEバッファー(10 mM Tris-Cl pH 7.4, 1 mM EDTA) でDNA濃度が50ng/μLになるように調整した。
 上記の各PCR産物(4Bfull、4BN、4BTM、4BC、4B1、4B2、4B3、4B1-2、4B2-3、4B9、4B10、4B11、4B9-10、4B10-11、4BNC)は、MARLIGEN 社Rapid PCR purification systemキットで精製した。次いで、各PCR産物について、定法によりBgl IIおよびEco RIで消化し、さらにアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを切り出してQIAGEN社 MinElute gel extraction kitによって精製した。TEバッファー(10 mM Tris-Cl pH 7.4, 1 mM EDTA) でDNA濃度が50ng/μlになるように調整する。
 上記の処理後ベクター0.5μL(25ng)、 処理後PCR断片0.5μL(25ng)、Ligation High 1μL(TOYOBO社)を混合し、16℃で、30分間ライゲーション反応を行った。
 ライゲーションしたDNAを、エレクトロポレーションにより、TG1株大腸菌にトランスフォームした(Tanaka et al, Nihon Univ. J. Med. 47, 43-56, 2005)。トランスフォームした菌体はカナマイシン 25μg/mLを含むLBプレート上で選択し、得られたコロニーを1mlスケールで培養し、プラスミドDNAをMarligen社Rapid plasmid miniprep systemにより抽出した。
 BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kitによりベクターに挿入されたNS4B各断片のヌクレオチド配列が正しいことを確認した。塩基配列の決定には、以下のプライマーを用いた。
pmCherry-C1用
 U側  5'-GTGGAACAGTACGAACGC-3'(配列番号40)
 R側  5'-TGTGGGAGGTTTTTTAAAGC-3'(配列番号41)
pEGFP-C1用
 U側  5'-AGCGCGATCACATGGTCC-3'(配列番号42)
 R側  5'-CTCTACAAATGTGGTATGGC-3'(配列番号43)
 正しい配列を確認した後、50 ml の培養スケールで形質転換体を培養し、Machery-Nagel社 Nucleobond PC500キットでプラスミドを抽出した。得られたプラスミドを定法によりフェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、1μg/μLの濃度になるようにTEバッファーに溶解した。
6.各コンストラクトの細胞へのトランスフェクション
 各コンストラクトは便宜上、以下の名前で表す。
 Cherry-4Bfull、Cherry-4BN、Cherry-4BTM、Cherry-4BC、Cherry-4B1、Cherry-4B2、Cherry-4B3、Cherry-4B1-2、Cherry-4B2-3、Cherry-4B9、Cherry-4B10、Cherry-4B11、Cherry-4B9-10、Cherry-4B10-11、Cherry-4BNC、
 EGFP-4BN、EGFP-4BTM、EGFP-4BC、EGFP-4B2-3、EGFP-4B3、EGFP-4B10-11、EGFP-4BNC
 実験には脂肪滴を豊富に持つOc細胞(Ikeda et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 329, 1350-1359, 2005)を用いた。蛍光顕微鏡で観察可能なガラス底の24ウェルプレート(EZViewカルチャープレートLBガラスボトム、IWAKI社)に70~80%コンフルエントになるようOc細胞を播き、Lipofectamin 2000 (Invitrogen社)を用いてプロトコールに従い、各プラスミドをトランスフェクションした。1ウェルあたりプラスミ1.6μg、Lipofectamin 2000を4.0μL使用した。トランスフェクションの24時間または48時間後に、各Oc細胞を観察した。
7.細胞の固定、染色
 細胞をTBS(20 mM Tris-Cl pH 7.4, 0.15 M NaCl)でリンスした後、4%パラフォルムアルデヒドで15分間固定した。全ての反応はシーソーシェーカー上で行った。
 上記Cherry融合タンパク質を発現させた細胞については、脂肪滴をBodipy493/503 (Invitrogen社)で20分間染色した(Ohsaki et al, Histochem. Cell Biol. 124, 445-452, 2005)。
 上記EGFP融合タンパク質を発現させた細胞については、脂肪滴膜を抗ADRP抗体で染色した。固定後0.01% digitonin /TBS で30分インキュベートし、1% BSA/TBSで1時間ブロッキングした。抗ADRP抗体(Acris社)/1% BSA/TBS(抗体終濃度5μg/mL)で1時間インキュベートし、次に2次抗体として抗mouse IgG-AlexaFluor 647 (Invitrogen社) 1000倍希釈/1% BSA/TBSで30分間インキュベートした。
 いずれの場合も、核をHechst 33342色素(終濃度5μg/mL TBS)で20分間染色した。
8.顕微鏡観察
 上記細胞を、共焦点レーザー走査型顕微鏡(FV1000, オリンパス社)を用いてシークエンシャルスキャンモードで鏡検した。
9.NS4B-Cherry融合タンパク質の脂肪滴局在についての定量的解析の方法
 細胞数あたりどれぐらいの頻度で、Cherry-4Bfull、Cherry-4BN、Cherry-4BTM、Cherry-4BC、Cherry-4B1、Cherry-4B2、Cherry-4B3、Cherry-4B1-2、Cherry-4B2-3、Cherry-4B9、Cherry-4B10、Cherry-4B11、Cherry-4B9-10、Cherry-4B10-11、Cherry-4BNCが脂肪滴膜へ局在するかをカウントした。
