WO2012029855A1 - 血液凝固調節物質のスクリーニング方法 - Google Patents

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WO2012029855A1
WO2012029855A1 PCT/JP2011/069780 JP2011069780W WO2012029855A1 WO 2012029855 A1 WO2012029855 A1 WO 2012029855A1 JP 2011069780 W JP2011069780 W JP 2011069780W WO 2012029855 A1 WO2012029855 A1 WO 2012029855A1
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WO
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tmem16f
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blood coagulation
cells
cell
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PCT/JP2011/069780
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重一 長田
鈴木　淳
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国立大学法人京都大学
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/22—Haematology
    • G01N2800/222—Platelet disorders

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a blood coagulation regulating substance, a composition for regulating blood coagulation, and a method for regulating blood coagulation targeting TMEM16F (transmembrane protein 16F). Furthermore, the present invention relates to a diagnostic method and diagnostic composition for Scott syndrome.
  • Non-patent Document 1 Choline-containing phospholipids (phosphatidylcholine [PC] and sphingomyelin [SM]) are basically located in the outer leaf, while anionic phospholipids and primary amine-containing phospholipids (phosphatidylserine [PS], phosphatidylethanol) Amine [PE], phosphoinositide [PIP], and phosphatidic acid ⁇ [PA]) are restricted to the cytoplasmic endoderm.
  • PC phosphatidylcholine
  • SM sphingomyelin
  • Non-patent Document 1 The asymmetry of phospholipid has been suggested in many cell functions (Non-patent Document 1).
  • the asymmetric distribution of phospholipids allows for tight packing of membrane lipids and appears to reduce membrane permeability to solutes.
  • Controlled disruption of asymmetric phospholipid distribution, particularly PS exposure at the cell surface is important in various systems.
  • platelets when activated by collagen or thrombin, they expose PS on their surface.
  • the exposed PS provides a catalytic surface for the complex of tenase and prothrombinase and induces clotting factor activation (Non-Patent Document 2).
  • Cells undergoing apoptotic cell death also expose PS, and the exposed PS functions as an “eat me” signal for phagocytes (Non-Patent Documents 3 and 4).
  • lipid transporters flippase, flippase, and scramble.
  • the flippase is also called an ATP-dependent aminophospholipid translocase, and transports aminophospholipid from the extracellular leaf to the inside of the cell (Non-patent Documents 1 and 3).
  • Type 4 P-type ATPase P4-ATPase
  • Floppase is a transporter that moves a wide range of lipids from the cytoplasm to the extracellular lobe in an ATP-dependent manner.
  • ABC ATP binding cassette
  • Non-Patent Documents 1 and 3 Two types of scrambling are envisaged. One functions constitutively in the endoplasmic reticulum and transports newly synthesized phospholipids from the cytoplasm to the inner lobe. The other is located in the cell membrane and is inactive when the cell is quiescent, but activated when intracellular Ca 2+ increases. Exposure of the activated PS on platelets from the need for Ca 2+, Ca 2+ dependent scrambling race is assumed. A family of proteins having this activity (phospholipid scrambled, PLSCR) has been isolated and characterized (Non-Patent Documents 9 and 10). However, there is controversy over whether the PLSCR protein actually provides endogenous cell membrane phospholipid scrambling activity, and recently there has been controversy (Non-Patent Documents 11-14).
  • TMEM16F Transmembrane protein 16F
  • SCR ⁇ scramble brace ⁇
  • the present invention provides the following: A method for screening a blood coagulation regulator, comprising the following steps: (1) contacting a TMEM16F-expressing cell with a candidate substance for a blood coagulation regulator, and (2) selecting a candidate substance that changes the exposure of phosphatidylserine on the surface of the cell,
  • a candidate substance that increases the exposure of phosphatidylserine is selected as a blood coagulation promoting substance
  • a candidate substance that decreases the exposure of phosphatidylserine is selected as a blood coagulation inhibitor.
  • the present invention also provides the following: A method for screening a blood coagulation regulator, comprising the following steps: (1) contacting a cell having a gene encoding TMEM16F with a candidate substance for a blood coagulation regulating substance, and (2) selecting a candidate substance that changes the expression of TMEM16F in the cell,
  • a candidate substance that increases the expression of TMEM16F is selected as a blood coagulation promoting substance
  • a candidate substance that decreases the expression of TMEM16F is selected as a blood coagulation inhibitor.
  • the present invention also provides a composition for promoting blood coagulation containing a substance that enhances the function of TMEM16F as an active ingredient, and a composition for inhibiting blood coagulation containing a substance that suppresses the function of TMEM16F as an active ingredient To do.
  • the present invention also inhibits blood coagulation, comprising administering to a subject a method that promotes blood coagulation, comprising administering a substance that enhances the function of TMEM16F to the subject, and a substance that inhibits the function of TMEM16F. Method.
  • the present invention also provides the following: A method for screening a substance that regulates the function of TMEM16F, which comprises the following steps: (1) contacting a TMEM16F-expressing cell with a candidate substance for a substance that regulates the function of TMEM16F, and (2) selecting a candidate substance that changes the exposure of phosphatidylserine on the surface of the cell,
  • a candidate substance that increases the exposure of phosphatidylserine is selected as a substance that enhances the function of TMEM16F
  • a candidate substance that decreases the exposure of phosphatidylserine is selected as a substance that suppresses the function of TMEM16F.
  • the present invention also provides the following: A method for screening a substance that regulates the function of TMEM16F, which comprises the following steps: (1) contacting a cell having a gene encoding TMEM16F with a candidate substance for a substance that regulates the function of TMEM16F; (2) selecting a candidate substance that changes the expression of TMEM16F in the cell;
  • a candidate substance that increases the expression of TMEM16F is selected as a substance that enhances the function of TMEM16F
  • a candidate substance that decreases the expression of TMEM16F is selected as a substance that suppresses the function of TMEM16F.
  • the present invention also provides a method for examining a subject's predisposition to Scott syndrome, comprising examining whether the subject has a mutation in a gene encoding TMEM16F.
  • the present invention also provides a diagnostic composition for Scott syndrome comprising an oligonucleotide that specifically hybridizes to the gene used as a probe or primer for detecting a mutation in the gene encoding TMEM16F.
  • the present invention also provides a diagnostic composition for Scott syndrome comprising an antibody that specifically recognizes TMEM16F.
  • the present invention makes it possible to screen for blood coagulation-regulating substances targeting TMEM16F.
  • the present invention makes it possible to provide a blood coagulation promoter and a blood coagulation inhibitor based on a novel mechanism.
  • Ba / F3 expressing Flag-tagged wild-type moth (WT) SCR ⁇ and mutant SCR ⁇ analyzed by Western blotting with anti-Flag. Arrows indicate SCR ⁇ monomers and multimers.
  • WT wild-type moth
  • c Human 293T cells expressing SCR ⁇ -mRFP observed with a fluorescent microscope. Scale bar: 10 ⁇ m.
