WO2012032497A1 - Nouveaux liposomes de vaccination génique - Google Patents

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WO2012032497A1
WO2012032497A1 PCT/IB2011/053956 IB2011053956W WO2012032497A1 WO 2012032497 A1 WO2012032497 A1 WO 2012032497A1 IB 2011053956 W IB2011053956 W IB 2011053956W WO 2012032497 A1 WO2012032497 A1 WO 2012032497A1
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WO
WIPO (PCT)
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variant
virus
dope
liposomes
vaccination
Prior art date
Application number
PCT/IB2011/053956
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English (en)
Inventor
Michael Mockey
Laurence Dedieu
Carolina Tafalla
Alberto Cuesta
Original Assignee
Centre De Cooperation Internationale En Recherche Agronomique Pour Le Developpement (Cirad)
Instituto Nacional De Investigacion Y Tecnologia Agraria Y Alimentaria (Inia)
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Filing date
Publication date
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    • C12N2800/95—Protection of vectors from inactivation by agents such as antibodies or enzymes, e.g. using polymers

Definitions

  • the present invention relates to novel liposomes useful for transfecting cells in vitro and in vivo, and in particular as gene vaccination carriers; these liposomes, associated with genetic material coding for an antigenic polypeptide of a pathogen, and encapsulated in a biodegradable and non-immunogenic gel, such as an alginate gel, are particularly suitable for oral vaccination of livestock, in particular, aquatic animals.
  • Gene (or genetic) vaccination is a vaccination based on DNA or "naked” RNA; it consists of administering to an animal or human organism some of the genetic material of the pathogen against which immunization is sought.
  • the genetic material corresponds to an expression vector comprising a DNA fragment (or the corresponding RNA sequence) coding for an antigenic protein capable of triggering a protective immune reaction.
  • the pathogen's DNA is then expressed in the nucleus of the cells of the host to be vaccinated; when it comes to RNA, it is expressed in the cytoplasm of said cells; there is antigen production; it is presented to the immune system and triggers a response.
  • the viral antigen causes a double immune response: humoral (production of antibodies capable, during an infection, to specifically recognize this antigen on the virus) and cellular (including the appearance of cytotoxic T lymphocytes (CTL) whose role is to destroy the cells infected by the virus).
  • humoral production of antibodies capable, during an infection, to specifically recognize this antigen on the virus
  • cellular including the appearance of cytotoxic T lymphocytes (CTL) whose role is to destroy the cells infected by the virus.
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • This technique has the advantage of being able to vaccinate against all infectious diseases.
  • DNA vaccines have produced convincing results for a large number of diseases, including influenza in primates, malaria and HIV in mice.
  • US Pat. Nos. 5,780,448 and 6,180,614 disclose gene vaccines adapted for the vaccination of fish consisting of DNA oligonucleotides encoding an antigenic polypeptide of a pathogen (virus, bacterium or parasite) and liposomes; these liposomes are, for example, constituted by neutral lipids such as DOPE (La-dioleoyl phosphatidylethanolamine, dioleoyloxyphosphatidylethanolamine or 1,2-dioleoylphosphatidylethanolamine) or cholesterol and a cationic lipid.
  • DOPE La-dioleoyl phosphatidylethanolamine, dioleoyloxyphosphatidylethanolamine or 1,2-dioleoylphosphatidylethanolamine
  • U.S. Patent No. 6,733,777 provides cationic liposomes suitable for delivery of compounds into cells in vitro or in vivo. These liposomes comprise a neutral lipid such as DOPE, cholesterol or dioleoylphosphatidylcholine (DPOC) and one or more cationic cytofectins of formula (I):
  • DOPE dioleoylphosphatidylcholine
  • DPOC dioleoylphosphatidylcholine
  • liposomes are especially suitable as a DNA support for transfecting cells in vivo.
  • DOGS spermine-5-carboxy-glycinediotade-cyclamide
  • DOPE cardiolipin with a weight ratio of 1: 1: 0.5
  • the aim of these authors is to carry out a structural study of lipoplexes made from such liposomes according to the nature of the nucleic acids associated with them; the ability of these lipoplexes to transfect cells is not tested (Biochimica & Biophysica Acta (2009) Vol.1790, No. 5, p.385-394).
  • DOGS spermine-5-carboxy-glycinediotade-cyclamide
  • DOPE DOPE and / or a variant of DOPE carrying at least one ligand for targeting dendritic cells
  • DOTAP DOTAP and / or a variant of DOTAP carrying at least one ligand for targeting dendritic cells
  • cardiolipin and / or a variant of cardiolipin carrying at least one ligand for targeting dendritic cells carrying at least one ligand for targeting dendritic cells.
  • ligand for the targeting of dendritic cells is meant compounds that bind to dendritic cell receptors such as, for example, biotin, CpG oligonucleotides, flagellin, complement proteins (especially C3, C5. ..), immunoglobulins or their crystallizable fraction (Fc) ...
  • the liposomes according to the invention are composed of DOPE and / or a variant of DOPE carrying at least one ligand for targeting dendritic cells, DOTAP and / or a variant of DOTAP carrying at least one ligand for targeting dendritic cells and cardiolipin and / or a cardiolipin variant carrying at least one ligand for targeting dendritic cells to the exclusion of any other compound.
  • These new liposomes are particularly useful as a support for genetic material.
  • DOPE is a neutral lipid of chemical structure:
  • the DOPE or DOPE variant content in the liposomes according to the invention is between 10 and 50% by weight relative to the total weight of liposomes.
  • DOTAP N- [1- (2,3-Dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium methylsulfate
  • N-[1- (2,3-Dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium methylsulfate is a cationic lipid of chemical structure:
  • the content of DOTAP or of variant DOTAP in the liposomes according to the invention is between 10 and 50% by weight relative to the total weight of liposomes.
  • Cardiolipin bisphosphatidyl glycerol
  • Cardiolipin is an anionic lipid that accounts for 18% of the mitochondrial inner membrane molecules and is responsible for the strong impermeability of the inner proton membrane.
  • the cardiolipin or cardiolipin varying content in the liposomes according to the invention is between 5 and 30% by weight relative to the total weight of liposomes.
  • the three lipids are present in a DOPE ratio and / or its variant: DOTAP and / or its variant: cardiolipin and / or its variant of 1: 1: 0.5 by weight .
  • the liposomes according to the invention are prepared according to the techniques known to those skilled in the art.
  • Such a technique may for example comprise the following steps: suspending each of the lipids in a polar solvent such as ethanol at a rate of 20 mg of lipids / ml;
  • mixture of neutral and cationic lipids in solution: forming a lipid film by evaporation of the solvent (s) by drying under vacuum (with, for example, a Speedvac® evaporator) and / or by heating under rotation (using, for example, as rotavap material) to 55-60 ° C on the night;
  • the extrusion of the suspension is carried out on a polycarbonate filter membrane (for example having pores of 100 nm in diameter) using a discontinuous extruder (for example: “LiposoFast” by Avanti Polar) or continuous high-pressure (for example: “Maximator HPE 12.0-100", from Dispex);
  • a discontinuous extruder for example: “LiposoFast” by Avanti Polar
  • continuous high-pressure for example: “Maximator HPE 12.0-100", from Dispex
  • aqueous isotonic buffer solutions such as MES buffer (2-morpholino ethanesulfonic acid monohydrate), MOPS buffer (N-morpholino-3-propanesulfonic acid), Tris buffer (trishydroxymethylaminomethane), etc. .. during this step.