 各サンプルで10~20視野鏡検し、Cherry融合タンパク質を発現しているすべての細胞について次の基準で判定した。
(1)カテゴリーA:Cherry融合タンパク質が脂肪滴膜のみに局在する。
(2)カテゴリーB:Cherry融合タンパク質が脂肪滴膜および他の部位(例えば細胞質、ERなど)に局在する。
(3)カテゴリーC:Cherry融合タンパク質が脂肪滴膜には局在せず、他の部位に局在する。
 共焦点顕微鏡(FV1000)による撮影は、PLAPO 100X OTIRFM 対物レンズにて、126.852μm×126.852μmを一視野(1024×1024 pixel)の画像として撮影し解析した。共焦点顕微鏡(FV1000)は、4種類の励起用レーザー(405nm、488nm、543nm、633nm;各々青色蛍光用、緑色蛍光用、赤色蛍光用、赤外部蛍光用)を持ち、各レーザー光によって励起されてサンプルより発せられる各蛍光を独立に撮像する。撮像後に、コンピュータによって各蛍光画像を作成した。なお、蛍光像は適宜色を選択して着色像を描くことができる。
 各融合タンパク質が脂肪滴に局在するか否かの判定は、すべてコンピュータの画像上で赤色蛍光像、緑色蛍光像、さらに両者のマージ(merge)像(合成像)を比較することにより行った。
 Cherry融合タンパク質を発現させた場合は、脂肪滴内部を染色するBodipyによる円形の緑色蛍光を縁取る、リング状の赤色蛍光像が得られた場合に、脂肪滴膜にCherry融合タンパク質が局在するものと判定した。
 EGFP融合タンパク質を発現させた場合は、EGFPの緑色蛍光とBodipyの緑色蛍光が区別できないため、脂肪滴膜を抗ADRP抗体およびローダミン(赤色蛍光)ラベル二次抗体で染色した後、蛍光の撮像を行った。この場合には、EGFP由来の緑色蛍光像として示されるリング状構造と、抗ADRP抗体で染色される脂肪滴膜のリング状の赤色蛍光像とが一致した場合に、EGFP融合タンパク質が脂肪滴膜に局在するものと判定した。
<結果>
1.4BNの細胞内局在
 Cherry-4BNをOc細胞にトランスフェクションし、24時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。図6に、観察された典型的細胞像を、Cherry-4BNを赤、Bodipy493/503を緑、コンピュータ上で赤と緑を重ね合わせた像(merge像)に核染色(青)を加えて示した。Cherry-4BNは緑で描出される脂肪滴の周囲に集積する明るい赤色の輪として描出される(つまり、脂肪滴膜に結合している)他、細胞質、細胞質の網状構造(ERと推定される)、核に分布する。なお、48時間後の観察でもほぼ同様の結果が得られたが、トランスフェクションのダメージと思われる細胞の変性が著しかった。以下24時間後の観察のみ示す。また、EGFP-4BNでもほぼ同様の結果を得た(データ省略)。
 データには示さないが、Cherryタンパク質単体では細胞全体(核に若干強い)に分布し、EGFPタンパク質単体も細胞全体に分布する。従って、図6の観察結果から、蛍光タンパク質に4BNを融合させることによって、脂肪滴膜およびERへ局在する性質が新たに生じたことがわかり、4BNは脂肪滴膜およびERに親和性を持つものと推定された。
2.4BCの細胞内局在
 Cherry-4BCをOc細胞にトランスフェクションし、24時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。図7に、観察された典型的細胞像を、Cherry-4BCを赤、Bodipy493/503を緑、コンピュータ上で赤と緑を重ね合わせた像(merge像)に核染色(青)を加えて示した。Cherry-4BCはCherry-4BNと同様に脂肪滴周囲に集積する他、細胞質、細胞質の網状構造(ERと推定される)に分布した。EGFP-4BCでもほぼ同様の結果を得た(データ省略)。上記4BNと同様に、4BCは脂肪滴膜およびERに親和性を持つものと推定される。
3.4BTMの細胞内局在
 Cherry-4BTMをOc細胞にトランスフェクションし、24時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。図8に、観察された典型的細胞像を、Cherry-4BTMを赤、Bodipy493/503を緑、コンピュータ上で赤と緑を重ね合わせた像(merge像)に核染色(青)を加えて示した。Cherry-4BTMは細胞質内で輪状の構造を示すが、この可視化された輪状構造は緑で示す脂肪滴とは全く無関係であった。EGFP-4BTMでもほぼ同様の結果が得られた(データ省略)。4BTMの局在部位は正確には同定できないが、おそらく4BTMによって形態変化を受けたERではないかと推定される。
4.4B2-3の細胞内局在
 EGFP-4B2-3をOc細胞にトランスフェクションし、24時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。色の関係上Bodipy493/503が使えないため、脂肪滴膜局在タンパク質のADRPに対する抗体を用いて脂肪滴の染色を行った。観察の結果、細胞内において、EGFP-4B2-3は、脂肪滴周囲への集積が認められたが、細胞質やERと推定される網目状構造にも分布した。
5.4B3の細胞内局在
 EGFP-4B3をOc細胞にトランスフェクションし、24時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。色の関係上Bodipy493/503が使えないため、脂肪滴膜局在タンパク質のADRPに対する抗体を用いて脂肪滴の染色を行った。観察の結果、細胞内において、EGFP-4B3は、脂肪滴周囲への集積が認められたが、細胞質やERと推定される網目状構造にも分布した。
6.4B10-11の細胞内局在
 EGFP-4B10-11をOc細胞にトランスフェクションし、24時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。色の関係上Bodipy493/503が使えないため、脂肪滴膜局在タンパク質のADRPに対する抗体を用いて脂肪滴の染色を行った。観察の結果、細胞内において、EGFP-4B10-11は、脂肪滴周囲への集積が認められたが、細胞質やERと推定される網目状構造にも分布した。
