WO2012060120A1 - 脂肪滴に特異的局在性を示すタンパク質 - Google Patents

脂肪滴に特異的局在性を示すタンパク質 Download PDF

Info

Publication number
WO2012060120A1
WO2012060120A1 PCT/JP2011/057818 JP2011057818W WO2012060120A1 WO 2012060120 A1 WO2012060120 A1 WO 2012060120A1 JP 2011057818 W JP2011057818 W JP 2011057818W WO 2012060120 A1 WO2012060120 A1 WO 2012060120A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
protein
seq
sequence represented
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/057818
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
寅彦 田中
Original Assignee
学校法人日本大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 学校法人日本大学 filed Critical 学校法人日本大学
Priority to JP2012541760A priority Critical patent/JP5828430B2/ja
Publication of WO2012060120A1 publication Critical patent/WO2012060120A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a novel protein exhibiting specific localization in lipid droplets.
  • a lipid droplet is one of the organelles in the cell, and is a spherical structure that includes lipid inside and is covered with a phospholipid monolayer (see Non-Patent Document 1).
  • Internal lipids are mainly triglycerides and sterol esters, and contain small amounts of other neutral lipids. The size varies and ranges from 1 ⁇ m or less to about 100 ⁇ m. The most extreme example is a fat cell, and fat droplets occupying most of the cell body are occupied. In other cells, hepatocytes contain many lipid droplets, but any type of cell has the ability to form lipid droplets.
  • the fat droplets of fat cells function as a lipid storage and become an individual energy source. Depending on the energy environment, such as starvation and overnutrition, the amount of lipid droplets is regulated by hormones and increases or decreases.
  • lipid droplets of other cells function as cell energy sources and also interact with cell membranes and intracellular organelles (endoplasmic reticulum (ER), mitochondria, peroxosomes, endosomes, etc.). It also functions as a source of lipid to the bilayer. In order to fulfill these functions, the size and localization of lipid droplets change during cell activity and proliferation. It is also considered that lipid droplets are responsible for lipid supply when secretory lipoprotein (VLDL) is formed in hepatocytes and the like.
  • VLDL secretory lipoprotein
  • ADRP adipocyte differentiation-related protein
  • perilipin adipocyte differentiation-related protein
  • Tip47 adipocyte
  • lipases lipid synthases
  • lipid droplets in hepatocytes are enlarged.
  • Foamed macrophages that form the core of the pathological state due to atherosclerosis also show a foam-like morphology due to extremely enlarged fat droplets inside the macrophages.
  • lipid droplets are closely related to lipid-related diseases and metabolic syndrome, studies on their dynamics and control are important.
  • Sudan® III red pigment
  • Oil® Red® O red pigment
  • Nile® Red yellow fluorescent pigment
  • Bodipy493 / 503 green fluorescent pigment
  • Non-Patent Document 2 Nile Red and Bodipy 493/503 can be used in an aqueous solution, but Bodipy493 / 503 is relatively superior in lipid droplet specificity.
  • Bodipy493 / 503 and its derivatives with slightly different chemical structures have been developed, and there are also red fluorescent dyes that have affinity for lipid droplets (for example, Bodipy558 / 568C12, LD540, etc.). These pigments utilize affinity for neutral fats such as triglycerides and do not necessarily act specifically on lipid droplets in principle. It has been discovered that Bodipy493 / 503, which is currently most widely used, emits red fluorescence depending on conditions, and may cause problems in multicolor fluorescence observation (see Non-Patent Document 3).
  • ADRP a fusion of ADRP and fluorescent protein
  • EGFP-ADRP fluorescent protein
  • Non-Patent Document 10 In the method of visualizing lipid droplets using antibodies, anti-ADRP antibodies are widely used. In the case of antibody staining, the shape of lipid droplets and lipid droplet membranes often changes in the process of fixation and permeabilization, and cellular antigens are not necessarily uniformly present in all lipid droplet membranes. It is difficult to completely and uniformly dye all lipid droplet films (see Non-Patent Document 10).
  • An object of the present invention is to provide a technique for visualizing (imaging) intracellular lipid droplets that can solve the above-described problems in the prior art. Specifically, an object of the present invention is to provide a technique for specifically visualizing only lipid droplets in a cell as an accurate image. At the same time, an object of the present invention is to provide a technique for specifically visualizing only the fat droplets without changing the original cell state and the original fat droplet state in the cell.
  • Patent Document 1 discloses a polypeptide consisting of amino acids 50 to 74 on the N-terminal side of non-structural protein 4B (NS4B) of hepatitis C virus, and amino acids 40 to 63 on the N-terminal side of NS4B. The polypeptide is described. However, the technique described in Patent Document 1 is not related to a technique for visualizing fat droplets.
  • Non-Patent Document 11 describes that when the C-terminal region of NS4B was expressed in Huh7 cells, a punctate structure was observed, and that the C-terminal region of NS4B would be related to the membrane. Has been suggested. However, Non-Patent Document 11 describes that the C-terminal region of NS4B was not localized in lipid droplets. Therefore, the technique described in Non-Patent Document 11 is not related to a technique for visualizing fat droplets.
  • Non-Patent Document 12 describes that when a protein (NS4B-EGFP) in which EGFP was fused to the C-terminal side of NS4B was expressed in cells, NS4B-EGFP was observed to be localized in the ER. Yes. Non-Patent Document 12 does not describe knowledge relating to a technique for visualizing fat droplets.
  • Non-Patent Document 13 describes that NS4B exhibited a spot-like pattern across the cytoplasm. Non-Patent Document 13 does not describe knowledge relating to the technique for visualizing fat droplets.
  • N-terminal region and the C-terminal region of non-structural protein 4B (NS4B) of hepatitis C virus (HCV) was found to be localized specifically in lipid droplets.
  • HCV hepatitis C virus
  • the present invention relates to the following.
  • [1] The amino acid sequence from the 50th to the 73rd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence represented by X 1 n that binds to the N-terminus thereof (with 0 ⁇ n ⁇ 49 And when n is 2 or more, X 1 may be the same or different from each other) at the C-terminus of the polypeptide (a), The amino acid sequence from No. 218 to No.
  • X 2 may be the same or different from each other), and is a protein formed by binding the N-terminus of the polypeptide (b), which shows specific localization to lipid droplets;
  • the protein defined in (A) lacks one or several amino acids in the region of the amino acid sequence from the 50th to 73rd amino acids and / or the amino acid sequence from the 218th to 261st amino acids.
  • X 2 may be the same or different from each other), and is a protein formed by binding the N-terminus of the polypeptide (b), which shows specific localization to lipid droplets;
  • B In the protein defined in (A), one or several amino acids are missing in the region of the amino acid sequence from the 50th to 73rd amino acids and / or the amino acid sequence from the 229th to 261st amino acids.
  • Any amino acid sequence represented by X 1 n is selected from amino acid sequences Nos. 1 to 49 of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23 Whether the amino acid sequence of the number n (1 ⁇ n ⁇ 49) (provided that the second and eighth amino acids “Xaa” in SEQ ID NO: 21 and the sixth amino acid “Xaa” in SEQ ID NO: 23 are: Or any number n selected from the amino acid sequences from No. 1 to No. 48 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, wherein the amino acid sequence represented by X 1 n is The protein according to [1] or [2], which is an amino acid sequence of (1 ⁇ n ⁇ 48).
  • the amino acid sequence represented by X 2 m is any amino acid sequence selected from the amino acid sequences from 192 to 217 of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23 Arbitrary number selected from amino acid sequence of number 192 to number 228 of amino acid sequence of number m (1 ⁇ m ⁇ 26) or amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23 m (1 ⁇ m ⁇ 37); or the amino acid sequence represented by X 2 m is derived from the amino acid sequence of No. 191 to No. 216 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • Arbitrary number m (1 ⁇ m ⁇ 26) of amino acid sequences selected or Arbitrary number m (1 ⁇ m) selected from amino acid sequences No. 191 to No. 227 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 m ⁇ 3 ) Is the amino acid sequence of the protein according to any one of [1] to [3].
  • the amino acid sequence represented by X 1 n is the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23, Nos. 1 to 49, Nos. 26 to 49, Whether it is the amino acid sequence from No. 40 to No. 49, or No. 43 to No. 49 (provided that the second and eighth amino acids “Xaa” in SEQ ID NO: 21 and the sixth amino acid in SEQ ID NO: 23)
  • the amino acid “Xaa” is any amino acid.
  • Or the amino acid sequence represented by X 1 n is from No. 1 to No. 48 and No. 26 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • the amino acid sequence represented by X 2 m is the amino acid sequence from No. 192 to No. 217 of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID Nos. 2 to 10 and 12 to 23, or SEQ ID Nos. 2 to 10 and The amino acid sequence of No. 192 to No. 228 of the amino acid sequence represented by any of 12 to 23; or the amino acid sequence of X 2 m is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11
  • the amino acid sequence represented by X 1 n is the amino acid sequence of No. 1 to No. 49 or No. 26 to No. 49 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and X 2 m
  • the amino acid sequence represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence from the 192th to the 217th amino acid sequence, or the amino acid sequence represented by the SEQ ID NO: 2 is the 192th to 228th amino acid sequence.
  • the protein according to any one of [1] to [6].
  • the protein comprises an amino acid sequence having at least 70% sequence homology with the amino acid sequence of the protein defined in (A), and exhibits specific localization in lipid droplets.
  • the protein according to [11], wherein the substance to be introduced is a fluorescent compound.
  • [13] A nucleic acid encoding the protein according to any one of [1] to [10].
  • [14] An expression vector comprising the nucleic acid according to [13].
  • [15] A transformant transformed with the expression vector according to [14].
  • [16] The expression vector according to [13] for use in visualization of lipid droplets in mammalian cells.
  • the protein according to any one of [1] to [12] for use in visualization of lipid droplets in mammalian cells.
  • the protein of the present invention shows specific localization to lipid droplets, which are intracellular organelles.
  • lipid droplets can be specifically visualized (imaging) in living cells or fixed cells.
  • only lipid droplets in cells can be specifically visualized as an accurate image.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence encoding the NS4B protein of the type 1b HCV-O strain used in the examples.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of NS4B protein of the HCV-O strain of type 1b.
  • FIG. 3 shows the results of comparison (alignment analysis) of the amino acid sequence of NS4B protein among various HCV subtypes.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the structure (three regions) of the NS4B protein.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of the protein of the present invention (4BNC showing specific localization to lipid droplets) produced in the examples.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence encoding the NS4B protein of the type 1b HCV-O strain used in the examples.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of NS4B protein of the HCV-O strain of type 1b.
  • FIG. 3 shows the results of comparison (alignment analysis) of the amino acid sequence of NS4B protein among various HCV
  • 4BNC is a protein created by linking two lipid droplet localization sequences (4BN and 4BC), and the protein was found to be localized in the lipid droplet membrane with extremely high specificity. did.
  • Cherry-4BNC indicates the structure of a protein obtained by fusing the 4BNC with the fluorescent protein mCherry.
  • EGFP-4BNC shows the structure of the protein obtained by fusing the 4BNC with the fluorescent protein EGFP.
  • FIG. 6 shows the result of analyzing the interaction between Cherry-4BN produced in the example and lipid droplets.
  • FIG. 7 shows the result of analyzing the interaction between Cherry-4BC produced in Example and lipid droplets.
  • FIG. 8 shows the results of analyzing the interaction between Cherry-4TM produced in the Examples and fat droplets.
  • FIG. 9 shows the results of analysis of the interaction between Cherry-4BNC (an example of the protein of the present invention) produced in the Examples and lipid droplets (imaging of lipid droplets).
  • FIG. 10 shows the results of analysis of the interaction between EGFP-4BNC (an example of the protein of the present invention) produced in Example and lipid droplets (imaging of lipid droplets).
  • FIG. 11 shows the results of visualization (imaging) of lipid droplets in human HEK293 cells (human-derived cultured cells) with few lipid droplets using the above Cherry-4BNC (an example of the protein of the present invention).
  • fatty acids stearic acid, 50 ⁇ M
  • FIG. 12 is a diagram showing structures of various NS4B fusion proteins (constructs) produced in Examples.
  • FIG. 13 shows the results of analyzing the interaction between Cherry-4Bfull (NS4B full length) produced in the Examples and fat droplets.
  • FIG. 14 shows the results of analyzing the interaction between various NS4B fusion proteins and lipid droplets.
  • FIG. 12 is a diagram showing structures of various NS4B fusion proteins (constructs) produced in Examples.
  • FIG. 13 shows the results of analyzing the interaction between Cherry-4Bfull (NS4B full length) produced in the Examples and fat droplets.
  • FIG. 14 shows the results of analyzing the interaction between various NS4B fusion proteins and lipid drop
  • FIG. 15 is a diagram showing the position of amphipathic ⁇ -helix existing in NS4B.
  • FIG. 16 is a view showing amino acid arrangements as viewed from the long axis direction of NS4B amphipathic ⁇ -helix.
  • FIG. 17 is a diagram illustrating various mutants of NS4B produced in Examples.
  • FIG. 18 is a diagram for explaining various mutants of NS4B produced in Examples.
  • FIG. 19 shows the result of comparing amino acids important for interaction with lipid droplets in NS4B among various HCV subtypes.
  • the first aspect of the present invention is: “(A) the amino acid sequence of amino acid sequence Nos. 50 to 73 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence represented by X 1 n binding to the N-terminus thereof (0 ⁇ n ⁇ 49, when n is 2 or more, X 1 may be the same or different from each other) at the C-terminus of the polypeptide (a), The amino acid sequence from No. 218 to No.
  • X 2 may be the same or different from each other), and is a protein formed by binding the N-terminus of the polypeptide (b), which shows specific localization to lipid droplets;
  • B In the protein defined in (A), one or several amino acids are missing in the region of the amino acid sequence from the 50th to 73rd amino acids and / or the amino acid sequence from the 218th to 261st amino acids.
  • the present invention relates to a protein consisting of an amino acid sequence having sequence homology and showing specific localization to lipid droplets.
  • a protein has “specific localization in lipid droplets” means that an Oc cell is transformed with an expression vector for a mammalian cell including a region encoding a fusion protein of a fluorescent protein, mCherry, and a target protein.
  • an Oc cell is transformed with an expression vector for a mammalian cell including a region encoding a fusion protein of a fluorescent protein, mCherry, and a target protein.
  • the number of cells in which the fusion protein is localized only in the lipid droplet membrane is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, particularly preferably 70% or more, most preferably 80% or more, 90% or more, 95%. That's it.
  • the protein defined in (A) has the following structure.
  • X 1 n -WAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGN-X 2 m -VSPTHYVPESDAAARVTQILSSLTITQLLKRLHQWINEDCSTPC In the above structure, X 1 n -WAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGN corresponds to the polypeptide (a).
  • X 2 m -VSPTHYVPESDAAARVTQILSSLTITQLLKRLHQWINEDCSTPC corresponds to the polypeptide (b).
  • n 5
  • the X 1 5, as a "AASSW" may contain identical or different amino acids from each other.
  • X 2 5 may contain the same or different amino acids as each other like “AASSW”.
  • the protein defined in (A) is a protein formed by binding the N-terminus of the polypeptide (b) to the C-terminus of the polypeptide (a).
  • Polypeptide (a) has the amino acid sequence from the 50th to the 73rd amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in its C-terminal region. This is because the region of the amino acid sequence from No. 50 to No. 73 includes a region in which the protein of the present invention functions to exhibit specific localization to lipid droplets.
  • polypeptide (b) has the amino acid sequence from No. 218 to No. 261 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in its C-terminal region. This is because the above amino acid sequences from No. 218 to No. 261 also include a region in which the protein of the present invention functions to exhibit specific localization to lipid droplets.
  • the N-terminal region of the polypeptide (a) is composed of an amino acid sequence represented by X 1 n , and the number (n) of the amino acid residues is in the range of 0 to 49 as described above, preferably 7 to It is in the range of 49, more preferably in the range of 10 to 49, still more preferably in the range of 24 to 49.
  • the type of amino acid constituting the amino acid sequence X 1 n is not particularly limited.
  • the amino acid sequence X 1 n is an arbitrary number n (1 ⁇ 1) selected from amino acid sequences Nos.
  • amino acid sequence X 1 n is an arbitrary number n (1 ⁇ n ⁇ 48) of amino acid sequences selected from the amino acid sequences of Nos. 1 to 48 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11. May be.
  • the amino acid sequence X 1 n is represented by amino acids 43 to 49 of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23.
  • the amino acid sequence is up to the 49th amino acid sequence (provided that the second and eighth amino acids “Xaa” in SEQ ID NO: 21 and the sixth amino acid in SEQ ID NO: 23).
  • the noic acid “Xaa” can take any amino acid as long as the protein of the present invention exhibits specific localization to lipid droplets).
  • the amino acid sequence X 1 n is the amino acid sequence from the 43rd to the 48th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or the 40th to the 48th amino acid sequence represented by the SEQ ID NO: 11
  • the amino acid sequence of No. 26 to No. 48 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, or No. 1 to No. 48 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 The amino acid sequence is preferably This is because when the amino acid sequence X 1 n is such an amino acid sequence, the specific localization of the protein of the present invention with respect to lipid droplets is enhanced.
  • the N-terminal region of polypeptide (b) is composed of amino acid sequence X 2 m , and the number (m) of amino acid residues is 0 to 26 as described above.
  • Types of amino acids constituting the amino acid sequence X 2 m is not particularly limited.
  • the amino acid sequence X 2 m is an arbitrary number m selected from amino acid sequences 192 to 217 of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23 (1 ⁇ The amino acid sequence may be m ⁇ 26).
  • amino acid sequence X 2 m is an arbitrary number m (1 ⁇ m ⁇ 26) of amino acid sequences selected from the amino acid sequences from the 191st to the 216th amino acid sequence represented by the SEQ ID NO: 11. May be.
  • the amino acid sequence X 2 m is represented by amino acids Nos. 192 to 217 of any one of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23.
  • the amino acid sequence up to the number is preferred.
  • the amino acid sequence X 2 m is preferably an amino acid sequence from No. 191 to No. 216 of the amino acid sequence represented by SEQ ID No. 11. This is because when the amino acid sequence X 2 m is such an amino acid sequence, the specific localization of the protein of the present invention with respect to lipid droplets is enhanced.
  • the second aspect of the present invention is “(A) the amino acid sequence of amino acid sequence Nos. 50 to 73 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence represented by X 1 n binding to the N-terminus thereof (0 ⁇ n ⁇ 49, when n is 2 or more, X 1 may be the same or different from each other) at the C-terminus of the polypeptide (a), The amino acid sequence from No. 229 to No.
  • X 2 may be the same or different from each other), and is a protein formed by binding the N-terminus of the polypeptide (b), which shows specific localization to lipid droplets;
  • B In the protein defined in (A), one or several amino acids are missing in the region of the amino acid sequence from the 50th to 73rd amino acids and / or the amino acid sequence from the 229th to 261st amino acids.
  • the present invention relates to a protein consisting of an amino acid sequence having sequence homology and showing specific localization to lipid droplets.
  • the protein defined in (A) has the following structure.
  • X 1 n -WAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGN corresponds to the polypeptide (a).
  • X 2 m -AAARVTQILSSLTITQLLKRLHQWINEDCSTPC corresponds to the polypeptide (b).
  • n 5
  • the X 1 5, as a "AASSW” may contain identical or different amino acids from each other.
  • X 2 5 may contain the same or different amino acids as each other like “AASSW”.