  • MES buffer (2-morpholino ethanesulfonic acid monohydrate
  • MOPS buffer N-morpholino-3-propanesulfonic acid
  • Tris buffer trishydroxymethylaminomethane
  • liposomes are useful as a genetic material support for transfection of cells in vitro or in vivo.
  • liposomes according to the invention are advantageously associated with genetic material and allow the administration of said material to cells in vitro or in vivo.
  • nucleic acids synthetic or natural, single or double stranded, such as genomic DNA, cDNA, plasmids, oligonucleotides, RNA, in particular sense or antisense mRNA or RNAs. interfering.
  • liposomes are particularly effective in delivering genetic material into cells; that is to say transfect cells in vitro or in vivo, which involves introducing said genetic material into the cytoplasm and / or the nucleus and / or cellular organelles of the cells; they find a particular application as a support for gene vaccination.
  • the liposomes according to the invention are advantageously used as a genetic material support for gene vaccination, since the cytotoxic effect is limited.
  • the liposomes according to the invention are associated with genetic material coding for an antigenic polypeptide of a pathogen against which an individual is to be vaccinated. The expression by the cells of the individual of this antigenic polypeptide causes an immune reaction that will allow recognition of said pathogen by the immune system of said individual in case of subsequent infection by said pathogen.
  • the present invention relates to lipoplexes comprising a liposome according to the invention and genetic material allowing the expression of an antigenic polypeptide of a pathogen and leading to a vaccination by induction of an immune response against said pathogen.
  • Pathogens include viruses, bacteria, yeasts, fungi or parasites.
  • the genetic material encoding the antigenic polypeptide is in the form of an expression vector comprising an expression control sequence adapted to the individual to be vaccinated, and at least one nucleotide fragment coding for said antigenic polypeptide.
  • the expression vector is a plasmid into which a coding sequence such as plasmid pMCV1.4 (Ready Vector, Madrid, Spain, Cuesta and Tafalla, Vaccine, 2009, 27: 280-289) is shown.
  • the nucleotide fragment encoding the antigenic polypeptide is selected according to the pathogen against which immunization is desired.
  • the preparation of the expression vector is carried out according to the standard methods of those skilled in the art; by way of example and whatever the nucleotide fragment to clone in the expression vector, the latter may be prepared using the method described in Cuesta and Tafalla, Vaccine, 2009, 27: 280-289 which applies to the introduction of the viral haemorrhagic septicemia virus (VHSH) G gene or the method described in Cuesta et al., Vaccine, 28 (2010) 3291-3300, which applies to the introduction of the hematopoietic necrosis virus VP1 gene. infectious disease (IPNV).
  • VHSH viral haemorrhagic septicemia virus
  • IPNV infectious disease
  • lipoplexes according to the invention is particularly useful and effective for the large-scale vaccination of farm animals; indeed, this form of vaccine can in particular be administered orally, thereby avoiding injection which requires animal handling by a specialist and is traumatic for the animals.
  • Livestock means grazing animals such as cattle, sheep, goats, pigs, equines, camelids and deer; barnyard animals, such as rabbits and birds; aquatic animals, aquaculture including fish farming, shellfish farming and crustacean farming, and finally, pets.
  • the lipoplexes are encapsulated in a biodegradable and non-immunogenic gel such as an alginate gel; they are then of particular interest for the oral vaccination of aquatic animals because said gel avoids the dilution of the active ingredient in water.
  • a biodegradable and non-immunogenic gel such as an alginate gel
  • Aquatic animals are especially marine fish such as sea bass, bream, salmon, tuna, turbot etc., pond fish such as carp, pike, roach, sturgeon etc, and freshwater fish such as catfish, trout etc.
  • the antigenic peptides of pathogens useful for the vaccination of aquatic animals are:
  • the pathogens are viruses
  • the pathogens are bacteria
  • the outer membrane regulating proteins iron IROMP for iron-regulated outer membrane protein
  • Aeromonas salmonicida A proteins that cause boils Aeromonas salmonicida A proteins that cause boils
  • Edwardsiella eta6 and FliC antigens late IROMP for iron-regulated outer membrane protein
  • IROMP outer membrane regulating proteins iron
  • Aeromonas salmonicida A proteins that cause boils
  • Renibacterium salmoninarum p57 protein that causes bacterial kidney disease (BKD)
  • Edwardsiella eta6 and FliC antigens late IROMP for iron-regulated outer membrane protein
  • FliC antigens late the outer membrane regulating proteins iron
  • pathogens are parasites, for example: Ichthyophtirius surface antigens.
  • the preparation of the lipopolysis of gene vaccination according to the invention is carried out by mixing a solution of liposomes according to the invention with the expression vectors.
  • the complexation step is carried out by adding a solution at a neutral pH or close to neutral (6.5 ⁇ pH ⁇ 8) containing the expression vector of interest, at the suspension of empty liposomes previously diluted in an isotonic aqueous solution at acid pH (pH ⁇ 5).
  • the ratio used of the preferred variant DOPE / DOT AP / cardiolipin (1: 1: 0.5, m / m / m) is 25 ⁇ l of liposomes at 6.25 mg / ml for 20 ⁇ g of expression vector.
  • the lipoplexes according to the invention can be administered orally, by immersion of a solution comprising said lipoplexes for aquatic animals, or by the airways (nasal or pulmonary spray), or by intramuscular, intravenous or intradermal injection.
  • the administration by immersion or by mixing with the food granules makes it possible to deliver the lipoplexes without any stress for the animals.
  • the lipoplexes are encapsulated in a biodegradable and non-immunogenic gel such as an alginate gel, in order to form a galenic formulation for oral administration to livestock.
  • a biodegradable and non-immunogenic gel such as an alginate gel
  • Alginates are biodegradable and non-immunogenic polysaccharides obtained from a family of brown algae, laminariae; it is more particularly a polymer formed of two monomers bonded together: mannuronate or mannuronic acid and guluronate or guluronic acid.
  • Other biodegradable and non-immunogenic gels may be used, for example other polysaccharides with gelling properties such as, in particular, carrageenans (galactans).
  • an aqueous solution at neutral pH and free of divalent cations containing sodium alginate (low viscosity pharmaceutical grade alginate) at a concentration of between 2 and 10% is prepared; it is then mixed with the lipoplexes according to the invention.
  • the addition is in suspension, volume to volume for a solution of alginate at 3%.
  • the mixture is placed in a syringe with a needle having a diameter of between 0.10 and 0.40 mm and extruded dropwise into a solution of divalent cations (Ca ++ , Ba ++ , Mg ++ etc.) or trivalent (Al 3+ ) to allow gelation of the formulation.
  • the galenic formulations are thus composed of gelled spheres incorporating the vaccine liposomes; these spheres have a diameter of between 1 and 3 mm depending on the diameter of the needle used.
  • the biodegradable and non-immunogenic gel encapsulation has the advantage of protecting the vaccine liposomes, to obtain a more attractive globular formulation for the fish, to improve the adhesion of the formulations to the mucous membranes and to increase the half-life. life of the formulation.
  • this galenic formulation is particularly suitable for oral vaccination of farmed fish.
  • lipoplexes and galenic formulations according to the invention are of interest for their use as a medicament, in particular as a vaccine.