7.4BNCの細胞内局在
 Cherry-4BNCをOc細胞にトランスフェクションし、24時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。図9に、観察された典型的細胞像を、Cherry-4BNCを赤、Bodipy493/503を緑、コンピュータ上で赤と緑を重ね合わせた像(merge像)に核染色(青)を加えて示した。Cherry-4BNCは輪状に描出され、かつその位置は緑で示される脂肪滴と完全に一致していた。細胞内の他の部位にはほとんどCherry-4BNCの分布は見られなかった。Cherry-4BNCは脂肪滴の周囲に限局して分布し、すなわち脂肪滴膜に高度に特異的に結合することがわかった。
 EGFP-4BNCをOc細胞にトランスフェクションし、24時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。色の関係上Bodipy493/503が使えないため、脂肪滴膜局在タンパク質のADRPに対する抗体を用いて脂肪滴の染色を行った。図10に、観察された典型的細胞像を、EGFP-4BNCを緑、ADRPをマゼンタ色で示した。 EGFP-4BNCとADRPの分布はほぼ完全に一致し、脂肪滴膜へのEGFP-4BNCの結合を示すとともに、EGFP-4BNCの方がADFP抗体より精彩に脂肪滴膜を描出することがわかった。
 脂肪滴の乏しい他の細胞の例として、ヒト腎由来のHEK293細胞に脂肪酸(stearic acid 50μM)を添加して脂肪滴を誘導し、Cherry-4BNCを用いて上記同様の観察を行った。図11に、観察された典型的細胞像を、Cherry-4BNCを赤、Bodipy493/503を緑、コンピュータ上で赤と緑を重ね合わせた像(merge像)に核染色(青)を加えて示した。この観察結果から異なる細胞種においても高い特異性をもってCherry-4BNCが脂肪滴膜に結合することがわかった。
 図9、10、及び11に示す結果から、4BNCは脂肪滴膜のみに特異的に結合することが示された。
8.NS4B-Cherry融合タンパク質の脂肪滴局在についての定量的解析
 細胞数あたりどれぐらいの頻度でCherry-4Bfull、Cherry-4BN、Cherry-4BTM、Cherry-4BC、Cherry-4B1、Cherry-4B2、Cherry-4B3、Cherry-4B1-2、Cherry-4B2-3、Cherry-4B9、Cherry-4B10、Cherry-4B11、Cherry-4B9-10、Cherry-4B10-11、Cherry-4BNCが脂肪滴膜へ局在するかをカウントした結果は、以下の通りである。なお、各コンストラクトの構造は図12に示す。
(1)Cherry-4Bfull
  カテゴリーA: 0(細胞数)   0(%)
  カテゴリーB:12       20
  カテゴリーC:47       80
(2)Cherry-4BN
   カテゴリーA:17(細胞数) 25(%)
   カテゴリーB:50      75
   カテゴリーC: 0       0
(3)Cherry-4BC
   カテゴリーA: 0(細胞数)  0(%)
   カテゴリーB:30      41
   カテゴリーC:44      59
(4)Cherry-4BTM
  カテゴリーA: 0(細胞数)   0(%)
  カテゴリーB: 0        0
  カテゴリーC:48      100
(5)Cherry-4B1
  カテゴリーA: 0(細胞数)   0(%)
  カテゴリーB: 0        0
  カテゴリーC:62      100
(6)Cherry-4B2
  カテゴリーA: 0(細胞数)   0(%)
  カテゴリーB: 0        0
  カテゴリーC:62      100
(7)Cherry-4B3
  カテゴリーA: 0(細胞数)   0(%)
  カテゴリーB: 5        6
  カテゴリーC:73       94
(8)Cherry-4B9
  カテゴリーA: 0(細胞数)   0(%)
  カテゴリーB: 1        2
  カテゴリーC:51       98
(9)Cherry-4B10
  カテゴリーA: 0(細胞数)   0(%)
  カテゴリーB: 0        0
  カテゴリーC:60      100
(10)Cherry-4B11
  カテゴリーA: 0(細胞数)   0(%)
  カテゴリーB: 1        2
  カテゴリーC:52       98
(11)Cherry-4B1-2
  カテゴリーA: 0(細胞数)   0(%)
  カテゴリーB: 0        0
  カテゴリーC:43      100
(12)Cherry-4B2-3
  カテゴリーA: 0(細胞数)   0(%)
  カテゴリーB:38       61
  カテゴリーC:24       39
(13)Cherry-4B9-10
  カテゴリーA: 0(細胞数)   0(%)
  カテゴリーB: 0        0
  カテゴリーC:62      100
(14)Cherry-4B10-11
  カテゴリーA: 0(細胞数)   0(%)
  カテゴリーB: 4        6
  カテゴリーC:66       94
(15)Cherry-4BNC
   カテゴリーA:62(細胞数) 95(%)
   カテゴリーB: 3       5
   カテゴリーC: 0       0
 上記の結果によれば、4BNCは、95%(65細胞のうち62細胞)という高い確率で脂肪滴膜のみに特異的に結合することが示された。一方、Cherry-4BNについては、脂肪滴膜に局在性を示すものの、その他の部位にも局在性を示した細胞の方が多かった(75%)。さらに、Cherry-4BCに関しては、脂肪滴にのみ局在性を示した細胞の数は0であり、脂肪滴膜には局在せずに他の部位への局在が認められた細胞(カテゴリーC)が過半数を超えた(59%)。これらの結果からも、4BNCは脂肪滴膜のみに特異的に結合することが実証された。