  • the protein defined in (A) is a protein formed by binding the N-terminus of the polypeptide (b) to the C-terminus of the polypeptide (a).
  • Polypeptide (a) has the amino acid sequence from the 50th to the 73rd amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in its C-terminal region. This is because the region of the amino acid sequence from No. 50 to No. 73 includes a region in which the protein of the present invention functions to exhibit specific localization to lipid droplets.
  • polypeptide (b) has the amino acid sequence from No. 229 to No. 261 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in its C-terminal region. This is because the amino acid sequences from No. 229 to No. 261 also include a region in which the protein of the present invention functions to exhibit specific localization to lipid droplets.
  • the N-terminal region of the polypeptide (a) is composed of an amino acid sequence represented by X 1 n , and the number (n) of the amino acid residues is in the range of 0 to 49 as described above, preferably 7 to It is in the range of 49, more preferably in the range of 10 to 49, still more preferably in the range of 24 to 49.
  • the type of amino acid constituting the amino acid sequence X 1 n is not particularly limited.
  • the amino acid sequence X 1 n is an arbitrary number n (1 ⁇ 1) selected from amino acid sequences Nos.
  • amino acid sequence X 1 n is an arbitrary number n (1 ⁇ n ⁇ 48) of amino acid sequences selected from the amino acid sequences of Nos. 1 to 48 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11. May be.
  • the amino acid sequence X 1 n is represented by amino acids 43 to 49 of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23.
  • the amino acid sequence is up to the 49th amino acid sequence (provided that the second and eighth amino acids “Xaa” in SEQ ID NO: 21 and the sixth amino acid in SEQ ID NO: 23).
  • the noic acid “Xaa” can take any amino acid as long as the protein of the present invention exhibits specific localization to lipid droplets).
  • the amino acid sequence X 1 n is the amino acid sequence from the 43rd to the 48th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or the 40th to the 48th amino acid sequence represented by the SEQ ID NO: 11
  • the amino acid sequence of No. 26 to No. 48 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, or No. 1 to No. 48 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 The amino acid sequence is preferably This is because when the amino acid sequence X 1 n is such an amino acid sequence, the protein of the present invention is localized more specifically in the lipid droplet.
  • the N-terminal region of polypeptide (b) is composed of amino acid sequence X 2 m , and the number (m) of amino acid residues is 0 to 37 as described above.
  • Types of amino acids constituting the amino acid sequence X 2 m is not particularly limited.
  • the amino acid sequence X 2 m is an arbitrary number m selected from amino acid sequences 192 to 228 of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23 (1 ⁇ The amino acid sequence may be m ⁇ 37).
  • the amino acid sequence X 2 m is an amino acid sequence of an arbitrary number m (1 ⁇ m ⁇ 26) selected from the amino acid sequences of Nos. 191 to 227 of the amino acid sequence represented by SEQ ID No. 11. May be.
  • the amino acid sequence X 2 m is represented by amino acid sequence Nos. 192 to 228 of any one of SEQ ID NOs: 2 to 10 and 12 to 23.
  • the amino acid sequence up to the number is preferred.
  • the amino acid sequence X 2 m is preferably an amino acid sequence from No. 191 to No. 227 of the amino acid sequence represented by SEQ ID No. 11. This is because when the amino acid sequence X 2 m is such an amino acid sequence, the protein of the present invention is localized more specifically in the lipid droplet.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a non-structural protein 4B of HCV-O strain (genome base sequence GenBank Accession number: AB19133, polyprotein amino acid sequence Accession number: BAD91386) whose genotype is type 1b.
  • NS4B amino acid sequence.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate H) (accession number of polyprotein amino acid sequence: P27958) whose genotype is type 1a.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is the NS4B amino acid sequence of the HCV (isolate HC-G9) genotype 1c (genome base sequence Accession53number: ⁇ ⁇ D14853, polyprotein amino acid sequence Accession number: BAA03581). is there.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 is the NS4B amino acid sequence of HCV (Accession number: AY746460 of the base sequence of the polyprotein cds region and Accession number: AAU89634 of the polyprotein amino acid sequence) of genotype 2a.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is the NS4B amino acid sequence of HCV (strain MD2b-1) genotype 2b (genome base sequence Accession number: ⁇ ⁇ AF238486, polyprotein amino acid sequence Accession ⁇ ⁇ number: AAF59945). is there.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate BEBE1) (genome base sequence Accession ⁇ ⁇ ⁇ number: D50409, polyprotein amino acid sequence Accession number: Q68749) whose genotype is 2c type.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate VAT96) genotype 2k (genome base sequence Accession03number: AB031663, polyprotein amino acid sequence Accession number: BAA88057).
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 is the NS4B amino acid of HCV (isolate HCV-K3a / 650) genotype 3a (genome base sequence Accession number: D28917, polyprotein amino acid sequence Accession ⁇ ⁇ number: Q81495) Is an array.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate Tr Kj) (genome base sequence Accession number: D49374, polyprotein amino acid sequence Accession number: BAA08372) whose genotype is 3b. .
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 is NS4B of HCV (isolate 02-42) genotype 4a (polyprotein cds region base sequence Accession number: DQ418783, polyprotein amino acid sequence Accession number: ABD75825) Is the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 is the NS4B amino acid sequence of HCV (Accession number of polyprotein amino acid sequence: ABD75828) whose genotype is 4d type.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 is the NS4B amino acid of HCV (isolate EUH1480) genotype 5a (polyprotein coding region base sequence Accession number: Y13184, polyprotein amino acid sequence Accession number: CAA73640) Is an array.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 is the NS4B amino acid of HCV (isolate EUHK2) genotype 6a (polyprotein coding region base sequence Accession number: ⁇ ⁇ Y12083, polyprotein amino acid sequence Accession number: ⁇ ⁇ CAA72801) Is an array.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate Th580) (genome base sequence Accession (number: D84262, polyprotein amino acid sequence Accession number: BAA32664) whose genotype is 6b.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate C-0044) genotype 6f (genome base sequence Accession number: ⁇ ⁇ DQ835760, polyprotein amino acid sequence Accession ⁇ ⁇ number: ABI36963). is there.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate JK046) (genome base sequence Accession number: D63822, polyprotein amino acid sequence Accession number: BAA09891) whose genotype is 6g.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate VN004) (Accession number of genome base sequence: D84265, Accession number of polyprotein amino acid sequence: BAA32667) whose genotype is 6h.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate C-0159) genotype 6i (genome base sequence Accession number: DQ835762, polyprotein amino acid sequence Accession number: ABI36965). is there.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate VN405) (genome base sequence Accession number: D84264, polyprotein amino acid sequence Accession number: BAA32666) whose genotype is 6k.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate 537796) (Accession number of genomic base sequence: EF424628, Accession ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ number of polyprotein amino acid sequence: ⁇ ⁇ ABP88847) whose genotype is 61.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate C-0208) (genome base sequence Accession number: DQ835763, polyprotein amino acid sequence Accession number: ABI36966) whose genotype is 6m. is there.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 is the NS4B amino acid sequence of HCV (isolate QC227) (genome base sequence Accession number: EF424627, polyprotein amino acid sequence Accession number: ABP88846) whose genotype is 6o.
  • FIG. 3 shows the results of alignment analysis performed on the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 23.
  • the sequence shown in FIG. 3 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 3, 2, 4 to 23 in order from the top.
  • the amino acid sequence of NS4B shown in SEQ ID NOs: 2 to 23 is derived from a specific HCV of the above genotype (subtype), but there are many HCVs of genotypes (subtypes) other than the above.
  • amino acid sequence of the protein of the present invention may be designed based on SEQ ID NOs: 2 to 23, but may be designed based on other known amino acid sequences of NS4B.
  • the protein defined in (B) is the protein defined in (A) and is present in the region of the amino acid sequence from the 50th to 73rd amino acids in SEQ ID NO: 2 (polypeptide (a) And / or one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the region of the amino acid sequence from No. 218 to No. 261 (region existing in the polypeptide (b)). It is a protein that has a specific amino acid sequence and shows specific localization to lipid droplets.
  • the range of “one or several” is not particularly limited as long as the protein of the present invention exhibits specific localization to lipid droplets.
  • region of the amino acid sequence from the 50th to the 73rd region existing in the polypeptide (a)
  • 1 to 20, preferably 1 to 9, more preferably 1 to 5 Particularly preferably, it can be 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or 1.
  • region of the amino acid sequence from No. 218 to No. 261 region existing in the polypeptide (b)
  • 1 to 40 preferably 1 to 30, more preferably 1 to The number may be 20, preferably 1 to 9, particularly preferably 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, and 1.
  • amino acid sequence from the 50th to the 73rd amino acid sequence and / or the amino acid sequence from the 218th to 261st amino acid sequence have such amino acids.
  • preferred sequences of the amino acid sequences X 1 n and X 2 m are as described for the protein (A) above.
  • the protein defined in (B) is, for example, the 51st alanine in the region of the amino acid sequence from the 50th to the 70th in SEQ ID NO: 2.
  • (A) is replaced with histidine (H), glutamine (Q), arginine (R), tyrosine (Y) or threonine (T); the 52nd lysine (K) is replaced with glutamine (Q); 53rd histidine (H) is replaced with glutamine (Q); 54th methionine (M) is replaced with leucine (L); 58th isoleucine (I) is replaced with valine (V); And / or 73rd asparagine (N) is substituted with serine (S).
  • the protein defined in (B) is, for example, in the region of the amino acid sequence from the 218th to 261st amino acids in SEQ ID NO: 2 in the 218th valine.
  • V is replaced with glycine (G); 219th serine (S) is replaced with alanine (A); 221th threonine (T) is replaced with alanine (A); 225th Proline (P) is replaced with threonine (T) or alanine (A); 227th serine (S) is replaced with threonine (T); 229th alanine is replaced with threonine (T); 230th alanine (A) is replaced by serine (S); 231st alanine (A) is valine (V), glutamine (Q), lysine (K), asparagine (N Or arginine (R) is substituted; 232nd arginine (R) is substituted with
  • the protein defined in (C) comprises an amino acid sequence having at least 60% sequence homology with the amino acid sequence of the protein defined in (A) above, and is specific for lipid droplets. It is a protein showing localization.
  • the protein defined in (C) is a protein exhibiting specific localization in lipid droplets, and is preferably 70% or more, more preferably with respect to the amino acid sequence of the protein defined in (A) above. 80% or higher, more preferably 90% or higher, 91% or higher, 92% or higher, 93% or higher, 94% or higher, 95% or higher, 96% or higher, 97% or higher, 98% or higher, 99% or higher.
  • sequence homology refers to the degree of identity of two or more amino acid sequences to each other. Therefore, the higher the homology between two amino acid sequences, the higher the identity or similarity between those sequences. Whether or not two kinds of amino acid sequences have homology can be analyzed by direct comparison of the sequences. Specifically, it can be analyzed using commercially available sequence analysis software or the like.
  • the protein of the present invention includes a fusion protein of the protein (A), (B) or (C) with a labeled protein and / or an affinity tag.
  • the labeled protein and / or the affinity tag can be located on the N-terminal side and / or C-terminal side of the protein (A), (B) or (C).
  • the fusion protein of the present invention may also contain a plurality of types of labeled proteins and / or affinity tags as long as the protein has a specific localization in lipid droplets.
  • the protein (A), (B) or (C) may be directly linked to the labeled protein and / or the affinity tag, or may be linked via various linkers. .
  • Examples of the labeled protein include fluorescent proteins, and specific examples thereof include GFP, EBFP, EGFP, EYFP, ECFP, RFP, mWasabi, AmCyan, ZsGreen, ZsYellow, DsRed, AsRed, HcRed, JRed, mCherry, mRuby, Examples include mStrawberry, mPlum, mOrange, mBana, Dendra2, E2-Crimson, mRasbury, tdTomato, and the like.
  • affinity tag examples include His tag, HA tag, myc tag, FLAG tag, glutathione-S-transferase (GST), maltose binding protein (MBP), E tag, S tag, HSV tag, Halo tag and the like. It is done.
  • the protein of the present invention includes the protein (A), (B) or (C), or a product obtained by modifying the fusion protein with a substance to be introduced.
  • a desired substance to be introduced can be localized in the lipid droplet in the target cell.
  • Specific examples of the substance to be introduced include substances that decompose fat (for example, various lipases), protein labeling compounds such as biotin, fluorescent compounds, and the like.
  • As a use of the protein of the present invention modified with a substance capable of decomposing fat for example, treatment or prevention of obesity is assumed.
  • As a use of the protein of the present invention labeled with a fluorescent compound visualization (imaging) of lipid droplets in cells is assumed.
  • Specific examples of the fluorescent compound include fluorescein, rhodamine, Cy dye (for example, Cy3, Cy 5), Alexa dye, and the like.
  • the protein of the present invention may be produced by various known genetic engineering techniques or may be produced by chemical synthesis.
  • the present inventor has developed a plasmid pON / C-5B / KE (Ikeda M. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 329) containing the full length of the HCV-0 strain of type 1b. 2005) 1350-1359) as a template DNA, the N-terminal region and the C-terminal region of the NS4B coding region were amplified by PCR, and the fragments were ligated by overlap PCR. Then, the ligated fragments were introduced into various expression vectors, whereby a mammalian expression plasmid encoding a protein as an example of the present invention was prepared.
  • the starting material is not limited to the above plasmid, and the specific method for constructing the expression system is not limited to the above method.
  • the nucleic acid (DNA or RNA) encoding the above protein (A), (B) or (C) or the above fusion protein is prepared and incorporated into various known expression vectors to express the protein of the present invention. Can do.
  • amino acid deletion, substitution and / or addition can be performed by, for example, error-prone PCR, DNA shuffling, various site-specific mutagenesis methods, etc. Any base deletion, substitution and / or insertion can be made.
  • the type of expression vector used in the present invention is not particularly limited, and microorganisms such as bacteria (for example, Escherichia coli , Bacillus subtilis ), fungi (for example, yeast), plants, insect cells, Various expression vectors that allow protein expression in a host such as a mammalian cell can be used, and they may be viral vectors (including phage vectors) or plasmid vectors.
  • the protein of the present invention can also be produced using a cell-free protein synthesis system using rabbit reticulocyte lysate, wheat germ lysate, E. coli lysate or the like.
  • a plasmid vector or a viral vector for expressing the mammalian cell.
  • the expressed protein of the present invention is specifically localized in intracellular lipid droplets. Therefore, when the nucleic acid encoding the protein of the present invention is incorporated into a plasmid vector or viral vector for mammalian cell expression, and the plasmid vector or viral vector is transformed in a mammalian cell, the protein of the present invention is directly expressed in the mammalian cell.
  • the expressed protein of the present invention is specifically localized in the lipid droplets in the cells, and the lipid droplets of mammalian cells can be observed or analyzed.
  • Lipid droplets are known to exist not only in mammalian cells but also in eukaryotes (including plants) and prokaryotes (eg, bacteria) (Murphy DJ: Prog. Lipid Res. 40, 325-438, 2001).
  • the species of the present invention may be expressed using a biological species having lipid droplets in the cell as a host and using various protein expression vectors corresponding to the biological species.
  • the protein of the present invention expressed in various biological species is localized in intracellular lipid droplets, and the lipid droplets of these biological species can be observed or analyzed.
  • the fusion protein of the protein (A), (B) or (C) and a fluorescent protein is expressed in a desired mammalian cell, lipid droplets can be visualized directly.
  • the fusion protein of the protein (A), (B) or (C) and the affinity tag is expressed by genetic engineering, the protein of the present invention can be purified by various affinity purification methods. It becomes.
  • the protein of the present invention can also be used for analysis of lipid droplets by directly expressing it in desired mammalian cells.
  • the protein of the present invention purified by various known methods can also be used for analysis of lipid droplets in desired mammalian cells. Specifically, analysis of intracellular lipid droplets and the like can be performed by introducing the purified protein of the present invention into a desired mammalian cell.
  • a lipid-based protein introduction reagent can be used.
  • Such a protein introduction reagent is available from a reagent manufacturer (for example, LSin (PPU); Pro-DeliverIN (OZB); BioPORTER Protein Delivery Reagent (GTS); Apa Carry 1 (CLG); Ab -DeliverIN (OZB Company)).
  • the protein of the present invention shows specific localization in intracellular lipid droplets, it can be used as a lipid droplet visualization (imaging) tool in living cells or fixed cells. Specifically, if an antibody against the protein (A), (B) or (C), or a labeled protein to be fused to it or an antibody against an affinity tag is immunostained, a cell into which the protein of the present invention has been introduced is stained. Fat droplets can be visualized. As a method of immunostaining, a known method can be used. In addition, if the protein of the present invention fused with a fluorescent protein is expressed in cells and the cells are observed using a confocal laser microscope or the like, fine imaging of intracellular lipid droplets becomes possible. Further, by introducing the protein of the present invention modified with a fluorescent compound or the like into a cell, it is possible to similarly perform fine imaging of intracellular lipid droplets.
  • the protein of the present invention has a specific binding ability to intracellular lipid droplets
  • the protein of the present invention modified with a substance to be introduced such as a lipolytic substance (for example, lipase) is used as a target cell such as an adipocyte.
  • a lipolytic substance for example, lipase
  • the protein of the present invention can be used as a visualization tool for intracellular lipid droplets, a drug delivery tool for delivering a substance to be introduced containing a drug to lipid droplets, and the like.
  • Another aspect of the present invention relates to the following protein: (1) In the amino acid sequences from No. 1 to No. 73 of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID Nos. 2 to 10 and 12 to 23, At least one of amino acids 43, 46, 50, 57, 61 and 64 is independently alanine, glycine, serine, threonine, cysteine, methionine, histidine, arginine, Proteins mutated to lysine, glutamine, asparagine, glutamic acid, aspartic acid or proline; or the amino acid sequence from No. 1 to No. 72 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, No. 43, No. 49, No.
  • At least one of amino acids 56, 60 and 63 is independently alanine, glycine, Protein mutated to serine, threonine, cysteine, methionine, histidine, arginine, lysine, glutamine, asparagine, glutamic acid, aspartic acid or proline.
  • at least one amino acid of the 241st, 245th, 248th and 252nd amino acids is independently alanine, glycine, Serine, threonine, cysteine, methionine, histidine , Arginine, lysine, glutamine, asparagine, glutamic acid, mutated proteins to aspartic acid or proline.
  • 253 is independently alanine, glycine, serine, threonine, cysteine, methionine, histidine, arginine, lysine, glutamine , A protein mutated to asparagine, glutamic acid, aspartic acid, or proline; or Nos. 1 to 72 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 In the amino acid sequence in which the N terminus of the amino acid sequence of No. 191 to No. 260 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 is linked to the C terminus of the amino acid sequence of No. 43, No. 49, No. 56, No. 60, No. 63, No. 241, No. 245, No. 248, No.
  • 252 amino acid is independently alanine, glycine, serine, threonine, cysteine, methionine , Histidine, arginine, lysine, glutamine, asparagine, glutamic acid, aspartic acid or proline mutated protein.