  • d Ba / F3 transformed with blue vector, wild-type SCR ⁇ expression vector, or mutant SCR ⁇ expression vector and stained with annexin V (with or without pretreatment with BAPTA-AM).
  • e Ba / F3 transformed with vector or wild type SCR ⁇ pre-incubated with Annexin V and mixed with A23187. Fluorescence was monitored.
  • Ba / F3 expressing vector, wild-type SCR ⁇ , or D409G mutant SCR ⁇ (with or without pretreatment with BAPTA-AM), incubated with biotin-labeled Ro09-0198 and then stained with APC streptavidin b, Ba / F3 transformed with vector or SCR ⁇ preincubated with biotin-Ro09-0198 and APC streptavidin. A23187 was added and fluorescence was monitored.
  • Ba / F3 expressing vector or mutant SCR ⁇ incubated with 0.5 ⁇ M NBD-PC (c) or NBD-SM (e) in c and e, Ca 2+ containing HBSS at room temperature.
  • samples were diluted with chilled fatty acid-free BSA-containing buffer and analyzed by flow cytometry.
  • d or f vector or wild type SCR ⁇ expressing Ba / F3 preincubated with 0.1 ⁇ M NBD-PC (d) or NBD-SM (f) at 4 ° C.
  • A23187 was added and the incorporated NBD phospholipid was analyzed as described above at room temperature.
  • the y-axis is the fluorescence intensity observed by FACS analysis, and is expressed in arbitrary units. Experiments were performed at least three times independently.
  • cf the proportion of NBD phospholipids that could not be extracted by BSA at the indicated time was measured in triplicate and plotted with SD.
  • SCR ⁇ for Ca 2+ -dependent phospholipid scrambling.
  • a Ba / F3 transformants expressing shRNA for SCR ⁇ (shSCR) or scrambled shRNA (shCon) were established. SCR ⁇ mRNA is quantified by real-time PCR, normalized to ⁇ -actin mRNA and shown as relative expression. Ba / F3 expressing shSCR or scrambled shRNA, preincubated with b and c, Cy5-Annexin V (b) or biotin-Ro09-0198 and APC streptavidin (c) in Annexin V binding buffer. Cell fluorescence was monitored after addition of 0.5 ⁇ M A23187.
  • b RT-PCR for exons 1-12 and 11-20 of SCR ⁇ mRNA using RNA from cells of Scott patients and their parents.
  • the size of the marker DNA is shown on the left.
  • c Junction of exon 13 and intron 12 of SCR ⁇ gene sequenced from 3 'side.
  • the “CT” complementary to the “AG” at the consensus splice acceptor site is underlined. Arrows indicate mutations.
  • d RT-PCR using primers on exon 12 and exon 16 of SCR ⁇ . Arrows indicate wild type and exon 13 deficient fragments.
  • the cells are analyzed by flow cytometry using FACSAria and the staining profile is shown (colored portion). The staining operation is performed without MFG-E8, and the staining profile is shown in white.
  • NBD derivatives of phosphatidic acid (PA), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylserine (PS), and sphingomyelin (SM) were chromatographed in parallel, with their chromatogram positions to the right. Show. Effect of SCR ⁇ knockdown on Ca 2+ -dependent PS exposure.
  • a pRS shRNA vector for SCR ⁇ was introduced into Ba / F3 cells. Of the Ba / F3 stable transformed clones with reduced SCR ⁇ mRNA levels, 5 clones (shSCR # 1-5) were selected and examined. As a control, Ba / F3 transformed cells (shCon) established by a pRS shRNA vector having an invalid scrambled sequence were also analyzed.
  • SCR ⁇ mRNA levels in Ba / F3 transformed clones are measured by real-time PCR and shown as a ratio to levels in control Ba / F3 (shCon).
  • Ba / F3 transformed cells (shCon and shSCR # 1-5) were treated with 1.0 ⁇ M A23187 at 37 ° C. for 15 minutes, stained with Cy5-labeled annexin V, and analyzed by flow cytometry. In addition, the transformant was stained with annexin V without A23187 treatment, and the staining profile is shown in white. Sequence of exon 12-exon 16 of human TMEM16F chromosomal gene. CDNA sequence of human TMEM16F.
  • the start codon (ATG), stop codon (TAA), exon 6 (nucleotide numbers 649-762), 11 (nucleotide numbers 1001-1323), and 13 (nucleotide numbers 1402-1627) are bold and underlined.
  • Amino acid sequence of human TMEM16F Mutant TMEM16F cDNA sequence found in a patient with Scott syndrome. By exon 13 being skipped, the sequence of exon 14 is combined from nucleotide 1402. In this sequence, there is a TAG stop codon at 43 bases downstream (nucleotide numbers 1444-1446), and translation is completed.
  • Amino acid sequence of mutant TMEM16F found in a patient with Scott syndrome. The amino acid newly added in exon 14 because it was spliced from exon 12 to exon 14 is shown in bold and underlined.
  • TMEM16F transmembrane protein 16F
  • 8-transmembrane protein is a phospholipid scramblase involved in blood coagulation. Therefore, the present invention provides a screening method for a blood coagulation regulating substance targeting TMEM16F.
  • the “blood coagulation regulating substance” of the present invention includes a blood coagulation promoting substance and a blood coagulation inhibiting substance.
  • blood coagulation refers to a series of molecular actions in which platelets or platelets adhere to vascular endothelial cells, or blood cells adhere to a blood vessel wall to form a blood clot together with a clotting factor.
  • promoting blood coagulation means promoting the blood coagulation and promoting hemostasis
  • “inhibiting blood coagulation” means inhibiting the blood coagulation at any stage. .
  • Candidate substances for blood coagulation regulating substances may be either naturally occurring substances or synthesized substances such as microorganisms, plant or animal cell extracts or culture supernatants, synthetic low molecular weight compounds, nucleic acids, proteins. , Peptides, antibodies and the like.
  • the candidate substance may be in the form of a library such as a synthetic low-molecular compound library, a synthetic peptide library, or an antibody library.
  • TMEM16F-expressing cells and “cells having a gene encoding TMEM16F” in the present invention include platelets, megakaryocyte cells, and megakaryocyte-derived cell lines derived from various organisms such as humans, mice, rats, rabbits, and the like. Including various cell lines and cells into which a gene encoding TMEM16F has been introduced and expressed. B cell lines such as human Namalwa cells and mouse Ba / F3 cells can also be used.
  • the screening method of the present invention is performed by examining changes in the enzyme activity of TMEM16F. Since TMEM16F has a function as a scramble that exposes phosphatidylserine (PS) to the cell surface, changes in the enzyme activity of TMEM16F can be examined by changes in the exposure of PS on the surface of TMEM16F-expressing cells. Since PS exposure in platelets activates platelets and induces blood clotting, candidate substances that increase PS exposure are selected as procoagulants, and candidate substances that decrease PS exposure are as blood clotting inhibitors. Selected.