 なお、NS4B全長をCherryに融合させたCherry-4Bfullは20%の細胞で脂肪滴への局在が観察された。図13に、観察された典型的細胞像を、Cherry-4Bfullを赤、Bodipy493/503を緑、コンピュータ上で赤と緑を重ね合わせた像(merge像)に核染色(青)を加えて示した。
 Cherry-4Bfull、Cherry-4BN、Cherry-4BTM、Cherry-4BC、Cherry-4B1、Cherry-4B2、Cherry-4B3、Cherry-4B1-2、Cherry-4B2-3、Cherry-4B9、Cherry-4B10、Cherry-4B11、Cherry-4B9-10、Cherry-4B10-11についての上記定量的解析の結果を図14に要約した。
<NS4Bにおける脂肪滴との相互作用に重要なアミノ酸残基の同定>
 上記の結果から、NS4Bにおいて脂肪滴局在のために重要なアミノ酸配列は、N末端領域では4B3部位(より強い局在を示すのは4B2-3部位)に存在し、C末端領域では4B10-11部位に存在することが推定できる(図14参照)。
 最近の報告において、タンパク質が脂肪滴に局在するときに、amphipathic α-helix(αへリックスを軸方向から見たときに、一方の側に疎水性アミノ酸残基が、他方の側に親水性アミノ酸残基が偏って存在する構造)が重要な働きをすることが示唆されている(Boulant et al, J. Biol. Chem. 281, 22236-22247, 2006; Shavinskaya et al, J. Biol. Chem. 282, 37158-37169, 2007)。
 NS4Bにおいて脂肪滴局在のために重要なアミノ酸配列が存在するものと推定される上記部位、すなわち4B2-3および4B10-11部位にもそれぞれ一つずつのamphipathic α-helixが存在することが知られている(Elazar et al, J. Virol. 78, 11393-11400, 2004; Gouttenoire et al, J. Virol. 83, 11378-11384, 2009)。当該部位をNS4B全体と対比させて図15に示す。
 そこで、上記の二つのamphipathic α-helixにおいて脂肪滴膜と相互作用する可能性のある疎水性残基を、長軸方向から見たアミノ酸配置図(図16)を参考にして選び出し、アラニンに置換する変異体を作製した。対象として選んだアミノ酸残基は43W, 46L, 50W, 57F, 61I, 64L, 242I, 246L, 249L, 253I,計10残基であった。
 ちなみにαへリックスにおいては、アミノ酸が1残基進むとちょうど100度長軸方向から見た角度がずれる。つまりアミノ酸3.6残基ごとに長軸方向からみて同じ位置に残基が出現する。従っておおむね3~4残基ごとのアミノ酸が同じ側に存在する。
 実施したアラニン置換は4B2-3領域ではW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64Aの全部または前半ないし後半の3残基ずつであり、4B10-11領域ではI242A, L246A, L249A, I253Aの全部である。
 これら変異をCherry-4BN、Cherry-4BCまたはCherry-4BNCに導入して脂肪滴への局在を共焦点顕微鏡によって解析した。
 細胞数あたりどれぐらいの頻度で各変異体が脂肪滴膜へ局在するかをカウントした結果を以下に示す(図17及び18を参照)。
(1)Cherry-4BN変異1(Cherry-4BNにW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64Aの変異を入れたもの)
  カテゴリーA: 0(細胞数)   0(%)
  カテゴリーB: 0        0
  カテゴリーC:58      100
(3)Cherry-4BN変異2(Cherry-4BNにW43A, L46A, W50Aの変異を入れたもの)
  カテゴリーA: 0(細胞数)   0(%)
  カテゴリーB:18       35
  カテゴリーC:33       65
(4)Cherry-4BN変異3(Cherry-4BNにF57A, I61A, L64Aの変異を入れたもの)
  カテゴリーA: 3(細胞数)   5(%)
  カテゴリーB:55       95
  カテゴリーC: 0        0
(5)Cherry-4BC変異1(Cherry-4BCにI242A, L246A, L249A, I253Aの変異を入れたもの)
  カテゴリーA: 0(細胞数)   0(%)
  カテゴリーB: 0        0
  カテゴリーC:65      100
(6)Cherry-4BNC変異1(Cherry-4BNCにW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64Aの変異を入れたもの)
  カテゴリーA: 9(細胞数)  17(%)
  カテゴリーB:41       77
  カテゴリーC: 3        6
(7)Cherry-4BNC変異2(Cherry-4BNCにW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A, I242A, L246A, L249A, I253Aの変異を入れたもの)
  カテゴリーA: 0(細胞数)   0(%)
  カテゴリーB: 5        8
  カテゴリーC:54       92
(8)Cherry-4BNC変異3(Cherry-4BNCにW43A, L46A, W50A, I242A, L246A, L249A, I253Aの変異を入れたもの)
  カテゴリーA:15(細胞数)  20.3(%)
  カテゴリーB:55       74.3
  カテゴリーC: 4        5.4
