WO2012053622A1 - 非ヒト動物、細胞、血圧調節物質の評価方法、血圧調節条件の評価方法および血圧の調節方法 - Google Patents

非ヒト動物、細胞、血圧調節物質の評価方法、血圧調節条件の評価方法および血圧の調節方法 Download PDF

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WO2012053622A1
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gene
blood pressure
dec1
atp1b1
cell
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PCT/JP2011/074228
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加藤　幸夫
健 河本
光秀 能城
歩 中島
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国立大学法人広島大学
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9453—Cardioregulators, e.g. antihypotensives, antiarrhythmics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives

Definitions

  • the present invention uses a non-human animal and cell in which a gene that changes the expression level of ATP1B1 is modified, a method for evaluating a blood pressure regulator using the non-human animal and the cell, a method for evaluating blood pressure regulation conditions, and the mechanism
  • the present invention relates to a method for regulating blood pressure.
  • Essential hypertension or essential hypotension is one of lifestyle-related diseases and is a conceptual, complex and multifactorial disease state. There are often no subjective symptoms of blood pressure itself. However, the clinical significance is great in that it is a risk of developing ischemic heart disease, stroke or renal failure.
  • Non-Patent Document 1 describes the relationship between (essential) hypertension and Na + / K + -ATPase. Specifically, it is described that inhibition of Na + / K + -ATPase can lead to hypertension.
  • Na + / K + -ATPase is a fundamental factor that regulates intracellular Na + and K + concentrations related to nerve stimulation transmission, nutrient or ion absorption, or intracellular Ca 2+ concentration, and the like.
  • Na + / K + -ATPase includes ⁇ subunit (hereinafter referred to as ATP1A1) and ⁇ subunit (hereinafter referred to as ATP1B1).
  • ouabain a steroid that regulates the activity of Na + / K + -ATPase
  • ouabain a steroid that regulates the activity of Na + / K + -ATPase
  • mutations in Adducin a cytoskeletal protein that controls the activity of Na + / K + -ATPase, are also known to cause hypertension.
  • the Dec1 gene is a gene that is specifically expressed in differentiated chondrocytes.
  • chondrocytes are cultured in a differentiated state by culturing chondrocytes in the presence of dibutyryl cAMP, and then there is a difference in expression between differentiated chondrocytes and dedifferentiated chondrocytes. It is described that a gene specifically expressed in the former could be obtained by searching for a gene.
  • DEC1 and DEC2 similar thereto are also clock transcription factors that control the body clock itself, and are also known to be expressed in circadian rhythms in all tissues.
  • Patent Document 2 describes in detail the role of DEC1 and DEC2 in a molecular clock. Specifically, a method for regulating circadian rhythm using DEC1 or DEC2 which is a basic helix-loop-helix transcription factor is described. A method for controlling transcription activation induced by CLOCK and BMAL1, which also functions as a molecular clock, through the E-box enhancer by using these DEC1 and DEC2 is also described.
  • essential hypertension or essential hypotension is a conceptual, complex and multifactorial pathology. Usually, blood pressure is high during the day and low at night. However, there is essential hypertension or essential hypotension that affects these circadian variations in blood pressure. The target molecules of these essential hypertension or essential hypotension therapeutics (or preventives, diagnostics, etc.) and the related genes are not well understood.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, genetically modified non-human animals and cells that change the expression level of ATP1B1, methods for evaluating blood pressure regulators using the non-human animals and cells, and evaluation of blood pressure regulation conditions It is an object of the present invention to provide a method and a method for regulating blood pressure using the mechanism.
  • DEC1 or CLOCK directly binds to CACGTG E-box at two locations in the ATP1B1 gene upstream promoter sequence and suppresses or promotes the expression of ATP1B1.
  • DEC1 increases blood pressure by suppressing the expression of ATP1B1
  • Dec1 gene knockout mice have lower blood pressure (becomes hypotension) compared to wild-type mice, particularly in the resting period ( See Examples).
  • the non-human animal according to the first aspect of the present invention is characterized by having a functional genetic modification in the Dec1 gene or the Dec2 gene and an increase or decrease in the expression level of ATP1B1.
  • the non-human animal is characterized by hypotension or hypertension.
  • the non-human animal is a Dec1 gene knockout animal or a Dec2 gene knockout animal, and the expression level of the ATP1B1 is increased.
  • the non-human animal is a Dec1 gene overexpressing animal or a Dec2 gene overexpressing animal, wherein the expression level of the ATP1B1 is decreased.
  • the non-human animal is a mouse or a rat.
  • the cell according to the second aspect of the present invention is characterized in that it has a functional genetic modification in the Dec1 gene or the Dec2 gene and the expression level of ATP1B1 is increased or decreased.
  • the cell is a Dec1 gene knockout cell or a Dec2 gene knockout cell, and the expression level of the ATP1B1 is increased.
  • the cell is a Dec1 gene overexpressing cell or a Dec2 gene overexpressing cell, wherein the expression level of the ATP1B1 is decreased.
  • the cell is any one of a vascular smooth muscle cell, a vascular endothelial cell, a renal tubular cell or a cardiomyocyte.
  • the method for evaluating a blood pressure regulator according to the third aspect of the present invention includes the non-human animal having a functional genetic modification in the Dec1 gene or the Dec2 gene and having an increased or decreased expression level of ATP1B1, or The method includes a step of administering or contacting a test substance to the cells.
  • the method includes a step of measuring blood pressure of the non-human animal.
  • a test is performed on a cell having a functional genetic modification in the Dec1 gene or the Dec2 gene and an increase or decrease in the expression level of ATP1B1.
  • the method includes a step of bringing a substance into contact.
  • the method includes a step of measuring the expression level of ATP1B1.
  • the method for evaluating a blood pressure regulator according to the third aspect of the present invention includes a method using wild-type non-human animals and wild-type cells as described below. That is, a step of administering a test substance to a wild-type non-human animal, Measuring the expression level of DEC1 or DEC2 and the expression level of ATP1B1 in the wild-type non-human animal before and after administration of the test substance;
  • a method for evaluating a blood pressure regulator comprising:
  • a method for evaluating a blood pressure regulator comprising:
  • the method for evaluating blood pressure regulation conditions according to the fourth aspect of the present invention is a wild-type non-human animal, or has a functional genetic modification in Dec1 gene or Dec2 gene, and the expression level of ATP1B1 is increased or decreased.
  • Non-human animals, wild-type cells, or cells that have a functional genetic modification in the Dec1 gene or Dec2 gene and the expression level of ATP1B1 is increased or decreased under the test conditions Including a step of placing.
  • the method includes a step of promoting or suppressing the transcriptional activity of the ATP1B1 gene.
  • the other clock transcription factor is CRY2, PER1-3, NPAS2, BMAL2, ROR alpha, RORb eta, ROR gamma, REV-ERB alpha or REV-ERB beta, or a combination thereof.
  • the expression level of ATP1B1 can be changed.
  • a substance that regulates blood pressure can be evaluated.
  • the blood pressure adjustment condition evaluation method evaluation method according to the fourth aspect
  • the condition for adjusting the blood pressure can be evaluated.
  • blood pressure can be regulated in a non-human animal.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis in ChIP assay according to Example 1, and E-boxes of ATP1B1 gene and Dec1 gene. It is a figure which shows the result of the relative luciferase activity by the luciferase assay which concerns on Example 2.
  • FIG. It is a figure which shows the result of the ATP1B1 mRNA expression level of the Dec1 gene knockout mouse embryo fibroblast which concerns on Example 3.
  • FIG. It is a figure which shows the result of the ATP1B1 mRNA expression level by the MOI dependence of Dec1 adenovirus which concerns on Example 4.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis in ChIP assay according to Example 1, and E-boxes of ATP1B1 gene and Dec1 gene. It is a figure which shows the result of the relative luciferase activity by the luciferase assay which concerns on Example 2.
  • FIG. It
  • the Dec1 and Dec2 genes are genes that are specifically expressed in differentiated chondrocytes as described above (see Patent Document 1). Furthermore, it is also a known gene as a gene related to circadian rhythm (see Patent Document 2).
  • the Dec1 and Dec2 genes are named as SHARP and Stra13 in the rat and mouse orthologous genes, for example. However, in this specification, the names of the Dec1 and Dec2 genes (DEC1 or DEC2) are used for convenience regardless of the animal species.
  • the gene symbols are designated as BHLHE40 or BHLHE41 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/8553/ and http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • the names of the Dec1 and Dec2 genes shall be used.
  • the base sequence of the DNA of the Dec1 gene of human (Homo sapiens) is shown in SEQ ID NO: 1
  • the base sequence of the DNA of the Dec2 gene is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the first embodiment of the present invention relates to a non-human animal having a functional genetic modification in the Dec1 or Dec2 gene.
  • non-human animal is not particularly limited as long as it is an animal excluding humans.
  • it is a mammal (referred to as a model animal).
  • mammals include mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, pigs, cows, goats, horses, sheep, dogs, cats, monkeys, orangutans and chimpanzees. Most preferred among these is mouse or rat.
  • the Dec1 or Dec2 gene in the present invention will be described.
  • the Dec1 or Dec2 gene in a region of the Dec1 or Dec2 gene of a certain non-human animal, the Dec1 or Dec2 gene is not expressed at all, is overexpressed, its expression level is reduced to the extent that it cannot exert its normal function, and has a normal normal
  • the expression level of the gene product is increased to such an extent that the function is greatly exceeded, the function of the gene product is completely lost, the function of the gene product is lowered to the extent that the normal function that it originally has cannot be performed, or Examples include genetic modification such that the function of the gene product is increased to such a degree that the normal function is greatly exceeded. That is, it means a genetic modification that affects the function of the Dec1 or Dec2 gene.
  • gene modification means a gene modification (for example, gene introduction, deletion or deletion) having a normal meaning performed using a technique known to those skilled in the art.
  • genetic modification for example, calcium phosphate coprecipitation method, electroporation method, lipofection method, aggregation method, microinjection method (microinjection) method, gene gun (particle gun) method or DEAE-dextran method Etc.
  • Dec1 or Dec2 gene means the thing connected with the change of the expression level of ATP1B1. Preferably, it means what leads to a change in blood pressure associated therewith (see Non-Patent Document 1). Details of this will be described in a later embodiment. That is, the non-human animal according to the present embodiment has an increased or decreased ATP1B1 expression level, and preferably has hypotension or hypertension.
  • the increase or decrease in the expression level of ATP1B1 refers to an increase in the expression level of ATP1B1 in wild-type non-human animals such as siblings and the same age who have no genetic modification. Whether or not it is decreasing.
  • hypertension or hypertension refers to the blood pressure (contraction) of a genetically modified non-human animal compared to the blood pressure of a wild-type non-human animal such as a sibling and the same age without genetic modification. It means a state in which the blood pressure (diastolic blood pressure and / or diastolic blood pressure) is decreasing or increasing. More preferably, it means a state in which the blood pressure decreases or increases while having a circadian rhythm. Most preferably, it means a state in which the blood pressure decreases, particularly during the rest period (sleeping period) of the non-human animal, when the blood pressure decreases with a circadian rhythm.
  • Preferred examples according to the first embodiment include Dec1 gene knockout non-human animals or Dec2 gene knockout non-human animals having an increased ATP1B1 expression level and low blood pressure.
  • the knockout non-human animal can be either a heterozygous non-human animal or a homozygous non-human animal.
  • Such a Dec1 or Dec2 gene knockout non-human animal may be produced by any method known to those skilled in the art.
  • a vector configured to functionally delete the Dec1 or Dec2 gene is introduced into embryonic stem cells (ES cells) of a non-human mammal by the gene introduction method described above.
  • ES cells embryonic stem cells
  • a clone stably recombined with the vector is selected.
  • the ES cell is injected into a blastocyst, or the ES cell mass and the 8-cell stage embryo are aggregated to produce a chimeric non-human animal.
  • a heterozygous Dec1 or Dec2 gene knockout non-human animal (Dec1 +/ ⁇ or Dec2 +/ ⁇ ) is selected from the chimeric non-human animal by transmitting a germline functional defect of the Dec1 or Dec2 gene.
  • Dec1 +/ ⁇ or Dec2 +/ ⁇ non-human animals It is possible to obtain Furthermore, it is possible to cross-specify Dec1 +/ ⁇ or Dec2 +/ ⁇ non-human animals and select and obtain homozygous Dec1 or Dec2 gene knockout non-human animals (Dec1 ⁇ / ⁇ or Dec2 ⁇ / ⁇ ).
  • Another preferred example according to the first embodiment is a dec1 gene overexpressing non-human animal or a dec2 gene overexpressing non-human animal that has a decreased expression level of ATP1B1 and is hypertensive. Any method known to those skilled in the art may be used for producing such a Dec1 gene overexpressing non-human animal or a Dec2 gene overexpressing non-human animal.
  • a vector for preparing an overexpression body of Dec1 or Dec2 gene is prepared.
  • fertilized eggs, unfertilized eggs, sperm or progenitor cells thereof primary germ cells, oocyte cells, oocytes, egg cells, spermatogonia, spermatocytes or sperm cells, etc.
  • a DNA encoding DEC1 or DEC2 is introduced and produced using a vector for producing an overexpressing body.
  • the DNA is introduced at an early stage (more preferably before the 8-cell stage) of embryo development of a fertilized egg.
  • the Dec1 or Dec2 gene-modified non-human animal according to the first embodiment is referred to as hypotension or hypertension (a state in which blood pressure is reduced or increased in systolic blood pressure and / or diastolic blood pressure).