  • PS phosphatidylserine
  • PS exposure can be examined by binding of a substance having a property of binding to PS, for example, Annexin V or MFG-E8 (also called lactadherin) to PS on the cell surface.
  • a substance having a property of binding to PS for example, Annexin V or MFG-E8 (also called lactadherin)
  • a TMEM16F-expressing cell is treated with a candidate substance, incubated with annexin V labeled with fluorescence or the like, and the amount of annexin V bound to the cell surface may be examined.
  • the candidate substance that increases the binding of Annexin V compared to the control is selected as a blood coagulation promoting substance
  • the candidate substance that decreases the selected substance is selected as a blood coagulation inhibitor.
  • PS exposure can also be examined by the induction of a blood clotting reaction.
  • Methods for examining blood clotting reactions are well known. For example, cells treated with a calcium ionophore that treats TMEM16F-expressing cells with a candidate substance and further allows Ca 2+ to flow into the cells (after or simultaneously with the candidate substance treatment) (Factor Xa, Factor Va, prothrombin) and the presence of thrombin is examined. Alternatively, it may be further mixed with fibrinogen to examine the production of fibrin.
  • the screening method of the present invention is performed by examining whether a candidate substance changes the expression of TMEM16F.
  • a candidate substance that increases the expression of TMEM16F is selected as a blood coagulation promoting substance, and a candidate substance that decreases the expression of TMEM16F is selected as a blood coagulation inhibitor.
  • candidate substances for blood coagulation regulating substances in this embodiment include substances that act on regulatory sequences such as promoters and enhancers that regulate the expression of TMEM16F, and antisense oligonucleotides prepared based on the sequences of genes encoding TMEM16F ( DNA or RNA), siRNA, shRNA, miRNA, and ribozyme.
  • the method for examining the expression of TMEM16F is not particularly limited.
  • protein expression may be examined by Western blotting, ELISA, etc.
  • mRNA expression may be examined by Northern blotting, RT-PCR, real-time PCR, etc.
  • the present invention also provides a composition for regulating blood coagulation containing a substance that regulates the function of TMEM16F as an active ingredient, and a substance that regulates the function of TMEM16F.
  • a method of regulating blood coagulation comprising:
  • “substances that regulate the function of TMEM16F” include “substances that enhance the function of TMEM16F” and “substances that inhibit the function of TMEM16F”. “Enhance / suppress the function of TMEM16F” means to promote / suppress the biochemical function or biological function of TMEM16F as a phospholipid scramble in cells or organisms, and this includes the enzyme of TMEM16F. This includes promoting / suppressing activity and increasing / decreasing expression of TMEM16F. “Increased / decreased expression of TMEM16F” includes increased / decreased expression of mRNA from the gene encoding TMEM16F and increased / decreased expression of TMEM16F protein.
  • examples of the “substance that promotes the function of TMEM16F” include wild-type TMEM16F protein.
  • examples of the “substance that suppresses the function of TMEM16F” include anti-TMEM16F antibodies that suppress the functions of antisense oligonucleotides, siRNA, shRNA, miRNA, and TMEM16F that suppress the expression of TMEM16F.
  • composition for promoting blood coagulation can be used to stop bleeding due to vascular injury or the like, and also treats abnormal diseases for blood coagulation such as hemophilia, von Willebrand disease, disseminated intravascular coagulation syndrome, etc. Can also be used.
  • the “composition for inhibiting blood coagulation” of the present invention is a thromboembolism (for example, venous thrombosis, myocardium, etc.) that moves to a site other than the site where the thrombus is formed due to blood vessel damage or the like. Infarction, cerebral embolism, etc.).
  • composition for inhibiting blood coagulation of the present invention can be used for promoting blood circulation and preventing congestion by inhibiting abnormal blood coagulation. Furthermore, since excessive blood coagulation and thrombus formation induce arteriosclerosis and infarction, the “blood coagulation inhibiting composition” of the present invention can also be used for the prevention of arteriosclerosis and infarction.
  • the present invention also provides a screening method for substances that regulate the function of TMEM16F.
  • This screening method may be performed as described in “1.1. Screening Method for Blood Coagulation Regulator”.
  • TMEM16F is a causative gene for Scott syndrome, which is a hemorrhagic disease caused by impaired PS migration to the platelet surface. Therefore, the present invention provides a method for diagnosing Scott syndrome by examining mutations in the gene encoding TMEM16F.
  • the “gene encoding TMEM16F” in this specification includes not only the coding sequence of TMEM16F but also regulatory sequences such as a promoter that regulates the expression of TMEM16F.
  • the “gene encoding TMEM16F” includes both exons and introns.
  • a “mutation of a gene encoding TMEM16F” includes any mutation (for example, deletion, substitution, addition and / or insertion of one or several bases) that inactivates the enzymatic activity of TMEM16F in a cell or organism. included.
  • Such mutations include, for example, deletion or substitution, addition and / or insertion of one or several amino acid residues, deletion of exons due to abnormal splicing of mRNA, frameshift during translation of mRNA, etc. Cause mutation.
  • Examples of such mutations include the mutations described herein, Castoldi E et al., Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome. Blood 117, 4399-4400 (2011) Non-patent document 47) can be mentioned. In the present specification, “several” means 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or about 10.
  • the diagnostic method of the present invention comprises examining a G to T mutation at position 11423 of SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 shows the sequence of exon 12 to exon 16 of the human TMEM16F chromosomal gene. Each sequence of exon 12 to exon 16 is shown in italics. The underline in the sequence indicates the positions of Ex12-FW and Ex16-RV used in PCR.
  • Mutation can be examined using genomic DNA, mRNA, and protein prepared by a known method from a sample collected from a subject.
  • the sample is not particularly limited, and for example, various cells, tissues, organs, blood, body fluids, and the like of a subject can be used.
  • Mutations can be detected by directly examining the sequence of the subject's genomic DNA or mRNA.
  • Various methods can be used to detect mutations, including the following: TaqMan PCR method (Genet. Anal., 14, 143-149 (1999), J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)); Invader method (Science, 5109, 778-783 (1993), J. Biol. Chem., 30, 21387-21394 (1999), Nat. Biotechnol., 17, 292-296 (1999)); Molecular Beacons method (Nat.
  • the mutation in the patient with Scott syndrome identified by the present inventors is located at the splice acceptor site of intron 12 of the gene encoding TMEM16F, mRNA splicing is not normally performed in the subject having the mutation, and as a result Exon 13 is missing. Therefore, the presence or absence of the mutation can also be examined by examining the presence or absence of exon 13 deletion in the TMEM16F mRNA of the subject.
  • SEQ ID NOs: 2 and 3 The cDNA sequence and amino acid sequence of wild-type TMEM16F are shown in SEQ ID NOs: 2 and 3. Further, SEQ ID NOs: 4 and 5 show the cDNA sequence and amino acid sequence of mutant TMEM16F in a patient with Scott syndrome identified by the present inventors.