 Cherry-4BNにW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64Aの変異を入れたCherry-4BN変異1では脂肪滴への局在は全く見られなくなった。次に、この前半3残基のみの変異体つまりCherry-4BN変異2(Cherry-4BNにW43A, L46A, W50Aの変異を入れたもの)では、脂肪滴への局在は若干見られるもののCherry-4BNよりは大幅に減少していた。一方、後半3残基のみの変異体、つまりCherry-4BN変異3(Cherry-4BNにF57A, I61A, L64Aの変異を入れたもの)では、Cherry-4BNよりも若干脂肪滴への局在が弱まる程度であった。
 Cherry-4BCはCherry-4BNより弱いが脂肪滴への局在を示す。 Cherry-4BCにI242A, L246A, L249A, I253Aの変異を入れたCherry-4BC変異1は、脂肪滴への局在を全く示さなかった。
 本発明によるCherry-4BNCは特異的な脂肪滴への局在を示す。Cherry-4BNCにW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64Aの変異を入れたCherry-4BNC変異1は相対的に強い脂肪滴への局在を示した。これらの変異をCherry-4BNに入れた場合(すなわちCherry4BN変異1)は大幅に局在が弱まるのに対し、Cherry-4BNCにこれらの変異を入れた場合の影響は少なかった。つまりC末端領域(4B10-11)がかなり強い作用を持つことが推測された。そこで上記の変異に加え、C末端領域の4残基にも変異を入れたCherry-4BNC変異2(Cherry-4BNCにW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A, I242A, L246A, L249A, I253Aの変異を入れたもの)を作製して解析したところ、ほぼ完全に脂肪滴への局在が無くなった。念のため、N末端領域の前半3残基とC末端領域の4残基に変異を入れたCherry-4BNC変異3(Cherry-4BNCにW43A, L46A, W50A, I242A, L246A, L249A, I253Aの変異を入れたもの)についても観察を行ったが、脂肪滴への局在は相対的に強かった(つまり変異によって脂肪滴への局在が完全には阻害されなかった)。
 以上の結果から、αへリックスの一方の側に連続して出現してくる3ないし4つの疎水性アミノ酸を一つのクラスターとすると、43W, 46L, 50Wから成るクラスターが単独では最も強い脂肪滴局在能を持つと考えられる。
 単独では57F, 61A, 64Lのクラスターと242I, 246L, 249L, 253Iのクラスターは脂肪滴への局在能は強くないと考えられる。しかしながら、Cherry-4BNCにおいては、3つのクラスターを全て変異させないと脂肪滴への局在能は無くならないことから、単独では作用の強くないこれらのクラスター(57F, 61A, 64Lおよび242I, 246L, 249L, 253I)が、43W, 46L, 50Wから成るクラスターと協調的に作用することによって、全体としてはきわめて強い脂肪滴への局在を示すものと考えられる。
 なお、Cherry-4BNCにおいて上記3つのクラスターを変異させても、ごくわずか脂肪滴への局在活性が残っており、未同定の残基による弱い相互作用も推定される。
 上記の通り同定したアミノ酸残基(43W, 46L, 50W, 57F, 61A, 64L, 242I, 246L, 249L, 253I)は、HCVの各サブタイプ間で高度に保存されている(図19参照)。一部のサブタイプにおいて置換が見られるが、出現するアミノ酸残基は性質の類似した疎水性アミノ酸に限られている。従って、これらの残基によって仲介されるNS4Bと脂肪滴との相互作用(NS4Bの脂肪滴膜への局在)は、HCVが増殖する過程において極めて重要な役割を負っていることが推定される。このことは、逆にこれらのアミノ酸残基をターゲットにして脂肪滴への局在を阻害する方法を講じてやれば、HCVの増殖を抑制できることを示唆する。
 上記各変異体の作製方法については、以下に記載の通りである。
<変異体作製方法>
 アラニン残基のコドンには、すべて真核細胞でのコドン使用率の最も高いGCCを用いた。所定の位置にヌクレオチドの変異を含ませたプライマーを用いて適切なPCR断片を作製し、既述のように重複部分を利用して断片同志をさらにPCRで連結し、目的のDNA断片を作製した。以降は既述の方法に準じ制限酵素消化などの処理の後pmCherry-C1ベクターに断片を挿入し、完成コンストラクトを得た。全てのコンストラクトについて、プラスミドを精製し、DNAシークエンシングを行って所定の変異が成功していることを確認した。
 以下各コンストラクトの断片の作製方法を述べる。プライマー配列の下線部はアラニン置換変異に該当する部位を表す。
1. Cherry-4BN変異1(W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A)
・断片A(アミノ酸1-48)作製PCR
 U側:4BN用U側プライマー
 R側:5'-GGCCTCGGCGGCTTGGGCCTTGGACTCCACCACGGG-3'(配列番号44)
 Cherry-4B1-2プラスミド1ngを鋳型とし、98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃5秒、72℃30秒}の反応を28サイクル繰り返した。反応後、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
・断片B(アミノ酸43-64)作製PCR
 U側:5'-GCCCAAGCCGCCGAGGCCTTTGCCGCGAAGCACATGTGGAAT-3'(配列番号45)
 R側:5'-GGCGTACTGGGCCCCGCTGATGGCATTCCACATGTGCTTCGCG-3'(配列番号46)
 両者のプライマーが一部相補的配列を持つように設計してあり、鋳型を加えずに98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、50℃20秒、72℃30秒}の反応を10サイクル繰り返し、プライマーダイマーを形成させた。
・断片A、B連結及び増幅