  • hypotension or hypertension a state in which blood pressure is reduced or increased in systolic blood pressure and / or diastolic blood pressure.
  • essential hypertension there are few model animals with essential hypotension, so the utility value is high.
  • the second embodiment of the present invention relates to a cell having a functional genetic modification in the Dec1 or Dec2 gene.
  • the “cell” is not particularly limited as long as the cell has a Dec1 or Dec2 gene in the genome configuration.
  • Examples thereof include cells of mammals such as humans and non-human animals as described above. Human, mouse or rat cells are preferred. Most preferably, vascular smooth muscle cells, vascular endothelial cells, kidney tubule cells, cardiomyocytes and the like related to blood pressure can be mentioned.
  • the cell may be a primary cultured cell or a cell line.
  • the means for genetic modification (for example, gene introduction, deletion or deletion) is the same as the means described in the first embodiment.
  • the functional genetic modification of the Dec1 or Dec2 gene in the second embodiment is the same as that described in the first embodiment, and increases or decreases the expression level of ATP1B1. It means something connected.
  • Dec1 gene knockout cell As a preferable example according to the second embodiment, there is a Dec1 gene knockout cell or a Dec2 gene knockout cell in which the expression level of ATP1B1 is increased.
  • the knockout cell may be either a heterozygous cell or a homozygous cell. Any method known to those skilled in the art may be used to produce such Dec1 or Dec2 gene knockout cells.
  • vascular smooth muscle cells and the like are collected from a mammal.
  • a vector configured to functionally delete the Dec1 or Dec2 gene is introduced.
  • knockout cells recombined with the vector are selected.
  • cells may be directly collected from the Dec1 or Dec2 gene knockout non-human animal according to the first embodiment described above.
  • Another preferred example according to the second embodiment is a dec1 gene overexpressing cell or a dec2 gene overexpressing cell in which the expression level of ATP1B1 is decreased. Any method known to those skilled in the art may be used to prepare such Dec1 gene overexpressing cells or Dec2 gene overexpressing cells.
  • a vector for producing an overexpression body of Dec1 or Dec2 gene is prepared.
  • vascular smooth muscle cells and the like are collected from the mammal, and DNA encoding DEC1 or DEC2 is introduced using the vector using the gene introduction method described above.
  • DNA encoding DEC1 or DEC2 is introduced using the vector using the gene introduction method described above.
  • cells that overexpress the Dec1 or Dec2 gene are produced.
  • cells may be directly collected from the non-human animal overexpressing Dec1 or Dec2 gene according to the first embodiment described above.
  • the Dec1 or Dec2 gene-modified cell according to the second embodiment has a feature that the expression level of ATP1B1 increases or decreases. It has also been found that an increase or decrease in the expression level of ATP1B1 leads to hypotension or hypertension (see Non-Patent Document 1). That is, the cell according to the second embodiment is used for diagnosis, treatment, development of diagnostic or therapeutic agent for essential hypotension or essential hypertension, or treatment of essential hypotension or essential hypertension. It is useful as a model cell to be used for the study of influential diet, lifestyle or environment.
  • the third embodiment of the present invention utilizes the Dec1 or Dec2 gene-modified non-human animal according to the first embodiment described above, and the Dec1 or Dec2 gene-modified cell according to the second embodiment.
  • the present invention relates to a method for evaluating a blood pressure regulator.
  • the blood pressure regulator evaluation method according to the third embodiment includes a blood pressure regulator screening method.
  • the evaluation method includes a step of administering a test substance to a Dec1 or Dec2 gene modified non-human animal.
  • the method further includes the step of measuring blood pressure of the non-human animal.
  • test substance means any substance that can be subjected to evaluation and screening as to whether it is a blood pressure regulator.
  • a low molecular compound, a nucleic acid, or a polypeptide can be used.
  • the low molecular weight compound, nucleic acid, polypeptide or the like may be extracted and purified from a natural product, or may be artificially synthesized.
  • purified thing not only the refine
  • any of a novel substance and a known substance may be used.
  • an existing or novel blood pressure regulation therapeutic or prophylactic agent, or a derivative thereof may also be included.
  • the administration method of the test substance to the non-human animal is not limited as long as it is a means for administration to the non-human animal known to those skilled in the art.
  • oral administration subcutaneous injection, intramuscular injection, local injection, intraperitoneal administration and the like can be mentioned.
  • the method for measuring (evaluating) blood pressure of the non-human animal is not limited as long as it is a method for measuring (evaluating) blood pressure of a non-human animal known to those skilled in the art.
  • direct blood pressure measurement using a commercially available blood pressure measurement device or the like can be mentioned.
  • indirect blood pressure fluctuation measurement (evaluation) such as measurement of an expression level of a substance whose expression level increases or decreases due to a change in blood pressure may be used.
  • the Dec1 or Dec2 gene-modified non-human animal to which the test substance is administered may be evaluated according to the pathological condition of essential hypotension due to wandering or behavior, or the pathological condition of essential hypertension such as arteriosclerosis.
  • the blood pressure of Dec1 or Dec2 gene modified non-human animals before administration of the test substance is measured in advance.
  • the circadian rhythm of blood pressure is measured (for example, blood pressure is measured every specific time).
  • the test substance is orally administered to the genetically modified non-human animal, and blood pressure is measured in the same manner.
  • the blood pressure (systolic blood pressure and / or diastolic blood pressure) of the genetically modified non-human animal before and after administration is compared, and from the change in blood pressure, the test substance is essential hypotension (or essential blood pressure).
  • the blood pressure comparison target is not the same genetically modified non-human animal before and after administration, but also other genetically modified non-human animals that do not receive siblings and the same age, and genetically modified non-human animals that have been administered. I do not care.
  • the evaluation method includes a step of bringing a test substance into contact with Dec1 or Dec2 gene-modified cells.
  • the method for bringing the test substance into contact with the genetically modified cells may be any method as long as the test substance is in contact with the genetically modified cells.
  • a method such as adding a test substance as described above to the culture medium of the genetically modified cells can be mentioned.
  • the step of contacting the aforementioned test substance, and further, the expression level or the like in the genetically modified cells of a substance that increases or decreases due to changes in blood pressure is measured.
  • Substances that increase or decrease due to changes in blood pressure include DEC1 or DEC2, or ATP1B1, Na + / K + -ATPase activity, endogenous ouabain, adducin, cytosolic calcium concentration or myosin light chain kinase activity, etc.
  • a method including a step of measuring the expression level of ATP1B1 is preferable.
  • the method for measuring the expression level from cells is not limited as long as it is a method known in the art.
  • the expression level of the transcript can be measured by RT-PCR or Northern blotting using Total RNA prepared from cells.
  • the expression level of the translation product can be measured by preparing an extract from the cells and using an immunological technique.
  • an immunological technique it can be measured by radioisotope immunoassay (RIA method), ELISA method or fluorescent antibody method.
  • RIA method radioisotope immunoassay
  • ELISA method ELISA method
  • fluorescent antibody method for example, the cytosolic calcium concentration can be measured by using the excitation wavelength change of a fluorescent probe (Fura2 or Fura4 or the like) that changes with respect to the calcium ion concentration.
  • Myosin light chain kinase activity can be measured using a specific antibody against the phosphorylated enzyme or 32 P-ATP.
  • the expression level of ATP1B1 in the Dec1 or Dec2 gene-modified cells in culture before contact with the test substance is measured by RT-PCR.
  • the circadian rhythm of the expression level is measured (for example, the expression level at a specific time is measured).
  • a test substance is added to the culture medium of the genetically modified cells, and then the expression level of ATP1B1 is similarly measured. Compare the expression level of ATP1B1 in the genetically modified cells before and after the addition, and evaluate whether or not the test substance is a blood pressure regulator (for example, a therapeutic or preventive agent for hypotension or hypertension) , And screen.
  • a blood pressure regulator for example, a therapeutic or preventive agent for hypotension or hypertension
  • the gene-modified cell is a Dec1 gene knockout cell
  • the expression level of ATP1B1 is decreased after addition than before addition, it is highly likely to be a substance for treating or preventing essential hypotension.
  • the genetically modified cell is a Dec1 gene overexpressing cell, if the expression level of ATP1B1 is increased after addition than before addition, it is likely to be a therapeutic or preventive substance for essential hypertension. .
  • the blood pressure regulator evaluation method includes the Dec1 or Dec2 gene-modified non-human animal according to the first embodiment and the Dec1 according to the second embodiment.
  • Dec2 gene-modified cells can be used to evaluate and screen substances effective in preventing, diagnosing or treating essential hypotension or essential hypertension. That is, it leads to the development of drugs related to essential hypotension or essential hypertension. Further, from the viewpoint closer to the patient, it can also be used for research on diets that affect the pathology of essential hypotension or essential hypertension.
  • antihypertensives, diuretics, hypotension drugs, shock treatment drugs (digitalis) and the like currently prescribed for patients with essential hypotension or essential hypertension are DEC / CLOCK discovered by the present inventors. -Whether it directly or indirectly affects the ATP1B1 system is clinically important because it may also affect the way these therapeutics are used. Therefore, the use of the method for evaluating a blood pressure regulator according to the third embodiment leads to the elucidation of such an effect of the therapeutic agent and further the action mechanism of the therapeutic agent. The same applies to blood pressure regulators to be developed in the future.
  • the blood pressure regulator evaluation method according to the third embodiment can also use a wild-type non-human animal or cell.
  • the present inventors have discovered a mechanism relating to blood pressure of the DEC / CLOCK-ATP1B1 system. That is, using this, a test substance is administered to a wild-type non-human animal, and the expression level of DEC1 or DEC2 and the expression level of ATP1B1 in the non-human animal before and after administration of the test substance are measured. . If the expression level of DEC1 or DEC2 increases and the expression level of ATP1B1 decreases, the test substance is likely to be a therapeutic or preventive substance for essential hypotension.
  • test substance is likely to be a therapeutic or preventive substance for essential hypertension.
  • wild-type cells A test substance is brought into contact with a wild-type cell, and the expression level of DEC1 or DEC2 and the expression level of ATP1B1 in the cell before and after contact with the test substance may be measured. Even with such a method, blood pressure regulators can be evaluated.
  • the fourth embodiment of the present invention is a blood pressure using the Dec1 or Dec2 gene modified non-human animal according to the first embodiment and the Dec1 or Dec2 gene modified cell according to the second embodiment.
  • the present invention relates to a method for evaluating adjustment conditions. Specifically, the method includes a step of placing the genetically modified non-human animal or the genetically modified cell under test conditions.
  • condition refers to sound, light (light or dark), temperature, time, action (including exercise), lifestyle, environment, or any combination of these situations or conditions.
  • Means. “Placing the genetically modified non-human animal or the genetically modified cell under test conditions” means placing the animal or cell under conditions that allow the animal or cell to be placed under the various conditions described above.
  • the evaluation method includes a step of measuring blood pressure of the genetically modified non-human animal.
  • the method for measuring (evaluating) blood pressure of the genetically modified non-human animal is the same as in the third embodiment described above.
  • the blood pressure of the Dec1 or Dec2 gene modified non-human animal before being placed under the test condition is measured.
  • the circadian rhythm of blood pressure is measured (for example, blood pressure is measured every specific time).
  • the genetically modified non-human animal is placed under test conditions, and then blood pressure is measured in the same manner. Compare the blood pressure (systolic blood pressure and / or diastolic blood pressure) of the genetically modified non-human animal before and after being placed under the test condition, and whether the test condition becomes a blood pressure regulation condition from the change in the blood pressure (for example, , Whether it is effective in the treatment or prevention of hypotension or hypertension).
  • the blood pressure comparison target is not the genetically modified non-human animal before and after the test condition, but other genetically modified non-human animals such as siblings and the same age under normal conditions.
  • the gene-modified non-human animal may also be used.
  • the method for evaluating blood pressure regulation conditions using the genetically modified cell may preferably include a step of measuring the expression level in the genetically modified cell of a substance whose expression level increases or decreases due to a change in blood pressure.
  • DEC1 or DEC2, or ATP1B1, Na + / K + -ATPase activity, endogenous ouabain, aducin examples thereof include cytosolic calcium concentration or myosin light chain kinase activity.
  • the process of measuring the expression level of ATP1B1 among these is included.
  • the method for measuring the expression level from the cells is also the same as in the third embodiment described above.
  • the expression level of ATP1B1 in the Dec1 or Dec2 gene-modified cells in culture before being placed under the test condition is measured by RT-PCR.
  • the circadian rhythm of the expression level is measured (for example, blood pressure is measured every specific time).
  • the culture medium of the genetically modified cells is placed under test conditions, and thereafter the expression level of ATP1B1 is similarly measured.
  • Dec1 or Dec2 gene-modified cells may be directly collected from Dec1 or Dec2 gene-modified non-human animals under test conditions, and the expression level may be measured and compared.
  • the genetically modified cell when the genetically modified cell is a Dec1 gene knockout cell, if the expression level of ATP1B1 is decreased later than before placing under test conditions, the condition is essential hypotension. It is likely to be treatment or prevention.
  • the genetically modified cell when the genetically modified cell is a Dec1 gene overexpressing cell, if the expression level of ATP1B1 is increased later than before being placed under the test condition, the condition is considered to be treatment or prevention of essential hypertension. Is likely to be.
  • the blood pressure regulation condition evaluation method includes the Dec1 or Dec2 gene-modified non-human animal according to the first embodiment and the Dec1 according to the second embodiment.