  • RT-PCR is performed using a primer that specifically hybridizes to a gene encoding TMEM16F to amplify a region containing exon 13, and control the length of DNA amplified from the subject's sample (healthy person) Compare with If the subject has the mutation, a short DNA fragment amplification is observed compared to the control.
  • RT-PCR is performed using a primer that specifically hybridizes to exon 13 of the gene encoding TMEM16F, a DNA fragment is not amplified from the sample of the subject.
  • the mutation of the gene encoding TMEM16F other than the mutation identified by the present inventors can be similarly detected by preparing a primer or probe corresponding to the mutation.
  • the presence of the mutation identified by the present inventors causes a frame shift in exon 14 in addition to the loss of exon 13, resulting in termination of protein translation in exon 14 encoding the third transmembrane domain of TMEM16F. To do. Therefore, the presence or absence of the mutation can also be examined by examining the expression of immature mutant TMEM16F in the subject.
  • mutant TMEM16F can be examined using an antibody that specifically recognizes TMEM16F.
  • an antibody that recognizes both wild-type TMEM16F and mutant-type TMEM16F is prepared using the amino acid sequence portion common to both wild-type TMEM16F and mutant-type TMEM16F as an antigen, and the size of the protein expressed in the subject by Western blotting is determined. What is necessary is just to investigate and compare this with the size of wild type TMEM16F.
  • an antibody that recognizes wild-type TMEM16F but does not recognize mutant-type TMEM16F is prepared using the amino acid sequence portion of the region that does not exist in mutant-type TMEM16F as an antigen, and whether or not the subject has a protein that is recognized by the antibody. You may investigate by a Western blot method, ELISA method, and dot blot method.
  • the mutation of the gene encoding TMEM16F other than the mutation identified by the present inventors can be similarly detected when the mutation results in a mutant TMEM16F having an amino acid sequence different from that of wild-type TMEM16F.
  • the present invention also provides a diagnostic composition for Scott syndrome comprising an oligonucleotide that specifically hybridizes to the gene used as a probe or primer for detecting a mutation in the gene encoding TMEM16F.
  • the diagnostic composition of the present invention is used in the diagnostic method.
  • the diagnostic composition of the invention comprises any of the following: (1) an oligonucleotide used as a probe that specifically hybridizes to a region containing position 11423 of SEQ ID NO: 1; (2) an oligonucleotide used as a probe that specifically hybridizes to the sequence of positions 11424 to 11649 of SEQ ID NO: 1; and (3) specifically hybridizes to the sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 1 Oligonucleotides used as primers for amplifying a region comprising all or part of positions 11424 to 11649.
  • the diagnostic composition of the present invention comprises an oligonucleotide that specifically hybridizes to the sequence of SEQ ID NO: 2 and is used as a primer for amplifying all or part of SEQ ID NO: 2. Including. Preferably, the oligonucleotide amplifies a region including all or part of positions 1402-1627 of SEQ ID NO: 2. In another embodiment, the diagnostic composition of the present invention comprises an oligonucleotide used as a probe that specifically hybridizes to the sequence at positions 1402-1627 of SEQ ID NO: 2.
  • sequence of the oligonucleotide need not be completely complementary to the sequence as long as it can specifically hybridize with the sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, but is preferably complementary to part of the sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 Is.
  • “specifically hybridizes” means stringent conditions determined according to the teaching of Molecular ⁇ ⁇ ⁇ Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) based on the Tm value of the oligonucleotide (for example, 6 ⁇ SSC, 0.5% SDS, 50% in formamide) means hybridization to the target sequence.
  • the oligonucleotide When used as a primer, the oligonucleotide is usually 15 to 100 bases, preferably 15 to 30 bases, more preferably 18 to 24 bases. When used as a probe, the oligonucleotide is usually 10 to 100 bases, preferably 10 to 50 bases, more preferably 15 to 25 bases. Oligonucleotides may be modified with radioisotopes, fluorescent materials, luminescent materials, enzymes, biotin, etc., depending on the method in which they are used. Further, when used as a probe, it may be fixed to a solid phase such as a glass plate, nylon membrane, microbead, capillary or the like.
  • the diagnostic composition of the present invention comprises an antibody that specifically recognizes TMEM16F.
  • the antibody of the present invention may be prepared using the whole or part of TMEM16F as an antigen, and may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibodies of the present invention also include antibody fragments such as Fab, F (ab ′) 2 and Fv. Methods for producing antibodies are well known in the art (see, eg, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Lane, HD, et al. Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989).
  • Method (1) Cell line, recombinant protein, antibody, serum Mouse interleukin (IL-3) dependent Ba / F3 cells are RPMI (10% fetal calf serum (FCS, Gibco), 45 units / ml recombinant mouse). IL-3 and containing 50 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol). EBV transformed human cell lines from Scott syndrome patients and their parents were grown in RPMI 1640 (containing 10% FCS and 50 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol). Human 293T cells were cultured in DMEM containing 10% FCS. Plat-E packaging cells (Non-patent Document 42) were grown in DMEM containing 10% FCS.
  • mouse IL-3 was produced by mouse C127I cells transformed with a bovine papilloma virus expression vector having mouse IL-3 cDNA as previously reported (Non-patent Document 43).
  • Flag-labeled mouse MFG-E8 was produced in human 293T cells as previously reported (Non-patent Document 44), and secreted MFG-E8 was purified using anti-Flag M2 beads (Sigma-Aldrich).
  • Ca 2+ / Mg 2+ -free RPMI1640 medium was purchased from Cell Science & Technology Institute.
  • Ca 2+ -free RPMI medium contained 0.5 mM MgSO 4 .
  • Ca 2+ free FCS was prepared by dialyzing FCS against PBS for 4 days with 4 buffer changes.
  • the cells were diluted with Cy5-labeled annexin V (Biovision) diluted 15 to 2500 times on ice for 15 minutes in staining buffer (containing 10 mM Hepes-NaOH buffer [pH7.4], 140 mM NaCl and 2.5 mM CaCl 2 ). Stained in the presence of 5 ⁇ g / ml propidium iodide (PI). Flow cytometry was performed with FACSAria (BD Bioscience) or FACSCalibur (BD Bioscience) and data was analyzed with FlowJo software (True Star).
  • Sublines of Ba / F3 cells sensitive to Ca 2+ ionophore-induced PS exposure were selected by repeated FACS sorting. Briefly, 2 x 10 7 Ba / F3 cells (in HBSS) were treated with A23187 for 15 minutes at 37 ° C and suspended in 1 ml Annexin V staining buffer previously cooled to 4 ° C. . The cells were stained on ice with Cy5-Annexin V as described above, and sorted using FACSAria with the injection chamber maintained at 4 ° C.
  • Cells that provide the highest level of Cy5 fluorescence signal (top 0.5-5.0%) are collected and Ca2 + -free RPMI (5% dialyzed FCS, 45 units / ml) at a density higher than 1.0 x 10 5 cells / ml IL-3 and 50 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol). After 24 hours, cells were resuspended in normal Ca 2+ -containing RPMI medium and grown for subsequent sorting.