  • the present invention also relates to a lipoplex or a galenical formulation according to the invention for their use for the vaccination of farm animals against pathogens chosen from viruses such as rhabdoviruses such as viral haemorrhagic septicemia virus (VHSV), infectious haematopoietic necrosis virus (IHNV), infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), spring viremia virus of carp (SVC), herpesviruses such as catfish virus (CCV) ); parasites such as Ichthyophtirius; bacteria such as Aeromonas salmonicida that causes boils, Renibacterium salmoninarum, Edwardsiella tarda; yeasts and mushrooms.
  • viruses such as rhabdoviruses such as viral haemorrhagic septicemia virus (VHSV), infectious haematopoietic necrosis virus (IHNV), infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), spring viremia virus of carp (SVC), herpe
  • the present invention relates to a pharmaceutical formulation according to the invention for the oral vaccination of farmed fish; preferably, said use is particularly suitable for the oral vaccination of farmed fish against rhabdoviruses, in particular, against the viral haemorrhagic septicemia virus (VSHV).
  • VSHV viral haemorrhagic septicemia virus
  • the present invention also relates to a method for vaccinating farm animals comprising a step of administering lipoplexes or galenic formulations according to the invention.
  • Figures 1 and 2 are diagrammatic representations of the plasmids respectively pMCV144 and pcDNA3.1.
  • FIG. 3 diagrammatically represents the process used to prepare the FELIA liposomes according to Example 1.
  • Figure 4 is a histogram showing the expression, in various organs, of several key proteins of the immune response (Mx, IFN2, IFNy, NKEF, MHC I, MHC la, MHC II, MHC Ha, IL1 p, IgM and CD8 ); the bars represent the gene expression ratios between the vaccinated group and (pG-FELIA) and the control group (cFELIA).
  • FIG. 5 shows the detection by PCR of the expression of the VHSV G gene in the digestive tract of trout after oral immunization with the galenic formulations according to the invention, called pG-FELIA (F).
  • M is the molecular weight marker and N is the negative control.
  • Figure 6 is the measurement, by ELISA, of anti-G-VHSV antibodies in the serum of trout 1 (lm) and 2 months (2m) after oral delivery of control FELIA (cFELIA group, lipoplexes containing expression plasmids empty and then encapsulated in a gel) and FELIA containing the VHSV G gene (pG-FELIA).
  • the bars represent the optical densities measured for each trout in the control group (cFELIA) and the vaccinated group (pG-FELIA).
  • the positive control C + represents the results obtained with the serum of a fish that survived a VHSV infection.
  • Figures 7.1 to 7.10 represent the real-time PCR measurement of the expression of immune response genes (Mx, MHC, CD4, NKEF, IFNy, MHC II, CD8, IFN, IgM and IgT, respectively) in the system. digestive (Gut) and in the spleen (Spleen) trout at different times (7, 15, 30, 60 and 120 days) after immunization.
  • the bars represent the gene expression ratios between the vaccinated group and (pG-FELIA) and the control group (cFELIA). The data is calculated for pools of 4 animals.
  • Each of the two lipids DOTAP and DOPE is solubilized beforehand in ethanol at a rate of 20 mg of lipids / ml; they are then mixed in a 1: 1 ratio.
  • the lipid film obtained is redissolved by adding a solution of cardiolipin in ethanol (at a rate of 20 mg of lipids / ml) in order to obtain a final lipid mass ratio
  • the lipoplexes are then prepared by simple injection of the plasmid solution containing the VHSH G gene (pMCV1.4-G), or empty plasmid (pMCV1.4 not containing the G gene) as a control, on the liposomes previously diluted in a solution of NaCl (150 mM, pH 5.4).
  • the ratio used for DOPE / DOTAP / cardiolipin liposomes (1: 1: 0.5, m / m / m) is 25 ⁇ l of liposomes at 6.25 mg / ml for 20 ⁇ g of DNA expression vector, ie a DNA / lipid mass ratio of 20 / 156.25, or 0.128.
  • the lipoplexes are then mixed with sodium alginate (sodium of alicic acid, 3%).
  • the solution obtained undergoes a spherification step; for this, the mixture is placed in a syringe mounted with a small diameter needle (27G, that is to say, having an outer diameter of about 0.40 mm and a light of about 0.20 mm) and extruded dropwise into a solution of divalent cations (CaCl 2 , 100 mM).
  • This step allows the gelation of drops alginate beads containing liposomes having a diameter of between 1 and 2 mm and called FELIA (Fish Egg-like Liposomes In Alginate).
  • DOPE / DOTAP / cardiolipin (1: 1: 0.5 m / m / m)
  • DOPE / DOTAP / cardiolipin liposomes (1: 1: 0.5 m / m / m)
  • Example 2 In Vivo Study of the Efficacy Evaluation: Induction of a Humoral and Cellular Immune Response by Administration of a Vaccine Formulation According to the Invention Orally in Trout
  • the RNA samples were treated with DNAse I to remove any traces of genomic DNA that could interfere with the polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • 1 microgram (g) of RNA was transformed into complementary DNA (cDNA) using Invitrogen's Superscript III reverse transcriptase reagent.
  • the samples of 1 ⁇ g of RNA were mixed with 1 ⁇ l of oligo (dT) 12-18 (0.5 ⁇ g / ml) and 1 ⁇ l of dinucleotide triphosphate (dNTP) at 10 millimolar (mM). and incubated at 65 ° C.
  • dT oligo
  • dNTP dinucleotide triphosphate
  • the serum was also collected for the analysis of the anti-G antibody response by the Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) technique.
  • ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
  • VHSV G protein was analyzed in the digestive tract of trout by PCR reaction as described in Cuesta & Tafalla, 2008.
  • Figure 4 shows the expression of several key proteins in the immune response such as gamma interferons (IFNy) and IFN 2 ; Mx protein (type I interferon-induced), class I and II molecules of the major histocompatibility complex (MHC I, also known as MHC I, and MHC II, also called MHC II), NKEF factor, interleukin 1 beta (IL- ⁇ ), IgM antibodies (IgM) and CD8 surface marker.
  • IFNy gamma interferons
  • IFN 2 gamma interferons
  • Mx protein type I interferon-induced
  • class I and II molecules of the major histocompatibility complex MHC I, also known as MHC I, and MHC II, also called MHC II
  • NKEF factor interleukin 1 beta
  • IgM antibodies IgM
  • CD8 surface marker CD8 surface marker
  • Figure 5 shows the detection by PCR of the gene encoding the G protein in the digestive tract of trout after immunization with pG-FELIA (F).
  • the results highlight the expression of this G gene in the digestive system of trout cells 4 weeks after vaccination. This expression is still detected 8 weeks after immunization with pG-FELIA (F).
  • Figure 6 shows the anti-GVHSV antibody response data measured by ELISA 1 (lm) and 2 months (2m) after vaccination with pG-FELIA. These data confirm the expression of the G gene observed in FIG. 4 and demonstrate the consequent induction of a specific antibody response of the VHSV G gene, 2 months after the oral administration of the pG-FELIA particles.
  • the immune response was analyzed at different times by real-time PCR in the spleen (Spleen) and the digestive system (Gut). In addition to the previously described immune markers, the CD4 lymphocyte marker and total immunoglobulin (IgT) measurement were added.