  • the 43rd, 46th and 50th (49th) amino acids are independently alanine, glycine, serine, threonine, cysteine, methionine, histidine, arginine, lysine, glutamine.
  • Asparagine, glutamic acid, aspartic acid or proline may be substituted, and 57th (56th), 61st (60th) and 64th (63th) are independently alanine and glycine.
  • the amino acids of No. 242 (No. 241), No. 246 (No. 245), No. 249 (No. 248) and No. 253 (No. 252) are independently alanine.
  • Glycine, serine, threonine, cysteine, methionine, histidine, arginine, lysine, glutamine, asparagine, glutamic acid, aspartic acid or proline may be substituted.
  • the 63rd amino acid may be independently substituted with alanine, glycine, serine, threonine, cysteine, methionine, histidine, arginine, lysine, glutamine, asparagine, glutamic acid, aspartic acid, or proline.
  • 252 are independently alanine, glycine, serine, threonine, cysteine, methionine, histidine, argin , Lysine, glutamine, asparagine, glutamic acid, aspartic acid or proline may be substituted, or 43rd, 46th, 50th (49th), 242nd (241st) 246 (No. 245), No. 249 (No. 248) and No. 253 (No. 252) are independently alanine, glycine, serine, threonine, cysteine, methionine, histidine, arginine, lysine, glutamine , Asparagine, glutamic acid, aspartic acid or proline may be substituted.
  • the amino acid sequence serving as each reference is preferably selected from SEQ ID NO: 2. Furthermore, in the proteins (1), (2) and (3), the amino acid mutation described above is preferably an alanine mutation.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding the protein (1), (2) or (3).
  • the present invention relates to an expression vector containing the nucleic acid.
  • the present invention also relates to a transformant using the expression vector.
  • NS4B is a protein encoded by nucleotide numbers 5475-6257 of this sequence and consists of 261 amino acids.
  • the nucleotide sequence of HCV-O strain NS4B is shown in FIG.
  • the amino acid sequence of HCV-O strain NS4B is shown in FIG. 2 and SEQ ID NO: 2.
  • NS4B functional domain (domain) NS4B is a membrane protein localized in the endoplasmic reticulum (ER), the central part of which is embedded in the ER membrane, part of the N-terminal side and one of the C-terminal side. The part is thought to be on the cytoplasm side. That is, NS4B proteins can be classified into three regions: an N-terminal cytoplasmic domain (4BN), a transmembrane domain (4BTM), and a C-terminal cytoplasmic domain (4BC) (see FIG. 4).
  • ER endoplasmic reticulum
  • 4BTM has amino acid residues 74 to 191 and 4BC has amino acid residues 192 to 261 (Jones et al, J. Virol. 83, 2163- 2177, 2009).
  • a fusion protein of each of these regions and a fluorescent protein was created as described below.
  • 4Bfull consisting of the full-length amino acid sequence of NS4B (amino acid residues 1 to 261), 4B1 consisting of amino acid residues 1 to 25 (part of 4BN), 4B2 consisting of amino acid residues 26 to 49 (part of 4BN) 4B3 consisting of amino acid residues 50 to 73 (part of 4BN), 4B1-2 consisting of amino acid residues 1 to 49 (part of 4BN), 4B2-3 consisting of amino acid residues 26 to 73 (one of 4BN) Part), 4B9 consisting of amino acid residues 192 to 217 (part of 4BC), 4B10 consisting of amino acid residues 218 to 239 (part of 4BC), 4B11 consisting of amino acid residues 240 to 261 (part of 4BC) 4B9-10 consisting of amino acid residues 192 to 239 (part of 4BC) and 4B10-11 consisting of amino acid residues 218 to 261 (part of 4BC) It was also produced a fusion protein of the same fluorescent protein
  • 4B9 primer U side 4BC U side primer R side: 5'-TTTGAATTCTTAATGGTTACCCCGCGAAGCG-3 '(SEQ ID NO: 34) Template: Cherry-4BC plasmid
  • composition of reaction solution PS buffer 10 ⁇ L, dNTP (2.5 mM each) 4 ⁇ L, U-side primer (0.1 mM) 0.4 ⁇ L, R-side primer (0.1 mM) 0.4 ⁇ L, template plasmid 10 ng, PS 0.5 ⁇ L, and the remainder as ultrapure water, PCR reaction was performed with a final volume of 50 ⁇ L.
  • PCR reaction Prepare the above reaction solution containing each primer pair (for 4Bfull, 4BN, 4BTM, 4BC, 4B1, 4B2, 4B3, 4B1-2, 4B2-3, 4B9, 4B10 4B11 use, 4B9-10 use, 4B10-11 use), and 98 ° C. for 10 seconds, followed by 25 cycles of ⁇ 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, 72 ° C. for 30 seconds ⁇ .
  • primer pair for 4Bfull, 4BN, 4BTM, 4BC, 4B1, 4B2, 4B3, 4B1-2, 4B2-3, 4B9, 4B10 4B11 use, 4B9-10 use, 4B10-11 use
  • Preparation of gene fragment encoding 4BNC 4BNC is a sequence in which 4BN and 4BC are linked (see FIG. 5). If two fragments whose sequences partially overlap on the 3 ′ side of 4BN and the 5 ′ side of 4BC are prepared, the two fragments can be directly ligated by PCR. These two fragments were prepared by PCR using the primers shown below.
  • a 4BN side fragment and a 4BC side fragment are respectively prepared by PCR.
  • the reaction solution composition and reaction conditions were the same as those described in 3. above, except that the primers shown above were used. It is based on.
  • the reaction product was purified using a MARLIGEN® Rapid® PCR® purification® system kit. Next, ligation PCR of each fragment was performed.
  • PCR reaction was performed with 10 ⁇ L of PS buffer, 4 ⁇ L of dNTP (2.5 mM each), 4 ng of 4BN-side purified fragment, 200 ng of 4BC-side purified fragment, 200 ng of PS, and 0.5 ⁇ L of PS, and a final volume of 50 ⁇ L with ultrapure water.
  • the vector was digested with Bgl II and Eco RI by a conventional method, then treated with Calf intestine alkaline phosphatase (TOYOBO), further agarose gel electrophoresis was performed, the vector DNA was excised from the gel, and purified by QIAGEN MinElute gel extraction kit. The DNA concentration was adjusted to 50 ng / ⁇ L with TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 7.4, 1 mM mM EDTA).
  • PCR products (4Bfull, 4BN, 4BTM, 4BC, 4B1, 4B2, 4B3, 4B1-2, 4B2-3, 4B9, 4B10, 4B11, 4B9-10, 4B10-11, 4BNC) Purified with purification system kit.
  • each PCR product was digested with BglII and EcoRI by a conventional method, further subjected to agarose gel electrophoresis, and the DNA was excised and purified by QIAGEN MinElute gel extraction kit. Adjust the DNA concentration to 50 ng / ⁇ l with TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 7.4, 1 mM mM EDTA).
  • the ligated DNA was transformed into TG1 strain E. coli by electroporation (Tanaka et al, Nihon Univ. J. Med, 47, 43-56, 2005).
  • the transformed cells were selected on an LB plate containing kanamycin 25 ⁇ g / mL, the obtained colonies were cultured on a 1 ml scale, and the plasmid DNA was extracted by Rapid-plasmid-miniprep-system of Marligen.
  • the transformant was cultured at a culture scale of 50 ml, and the plasmid was extracted using the Macchery-Nagel Nucleobond PC500 kit.
  • the obtained plasmid was subjected to phenol extraction, chloroform extraction and ethanol precipitation by a conventional method, and dissolved in TE buffer to a concentration of 1 ⁇ g / ⁇ L.
  • Oc cells (Ikeda et al., Biochem. Bios. Res. Comm. 329, 1350-1359, 2005) with abundant lipid droplets were used in the experiment.
  • Oc cells are seeded in a 24-well plate (EZView culture plate LB glass bottom, IWAKI) that can be observed with a fluorescence microscope so as to be 70-80% confluent, and according to the protocol using Lipofectamin 2000 (Invitrogen) according to the protocol.
  • the plasmid was transfected. 1.6 ⁇ g of plasmin per well and 4.0 ⁇ L of Lipofectamin 2000 were used. Each Oc cell was observed 24 or 48 hours after transfection.
  • lipid droplets were stained with Bodipy493 / 503tro (Invitrogen) for 20 minutes (Ohsaki et al, Histochem. Cell Biol. 124, 445-452, 2005).
  • the lipid droplet membrane was stained with an anti-ADRP antibody. After fixation, it was incubated with 0.01% digitonin / TBS for 30 minutes and blocked with 1% BSA / TBS for 1 hour. Incubate for 1 hour with anti-ADRP antibody (Acris) / 1% TBSA / TBS (final antibody concentration 5 ⁇ g / mL), then antimouse IgG-AlexaFluor 647 (Invitrogen) 1000-fold diluted / 1% BSA as secondary antibody Incubated with / TBS for 30 minutes.
  • the nuclei were stained with Hechst 33333 dye (final concentration 5 ⁇ g / mL TBS) for 20 minutes.
  • the cells were microscopically examined in sequential scan mode using a confocal laser scanning microscope (FV1000, Olympus).
  • Each sample was subjected to 10-20 visual field microscopy and all cells expressing the Cherry fusion protein were judged according to the following criteria.
  • Category A Cherry fusion protein is localized only in the lipid droplet membrane.
  • Category B Cherry fusion protein is localized in the lipid droplet membrane and other sites (eg, cytoplasm, ER, etc.).
  • Category C Cherry fusion protein is not localized in the lipid droplet film, but is localized in other sites.
  • the images taken with a confocal microscope were taken and analyzed with a PLAPO® 100X® OTIRFM® objective lens as an image of one field of view (1024 ⁇ 1024 ⁇ pixel) at 126.852 ⁇ m ⁇ 126.852 ⁇ m.
  • the confocal microscope has four types of excitation lasers (405 nm, 488 nm, 543 nm, and 633 nm; each for blue fluorescence, green fluorescence, red fluorescence, and infrared fluorescence) and is excited by each laser beam. Each fluorescence emitted from the sample is imaged independently. After imaging, each fluorescent image was created by a computer.
  • a color image can select a color suitably and can draw a colored image.
  • each fusion protein is localized in a lipid droplet was determined by comparing a red fluorescent image, a green fluorescent image, and a merge image (composite image) of both on a computer image. .
  • the Cherry fusion protein When the Cherry fusion protein is expressed, the Cherry fusion protein is localized in the lipid droplet membrane when a ring-shaped red fluorescence image is obtained that borders the circular green fluorescence by Bodipy that stains the inside of the lipid droplet. Judged to be a thing.
  • the green fluorescence of EGFP and the green fluorescence of Bodipy cannot be distinguished. Therefore, after staining the lipid droplet membrane with an anti-ADRP antibody and a rhodamine (red fluorescence) labeled secondary antibody, imaging of the fluorescence is performed. went. In this case, when the ring-shaped structure shown as an EGFP-derived green fluorescent image matches the ring-shaped red fluorescent image of the lipid droplet membrane stained with the anti-ADRP antibody, the EGFP fusion protein becomes the lipid droplet membrane. It was determined to be localized in
  • Fig. 7 shows the observed typical cell image of Cherry-4BC in red, Bodipy493 / 503 in green, and a red and green image superimposed on a computer (merge image) with nuclear staining (blue). It was. Similar to Cherry-4BN, Cherry-4BC accumulated around the lipid droplets, but also distributed in the cytoplasm and cytoplasmic network (estimated ER). Similar results were obtained with EGFP-4BC (data not shown). Like 4BN, 4BC is presumed to have affinity for the lipid droplet membrane and ER.
  • FIG. 8 shows the typical cell images observed, with Cherry-4BTM in red, Bodipy493 / 503 in green, and a red and green image superimposed on a computer (merge image) with nuclear staining (blue). It was. Cherry-4BTM showed a ring-shaped structure in the cytoplasm, but this visualized ring-shaped structure was completely unrelated to the fat droplets shown in green. Similar results were obtained with EGFP-4BTM (data not shown). Although the localization site of 4BTM cannot be accurately identified, it is presumed that it is probably an ER that has undergone shape change by 4BTM.
  • FIG. 9 shows the observed typical cell image of Cherry-4BNC in red, Bodipy493 / 503 in green, and a red and green image superimposed on a computer (merge image) with nuclear staining (blue). It was. Cherry-4BNC was depicted in a ring shape, and its position completely coincided with the fat droplets shown in green. There was almost no distribution of Cherry-4BNC in other parts of the cell. Cherry-4BNC was found to be localized around the lipid droplets, that is, to bind highly specifically to the lipid droplet membrane.
  • FIG. 10 shows the observed typical cell images in green for EGFP-4BNC and magenta for ADRP. The distributions of EGFP-4BNC and ADRP were almost completely consistent, indicating that EGFP-4BNC bound to the lipid droplet membrane, and that EGFP-4BNC depicted the lipid droplet membrane more clearly than the ADFP antibody.
  • fatty acid stearic acid 50 ⁇ M
  • Fig. 11 shows the observed typical cell image with Cherry-4BNC in red, Bodipy493 / 503 in green, and a red and green image superimposed on a computer (merge image) with nuclear staining (blue). It was.
  • FIG. 13 shows a typical cell image observed, in which Cherry-4Bfull is red, Bodipy493 / 503 is green, and a red and green image superimposed on a computer (merge image) with nuclear staining (blue) added. It was.
  • hydrophobic residues that may interact with the lipid droplet membrane in the above two amphipathic ⁇ -helix were selected with reference to the amino acid arrangement diagram (Fig. 16) seen from the long axis direction and replaced with alanine.
  • a mutant was prepared.
  • the selected amino acid residues were 43W, 46L, 50W, 57F, 61I, 64L, 242I, 246L, 249L, 253I, a total of 10 residues.
  • the alanine substitution performed was all of W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A, or the first half to the latter half, and in the 4B10-11 region, I242A, L246A, L249A, I253A is there.
  • Cherry-4BC mutation 1 (Cherry-4BC with mutations I242A, L246A, L249A, I253A) Category A: 0 (number of cells) 0 (%) Category B: 0 0 Category C: 65 100
  • Cherry-4BNC mutation 1 (Cherry-4BNC with W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A mutations) Category A: 9 (number of cells) 17 (%) Category B: 41 77 Category C: 3 6
  • Cherry-4BNC mutation 2 (Cherry-4BNC with mutations W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A, I242A, L246A, L249A, I253A) Category A: 0 (number of cells) 0 (%) Category B: 5 8 Category C: 54 92
  • Cherry-4BNC mutation 3 (Cherry-4BNC with mutations W43A, L46A, W50A, I242A, L246A, L249A, I253A) Category A: 15 (number of cells) 20.3 (%) Category B: 55 74.3 Category C: 4 5.4
  • Cherry-4BC is weaker than Cherry-4BN, but shows localization to fat droplets.
  • Cherry-4BC mutation 1 in which mutations I242A, L246A, L249A, and I253A were added to Cherry-4BC did not show any localization to lipid droplets.
  • the Cherry-4BNC according to the present invention shows specific localization to fat droplets.
  • Cherry-4BNC mutation 1 in which W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, and L64A mutations were added to Cherry-4BNC showed relatively strong localization to fat droplets.
  • Cherry-4BN that is, Cherry4BN mutation 1
  • the localization was greatly weakened
  • Cherry-4BNC the effect was small. That is, it was speculated that the C-terminal region (4B10-11) has a fairly strong action.
  • Cherry-4BNC mutation 2 in which 4 residues in the C-terminal region were also mutated (Cherry-4BNC was changed to W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, I64A, I242A, L246A, L249A, I253A (Mutation with mutation) was created and analyzed, and the localization to lipid droplets was almost completely lost.
  • Cherry-4BNC mutation 3 with mutations in the first 3 residues of the N-terminal region and 4 residues of the C-terminal region (Cherry-4BNC mutations W43A, L46A, W50A, I242A, L246A, L249A, I253A)
  • localization to lipid droplets was relatively strong (that is, localization to lipid droplets was not completely inhibited by mutation).
  • 57F, 61A, 64L clusters and 242I, 246L, 249L, and 253I clusters are considered not to have strong localization ability to fat droplets.
  • Cherry-4BNC the ability to localize to lipid droplets is not lost unless all three clusters are mutated. Therefore, these clusters (57F, 61A, 64L and 242I, 246L, 249L, which do not have strong action alone) , 253I) is considered to exhibit extremely strong localization of fat droplets as a whole by acting cooperatively with clusters consisting of 43W, 46L, and 50W.
  • amino acid residues identified as described above are highly conserved among the HCV subtypes (see FIG. 19). Although substitution is seen in some subtypes, the appearing amino acid residues are limited to hydrophobic amino acids with similar properties. Therefore, it is presumed that the interaction between NS4B and lipid droplets mediated by these residues (localization of NS4B to the lipid droplet membrane) plays an extremely important role in the process of HCV growth. . On the contrary, this suggests that if these amino acid residues are targeted and a method for inhibiting localization to lipid droplets is taken, the growth of HCV can be suppressed.
  • ⁇ Mutant production method> As a codon for an alanine residue, GCC having the highest codon usage in eukaryotic cells was used. An appropriate PCR fragment was prepared using a primer containing a nucleotide mutation at a predetermined position, and the fragments were further linked by PCR using the overlapping portion as described above to produce the target DNA fragment. . Thereafter, the fragment was inserted into the pmCherry-C1 vector after treatment such as restriction enzyme digestion according to the method described above to obtain a completed construct. For all constructs, the plasmid was purified and DNA sequencing was performed to confirm that the given mutation was successful.
  • the following describes how to construct each construct fragment.
  • the underlined portion of the primer sequence represents a site corresponding to an alanine substitution mutation.
  • Cherry-4BN mutation 1 (W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A) -Fragment A (amino acids 1-48) production PCR
  • U side U side primer for 4BN
  • R side 5'-GGCCTC GGC GGCTTG GGC CTTGGACTCCACCACGGG-3 '(SEQ ID NO: 44)
  • a reaction of ⁇ 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, 72 ° C. for 30 seconds ⁇ was repeated 28 cycles.
  • the reaction product was purified using a Rapid PCR purification system kit manufactured by MARLIGEN.
  • Fragment A, B ligation and amplification Fragment A (10 ⁇ L), Fragment B (4 ⁇ L), PS buffer 10 ⁇ L, dNTP (2.5 mM each), PS 0.5 ⁇ L, and reaction solution adjusted to 50 ⁇ L with ultrapure water 10 ° C. After the denaturation reaction for 2 seconds, the PCR reaction of ⁇ 98 ° C. for 10 seconds, 50 ° C. for 20 seconds, 72 ° C. for 30 seconds ⁇ was repeated 10 cycles, and fragments A and B were ligated.
  • the PCR reaction After the denaturation reaction at 98 ° C. for 10 seconds, the PCR reaction of ⁇ 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, 72 ° C. for 30 seconds ⁇ was repeated 20 cycles. After the reaction, the reaction product was purified using MARLIGEN Rapid® PCR® purification® system kit.
  • the pcDNA4BFLAG plasmid is a plasmid in which a full-length NS4B sequence and a sequence with the amino acid sequence DYKDDDDK (FLAG tag) added to the C-terminal site are inserted into a pcDNA3.1 (+) vector (Invitrogen).
  • Fragment C D ligation and amplification Fragment C (10 ⁇ L), Fragment D (5 ⁇ L), PS buffer 10 ⁇ L, dNTP (2.5 mM each), PS 0.5 ⁇ L, and reaction solution adjusted to 50 ⁇ L with ultrapure water at 98 ° C. for 10 seconds After the denaturation reaction, the PCR reaction of ⁇ 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 20 seconds, 72 ° C. for 60 seconds ⁇ was repeated 10 cycles, and fragments C and D were linked.
  • PCR reaction ⁇ 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 5 seconds, 72 ° C for 45 seconds ⁇ was repeated 30 cycles after a denaturation reaction at 98 ° C for 10 seconds. After the reaction, the reaction product was purified using MARLIGEN Rapid® PCR® purification® system kit.
  • Fragment E, F ligation and amplification Fragment E (5 ⁇ L), Fragment F (5 ⁇ L), PS buffer 10 ⁇ L, dNTP (2.5 mM each), PS 0.5 ⁇ L, and reaction solution made 50 ⁇ l with ultrapure water at 98 ° C. After the denaturation reaction for 2 seconds, the PCR reaction of ⁇ 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 20 seconds, 72 ° C. for 60 seconds ⁇ was repeated 10 cycles, and fragments E and F were ligated. After the ligation reaction, 0.4 ⁇ L of the next primer (0.1 mM) was added to the reaction solution and amplified by PCR.
  • U side U side primer for 4BN
  • R side R side primer for 4BN 98 ° C for 10 seconds, followed by 10 cycles of PCR reaction of ⁇ 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 5 seconds, 72 ° C for 60 seconds ⁇
  • the reaction product was purified using a Rapid PCR purification system kit from MARLIGEN.
  • Cherry-4BNC mutation 1 (W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A) -Fragment H (amino acid 1-73) production PCR U side: 4BNU side primer R side: 5'-GTTCCCAGGCAGAGTGGACAA-3 '(SEQ ID NO: 52)
  • U side U primer for 4BN
  • R side R side primer for 4BC
  • a denaturation reaction at 98 ° C. for 10 seconds a PCR reaction of ⁇ 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, 72 ° C. for 60 seconds ⁇ is performed for 8 cycles, The reaction product was purified using a Rapid PCR purification system kit from MARLIGEN.
  • Cherry-4BNC mutation 2 (W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A, I242A, L246A, L249A, I253A) -Fragment J (amino acids 1-73 and 192-261) production PCR
  • U side primer U side primer for 4BN
  • R side primer R side primer for fragment G
  • 10 ng of Cherry-4BNC mutation 1 plasmid as a template, 98 ° C for 10 seconds, ⁇ 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 20 seconds Second, 72 ° C. 60 seconds ⁇ was performed 27 cycles, and the reaction product was purified using a Rapid PCR purification system kit manufactured by MARLIGEN.
  • Cherry-4BNC mutation 3 (W43A, L46A, W50A, I242A, L246A, L249A, I253A) -Fragment K (amino acids 1-73) production PCR
  • U side U side primer for 4BN
  • R side R side primer for fragment H
  • 10 ng of Cherry-4BN mutation 2 plasmid as a template, after a denaturation reaction at 98 ° C. for 10 seconds, ⁇ 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, PCR reaction at 72 ° C. for 30 seconds ⁇ was performed 28 cycles, and the reaction product was purified using a Rapid PCR purification system kit manufactured by MARLIGEN.
  • U side U side primer for 4BN
  • R side R side primer for fragment G
  • PCR reaction ⁇ 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 5 seconds, 72 ° C for 30 seconds ⁇ is performed for 8 cycles.
  • the reaction product was purified using a Rapid PCR purification system kit from MARLIGEN.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