  • a cDNA synthesis kit SuperScript TM Choice System for cDNA Synthesis, Invitrogen
  • a DNA fragment longer than 2.5 kb was recovered from the gel using a DNA extraction kit (Wizard R SV Gel and PCR Clean-up System, Promega) and ligated to a Bst XI digested pMXs vector (Non-patent Document 45).
  • E. coli DH10B cells ElectroMax DH10B; Invitrogen
  • Gene Pulser Bio-Rad
  • About 9.3 ⁇ 10 5 clones were produced, and plasmid DNA was prepared by QIAfilter Plasmid Maxi Kit (Qiagen).
  • Plasmid DNA (108 ⁇ g) derived from cDNA library was grown in 18 10 cm dishes by lipofection using FuGENE6 (Roche Diagnostics) 7.2 x 10 7 PLAT-E It introduced into the packaging cell (nonpatent literature 42). Two days after transfection, the virus in the culture supernatant was centrifuged at 6,000 xg for 16 hours, centrifuged at 4 ° C, and resuspended in RPMI1640 medium (containing 10% FCS and 45 units / ml IL-3). Used to infect 7.2 ⁇ 10 6 Ba / F3 cells in the presence of 8 ⁇ g / ml polybrene (Sigma-Aldrich). After culturing for 24 hours, the medium was replaced with fresh medium and the cells were cultured for an additional 2 hours. Sorting of cells sensitive to ionophore-induced PS exposure was performed as described above.
  • PCR fragment was cloned into pGEM-T Easy vector (Promega) and DNA sequence analysis was performed using ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
  • the primers used are as follows (Eco RI recognition sites are underlined in each primer): mTMEM16F, 5'-ATAT GAATTC GACATGCAGATGATGACTAGGAA-3 '(SEQ ID NO: 8) and 5'-ATAT GAATTC GACATGCAGATGATGACTAGGAA-3' (SEQ ID NO: 9); hTMEM16F, 5'-ATAT GAATTC GACATGAAAAAGATGAGCAGGAA-3 '(SEQ ID NO: 10) and 5'-ATAT GAATTC TTCTGATTTTGGCCGTAAAT-3' (SEQ ID NO: 11).
  • the PCR fragment was inserted into the Eco RI site of pMXs-puro c-Flag and the reliability of the cDNA was verified by DNA sequencing.
  • the coding sequence of mRFP in pcDNA-mRFP (Invitrogen) was linked to the C terminus of mouse TMEM16F in frame and introduced into the pMXs vector.
  • HRP-conjugated mouse anti-FLAG M2 (Sigma) was bound to the membrane, and peroxidase activity was detected by Western Lightning R- ECL system (PerkinElmer).
  • Ex1 -FW (5'- ATATGAATTC GACATGAAAAAGATGAGCAGGAA-3 ') (SEQ ID NO: 12) and Ex11 / 12-RV (5'-GCGTTCTTCTTCCTGAGTAA-3') (SEQ ID NO: 13); Ex11 / 12-FW (5'-TTACTCAGGAAGAAGAACGC -3 ') (SEQ ID NO: 14) and Ex20-RV (5'- ATATGAATTC TTCTGATTTTGGCCGTAAAAT-3 ') (SEQ ID NO: 15); Ex12-FW (5'-TCTGTGCCAGTGCTGTCTTT-3 ') (SEQ ID NO: 16) and Ex16-RV (5'- CTGCAGATGGTAGTCCTGTT- 3') (SEQ ID NO: 17).
  • Genomic DNA was prepared from a human cell line for sequence analysis of the human SCR ⁇ chromosomal gene, and 964-bp with 226-bp exon 13 and its 5'- and 3'-flanking regions (each about 370-bp)
  • the DNA fragments were amplified by PCR using the following primers: 5'-CCAGAGTATGCTACTAGTTG-3 '(SEQ ID NO: 18) and 5'-TCTCAGCAACCGAGGAACAT-3' (SEQ ID NO: 19).
  • the PCR product was purified by Wizard R SV PCR and Gel Clean-up System.
  • Cycle sequencing was performed using the BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit with the primer 5'-ACATATGTGGATGCGCCTTC-3 '(SEQ ID NO: 20) and analyzed with the ABI PRIZM 3100 Genetic Analyzer.
  • MFG-E8 binding cells were suspended in RPMI 1640 containing 10% FCS and incubated with 0.4 ⁇ g / ml Flag-labeled MFG-E8 D89E mutant (44) on ice for 20 minutes. The cells were washed with the above medium and incubated on ice for 20 minutes with 1.0 ⁇ g / ml hamster monoclonal antibody (mAb) against mouse MFG-E8 (clone 2422) and then with PE-labeled mouse anti-hamster IgG (BD Bioscience). Analysis by flow cytometry using FACSAria.
  • mAb monoclonal antibody
  • cells 1.0 x 10 5 cells
  • 10 ⁇ M BAPTA-AM in RPMI1640 medium containing 10% FCS
  • 37 ° C for 5 minutes for PS exposure or for PE exposure
  • the cells were washed with Annexin V staining buffer and stained with Cy5-Annexin V or Biotin-Ro09-0198 as described above.
  • cells 1.0 x 10 6 cells were washed with PBS and added to 1.0 ml cold annexin V staining buffer with Cy5 labeled annexin V or biotin-Ro09- A mixture of 0198 and APC-labeled streptavidin and 5 ⁇ g / ml PI were suspended.
  • the cells were mixed with A23187 on ice at a final concentration of 0.25 or 0.5 ⁇ M and applied to a FACSAria injection chamber set at 20 ° C. (Ba / F3 cells) or 37 ° C. (human cell line) to induce A23187 reaction. Data were recorded for the period indicated and PI positive cells were excluded from the analysis.
  • NBD-PC and NBD-SM Uptake of NBD lipid analogues was basically analyzed by flow cytometry as described by Williamson et al. (Non-patent Document 17). Briefly, cells (10 6 cells) were washed with HBSS and resuspended in 0.5 ml HBSS (containing 2 mM CaCl 2 ).
  • HBSS 2 mM CaCl 2 and 1 ⁇ M 1-oleoyl-2- ⁇ 6-[(7-nitro-2-1,3-benzooxadiazol-4-yl) amino] hexanoyl ⁇ -sn-glycero -3-phosphocholine (NBD-PC), or 1-oleoyl-2- ⁇ 6-[(7-nitro-2-1,3-benzooxadiazol-4-yl) amino] hexanoyl ⁇ -sphingosine-1 -Phosphocholine (NBD-SM) (containing Avanti Polar Lipids) was added to the cell suspension and incubated at room temperature.