  • FIGS. 7.1 to 7.10 show that the administration of the plasmid carrying the VHSV G gene within the FELIAs is capable of inducing, at the same time, a local (at the level of the digestive tract) and systemic immune response (implementation evidence at the level of the spleen).
  • a local at the level of the digestive tract
  • systemic immune response implantation evidence at the level of the spleen.
  • an anti-GVHSV antibody response is actually detected in the serum of the fish (see Table I). Positive time (days)
  • This response is maximal at 30 days with 4 fish out of 5 presenting a seroconversion. It is still detectable in some fish, 120 days post-vaccination.

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Abstract

La présente invention se rapporte à des liposomes composés de DOPE et/ou d'un variant du DOPE porteur d'au moins un ligand pour le ciblage de cellules dendritiques, de DOTAP et/ou d'un variant du DOTAP porteur d'au moins un ligand pour le ciblage de cellules dendritiques et de cardiolipine et/ou d'un variant de la caridiolipine porteur d'au moins un ligand pour le ciblage de cellules dendritiques; à leur utilisation comme support de matériel génétique pour la préparation lipoplexes. Les lipoplexes selon l'invention sont avantageux par leur cytotoxicité limitée in vivo; ils présentent donc un intérêt particulier pour la vaccination génique; sous forme encapsulée dans un gel biodégradable et non immunogène tel qu'un gel d'alginate, ils sont particulièrement adaptés, en particulier, pour la vaccination par voie orale d'animaux aquatiques.

Description

NOUVEAUX LIPOSOMES DE VACCINATION GENIQUE
La présente invention se rapporte à de nouveaux liposomes utiles pour transfecter des cellules in vitro et in vivo, et en particulier comme supports de vaccination génique ; ces liposomes, associés à du matériel génétique codant pour un polypeptide antigénique d'un agent pathogène, et encapsulés dans un gel biodégradable et non immunogène, tel qu'un gel d'alginate, sont particulièrement adaptés à la vaccination par la voie orale d'animaux d'élevage, en particulier, d'animaux aquatiques.
La vaccination génique (ou génétique) est une vaccination à base d'ADN ou d'ARN "nu" ; elle consiste à administrer à un organisme animal ou humain une partie du matériel génétique de l'agent pathogène contre lequel on recherche l'immunisation.
Plus précisément, le matériel génétique correspond à un vecteur d'expression comprenant un fragment d'ADN (ou à la séquence ARN correspondante) codant pour une protéine antigénique capable de déclencher une réaction immunitaire protectrice. L'ADN du pathogène s'exprime alors dans le noyau des cellules de l'hôte à vacciner ; lorsqu'il s'agit d'ARN, il s'exprime dans le cytoplasme desdites cellules ; il y a production d'antigène ; celui-ci est présenté au système immunitaire et déclenche une réponse.
Lorsque l'agent pathogène est un virus, l'antigène viral provoque une double réponse immunitaire : humorale (production d'anticorps capables, lors d'une infection, de reconnaître spécifiquement cet antigène sur le virus) et cellulaire (incluant l'apparition de lymphocytes T cyto toxiques (CTL) dont le rôle est de détruire les cellules infectées par le virus).
Cette technique présente l'avantage de permettre de vacciner contre toutes les maladies infectieuses.
Chez l'animal, les vaccins à ADN ont donné des résultats probants pour un grand nombre de maladies, notamment la grippe chez les primates, le paludisme, le VIH chez la souris.
Les Brevets Américains US 5,780,448 et US 6,180,614 décrivent des vaccins géniques adaptés pour la vaccination de poissons constitués d'oligonucléotides d'ADN codant pour un polypeptide antigénique d'un agent pathogène (virus, bactérie ou parasite) et de liposomes ; ces liposomes sont, par exemple, constitués de lipides neutres tels que du DOPE (L-a-dioleoyl phosphatidyléthanolamine, 1,2- dioléoyloxyphosphatidyléthanolamine ou 1,2-dioleoylphosphatidyléthanolamine) ou du cholestérol et d'un lipide cationique.
Le Brevet Américain US 6,733,777 propose des liposomes cationiques adaptés à la délivrance de composés dans des cellules in vitro ou in vivo. Ces liposomes comprennent un lipide neutre tel que du DOPE, du cholestérol ou de la dioléoylphosphatidylcholine (DPOC) et une ou plusieurs cytofectines cationiques de formule (I) :
Figure imgf000003_0001
Ces liposomes sont notamment adaptés comme support d'ADN pour transfecter des cellules in vivo.
Romoren et al. ont cependant décrit que certains de ces liposomes, en particulier, les liposomes composés de DOPE et de DOTAP à un ratio massique 1 : 1, utilisées pour la vaccination génique de poissons pouvaient présenter un effet toxique sur les poissons en les asphyxiant par fixation aux branchies (J. Controlled Release (2002) 85:203-213).
Dans des travaux ultérieurs, Romoren et al. ont également décrit la préparation de plusieurs liposomes cationiques pour l'administration de vaccin à des poissons ; ces liposomes sont composés de DOPE : DOTAP avec un ratio pondéral de 1 :1, DOPE : DOTAP avec un ratio pondéral 3: 1, DSPC (distearoyl phosphatidylcholine) ou DSPC : DSPG (DSPG, distearoyl phosphatidylglycerol) avec un ratio pondéral de 9:1 (Biochimica & Biophysica Acta. (2005) Vol.1717, n°l , p.50-57) ; là encore, ces travaux indiquent que l'association de DOPE et de DOTAP est toxique.
Enfin, Thierry et al. décrivent la préparation de liposomes anioniques composés de DOGS (spermine-5-carboxy-glycinediotade- cyclamide) : DOPE : cardiolipine avec un ratio pondéral de 1 : 1 :0,5 ; le but de ces auteurs est de réaliser une étude structurelle des lipoplexes fabriqués à partir de tels liposomes en fonction de la nature des acides nucléiques qui leur sont associés ; la capacité de ces lipoplexes à transfecter des cellules n'est pas testée (Biochimica & Biophysica Acta. (2009) Vol.1790, n°5, p.385-394). Il demeure donc le besoin de préparer des supports de vaccination génique conduisant à une réaction immunitaire efficace tout en préservant une bonne innocuité de la formulation.
C'est ce à quoi est parvenue la Demanderesse en mettant au point de nouveaux liposomes composés :
- de DOPE et/ou d'un variant du DOPE porteur d'au moins un ligand pour le ciblage de cellules dendritiques,
- de DOTAP et/ou d'un variant du DOTAP porteur d'au moins un ligand pour le ciblage de cellules dendritiques et
- de cardiolipine et/ou d'un variant de la cardiolipine porteur d'au moins un ligand pour le ciblage de cellules dendritiques.
Par ligand pour le ciblage de cellules dendritiques, on entend des composés qui se fixent sur les récepteurs de cellules dendritiques tels que, par exemple, la biotine, des oligonucléotides de type CpG, la flagelline, les protéines du complément (notamment C3, C5...), des immunoglobulines ou leur fraction cristallisable (Fc) ...
Selon une variante préférée, les liposomes selon l'invention sont composés du DOPE et/ou d'un variant du DOPE porteur d'au moins un ligand pour le ciblage de cellules dendritiques, de DOTAP et/ou d'un variant du DOTAP porteur d'au moins un ligand pour le ciblage de cellules dendritiques et de cardiolipine et/ou d'un variant de la cardiolipine porteur d'au moins un ligand pour le ciblage de cellules dendritiques à l'exclusion de tout autre composé.