　本発明の目的は、脂肪滴に特異的な局在性を示す新規なタンパク質を提供することにある。本発明によれば、(Ａ)配列番号２で表されるアミノ酸配列の第５０番から第７３番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ1 nで表されるアミノ酸配列(０≦ｎ≦４９であり、ｎが２以上の場合、Ｘ1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ａ）のＣ末端に、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ2 mで表されるアミノ酸配列(０≦ｍ≦２６であり、ｍが２以上の場合、Ｘ2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ｂ）のＮ末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；(Ｂ)（Ａ)に規定されるタンパク質において上記第５０番から第７３番までアミノ酸配列および／または上記第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域中に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；または（Ｃ）（Ａ)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質が提供される。

Description

脂肪滴に特異的局在性を示すタンパク質 関連出願の相互参照
　本出願は、２０１０年１１月５日出願の日本特願２０１０－２４８７７３号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
　本発明は、脂肪滴に特異的な局在性を示す新規なタンパク質に関する。
　脂肪滴は細胞内小器官の一つであり、内部に脂質を含み、表面をリン脂質一重膜に覆われた球状の構造物である（非特許文献１参照）。内部の脂質としてはトリグリセリド、ステロールエステルが主体で、他の中性脂質も少量含む。大きさは様々で、１μｍ以下から１００μｍ程度のものまである。最も極端な例は、脂肪細胞であり、細胞体の大部分を肥大化した脂肪滴が占めている。その他の細胞では、肝細胞が脂肪滴を多く含むが、どのような種類の細胞でも脂肪滴の形成能力を持つ。
　脂肪細胞の脂肪滴は、脂質の貯蔵庫として機能し、個体のエネルギー源となる。飢餓状態や栄養過多といったエネルギー環境に応じて、脂肪滴量は、ホルモンによる調節を受け、増減する。一方、その他の細胞の脂肪滴は、細胞のエネルギー源として機能する他、細胞膜や細胞内小器官（小胞体（endoplasmic reticulum；ＥＲ）、ミトコンドリア、ペルオキソゾーム、エンドゾームなど）とも相互作用し、脂質二重膜への脂質の供給源としても機能する。これらの機能を果たすため、細胞の活動や増殖の際に脂肪滴の大きさや局在が変化する。また、分泌性のリポタンパク（ＶＬＤＬ）が肝細胞などで形成される際に、脂肪滴が脂質の供給を担っているとも考えられている。
　脂肪滴膜には複数のタンパク質が局在しており、最も良く知られているのはADRP (adipocyte differentiation-related protein, 別名adipophilin, ADFP), perilipin, Tip47などであり、リパーゼ類や脂質合成酵素などもある。細胞の種類によって、タンパク質の種類に違いがあり、例えばperilipinは脂肪細胞とステロイド産生性細胞のみに存在する一方、ADRPは広汎な細胞種に存在する。
　現時点では、脂肪滴の正確な形成機構についてはコンセンサスが得られていないが、ＥＲの脂質二重膜の二層の中間に合成された脂質が蓄積し、次第に細胞質側に突出・出芽し、ついにはＥＲと分離して脂質一重膜に覆われた独立した構造物になると推測されている。
　脂肪肝においては、肝細胞内の脂肪滴が肥大する。またアテローム性動脈硬化で病態の中核を成す泡沫化マクロファージも、マクロファージ内部の脂肪滴が極端に肥大化して泡沫状の形態を示したものである。このように脂肪滴は脂質関連疾患やメタボリックシンドロームとも密接に関連するため、その動態や制御についての研究は重要である。
特開２０１０－２１３６８５
Zehmer et al, Proteomics, 9, 914-921, 2009; Beller et al, FEBS Lett. 584, 2176-2182, 2010; Olofsson et al, Biochim. Biophys. Acta, 1791, 448-458, 2009, Thiele et al, Current Opin. Cell Biol. 20, 378-385, 2008 Fukumoto et al, Histochem. Cell Biol. 118, 423-428, 2002 Ohsaki et al, Histochem. Cell Biol. 133, 477-480, 2010 Targett-Adams et al, J. Biol. Chem. 278, 15998-16007, 2003 Bostrom et al, Arterioscler. Thromb. Vas. Biol. 25, 1945-1951, 2005 Pol et al, J. Cell Biol. 152, 1057-1070, 2001 Turro et al, Traffic 7, 1254-1269, 2006 Spandl et al, Traffic 10, 1579-1584, 2009 Brasemle et al, J. Lipid Res. 38, 2249-2263, 1997 Ohsaki et al, Histochem. Cell Biol. 124, 445-452, 2005; Thiele et al, Curr. Opin. Cell Biol. 20, 378-385, 2008 Liefhebber JM, et al., Virology Journal 2009, 6:62: "Hepatitis C virus NS4B carboxy terminal domain is a membrane binding domain." Journal of Virology, May 2003, p. 5428-5438 Arch Virol. 1999;144(2):329-43.
　脂肪滴の染色には従来Sudan III（赤色色素）、Oil Red O（赤色色素）、Nile Red（黄色蛍光色素）、Bodipy493/503（緑色蛍光色素）などが用いられてきた。いずれも脂溶性化合物であり、中性脂肪に親和性が高いため、脂肪滴内部の脂質自体を染色する（顕微鏡観察で円形（三次元であれば球形）の像が得られる）。Sudan IIIや Oil Red Oは７０％エタノールなどに溶解して使用するが、実はこのような高濃度のエタノールは脂肪滴を融合させてしまい正しい像が得られないと言う問題がある(非特許文献２参照)。また、グリセロールを含む包埋剤を用いると、アルデヒド類で固定した後でもやはり脂肪滴の融合が見られる（非特許文献２参照）。Nile RedやBodipy 493/503は水系の溶液で使用できるが、Bodipy493/503の方が、相対的に脂肪滴特異性に優れている。
　また、Bodipy493/503と、化学構造の若干異なるその誘導体が開発されており、脂肪滴に親和性のある赤色蛍光色素もある(例えば、Bodipy558/568C12, LD540など)。これらの色素は、トリグリセリドなどの中性脂肪に対する親和性を利用するもので、原理的に必ずしも脂肪滴に特異的に作用するものではない。現在最も汎用されているBodipy493/503は、条件によって赤色の蛍光が出てしまい、多色の蛍光観察に問題を起こしうることが発見された（非特許文献３参照）。
　また、細胞内在性の脂肪滴膜局在タンパク質に蛍光タンパク質を融合させたコンストラクトも多数作製され、脂肪滴の染色（イメージング）に利用されている。しかし、これらは本来的には当該タンパク質の機能を調べる道具であるから、発現させた当該タンパク質の機能が強く現れる可能性があり、脂肪滴が当該タンパク質の影響を受けて細胞内の状態が変化する可能性もある。したがって、これら従来技術では、細胞内における本来の脂肪滴の正確な情報が得られないという問題がある。また、小胞体（ＥＲ）など他の部位に局在したり、全部の脂肪滴を均一にイメージングできないという問題がある（非特許文献４～８）。
　上述の従来技術では、ADRPと蛍光タンパク質の融合体（EGFP-ADRP）が脂肪滴のイメージングツールとして優れている（非特許文献４参照）。しかし、ADRPは脂肪滴の成長や動態に密接に関連しているタンパク質であり（非特許文献９参照）、それ自体の強制発現の影響を考慮する必要がある。また、EGFP-ADRPを発現させた場合、本来細胞で発現しているADRPを検出することが手技的に煩雑となり、評価が難しい。
　抗体を用いて脂肪滴を可視化する方法では、抗ADRP抗体が汎用されている。抗体染色の場合、固定や透過処理（permeabilization）の工程において脂肪滴や脂肪滴膜の形態が変化する場合が多いこと、必ずしも細胞性の抗原が全ての脂肪滴膜に均一に存在しないことから、全ての脂肪滴膜を完全に均一に染めだすことは困難である（非特許文献１０参照）。
　本発明の課題は、上記従来技術における問題点を解決できる細胞内脂肪滴の可視化（イメージング）技術を提供することにある。具体的には、本発明の課題は、正確な像（イメージ）として、細胞内における脂肪滴のみを特異的に可視化する技術を提供することにある。また、同時に、本発明の課題は、本来の細胞の状態、及び細胞内における本来の脂肪滴の状態を変化させることなく、該脂肪滴のみを特異的に可視化する技術を提供することにある。
　なお、特許文献１には、Ｃ型肝炎ウイルスの非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）のＮ末端側５０番から７４番のアミノ酸からなるポリペプチド、及びＮＳ４ＢのＮ末端側４０番から６３番のアミノ酸からなるポリペプチドが記載されている。しかしながら、特許文献１に記載される技術は、脂肪滴の可視化技術に関するものではない。
　非特許文献１１には、ＮＳ４ＢのＣ末端領域をＨｕｈ７細胞に発現させた場合、点状の構造が観察されたことが記載され、さらに、ＮＳ４ＢのＣ末端領域は膜に関係するであろうことが示唆されている。しかしながら、非特許文献１１には、ＮＳ４ＢのＣ末端領域は脂肪滴には局在しなかった事が記載されている。したがって、非特許文献１１に記載の技術は、脂肪滴の可視化技術に関するものではない。
　非特許文献１２には、ＮＳ４ＢのＣ末端側にＥＧＦＰを融合させたタンパク質（ＮＳ４Ｂ－ＥＧＦＰ）を細胞で発現させたところ、ＮＳ４Ｂ－ＥＧＦＰがＥＲに局在して観察されたことが記載されている。非特許文献１２には、脂肪滴の可視化技術に関する知見は記載されていない。
　非特許文献１３には、ＮＳ４Ｂは、細胞質に渡って点状のパターン（spot-like pattern）を示したことが記載されている。非特許文献１３には、脂肪滴の可視化技術に関する知見は記載されていない。
　本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis C Virus；ＨＣＶ）の非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）のＮ末端側領域とＣ末端側領域を融合させたタンパク質が脂肪滴に特異的に局在することを見出した。本発明は、係る知見により完成されたものである。
　すなわち、本発明は以下に関する。
〔１〕　(Ａ)配列番号２で表されるアミノ酸配列の第５０番から第７３番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ1 nで表されるアミノ酸配列(０≦ｎ≦４９であり、ｎが２以上の場合、Ｘ1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ａ）のＣ末端に、
　配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ2 mで表されるアミノ酸配列(０≦ｍ≦２６であり、ｍが２以上の場合、Ｘ2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ｂ）のＮ末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；
(Ｂ)（Ａ)に規定されるタンパク質において上記第５０番から第７３番までアミノ酸配列および／または上記第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域中に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；または
（Ｃ）（Ａ)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質。
〔２〕　(Ａ)配列番号２で表されるアミノ酸配列の第５０番から第７３番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ1 nで表されるアミノ酸配列(０≦ｎ≦４９であり、ｎが２以上の場合、Ｘ1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ａ）のＣ末端に、
　配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２２９番から第２６１番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ2 mで表されるアミノ酸配列(０≦ｍ≦３７であり、ｍが２以上の場合、Ｘ2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ｂ）のＮ末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；
(Ｂ)（Ａ)に規定されるタンパク質において上記第５０番から第７３番までアミノ酸配列および／または上記第２２９番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域中に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；または
（Ｃ）（Ａ)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質。
〔３〕　Ｘ1 nで表されるアミノ酸配列が、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１番から第４９番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｎ（１≦ｎ≦４９）のアミノ酸配列であるか（但し、配列番号２１における第２番目及び第８番目のアミノ酸「Ｘａａ」、並びに配列番号２３における第６番目のアミノ酸「Ｘａａ」は、任意のアミノ酸である。）；又は、Ｘ1 nで表されるアミノ酸配列が、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１番から第４８番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｎ（１≦ｎ≦４８）のアミノ酸配列である、〔１〕又は〔２〕に記載のタンパク質。
〔４〕　Ｘ2 mで表されるアミノ酸配列が、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２１７番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦２６）のアミノ酸配列若しくは配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２２８番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦３７）のアミノ酸配列であるか；又は、Ｘ2 mで表されるアミノ酸配列が、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１９１番から第２１６番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦２６）のアミノ酸配列若しくは配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１９１番から第２２７番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦３７）のアミノ酸配列である、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔５〕　Ｘ1 nで表されるアミノ酸配列が、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１番から第４９番、第２６番から第４９番、第４０番から第４９番、または第４３番から第４９番までのアミノ酸配列であるか（但し、配列番号２１における第２番目及び第８番目のアミノ酸「Ｘａａ」、並びに配列番号２３における第６番目のアミノ酸「Ｘａａ」は、任意のアミノ酸である。）；又は、Ｘ1 nで表されるアミノ酸配列が、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１番から第４８番、第２６番から第４８番、第４０番から第４８番、または第４３番から第４８番までのアミノ酸配列である、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔６〕　Ｘ2 mで表されるアミノ酸配列が、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第１９２番から第２１７番までのアミノ酸配列若しくは配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第１９２番から第２２８番までのアミノ酸配列であるか；又は、Ｘ2 mで表されるアミノ酸配列が、配列番号１１で表わされるアミノ酸配列の第１９１番から第２１６番までのアミノ酸配列若しくは配列番号１１で表わされるアミノ酸配列の第１９１番から第２２７番までのアミノ酸配列である、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔７〕　Ｘ1 nで表されるアミノ酸配列が配列番号２に表されるアミノ酸配列の第１番から第４９番または第２６番から第４９番までのアミノ酸配列であり、かつ、Ｘ2 mで表されるアミノ酸配列が配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２１７番までのアミノ酸配列または配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２２８番までのアミノ酸配列である、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔８〕　前記タンパク質が、（Ａ）に規定されるタンパク質である、〔1〕～〔７〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔９〕　前記タンパク質が、（Ａ）に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示す、〔１〕～〔７〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔１０〕　標識タンパク質及び／又はアフィニティタグとの融合タンパク質である、〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔１１〕　被導入物質により修飾された〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔１２〕　被導入物質が、蛍光化合物である、〔１１〕に記載のタンパク質。
〔１３〕　〔１〕～〔１０〕のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
〔１４〕　〔１３〕に記載の核酸を含む、発現用ベクター。
〔１５〕　〔１４〕に記載の発現用ベクターにより形質転換された、形質転換体。
〔１６〕　哺乳細胞において脂肪滴の可視化に用いるための、〔１３〕に記載の発現用ベクター。
〔１７〕　哺乳細胞において脂肪滴の可視化に用いるための、〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載のタンパク質。
〔１８〕　〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載のタンパク質に対する抗体。
　本発明のタンパク質は、細胞内小器官である脂肪滴への特異的局在性を示す。また、本発明のタンパク質によれば、生細胞又は固定細胞において脂肪滴を特異的に可視化（イメージング）することが可能となる。さらに、本発明のタンパク質によれば、正確な像として、細胞内における脂肪滴のみを特異的に可視化することができる。同時に、本発明のタンパク質によれば、本来の細胞の状態、及び細胞内における本来の脂肪滴の状態を変化させることなく、該脂肪滴のみを特異的に可視化することが可能となる。
図１は、実施例で用いた１ｂ型のＨＣＶ－Ｏ株のＮＳ４Ｂタンパク質をコードする塩基配列を示す。 図２は、上記１ｂ型のＨＣＶ－Ｏ株のＮＳ４Ｂタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図３は、各種ＨＣＶサブタイプ間で、ＮＳ４Ｂタンパク質のアミノ酸配列を比較（アライメント解析）した結果を示す。 図４は、ＮＳ４Ｂタンパク質の構造（三つの領域）を示す模式図である。 図５は、実施例で製造した本発明のタンパク質（脂肪滴への特異的局在性を示す４ＢＮＣ）の模式図である。図５において、４ＢＮＣは、二ヶ所の脂肪滴局在性の配列（４ＢＮ及び４ＢＣ）を連結して作成したタンパク質であり、該タンパク質は極めて高い特異性で脂肪滴膜に局在することが判明した。図５において、Cherry－4BNCは、上記４BNCを蛍光タンパク質mCherryと融合させて得られるタンパク質の構造を示す。図５において、EGFP－4BNCは、上記４BNCを蛍光タンパク質EGFPと融合させて得られるタンパク質の構造を示す。これら異なる蛍光タンパク質を４BNCに連結しても脂肪滴膜への局在性に変化はなく、４BNCを蛍光タンパク質と連結して細胞に発現させると、脂肪滴の膜が描出され、Bodipy493/503などの従来の脂肪滴染色試薬とは異なる、新しい脂肪滴のイメージングが可能になった。 図６は、実施例で製造したＣｈｅｒｒｙ-４ＢＮと脂肪滴との相互作用を解析した結果を示す。 図７は、実施例で製造したＣｈｅｒｒｙ-４ＢＣと脂肪滴との相互作用を解析した結果を示す。 図８は、実施例で製造したＣｈｅｒｒｙ-４ＴＭと脂肪滴との相互作用を解析した結果を示す。 図９は、実施例で製造したＣｈｅｒｒｙ-４ＢＮＣ（本発明のタンパク質の一例）と脂肪滴との相互作用を解析した結果（脂肪滴のイメージング）を示す。 図１０は、実施例で製造したＥＧＦＰ-４ＢＮＣ（本発明のタンパク質の一例）と脂肪滴との相互作用を解析した結果（脂肪滴のイメージング）を示す。 図１１は、上記Ｃｈｅｒｒｙ-４ＢＮＣ（本発明のタンパク質の一例）を用いて、脂肪滴の少ないヒトＨＥＫ２９３細胞（ヒト由来培養細胞）において脂肪滴の可視化（イメージング）を行った結果を示す。脂肪滴を誘導するために脂肪酸（stearic acid, 50μＭ）を添加してある。 図１２は、実施例で製造した各種ＮＳ４Ｂ融合タンパク質（コンストラクト）の構造を示す図である。 図１３は、実施例で製造したＣｈｅｒｒｙ－４Ｂｆｕｌｌ（ＮＳ４Ｂ全長）と脂肪滴との相互作用を解析した結果を示す。 図１４は、各種ＮＳ４Ｂ融合タンパク質と脂肪滴との相互作用を解析した結果を示す。 図１５は、ＮＳ４Ｂに存在するamphipathic α-helixの位置を示す図である。 図１６は、ＮＳ４Ｂのamphipathic α-helixの長軸方向から見たアミノ酸配置を示す図である。 図１７は、実施例で製造したＮＳ４Ｂの各種変異体を説明する図である。 図１８は、実施例で製造したＮＳ４Ｂの各種変異体を説明する図である。 図１９は、各種ＨＣＶサブタイプ間で、ＮＳ４Ｂにおける脂肪滴との相互作用に重要なアミノ酸を比較した結果を示す
　本発明の第一の態様は、
「(Ａ)配列番号２で表されるアミノ酸配列の第５０番から第７３番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ1 nで表されるアミノ酸配列(０≦ｎ≦４９であり、ｎが２以上の場合、Ｘ1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ａ）のＣ末端に、
　配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ2 mで表されるアミノ酸配列(０≦ｍ≦２６であり、ｍが２以上の場合、Ｘ2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ｂ）のＮ末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；
(Ｂ)（Ａ)に規定されるタンパク質において上記第５０番から第７３番までアミノ酸配列および／又は上記第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域中に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；または
（Ｃ）（Ａ)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質」に関する。
　本発明において、タンパク質が「脂肪滴への特異的局在性」を有するとは、蛍光タンパク質であるｍＣｈｅｒｒｙと対象タンパク質との融合タンパク質をコードする領域を含む哺乳細胞用発現ベクターでＯｃ細胞を形質転換（トランスフェクション）し、蛍光顕微鏡により該細胞を観察した場合に、融合タンパク質が脂肪滴膜にのみ局在する細胞数が５０％を超え、該融合タンパク質が脂肪滴膜及び細胞内の他の部位（例えば、細胞質、ＥＲ等の細胞小器官）に局在する細胞数が５０％未満であり、かつ該融合タンパク質が脂肪滴には局在せず細胞内の他の部位に局在する細胞数が０％であることを意味する。形質転換（トランスフェクション）及び蛍光顕微鏡による観察の具体的な方法は、実施例に記載する通りである。該融合タンパク質が脂肪滴膜にのみ局在する細胞の数は、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上、最も好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上である。
　本発明の第一の態様において、（Ａ）に規定されるタンパク質は、以下の構造からなる。
Ｘ1 n－WAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGN－Ｘ2 m－VSPTHYVPESDAAARVTQILSSLTITQLLKRLHQWINEDCSTPC
　上記の構造において、Ｘ1 n－WAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGNは、ポリペプチド（ａ)に相当する。Ｘ2 m－VSPTHYVPESDAAARVTQILSSLTITQLLKRLHQWINEDCSTPCは、ポリペプチド（ｂ）に相当する。ここで、例えば、ｎ＝５である場合には、Ｘ1 5は、「ＡＡＳＳＷ」のように、相互に同一又は異なるアミノ酸を含み得る。また、例えば、ｍ＝５である場合には、Ｘ2 5は、「ＡＡＳＳＷ」のように、相互に同一又は異なるアミノ酸を含み得る。
　上記の通り、（Ａ）に規定されるタンパク質は、上記ポリペプチド(ａ)のＣ末端に上記ポリペプチド（ｂ）のＮ末端が結合してなるタンパク質である。ポリペプチド（ａ)は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第５０番から第７３番までのアミノ酸配列をそのＣ末端領域に有する。第５０番から第７３番までの上記アミノ酸配列の領域は、この領域の中に、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示すために機能する領域を含むからである。一方、ポリペプチド（ｂ）は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列をそのＣ末端領域に有する。第２１８番から第２６１番までの上記アミノ酸配列も、この領域の中に、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示すために機能する領域を含むからである。
　ポリペプチド（ａ）のＮ末端領域は、Ｘ1 nで表わされるアミノ酸配列で構成され、そのアミノ酸残基の数（ｎ）は、上記の通り、０～４９の範囲であり、好ましくは７～４９の範囲、より好ましくは１０～４９の範囲、さらに好ましくは２４～４９の範囲である。本発明のタンパク質が脂肪滴に特異的な局在性を示す限り、アミノ酸配列Ｘ1 nを構成するアミノ酸の種類は特に限定されるものではない。例えば、アミノ酸配列Ｘ1 nは、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１番から第４９番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｎ（１≦ｎ≦４９）のアミノ酸配列であってもよい（但し、配列番号２１における第２番目及び第８番目のアミノ酸「Ｘａａ」、並びに配列番号２３における第６番目のアミノ酸「Ｘａａ」は、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示す限り、任意のアミノ酸を取り得る）。或いは、アミノ酸配列Ｘ1 nは、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１番から第４８番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｎ（１≦ｎ≦４８）のアミノ酸配列であってもよい。
　脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質を提供するという観点から、アミノ酸配列Ｘ1 nは、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第４３番から第４９番までのアミノ酸配列であるか、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第４０番から第４９番までのアミノ酸配列であるか、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第２６番から第４９番までのアミノ酸配列であるか、または、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第１番から第４９番までのアミノ酸配列であることが好ましい（但し、配列番号２１における第２番目及び第８番目のアミノ酸「Ｘａａ」、並びに配列番号２３における第６番目のアミノ酸「Ｘａａ」は、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示す限り、任意のアミノ酸を取り得る）。或いは、アミノ酸配列Ｘ1 nは、配列番号１１に表わされるアミノ酸配列の第４３番から第４８番までのアミノ酸配列であるか、配列番号１１に表わされるアミノ酸配列の第４０番から第４８番までのアミノ酸配列であるか、配列番号１１に表わされるアミノ酸配列の第２６番から第４８番までのアミノ酸配列であるか、または、配列番号１１に表わされるアミノ酸配列の第１番から第４８番までのアミノ酸配列であることが好ましい。アミノ酸配列Ｘ1 nが、これらのアミノ酸配列である場合には、本発明のタンパク質が有する脂肪滴に対する特異的局在性が強まるからである。