  • NBD-SM 1-oleoyl-2- ⁇ 6-[(7-nitro-2-1,3-benzooxadiazol-4-yl) amino] hexanoyl ⁇ -sphingosine-1 -Phosphocholine
  • Non-patent Document 46 Ca 2+ influx was measured as previously reported (Non-patent Document 46). Briefly, cells (1.0 ⁇ 10 6 ) were labeled with Fluo-4-AM (1 ⁇ M) (in RPMI containing 10% FCS) for 30 minutes at 37 ° C. After washing with annexin V staining buffer, the cells were suspended in annexin V staining buffer and maintained at 4 ° C. To this mixture was added Ca 2+ ionophore A23187 at a final concentration of 0.5 ⁇ M, and changes in mean fluorescence intensity (MFI) were recorded directly using a FACSCalibur system. Data was analyzed by FlowJo Software.
  • shRNA The shRNA expression plasmid for mouse SCR ⁇ in the pRS shRNA vector carrying the puromycin resistance gene was purchased from OriGene.
  • Ba / F3 cells were infected with retrovirus containing shRNA and cultured in the presence of 1.0 ⁇ g / ml puromycin. Puromycin resistant cells were subjected to cloning by limiting dilution.
  • SCR ⁇ mRNA was quantified by real-time PCR, and clones showing decreased expression of SCR ⁇ were used in subsequent experiments.
  • TMEM16A is another member of TMEM16 family Ca 2+ dependent Cl - was shown to be a channel (Non-Patent Document 19-21).
  • Cl ⁇ channel activity of TMEM16F was very low compared to TMEM16A (Non-patent Document 22).
  • Flag or mRFP was added to the C-terminus of the wild-type and mutant (D409G) forms of SCR ⁇ and expressed in Ba / F3 cells or human 293T cells.
  • Annexin V binds to Ba / F3 cells that express the D409G mutant, but does not bind to Ba / F3 cells that express wild-type SCR ⁇ (FIG. 2d), and cells that express the SCR ⁇ mutant are constitutive. It was suggested that PS was exposed to. This was confirmed by the fact that MFG-E8 (lactoadherin) (Non-patent Documents 23 and 24) that specifically binds to phosphatidylserine bound to the D409G mutant-expressing cells (FIG. 6). When intracellular Ca 2+ was chelated by BAPTA-AM, the level of exposed PS in SCR ⁇ mutant-expressing cells decreased (FIG. 2d).
  • phospholipid scrambles should mediate bidirectional transport of phospholipids.
  • Culture of 1-oleoyl-2- [6-[(7-nitro-2-1,3-benzooxadiazol-4-yl) amino] dodecanoyl] -sn-glycero-3-phosphocholine (NBD-PC) When added to the product, it was rapidly taken up by cells expressing the D409G mutant (FIG. 3c). That is, over 40% of NBD-PC bound to the cells became resistant to BSA extraction within 6 minutes. When cells overexpressing wild-type SCR ⁇ were treated with A23187, these cells took up NBD-PC faster than the parent cells, and about 25% of the NBD-PC bound to the cells was observed within the cell within 4 minutes.
  • Non-patent Document 27 Splice site mutation of SCR ⁇ in a patient with Scott syndrome Platelets and other blood cells obtained from a patient with Scott syndrome lack the ability to expose PS in response to Ca 2+ ionophore.
  • Non-patent Document 28 Kojima et al. (Non-Patent Document 28) established an EBV-transformed B cell line from Scott syndrome patients and their parents. Consistent with previous reports (Non-Patent Documents 17 and 28), patient-derived cells did not expose PS in response to Ca 2+ ionophore (FIG. 5a). In contrast, in a cell line derived from the patient's parents, A23187 induced PS exposure at the same level as a cell line from an unrelated healthy volunteer.
  • RNA was prepared from the patient and parents, and the SCR ⁇ mRNA was divided into two parts, the 5 ′ half (equivalent to exon 1-12) and the 3 ′ half (exon 11-20). Analyzed by PCR. The 5'-half 1320-bp DNA fragment was identical in the patient and parents, whereas the patient-derived 3'-half fragment was shorter than the parents' fragment ( Figure 5b). DNA sequence analysis suggested that the patient's cDNA lacks the 226-bp sequence corresponding to exon 13.
  • the patient's SCR ⁇ gene has a G-to-T homozygous mutation at the consensus splice acceptor site in intron 12, but parents found that the mutation at this position is heterozygous. Suggested ( Figure 5c). PCR analysis of SCR ⁇ mRNA using primers designed to bind to exons 12 and 16 showed a 608-bp band from the control cell line and a 382-bp band from the Scott syndrome patient cell line. As shown (FIG. 5d), suggesting that exon 13 was skipped by mutations in the splice acceptor site.
  • TMEM16F (SCR ⁇ ) is a phospholipid scramble that controls the distribution of phospholipids in the cell membrane, and TMEM16F is a cause of Scott syndrome, which is a hemorrhagic disease caused by impaired PS migration to the platelet surface. It became clear that it was a gene. Therefore, TMEM16F is useful as a novel target for blood coagulation regulating substances.
  • Non-patent literature [Non-patent literature] 1. Leventis, P. A. & Grinstein, S., The Distribution and Function of Phosphatidylserine in Cellular Membranes. Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010). 2. Lentz, B., Exposure of platelet membrane phosphatidylserine regulates blood coagulation.Prog. Lipid Res. 42, 423-438 (2003). 3. Balasubramanian, K. & Schroit, A. J., Aminophospholipid asymmetry: A matter of life and death. Annu. Rev. Physiol. 65, 701-734 (2003). 4.