 断片A(10 μL),断片B(4 μL)、PSバッファー10μL,dNTP(各2.5 mM),PS 0.5 μL,超純水で50μLとした反応液で98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、50℃20秒、72℃30秒}のPCR反応を10サイクル繰り返して断片A,Bを連結した。
 連結反応後、反応液に次のプライマー(0.1 mM)を0.4 μL ずつ加え、断片にさらに配列を付加しつつ増幅した。
 U側:4BN用U側プライマー
 R側:5'-TTTGAATTCTTAGTTCCCAGGCAGAGTGGACAAGCCTGCGGCGTACTGGGCCCCGCT-3'(配列番号47)
 98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃5秒、72℃30秒}のPCR反応を20サイクル繰り返した。反応後、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
2. Cherry-4BN変異2(W43A, L46A, W50A,)
・断片C(アミノ酸1-50)作製PCR
 U側:4BN用U側プライマー
 R側:5'-GGCAAAGGCCTCGGCGGCTTGGGCCTTGGACTCCACCACGGG-3'(配列番号48)
pcDNA4BFLAGプラスミド1ngを鋳型とし、98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃5秒、72℃45秒}のPCR反応を30サイクル繰り返した。反応後、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。上記pcDNA4BFLAGプラスミドは、pcDNA3.1(+)ベクター(Invitrogen社)に、NS4B全長配列とそのC末端部位にアミノ酸配列DYKDDDDK(FLAGタグ)を付加した配列を挿入してあるプラスミドである。
・断片D(アミノ酸43-73)作製PCR
 U側:断片B用U側プライマー
 R側:4BN用R側プライマー
 pcDNA4BFLAGプラスミド1ngを鋳型とし、98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃5秒、72℃45秒}のPCR反応を30サイクル繰り返した。
・断片C,D連結及び増幅
 断片C(10 μL)、断片D(5μL)、PSバッファー10μL,dNTP(各2.5 mM),PS 0.5 μL,超純水で50μLとした反応液で98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃20秒、72℃60秒}のPCR反応を10サイクル繰り返して断片C,Dを連結した。
 連結反応後、反応液に次のプライマー(0.1 mM)を0.4 μL ずつ加え、PCRで増幅した。
 U側:4BN用U側プライマー
 R側:4BN用R側プライマー
 98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃5秒、72℃60秒}のPCR反応を10サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
3. Cherry-4BN変異3(F57A, I61A, L64A)
・断片E(アミノ酸1-64)作製PCR
 U側:4BN用U側プライマー
 R側:5'-GGCGTACTGGGCCCCGCTGATGGCATTCCACATGTGCTTCGC-3'(配列番号49)
 pcDNA4BFLAGプラスミド1ngを鋳型とし、98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃5秒、72℃45秒}のPCR反応を30サイクル繰り返した。反応後、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
・断片F(アミノ酸57-73)作製PCR
 U側:5'-GCCATCAGCGGGGCCCAGTACGCCGCAGGCTTGTCCACTCTG-3'(配列番号50)
 R側:4BN用R側プライマー
 pcDNA4BFLAGプラスミド1ngを鋳型とし、98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃5秒、72℃45秒}のPCR反応を30サイクル繰り返した。
・断片E,F連結及び増幅
 断片E(5 μL),断片F(5 μL)、PSバッファー10μL,dNTP(各2.5 mM),PS 0.5 μL,超純水で50μlとした反応液で98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃20秒、72℃60秒}のPCR反応を10サイクル繰り返して断片E,Fを連結した。連結反応後、反応液に次のプライマー(0.1 mM)を0.4 μL ずつ加え、PCRで増幅した。
 U側:4BN用U側プライマー
 R側:4BN用R側プライマー
 98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃5秒、72℃60秒}のPCR反応を10サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
4. Cherry-4BC変異1(I242A, L246A, L249A, I253A)
・断片G(アミノ酸192-261)作製PCR
 U側:4BC用U側プライマー
 R側:5'-TTTGAATTCTTAGCATGGCGTGGAGCAGTCCTCATTGGCCCACTGGTGGGCTCT
CTTGGCCAGCTGGGTGGCGGTAAGGCTGGAGAGGAT-3'(配列番号51)
 Cherry-4Bfullプラスミド10 ngを鋳型とし、98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃20秒、72℃60秒}のPCR反応を27サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
5. Cherry-4BNC変異1(W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A)