　一方、ポリペプチド（ｂ）のＮ末端領域は、アミノ酸配列Ｘ2 mで構成され、そのアミノ酸残基の数（ｍ）は、上記の通り、０～２６である。アミノ酸配列Ｘ2 mを構成するアミノ酸の種類は特に限定されるものではない。例えば、アミノ酸配列Ｘ2 mは、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２１７番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦２６）のアミノ酸配列であってもよい。或いは、アミノ酸配列Ｘ2 mは、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１９１番から第２１６番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦２６）のアミノ酸配列であってもよい。
　脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質を提供するという観点から、アミノ酸配列Ｘ2 mは、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第１９２番から第２１７番までのアミノ酸配列であることが好ましい。或いは、アミノ酸配列Ｘ2 mは、配列番号１１で表わされるアミノ酸配列の第１９１番から第２１６番までのアミノ酸配列であることが好ましい。アミノ酸配列Ｘ2 mが、これらのアミノ酸配列である場合には、本発明のタンパク質が有する脂肪滴に対する特異的局在性が強まるからである。
　また、本発明の第二の態様は、
「(Ａ)配列番号２で表されるアミノ酸配列の第５０番から第７３番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ1 nで表されるアミノ酸配列(０≦ｎ≦４９であり、ｎが２以上の場合、Ｘ1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ａ）のＣ末端に、
　配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２２９番から第２６１番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ2 mで表されるアミノ酸配列(０≦ｍ≦３７であり、ｍが２以上の場合、Ｘ2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ｂ）のＮ末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；
(Ｂ)（Ａ)に規定されるタンパク質において上記第５０番から第７３番までアミノ酸配列および／または上記第２２９番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域中に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；または
（Ｃ）（Ａ)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質」に関する。
　本発明の第二の態様において、（Ａ）に規定されるタンパク質は、以下の構造からなる。
Ｘ1 n－WAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGN－Ｘ2 m－AAARVTQILSSLTITQLLKRLHQWINEDCSTPC
　上記の構造において、Ｘ1 n－WAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGNは、ポリペプチド（ａ)に相当する。Ｘ2 m－AAARVTQILSSLTITQLLKRLHQWINEDCSTPCは、ポリペプチド（ｂ）に相当する。ここで、例えば、ｎ＝５である場合には、Ｘ1 5は、「ＡＡＳＳＷ」のように、相互に同一又は異なるアミノ酸を含み得る。また、例えば、ｍ＝５である場合には、Ｘ2 5は、「ＡＡＳＳＷ」のように、相互に同一又は異なるアミノ酸を含み得る。
　上記の通り、（Ａ）に規定されるタンパク質は、上記ポリペプチド(ａ)のＣ末端に上記ポリペプチド（ｂ）のＮ末端が結合してなるタンパク質である。ポリペプチド（ａ)は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第５０番から第７３番までのアミノ酸配列をそのＣ末端領域に有する。第５０番から第７３番までの上記アミノ酸配列の領域は、この領域の中に、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示すために機能する領域を含むからである。一方、ポリペプチド（ｂ）は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第２２９番から第２６１番までのアミノ酸配列をそのＣ末端領域に有する。第２２９番から第２６１番までの上記アミノ酸配列も、この領域の中に、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示すために機能する領域を含むからである。
　ポリペプチド（ａ）のＮ末端領域は、Ｘ1 nで表わされるアミノ酸配列で構成され、そのアミノ酸残基の数（ｎ）は、上記の通り、０～４９の範囲であり、好ましくは７～４９の範囲、より好ましくは１０～４９の範囲、さらに好ましくは２４～４９の範囲である。本発明のタンパク質が脂肪滴に特異的な局在性を示す限り、アミノ酸配列Ｘ1 nを構成するアミノ酸の種類は特に限定されるものではない。例えば、アミノ酸配列Ｘ1 nは、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１番から第４９番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｎ（１≦ｎ≦４９）のアミノ酸配列であってもよい（但し、配列番号２１における第２番目及び第８番目のアミノ酸「Ｘａａ」、並びに配列番号２３における第６番目のアミノ酸「Ｘａａ」は、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示す限り、任意のアミノ酸を取り得る）。或いは、アミノ酸配列Ｘ1 nは、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１番から第４８番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｎ（１≦ｎ≦４８）のアミノ酸配列であってもよい。
　脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質を提供するという観点から、アミノ酸配列Ｘ1 nは、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第４３番から第４９番までのアミノ酸配列であるか、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第４０番から第４９番までのアミノ酸配列であるか、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第２６番から第４９番までのアミノ酸配列であるか、または、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第１番から第４９番までのアミノ酸配列であることが好ましい（但し、配列番号２１における第２番目及び第８番目のアミノ酸「Ｘａａ」、並びに配列番号２３における第６番目のアミノ酸「Ｘａａ」は、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示す限り、任意のアミノ酸を取り得る）。或いは、アミノ酸配列Ｘ1 nは、配列番号１１に表わされるアミノ酸配列の第４３番から第４８番までのアミノ酸配列であるか、配列番号１１に表わされるアミノ酸配列の第４０番から第４８番までのアミノ酸配列であるか、配列番号１１に表わされるアミノ酸配列の第２６番から第４８番までのアミノ酸配列であるか、または、配列番号１１に表わされるアミノ酸配列の第１番から第４８番までのアミノ酸配列であることが好ましい。アミノ酸配列Ｘ1 nが、これらのアミノ酸配列である場合には、本発明のタンパク質が脂肪滴により特異的に局在するからである。
　一方、ポリペプチド（ｂ）のＮ末端領域は、アミノ酸配列Ｘ2 mで構成され、そのアミノ酸残基の数（ｍ）は、上記の通り、０～３７である。アミノ酸配列Ｘ2 mを構成するアミノ酸の種類は特に限定されるものではない。例えば、アミノ酸配列Ｘ2 mは、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２２８番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦３７）のアミノ酸配列であってもよい。或いは、アミノ酸配列Ｘ2 mは、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１９１番から第２２７番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦２６）のアミノ酸配列であってもよい。
　脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質を提供するという観点から、アミノ酸配列Ｘ2 mは、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第１９２番から第２２８番までのアミノ酸配列であることが好ましい。或いは、アミノ酸配列Ｘ2 mは、配列番号１１で表わされるアミノ酸配列の第１９１番から第２２７番までのアミノ酸配列であることが好ましい。アミノ酸配列Ｘ2 mが、これらのアミノ酸配列である場合には、本発明のタンパク質が脂肪滴により特異的に局在するからである。
　ところで、配列番号２に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が１ｂ型であるＨＣＶ－Ｏ株（ゲノム塩基配列のGenBank Accession number: AB19133、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAD91386）の非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）のアミノ酸配列である。配列番号３に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が１ａ型であるＨＣＶ（isolate H）（ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: P27958）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号４に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が１ｃ型であるＨＣＶ(isolate HC-G9)（ゲノム塩基配列のAccession number: D14853、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA03581）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号５に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が２ａ型であるＨＣＶ（ポリプロテインｃｄｓ領域の塩基配列のAccession number: AY746460、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: AAU89634）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号６に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が２ｂ型であるＨＣＶ(strain MD2b-1)（ゲノム塩基配列のAccession number: AF238486、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: AAF59945）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号７に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が２ｃ型であるＨＣＶ(isolate BEBE1)（ゲノム塩基配列のAccession number: D50409、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: Q68749）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号８に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が２ｋ型であるＨＣＶ(isolate VAT96)（ゲノム塩基配列のAccession number: AB031663、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA88057）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号９に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が３ａ型であるＨＣＶ(isolate HCV-K3a/650)（ゲノム塩基配列のAccession number: D28917、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: Q81495）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１０に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が３ｂ型であるＨＣＶ(isolate Tr Kj)（ゲノム塩基配列のAccession number: D49374、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA08372）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１１に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が４ａ型であるＨＣＶ（isolate 02-42）（ポリプロテインｃｄｓ領域の塩基配列のAccession number: DQ418783、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABD75825）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１２に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が４ｄ型であるＨＣＶ（ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABD75828）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１３に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が５ａ型であるＨＣＶ(isolate EUH1480)（ポリプロテイン・コード領域塩基配列のAccession number: Y13184、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: CAA73640）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１４に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６ａ型であるＨＣＶ(isolate EUHK2)（ポリプロテイン・コード領域塩基配列のAccession number: Y12083、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: CAA72801）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１５に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６ｂ型であるＨＣＶ(isolate Th580)（ゲノム塩基配列のAccession number: D84262、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA32664）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１６に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６ｆ型であるＨＣＶ(isolate C-0044)（ゲノム塩基配列のAccession number: DQ835760、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABI36963）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１７に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６ｇ型であるＨＣＶ(isolate JK046)（ゲノム塩基配列のAccession number: D63822、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA09891）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１８に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６ｈ型であるＨＣＶ(isolate VN004)（ゲノム塩基配列のAccession number: D84265、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA32667）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号１９に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６ｉ型であるＨＣＶ(isolate C-0159)（ゲノム塩基配列のAccession number: DQ835762、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABI36965）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号２０に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６ｋ型であるＨＣＶ(isolate VN405)（ゲノム塩基配列のAccession number: D84264、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: BAA32666）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号２１に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６ｌ型であるＨＣＶ(isolate 537796)（ゲノム塩基配列のAccession number: EF424628、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABP88847）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号２２に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６ｍ型であるＨＣＶ(isolate C-0208)（ゲノム塩基配列のAccession number: DQ835763、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABI36966）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。配列番号２３に示すアミノ酸配列は、遺伝子型が６o型であるＨＣＶ(isolate QC227)（ゲノム塩基配列のAccession number: EF424627、ポリプロテイン・アミノ酸配列のAccession number: ABP88846）のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列である。図３に、配列番号２～２３に示されるアミノ酸配列について、アライメント解析を行った結果が示されている。図３に示される配列は、上から順に、配列番号３、２、４～２３に示すアミノ酸配列である。上記の通り、配列番号２～２３に示されるＮＳ４Ｂのアミノ酸配列は、上記遺伝子型（サブタイプ）の特定のＨＣＶに由来するものであるが、上記以外の遺伝子型（サブタイプ）のＨＣＶが多数存在し、さらに、同じ遺伝子型（サブタイプ）の中でも塩基配列及びアミノ酸配列が異なるものも存在する。本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２～２３に基づいて設計してもよいが、その他公知のＮＳ４Ｂのアミノ酸配列に基づいて設計してもよい。
　本発明において、（Ｂ）に規定されるタンパク質は、（Ａ）に規定されるタンパク質において、配列番号２における上記第５０番から第７３番までのアミノ酸配列の領域（ポリペプチド（ａ）に存在する領域）、及び／又は上記第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域（ポリペプチド（ｂ）に存在する領域）中に１もしくは数個のアミノ酸が、欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質である。ここで、「１もしくは数個」の範囲は、本発明のタンパク質が脂肪滴への特異的局在性を示す限り、特に限定されない。例えば、上記第５０番から第７３番までのアミノ酸配列の領域（ポリペプチド（ａ）に存在する領域）について言えば、１から２０個、好ましくは１から９個、より好ましくは１から５個、特に好ましくは１から４個、１から３個、１から２個、１個とすることができる。一方、上記第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域（ポリペプチド（ｂ）に存在する領域）について言えば、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から９個、特に好ましくは１から５個、１から４個、１から３個、１から２個、１個とすることができる。さらに、本発明のタンパク質（Ｂ）において上記第５０番から第７３番までのアミノ酸配列の領域、及び／又は上記第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域中に、このようなアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加がある場合において、アミノ酸配列Ｘ1 n及びＸ2 mの好ましい配列は、上記タンパク質（Ａ）について記載した通りである。
　さらに、図３のアライメント解析の結果を考慮すると、（Ｂ）に規定されるタンパク質は、例えば、配列番号２における上記第５０番から第７０番までのアミノ酸配列の領域において、第５１番目のアラニン（Ａ）がヒスチジン（Ｈ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、チロシン（Ｙ）又はトレオニン（Ｔ）に置換され；第５２番目のリシン（Ｋ）がグルタミン（Ｑ）に置換され；第５３番目のヒスチジン（Ｈ）がグルタミン（Ｑ）に置換され；第５４番目のメチオニン（Ｍ）がロイシン（Ｌ）に置換され；第５８番目のイソロイシン（Ｉ）がバリン（Ｖ）に置換され；及び／又は第７３番目のアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）に置換されたものが挙げられる。
　また、図３のアライメント解析の結果を考慮すると、（Ｂ）に規定されるタンパク質は、例えば、配列番号２における上記第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域において、第２１８番目のバリン（Ｖ）がグリシン（Ｇ）に置換され；第２１９番目のセリン（Ｓ）がアラニン（Ａ）に置換され；第２２１番目のトレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）に置換され；第２２５番目のプロリン（Ｐ）がトレオニン（Ｔ）又はアラニン（Ａ）に置換され；第２２７番目のセリン（Ｓ）がトレオニン（Ｔ）に置換され；第２２９番目のアラニンがトレオニン（Ｔ）に置換され；第２３０番目のアラニン（Ａ）がセリン（Ｓ）に置換され；第２３１番目のアラニン（Ａ）がバリン（Ｖ）、グルタミン（Ｑ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）又はアルギニン（Ｒ）に置換され；第２３２番目のアルギニン（Ｒ）がリシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、アラニン（Ａ）又はグルタミン（Ｑ）に置換され；第２３３番目のバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に置換され；第２３４番目のトレオニン（Ｔ）がメチオニン（Ｍ）に置換され；第２３５番目のグルタミン（Ｑ）がヒスチジン（Ｈ）、アラニン（Ａ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）又はセリン（Ｓ）に置換され；第２３６番目のイソロイシン（Ｉ）がロイシン（Ｌ）に置換され；第２３８番目のセリン（Ｓ）がトレオニン（Ｔ）又はグリシン（Ｇ）に置換され；第２４２番目のイソロイシン（Ｉ）がバリン（Ｖ）に置換され；第２４４番目のグルタミン（Ｑ）がセリン（Ｓ）又はアルギニン（Ｒ）に置換され；第２４６番目のロイシン（Ｌ）がプロリン（Ｐ）に置換され；第２４７番目のリシン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に置換され；第２４８番目のアルギニン（Ｒ）がリシン（Ｋ）に置換され；第２５１番目のグルタミン（Ｑ）がバリン（Ｖ）、アスパラギン（Ｎ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、リシン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）又はヒスチジン（Ｈ）に置換され；第２５３番目のイソロイシン（Ｉ）がバリン（Ｖ）に置換され；第２５４番目のアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）又はヒスチジン（Ｈ）に置換され；第２５５番目のグルタミン酸（Ｅ）がセリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）又はトレオニン（Ｔ）に置換され；第２５６番目のアスパラギン酸（Ｄ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換され；第２５７番目のシステイン（Ｃ）がチロシン（Ｙ）、トレオニン（Ｔ）又はトリプトファン（Ｗ）に置換され；第２５８番目のセリン（Ｓ）がトレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）又はアラニン（Ａ）に置換され；及び／又は第２５９番目のトレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）又はセリン（Ｓ）に置換されたものが挙げられる。
　本発明において、（Ｃ）に規定されるタンパク質は、上記（Ａ)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質である。（Ｃ）に規定されるタンパク質は、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質であって、上記（Ａ）に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列相同性を有する。本発明において「配列相同性」という語は、２以上のアミノ酸配列の互いに対する同一性の程度を指す。したがって、ある二つのアミノ酸配列の相同性が高い程、それらの配列の同一性又は類似性は高い。２種類のアミノ酸配列が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較によって解析することが可能であり、具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて解析することができる。
　さらに、本発明のタンパク質は、上記タンパク質（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）と、標識タンパク質及び／又はアフィニティタグとの融合タンパク質を含む。本発明の融合タンパク質において、標識タンパク質及び／又はアフィニティタグは、上記タンパク質（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のＮ末端側及び／又はＣ末端側に位置し得る。また、本発明の融合タンパク質は、当該タンパク質が脂肪滴への特異的局在性を有する限りにおいて、複数種の標識タンパク質及び／又はアフィニティタグも含み得る。本発明の融合タンパク質において、上記タンパク質（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）と標識タンパク質及び／又はアフィニティタグとは直接連結していてもよいし、各種リンカーを介して結合していてもよい。
　上記標識タンパク質としては、蛍光タンパク質が挙げられ、その具体例としては、ＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰ、ＲＦＰ、ｍＷａｓａｂｉ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＤｓＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲｕｂｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＢａｎａｎａ、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなどが挙げられる。上記アフィニティタグの例としては、Ｈｉｓタグ、HAタグ、mycタグ、FLAGタグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｅタグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、Ｈａｌｏタグ等が挙げられる。
　さらに、本発明のタンパク質は、上記タンパク質（Ａ）、（Ｂ）若しくは（Ｃ）、又は上記融合タンパク質が被導入物質により修飾されたものを含む。標的細胞において所望の被導入物質を脂肪滴に局在させることが可能となるからである。被導入物質の具体例としては、脂肪を分解する物質（例えば、各種リパーゼ）、ビオチン等のタンパク質標識化合物、蛍光化合物等が挙げられる。脂肪を分解する物質で修飾された本発明のタンパク質の用途としては、例えば、肥満の治療又は予防が想定される。蛍光化合物により標識された本発明のタンパク質の用途としては、細胞内における脂肪滴の可視化（イメージング）が想定される。蛍光化合物の具体例としては、フルオロセイン（fluorescein）、ローダミン（rhodamine）、Cy色素（例えば、Cy3、Cy 5）、アレクサ色素等が挙げられる。