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Abstract

　本発明は、ＴＭＥＭ１６Ｆ（transmembrane protein 16 F）を標的とした、血液凝固調節物質のスクリーニング方法、血液凝固調節用組成物、および血液凝固調節方法に関する。さらに本発明は、Ｓｃｏｔｔ症候群の診断方法および診断用組成物に関する。

Description

血液凝固調節物質のスクリーニング方法
　本発明は、ＴＭＥＭ１６Ｆ（transmembrane protein 16 F）を標的とした、血液凝固調節物質のスクリーニング方法、血液凝固調節用組成物、および血液凝固調節方法に関する。さらに本発明は、Ｓｃｏｔｔ症候群の診断方法および診断用組成物に関する。
　脊椎動物および無脊椎動物のあらゆる正常な細胞において、リン脂質は細胞膜の外葉と内葉の間に非対称性に分布している（非特許文献１）。コリン含有リン脂質（ホスファチジルコリン [PC] およびスフィンゴミエリン [SM]）は基本的に外葉に位置し、一方、陰イオン性リン脂質と第一級アミン含有リン脂質（ホスファチジルセリン [PS]、ホスファチジルエタノールアミン [PE]、ホスホイノシチド [PIP]、およびホスファチジン酸 [PA]）は細胞質内葉に限定される。
　リン脂質の非対称性は、多くの細胞機能において示唆されている（非特許文献１）。例えば、リン脂質の非対称性分布によって、膜脂質の密な充填が可能となり、溶質に対する膜の透過性が減少するようである。非対称性のリン脂質分布の制御された破壊、特に細胞表面におけるPSの露出は、様々な系で重要である。例えば、血小板がコラーゲンまたはトロンビンにより活性化されると、血小板はその表面にPSを露出する。露出されたPSは、テナーゼとプロトロンビナーゼの複合体に対する触媒表面を提供し、凝固因子の活性化を誘発する（非特許文献２）。アポトーシス細胞死を起こしている細胞もまたPSを露出し、露出されたPSは食細胞のための「eat me」シグナルとして機能する（非特許文献３、４）。
　膜におけるリン脂質の非対称性分布は、フリッパーゼ、フロッパーゼ、およびスクランブレースの、３つのタイプの脂質トランスポーターにより構築されると考えられている。フリッパーゼは、ATP依存的アミノリン脂質トランスロケースとも呼ばれ、細胞外葉から細胞内側へアミノリン脂質を輸送する（非特許文献１、３）。4型P型ATPアーゼ (P4-ATPアーゼ)は、P型ATPアーゼ多重スパン膜貫通タンパク質のサブファミリーであり、フリッパーゼの有力な候補である（非特許文献５、６）。フロッパーゼは、広範な脂質を細胞質から細胞外葉へATP依存的に移動させるトランスポーターである。ATP結合カセット (ABC) ATPエース、特にABCA1は、フロッパーゼとして示唆されている（非特許文献７）が、ABCA1欠損細胞は2層間のリン脂質移動に何ら欠陥を示さず（非特許文献８）、この役割は疑問視されている。
　リン脂質スクランブレースは、ATP依存的にリン脂質を二方向性に輸送し、膜における脂質の非対称性を減少させる（非特許文献１、３）。2つのタイプのスクランブレースが想定されている。一方は、小胞体内で構成的に機能し、新規に合成されたリン脂質を細胞質から内葉へ輸送する。他方は、細胞膜に位置し、細胞が静止状態のときは不活性であるが、細胞内Ca2+が増加すると活性化される。活性化された血小板上のPSの露出はCa2+を必要とすることから、Ca2+依存的スクランブレースが想定されている。この活性を有するタンパク質（リン脂質スクランブレース、PLSCR）のファミリーが単離され、特徴決定されている（非特許文献９、１０）。しかしながら、PLSCRタンパク質が実際に内因性の細胞膜のリン脂質スクランブレース活性を提供するかについては議論があり、最近は異議をとなえられている（非特許文献１１－１４）。
　本発明者らは、8回膜貫通型タンパク質であるTMEM16F（Transmembrane protein 16F）（本明細書中、スクランブレースα（SCRα）とも称する）（非特許文献１５）がリン脂質スクランブレースであることを見出した。さらに、リン脂質スクランブリング活性の異常に起因する出血性疾患であるScott症候群（非特許文献１６、１７、１８）の患者がSCRα遺伝子に変異を有することを見出した。以上より、血液凝固経路の制御を可能とする新規ターゲットとしてSCRαを同定し、本発明を完成した。
　本発明は、以下を提供する：
　血液凝固調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）ＴＭＥＭ１６Ｆ発現細胞と血液凝固調節物質の候補物質とを接触させる工程、および
（２）該細胞の表面におけるホスファチジルセリンの露出を変化させる候補物質を選択する工程、
　ここで、ホスファチジルセリンの露出を増加させる候補物質が血液凝固促進物質として選択され、ホスファチジルセリンの露出を減少させる候補物質が血液凝固阻害物質として選択される。
　本発明はまた、以下を提供する：
　血液凝固調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）ＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子を有する細胞と血液凝固調節物質の候補物質とを接触させる工程、および
（２）該細胞におけるＴＭＥＭ１６Ｆの発現を変化させる候補物質を選択する工程、
　ここで、ＴＭＥＭ１６Ｆの発現を増加させる候補物質が血液凝固促進物質として選択され、ＴＭＥＭ１６Ｆの発現を減少させる候補物質が血液凝固阻害物質として選択される。
　本発明はまた、ＴＭＥＭ１６Ｆの機能を亢進する物質を有効成分として含有する、血液凝固促進用組成物、およびＴＭＥＭ１６Ｆの機能を抑制する物質を有効成分として含有する、血液凝固阻害用組成物、を提供する。
　本発明はまた、ＴＭＥＭ１６Ｆの機能を亢進する物質を対象に投与することを含む、血液凝固を促進する方法、およびＴＭＥＭ１６Ｆの機能を抑制する物質を対象に投与することを含む、血液凝固を阻害する方法、を提供する。
　本発明はまた、以下を提供する：
　ＴＭＥＭ１６Ｆの機能を調節する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）ＴＭＥＭ１６Ｆ発現細胞とＴＭＥＭ１６Ｆの機能を調節する物質の候補物質とを接触させる工程、および
（２）該細胞の表面におけるホスファチジルセリンの露出を変化させる候補物質を選択する工程、
　ここで、ホスファチジルセリンの露出を増加させる候補物質がＴＭＥＭ１６Ｆの機能を亢進する物質として選択され、ホスファチジルセリンの露出を減少させる候補物質がＴＭＥＭ１６Ｆの機能を抑制する物質として選択される。
　本発明はまた、以下を提供する：
　ＴＭＥＭ１６Ｆの機能を調節する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）ＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子を有する細胞とＴＭＥＭ１６Ｆの機能を調節する物質の候補物質とを接触させる工程、
（２）該細胞におけるＴＭＥＭ１６Ｆの発現を変化させる候補物質を選択する工程、
　ここで、ＴＭＥＭ１６Ｆの発現を増加させる候補物質がＴＭＥＭ１６Ｆの機能を亢進する物質として選択され、ＴＭＥＭ１６Ｆの発現を減少させる候補物質がＴＭＥＭ１６Ｆの機能を抑制する物質として選択される。
　本発明はまた、被験者のＳｃｏｔｔ症候群の素因を調べる方法であって、該被験者がＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子に変異を有するかを調べることを含む方法、を提供する。
　本発明はまた、ＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子の変異を検出するためのプローブまたはプライマーとして使用される該遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、Ｓｃｏｔｔ症候群の診断用組成物を提供する。