・断片H(アミノ酸1-73)作製PCR
 U側:4BNU側プライマー
 R側:5'-GTTCCCAGGCAGAGTGGACAA-3'(配列番号52)
 Cherry-4BN変異1プラスミド10 ngを鋳型として、98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃5秒、72℃30秒}のPCR反応を25サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
・断片I(アミノ酸65-73および192-217)作製PCR
 U側:5'-GCAGGCTTGTCCACTCTGC-3'(配列番号53)
 R側:4BC用R側プライマー
 Cherry-4BNCプラスミド10 ngを鋳型として、98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃5秒、72℃60秒}のPCR反応を25サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
・断片H,Iの連結及び増幅
 断片H(200 ng),断片I(200 ng)、PSバッファー10μL,dNTP(各2.5 mM),PS 0.5μL,超純水で50μLとした反応液で98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃20秒、72℃60秒}のPCR反応を10サイクル繰り返して断片H,Iを連結した。連結反応後、反応液に次のプライマー(0.1 mM)を0.4 μL ずつ加え、PCRで増幅した。
 U側:4BN用U側プライマー
 R側:4BC用R側プライマー
 98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃5秒、72℃60秒}のPCR反応を8サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
6. Cherry-4BNC変異2(W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A, I242A, L246A, L249A, I253A)
・断片J(アミノ酸1-73及び192-261)作製PCR
 U側プライマー:4BN用U側プライマー
 R側プライマー:断片G用R側プライマー
 Cherry-4BNC変異1プラスミド10 ngを鋳型として、98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃20秒、72℃60秒}のPCR反応を27サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
7. Cherry-4BNC変異3(W43A, L46A, W50A, I242A, L246A, L249A, I253A)
・断片K(アミノ酸1-73)作製PCR
 U側:4BN用U側プライマー
 R側:断片H用R側プライマー
 Cherry-4BN変異2プラスミド10 ngを鋳型として、98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃5秒、72℃30秒}のPCR反応を28サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
・断片L(アミノ酸65-73および192-217)作製PCR
 U側:断片I用U側プライマー
 R側:断片G用R側プライマー
 Cherry-4BNC変異2プラスミド10 ngを鋳型として、98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃5秒、72℃30秒}のPCR反応を28サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
・断片K,Lの連結及び増幅
 断片K(200 ng),断片L(200 ng)、PSバッファー10μL,dNTP(各2.5 mM),PS 0.5 μL,超純水で50μlとした反応液で98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃20秒、72℃30秒}のPCR反応を10サイクル繰り返して断片K,Lを連結した。連結反応後、反応液に次のプライマー(0.1 mM)を0.4 μL ずつ加え、PCRで増幅した。
 U側:4BN用U側プライマー
 R側:断片G用R側プライマー
 98℃10秒の変性反応の後、{98℃10秒、55℃5秒、72℃30秒}のPCR反応を8サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。

Claims (18)

  1. (A)配列番号2で表されるアミノ酸配列の第50番から第73番までのアミノ酸配列とそのN末端に結合するX1 nで表されるアミノ酸配列(0≦n≦49であり、nが2以上の場合、X1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド(a)のC末端に、
     配列番号2で表されるアミノ酸配列の第218番から第261番までのアミノ酸配列とそのN末端に結合するX2 mで表されるアミノ酸配列(0≦m≦26であり、mが2以上の場合、X2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド(b)のN末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質;
    (B)(A)に規定されるタンパク質において上記第50番から第73番までアミノ酸配列および/または上記第218番から第261番までのアミノ酸配列の領域中に1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質;または
    (C)(A)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質。