Ces nouveaux liposomes sont particulièrement utiles comme support de matériel génétique.
Le DOPE est un lipide neutre de structure chimique :
Figure imgf000004_0001
La teneur en DOPE ou en variant du DOPE dans les liposomes selon l'invention est comprise entre 10 et 50% en poids par rapport au poids total de liposomes.
Le DOTAP (N-[l-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-triméthylammonium méthylsulfate) est un lipide cationique de structure chimique :
Figure imgf000005_0001
La teneur en DOTAP ou en variant du DOTAP dans les liposomes selon l'invention est comprise entre 10 et 50% en poids par rapport au poids total de liposomes.
La cardiolipine (glycérol bisphosphatidyle) est un lipide anionique qui représente 18% des molécules de la membrane interne de la mitochondrie et qui est res onsable de la forte im erméabilité de la membrane interne aux protons.
Figure imgf000005_0002
La teneur en cardiolipine ou en variant de la cardiolipine dans les liposomes selon l'invention est comprise entre 5 et 30% en poids par rapport au poids total de liposomes.
Selon une variante préférée de l'invention, les trois lipides sont présents dans un ratio DOPE et/ou de son variant : DOTAP et/ou de son variant : cardiolipine et/ou de son variant de 1 :1 :0,5 en poids.
Les liposomes selon l'invention sont préparés selon les techniques connues de l'homme du métier.
Une telle technique peut par exemple comprendre les étapes suivantes : mise en suspension de chacun des lipides dans un solvant polaire tel que l'éthanol à raison de 20 mg de lipides/ml ;
mélange des lipides neutre et cationique (DOPE et DOTAP) en solution : formation d'un film lipidique par évaporation du ou des solvants par séchage sous vide d'air (avec, par exemple, un évaporateur Speedvac®) et/ou par chauffage sous rotation (en utilisant, par exemple, comme matériel le rotavap) à 55-60°C sur la nuit ;
dilution du film lipidique par ajout du lipide anionique (cardiolipine) solubilisé dans l'éthanol ;
formation des liposomes par ajout d'eau ;
optionnellement, l'extrusion de la suspension est réalisée sur membrane-filtre de polycarbonate (présentant par exemple des pores de 100 nm de diamètre) à l'aide d'un extrudeur discontinu (par exemple : « LiposoFast » d'Avanti Polar) ou continu haute-pression (par exemple : « Maximator HPE 12.0-100 », de Dispex) ;
dilution des liposomes dans une solution à pH acide (par exemple à pH~5) lors de l'étape de formation des complexes ; il est possible d'utiliser d'autres solutions aqueuses isotoniques tampons comme le tampon MES (acide 2-morpholino éthanesulfonique monohydraté), le tampon MOPS (acide N-morpholino-3 -propane sulfonique), le tampon Tris (trishydroxyméthylaminométhane), etc... lors de cette étape.
Ces liposomes sont utiles comme support de matériel génétique pour la transfection de cellules in vitro ou in vivo.
Par support de matériel génétique, il est entendu que les liposomes selon l'invention sont avantageusement associés à du matériel génétique et permettent l'administration dudit matériel à des cellules in vitro ou in vivo.
Par matériel génétique, on entend des acides nucléiques, synthétiques ou naturels, simple ou double brins, tels que l'ADN génomique, l'ADNc, des plasmides, des oligonucléotides, l'ARN, notamment l'ARNm sens ou antisens ou des ARN interférents.
Ces liposomes sont particulièrement efficaces pour délivrer du matériel génétique dans les cellules ; c'est-à-dire transfecter des cellules in vitro ou in vivo, ce qui consiste à introduire ledit matériel génétique dans le cytoplasme et/ou le noyau et/ou les organelles cellulaires des cellules ; ils trouvent une application particulière comme support de vaccination génique.
Ainsi les liposomes selon l'invention sont avantageusement utilisés comme support de matériel génétique pour vaccination génique, car l'effet cyto toxique est limité. Lorsqu'ils sont utilisés à des fins vaccinales, les liposomes selon l'invention sont associés à du matériel génétique codant pour un polypeptide antigénique d'un agent pathogène contre lequel on veut vacciner un individu. L'expression par les cellules de l'individu de ce polypeptide antigénique provoque une réaction immunitaire qui permettra la reconnaissance dudit agent pathogène par le système immunitaire dudit individu en cas d'infection ultérieure par ledit agent pathogène.
Selon un autre de ses objets, la présente invention se rapporte à des lipoplexes comprenant un liposome selon l'invention et du matériel génétique permettant l'expression d'un polypeptide antigénique d'un agent pathogène et conduisant à une vaccination par l'induction d'une réponse immunitaire contre ledit agent pathogène.
Les agents pathogènes sont notamment des virus, des bactéries, des levures, des champignons ou des parasites.
Le matériel génétique codant pour le polypeptide antigénique se présente sous la forme d'un vecteur d'expression comprenant une séquence de contrôle de l'expression adaptée à l'individu à vacciner, et au moins un fragment nucléotidique codant pour ledit polypeptide antigénique.
En particulier, le vecteur d'expression est un plasmide dans lequel est introduit une séquence codante tel que le plasmide pMCV1.4 (Ready Vector, Madrid, Espagne; Cuesta and Tafalla, Vaccine, 2009, 27 : 280-289.) représenté à la Figure 1 et de séquence nucléotidique SEQ. ID. N°l ou le plasmide pcDNA3.1 d'Invitrogen représenté à la Figure 2 et de séquence nucléotidique SEQ. ID. N°2.
Le fragment nucléotidique codant pour le polypeptide antigénique est choisi selon l'agent pathogène contre lequel on veut obtenir une immunisation.
La préparation du vecteur d'expression est réalisée selon les méthodes classiques de l'homme du métier ; à titre d'exemple et quel que soit le fragment nucléotidique à cloner dans le vecteur d'expression, ce dernier peut être préparé en utilisant la méthode décrite dans Cuesta and Tafalla, Vaccine, 2009, 27: 280-289 qui s'applique à l'introduction du gène G du virus de la septicémie hémorragique virale (VHSH) ou la méthode décrite dans Cuesta et al, Vaccine, 28 (2010) 3291-3300 qui s'applique à l'introduction du gène VP1 du virus de nécrose hématopoïétique infectieuse (IPNV).
L'utilisation des lipoplexes selon l'invention s'avère particulièrement utile et efficace pour la vaccination à grande échelle d'animaux d'élevage ; en effet, cette forme de vaccin peut notamment être administrée par la voie orale, évitant ainsi l'injection qui demande une manipulation des animaux par un spécialiste et qui est traumatisante pour les animaux.
On entend par animaux d'élevage, les animaux de pacage tels que les bovins, les ovins, les caprins, les porcins, les équidés, les camélidés et les cervidés ; les animaux de basse-cour, tels que les lapins et les oiseaux ; les animaux aquatiques, l'aquaculture comprenant la pisciculture, la conchyliculture et l'élevage de crustacés et enfin, les animaux de compagnie.