　本発明のタンパク質は、公知の各種遺伝子工学的技術により製造してもよいし、化学合成により製造してもよい。
　本発明者は、後述の実施例に示す通り、1b型であるＨＣＶ－Ｏ株の全長を含むプラスミドpON/C-5B/KE (Ikeda M. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 329（2005)１３５０－１３５９）を鋳型ＤＮＡとして、ＮＳ４Ｂコード領域のうち、そのＮ末端領域及びＣ末端領域をＰＣＲによりそれぞれ増幅し、オーバーラップＰＣＲにより各断片を連結した。次いで、連結した断片を、各種発現ベクターに増幅断片を導入することにより、本発明の一例であるタンパク質をコードする哺乳動物発現プラスミドを作成した。しかしながら、本発明のタンパク質を遺伝子工学的に作成する上で、出発材料は上記プラスミドに限定されるものでもなく、その具体的な発現系の構築方法も上記方法に限定されるものではない。
　上述のタンパク質（Ａ）、（Ｂ）若しくは（Ｃ）、又は上記融合タンパク質をコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を作成し、公知の各種発現ベクターに組み込むことにより、本発明のタンパク質を発現させることができる。本発明のタンパク質をコードする核酸を作成する上で、アミノ酸の欠失、置換及び／または付加を施すためには、例えば、エラープローンＰＣＲ法、ＤＮＡシャッフリング法、各種部位特異的変異導入法などにより、任意の塩基の欠失、置換及び／または挿入を行うことができる。
　本発明において用いられる発現ベクターの種類は特に限定されず、細菌（例えば、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis））、真菌類（例えば、酵母類）等の微生物、植物、昆虫細胞、哺乳細胞などのホストにおいてタンパク質の発現を可能とする各種発現ベクターを用いることができ、ウイルスベクター（ファージベクターを含む）でもプラスミドベクターであってもよい。あるいは、ウサギ網状赤血球ライセート、小麦胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いた無細胞タンパク質合成系を用いて、本発明のタンパク質を製造することもできる。このうち、本発明のタンパク質を用いて哺乳細胞の脂肪滴を観察又は解析する場合には、哺乳細胞発現用のプラスミドベクター又はウイルスベクターを用いることが好ましい。哺乳細胞において本発明のタンパク質を発現させると、発現した本発明のタンパク質は細胞内の脂肪滴に特異的に局在する。したがって、本発明のタンパク質をコードする核酸を哺乳細胞発現用のプラスミドベクター又はウイルスベクターに組み込み、該プラスミドベクター又はウイルスベクターを哺乳細胞で形質転換すれば、本発明のタンパク質を哺乳細胞において直接発現させることが可能であり、発現した本発明のタンパク質は細胞内の脂肪滴に特異的に局在し、哺乳細胞の脂肪滴を観察又は解析することができる。また、脂肪滴は、哺乳細胞だけでなく、広く真核生物（植物を含む）や原核生物（例えば、細菌）にも存在することが知られている（Murphy DJ: Prog. Lipid Res. 40, 325-438, 2001）。細胞内に脂肪滴を有する生物種をホストとして、それらの生物種に応じた各種タンパク質発現ベクターを用い、本発明のタンパク質を発現させてもよい。各種生物種において発現した本発明のタンパク質は、細胞内の脂肪滴に局在し、それら生物種の脂肪滴を観察又は解析することができる。
　また、上記タンパク質（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）と蛍光タンパク質との融合タンパク質を、所望の哺乳細胞において発現させれば、直接的に、脂肪滴を可視化することができる。また、上記タンパク質（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）とアフィニティタグとの融合タンパク質を遺伝子工学的に発現させた場合には、各種アフィニティ精製法により、本発明のタンパク質を精製することが可能となる。
　本発明のタンパク質は、上記の通り、所望の哺乳細胞において直接発現させることにより、脂肪滴の解析等に用いることも可能である。しかしながら、各種公知の方法により精製した本発明のタンパク質を、所望の哺乳細胞における脂肪滴の解析等に用いることもできる。具体的には、精製した本発明のタンパク質を所望の哺乳細胞へ導入することにより、細胞内脂肪滴の解析等を行うことができる。精製した本発明のタンパク質を所望の哺乳細胞へ導入するためには、例えば、脂質ベースのタンパク質導入試薬等を用いることができる。このようなタンパク質導入試薬は、試薬メーカーから入手可能である（例えば、LSin(PPU 社)；Pro-DeliverIN(OZB 社)；BioPORTER Protein Delivery Reagent(GTS 社)；アパキャリー1(CLG 社)；Ab-DeliverIN(OZB 社)）。
　本発明のタンパク質は、細胞内脂肪滴に特異的な局在性を示すことから、生細胞又は固定細胞において、脂肪滴の可視化（イメージング）ツールとして用いることができる。具体的には、上記タンパク質（Ａ）、（Ｂ）若しくは（Ｃ）に対する抗体、又はそれに融合させる標識タンパク質若しくはアフィニティタグに対する抗体を用いて、本発明のタンパク質を導入した細胞を免疫染色すれば、脂肪滴を可視化することができる。免疫染色の方法は公知の手法を用いることができる。また、本発明のタンパク質に蛍光タンパク質を融合させたものを細胞で発現させ、共焦点レーザー顕微鏡等を用いて該細胞を観察すれば、細胞内脂肪滴の精彩なイメージングが可能となる。さらに、本発明のタンパク質を蛍光化合物等で修飾したものを細胞に導入することによっても、同様に細胞内脂肪滴の精彩なイメージングが可能となる。
　さらに、本発明のタンパク質は細胞内脂肪滴に特異的な結合能力を有することから、脂肪分解物質（例えば、リパーゼ）等の被導入物質で修飾した本発明のタンパク質を脂肪細胞などの標的細胞に導入し、細胞内脂肪滴を分解することにより、肥満などの疾患の治療又は予防を行うことも可能となる。
　上述の通り、本発明のタンパク質は、細胞内脂肪滴の可視化ツール、薬物を含む被導入物質を脂肪滴に送達させるための薬物送達ツール等として用いることができる。
　また、本発明の別の態様は、以下のタンパク質に関する
　（１）配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１番から第７３番までのアミノ酸配列において、第４３番、第４６番、第５０番、第５７番、第６１番及び第６４番のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに変異したタンパク質；又は配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１番から第７２番までのアミノ酸配列において、第４３番、第４９番、第５６番、第６０番及び第６３番のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに変異したタンパク質。
（２）配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２６１番までのアミノ酸配列において、第２４２番、第２４６番、第２４９番及び第２５３番のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに変異したタンパク質；又は配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１９１番から第２６０番までのアミノ酸配列において、第２４１番、第２４５番、第２４８番及び第２５２番のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに変異したタンパク質。
（３）配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１番から第７３番までのアミノ酸配列のＣ末端に、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２６１番までのアミノ酸配列のＮ末端が結合してなるアミノ酸配列において、第４３番、第４６番、第５０番、第５７番、第６１番、第６４番、第２４２番、第２４６番、第２４９番及び第２５３番のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに変異したタンパク質；又は配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１番から第７２番までのアミノ酸配列のＣ末端に、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１９１番から第２６０番までのアミノ酸配列のＮ末端が結合してなるアミノ酸配列において、第４３番、第４９番、第５６番、第６０番、第６３番、第２４１番、第２４５番、第２４８番及び第２５２番のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに変異したタンパク質。
　上記（１）のタンパク質において、例えば、第４３番、第４６番及び第５０番（第４９番）のアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよいし、第５７番（第５６番）、第６１番（第６０番）及び第６４番（第６３番）が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよいし、あるいは、第４３番、第４６番、第５０番（第４９番）、第５７番（第５６番）、第６１番（第６０番）及び第６４番（第６３番）のアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよい。
　上記（２）のタンパク質において、例えば、第２４２番（第２４１番）、第２４６番（第２４５番）、第２４９番（第２４８番）及び第２５３番（２５２番）のアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよい。
　上記（３）のタンパク質において、例えば、第４３番、第４６番、第５０番（第４９番）、第５７番（第５６番）、第６１番（第６０番）及び第６４番（第６３番）のアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよいし、第４３番、第４６番、第５０番（第４９番）、第５７番（第５６番）、第６１番（第６０番）、第６４番（第６３番）、第２４２番（第２４１番）、第２４６番（第２４５番）、第２４９番（第２４８番）及び第２５３番（２５２番）のアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよいし、あるいは、第４３番、第４６番、第５０番（第４９番）、第２４２番（第２４１番）、第２４６番（第２４５番）、第２４９番（第２４８番）及び第２５３番（２５２番）のアミノ酸が独立にアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はプロリンに置換されていてもよい。
　上記（１）、（２）及び（３）のタンパク質において、各基準となるアミノ酸配列は配列番号２から選ばれることが好ましい。さらに、上記（１）、（２）及び（３）のタンパク質において、上記したアミノ酸の変異は、アラニンによる変異であることが好ましい。
　さらに、本発明は、上記（１）、（２）又は（３）のタンパク質をコードする核酸に関する。
　さらに、本発明は上記核酸を含む、発現用ベクターに関する。また、本発明は、前記発現用ベクターにより形質転換体に関する。
　以下、本発明について、実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
１．Ｃ型肝炎ウイルスＯ株の配列
　本実施例では、1b型のＨＣＶ－Ｏ株（DDBJ/EMBL/GenBank Accession number, AB191333, Ikeda et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 329, 1350-1359, 2005）の配列を用いた。
　ＮＳ４Ｂはこの配列のヌクレオチド番号5475～6257によってコードされるタンパク質であり、２６１アミノ酸から成る。ＨＣＶ－Ｏ株ＮＳ４Ｂのヌクレオチド配列を図１及び配列番号１に示す。また、ＨＣＶ－Ｏ株ＮＳ４Ｂのアミノ酸配列を図２及び配列番号２に示す。
２．ＮＳ４Ｂの機能領域（ドメイン）の設定
　ＮＳ４Ｂは小胞体（ＥＲ；endoplasmic reticulum）に局在する膜タンパク質であり、その中央部がＥＲ膜に埋め込まれ、Ｎ末端側の一部とＣ末端側の一部が細胞質側に出ていると考えられている。つまり、ＮＳ４Ｂタンパク質は、Ｎ末端側細胞質ドメイン（４ＢＮ）、膜貫通ドメイン（４ＢＴＭ）、及びＣ末端側細胞質ドメイン（４ＢＣ）の三つの領域に分類することができる（図４参照）。
　現在、ＮＳ４Ｂの結晶構造解析が為されていないため、正確な立体構造は不明である。４ＢＮと４ＢＴＭの境界はアミノ酸残基７０～７５番付近と考えられているが定まっていない。複数のタンパク質二次構造予測プログラムでアミノ酸残基７４番からαへリックスが始まることが予測されている（Gouttenoire et al, J. Virol. 83, 6257-6268, 2009）。そこで、このαへリックスを最初の膜貫通αへリックスと考え、アミノ酸残基１～７３を４ＢＮとした。４ＢＴＭと４ＢＣの境界は配列の特徴からおおむねコンセンサスが得られており、４ＢＴＭはアミノ酸残基７４～１９１、４ＢＣはアミノ酸残基１９２～２６１とした(Jones et al, J. Virol. 83, 2163-2177, 2009)。下記の通り、これらの各領域と蛍光タンパク質との融合タンパク質を作出した。さらに、ＮＳ４Ｂの全長アミノ配列（アミノ酸残基１～２６１）からなる４Ｂｆｕｌｌ、アミノ酸残基１～２５からなる４Ｂ１（４ＢＮの一部）、アミノ酸残基２６～４９からなる４Ｂ２（４ＢＮの一部）、アミノ酸残基５０～７３からなる４Ｂ３（４ＢＮの一部）、アミノ酸残基１～４９からなる４Ｂ１－２（４ＢＮの一部）、アミノ酸残基２６～７３からなる４Ｂ２－３（４ＢＮの一部）、アミノ酸残基１９２～２１７からなる４Ｂ９（４ＢＣの一部）、アミノ酸残基２１８～２３９からなる４Ｂ１０（４ＢＣの一部）、アミノ酸残基２４０～２６１からなる４Ｂ１１（４ＢＣの一部）、アミノ酸残基１９２～２３９からなる４Ｂ９－１０（４ＢＣの一部）、アミノ酸残基２１８～２６１からなる４Ｂ１０－１１（４ＢＣの一部）についても、同様に蛍光タンパク質との融合タンパク質を作出した。蛍光タンパク質として例えばｍＣｈｅｒｒｙを用いる場合、各融合タンパク質は、Ｃｈｅｒｒｙ－に領域名を付してＣｈｅｒｒｙ-４ＢＮなどの名前で表す。
３．４Ｂｆｕｌｌ、４ＢＮ、４ＢＴＭ、４ＢＣ、４Ｂ１、４Ｂ２、４Ｂ３、４Ｂ１－２、４Ｂ２－３、４Ｂ９、４Ｂ１０、４Ｂ１１、４Ｂ９－１０、４Ｂ１０－１１をコードする遺伝子断片の作製
　ＮＳ４Ｂの各領域をＰＣＲにより増幅した。各増幅断片を蛍光タンパク質発現ベクターに組み込むために、ＰＣＲに用いたプライマーには制限酵素認識配列を付加した（Ｕ側：Bgl II サイト, Ｒ側：Eco RIサイト）。また、Ｒ側プライマーでは４Ｂ配列の最後に終止コドンを挿入した。鋳型として、ＨＣＶ－Ｏ株の全長を含むプラスミドpON/C-5B/KE (Ikeda M. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 329（2005)１３５０－１３５９）又は以下に示す各プラスミドを用い、ＤＮＡポリメラーゼは高フィデリティのPrimeSTAR HS DNA polymerase (タカラバイオ社、以下ＰＳと略す)を用いた。
　以下に、各プライマーの配列を示す。
４Ｂｆｕｌｌ用プライマー
　Ｕ側　5'-TTTAGATCTGCCTCGCACCTCCCTTAC-3'（配列番号２４）（４ＢＮ用Ｕ側プライマー）
　Ｒ側　5'-TTTGAATTCTTAGCATGGCGTGGAGCAGTC-3'（配列番号２９）（４ＢＣ用Ｒ側プライマー）
4BN用プライマー
　Ｕ側   5'-TTTAGATCTGCCTCGCACCTCCCTTAC-3'（配列番号２４）
　Ｒ側   5'-TTTGAATTCTTAGTTCCCAGGCAGAGTGGA-3'（配列番号２５）
4BTM用プライマー
　Ｕ側　　5'-TTTAGATCTCCCCCGATAGCTTCACTG-3'（配列番号２６）
　Ｒ側    5'-TTTGAATTCTTACAGTATTGCCGCGCACAC-3'（配列番号２７）
4BC用プライマー
　Ｕ側　　5'-TTTAGATCTCGCCGGCACGTGGGC-3'（配列番号２８）
　Ｒ側    5'-TTTGAATTCTTAGCATGGCGTGGAGCAGTC-3'（配列番号２９）
4B1用プライマー
　Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
　Ｒ側：5'-TTTGAATTCTTACAGCAACCCGAGCGCCTT-3'（配列番号３０）
　鋳型：Cherry-4BNプラスミド
4B2用プライマー
　Ｕ側：４Ｂ２－３用Ｕ側プライマー
　Ｒ側：5'-TTTGAATTCTTAAAAGGCCTCAAGGGCTTGC-3'（配列番号３１）
　鋳型：Cherry-4BNプラスミド
４Ｂ３用プライマー
　Ｕ側　　5'-TTTAGATCTTGGGCGAAGCACATGTGG-3'（配列番号３２）
　Ｒ側  　４ＢＮ用のＲ側プライマー
4B1-2用プライマー
　Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
　Ｒ側：４Ｂ２用Ｒ側プライマー
　鋳型：Cherry-4BNプラスミド
４Ｂ２－３用プライマー
　Ｕ側　　5'-TTTAGATCTCAAGCAGCCACCAAGCAAG-3'（配列番号３３）
　Ｒ側  　４ＢＮ用のＲ側プライマー
4B9用プライマー
　Ｕ側：４ＢＣ用Ｕ側プライマー
　Ｒ側：5'-TTTGAATTCTTAATGGTTACCCCGCGAAGCG-3'（配列番号３４）
　鋳型：Cherry-4BCプラスミド
4B10用プライマー
　Ｕ側：４Ｂ１０－１１用Ｕ側プライマー
　Ｒ側：5'-TTTGAATTCTTAGCTGGAGAGGATCTGAGTG-3'（配列番号３５）
　鋳型：Cherry-4BCプラスミド
4B11用プライマー
　Ｕ側：5'-TTTAGATCTCTTACCATCACCCAGCTGTT-3'（配列番号３６）
　Ｒ側：４ＢＣ用Ｒ側プライマー
　鋳型：Cherry-4BCプラスミド
4B9-10用プライマー
　Ｕ側：４ＢＣ用Ｕ側プライマー
　Ｒ側：４Ｂ１０用Ｒ側プライマー
　鋳型：Cherry-4BCプラスミド
４Ｂ１０－１１用プライマー
　Ｕ側　　5'-TTTAGATCTGTTTCCCCCACGCACTATG-3'（配列番号３７）
　Ｒ側  　4BC用のＲ側プライマー
（反応液の組成）
　ＰＳバッファー１０μＬ、dNTP(各2.5 mM)４μＬ、Ｕ側プライマー(0.1 mM)０．４μＬ、Ｒ側プライマー(0.1 mM)０．４μＬ、鋳型プラスミド１０ｎｇ、ＰＳ ０．５μＬ、残部を超純水とし、最終容量を50μＬとしてＰＣＲ反応を行った。
（ＰＣＲ反応）
　それぞれのプライマーペアを含む上記の反応液を作製し（４Ｂｆｕｌｌ用、４ＢＮ用、４ＢＴＭ用、４ＢＣ用、４Ｂ１用、４Ｂ２用、４Ｂ３用、４Ｂ１－２用、４Ｂ２－３用、４Ｂ９用、４Ｂ１０用、４Ｂ１１用、４Ｂ９－１０用、４Ｂ１０－１１用）、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒｝を２５サイクル繰返した。
４．４ＢＮＣをコードする遺伝子断片の作製
　４ＢＮＣとは、４ＢＮと４ＢＣを連結した配列である（図５参照）。４ＢＮの３’側と４ＢＣの５’側で配列が一部重複するような二つの断片を作製すれば、その二つの断片を直接ＰＣＲで連結できる。これら二つの断片を以下に示すプライマーを用いて、ＰＣＲにより作成した。
４ＢＮ側断片用プライマー
　Ｕ側    ４ＢＮ用のＵ側プライマー
　Ｒ側　　5'-CTCCCCCGGGCCCACGTGCCGGCGGTTCCCAGGCAGAGTGGA-3'（配列番号３８）
４ＢＣ側断片用プライマー
　Ｕ側    5'-CGCCGGCACGTGGGCC-3'（配列番号３９）
  Ｒ側　　４ＢＣ用のＲ側プライマー
　まず、４ＢＮ側断片と４ＢＣ側断片を各々ＰＣＲで作成する。上記に示すプライマーを使用した以外、反応液組成及び反応条件は上記３．に準じたものである。ＰＣＲ反応後、MARLIGEN 社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。次に各断片の連結ＰＣＲを行った。
（各断片の連結ＰＣＲのための反応液）
　ＰＳバッファー１０μＬ、dNTP(各2.5 mM)４μＬ、４ＢＮ側精製断片２００ｎｇ、４ＢＣ側精製断片２００ｎｇ、ＰＳ ０．５μＬとし、超純水で最終容量を５０μＬとしてＰＣＲ反応を行った。
（連結ＰＣＲの反応条件）
　９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃２０秒、７２℃６０秒｝を６サイクル繰返した。このＰＣＲ反応により、４ＢＮ側断片と４ＢＣ側断片を連結した。
　上記の連結ＰＣＲの後、反応液に、直接、以下のプライマーを加え、増幅ＰＣＲを行う。
　Ｕ側プライマー　４ＢＮ用のＵ側プライマー　(0.1 mM) ０．４μＬ
　Ｒ側プライマー　４ＢＣ用のＲ側プライマー　(0.1 mM) ０．４μＬ
（増幅ＰＣＲの反応条件）
　９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃６０秒｝を８サイクル繰り返した。この反応により、４ＢＮＣをコードするＤＮＡ断片を得た。
５．各ＮＳ４Ｂ断片の蛍光タンパク質発現プラスミドへの組み込み
　蛍光タンパク質発現用ベクターは、pmCherry-C1とpEGFP-C1 (いずれもClontech社)とを用いた。
　ベクターは定法によりBgl IIおよびEco RIで消化後、Calf intestine alkaline phosphatase （TOYOBO社）で処理し、さらにアガロースゲル電気泳動を行い、ゲルよりベクターＤＮＡを切り出し、QIAGEN社 MinElute gel extraction kitによって精製した。ＴＥバッファー(10 mM Tris-Cl pH 7.4, 1 mM EDTA) でＤＮＡ濃度が５０ng/μＬになるように調整した。
　上記の各ＰＣＲ産物（４Ｂｆｕｌｌ、４ＢＮ、４ＢＴＭ、４ＢＣ、４Ｂ１、４Ｂ２、４Ｂ３、４Ｂ１－２、４Ｂ２－３、４Ｂ９、４Ｂ１０、４Ｂ１１、４Ｂ９－１０、４Ｂ１０－１１、４ＢＮＣ）は、MARLIGEN 社Rapid PCR purification systemキットで精製した。次いで、各ＰＣＲ産物について、定法によりBgl IIおよびEco RIで消化し、さらにアガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡを切り出してQIAGEN社 MinElute gel extraction kitによって精製した。ＴＥバッファー(10 mM Tris-Cl pH 7.4, 1 mM EDTA) でＤＮＡ濃度が５０ｎｇ/μlになるように調整する。
　上記の処理後ベクター０．５μＬ（２５ｎｇ）、 処理後ＰＣＲ断片０．５μＬ（２５ｎｇ）、Ligation High １μＬ（TOYOBO社)を混合し、１６℃で、３０分間ライゲーション反応を行った。
　ライゲーションしたＤＮＡを、エレクトロポレーションにより、ＴＧ１株大腸菌にトランスフォームした(Tanaka et al, Nihon Univ. J. Med. 47, 43-56, 2005)。トランスフォームした菌体はカナマイシン ２５μｇ/ｍＬを含むLBプレート上で選択し、得られたコロニーを1mlスケールで培養し、プラスミドＤＮＡをMarligen社Rapid plasmid miniprep systemにより抽出した。
　BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kitによりベクターに挿入されたＮＳ４Ｂ各断片のヌクレオチド配列が正しいことを確認した。塩基配列の決定には、以下のプライマーを用いた。
pmCherry-C1用
　Ｕ側　　5'-GTGGAACAGTACGAACGC-3'（配列番号４０）
　Ｒ側　　5'-TGTGGGAGGTTTTTTAAAGC-3'（配列番号４１）
pEGFP-C1用
　Ｕ側　　5'-AGCGCGATCACATGGTCC-3'（配列番号４２）
　Ｒ側　　5'-CTCTACAAATGTGGTATGGC-3'（配列番号４３）
　正しい配列を確認した後、50 ml の培養スケールで形質転換体を培養し、Machery-Nagel社 Nucleobond PC500キットでプラスミドを抽出した。得られたプラスミドを定法によりフェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、１μｇ/μＬの濃度になるようにＴＥバッファーに溶解した。
６．各コンストラクトの細胞へのトランスフェクション
　各コンストラクトは便宜上、以下の名前で表す。
　Cherry-4Bfull、Cherry-4BN、Cherry-4BTM、Cherry-4BC、Cherry-4B1、Cherry-4B2、Cherry-4B3、Cherry-4B1-2、Cherry-4B2-3、Cherry-4B9、Cherry-4B10、Cherry-4B11、Cherry-4B9-10、Cherry-4B10-11、Cherry-4BNC、
　EGFP-4BN、EGFP-4BTM、EGFP-4BC、EGFP-4B2-3、EGFP-4B3、EGFP-4B10-11、EGFP-4BNC
　実験には脂肪滴を豊富に持つＯｃ細胞(Ikeda et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 329, 1350-1359, 2005)を用いた。蛍光顕微鏡で観察可能なガラス底の２４ウェルプレート（EZViewカルチャープレートLBガラスボトム、IWAKI社）に７０～８０％コンフルエントになるようOc細胞を播き、Lipofectamin 2000 (Invitrogen社)を用いてプロトコールに従い、各プラスミドをトランスフェクションした。１ウェルあたりプラスミ１．６μｇ、Lipofectamin 2000を４．０μＬ使用した。トランスフェクションの２４時間または４８時間後に、各Oc細胞を観察した。
７．細胞の固定、染色
　細胞をＴＢＳ（20 mM Tris-Cl pH 7.4, 0.15 M NaCl）でリンスした後、４％パラフォルムアルデヒドで１５分間固定した。全ての反応はシーソーシェーカー上で行った。
　上記Cherry融合タンパク質を発現させた細胞については、脂肪滴をBodipy493/503 (Invitrogen社)で２０分間染色した（Ohsaki et al, Histochem. Cell Biol. 124, 445-452, 2005）。
　上記EGFP融合タンパク質を発現させた細胞については、脂肪滴膜を抗ADRP抗体で染色した。固定後0.01% digitonin /TBS で３０分インキュベートし、1% BSA/TBSで１時間ブロッキングした。抗ADRP抗体（Acris社）／1% BSA/TBS（抗体終濃度5μｇ/ｍＬ）で１時間インキュベートし、次に２次抗体として抗mouse IgG-AlexaFluor 647 (Invitrogen社) １０００倍希釈／1% BSA/TBSで３０分間インキュベートした。
　いずれの場合も、核をHechst 33342色素（終濃度５μg/ｍＬ ＴＢＳ）で２０分間染色した。
８．顕微鏡観察
　上記細胞を、共焦点レーザー走査型顕微鏡（FV1000, オリンパス社）を用いてシークエンシャルスキャンモードで鏡検した。
９．ＮＳ４Ｂ－Ｃｈｅｒｒｙ融合タンパク質の脂肪滴局在についての定量的解析の方法
　細胞数あたりどれぐらいの頻度で、Cherry-4Bfull、Cherry-4BN、Cherry-4BTM、Cherry-4BC、Cherry-4B1、Cherry-4B2、Cherry-4B3、Cherry-4B1-2、Cherry-4B2-3、Cherry-4B9、Cherry-4B10、Cherry-4B11、Cherry-4B9-10、Cherry-4B10-11、Cherry-4BNCが脂肪滴膜へ局在するかをカウントした。
　各サンプルで１０～２０視野鏡検し、Cherry融合タンパク質を発現しているすべての細胞について次の基準で判定した。
（１）カテゴリーＡ：Cherry融合タンパク質が脂肪滴膜のみに局在する。
（２）カテゴリーＢ：Cherry融合タンパク質が脂肪滴膜および他の部位（例えば細胞質、ＥＲなど）に局在する。
（３）カテゴリーＣ：Cherry融合タンパク質が脂肪滴膜には局在せず、他の部位に局在する。
　共焦点顕微鏡(FV1000)による撮影は、PLAPO 100X OTIRFM 対物レンズにて、126.852μｍ×126.852μｍを一視野（1024×1024 pixel）の画像として撮影し解析した。共焦点顕微鏡(FV1000)は、４種類の励起用レーザー（405nm、488nm、543nm、633nm；各々青色蛍光用、緑色蛍光用、赤色蛍光用、赤外部蛍光用）を持ち、各レーザー光によって励起されてサンプルより発せられる各蛍光を独立に撮像する。撮像後に、コンピュータによって各蛍光画像を作成した。なお、蛍光像は適宜色を選択して着色像を描くことができる。
　各融合タンパク質が脂肪滴に局在するか否かの判定は、すべてコンピュータの画像上で赤色蛍光像、緑色蛍光像、さらに両者のマージ（merge）像（合成像）を比較することにより行った。
　Cherry融合タンパク質を発現させた場合は、脂肪滴内部を染色するBodipyによる円形の緑色蛍光を縁取る、リング状の赤色蛍光像が得られた場合に、脂肪滴膜にCherry融合タンパク質が局在するものと判定した。
　ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現させた場合は、ＥＧＦＰの緑色蛍光とBodipyの緑色蛍光が区別できないため、脂肪滴膜を抗ＡＤＲＰ抗体およびローダミン（赤色蛍光）ラベル二次抗体で染色した後、蛍光の撮像を行った。この場合には、ＥＧＦＰ由来の緑色蛍光像として示されるリング状構造と、抗ＡＤＲＰ抗体で染色される脂肪滴膜のリング状の赤色蛍光像とが一致した場合に、ＥＧＦＰ融合タンパク質が脂肪滴膜に局在するものと判定した。
＜結果＞
１．４ＢＮの細胞内局在
　Cherry-4BNをOc細胞にトランスフェクションし、２４時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。図６に、観察された典型的細胞像を、Cherry-4BNを赤、Bodipy493/503を緑、コンピュータ上で赤と緑を重ね合わせた像（merge像）に核染色（青）を加えて示した。Cherry-4BNは緑で描出される脂肪滴の周囲に集積する明るい赤色の輪として描出される（つまり、脂肪滴膜に結合している）他、細胞質、細胞質の網状構造（ＥＲと推定される）、核に分布する。なお、４８時間後の観察でもほぼ同様の結果が得られたが、トランスフェクションのダメージと思われる細胞の変性が著しかった。以下２４時間後の観察のみ示す。また、EGFP-4BNでもほぼ同様の結果を得た（データ省略）。
　データには示さないが、Cherryタンパク質単体では細胞全体（核に若干強い）に分布し、EGFPタンパク質単体も細胞全体に分布する。従って、図６の観察結果から、蛍光タンパク質に４ＢＮを融合させることによって、脂肪滴膜およびＥＲへ局在する性質が新たに生じたことがわかり、４ＢＮは脂肪滴膜およびＥＲに親和性を持つものと推定された。
２．４ＢＣの細胞内局在
　Cherry-4BCをOc細胞にトランスフェクションし、２４時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。図７に、観察された典型的細胞像を、Cherry-4BCを赤、Bodipy493/503を緑、コンピュータ上で赤と緑を重ね合わせた像（merge像）に核染色（青）を加えて示した。Cherry-4BCはCherry-4BNと同様に脂肪滴周囲に集積する他、細胞質、細胞質の網状構造（ＥＲと推定される）に分布した。EGFP-4BCでもほぼ同様の結果を得た（データ省略）。上記４ＢＮと同様に、４ＢＣは脂肪滴膜およびＥＲに親和性を持つものと推定される。