  • Dec2 gene-modified cells can be used to evaluate conditions effective for preventing or treating essential hypotension or essential hypertension.
  • the blood pressure regulation condition evaluation method can be performed using a wild-type non-human animal or cell.
  • a wild-type non-human animal is placed under test conditions, and the expression level of DEC1 or DEC2 and the expression level of ATP1B1 of the non-human animal before and after being placed under the test conditions are measured. If the expression level of DEC1 or DEC2 increases and the expression level of ATP1B1 decreases, the test condition is likely to be a treatment condition or a prevention condition for essential hypotension. Conversely, if the expression level of DEC1 or DEC2 decreases and the expression level of ATP1B1 increases, the test condition is likely to be a treatment condition or a prevention condition for essential hypertension.
  • wild-type cells The same applies to wild-type cells.
  • the wild-type cell is placed under the test conditions, and the expression level of DEC1 or DEC2 and the expression level of ATP1B1 of the cell before and after the test condition may be measured. Even with such a method, the blood pressure regulation condition can be evaluated.
  • the fifth embodiment of the present invention relates to the regulation of blood pressure including the step of promoting or suppressing the transcriptional activity of the ATP1B1 gene by DEC1 or DEC2 and one or more other clock-related factors in a non-human animal. Regarding the method.
  • clock-related factors include, for example, CLOCK, BMAL1, CRY1, CRY2, PER1-3, NPAS2, BMAL2, ROR alpha, RORb beta, ROR gamma, REV-ERB alpha, and REV-ERB beta.
  • it is CLOCK, BMAL1 and / or CRY1.
  • Example 1 In this Example 1, Genome-wide chromaprecipitation (ChIP) -on-chip assay (hereinafter referred to as ChIP-on-chip) using anti-DEC1 antibody, and ChIP immunoprecipitation using anti-DEC1 antibody and anti-CLOCK antibody (hereinafter referred to as ChIP immunoprecipitation).
  • ChIP assay Genome-wide chromaprecipitation (ChIP) -on-chip assay (hereinafter referred to as ChIP-on-chip) using anti-DEC1 antibody, and ChIP immunoprecipitation).
  • ChIP immunoprecipitation ChIP immunoprecipitation
  • ChIP-on-chip using an anti-DEC1 antibody was performed in a human embryonic kidney cell line (HEK293 cells). This utilizes the property that DEC1 can directly bind to E-box (CACGTG), which is the transcriptional regulatory region of the clock gene (see Patent Document 2). In the kidney, which is a blood pressure control organ, the clock gene is directly controlled. This is because the gene (clock-related gene) is selected. Note that ChIP-on-chip is a series of studies in which chromatin immunoprecipitation and DNA microarray are performed in a series, and is a method of comprehensively analyzing which position on the genome the immunoprecipitated DNA fragment corresponds to.
  • ChIP assay was performed according to the attached protocol using ChIP assay kit (Upstate).
  • a DNA sample for ChIP assay was collected from cultured human mesenchymal stem cells (BioWhittaker, Walkersville, MD).
  • the amino acid sequence of the anti-DEC1 antibody used is shown in SEQ ID NO: 3.
  • Anti-CLOCK antibodies are available from Santa Cruz Biotechnology, catalog no. The one of sc-6927 was used. As controls, Santa Cruz Biotechnology, catalog no. An anti-IgG antibody of sc-2027 was used.
  • the collected DNA sample was amplified by PCR so as to contain two E-boxes (ATP1B1 E1-box and ATP1B1 E2-box) in the promoter sequence upstream of the ATP1B1 gene.
  • E-boxes ATP1B1 E1-box and ATP1B1 E2-box
  • the base sequences of the forward and reverse primers used in each were as follows: SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 for ATP1B1 E1-box, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 for ATP1B1 E2-box, and SEQ ID NO: 6 for SEQ1 E-box No. 8 and SEQ ID No. 9.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis in ChIP assay according to Example 1, and E-boxes of ATP1B1 and Dec1. As shown in FIG. 1, DEC1 and CLOCK were shown to bind directly to ATP1B1 E1-box and ATP1B1 E2-box in the promoter region of ATP1B1.
  • Example 2 In Example 2, the influence of DEC1 and other molecular clock-related factors including CLOCK on the transcriptional activity of two E-boxes in the ATP1B1 promoter region will be described in detail. For details of other molecular clocks such as CLOCK or related factors of circadian rhythm, see Patent Document 2.
  • Example 1 it was shown that DEC1 and CLOCK directly bind to two E-boxes of ATP1B1. Therefore, whether or not these two E-boxes function as clock elements was examined by a luciferase assay (Luciferase assay). Specifically, reporters each containing an E-box sequence upstream of the ATP1B1 gene were prepared, and transcriptional activity by CLOCK / BMAL1, which is a promoter of the molecular clock, and DEC1 and CRY1, which are suppressors, was examined.
  • CLOCK / BMAL1 which is a promoter of the molecular clock
  • DEC1 and CRY1 which are suppressors
  • hATP1B1 E1-box and a sequence of 3 flanking 6 bp flanking sequences (shown in SEQ ID NO: 10), and hATP1B1 E2-box and a sequence of 3 flanking 6 bp flanking sequences PGL3-TK containing (shown in SEQ ID NO: 11) was produced.
  • the expression vectors for Clock, Bmal1, Dec1, and Cry1 genes, including the sequence that hdec1 E-box and 3 bp flanking sequences of 6 bp, and the clock, Bmal1, Dec1, and Cry1 genes are expressed as “DEC1 modulated the cicadian phase capped.
  • NIH3T3 cells were seeded at 3 ⁇ 10 4 cells per 24 well dish. Then, a luciferase reporter plasmid (4 ng per well), mouse clock and mouse Bmal1 expression vector (75 ng per well), Dec1 or Cry1 expression vector (10 ng per well), or empty vector (10 ng per well (pcDNA3.1 / Zeo) (Promega))) was transfected using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). As an internal standard, pRL-SV40 (0.1 ng per well) was simultaneously transfected (the total DNA used for transfection was 164.1 ng per well).
  • luciferase activity was measured using a dual luciferase reporter assay system (Promega). Luciferase activity was corrected with the activity of the internal standard.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of relative luciferase activity by the luciferase assay according to Example 2.
  • the transcriptional activity of two E-boxes (ATP1B1 E1-box and ATP1B1 E2-box) in the promoter region of ATP1B1 was increased by Clock + Bmal1, and was suppressed by Dec1 or Cry1. That is, from the results of Example 1 and Example 2, DEC1 and CLOCK directly bind to two E-boxes in the promoter region of ATP1B1, DEC1 represses transcriptional activity, and CLOCK promotes transcriptional activity. It has been shown.
  • Example 3 In this Example 3, the effect on the expression level of ATP1B1 mRNA in Dec1 gene knockout mice (Dec1-/-) will be described in detail.
  • Dec1 gene knockout mice are “DEC1 modulateds the cicadian phase of, clock gene, YonemoK, Homomoto, T, HondaK, UShimaK, UH. N, Kato Y, Mol Cell Biol. 28, 4080-4092, 2008 and Epub, Apr. 14, 2008).
  • Using the third passage of each fetal fibroblast collected each ATP1B1 mRNA was extracted when it became confluent.
  • RNeasy Mini kit (Qiagen) was used for total RNA extraction.
  • ABI Prism 7900 sequence detection system (Applied Biosystems) was used for quantification RT-PCR.
  • the base sequences of the forward and reverse primers used for quantification are shown in SEQ ID NOs: 12 and 13. Further, 5'-6-carbofluorescein (FAM) -TTCCCAGT-6-carboxytetramethylhydrolamine (TAMRA) -3 '(Mouse Universal Probe Library) was used as a probe.
  • FIG. 3 shows the results of ATP1B1 mRNA expression levels of Dec1 gene knockout mouse fetal fibroblasts according to Example 3.
  • the relative expression level of dec1 gene knockout mouse fetal fibroblast mRNA expression level (Dec1KO) is shown assuming that the sibling and age-matched wild-type mouse fetal fibroblast mRNA expression level (WT) is 1.0.
  • Dec1 gene knockout mouse (Dec1-/-) fibroblasts showed significantly higher expression levels of ATP1B1 mRNA than wild-type mouse fibroblasts.
  • Example 4 From the results of Example 3 described above, it is suggested that the ATP1B1 mRNA expression level decreases by overexpressing the Dec1 gene. Therefore, in this Example 4, the influence on the expression of ATP1B1 in Dec1 gene overexpressing cells will be described in detail.
  • human aortic smooth muscle cells (Cambrex Bio Science Walkersville Inc.) were seeded at 2 ⁇ 10 5 cells / well in a 6-well dish, and Dec1 was overexpressed using adenovirus 24 hours later.
  • the adenovirus which overexpressed LacZ was used for the control ("DEC1 modulars the circdian phase of clock gene expression.”, Nakashima A, Kawamoto K, UiSimaF, T H, Honma S, Yorioka N, Kohno N, Kato Y, Mol Cell Biol. 28, 4080-4092, 2008).
  • RNeasy Mini kit (Qiagen) was used for total RNA extraction.
  • ABI Prism 7900 sequence detection system (Applied Biosystems) was used.
  • the base sequences of the forward and reverse primers used for quantification are shown in SEQ ID NOs: 14 and 15.
  • the probe used was 5'-6-carbofluorescein (FAM) -CTGGCTGG-6-carbomethyltetramethylamine (TAMRA) -3 '(Human Universal Probe Library).
  • FAM 5'-6-carbofluorescein
  • TAMRA 5'-6-carbomethyltetramethylamine
  • FIG. 4 is a graph showing the results of ATP1B1 mRNA expression level due to MOI dependence of Dec1 adenovirus according to Example 4.
  • the expression level of ATP1B1 mRNA when the MOI (multiplicity of infection: the number of viruses that infect one cell) is 0 is 100, indicating the MOI dependence of Dec1-overexpressing human aortic smooth muscle cells.
  • the ATP1B1 mRNA expression level decreased depending on the MOI of Dec1 adenovirus.
  • Example 5 In this Example 5, the expression level of ATP1B1 mRNA over time in the kidneys of Dec1 gene knockout mice (Dec1 ⁇ / ⁇ ) (that is, suggesting the expression level of Na + / K + -ATPase mRNA) will be described in detail.
  • RNA extraction and quantification RT-PCR was performed using the same method as described above in Example 3. The same applies to the base sequences of the forward and reverse primers used for quantification of mATP1B1 mRNA, and the probe.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of circadian rhythm of ATP1B1 mRNA expression level in the kidneys of wild type mice and Dec1 gene knockout mice according to Example 5.
  • the expression level of ATP1B1 mRNA in 24ZT (Zeitgeber time: Zeitgeber time: 1 cycle of light-dark cycle is 24ZT) of siblings and wild-type mice of the same age is shown as 1.
  • FIG. 6 shows the results of circadian rhythms of ATP1B1 immunostaining in the kidneys of wild-type mice and Dec1 gene knockout mice according to Example 5.
  • Example 6 The blood pressure is expressed by (cardiac output) ⁇ (peripheral vascular resistance). Therefore, in the present embodiment 6, Dec1 gene knockout mice (Dec1 - / -) expression level over time in ATP1B1 mRNA in aorta and heart (i.e., Na + / K + -ATPase suggestion of mRNA expression level) details Explained.
  • FIG. 7 shows the results of circadian rhythms of ATP1B1 mRNA expression levels in the aorta of wild-type mice and Dec1 gene knockout mice according to Example 6.
  • FIG. 7 shows the expression level of ATP1B1 mRNA in 24ZT of siblings and wild-type mice of the same age.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of circadian rhythms of ATP1B1 immunostaining in the aorta of wild-type mice and Dec1 gene knockout mice according to Example 6.
  • ATP1B1 mRNA similar to that of the above-mentioned kidney of Example 5 and circadian variation over time of immunostaining of ATP1B1 were observed.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of circadian rhythms of ATP1B1 mRNA expression levels in the hearts of wild-type mice and Dec1 gene knockout mice according to Example 6.
  • the expression level of ATP1B1 mRNA in 24ZT of siblings and wild-type mice of the same age is shown as 1. Again, circadian variation of ATP1B1 mRNA over time was observed in the heart, similar to the kidney and aorta described above.
  • Example 7 In this Example 7, the 24-hour blood pressure measurement of Dec1 gene knockout mice (Dec1-/-) and sibling wild-type mice will be described in detail.
  • FIG. 10 is a graph showing systolic blood pressure circadian rhythm results of wild-type mice and Dec1 gene knockout mice according to Example 7.
  • FIG. 11 is a diagram showing diastolic blood pressure circadian rhythm results of wild-type mice and Dec1 gene knockout mice according to Example 7.
  • the blood pressure of wild-type mice for 24 hours had a circadian rhythm and a peak at night.
  • rhythm formation for 24 hours was maintained, but a significant decrease in blood pressure was observed compared to the wild type mouse.
  • blood pressure was greatly reduced during the day when the mouse goes to bed.
  • hypoglycemia or hypertension occurs when the Dec1 gene has a functional gene mutation.
  • symptoms such as wakefulness or dizziness in the morning, dizziness on standing up, headache or general malaise may occur.
  • a hypotensive drug such as amedium methyl sulfate
  • Symptoms appearing early in the morning (the second half of the resting period) in humans are consistent with an excessive decrease in blood pressure in Dec1 gene knockout mice during the daytime (resting period). That is, the Dec1 gene knockout mouse is similar to human essential hypotension, and it is suggested that the Dec1 gene knockout mouse can be used for the treatment of human essential hypotension.