Selon un mode réalisation particulier de l'invention, les lipoplexes sont encapsulés dans un gel biodégradable et non immunogène tel qu'un gel d'alginate ; ils présentent alors un intérêt particulier pour la vaccination orale d'animaux aquatiques car ledit gel évite la dilution du principe actif dans l'eau. Les animaux aquatiques sont en particulier des poissons marins tels que bar, dorade, saumon, thon, turbot etc., des poissons d'étang tels que carpe, brochet, gardon, esturgeon etc, et des poissons d'eau douce tels que silure, truite etc.
Les peptides antigéniques d'agents pathogènes utilisables pour la vaccination d'animaux aquatiques sont :
lorsque les agents pathogènes sont des virus, par exemple : les glycoprotéines (G) du virus de la septicémie hémorragique virale (VHSV) ; du virus de la nécrose hématopoïétique infectieuse (IHNV) ; les protéines structurales VP1 ou VP2 du virus de la nécrose pancréatique infectieuse (IPNV) ; la protéine G du virus de la virémie printanière de la carpe (SVC) et des glycoprotéines ou des protéines associées aux membranes, téguments ou capsides du virus du poisson chat (CCV) ;
lorsque les agents pathogènes sont des bactéries, par exemple : les protéines membranaires externes de régulation du fer (IROMP pour iron-regulated outer membrane protein) ; les protéines A de Aeromonas salmonicida qui provoque des furoncles ; la protéine p57 de Renibacterium salmoninarum qui provoque la maladie bactérienne du rein (BKD), les antigènes Eta6 et FliC de Edwardsiella tarda ;
lorsque les agents pathogènes sont des parasites, par exemple : les antigènes de surface d'Ichthyophtirius.
La préparation du lipoplexe de vaccination génique selon l'invention est réalisée par mélange d'une solution de liposomes selon l'invention avec les vecteurs d'expression. L'étape de complexation se fait par ajout d'une solution à un pH neutre ou proche de la neutralité (6,5 < pH < 8) contenant le vecteur d'expression d'intérêt, à la suspension de liposomes vides préalablement dilués dans une solution aqueuse isotonique à pH acide (pH~5). Le ratio utilisé de la variante préférée DOPE/DOT AP/cardiolipine (1 :1 :0,5, m/m/m) est de 25 μΐ de liposomes à 6,25 mg/ml pour 20 μg de vecteur d'expression d'ADN, soit un ratio massique ADN/lipides de 20/156,25, soit 0,128 mais ce ratio massique ADN/lipide peut plus largement être compris entre 0,01 et 0,5.
Les lipoplexes selon l'invention peuvent être administrés par la voie orale, par immersion d'une solution comprenant lesdits lipoplexes pour les animaux aquatiques, ou par les voies aériennes (spray nasal ou pulmonaire), ou encore par injection intramusculaire, intraveineuse ou intradermique. Dans le cas des poisons, l'administration par immersion ou par mélange avec les granulés alimentaires permet de délivrer les lipoplexes sans aucun stress pour les animaux.
L'homme du métier adaptera la quantité de lipoplexes à administrer selon l'animal visé et l'agent pathogène.
Comme indiqué plus tôt, selon une forme particulière de l'invention, les lipoplexes sont encapsulés dans un gel biodégradable et non immunogène tel qu'un gel d'alginate, afin de former une formulation galénique en vue de leur administration par voie orale à des animaux d'élevage.
Les alginates sont des polysaccharides biodégradables et non- immuno gènes obtenus à partir d'une famille d'algues brunes, les laminaires ; il s'agit plus particulièrement d'un polymère formé de deux monomères liés ensembles : le mannuronate ou acide mannuronique et le guluronate ou acide guluronique. D'autres gels biodégradables et non immunogènes peuvent être utilisés, il s'agit par exemple d'autres polysaccharides aux propriétés gélifiantes tels que, notamment les carraghénanes (galactanes).
Pour préparer les formulations galéniques selon l'invention, une solution aqueuse au pH neutre et dépourvue de cations divalents contenant de l'alginate de sodium (alginate de grade pharmaceutique à faible viscosité) à une concentration comprise entre 2 et 10% est préparée ; elle est ensuite mélangée aux lipoplexes selon l'invention. L'ajout se fait en suspension, volume à volume pour une solution d'alginate à 3%.
Le mélange est placé dans une seringue avec une aiguille d'un diamètre compris entre 0, 10 et 0,40 mm et est extradé goutte-à-goutte dans une solution de cations divalents (Ca++, Ba++, Mg++ etc) ou trivalent (Al3+) afin de permettre la gélification de la formulation. Les formulations galéniques sont donc composées de sphères gélifiées incorporant les liposomes vaccinaux ; ces sphères ont un diamètre compris entre 1 à 3 mm selon le diamètre de l'aiguille utilisée.
L'encapsulation à base de gel biodégradable et non immunogène présente l'avantage de protéger les liposomes vaccinaux, d'obtenir une formulation globulaire plus attractive pour les poissons, d'améliorer l'adhésion des formulations aux muqueuses et d'augmenter la demi-vie de la formulation.
Comme l'illustre l'exemple 2, cette formulation galénique s'avère particulièrement adaptée pour la vaccination par voie orale de poissons d'élevage.
Ainsi les lipoplexes et les formulations galéniques selon l'invention présentent un intérêt pour leur utilisation en tant que médicament, en particulier, en tant que vaccin.
La présente invention se rapporte également à un lipoplexe ou à une formulation galénique selon l'invention pour leur utilisation pour la vaccination d'animaux d'élevage contre des agents pathogènes choisis parmi les virus comme les rhabdovirus tels que le virus de la septicémie hémorragique virale (VHSV), le virus de la nécrose hématopoïétique infectieuse (IHNV), le virus de la nécrose pancréatique infectieuse (IPNV), le virus de la virémie printanière de la carpe (SVC), les herpesvirus tels que le virus du poisson chat (CCV) ; les parasites tels que les Ichthyophtirius ; les bactéries comme Aeromonas salmonicida qui provoque des furoncles, Renibacterium salmoninarum, Edwardsiella tarda ; les levures et les champignons. De façon préférée, la présente invention se rapporte à une formulation galénique selon l'invention pour la vaccination orale de poissons d'élevage ; de préférence, ladite utilisation est particulièrement adaptée à la vaccination orale de poissons d'élevage contre les rhabdovirus, en particulier, contre le virus de la septicémie hémorragique virale (VSHV).
La présente invention se rapporte encore à une méthode de vaccination d'animaux d'élevage comprenant une étape d'administration des lipoplexes ou des formulations galéniques selon l'invention.
Figures
Les Figures 1 et 2 sont des représentations schématiques des plasmides respectivement pMCVl .4 et pcDNA3.1.
La Figure 3 représente schématiquement le procédé mis en œuvre pour préparer les liposomes FELIA selon l'exemple 1. La Figure 4 est un histogramme représentant l'expression, dans divers organes, de plusieurs protéines clés de la réponse immunitaire (Mx, IFN2, IFNy, NKEF, CMH I, CMH la, CMH II, CMH Ha, ILl p, IgM et CD8) ; les barres représentent les ratios d'expression génique entre le groupe vacciné et (pG-FELIA) et le groupe contrôle (cFELIA).
La Figure 5 représente la détection par PCR de l'expression du gène G du VHSV au niveau du tube digestif des truites après immunisation orale par les formulations galéniques selon l'invention, dénommées pG-FELIA (F). M représente le marqueur de poids moléculaire et N, le contrôle négatif.