３．４ＢＴＭの細胞内局在
　Cherry-4BTMをOc細胞にトランスフェクションし、２４時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。図８に、観察された典型的細胞像を、Cherry-4BTMを赤、Bodipy493/503を緑、コンピュータ上で赤と緑を重ね合わせた像（merge像）に核染色（青）を加えて示した。Cherry-4BTMは細胞質内で輪状の構造を示すが、この可視化された輪状構造は緑で示す脂肪滴とは全く無関係であった。EGFP-4BTMでもほぼ同様の結果が得られた（データ省略）。４ＢＴＭの局在部位は正確には同定できないが、おそらく４ＢＴＭによって形態変化を受けたＥＲではないかと推定される。
４．４Ｂ２－３の細胞内局在
　EGFP-4B2-3をOc細胞にトランスフェクションし、２４時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。色の関係上Bodipy493/503が使えないため、脂肪滴膜局在タンパク質のＡＤＲＰに対する抗体を用いて脂肪滴の染色を行った。観察の結果、細胞内において、EGFP-4B2-3は、脂肪滴周囲への集積が認められたが、細胞質やＥＲと推定される網目状構造にも分布した。
５．４Ｂ３の細胞内局在
　EGFP-4B3をOc細胞にトランスフェクションし、２４時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。色の関係上Bodipy493/503が使えないため、脂肪滴膜局在タンパク質のＡＤＲＰに対する抗体を用いて脂肪滴の染色を行った。観察の結果、細胞内において、EGFP-4B3は、脂肪滴周囲への集積が認められたが、細胞質やＥＲと推定される網目状構造にも分布した。
６．４Ｂ１０－１１の細胞内局在
　EGFP-4B10-11をOc細胞にトランスフェクションし、２４時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。色の関係上Bodipy493/503が使えないため、脂肪滴膜局在タンパク質のＡＤＲＰに対する抗体を用いて脂肪滴の染色を行った。観察の結果、細胞内において、EGFP-4B10-11は、脂肪滴周囲への集積が認められたが、細胞質やＥＲと推定される網目状構造にも分布した。
７．４ＢＮＣの細胞内局在
　Cherry-4BNCをOc細胞にトランスフェクションし、２４時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。図９に、観察された典型的細胞像を、Cherry-4BNCを赤、Bodipy493/503を緑、コンピュータ上で赤と緑を重ね合わせた像（merge像）に核染色（青）を加えて示した。Cherry-4BNCは輪状に描出され、かつその位置は緑で示される脂肪滴と完全に一致していた。細胞内の他の部位にはほとんどCherry-4BNCの分布は見られなかった。Cherry-4BNCは脂肪滴の周囲に限局して分布し、すなわち脂肪滴膜に高度に特異的に結合することがわかった。
　EGFP-4BNCをOc細胞にトランスフェクションし、２４時間後に共焦点顕微鏡観察を行った。色の関係上Bodipy493/503が使えないため、脂肪滴膜局在タンパク質のＡＤＲＰに対する抗体を用いて脂肪滴の染色を行った。図１０に、観察された典型的細胞像を、EGFP-4BNCを緑、ADRPをマゼンタ色で示した。 EGFP-4BNCとADRPの分布はほぼ完全に一致し、脂肪滴膜へのEGFP-4BNCの結合を示すとともに、EGFP-4BNCの方がADFP抗体より精彩に脂肪滴膜を描出することがわかった。
　脂肪滴の乏しい他の細胞の例として、ヒト腎由来のHEK293細胞に脂肪酸（stearic acid 50μＭ）を添加して脂肪滴を誘導し、Cherry-4BNCを用いて上記同様の観察を行った。図１１に、観察された典型的細胞像を、Cherry-4BNCを赤、Bodipy493/503を緑、コンピュータ上で赤と緑を重ね合わせた像（merge像）に核染色（青）を加えて示した。この観察結果から異なる細胞種においても高い特異性をもってCherry-4BNCが脂肪滴膜に結合することがわかった。
　図９、１０、及び１１に示す結果から、４ＢＮＣは脂肪滴膜のみに特異的に結合することが示された。
８．ＮＳ４Ｂ－Ｃｈｅｒｒｙ融合タンパク質の脂肪滴局在についての定量的解析
　細胞数あたりどれぐらいの頻度でCherry-4Bfull、Cherry-4BN、Cherry-4BTM、Cherry-4BC、Cherry-4B1、Cherry-4B2、Cherry-4B3、Cherry-4B1-2、Cherry-4B2-3、Cherry-4B9、Cherry-4B10、Cherry-4B11、Cherry-4B9-10、Cherry-4B10-11、Cherry-4BNCが脂肪滴膜へ局在するかをカウントした結果は、以下の通りである。なお、各コンストラクトの構造は図１２に示す。
（１）Cherry-4Bfull
　　カテゴリーＡ：　０（細胞数）　　　０（％）
　　カテゴリーＢ：１２　　　　　　　２０
　　カテゴリーＣ：４７　　　　　　　８０
（２）Cherry-4BN
　　　カテゴリーＡ：１７（細胞数）　２５（％）
　　　カテゴリーＢ：５０　　　　　　７５
　　　カテゴリーＣ：　０　　　　　　　０
（３）Cherry-4BC
　　　カテゴリーＡ：　０（細胞数）　　０（％）
　　　カテゴリーＢ：３０　　　　　　４１
　　　カテゴリーＣ：４４　　　　　　５９
（４）Cherry-4BTM
　　カテゴリーＡ：　０（細胞数）　　　０（％）
　　カテゴリーＢ：　０　　　　　　　　０
　　カテゴリーＣ：４８　　　　　　１００
（５）Cherry-4B1
　　カテゴリーＡ：　０（細胞数）　　　０（％）
　　カテゴリーＢ：　０　　　　　　　　０
　　カテゴリーＣ：６２　　　　　　１００
（６）Cherry-4B2
　　カテゴリーＡ：　０（細胞数）　　　０（％）
　　カテゴリーＢ：　０　　　　　　　　０
　　カテゴリーＣ：６２　　　　　　１００
（７）Cherry-4B3
　　カテゴリーＡ：　０（細胞数）　　　０（％）
　　カテゴリーＢ：　５　　　　　　　　６
　　カテゴリーＣ：７３　　　　　　　９４
（８）Cherry-4B9
　　カテゴリーＡ：　０（細胞数）　　　０（％）
　　カテゴリーＢ：　１　　　　　　　　２
　　カテゴリーＣ：５１　　　　　　　９８
（９）Cherry-4B10
　　カテゴリーＡ：　０（細胞数）　　　０（％）
　　カテゴリーＢ：　０　　　　　　　　０
　　カテゴリーＣ：６０　　　　　　１００
（１０）Cherry-4B11
　　カテゴリーＡ：　０（細胞数）　　　０（％）
　　カテゴリーＢ：　１　　　　　　　　２
　　カテゴリーＣ：５２　　　　　　　９８
（１１）Cherry-4B1-2
　　カテゴリーＡ：　０（細胞数）　　　０（％）
　　カテゴリーＢ：　０　　　　　　　　０
　　カテゴリーＣ：４３　　　　　　１００
（１２）Cherry-4B2-3
　　カテゴリーＡ：　０（細胞数）　　　０（％）
　　カテゴリーＢ：３８　　　　　　　６１
　　カテゴリーＣ：２４　　　　　　　３９
（１３）Cherry-4B9-10
　　カテゴリーＡ：　０（細胞数）　　　０（％）
　　カテゴリーＢ：　０　　　　　　　　０
　　カテゴリーＣ：６２　　　　　　１００
（１４）Cherry-4B10-11
　　カテゴリーＡ：　０（細胞数）　　　０（％）
　　カテゴリーＢ：　４　　　　　　　　６
　　カテゴリーＣ：６６　　　　　　　９４
（１５）Cherry-4BNC
　　　カテゴリーＡ：６２（細胞数）　９５（％）
　　　カテゴリーＢ：　３　　　　　　　５
　　　カテゴリーＣ：　０　　　　　　　０
　上記の結果によれば、４ＢＮＣは、９５％（６５細胞のうち６２細胞）という高い確率で脂肪滴膜のみに特異的に結合することが示された。一方、Cherry-4BNについては、脂肪滴膜に局在性を示すものの、その他の部位にも局在性を示した細胞の方が多かった（７５％）。さらに、Cherry-4BCに関しては、脂肪滴にのみ局在性を示した細胞の数は０であり、脂肪滴膜には局在せずに他の部位への局在が認められた細胞（カテゴリーＣ）が過半数を超えた（５９％）。これらの結果からも、４ＢＮＣは脂肪滴膜のみに特異的に結合することが実証された。
　なお、ＮＳ４Ｂ全長をＣｈｅｒｒｙに融合させたＣｈｅｒｒｙ－４Ｂｆｕｌｌは２０％の細胞で脂肪滴への局在が観察された。図１３に、観察された典型的細胞像を、Ｃｈｅｒｒｙ－４Ｂｆｕｌｌを赤、Bodipy493/503を緑、コンピュータ上で赤と緑を重ね合わせた像（merge像）に核染色（青）を加えて示した。
　Cherry-4Bfull、Cherry-4BN、Cherry-4BTM、Cherry-4BC、Cherry-4B1、Cherry-4B2、Cherry-4B3、Cherry-4B1-2、Cherry-4B2-3、Cherry-4B9、Cherry-4B10、Cherry-4B11、Cherry-4B9-10、Cherry-4B10-11についての上記定量的解析の結果を図１４に要約した。
＜ＮＳ４Ｂにおける脂肪滴との相互作用に重要なアミノ酸残基の同定＞
　上記の結果から、ＮＳ４Ｂにおいて脂肪滴局在のために重要なアミノ酸配列は、Ｎ末端領域では4B3部位（より強い局在を示すのは4B2-3部位）に存在し、Ｃ末端領域では4B10-11部位に存在することが推定できる（図１４参照）。
　最近の報告において、タンパク質が脂肪滴に局在するときに、amphipathic α-helix（αへリックスを軸方向から見たときに、一方の側に疎水性アミノ酸残基が、他方の側に親水性アミノ酸残基が偏って存在する構造）が重要な働きをすることが示唆されている（Boulant et al, J. Biol. Chem. 281, 22236-22247, 2006; Shavinskaya et al, J. Biol. Chem. 282, 37158-37169, 2007）。
　ＮＳ４Ｂにおいて脂肪滴局在のために重要なアミノ酸配列が存在するものと推定される上記部位、すなわち4B2-3および4B10-11部位にもそれぞれ一つずつのamphipathic α-helixが存在することが知られている（Elazar et al, J. Virol. 78, 11393-11400, 2004; Gouttenoire et al, J. Virol. 83, 11378-11384, 2009）。当該部位をＮＳ４Ｂ全体と対比させて図１５に示す。
　そこで、上記の二つのamphipathic α-helixにおいて脂肪滴膜と相互作用する可能性のある疎水性残基を、長軸方向から見たアミノ酸配置図（図１６）を参考にして選び出し、アラニンに置換する変異体を作製した。対象として選んだアミノ酸残基は43W, 46L, 50W, 57F, 61I, 64L, 242I, 246L, 249L, 253I，計１０残基であった。
　ちなみにαへリックスにおいては、アミノ酸が１残基進むとちょうど１００度長軸方向から見た角度がずれる。つまりアミノ酸3.6残基ごとに長軸方向からみて同じ位置に残基が出現する。従っておおむね３～４残基ごとのアミノ酸が同じ側に存在する。
　実施したアラニン置換は4B2-3領域ではW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64Aの全部または前半ないし後半の３残基ずつであり、4B10-11領域ではI242A, L246A, L249A, I253Aの全部である。
　これら変異をCherry-4BN、Cherry-4BCまたはCherry-4BNCに導入して脂肪滴への局在を共焦点顕微鏡によって解析した。
　細胞数あたりどれぐらいの頻度で各変異体が脂肪滴膜へ局在するかをカウントした結果を以下に示す（図１７及び１８を参照）。
（１）Cherry-4BN変異１（Cherry-4BNにW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64Aの変異を入れたもの）
　　カテゴリーＡ：　０（細胞数）　　　０（％）
　　カテゴリーＢ：　０　　　　　　　　０
　　カテゴリーＣ：５８　　　　　　１００
（３）Cherry-4BN変異２(Cherry-4BNにW43A, L46A, W50Aの変異を入れたもの)
　　カテゴリーＡ：　０（細胞数）　　　０（％）
　　カテゴリーＢ：１８　　　　　　　３５
　　カテゴリーＣ：３３　　　　　　　６５
（４）Cherry-4BN変異３(Cherry-4BNにF57A, I61A, L64Aの変異を入れたもの)
　　カテゴリーＡ：　３（細胞数）　　　５（％）
　　カテゴリーＢ：５５　　　　　　　９５
　　カテゴリーＣ：　０　　　　　　　　０
（５）Cherry-4BC変異１(Cherry-4BCにI242A, L246A, L249A, I253Aの変異を入れたもの)
　　カテゴリーＡ：　０（細胞数）　　　０（％）
　　カテゴリーＢ：　０　　　　　　　　０
　　カテゴリーＣ：６５　　　　　　１００
（６）Cherry-4BNC変異１(Cherry-4BNCにW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64Aの変異を入れたもの)
　　カテゴリーＡ：　９（細胞数）　　１７（％）
　　カテゴリーＢ：４１　　　　　　　７７
　　カテゴリーＣ：　３　　　　　　　　６
（７）Cherry-4BNC変異２(Cherry-4BNCにW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A, I242A, L246A, L249A, I253Aの変異を入れたもの)
　　カテゴリーＡ：　０（細胞数）　　　０（％）
　　カテゴリーＢ：　５　　　　　　　　８
　　カテゴリーＣ：５４　　　　　　　９２
（８）Cherry-4BNC変異３(Cherry-4BNCにW43A, L46A, W50A, I242A, L246A, L249A, I253Aの変異を入れたもの)
　　カテゴリーＡ：１５（細胞数）　　２０．３（％）
　　カテゴリーＢ：５５　　　　　　　７４．３
　　カテゴリーＣ：　４　　　　　　　　５．４
　Cherry-4BNにW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64Aの変異を入れたCherry-4BN変異１では脂肪滴への局在は全く見られなくなった。次に、この前半３残基のみの変異体つまりCherry-4BN変異２(Cherry-4BNにW43A, L46A, W50Aの変異を入れたもの)では、脂肪滴への局在は若干見られるもののCherry-4BNよりは大幅に減少していた。一方、後半３残基のみの変異体、つまりCherry-4BN変異３(Cherry-4BNにF57A, I61A, L64Aの変異を入れたもの)では、Cherry-4BNよりも若干脂肪滴への局在が弱まる程度であった。
　Cherry-4BCはCherry-4BNより弱いが脂肪滴への局在を示す。 Cherry-4BCにI242A, L246A, L249A, I253Aの変異を入れたCherry-4BC変異１は、脂肪滴への局在を全く示さなかった。
　本発明によるCherry-4BNCは特異的な脂肪滴への局在を示す。Cherry-4BNCにW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64Aの変異を入れたCherry-4BNC変異１は相対的に強い脂肪滴への局在を示した。これらの変異をCherry-4BNに入れた場合（すなわちCherry4BN変異１）は大幅に局在が弱まるのに対し、Cherry-4BNCにこれらの変異を入れた場合の影響は少なかった。つまりＣ末端領域（4B10-11）がかなり強い作用を持つことが推測された。そこで上記の変異に加え、Ｃ末端領域の４残基にも変異を入れたCherry-4BNC変異２(Cherry-4BNCにW43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A, I242A, L246A, L249A, I253Aの変異を入れたもの)を作製して解析したところ、ほぼ完全に脂肪滴への局在が無くなった。念のため、Ｎ末端領域の前半３残基とＣ末端領域の４残基に変異を入れたCherry-4BNC変異３(Cherry-4BNCにW43A, L46A, W50A, I242A, L246A, L249A, I253Aの変異を入れたもの)についても観察を行ったが、脂肪滴への局在は相対的に強かった（つまり変異によって脂肪滴への局在が完全には阻害されなかった）。
　以上の結果から、αへリックスの一方の側に連続して出現してくる３ないし４つの疎水性アミノ酸を一つのクラスターとすると、43W, 46L, 50Wから成るクラスターが単独では最も強い脂肪滴局在能を持つと考えられる。
　単独では57F, 61A, 64Lのクラスターと242I, 246L, 249L, 253Iのクラスターは脂肪滴への局在能は強くないと考えられる。しかしながら、Cherry-4BNCにおいては、３つのクラスターを全て変異させないと脂肪滴への局在能は無くならないことから、単独では作用の強くないこれらのクラスター（57F, 61A, 64Lおよび242I, 246L, 249L, 253I）が、43W, 46L, 50Wから成るクラスターと協調的に作用することによって、全体としてはきわめて強い脂肪滴への局在を示すものと考えられる。
　なお、Cherry-4BNCにおいて上記３つのクラスターを変異させても、ごくわずか脂肪滴への局在活性が残っており、未同定の残基による弱い相互作用も推定される。
　上記の通り同定したアミノ酸残基（43W, 46L, 50W, 57F, 61A, 64L, 242I, 246L, 249L, 253I）は、ＨＣＶの各サブタイプ間で高度に保存されている（図１９参照）。一部のサブタイプにおいて置換が見られるが、出現するアミノ酸残基は性質の類似した疎水性アミノ酸に限られている。従って、これらの残基によって仲介されるNS4Bと脂肪滴との相互作用（NS4Bの脂肪滴膜への局在）は、ＨＣＶが増殖する過程において極めて重要な役割を負っていることが推定される。このことは、逆にこれらのアミノ酸残基をターゲットにして脂肪滴への局在を阻害する方法を講じてやれば、ＨＣＶの増殖を抑制できることを示唆する。
　上記各変異体の作製方法については、以下に記載の通りである。
＜変異体作製方法＞
　アラニン残基のコドンには、すべて真核細胞でのコドン使用率の最も高いGCCを用いた。所定の位置にヌクレオチドの変異を含ませたプライマーを用いて適切なＰＣＲ断片を作製し、既述のように重複部分を利用して断片同志をさらにＰＣＲで連結し、目的のＤＮＡ断片を作製した。以降は既述の方法に準じ制限酵素消化などの処理の後pmCherry-C1ベクターに断片を挿入し、完成コンストラクトを得た。全てのコンストラクトについて、プラスミドを精製し、ＤＮＡシークエンシングを行って所定の変異が成功していることを確認した。
　以下各コンストラクトの断片の作製方法を述べる。プライマー配列の下線部はアラニン置換変異に該当する部位を表す。
1. Cherry-4BN変異１（W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A）
・断片Ａ（アミノ酸１－４８）作製ＰＣＲ
　Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
　Ｒ側：5'-GGCCTCGGCGGCTTGGGCCTTGGACTCCACCACGGG-3'（配列番号４４）
　Cherry-4B1-2プラスミド１ngを鋳型とし、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒｝の反応を２８サイクル繰り返した。反応後、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
・断片Ｂ（アミノ酸４３－６４）作製ＰＣＲ
　Ｕ側：5'-GCCCAAGCCGCCGAGGCCTTTGCCGCGAAGCACATGTGGAAT-3'（配列番号４５）
　Ｒ側：5'-GGCGTACTGGGCCCCGCTGATGGCATTCCACATGTGCTTCGCG-3'（配列番号４６）
　両者のプライマーが一部相補的配列を持つように設計してあり、鋳型を加えずに９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５０℃２０秒、７２℃３０秒｝の反応を１０サイクル繰り返し、プライマーダイマーを形成させた。
・断片Ａ、Ｂ連結及び増幅
　断片Ａ（10 μＬ），断片Ｂ（4 μＬ）、ＰＳバッファー１０μＬ，dNTP(各2.5 mM)，ＰＳ 0.5 μＬ，超純水で５０μＬとした反応液で９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５０℃２０秒、７２℃３０秒｝のＰＣＲ反応を１０サイクル繰り返して断片Ａ，Ｂを連結した。
　連結反応後、反応液に次のプライマー（0.1 mM）を0.4 μＬ ずつ加え、断片にさらに配列を付加しつつ増幅した。
　Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
　Ｒ側：5'-TTTGAATTCTTAGTTCCCAGGCAGAGTGGACAAGCCTGCGGCGTACTGGGCCCCGCT-3'（配列番号４７）
　９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒｝のＰＣＲ反応を２０サイクル繰り返した。反応後、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
2. Cherry-4BN変異２（W43A, L46A, W50A,）
・断片Ｃ（アミノ酸１－５０）作製ＰＣＲ
　Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
　Ｒ側：5'-GGCAAAGGCCTCGGCGGCTTGGGCCTTGGACTCCACCACGGG-3'（配列番号４８）
pcDNA4BFLAGプラスミド1ngを鋳型とし、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃４５秒｝のＰＣＲ反応を３０サイクル繰り返した。反応後、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。上記pcDNA4BFLAGプラスミドは、pcDNA3.1(+)ベクター（Invitrogen社）に、ＮＳ４Ｂ全長配列とそのＣ末端部位にアミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＦＬＡＧタグ）を付加した配列を挿入してあるプラスミドである。
・断片Ｄ（アミノ酸４３－７３）作製ＰＣＲ
　Ｕ側：断片Ｂ用Ｕ側プライマー
　Ｒ側：４ＢＮ用Ｒ側プライマー
　pcDNA4BFLAGプラスミド1ngを鋳型とし、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃４５秒｝のＰＣＲ反応を３０サイクル繰り返した。
・断片Ｃ，Ｄ連結及び増幅
　断片Ｃ（10 μＬ）、断片Ｄ（5μＬ）、ＰＳバッファー１０μＬ，dNTP(各2.5 mM)，ＰＳ 0.5 μＬ，超純水で５０μＬとした反応液で９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃２０秒、７２℃６０秒｝のＰＣＲ反応を１０サイクル繰り返して断片Ｃ，Ｄを連結した。
　連結反応後、反応液に次のプライマー（0.1 mM）を0.4 μＬ ずつ加え、ＰＣＲで増幅した。
　Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
　Ｒ側：４ＢＮ用Ｒ側プライマー
　９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃６０秒｝のＰＣＲ反応を１０サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
3. Cherry-4BN変異３(F57A, I61A, L64A)
・断片Ｅ（アミノ酸１－６４）作製ＰＣＲ
　Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
　Ｒ側：5'-GGCGTACTGGGCCCCGCTGATGGCATTCCACATGTGCTTCGC-3'（配列番号４９）
　pcDNA4BFLAGプラスミド1ngを鋳型とし、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃４５秒｝のＰＣＲ反応を３０サイクル繰り返した。反応後、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
・断片Ｆ（アミノ酸５７－７３）作製ＰＣＲ
　Ｕ側：5'-GCCATCAGCGGGGCCCAGTACGCCGCAGGCTTGTCCACTCTG-3'（配列番号５０）
　Ｒ側：４ＢＮ用Ｒ側プライマー
　pcDNA4BFLAGプラスミド1ngを鋳型とし、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃４５秒｝のＰＣＲ反応を３０サイクル繰り返した。
・断片Ｅ，Ｆ連結及び増幅
　断片Ｅ（5 μＬ），断片Ｆ（5 μＬ）、ＰＳバッファー１０μＬ，dNTP(各2.5 mM)，ＰＳ 0.5 μＬ，超純水で５０μｌとした反応液で９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃２０秒、７２℃６０秒｝のＰＣＲ反応を１０サイクル繰り返して断片Ｅ，Ｆを連結した。連結反応後、反応液に次のプライマー（0.1 mM）を0.4 μＬ ずつ加え、ＰＣＲで増幅した。
　Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
　Ｒ側：４ＢＮ用Ｒ側プライマー
　９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃６０秒｝のＰＣＲ反応を１０サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
4. Cherry-4BC変異１（I242A, L246A, L249A, I253A）
・断片Ｇ（アミノ酸１９２－２６１）作製ＰＣＲ
　Ｕ側：４ＢＣ用Ｕ側プライマー
　Ｒ側：5'-TTTGAATTCTTAGCATGGCGTGGAGCAGTCCTCATTGGCCCACTGGTGGGCTCT
CTTGGCCAGCTGGGTGGCGGTAAGGCTGGAGAGGAT-3'（配列番号５１）
　Cherry-4Bfullプラスミド10 ngを鋳型とし、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃２０秒、７２℃６０秒｝のＰＣＲ反応を２７サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
5. Cherry-4BNC変異１（W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A）
・断片Ｈ（アミノ酸１－７３）作製ＰＣＲ
　Ｕ側：４ＢＮＵ側プライマー
　Ｒ側：5'-GTTCCCAGGCAGAGTGGACAA-3'（配列番号５２）
　Cherry-4BN変異１プラスミド10 ngを鋳型として、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒｝のＰＣＲ反応を２５サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
・断片Ｉ（アミノ酸６５－７３および１９２－２１７）作製ＰＣＲ
　Ｕ側：5'-GCAGGCTTGTCCACTCTGC-3'（配列番号５３）
　Ｒ側：４ＢＣ用Ｒ側プライマー
　Cherry-4BNCプラスミド10 ngを鋳型として、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃６０秒｝のＰＣＲ反応を２５サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
・断片Ｈ，Ｉの連結及び増幅
　断片Ｈ（200 ng），断片Ｉ（200 ng）、ＰＳバッファー１０μＬ，dNTP(各2.5 mM)，ＰＳ 0.5μＬ，超純水で５０μＬとした反応液で９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃２０秒、７２℃６０秒｝のＰＣＲ反応を１０サイクル繰り返して断片Ｈ，Ｉを連結した。連結反応後、反応液に次のプライマー（0.1 mM）を0.4 μＬ ずつ加え、ＰＣＲで増幅した。
　Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
　Ｒ側：４ＢＣ用Ｒ側プライマー
　９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃６０秒｝のＰＣＲ反応を８サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
6. Cherry-4BNC変異２（W43A, L46A, W50A, F57A, I61A, L64A, I242A, L246A, L249A, I253A）
・断片Ｊ（アミノ酸１－７３及び１９２－２６１）作製ＰＣＲ
　Ｕ側プライマー：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
　Ｒ側プライマー：断片Ｇ用Ｒ側プライマー
　Cherry-4BNC変異１プラスミド10 ngを鋳型として、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃２０秒、７２℃６０秒｝のＰＣＲ反応を２７サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
7. Cherry-4BNC変異３（W43A, L46A, W50A, I242A, L246A, L249A, I253A）
・断片Ｋ（アミノ酸１－７３）作製ＰＣＲ
　Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
　Ｒ側：断片Ｈ用Ｒ側プライマー
　Cherry-4BN変異２プラスミド10 ngを鋳型として、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒｝のＰＣＲ反応を２８サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
・断片Ｌ（アミノ酸６５－７３および１９２－２１７）作製ＰＣＲ
　Ｕ側：断片Ｉ用Ｕ側プライマー
　Ｒ側：断片Ｇ用Ｒ側プライマー
　Cherry-4BNC変異２プラスミド10 ngを鋳型として、９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒｝のＰＣＲ反応を２８サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。
・断片Ｋ，Ｌの連結及び増幅
　断片Ｋ（200 ng），断片Ｌ（200 ng）、ＰＳバッファー１０μＬ，dNTP(各2.5 mM)，ＰＳ 0.5 μＬ，超純水で５０μｌとした反応液で９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒｝のＰＣＲ反応を１０サイクル繰り返して断片Ｋ，Ｌを連結した。連結反応後、反応液に次のプライマー（0.1 mM）を0.4 μＬ ずつ加え、ＰＣＲで増幅した。
　Ｕ側：４ＢＮ用Ｕ側プライマー
　Ｒ側：断片Ｇ用Ｒ側プライマー
　９８℃１０秒の変性反応の後、｛９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒｝のＰＣＲ反応を８サイクル行い、MARLIGEN社Rapid PCR purification systemキットを用いて反応産物を精製した。