  • Dec1 gene and the Dec2 gene have different actions, but the action as a clock gene that mediates E-box is common, and there are many similarities (see Patent Document 1 and Patent Document 2). Therefore, it can be sufficiently predicted that a decrease in blood pressure is observed in the Dec2 gene knockout mouse. Also, in human families with dominant active dec2 gene mutations, sleep time is short and they get up early in the morning ("The transcriptional repressor DEC2 regulates length in mammals.”, HeY, Jones CR, FujiX, FujiX, FujiX, Japan. , Holder JL Jr, Rossner MJ, Nishino S, Fu YH, Science 2009 Aug. 14, 325 (5942), 866-870) and Dec2 gene are also suggested to be related to circadian rhythm abnormalities in blood pressure. This is because blood pressure usually rises after waking up.
  • DEC1 is a transcription factor capable of reducing expression of Na + / K + -ATPase ⁇ 1 (ATP1B1 ) small subunit of Na + / K + -ATPase associated with hypertension, blood pressure governing organs ( It was elucidated that blood pressure is increased by suppressing the expression of ATP1B1 in the heart, blood vessels, kidneys and the like). Furthermore, it was also clarified that the Dec1 gene knockout mouse had a lower blood pressure (lower blood pressure) especially in the resting period while maintaining the circadian rhythm as compared with the wild type mouse.
  • the Dec1 gene and Dec2 gene-modified non-human animals and cells according to the present invention can be used for evaluation / screening of blood pressure regulators, evaluation of blood pressure regulation conditions, or regulation of blood pressure.
  • it will lead to the development of diagnostic methods, therapeutic methods, diagnostic or therapeutic agents for essential hypotension and essential hypertension, or elucidation of the mechanism of action of currently prescribed or future developed therapeutic agents. . It can also be used to study diets, lifestyle or the environment that affects treatment.

Abstract

　ＡＴＰ１Ｂ１の発現量を変化させる遺伝子改変非ヒト動物および細胞、当該非ヒト動物および細胞を利用した血圧調節物質の評価方法および血圧調節条件の評価方法、ならびに、当該機構を利用した血圧の調節方法を提供する。非ヒト動物および細胞は、Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子に機能的な遺伝子改変を有し、かつＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加または減少している。血圧調節物質の評価方法は、当該非ヒト動物に被験物質を投与する工程を含む。または、当該細胞に被験物質を接触させる工程を含む。血圧調節条件の評価方法は、当該非ヒト動物および細胞を、被験条件下におく工程を含む。血圧の調節方法は、非ヒト動物内において、ＤＥＣ１またはＤＥＣ２、ならびに、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＣＲＹ１およびその他の時計転写因子のうちの少なくとも一つによって、ＡＴＰ１Ｂ１遺伝子の転写活性を促進または抑制させる工程を含む。

Description

非ヒト動物、細胞、血圧調節物質の評価方法、血圧調節条件の評価方法および血圧の調節方法
　本発明は、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量を変化させる遺伝子を改変した非ヒト動物および細胞、当該非ヒト動物および細胞を利用した血圧調節物質の評価方法および血圧調節条件の評価方法、ならびに、当該機構を利用した血圧の調節方法に関する。
　本態性高血圧または本態性低血圧は、生活習慣病のひとつであり、概念的で複雑かつ多因子性の病態である。血圧自体の自覚症状は何もないことが多い。しかし、虚血性心疾患、脳卒中または腎不全等の発症リスクとなる点で臨床的な意義は大きい。
　例えば、本態性高血圧に関連する因子として、非特許文献１には、（本態性）高血圧とＮａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅとの関連性が記載されている。具体的には、Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅの阻害が、高血圧症に繋がり得るということが記載されている。Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅは、神経刺激伝達、栄養素もしくはイオンの吸収、または、細胞内のＣａ２＋濃度等に関連する、細胞内のＮａ＋およびＫ＋濃度を調節する基本的因子である。また、Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅは、α　ｓｕｂｕｎｉｔ（以下、ＡＴＰ１Ａ１）と、β　ｓｕｂｕｎｉｔ（以下、ＡＴＰ１Ｂ１）とを含む構成となっている。
　Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅの活性を制御するステロイドであるウアバイン（Ｏｕａｂａｉｎ）を投与すると血圧が上昇することと、多数の高血圧患者において内因性ウアバインの血中レベルが上昇していることが知られている。同様に、Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅの活性を制御する細胞骨格タンパク質であるアデューシン（Ａｄｄｕｃｉｎ）の変異でも、高血圧をもたらすことが知られている。
　一方、Ｄｅｃ１遺伝子は、分化状態の軟骨細胞に特異的に発現する遺伝子である。特許文献１には、ジブチリルｃＡＭＰの存在下で軟骨細胞を培養することにより、軟骨細胞が分化状態で培養され、その後、分化した軟骨細胞と脱分化した軟骨細胞との間で発現に差異のある遺伝子の探索を行うことで、前者に特異的に発現している遺伝子を取得することができたことが記載されている。
　さらに、ＤＥＣ１、およびそれに類似するＤＥＣ２は、体内時計自体を制御する時計転写因子でもあり、全組織で概日リズムにおける発現をしていることも分かっている。特許文献２には、分子時計におけるＤＥＣ１およびＤＥＣ２の役割が詳細に記載されている。具体的には、塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子であるＤＥＣ１またはＤＥＣ２を用いて概日リズムを調節する方法が記載されている。これらＤＥＣ１およびＤＥＣ２を用いることにより、Ｅ－ｂｏｘエンハンサを通し、同様に分子時計として機能しているＣＬＯＣＫおよびＢＭＡＬ１の誘発する転写活性化を制御する方法についても記載されている。
特開平１１－７５８８２号公報 特開２００５－２０４５０１号公報
Ｊｏｈｎ　Ｍ．Ｈａｍｌｙｎ，Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｒｉｎｇｅｌ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３００，６５０－６５２，１９８２
　前述したように、本態性高血圧または本態性低血圧は、概念的で複雑かつ多因子性の病態である。通常、血圧は昼に高く夜に低い。しかし、このような血圧の日内変動に関連して影響する本態性高血圧または本態性低血圧も存在する。これら本態性高血圧または本態性低血圧の治療薬（または予防薬、診断薬等）の標的分子および関連する遺伝子は、充分に明らかになっているとは言い難い。
　そのため、本態性高血圧または本態性低血圧の治療薬等の開発のために、未だ解明されていない、特に日内変動における、血圧上昇および血圧低下機構に関連する遺伝子およびタンパク質の解明が必要とされる。
　一方、前述したように、ＡＴＰ１Ａ１とＡＴＰ１Ｂ１とを含む構成のＮａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅの活性変化は、高血圧または低血圧に繋がり得ることが知られている。すなわち、これらの発現量の変化機構に関連する遺伝子およびタンパク質は、血圧の日内運動に影響している可能性が高い。
　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量を変化させる遺伝子改変非ヒト動物および細胞、当該非ヒト動物および細胞を利用した血圧調節物質の評価方法および血圧調節条件の評価方法、ならびに、当該機構を利用した血圧の調節方法の提供を目的とする。
　本発明者らが鋭意研究を行った結果、ＤＥＣ１またはＣＬＯＣＫが、ＡＴＰ１Ｂ１遺伝子上流プロモーター配列の二箇所のＣＡＣＧＴＧ　Ｅ－ｂｏｘに直接結合し、ＡＴＰ１Ｂ１の発現を抑制または促進させることを解明した。また、ＤＥＣ１はＡＴＰ１Ｂ１の発現を抑制することで血圧を上昇させるため、Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスは野生型マウスと比較して、特に休息期に血圧が低下する（低血圧となる）ことを解明した（実施例参照）。
　そこで、本発明の第１の態様に係る非ヒト動物は、Ｄｅｃ１遺伝子またはＤｅｃ２遺伝子に機能的な遺伝子改変を有し、かつＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加または減少していることを特徴とする。
　好ましくは、前記非ヒト動物は、低血圧または高血圧であることを特徴とする。
　さらに好ましくは、前記非ヒト動物は、Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウト動物またはＤｅｃ２遺伝子ノックアウト動物であり、前記ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加していることを特徴とする。
　また、好ましくは、前記非ヒト動物は、Ｄｅｃ１遺伝子過剰発現動物またはＤｅｃ２遺伝子過剰発現動物であり、前記ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が減少していることを特徴とする。
　好ましくは、前記非ヒト動物は、マウスまたはラットであることを特徴とする。
　本発明の第２の態様に係る細胞は、Ｄｅｃ１遺伝子またはＤｅｃ２遺伝子に機能的な遺伝子改変を有し、かつＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加または減少していることを特徴とする。
　好ましくは、前記細胞は、Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウト細胞またはＤｅｃ２遺伝子ノックアウト細胞であり、前記ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加していることを特徴とする。
　また、好ましくは、前記細胞は、Ｄｅｃ１遺伝子過剰発現細胞またはＤｅｃ２遺伝子過剰発現細胞であり、前記ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が減少していることを特徴とする。
　さらに好ましくは、前記細胞は、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞、腎臓尿細管細胞または心筋細胞のいずれかであることを特徴とする。
　本発明の第３の態様に係る血圧調節物質の評価方法は、Ｄｅｃ１遺伝子またはＤｅｃ２遺伝子に機能的な遺伝子改変を有し、かつＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加または減少している前記非ヒト動物、または前記細胞に、被験物質を投与する、または接触させる工程を含むことを特徴とする。
　好ましくは、前記非ヒト動物の血圧を測定する工程を含むことを特徴とする。
　または、本発明の第３の態様に係る血圧調節物質の評価方法は、Ｄｅｃ１遺伝子またはＤｅｃ２遺伝子に機能的な遺伝子改変を有し、かつＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加または減少している細胞に、被験物質を接触させる工程を含むことを特徴とする。
　好ましくは、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする。
　さらに、本発明の第３の態様に係る血圧調節物質の評価方法には、以下に示す野生型の非ヒト動物、野生型の細胞を用いる方法も含まれる。
　すなわち、野生型の非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、
　前記被験物質の投与前と投与後の、前記野生型の非ヒト動物の、ＤＥＣ１またはＤＥＣ２の発現量およびＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定する工程と、
　を含むことを特徴とする、血圧調節物質の評価方法。
　または、野生型の細胞に被験物質を接触させる工程と、
　前記被験物質の接触前と接触後の、前記野生型の細胞の、ＤＥＣ１またはＤＥＣ２の発現量およびＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定する工程と、
　を含むことを特徴とする、血圧調節物質の評価方法。
　本発明の第４の態様に係る血圧調節条件の評価方法は、野生型の非ヒト動物、または、Ｄｅｃ１遺伝子またはＤｅｃ２遺伝子に機能的な遺伝子改変を有し、かつＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加または減少している非ヒト動物、あるいは、野生型の細胞、または、Ｄｅｃ１遺伝子またはＤｅｃ２遺伝子に機能的な遺伝子改変を有し、かつＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加または減少している細胞を、被験条件下におく工程を含むことを特徴とする。
　本発明の第５の態様に係る血圧の調節方法は、前記遺伝子改変、または野生型の非ヒト動物内において、ＤＥＣ１またはＤＥＣ２、ならびに、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＣＲＹ１およびその他の時計転写因子のうちの少なくとも一つによって、ＡＴＰ１Ｂ１遺伝子の転写活性を促進または抑制させる工程を含むことを特徴とする。
　好ましくは、前記その他の時計転写因子は、ＣＲＹ２、ＰＥＲ１－３、ＮＰＡＳ２、ＢＭＡＬ２、ＲＯＲ　ａｌｐｈａ、ＲＯＲｂ　ｅｔａ、ＲＯＲ　ｇａｍｍａ、ＲＥＶ－ＥＲＢ　ａｌｐｈａもしくはＲＥＶ－ＥＲＢ　ｂｅｔａ、または、これらの組み合わせであることを特徴とする。
　本発明の第１の態様に係る非ヒト動物および第２の態様に係る細胞によれば、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量を変化させることができる。第３の態様に係る血圧調節物質の評価方法によれば、血圧を調節する物質を評価することができる。第４の態様に係る血圧調節条件の評価方法によれば、血圧を調節する条件を評価することができる。第５の態様に係る血圧の調節方法によれば、非ヒト動物内において血圧を調節することができる。