La Figure 6 est la mesure, par ELISA, des anticorps anti-G-VHSV dans le sérum des truites 1 (lm) et 2 mois (2m) après délivrance orale de FELIA de contrôle (groupe cFELIA, lipoplexes contenant des plasmides d'expression vides puis encapsulé dans un gel) et de FELIA contenant le gène G du VHSV (pG-FELIA). Les barres représentent les densités optiques mesurées pour chaque truite du groupe contrôle (cFELIA) et du groupe vaccinés (pG-FELIA). Le contrôle positif C+ représente les résultats obtenus avec le sérum d'un poisson ayant survécu à une infection par le VHSV.
Les Figures 7.1 à 7.10 représentent la mesure par PCR en temps réel de l'expression de gènes de la réponse immunitaire (respectivement Mx, CMH I, CD4, NKEF, IFNy, CMH II, CD8, IFN, IgM et IgT) dans le système digestif (Gut) et dans la rate (Spleen) des truites à différentes temps (7, 15, 30, 60 et 120 jours) après immunisation. Les barres représentent les ratios d'expression génique entre le groupe vacciné et (pG-FELIA) et le groupe contrôle (cFELIA). Les données sont calculées pour des pools de 4 animaux.
L'invention est maintenant décrite plus en détail au regard des exemples qui suivent. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemple 1 - Procédé de préparation des liposomes selon l'invention
1. Préparation des liposomes
Chacun des deux lipides DOTAP et DOPE est préalablement solubilisé dans l'éthanol à raison de 20 mg de lipides/ml; ils sont ensuite mélangés dans un ratio 1 :1.
Après une étape d'évaporation du solvant, le film lipidique obtenu est redissout par ajout d'une solution de cardiolipine dans de l'éthanol (à raison de 20 mg de lipides/ml) afin d'obtenir un ratio massique lipidique final DOPE:DOTAP:cardiolipine de 1 : 1 :0,5.
2. Préparation des lipoplexes (liposome et matériel génétique)
Les lipoplexes sont ensuite préparés par simple injection de la solution plasmidique contenant le gène G du VHSH (pMCV1.4-G), ou de plasmide vide (pMCV1.4 ne contenant pas le gène G) comme contrôle, sur les liposomes préalablement dilués dans une solution de NaCl (150 mM, pH 5,4). Le ratio utilisé pour les liposomes DOPE/DOTAP/cardiolipine (1 :1 :0,5, m/m/m) est de 25 μΐ de liposomes à 6,25 mg/ml pour 20 μg de vecteur d'expression ADN, soit un ratio massique ADN/lipides de 20/156,25, soit 0,128.
3. Préparation de la formulation vaccinale (lipoplexe encapsulé dans un gel d'alginate)
Les lipoplexes sont alors mélangés à de l'alginate de sodium (sodium d'acide al inique, 3%). La solution obtenue subit une étape de sphérification ; pour cela, le mélange est placé dans une seringue montée d'une aiguille de faible diamètre (27G, c'est-à- dire, présentant un diamètre externe d'environ 0,40 mm et une lumière de d'environ 0,20 mm) et extradé goutte-à-goutte dans une solution de cations divalents (CaCl2, 100 mM).
Cette étape permet la gélification des gouttes en billes d'alginate contenant les liposomes ayant un diamètre compris entre 1 et 2 mm et dénommées FELIA (Fish Egg-like Liposomes In Alginate).
La mise en œuvre de ce procédé est schématisée ci-dessous et à la Figure
3.
Mélange des lipides
Solution DOPE / DOTAP (1 : 1 m/m)
Evaporation
Film lipidique
Solution DOPE / DOTAP (1 : 1 m/m)
Dissolution à l'éthanol
Ajout de cardiolipine
Solution DOPE / DOTAP / cardiolipine (1 :1 :0.5 m/m/m) Injection éthanolique
Injection d'une solution de NaCI 150 mM (pH 5.2) sur la
solution
DOPE / DOTAP / cardiolipine (1 : 1 :0.5 m/m/m)
Formation spontanée de liposomes de type SUV
V
Formation de lipoplexes
Injection de la solution d'acides nucléiques (ADN) sur les
liposomes DOPE / DOTAP / cardiolipine (1 :1 :0.5 m/m/m)
V
Mélange lipoplexes / alginate
Mélange lipoplexes / alginate 3% volume/volume
V
Formation des FELIA
Extrusion goutte à goutte et gélification en CaCI2
Exemple 2 - étude in vivo de l'évaluation de l'efficacité : induction d'une réponse immunitaire humorale et cellulaire par administration d'une formulation vaccinale selon l'invention par voie orale chez les truites
A) Description du matériel et des méthodes
L'expérience a été conduite avec des truites arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) de 12 à 15 cm (22-40g). Chaque groupe était composé de 1 1 truites. Ces animaux ont été nourris en une fois avec un aliment du commerce mélangé soit avec des FELIA vides comme contrôle (cFELIA, sans le plasmide d'expression génique), soit avec des FELIA (pG-FELIA) contenant le plasmide d'expression du gène G du VHSV. Compte tenu de la quantité de nourriture ingérée par chaque poisson et de la concentration en plasmide de chaque particule de FELIA, la quantité de plasmides ingérée est estimée à 10 μg de plasmides. Apres 1 à 2 mois d'alimentation normale, les truites ont été soumises à différentes analyses comme décrit ci-après.
1. Plusieurs types de tissus ont été prélevés pour étudier la réponse immunitaire des truites contre le VHSV. Les prélèvements concernaient le tube digestif, les reins, la rate et le sang.
L'ARN total a été extrait en utilisant le Trizol (Invitrogen) selon les conditions du fournisseur. Les échantillons d'ARN ont été traités par de la DNAse I pour éliminer toutes traces d'ADN génomique qui pourraient interférer avec la réaction de PCR (Polymerase chain reaction). Pour chaque échantillon, 1 microgramme ^g) d'ARN a été transformé en ADN complémentaire (ADNc) grâce au réactif Superscript III reverse transcriptase de Invitrogen. Dans ce but, les échantillons de 1 μg d'ARN ont été mélangés avec 1 μΐ d'oligo (dT) 12-18 (0,5 μg/ml) et 1 μΐ de dinucléotides tripphosphate (dNTP) à 10 millimolaire (mM) et incubés à 65°C. Apres 5 minutes, 4 μΐ du tampon « 5x first strand buffer », 1 μΐ de dithiotréitol (DTT) à 0,1 molaire (M) et 1 μΐ du réactif « Superscript III reverse transcriptase » ont été ajoutés, mélangés et, le tout incubé pendant 1 heure à 50°C. La réaction a été stoppée par chauffage à 70°C pendant 15 minutes. L'ADNc ainsi obtenu a été dilué au dixième (1/10) dans de l'eau et conservé à moins 20°C.
Les niveaux d'expression de différents gènes clés de la réponse immunitaire ont ensuite été étudiés par PCR en temps réel comme décrit précédemment (Cuesta and Tafalla, 2008). Les mesures ont été effectuées sur des pools de 4 animaux. Les résultats sont exprimés par le ratio entre les données obtenus pour les animaux contrôle (cFELIA) et ceux ayant reçus les pG-FELIA.