Claims (18)

  1. (Ａ)配列番号２で表されるアミノ酸配列の第５０番から第７３番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ1 nで表されるアミノ酸配列(０≦ｎ≦４９であり、ｎが２以上の場合、Ｘ1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ａ）のＣ末端に、
    　配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ2 mで表されるアミノ酸配列(０≦ｍ≦２６であり、ｍが２以上の場合、Ｘ2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ｂ）のＮ末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；
    (Ｂ)（Ａ)に規定されるタンパク質において上記第５０番から第７３番までアミノ酸配列および／または上記第２１８番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域中に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；または
    （Ｃ）（Ａ)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質。
  2. (Ａ)配列番号２で表されるアミノ酸配列の第５０番から第７３番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ1 nで表されるアミノ酸配列(０≦ｎ≦４９であり、ｎが２以上の場合、Ｘ1は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ａ）のＣ末端に、
    　配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２２９番から第２６１番までのアミノ酸配列とそのＮ末端に結合するＸ2 mで表されるアミノ酸配列(０≦ｍ≦３７であり、ｍが２以上の場合、Ｘ2は相互に同一でも異なってもよい)とからなるポリペプチド（ｂ）のＮ末端が結合してなるタンパク質であって、脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；
    (Ｂ)（Ａ)に規定されるタンパク質において上記第５０番から第７３番までアミノ酸配列および／または上記第２２９番から第２６１番までのアミノ酸配列の領域中に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質；または
    （Ｃ）（Ａ)に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示すタンパク質。
  3. Ｘ1 nで表されるアミノ酸配列が、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１番から第４９番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｎ（１≦ｎ≦４９）のアミノ酸配列であるか（但し、配列番号２１における第２番目及び第８番目のアミノ酸「Ｘａａ」、並びに配列番号２３における第６番目のアミノ酸「Ｘａａ」は、任意のアミノ酸である。）；又は、Ｘ1 nで表されるアミノ酸配列が、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１番から第４８番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｎ（１≦ｎ≦４８）のアミノ酸配列である、請求項１又は２に記載のタンパク質。
  4. Ｘ2 mで表されるアミノ酸配列が、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２１７番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦２６）のアミノ酸配列若しくは配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２２８番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦３７）のアミノ酸配列であるか；又は、Ｘ2 mで表されるアミノ酸配列が、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１９１番から第２１６番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦２６）のアミノ酸配列若しくは配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１９１番から第２２７番までのアミノ酸配列から選択される任意の数ｍ（１≦ｍ≦３７）のアミノ酸配列である、請求項１～３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  5. Ｘ1 nで表されるアミノ酸配列が、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表されるアミノ酸配列の第１番から第４９番、第２６番から第４９番、第４０番から第４９番、または第４３番から第４９番までのアミノ酸配列であるか（但し、配列番号２１における第２番目及び第８番目のアミノ酸「Ｘａａ」、並びに配列番号２３における第６番目のアミノ酸「Ｘａａ」は、任意のアミノ酸である。）；又は、Ｘ1 nで表されるアミノ酸配列が、配列番号１１に表されるアミノ酸配列の第１番から第４８番、第２６番から第４８番、第４０番から第４８番、または第４３番から第４８番までのアミノ酸配列である、請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質。
  6. Ｘ2 mで表されるアミノ酸配列が、配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第１９２番から第２１７番までのアミノ酸配列若しくは配列番号２～１０及び１２～２３のいずれかに表わされるアミノ酸配列の第１９２番から第２２８番までのアミノ酸配列であるか；又は、Ｘ2 mで表されるアミノ酸配列が、配列番号１１で表わされるアミノ酸配列の第１９１番から第２１６番までのアミノ酸配列若しくは配列番号１１で表わされるアミノ酸配列の第１９１番から第２２７番までのアミノ酸配列である、請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質。
  7. Ｘ1 nで表されるアミノ酸配列が配列番号２に表されるアミノ酸配列の第１番から第４９番または第２６番から第４９番までのアミノ酸配列であり、かつ、Ｘ2 mで表されるアミノ酸配列が配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２１７番までのアミノ酸配列または配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１９２番から第２２８番までのアミノ酸配列である、請求項１～６のいずれか１項に記載のタンパク質。
  8. 前記タンパク質が、（Ａ）に規定されるタンパク質である、請求項1～７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  9. 前記タンパク質が、（Ａ）に規定されるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪滴への特異的局在性を示す、請求項１～７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  10. 標識タンパク質及び／又はアフィニティタグとの融合タンパク質である、請求項１～９のいずれか１項に記載のタンパク質。
  11. 被導入物質により修飾された請求項１～１０のいずれか１項に記載のタンパク質。
  12. 被導入物質が、蛍光化合物である、請求項１１に記載のタンパク質。
  13. 請求項１～１０のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
  14. 請求項１３に記載の核酸を含む、発現用ベクター。
  15. 請求項１４に記載の発現用ベクターにより形質転換された、形質転換体。
  16. 哺乳細胞において脂肪滴の可視化に用いるための、請求項１３に記載の発現用ベクター。
  17. 哺乳細胞において脂肪滴の可視化に用いるための、請求項１～１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
  18. 請求項１～１２のいずれか１項に記載のタンパク質に対する抗体。
PCT/JP2011/057818 2010-11-05 2011-03-29 脂肪滴に特異的局在性を示すタンパク質 WO2012060120A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012541760A JP5828430B2 (ja) 2010-11-05 2011-03-29 脂肪滴に特異的局在性を示すタンパク質

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010-248773 2010-11-05
JP2010248773 2010-11-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012060120A1 true WO2012060120A1 (ja) 2012-05-10

Family

ID=46024244

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/057818 WO2012060120A1 (ja) 2010-11-05 2011-03-29 脂肪滴に特異的局在性を示すタンパク質

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP5828430B2 (ja)
WO (1) WO2012060120A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108530523B (zh) * 2018-03-13 2020-09-15 上海交通大学 拟南芥Sec14p-like基因在植物细胞脂滴荧光标记中的应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOLETI, H. ET AL.: "ER targeting and retention of the HCV NS4B protein relies on the concerted action of multiple structural features including its transmembrane domains.", MOL. MEMBR. BIOL., vol. 27, no. L, January 2010 (2010-01-01), pages 45 - 62 *
ELAZAR, M. ET AL.: "An N-terminal amphipathic helix in hepatitis C virus (HCV) NS4B mediates membrane association, correct localization of replication complex proteins, and HCV RNA replication.", J. VIROL., vol. 78, no. 20, 2004, pages 11393 - 11400, XP002420494, DOI: doi:10.1128/JVI.78.20.11393-11400.2004 *
LIEFHEBBER, J.M.P. ET AL.: "Hepatitis C virus NS4B carboxy terminal domain is a membrane binding domain.", VIROL. J., vol. 6, 2009, pages 62, XP021059679, DOI: doi:10.1186/1743-422X-6-62 *
MIYANARI, Y. ET AL.: "The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production.", NAT. CELL BIOL., vol. 9, no. 9, 2007, pages 961 - 969, XP009142685, DOI: doi:10.1038/ncb1631 *
TORAHIKO TANAKA ET AL.: "C-gata Kan'en Virus Hi Kozo Tanpakushitsu 4B ni Okeru lipid droplet tono Sogo Sayo Bui no Dotei", JOURNAL OF JAPANESE BIOCHEMICAL SOCIETY (GAKKAI YOSHISHU), December 2010 (2010-12-01), pages 1P-1046 *
TORAHIKO TANAKA ET AL.: "C-gata Kan'en Virus NS4B to lipid droplet no Sogo Sayo", THE JAPANESE SOCIETY OF VIROLOGY GAKUJUTSU SHUKAI PROGRAM SHOROKU-SHU, vol. 58, October 2010 (2010-10-01), pages 312 - 03-5-01 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2012060120A1 (ja) 2014-05-12
JP5828430B2 (ja) 2015-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Luo et al. Structure of the Legionella virulence factor, SidC reveals a unique PI (4) P-specific binding domain essential for its targeting to the bacterial phagosome
US11913081B2 (en) Proximity-dependent split RNA polymerases as a versatile biosensor platform
Brödel et al. Cell‐free protein expression based on extracts from CHO cells
Janvier et al. Recognition of dileucine-based sorting signals from HIV-1 Nef and LIMP-II by the AP-1 γ–σ1 and AP-3 δ–σ3 hemicomplexes
Marques et al. Liposome-mediated cellular delivery of active gp91phox
Grefen et al. Split‐ubiquitin system for identifying protein‐protein interactions in membrane and full‐length proteins
US7759461B2 (en) Expression system for enhancing solubility and immunogeneicity of recombinant proteins
Hassaine et al. Semliki Forest virus vectors for overexpression of 101 G protein-coupled receptors in mammalian host cells
Stevanovic et al. Monotopic topology is required for lipid droplet targeting of ancient ubiquitous protein 1 [S]
JP6876628B2 (ja) 細胞表面上にペプチドを提示するためのシステム
CN113727993A (zh) 通过遗传密码子扩展以靶蛋白选择性方式制备工程化靶蛋白的手段和方法
CN109575116B (zh) 一种线粒体定位导肽及其发现方法与应用
JP4772247B2 (ja) タンパク質の溶解性及びフォールディングを評価する相補性アッセイ
Ling et al. The C-terminal appended domain of human cytosolic leucyl-tRNA synthetase is indispensable in its interaction with arginyl-tRNA synthetase in the multi-tRNA synthetase complex
Lee et al. Live-cell topology assessment of URG7, MRP6102 and SP-C using glycosylatable green fluorescent protein in mammalian cells
Park et al. Dimerization of 30Kc19 protein in the presence of amphiphilic moiety and importance of Cys‐57 during cell penetration
Santagata et al. Molecular cloning and characterization of a mouse homolog of bacterial ClpX, a novel mammalian class II member of the Hsp100/Clp chaperone family
JP5828430B2 (ja) 脂肪滴に特異的局在性を示すタンパク質
CN112813049B (zh) 用于活细胞rna标记的融合蛋白及应用
Rao et al. A novel lysine-rich domain and GTP binding motifs regulate the nucleolar retention of human guanine nucleotide binding protein, GNL3L
JP6667897B2 (ja) 蛍光特性を示すポリペプチド、およびその利用
US9611486B2 (en) Constructs and method for regulating gene expression or for detecting and controlling a DNA locus in eukaryotes
CN112162096A (zh) 用于检测细胞线粒体自噬的双荧光蛋白定位检测系统及应用
Hong et al. Cloning and characterization of ApRab4, a recycling Rab protein of Aiptasia pulchella, and its implication in the symbiosome biogenesis
WO2004027057A1 (ja) オルガネラ局在タンパク質の解析方法と解析材料

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11837773

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2012541760

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11837773

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1