実施例１に係るＣｈＩＰ　ａｓｓａｙにおけるアガロースゲル電気泳動の結果、ならびに、ＡＴＰ１Ｂ１遺伝子およびＤｅｃ１遺伝子のＥ－ｂｏｘを示す図である。 実施例２に係るルシフェラーゼアッセイによる相対的ルシフェラーゼ活性の結果を示す図である。 実施例３に係るＤｅｃ１遺伝子ノックアウトマウス胎児線維芽細胞のＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ発現レベルの結果を示す図である。 実施例４に係るＤｅｃ１アデノウイルスのＭＯＩ依存性によるＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ発現レベルの結果を示す図である。 実施例５に係る野生型マウスおよびＤｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスの腎臓でのＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ発現レベルの概日リズムの結果を示す図である。 実施例５に係る野生型マウスおよびＤｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスの腎臓でのＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ発現レベルの概日リズムの結果を示す図である。 実施例６に係る野生型マウスおよびＤｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスの大動脈でのＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ発現レベルの概日リズムの結果を示す図である。 実施例６に係る野生型マウスおよびＤｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスの大動脈でのＡＴＰ１Ｂ１免疫染色の概日リズムの結果を示す図である。 実施例６に係る野生型マウスおよびＤｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスの心臓でのＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ発現レベルの概日リズムの結果を示す図である。 実施例７に係る野生型マウスおよびＤｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスの収縮期血圧概日リズム結果を示す図である。 実施例７に係る野生型マウスおよびＤｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスの拡張期血圧概日リズム結果を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。本明細書において「有する」、「含む」または「含有する」といった表現は、「からなる」または「から構成される」という意味も含むものとする。
　Ｄｅｃ１およびＤｅｃ２遺伝子は、前述したとおり、分化状態の軟骨細胞に特異的に発現する遺伝子（特許文献１参照）である。さらに、概日リズムに関連する遺伝子として既知の遺伝子でもある（特許文献２参照）。Ｄｅｃ１およびＤｅｃ２遺伝子は、例えば、ラットとマウスとのオーソロガス遺伝子では、ＳＨＡＲＰとＳｔｒａ１３として命名されている。しかし、本明細書では、便宜上動物種によらずＤｅｃ１およびＤｅｃ２遺伝子（ＤＥＣ１またはＤＥＣ２）の名称を使用するものとする。ヒトでも同様に、遺伝子記号はＢＨＬＨＥ４０またはＢＨＬＨＥ４１として命名されているが（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／８５５３／およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／７９３６５／参照）、Ｄｅｃ１およびＤｅｃ２遺伝子（ＤＥＣ１またはＤＥＣ２）の名称を使用するものとする。一例として、ヒト（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ）のＤｅｃ１遺伝子のＤＮＡの塩基配列を配列番号１に、Ｄｅｃ２遺伝子のＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。
　（Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変非ヒト動物）
　本発明の第１の実施の形態は、Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子に機能的な遺伝子改変を有する非ヒト動物に関する。
　なお、本明細書において「非ヒト動物」とは、ヒトを除く動物である限り特に限定されない。好ましくは、（モデル動物とされる）哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、オランウータンまたはチンパンジー等が挙げられる。このうち最も好ましくは、マウスまたはラットである。
　本発明における、Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子の機能的な遺伝子改変について説明する。例えば、ある非ヒト動物のＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子の領域において、Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子が全く発現しなくなる、過剰発現する、本来有する正常な機能が発揮できない程度にその発現量が低下する、本来有する正常な機能を大幅に越えて発揮する程度にその発現量が上昇する、その遺伝子産物の機能が完全に喪失する、本来有する正常な機能が発揮できない程度にその遺伝子産物の機能が低下する、または、本来有する正常な機能を大幅に越えて発揮する程度にその遺伝子産物の機能が上昇する等の、遺伝子改変が挙げられる。すなわち、Ｄｅｃ１もしくはＤｅｃ２遺伝子による機能に影響を与える遺伝子改変を意味する。
　本明細書において、「遺伝子改変」は、当該分野の当業者に公知である技術を用いて行う通常の意味の遺伝子の改変（例えば、遺伝子導入、欠失または欠損等）を意味する。このような遺伝子改変には、例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法またはＤＥＡＥ－デキストラン法等を挙げることができる。
　Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子による機能とは、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量の変化に繋がるものを意味する。好ましくは、それに伴う血圧の変化に繋がるものを意味する（非特許文献１参照）。この詳細については後の実施例において説明する。すなわち、本実施の形態に係る非ヒト動物は、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加または減少しており、好ましくは低血圧または高血圧である。
　本明細書において、「ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加または減少」とは、特に、遺伝子改変を有さない同胞および同齢等の野生型の非ヒト動物のＡＴＰ１Ｂ１の発現量を基準とし、増加しているか、または減少しているか否かを意味する。
　さらに、本明細書において、「低血圧または高血圧」とは、遺伝子改変を有さない同胞および同齢等の野生型の非ヒト動物の血圧と比較して、遺伝子改変非ヒト動物の血圧（収縮期血圧および／または拡張期血圧）が、低下または上昇している状態を意味する。さらに好ましくは、概日リズムを有したまま、血圧が低下または上昇している状態を意味する。最も好ましくは、概日リズムを有したまま血圧が低下する場合において、特に当該非ヒト動物の休息期（就寝期間）に血圧が低下している状態を意味する。
　本第１の実施の形態に係る好ましい例として、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加しており、低血圧であるＤｅｃ１遺伝子ノックアウト非ヒト動物またはＤｅｃ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物が挙げられる。ノックアウト非ヒト動物は、ヘテロ接合体非ヒト動物またはホモ接合体非ヒト動物のいずれでも可能である。このようなＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物の作製は、当該分野の当業者に公知である任意の方法のいずれを用いても構わない。
　一例を簡単に説明すると、まず、非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に、前述したような遺伝子導入法によって、Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子を機能的に欠損させるよう構成したベクターを導入する。次に、当該ベクターによって安定して組み換えられたクローンを選択する。その後、当該ＥＳ細胞を胚盤胞に注入するか、あるいはＥＳ細胞塊と８細胞期胚とを凝集させ、キメラ非ヒト動物を作製する。当該キメラ非ヒト動物から、生殖系列にＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子の機能的な欠損が伝達されたものを選択することにより、ヘテロ接合体Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物（Ｄｅｃ１＋／－またはＤｅｃ２＋／－）を得ることが可能である。さらに、Ｄｅｃ１＋／－またはＤｅｃ２＋／－非ヒト動物同士を交配させ、ホモ接合体Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物（Ｄｅｃ１－／－またはＤｅｃ２－／－）を選択し、得ることも可能である。
　本第１の実施の形態に係るもう一つの好ましい例として、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が減少しており、高血圧であるＤｅｃ１遺伝子過剰発現非ヒト動物またはＤｅｃ２遺伝子過剰発現非ヒト動物が挙げられる。このようなＤｅｃ１遺伝子過剰発現非ヒト動物またはＤｅｃ２遺伝子過剰発現非ヒト動物の作製は、当該分野の当業者に公知である任意の方法のいずれを用いても構わない。
　一例を簡単に説明する。まず、Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子の過剰発現体作製用ベクターを作製する。次に、非ヒト動物の受精卵、未受精卵、精子またはその前駆細胞（始原生殖細胞、卵原細胞、卵母細胞、卵細胞、精原細胞、精母細胞もしくは精細胞等）等に、前述したような遺伝子導入法により過剰発現体作製用ベクターを用いて、ＤＥＣ１またはＤＥＣ２をコードするＤＮＡを導入し、作製する。好ましくは、受精卵の胚発生の初期段階（さらに好ましくは８細胞期以前）において、当該ＤＮＡを導入する。
　このように、本第１の実施の形態に係るＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変非ヒト動物は、低血圧または高血圧（収縮期血圧および／または拡張期血圧において、血圧が低下または上昇している状態）という特徴を持っている。これらは、低血圧または高血圧モデル非ヒト動物として有用である。例えば、本態性低血圧（本態性高血圧）の診断方法、治療方法、診断薬もしくは治療薬の開発、または、本態性低血圧（本態性高血圧）の治療に影響する食事、生活習慣もしくは環境の研究に利用することができる。特に、本態性高血圧と比較し、本態性低血圧のモデル動物は少ない為、利用価値が高い。
　（Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変細胞）
　本発明の第２の実施の形態は、Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子に機能的な遺伝子改変を有する細胞に関する。
　なお、本明細書において「細胞」とは、その細胞のゲノム構成にＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子を有する限り特に限定されない。例えば、ヒトおよび前述したような非ヒト動物等の哺乳動物の細胞が挙げられる。好ましくは、ヒト、マウスまたはラットの細胞である。最も好ましくは、血圧に関連する、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞、腎臓尿細管細胞または心筋細胞等を挙げることができる。なお、当該細胞は、初代培養細胞または細胞株のいずれの細胞であってもよい。遺伝子改変（例えば、遺伝子導入、欠失または欠損等）の手段については、前述した第１の実施の形態で述べた手段と同様である。
　また、本第２の実施の形態でのＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子の機能的な遺伝子改変についても、第１の実施の形態において述べたものと同様の趣旨であり、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量の増加または減少に繋がるものを意味する。
　本第２の実施の形態に係る好ましい例として、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加したＤｅｃ１遺伝子ノックアウト細胞またはＤｅｃ２遺伝子ノックアウト細胞が挙げられる。ノックアウト細胞は、ヘテロ接合体細胞またはホモ接合体細胞のいずれでも構わない。このようなＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子ノックアウト細胞の作製は、当該分野の当業者に公知である任意の方法のいずれを用いても構わない。
　一例を簡単に説明すると、まず、哺乳動物から血管平滑筋細胞等を採取する。次いで、前述したような遺伝子導入法を用い、Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子を機能的に欠損させるよう構成したベクターを導入する。その後、当該ベクターによって組み換えられたノックアウト細胞を選択する。他の方法としては、前述の第１の実施の形態に係るＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物から直接細胞を採取しても構わない。
　本第２の実施の形態に係るもう一つの好ましい例として、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が減少した、Ｄｅｃ１遺伝子過剰発現細胞またはＤｅｃ２遺伝子過剰発現細胞が挙げられる。このようなＤｅｃ１遺伝子過剰発現細胞またはＤｅｃ２遺伝子過剰発現細胞の作製は、当該分野の当業者に公知である任意の方法のいずれを用いても構わない。
　一例を簡単に説明すると、まず、Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子の過剰発現体作製用ベクターを作製する。次に、哺乳動物から血管平滑筋細胞等を採取し、前述したような遺伝子導入法を用い、当該ベクターを使用してＤＥＣ１またはＤＥＣ２をコードするＤＮＡを導入する。その結果、Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子の過剰発現細胞が作製される。他の方法としては、前述の第１の実施の形態に係るＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子過剰発現非ヒト動物から直接細胞を採取しても構わない。
　本第２の実施の形態に係るＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変細胞は、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加または減少するという特徴を持っている。また、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量の増加または減少は、低血圧または高血圧に繋がることも分かっている（非特許文献１参照）。すなわち、本第２の実施の形態に係る細胞は、本態性低血圧または本態性高血圧の診断方法、治療方法、診断薬もしくは治療薬の開発、または、本態性低血圧もしくは本態性高血圧の治療に影響する食事、生活習慣もしくは環境の研究に利用するモデル細胞として有用である。
　（血圧調節物質の評価方法）
　本発明の第３の実施の形態は、前述の第１の実施の形態に係るＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変非ヒト動物、および、第２の実施の形態に係るＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変細胞を利用する、血圧調節物質の評価方法に関する。なお、本第３の実施の形態に係る血圧調節物質の評価方法には、血圧調節物質のスクリーニング方法も含まれる。
　まず、Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変非ヒト動物を利用する血圧調節物質の評価方法について説明する。具体的には、当該評価方法は、Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変非ヒト動物に被験物質を投与する工程を含む。好ましくは、当該非ヒト動物の血圧を測定する工程をさらに含む。
　なお、本明細書において「被験物質」とは、血圧調節物質となるか否かの評価、およびスクリーニングの対象となり得る、あらゆる物質を意味する。例えば、低分子化合物、核酸またはポリペプチド等が挙げられる。低分子化合物、核酸またはポリペプチド等は、天然物から抽出および精製されたものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。また、精製されたものに限らず、未精製のものでも被験物質として使用することができる。さらに、新規な物質および公知の物質のいずれでも構わない。例えば、既存もしくは新規の血圧調節の治療薬もしくは予防薬、またはその誘導体をも含み得る。
　当該非ヒト動物への被験物質の投与方法は、当該技術分野の当業者に公知である非ヒト動物への投与手段であれば限定されない。例えば、経口投与、皮下注射、筋肉注射、局所注入または腹腔内投与等が挙げられる。