2. Le sérum a également été récolté pour l'analyse de la réponse anticorps anti-G par la technique ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
Dans ce but, le sang a été prélevé au niveau de la veine caudale de 7 truites pour chaque groupe. Apres coagulation à température ambiante pendant 1 heure puis incubation 1 nuit à 4°C, le sérum a été récolté. Le protocole ELISA a été adapté de celui décrit par Johansson et al. {Johansson T, Einer-Jensen K, Batts W, Ahrens P, Bjorkblom C, Kurath G, Bjorklund H, Lorenzen N. Genetic and serological typing of European infections haematopoietic necrosis virus (IHNV) isolâtes. Dis Aquat Organ. 2009, 86(3):213-21).
3. L'expression de la protéine G du VHSV a été analysée au niveau du tube digestif des truites par réaction de PCR comme décrit dans Cuesta & Tafalla, 2008.
B) Résultats obtenus
La Figure 4 montre l'expression de plusieurs protéines clés dans la réponse immunitaire telles que les interférons gamma (IFNy) et IFN2 ; la protéine Mx (induite par les interférons de type I), les molécules de classe I et II du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH I, aussi dénommée MHC I, et CMH II, aussi dénommée MHC II), le facteur NKEF, l'interleukine 1 beta (IL-Ι β), les anticorps de type IgM (IgM) et le marqueur de surface CD 8.
Les résultats démontrent que l'immunisation par le gène G du VHSV induit une forte transcription, 1) au niveau du tube digestif, de la molécule Mx et des anticorps IgM ; 2) dans la rate, des molécules CMH-I, CMH-II et du marqueur CD8 et 3) au niveau des reins, de Mx, IFN-γ, NKEF and MHC-II. Ces résultats prouvent que la vaccination des truites par les FELIA contenant le gène G du VHSV stimule une réponse immunitaire cellulaire et moléculaire.
La Figure 5 montre la détection par PCR du gène codant pour la protéine G au niveau du tube digestif des truites après immunisation par les pG-FELIA (F). Les résultats mettent en évidence l'expression de ce gène G dans les cellules du système digestif des truites des 4 semaines après la vaccination. Cette expression est toujours détectée 8 semaines après immunisation par les pG-FELIA (F).
La Figure 6 présente les données de la réponse anticorps anti-GVHSV mesurées par ELISA 1 (lm) et 2 mois (2m) après vaccination par les pG-FELIA. Ces données confirment l'expression du gène G observée dans la figure 4 et démontrent l'induction consécutive d'une réponse anticorps spécifique du gène G du VHSV, 2 mois après l'administration par voie orale des particules de pG-FELIA.
Une dernière expérience a été réalisée avec des poissons plus petits (5-7 cm, 4-10 g). Dans ce cas, les FELIA ont été mixés avec les granulés alimentaires pour pouvoir délivrer environ 5 μg de plasmide pMCV1.4-G par poisson. Le groupe contrôle a reçu une même dose de FELIA contenant le plasmide vide.
La réponse immunitaire a été analysée à différents temps par PCR en temps réel dans la rate (Spleen) et le système digestif (Gut). En plus des marqueurs immunitaires décrits précédemment, le marqueur lymphocytaire CD4 et la mesure des immunoglobulines totales (IgT) ont été ajoutés.
Les résultats des Figures 7.1 à 7.10 montrent que l'administration du plasmide portant le gène G du VHSV au sein des FELIA est capable d'induire, à la fois, une réponse immunitaire locale (au niveau du tube digestif) et systémique (mise en évidence au niveau de la rate). Comme précédemment, une réponse anticorps anti-GVHSV est effectivement détectée dans le sérum des poissons (voir le Tableau I). Temps (jours) Positives
7 1/5
15 3/5
30 4/5
60 3/5
120 3/5
Tableau I : Etude cinétique de la réponse anticorps anti-G-VHSV
Cette réponse est maximale à 30 jours avec 4 poissons sur 5 présentant une séroconversion. Elle est toujours détectable chez certains poissons, 120 jours postvaccination.
Cette expérience démontre que la vaccination des truites avec 5 μg de plasmide G-VHSV est suffisante pour stimuler une réponse immunitaire cellulaire et humorale, spécifique du VHSV.

Claims

REVENDICATIONS
1. Liposome composé :
- de DOPE et/ou d'un variant du DOPE porteur d'au moins un ligand pour le ciblage de cellules dendritiques choisi parmi la biotine, les oligonucléotides de type CpG, la flagelline, les protéines du complément, les immunoglobulines ou leur fraction cristallisable,
- de DOTAP et/ou d'un variant du DOTAP porteur d'au moins un ligand pour le ciblage de cellules dendritiques choisi parmi la biotine, les oligonucléotides de type CpG, la flagelline, les protéines du complément, les immunoglobulines ou leur fraction cristallisable et
- de cardiolipine et/ou d'un variant de la cardiolipine porteur d'au moins un ligand pour le ciblage de cellules dendritiques choisi parmi la biotine, les oligonucléotides de type CpG, la flagelline, les protéines du complément, les immunoglobulines ou leur fraction cristallisable.
2. Liposome selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend entre 10 et 50% de DOPE et/ou de son variant, entre 10 et 50% de DOTAP et/ou de son variant et entre 5 et 30% de cardiolipine et/ou de son variant en poids par rapport au poids total de liposomes.
3. Liposome selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que lesdits lipides sont présents dans un ratio DOPE et/ou de son variant : DOTAP et/ou de son variant : cardiolipine et/ou de son variant de 1 : 1 :0,5 en poids.
4. Utilisation d'un liposome selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 comme support de matériel génétique pour la transfection de cellules in vitro ou in vivo.
5. Utilisation selon la revendication 4 comme support de matériel génétique de vaccination et de thérapie génique.
6. Lipoplexe de vaccination génique comprenant un liposome selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 associé à du matériel biologique codant pour un polypeptide antigénique d'un agent pathogène.
7. Lipoplexe selon la revendication 6, caractérisé en ce que le matériel biologique est un plasmide dans lequel un fragment d'acide nucléique codant pour ledit polypeptide antigénique est cloné.
8. Lipoplexe selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6 pour une utilisation comme vaccin.
9. Formulation galénique caractérisée en ce qu'elle comprend des lipoplexes selon la revendication 6 ou 7 encapsulés dans un gel biodégradable et non immunogène.
10. Formulation galénique selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit gel biodégradable et non immunogène est un gel d'alginate.
1 1. Formulation galénique selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que ledit lipoplexe comprend, à titre de matériel génétique, un plasmide comprenant un fragment d'acide nucléique codant pour la protéine G du virus de la septicémie hémorragique.
12. Formulation galénique selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 pour son utilisation en tant que médicament.
13. Formulation galénique selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 pour son utilisation pour la vaccination d'animaux d'élevage.
14. Formulation galénique pour son utilisation selon la revendication 13 pour la vaccination de poissons d'élevage contre les rhabdovirus tels que le virus de la septicémie hémorragique virale (VHSV), le virus de la nécrose hématopoïétique infectieuse (IHNV), le virus de la nécrose pancréatique infectieuse (IPNV), le virus de la virémie printanière de la carpe (SVC), les herpesvirus tels que le virus du poisson chat (CCV) ; les parasites tels que les Ichthyophtirius ; les bactéries comme Aeromonas salmonicida qui provoque des furoncles, Renibacterium salmoninarum, Edwardsiella tarda ; les levures et les champignons.
15. Formulation galénique pour son utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que ledit rhabdovirus est le virus de la septicémie hémorragique virale (VHSV).
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