  2. (A)配列番号2で表されるアミノ酸配列の第50番から第73番までのアミノ酸配列とそのN末端に結合するX1 nで表されるアミノ酸配列(0≦n≦49であり、nが2以上の場合、X1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド(a)のC末端に、
     配列番号2で表されるアミノ酸配列の第229番から第261番までのアミノ酸配列とそのN末端に結合するX2 mで表されるアミノ酸配列(0≦m≦37であり、mが2以上の場合、X2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド(b)のN末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質;
    (B)(A)に規定されるタンパク質において上記第50番から第73番までアミノ酸配列および/または上記第229番から第261番までのアミノ酸配列の領域中に1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質;または
    (C)(A)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質。
  3. 1 nで表されるアミノ酸配列が、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表されるアミノ酸配列の第1番から第49番までのアミノ酸配列から選択される任意の数n(1≦n≦49)のアミノ酸配列であるか(但し、配列番号21における第2番目及び第8番目のアミノ酸「Xaa」、並びに配列番号23における第6番目のアミノ酸「Xaa」は、任意のアミノ酸である。);又は、X1 nで表されるアミノ酸配列が、配列番号11に表されるアミノ酸配列の第1番から第48番までのアミノ酸配列から選択される任意の数n(1≦n≦48)のアミノ酸配列である、請求項1又は2に記載のタンパク質。
  4. 2 mで表されるアミノ酸配列が、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表されるアミノ酸配列の第192番から第217番までのアミノ酸配列から選択される任意の数m(1≦m≦26)のアミノ酸配列若しくは配列番号2~10及び12~23のいずれかに表されるアミノ酸配列の第192番から第228番までのアミノ酸配列から選択される任意の数m(1≦m≦37)のアミノ酸配列であるか;又は、X2 mで表されるアミノ酸配列が、配列番号11に表されるアミノ酸配列の第191番から第216番までのアミノ酸配列から選択される任意の数m(1≦m≦26)のアミノ酸配列若しくは配列番号11に表されるアミノ酸配列の第191番から第227番までのアミノ酸配列から選択される任意の数m(1≦m≦37)のアミノ酸配列である、請求項1~3のいずれか1項に記載のタンパク質。
  5. 1 nで表されるアミノ酸配列が、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表されるアミノ酸配列の第1番から第49番、第26番から第49番、第40番から第49番、または第43番から第49番までのアミノ酸配列であるか(但し、配列番号21における第2番目及び第8番目のアミノ酸「Xaa」、並びに配列番号23における第6番目のアミノ酸「Xaa」は、任意のアミノ酸である。);又は、X1 nで表されるアミノ酸配列が、配列番号11に表されるアミノ酸配列の第1番から第48番、第26番から第48番、第40番から第48番、または第43番から第48番までのアミノ酸配列である、請求項1~4のいずれか1項に記載のタンパク質。
  6. 2 mで表されるアミノ酸配列が、配列番号2~10及び12~23のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第192番から第217番までのアミノ酸配列若しくは配列番号2~10及び12~23のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第192番から第228番までのアミノ酸配列であるか;又は、X2 mで表されるアミノ酸配列が、配列番号11で表わされるアミノ酸配列の第191番から第216番までのアミノ酸配列若しくは配列番号11で表わされるアミノ酸配列の第191番から第227番までのアミノ酸配列である、請求項1~4のいずれか1項に記載のタンパク質。
  7. 1 nで表されるアミノ酸配列が配列番号2に表されるアミノ酸配列の第1番から第49番または第26番から第49番までのアミノ酸配列であり、かつ、X2 mで表されるアミノ酸配列が配列番号2で表されるアミノ酸配列の第192番から第217番までのアミノ酸配列または配列番号2で表されるアミノ酸配列の第192番から第228番までのアミノ酸配列である、請求項1~6のいずれか1項に記載のタンパク質。
  8. 前記タンパク質が、(A)に規定されるタンパク質である、請求項1~7のいずれか1項に記載のタンパク質。
  9. 前記タンパク質が、(A)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示す、請求項1~7のいずれか1項に記載のタンパク質。
  10. 標識タンパク質及び/又はアフィニティタグとの融合タンパク質である、請求項1~9のいずれか1項に記載のタンパク質。
  11. 被導入物質により修飾された請求項1~10のいずれか1項に記載のタンパク質。
  12. 被導入物質が、蛍光化合物である、請求項11に記載のタンパク質。
  13. 請求項1~10のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする核酸。
  14. 請求項13に記載の核酸を含む、発現用ベクター。
  15. 請求項14に記載の発現用ベクターにより形質転換された、形質転換体。
  16. 哺乳細胞において脂肪滴の可視化に用いるための、請求項13に記載の発現用ベクター。
  17. 哺乳細胞において脂肪滴の可視化に用いるための、請求項1~12のいずれか1項に記載のタンパク質。
  18. 請求項1~12のいずれか1項に記載のタンパク質に対する抗体。
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