　当該非ヒト動物の血圧の測定（評価）方法についても、当該技術分野の当業者に公知である非ヒト動物の血圧の測定（評価）方法であれば限定されない。例えば、市販の血圧測定装置等による直接的な血圧の測定が挙げられる。または、血圧変化により発現量が増減する物質の発現量の測定等のような、間接的な血圧変動の測定（評価）でも構わない。さらには、ふらつきもしくは行動等での本態性低血圧の病状、または、動脈硬化等の本態性高血圧の病状によって、被験物質を投与したＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変非ヒト動物を評価してもよい。
　当該血圧調節物質の評価、およびスクリーニング方法の一例を簡単に説明する。予め、被験物質の投与前のＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変非ヒト動物の血圧を測定しておく。好ましくは、血圧の概日リズムを測定しておく（例えば、特定時間毎の血圧を測定する）。次に、当該遺伝子改変非ヒト動物に被験物質を経口投与し、同様に血圧を測定する。その後、投与前と投与後との当該遺伝子改変非ヒト動物の血圧（収縮期血圧および／または拡張期血圧）を比較し、その血圧の変化から、当該被験物質が本態性低血圧症（または本態性高血圧症）に対して血圧調節物質（例えば、低血圧または高血圧の治療または予防剤）となるか否かを評価、およびスクリーニングする。なお、血圧の比較対象は、投与前後の同じ遺伝子改変非ヒト動物でなくとも、同胞および同齢の投与を行わない他の遺伝子改変非ヒト動物と、投与を行った遺伝子改変非ヒト動物とでも構わない。
　次に、Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変細胞を、本態性低血圧症または本態性高血圧症のモデル細胞として利用する血圧調節物質の評価方法について説明する。具体的には、当該評価方法は、Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変細胞に被験物質を接触させる工程を含む。
　当該遺伝子改変細胞に被験物質を接触させる方法は、当該遺伝子改変細胞に被験物質が接触している状態であれば、どのような方法でも構わない。例えば、当該遺伝子改変細胞の培養培地中において、前述したような被験物質を添加する等の方法が挙げられる。
　当該遺伝子改変細胞を利用する血圧調節物質の評価、およびスクリーニング方法では、前述の被験物質を接触させる工程と、さらには、血圧変化により増減する物質の当該遺伝子改変細胞中における発現量等を測定する工程とを含み得る。血圧変化により増減する物質等には、本発明に係るＤＥＣ１もしくはＤＥＣ２、または、ＡＴＰ１Ｂ１、Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ活性、内在性ウアバイン、アデューシン、細胞質カルシウム濃度もしくはミオシン軽鎖リン酸化酵素活性等を挙げることができる。これらのうち、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定する工程を含む方法が好ましい。
　細胞から発現量を測定する方法は、当該技術分野において公知である方法なら限定されない。例えば、転写産物の発現量は、細胞から調整したＴｏｔａｌ　ＲＮＡを用いての、ＲＴ－ＰＣＲまたはノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法または蛍光抗体法等により測定され得る。例えば、細胞質カルシウム濃度については、カルシウムイオン濃度に対して変化する蛍光プローブ（Ｆｕｒａ２またはＦｕｒａ４等）の励起波長変化を利用して測定され得る。ミオシン軽鎖リン酸化酵素活性については、リン酸化した同酵素に対する特異的抗体または３２Ｐ－ＡＴＰを用いて測定され得る。
　当該血圧調節物質の評価、およびスクリーニング方法の一例を簡単に説明すると、まず、被験物質接触前の培養中のＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変細胞における、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量をＲＴ－ＰＣＲにより測定しておく。好ましくは、発現量の概日リズムを測定しておく（例えば、特定時間毎の発現量を測定する）。次に、当該遺伝子改変細胞の培養培地中に被験物質を添加し、その後同様にＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定する。添加前と添加後との当該遺伝子改変細胞のＡＴＰ１Ｂ１の発現量を比較し、その変化から当該被験物質が血圧調節物質（例えば、低血圧または高血圧の治療または予防剤）となるか否かを評価、およびスクリーニングする。
　すなわち、当該遺伝子改変細胞がＤｅｃ１遺伝子ノックアウト細胞であった場合、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が添加前より添加後の方が減少していれば、本態性低血圧の治療または予防物質となる可能性が高い。また、当該遺伝子改変細胞がＤｅｃ１遺伝子過剰発現細胞であった場合、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が添加前より添加後の方が増加していれば、本態性高血圧の治療または予防物質となる可能性が高い。
　このように、本第３の実施の形態に係る血圧調節物質の評価方法は、第１の実施の形態に係るＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変非ヒト動物、および、第２の実施の形態に係るＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変細胞を利用し、本態性低血圧または本態性高血圧の予防、診断もしくは治療に有効な物質を評価、およびスクリーニングすることができる。すなわち、本態性低血圧または本態性高血圧に関する薬剤の開発に繋がる。また、より患者に近い観点では、本態性低血圧または本態性高血圧の病態に影響する食事等の研究にも利用され得る。
　さらに、例えば、現在本態性低血圧または本態性高血圧患者に処方されている、降圧剤、利尿剤、低血圧治療薬またはショック治療薬（ジギタリス）等が、本発明者らが発見したＤＥＣ／ＣＬＯＣＫ－ＡＴＰ１Ｂ１系に直接または間接的に影響しないかどうかは、これらの治療薬の使用方法にも影響する可能性があるため、臨床的に重要である。そこで、本第３の実施の形態に係る血圧調節物質の評価方法を利用すると、当該治療薬によるそのような影響、さらには当該治療薬の作用機序の解明にも繋がる。これは、今後開発される血圧調節剤についても同様である。
　なお、本第３の実施の形態に係る血圧調節物質の評価方法は、野生型の非ヒト動物または細胞を用いても可能である。前述のとおり、本発明者らはＤＥＣ／ＣＬＯＣＫ－ＡＴＰ１Ｂ１系の血圧に関する機序を発見した。すなわち、これを利用し、野生型の非ヒト動物に被験物質を投与し、被験物質の投与前と投与後の、当該非ヒト動物の、ＤＥＣ１またはＤＥＣ２の発現量およびＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定する。ＤＥＣ１またはＤＥＣ２の発現量が増加し、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が減少していれば、当該被験物質は、本態性低血圧の治療または予防物質となる可能性が高い。逆に、ＤＥＣ１またはＤＥＣ２の発現量が減少し、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加していれば、当該被験物質は、本態性高血圧の治療または予防物質となる可能性が高い。野生型の細胞であっても同様である。野生型の細胞に被験物質を接触させ、被験物質の接触前と接触後の、当該細胞の、ＤＥＣ１またはＤＥＣ２の発現量およびＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定すればよい。このような方法であっても血圧調節物質の評価をすることができる。
　（血圧調節条件の評価方法）
　本発明の第４の実施の形態は、前述の第１の実施の形態に係るＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変非ヒト動物、および、第２の実施の形態に係るＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変細胞を利用する血圧調節条件の評価方法に関する。具体的には、当該遺伝子改変非ヒト動物、または、当該遺伝子改変細胞を、被験条件下におく工程を含む。
　本明細書において「条件」とは、音、光（明もしくは暗等）、温度、時間、行動（運動も含む）、生活習慣、環境、または、これらを組み合わせた様々な任意の状況もしくは状態等を意味するものとする。当該遺伝子改変非ヒト動物または当該遺伝子改変細胞を「被験条件下におく」とは、前述した様々な条件等に、動物または細胞のそれぞれを通常おかれ得る条件下におくことを意味する。
　まず、第１の実施の形態に係るＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変非ヒト動物を利用する、血圧調節条件の評価方法について説明する。好ましくは、当該評価方法では、当該遺伝子改変非ヒト動物の血圧を測定する工程を含む。なお、当該遺伝子改変非ヒト動物の血圧の測定（評価）方法については、前述した第３の実施の形態と同様である。
　当該血圧調節条件の評価方法の一例を簡単に説明すると、まず、被験条件下におく前のＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変非ヒト動物の血圧を測定しておく。好ましくは、血圧の概日リズムを測定しておく（例えば、特定時間毎の血圧を測定する）。次に、当該遺伝子改変非ヒト動物を被験条件下におき、その後同様に血圧を測定する。被験条件下におく前後での当該遺伝子改変非ヒト動物の血圧（収縮期血圧および／または拡張期血圧）を比較し、その血圧の変化から当該被験条件が血圧調節条件となるか否か（例えば、低血圧または高血圧の治療または予防に有効か否か）を評価する。なお、血圧の比較対象は、被験条件下におく前後での当該遺伝子改変非ヒト動物でなくとも、通常条件下においた同胞および同齢等の他の遺伝子改変非ヒト動物と、被験条件下においた当該遺伝子改変非ヒト動物とでも構わない。
　次に、第２の実施の形態に係るＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変細胞を利用する、血圧調節条件の評価方法について説明する。
　当該遺伝子改変細胞を利用する血圧調節条件の評価方法では、好ましくは、血圧変化により発現量が増減する物質の、当該遺伝子改変細胞中における発現量を測定する工程を含み得る。このような血圧変化により発現量が増減するものには、第３の実施の形態同様、本発明に係るＤＥＣ１もしくはＤＥＣ２、または、ＡＴＰ１Ｂ１、Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ活性、内在性ウアバイン、アデューシン、細胞質カルシウム濃度もしくはミオシン軽鎖リン酸化酵素活性等を挙げることができる。好ましくは、これらのうちＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定する工程を含む。細胞から発現量を測定する方法についても、前述の第３の実施の形態と同様である。
　当該血圧調節条件の評価方法の一例を簡単に説明すると、まず、被験条件下におく前の培養中のＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変細胞における、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量をＲＴ－ＰＣＲにより測定しておく。好ましくは、発現量の概日リズムを測定しておく（例えば、特定時間毎の血圧を測定する）。次に、当該遺伝子改変細胞の培養培地を被験条件下におき、その後同様にＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定する。被験条件下におく前後での当該遺伝子改変細胞のＡＴＰ１Ｂ１の発現量を比較し、その変化から当該被験条件が血圧調節条件となるか否か（例えば、低血圧または高血圧となり易いか否か）を評価する。他の例として、被験条件下においたＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変非ヒト動物から直接Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変細胞を採取し、発現量を測定および比較しても構わない。
　すなわち、この例において、当該遺伝子改変細胞がＤｅｃ１遺伝子ノックアウト細胞であった場合、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が被験条件下におく前より後の方が減少していれば、当該条件が本態性低血圧の治療または予防となる可能性が高い。また、当該遺伝子改変細胞がＤｅｃ１遺伝子過剰発現細胞であった場合、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が被験条件下におく前より後の方が増加していれば、当該条件が本態性高血圧の治療または予防となる可能性が高い。
　このように、本第４の実施の形態に係る血圧調節条件の評価方法は、第１の実施の形態に係るＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変非ヒト動物、および、第２の実施の形態に係るＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変細胞を利用し、本態性低血圧または本態性高血圧の予防もしくは治療に有効な条件を評価することができる。
　前述の第３の実施の形態に係る血圧調節物質の評価方法と同様に、野生型の非ヒト動物または細胞を用いても、血圧調節条件の評価方法を行うことが可能である。野生型の非ヒト動物を被験条件下に置き、被験条件下に置く前と被験条件下に置いた後の、当該非ヒト動物の、ＤＥＣ１またはＤＥＣ２の発現量およびＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定する。ＤＥＣ１またはＤＥＣ２の発現量が増加し、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が減少していれば、当該被験条件は、本態性低血圧の治療条件または予防条件である可能性が高い。逆に、ＤＥＣ１またはＤＥＣ２の発現量が減少し、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加していれば、当該被験条件は、本態性高血圧の治療条件または予防条件である可能性が高い。野生型の細胞であっても同様である。野生型の細胞を被験条件下に置き、被験条件下に置く前と被験条件下に置いた後の、当該細胞の、ＤＥＣ１またはＤＥＣ２の発現量およびＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定すればよい。このような方法であっても血圧調節条件の評価をすることができる。
　（血圧の調節方法）
　本発明の第５の実施の形態は、非ヒト動物内において、ＤＥＣ１またはＤＥＣ２、ならびに、一つ以上の他の時計関連因子によって、ＡＴＰ１Ｂ１遺伝子の転写活性を促進または抑制させる工程を含む血圧の調節方法に関する。
　具体的に、他の時計関連因子とは、例えば、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＣＲＹ１、ＣＲＹ２、ＰＥＲ１－３、ＮＰＡＳ２、ＢＭＡＬ２、ＲＯＲ　ａｌｐｈａ、ＲＯＲｂ　ｅｔａ、ＲＯＲ　ｇａｍｍａ、ＲＥＶ－ＥＲＢ　ａｌｐｈａおよびＲＥＶ－ＥＲＢ　ｂｅｔａ等の、当該技術分野において公知である分子時計に関する因子および概日リズムに関連する因子を意味する（特許文献２参照）。好ましくは、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１および／またはＣＲＹ１である。
　当該血圧の調節方法の一例を簡単に説明すると、まず、第１の実施の形態において前述したように、非ヒト動物のＤｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子に機能的な遺伝子改変を持たせる。次に、当該Ｄｅｃ１またはＤｅｃ２遺伝子改変非ヒト動物のＣｌｏｃｋ、Ｂｍａｌ１および／またはＣｒｙ１遺伝子において、再度同様に機能的な遺伝子改変を持たせる。このような工程を繰り返すことによって、ＡＴＰ１Ｂ１遺伝子の転写活性を調節（促進または抑制）することができる。これに伴い、非ヒト動物内において、血圧を調節することができる。なお、このような遺伝子改変の繰り返しを、前述した第２の実施の形態の細胞において行うことにより、ＡＴＰ１Ｂ１の発現量の調節を行うことも可能である。
　以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
　（実施例１）
　本実施例１では、抗ＤＥＣ１抗体を用いたＧｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ　ｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ＣｈＩＰ）－ｏｎ－ｃｈｉｐ　ａｓｓａｙ（以下、ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐ）、ならびに、抗ＤＥＣ１抗体および抗ＣＬＯＣＫ抗体を用いたＣｈＩＰ　ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（以下、ＣｈＩＰ　ａｓｓａｙ）について詳細に説明する。
　まず、ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｋｉｄｎｅｙ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ（ＨＥＫ２９３細胞）において、抗ＤＥＣ１抗体を用いたＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐを行った。これは、ＤＥＣ１が時計遺伝子の転写調節領域であるＥ－ｂｏｘ（ＣＡＣＧＴＧ）に直接結合できる性質（特許文献２参照）を利用し、血圧制禦器官である腎臓において、時計遺伝子が直接制御している遺伝子（時計関連遺伝子）を選定するためである。なお、ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐはクロマチン免疫沈降とＤＮＡマイクロアレイとを一連に行う研究であり、免疫沈降したＤＮＡ断片がゲノム上のどの位置に相当するかを網羅的に解析する方法である。
　ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐの解析結果から、可能性が高い１０７遺伝子について、遺伝子上流のプロモーター領域にＥ－ｂｏｘが存在するか検索を行った。その結果、７６遺伝子（７１％）のプロモーター領域にＥ－ｂｏｘが存在した。それらのプロモーター領域のうち、ＡＴＰ１Ｂ１遺伝子上流のプロモーター領域には、ヒト、マウスおよびラット等の複数の種族間で保存されたＥ－ｂｏｘが二箇所存在していた。そのことから、本発明者らは、この領域は時計エレメントとして機能している可能性が高いと考えた。
　次に、ＤＥＣ１、および同様に時計関連因子であることが既知であるＣＬＯＣＫ（特許文献２参照）について、前述したＡＴＰ１Ｂ１遺伝子上流のプロモーター領域の二箇所のＥ－ｂｏｘへの結合を確認するためのＣｈＩＰ　ａｓｓａｙを行った。
　ＣｈＩＰ　ａｓｓａｙは、ＣｈＩＰ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｕｐｓｔａｔｅ）を用い、添付のプロトコールに従って行った。ＣｈＩＰ　ａｓｓａｙ用のＤＮＡサンプルは、培養細胞のヒト間葉系幹細胞（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より採取した。使用した抗ＤＥＣ１抗体のアミノ酸配列を、配列番号３に示す。抗ＣＬＯＣＫ抗体は、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログｎｏ．ｓｃ－６９２７のものを使用した。コントロールとしては、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログｎｏ．ｓｃ－２０２７の抗ＩｇＧ抗体を使用した。
　採取したＤＮＡサンプルを、ＡＴＰ１Ｂ１遺伝子上流のプロモーター配列にある二箇所のＥ－ｂｏｘ（ＡＴＰ１Ｂ１　Ｅ１－ｂｏｘおよびＡＴＰ１Ｂ１　Ｅ２－ｂｏｘ）を含むよう、ＰＣＲ法によって増幅した。コントロールには、Ｄｅｃ１　Ｅ－ｂｏｘを含む様に増幅したＤＮＡサンプルを用いた。それぞれにおいて使用したフォワードおよびリバースプライマーの塩基配列は、ＡＴＰ１Ｂ１　Ｅ１－ｂｏｘについては配列番号４および配列番号５に、ＡＴＰ１Ｂ１　Ｅ２－ｂｏｘについては配列番号６および配列番号７に、Ｄｅｃ１　Ｅ－ｂｏｘについては配列番号８および配列番号９に示す。
　最後に、得られたＰＣＲ産物を、アガロースゲルを用いた電気泳動法によって検出した。図１は、実施例１に係るＣｈＩＰ　ａｓｓａｙにおけるアガロースゲル電気泳動の結果、ならびに、ＡＴＰ１Ｂ１およびＤｅｃ１のＥ－ｂｏｘを示す図である。図１に示すように、ＤＥＣ１およびＣＬＯＣＫは、ＡＴＰ１Ｂ１のプロモーター領域のＡＴＰ１Ｂ１　Ｅ１－ｂｏｘおよびＡＴＰ１Ｂ１　Ｅ２－ｂｏｘに直接結合することが示された。
　（実施例２）
　本実施例２では、ＤＥＣ１、およびＣＬＯＣＫを含む他の分子時計の関連因子による、ＡＴＰ１Ｂ１プロモーター領域の二箇所のＥ－ｂｏｘの転写活性への影響について詳細に説明する。ＣＬＯＣＫ等の他の分子時計、または概日リズムの関連因子の詳細については特許文献２を参照されたい。
　前述の実施例１においてＤＥＣ１およびＣＬＯＣＫがＡＴＰ１Ｂ１の二箇所のＥ－ｂｏｘに直接結合することが示された。そこで、ルシフェラーゼアッセイ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ａｓｓａｙ）によって、これらの二箇所のＥ－ｂｏｘが時計エレメントとして機能しているか否かを調べた。具体的には、ＡＴＰ１Ｂ１遺伝子上流のＥ－ｂｏｘ配列を含むレポーターをそれぞれ作成し、分子時計の促進因子であるＣＬＯＣＫ／ＢＭＡＬ１、ならびに抑制因子であるＤＥＣ１およびＣＲＹ１による転写活性を検討した。
　まず、ｈＡＴＰ１Ｂ１　Ｅ１－ｂｏｘと、６ｂｐのフランキング配列を３つ横につなげた配列（配列番号１０に示す）、および、ｈＡＴＰ１Ｂ１　Ｅ２－ｂｏｘと、６ｂｐのフランキング配列を３つ横につなげた配列（配列番号１１に示す）を含むＰＧＬ３－ＴＫを作製した。ｈＤｅｃ１　Ｅ－ｂｏｘと６ｂｐのフランキング配列を３つ横につなげた配列を含むＰＧＬ３－ＴＫ、ならびに、Ｃｌｏｃｋ、Ｂｍａｌ１、Ｄｅｃ１およびＣｒｙ１遺伝子の発現ベクターは、「ＤＥＣ１　ｍｏｄｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｃｉｒｃａｄｉａｎ　ｐｈａｓｅ　ｏｆ　ｃｌｏｃｋ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．」（Ｎａｋａｓｈｉｍａ　Ａ，Ｋａｗａｍｏｔｏ　Ｔ，Ｈｏｎｄａ　ＫＫ，Ｕｅｓｈｉｍａ　Ｔ，Ｉｗａｔａ　Ｔ，Ｎｏｓｈｉｒｏ　Ｍ，Ｆｕｊｉｍｏｔｏ　Ｋ，Ｋｕｂｏ　Ｈ，Ｈｏｎｍａ　Ｓ，Ｙｏｒｉｏｋａ　Ｎ，Ｋｏｈｎｏ　Ｎ，Ｋａｔｏ　Ｙ、Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．２８、４０８０－４０９２、２００８）に記載の方法と同様の方法を用いて作成した。
　トランスフェクションの２４時間前に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を２４ｗｅｌｌ　ｄｉｓｈ当たり３×１０４ｃｅｌｌｓにて播種した。その後、ルシフェラーゼレポータープラスミド（４ｎｇ　ｐｅｒ　ｗｅｌｌ）、マウスＣｌｏｃｋおよびマウスＢｍａｌ１の発現ベクター（７５ｎｇ　ｐｅｒ　ｗｅｌｌ）、Ｄｅｃ１もしくはＣｒｙ１発現ベクター（１０ｎｇ　ｐｅｒ　ｗｅｌｌ）、または、ｅｍｐｔｙベクター（１０ｎｇ　ｐｅｒ　ｗｅｌｌ（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）））をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションした。内標準として、ｐＲＬ－ＳＶ４０（０．１ｎｇ　ｐｅｒ　ｗｅｌｌ）を同時にトランスフェクションした（トランスフェクションに使用したＤＮＡは、トータル１６４．１ｎｇ　ｐｅｒ　ｗｅｌｌ）。
　４時間インキュベーションした後培地交換し、４８時間後にデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ活性を計測した。ルシフェラーゼ活性は内標準の活性で補正した。
　図２は、実施例２に係るルシフェラーゼアッセイによる相対的ルシフェラーゼ活性の結果を示す図である。図２に示すように、ＡＴＰ１Ｂ１のプロモーター領域にある二箇所のＥ－ｂｏｘ（ＡＴＰ１Ｂ１　Ｅ１－ｂｏｘおよびＡＴＰ１Ｂ１　Ｅ２－ｂｏｘ）の転写活性は、Ｃｌｏｃｋ＋Ｂｍａｌ１で上昇し、Ｄｅｃ１またはＣｒｙ１によって抑制されていた。すなわち、実施例１および実施例２の結果から、ＤＥＣ１およびＣＬＯＣＫはＡＴＰ１Ｂ１のプロモーター領域の二箇所のＥ－ｂｏｘに直接結合し、ＤＥＣ１は転写活性を抑制し、ＣＬＯＣＫは転写活性を促進するということが示された。
　（実施例３）
　本実施例３では、Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウトマウス（Ｄｅｃ１－／－）におけるＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡの発現量への影響について詳細に説明する。
　Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスおよび同胞の野生型マウスの胎児線維芽細胞は、１４．５日齢目において採取した。Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスは、「ＤＥＣ１　ｍｏｄｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｃｉｒｃａｄｉａｎ　ｐｈａｓｅ　ｏｆ　ｃｌｏｃｋ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．」（Ｎａｋａｓｈｉｍａ　Ａ，Ｋａｗａｍｏｔｏ　Ｔ，Ｈｏｎｄａ　ＫＫ，Ｕｅｓｈｉｍａ　Ｔ，Ｎｏｓｈｉｒｏ　Ｍ，Ｉｗａｔａ　Ｔ，Ｆｕｊｉｍｏｔｏ　Ｋ，Ｋｕｂｏ　Ｈ，Ｈｏｎｍａ　Ｓ，Ｙｏｒｉｏｋａ　Ｎ，Ｋｏｈｎｏ　Ｎ，Ｋａｔｏ　Ｙ、Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．２８、４０８０－４０９２、２００８およびＥｐｕｂ、Ａｐｒ．１４、２００８）に記載されている作製方法と同様の方法を用いて作製した。採取したそれぞれの胎児線維芽細胞の３継代目を使用し、コンフルエントになった時点で、それぞれのＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡを抽出した。Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの抽出にはＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。定量化ＲＴ－ＰＣＲにはＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７９００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｏｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。定量に使用したフォワードおよびリバースプライマーの塩基配列を配列番号１２および１３に示す。また、プローブには５’－６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＡＭ）－ＴＴＣＣＣＡＧＴ－６－ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ　（ＴＡＭＲＡ）－３’（Ｍｏｕｓｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｏｂｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ）を使用した。
　図３は、実施例３に係るＤｅｃ１遺伝子ノックアウトマウス胎児線維芽細胞のＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ発現レベルの結果を示す図である。同胞および同齢の野生型マウス胎児線維芽細胞のｍＲＮＡ発現レベル（ＷＴ）を１．０として、Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウトマウス胎児線維芽細胞のｍＲＮＡ発現レベル（Ｄｅｃ１ＫＯ）の相対量を示している。図３に示すように、Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウトマウス（Ｄｅｃ１－／－）線維芽細胞は、野生型マウス線維芽細胞よりもＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡの発現量が有意に高値であった。
　（実施例４）
　前述の実施例３の結果から、Ｄｅｃ１遺伝子を過剰発現することによって、ＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ発現レベルが減少することが示唆される。そこで、本実施例４では、Ｄｅｃ１遺伝子過剰発現細胞におけるＡＴＰ１Ｂ１の発現への影響について詳細に説明する。
　まず、ヒト大動脈平滑筋細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ　Ｂｉｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ　Ｉｎｃ．）を６ｗｅｌｌ　ｄｉｓｈに２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌにて播種し、２４時間後にアデノウイルスを用いてＤｅｃ１過剰発現を行った。コントロールにはＬａｃＺを過剰発現させたアデノウイルスを用いた（「ＤＥＣ１　ｍｏｄｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｃｉｒｃａｄｉａｎ　ｐｈａｓｅ　ｏｆ　ｃｌｏｃｋ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．」、Ｎａｋａｓｈｉｍａ　Ａ，Ｋａｗａｍｏｔｏ　Ｔ，Ｈｏｎｄａ　ＫＫ，Ｕｅｓｈｉｍａ　Ｔ，Ｉｗａｔａ　Ｔ，Ｎｏｓｈｉｒｏ　Ｍ，Ｆｕｊｉｍｏｔｏ　Ｋ，Ｋｕｂｏ　Ｈ，Ｈｏｎｍａ　Ｓ，Ｙｏｒｉｏｋａ　Ｎ，Ｋｏｈｎｏ　Ｎ，Ｋａｔｏ　Ｙ、Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．２８、４０８０－４０９２、２００８参照）。
　その後、培地交換を行い、２４時間後にＲＮＡを採取した。Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの抽出には、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。また、定量化ＰＣＲには、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７９００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｏｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。定量に使用したフォワードおよびリバースプライマーの塩基配列を配列番号１４および１５に示す。また、プローブには５’－６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＡＭ）－ＣＴＧＧＣＴＧＧ－６－ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＴＡＭＲＡ）－３’（Ｈｕｍａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｏｂｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ）を使用した。その結果、やはり、ＬａｃＺ過剰発現ヒト大動脈平滑筋細胞のＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ発現レベルと比較して、ＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ発現レベルは減少していた。
　図４は、実施例４に係るＤｅｃ１アデノウイルスのＭＯＩ依存性によるＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ発現レベルの結果を示す図である。ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：細胞１個に感染するウイルスの数）が０である時のＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡの発現レベルを１００とし、Ｄｅｃ１過剰発現ヒト大動脈平滑筋細胞のＭＯＩ依存性を示している。ＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ発現レベルは、図４に示すように、Ｄｅｃ１アデノウイルスのＭＯＩに依存し減少していた。
　（実施例５）
　本実施例５では、Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウトマウス（Ｄｅｃ１－／－）の腎臓における経時的なＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡの発現量（すなわち、Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ　ｍＲＮＡの発現量の示唆）について詳細に説明する。
　１２時間明および１２時間暗の明暗条件下で飼育したＤｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスおよび同胞かつ同齢の野生型マウスの腎臓を、６時間ごとにサンプリングした（ｎ＝３）。Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの抽出および定量化ＲＴ－ＰＣＲについては、実施例３において前述した方法と同様の方法を用いて行った。ｍＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡの定量に使用したフォワードおよびリバースプライマーの塩基配列、ならびにプローブについても同様である。
　図５は、実施例５に係る野生型マウスおよびＤｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスの腎臓でのＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ発現レベルの概日リズムの結果を示す図である。同胞、かつ同齢の野生型マウスの２４ＺＴ（Ｚｅｉｔｇｅｂｅｒ　ｔｉｍｅ：ツァイトゲーバー時刻、明暗サイクルの１周期を２４ＺＴとする）でのＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡの発現量を１として示している。
　さらに、免疫組織染色においても腎臓でのＡＴＰ１Ｂ１の概日リズムが見られるか否か、および発現量の変化が見られるか否かを調べた。まず、前述した条件と同条件において飼育し、サンプリングしたＤｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスおよび野生型マウスの腎臓を、４％パラホルムアルデヒドに４時間浸透させた。その後、パラフィン処理し、４μｍにスライスした。次に、切片をキシレンおよびアルコールを用いて脱パラフィン化した。免疫染色性を高めるため、０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０、Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ、ＵＳＡ）に浸し、電子レンジ（５００Ｗ）で５分間ずつ２回加熱した。
　加熱後ＰＢＳ（ｐＨ７．６）で洗浄し、１５分間０．３％のＨ２Ｏ２に浸した。その後、ＰＢＳで洗浄し、ｂｉｏｔｉｎ　ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｄａｋｏ　Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてビオチン活性をブロックした。さらに、ＰＢＳで洗浄した後、４０００倍に希釈した抗ＡＴＰ１Ｂ１ラビットポリクローナル抗体（Ａｖｉｖａ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．）を使用し、４℃で２４時間インキュベートした。その後、０．０７５％のブリッジ３５を含有したＰＢＳ溶液で３０分間洗浄した後、ａｖｉｄｉｎ－ｂｉｏｔｉｎ－ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてラビットＩｇＧを発色させた。図６は、実施例５に係る野生型マウスおよびＤｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスの腎臓でのＡＴＰ１Ｂ１免疫染色の概日リズムの結果を示す図である。
　図５に示すように、野生型マウスの腎臓では、ＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ（すなわち、Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ　ｍＲＮＡの発現量の示唆）の発現量は２４時間のリズム形成を示した。一方、Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスの腎臓では、２４時間のリズム形成は保たれていたが、ＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ（Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ　ｍＲＮＡ）の発現量は上昇していた。図６に示すように、免疫染色においても同様にＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ（Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ　ｍＲＮＡ）の発現量は日内変動を認め、ＤＥＣ１遺伝子ノックアウトマウスではＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ（Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ　ｍＲＮＡ）の発現量は上昇していた。
　（実施例６）
　血圧は、（心拍出数）×（末梢血管抵抗）で示される。そこで、本実施例６では、Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウトマウス（Ｄｅｃ１－／－）の大動脈および心臓における経時的なＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡの発現量（すなわち、Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ　ｍＲＮＡの発現量の示唆）について詳細に説明する。
　実験方法等については前述した実施例５と同様であるが、本実施例６ではマウスの大動脈および心臓をサンプリングした。図７は、実施例６に係る野生型マウスおよびＤｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスの大動脈でのＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ発現レベルの概日リズムの結果を示す図である。図７では、同胞、かつ同齢の野生型マウスの２４ＺＴでのＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡの発現量を１として示されている。図８は、実施例６に係る野生型マウスおよびＤｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスの大動脈でのＡＴＰ１Ｂ１免疫染色の概日リズムの結果を示す図である。このように、大動脈においても前述の実施例５の腎臓と類似したＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ、およびＡＴＰ１Ｂ１の免疫染色の経時的な日内変動が観察された。
　図９は、実施例６に係る野生型マウスおよびＤｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスの心臓でのＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡ発現レベルの概日リズムの結果を示す図である。図９では、同胞、かつ同齢の野生型マウスの２４ＺＴでのＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡの発現量を１として示されている。やはり、心臓においても前述の腎臓および大動脈と類似したＡＴＰ１Ｂ１　ｍＲＮＡの経時的な日内変動が観察された。
　（実施例７）
　本実施例７では、Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウトマウス（Ｄｅｃ１－／－）および同胞の野生型マウスの２４時間血圧測定について詳細に説明する。
　前述の実施例５および実施例６と同様の方法で飼育したＤｅｃ１遺伝子ノックアウトマウス、および、野生型マウスについて、マウス非観血的血圧測定装置ＢＰ－９８を用い、２時間毎に血圧（収縮期血圧および拡張期血圧）を測定した（いずれもｎ＝１０）。
　図１０は、実施例７に係る野生型マウスおよびＤｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスの収縮期血圧概日リズム結果を示す図である。図１１は、実施例７に係る野生型マウスおよびＤｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスの拡張期血圧概日リズム結果を示す図である。図１０および図１１に示すように、野生型マウスの２４時間の血圧は概日リズムを有し、夜間にピークを認めた。Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスでも、２４時間のリズム形成は保たれていたが、野生型マウスと比較し有意な血圧の低下を認めた。特に、Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスでは、マウスが就寝する日中に血圧の低下が大きかった。
　これらの実施例の結果から、ＤＥＣ１のＡＴＰ１Ｂ１の発現抑制、すなわちＮａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅの発現抑制機能が示された。また、Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスでの概日リズムを有する血圧低下も解明された。特に、就寝時（休息期）における過度な血圧低下が観察され、収縮期血圧、拡張期血圧および平均血圧のいずれもが顕著に低下することも示された。
　また、マウスだけでなく他の哺乳動物のヒト等においても、Ｄｅｃ１遺伝子に機能的な遺伝子変異を有する場合、低血圧または高血圧となることが充分に示唆される。例えば、ヒト低血圧症の場合、起床時や午前中のめまい、立ちくらみ、頭痛または全身倦怠感等の症状がでる。これに対し、低血圧治療薬（アメジウムメチル硫酸塩等）が処方される。ヒトにおいて早朝（休息期後半）に症状が出るということは、Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスの血圧が日中（休息期）に過度に低下することと一致する。つまり、Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスはヒト本態性低血圧と類似しており、当該Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスを利用することでヒト本態性低血圧の治療等に利用可能であることが示唆される。
　さらに、Ｄｅｃ１遺伝子およびＤｅｃ２遺伝子には異なる作用もあるが、Ｅ－ｂｏｘを仲介する時計遺伝子としての作用は共通であり、類似している点も多い（特許文献１および特許文献２参照）。従って、Ｄｅｃ２遺伝子ノックアウトマウスも血圧低下等が観察されることは、充分に予想できる。またドミナント活性型Ｄｅｃ２遺伝子変異のヒト家系では、睡眠時間が短く早朝に起床することから（「Ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　ＤＥＣ２　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｓｌｅｅｐ　ｌｅｎｇｔｈ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｓ．」、Ｈｅ　Ｙ，Ｊｏｎｅｓ　ＣＲ，Ｆｕｊｉｋｉ　Ｎ，Ｘｕ　Ｙ，Ｇｕｏ　Ｂ，Ｈｏｌｄｅｒ　ＪＬ　Ｊｒ，Ｒｏｓｓｎｅｒ　ＭＪ，Ｎｉｓｈｉｎｏ　Ｓ，Ｆｕ　ＹＨ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２００９　Ａｕｇ．１４、３２５（５９４２）、８６６－８７０参照）、Ｄｅｃ２遺伝子も血圧の概日リズム異常に関連があることが示唆される。これは、血圧は通常起床後上がるためである。
　さらに、本発明に係るＤＥＣ１またはＤＥＣ２単独の場合だけではなく、特許文献２に記載されているような、その他の時計関連因子（ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１またはＣＲＹ１等）と組み合わせ、血圧を調節する方法も可能であることも示唆される。これは、実施例２において、ＡＴＰ１Ｂ１のプロモーター領域にある二箇所のＥ－ｂｏｘの転写活性は、Ｃｌｏｃｋ＋Ｂｍａｌ１で上昇し、Ｄｅｃ１またはＣｒｙ１によって抑制されるという結果が示されているためである。特に、ＣＬＯＣＫについては、実施例１および実施例２において、ＡＴＰ１Ｂ１のプロモーター領域のＥ－ｂｏｘに直接結合し、その転写活性を促進することが新たに解明された。そのため、本発明に係るＤｅｃ１遺伝子改変非ヒト動物等と同様の新規な発明が期待される。
　本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
　本明細書の中で明示した論文および公開特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
　本出願は、２０１０年１０月２１日に出願された日本国特許出願２０１０－２３６８９１号に基づく。本明細書中に、日本国特許出願２０１０－２３６８９１号の、明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
　本発明者らは、ＤＥＣ１が、高血圧に関連するＮａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅの小型サブユニットのＮａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅβ１（ＡＴＰ１Ｂ１）の発現を抑制する転写因子であり、血圧制禦器官（心臓、血管および腎臓等）においてＡＴＰ１Ｂ１の発現を抑制することで血圧を上昇させることを解明した。さらに、Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウトマウスでは、野生型マウスと比較して、概日リズムを保った状態で特に休息期において血圧が低下する（低血圧となる）ことも解明した。
　そこで、本発明に係るＤｅｃ１遺伝子およびＤｅｃ２遺伝子改変非ヒト動物および細胞によれば、血圧調節物質の評価・スクリーニング、血圧調節条件の評価または血圧の調節に利用することができる。さらに、本態性低血圧および本態性高血圧の診断方法、治療方法、診断薬もしくは治療薬の開発、または、現在処方されている治療薬もしくは今後開発される治療薬の作用機序の解明にも繋がる。また、治療に影響する食事、生活習慣または環境の研究にも利用することができる。

Claims (18)

  1. 　Ｄｅｃ１遺伝子またはＤｅｃ２遺伝子に機能的な遺伝子改変を有し、かつＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加または減少していることを特徴とする、非ヒト動物。
  2. 　前記非ヒト動物は、低血圧または高血圧であることを特徴とする、請求項１に記載の非ヒト動物。
  3. 　前記非ヒト動物は、Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウト動物またはＤｅｃ２遺伝子ノックアウト動物であり、前記ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加していることを特徴とする、請求項１に記載の非ヒト動物。
  4. 　前記非ヒト動物は、Ｄｅｃ１遺伝子過剰発現動物またはＤｅｃ２遺伝子過剰発現動物であり、前記ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が減少していることを特徴とする、請求項１に記載の非ヒト動物。
  5. 　前記非ヒト動物は、マウスまたはラットであることを特徴とする、請求項１に記載の非ヒト動物。
  6. 　Ｄｅｃ１遺伝子またはＤｅｃ２遺伝子に機能的な遺伝子改変を有し、かつＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加または減少していることを特徴とする、細胞。
  7. 　前記細胞は、Ｄｅｃ１遺伝子ノックアウト細胞またはＤｅｃ２遺伝子ノックアウト細胞であり、前記ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加していることを特徴とする、請求項６に記載の細胞。
  8. 　前記細胞は、Ｄｅｃ１遺伝子過剰発現細胞またはＤｅｃ２遺伝子過剰発現細胞であり、前記ＡＴＰ１Ｂ１の発現量が減少していることを特徴とする、請求項６に記載の細胞。
  9. 　前記細胞は、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞、腎臓尿細管細胞または心筋細胞のいずれかであることを特徴とする、請求項６に記載の細胞。
  10. 　Ｄｅｃ１遺伝子またはＤｅｃ２遺伝子に機能的な遺伝子改変を有し、かつＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加または減少している非ヒト動物に、被験物質を投与する工程を含むことを特徴とする、血圧調節物質の評価方法。
  11. 　前記非ヒト動物の血圧を測定する工程を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の血圧調節物質の評価方法。
  12. 　Ｄｅｃ１遺伝子またはＤｅｃ２遺伝子に機能的な遺伝子改変を有し、かつＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加または減少している細胞に、被験物質を接触させる工程を含むことを特徴とする、血圧調節物質の評価方法。
  13. 　ＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする、請求項１０ないし１２のいずれか１項に記載の血圧調節物質の評価方法。
  14. 　野生型の非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、
    　前記被験物質の投与前と投与後の、前記野生型の非ヒト動物の、ＤＥＣ１またはＤＥＣ２の発現量およびＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定する工程と、
    　を含むことを特徴とする、血圧調節物質の評価方法。
  15. 　野生型の細胞に被験物質を接触させる工程と、
    　前記被験物質の接触前と接触後の、前記野生型の細胞の、ＤＥＣ１またはＤＥＣ２の発現量およびＡＴＰ１Ｂ１の発現量を測定する工程と、
    　を含むことを特徴とする、血圧調節物質の評価方法。
  16. 　野生型の非ヒト動物、または、Ｄｅｃ１遺伝子またはＤｅｃ２遺伝子に機能的な遺伝子改変を有し、かつＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加または減少している非ヒト動物、あるいは、野生型の細胞、または、Ｄｅｃ１遺伝子またはＤｅｃ２遺伝子に機能的な遺伝子改変を有し、かつＡＴＰ１Ｂ１の発現量が増加または減少している細胞を、被験条件下におく工程を含むことを特徴とする、血圧調節条件の評価方法。
  17. 　遺伝子改変、または野生型の非ヒト動物内において、ＤＥＣ１またはＤＥＣ２、ならびに、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、ＣＲＹ１およびその他の時計転写因子のうちの少なくとも一つによって、ＡＴＰ１Ｂ１遺伝子の転写活性を促進または抑制させる工程を含むことを特徴とする、血圧の調節方法。
  18. 　前記その他の時計転写因子は、ＣＲＹ２、ＰＥＲ１－３、ＮＰＡＳ２、ＢＭＡＬ２、ＲＯＲ　ａｌｐｈａ、ＲＯＲｂ　ｅｔａ、ＲＯＲ　ｇａｍｍａ、ＲＥＶ－ＥＲＢ　ａｌｐｈａもしくはＲＥＶ－ＥＲＢ　ｂｅｔａ、または、これらの組み合わせであることを特徴とする、請求項１７に記載の血圧の調節方法。
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