　本発明はまた、ＴＭＥＭ１６Ｆを特異的に認識する抗体を含む、Ｓｃｏｔｔ症候群の診断用組成物を提供する。
　本発明により、ＴＭＥＭ１６Ｆを標的とした血液凝固調節物質のスクリーニングが可能となった。本発明は、新規メカニズムに基づく血液凝固促進剤や血液凝固阻害剤の提供を可能とする。
SCRαの分子クローニング。a, A23187 ± CaCl2で処理し、アネキシンVおよびPIにより染色したBa/F3。 b, BAPTA-AMとインキュベートし、A23187で処理したBa/F3。PI陰性集団におけるアネキシンV染色プロファイルを示す。白抜き部分は休止期の細胞を示す。c, A23187で処理し、次いでBAPTA-AMで5分間処理し、アネキシンVで染色したBa/F3。d. A23187で処理し、アネキシンVで染色した、Ba/F3および12サイクルのソーティング後の細胞 (PS12)。e. PS0、PS19、およびPS0/19ハイブリッドのGFPおよびDsRedの発現プロファイル。右：A23187で処理し、アネキシンVで染色した前記細胞。f, Ba/F3-PS19 cDNAライブラリーにより形質転換し、A23187で処理し、アネキシンVで染色し、そしてソーティングした、Ba/F3 (LD-PS0)。第１(LD-PS1)および第３(LD-PS3)のソーティング後の細胞のアネキシンVとPIのプロファイル。右：ソーティング前(LD-PS0)および第４のソーティングの後(LD-PS4)の細胞のA23187非存在下でのアネキシンVプロファイル。 SCRα発現細胞上のPS露出。a, マウスSCRαの模式図。D409G変異体(Mut) は、コドン409においてアスパラギン酸をグリシンに置換するAからGへの変異を有する。b, 抗Flagによるウェスタンブロッティングにより解析したFlag標識野生型 (WT) SCRαおよび変異体SCRαを発現するBa/F3。矢印はSCRαの単量体および多量体を示す。c, 蛍光顕微鏡で観察したSCRα-mRFPを発現するヒト293T細胞。スケールバー：10μm。d, 空のベクター、野生型SCRα発現ベクター、または変異体SCRα発現ベクターにより形質転換し、アネキシンVで染色したBa/F3（BAPTA-AMによる前処理有り、または無し）。e, アネキシンVでプレインキュベートし、A23187と混合した、ベクターまたは野生型SCRαで形質転換したBa/F3。蛍光をモニターした。f, ベクター、野生型SCRα発現ベクター、または変異体SCRα発現ベクターにより形質転換し、Fluo-4-AMをロードし、FACSにより解析したBa/F3。g, Fluo-4-AMでプレインキュベートした、ベクターまたは野生型SCRαで形質転換したBa/F3。A23187を矢印で示した時点で添加し、蛍光をモニターした。d-gの実験はいずれも少なくとも３回実施した。 SCRα発現細胞におけるリン脂質のスクランブリング。a, ビオチン標識Ro09-0198とインキュベートし、次いでAPCストレプトアビジンにより染色した、ベクター、野生型SCRα、またはD409G変異体SCRαを発現するBa/F3（BAPTA-AMによる前処理有り、または無し）b, ビオチン-Ro09-0198およびAPCストレプトアビジンとプレインキュベートした、ベクターまたはSCRαにより形質転換したBa/F3。A23187を添加し、蛍光をモニターした。cおよびe, Ca2+含有HBSS中で0.5μMのNBD-PC (c)またはNBD-SM (e)と室温でインキュベートした、ベクターまたは変異体SCRαを発現するBa/F3。表示した時点において、冷却した脂肪酸不含BSA含有バッファーでサンプルを希釈し、フローサイトメトリーにより解析した。dおよびf, 4℃で0.1μM NBD-PC (d) またはNBD-SM (f)とプレインキュベートした、ベクターまたは野生型SCRα発現Ba/F3。A23187を添加し、取り込まれたNBDリン脂質を室温で前述のように解析した。b-fにおいて、y軸はFACS解析により観察された蛍光強度であり、任意単位（arbitrary unit）で示す。実験は独立に少なくとも3回行った。c-fにおいて、表示した時点でBSAにより抽出できなかったNBDリン脂質の割合をトリプリケートで測定し、S.D.とともにプロットした。 Ca2+依存性リン脂質スクランブリングについてのSCRαの必要性。a. SCRαのためのshRNA (shSCR)、またはスクランブルなshRNA (shCon)を発現するBa/F3形質転換体を樹立した。SCRα mRNAをリアルタイムPCRにより定量し、β-アクチン mRNAに対してノーマライズし、相対的な発現として示す。bおよびc, Cy5-アネキシンV (b) またはビオチン-Ro09-0198およびAPCストレプトアビジン (c)とアネキシンV結合バッファーにおいてプレインキュベートした、shSCRまたはスクランブルなshRNAを発現するBa/F3 。0.5μMのA23187を添加後、細胞の蛍光をモニターした。dおよびe, 0.5μMのNBD-PC (d) またはNBD-SM (e)とHBSS（2 mM CaCl2含有）においてプレインキュベートした、shSCRまたはスクランブルなshRNAを発現するBa/F3。A23187を0.5μMまで添加後、混合物を表示した時点で脂肪酸不含BSA含有バッファーにより希釈し、蛍光を測定した。b-eの実験は少なくとも3回実施した。 Scott症候群患者におけるSCRα遺伝子のスプライス変異。a, 対照、Scott症候群患者、および患者の両親由来の細胞をアネキシンVとプレインキュベートした。A23187を添加し、蛍光をモニターした。b, Scott患者および患者の両親の細胞由来のRNAを用いた、SCRα mRNAのエクソン 1-12および11-20についてのRT-PCR。マーカーDNAのサイズを左に示す。c, 3'側から配列決定したSCRα遺伝子のエクソン13およびイントロン12のジャンクション。コンセンサススプライスアクセプターサイトの“AG”に相補的な“CT”に下線を付す。矢印は変異を示す。d, SCRαのエクソン12およびエクソン16上のプライマーを用いたRT-PCR。矢印は、野生型およびエクソン13欠損型のフラグメントを示す。eおよびf, 両親のSCRα遺伝子におけるスプライシング。イントロン12におけるスプライスアクセプターサイト (AG) のATへの変異は、エクソン13のスキッピングを生じさせ、結果として第3膜貫通領域において未成熟に終結するフレームシフト変異が起こる。 D409G変異体SCRαを発現するBa/F3細胞へのMFG-E8の結合。空のレトロウイルスベクター、または野生型SCRαもしくはD409G 変異体SCRαを有するレトロウイルスを感染させたBa/F3細胞を0.4μg/mlのマウスMFG-E8とインキュベートし、続けてハムスター抗マウスMFG-E8およびPE標識マウス抗ハムスターIgGとともにインキュベートした。この細胞をFACSAriaを用いてフローサイトメトリーにより解析し、その染色プロファイルを示す（色付き部分)。染色操作をMFG-E8なしでも行い、その染色プロファイルを白抜き部分で示す。 細胞に取り込まれたNBD-PCの非分解。NBD-PCを、SCRαのD409G変異体を発現するBa/F3に添加した。室温で8分間インキュベートした後、細胞に取り込まれたNBD-PCを細胞から抽出し、添加したNBD-PC（インプット）とともに薄層クロマトグラフィーにより解析した。参考用に、ホスファチジン酸 (PA)、ホスファチジルエタノールアミン (PE)、ホスファチジルセリン (PS)、およびスフィンゴミエリン (SM)のNBD誘導体を並行してクロマトグラフィーにかけ、それらのクロマトグラム上の位置を右に示す。 Ca2+依存性PS露出に対するSCRαのノックダウンの効果。SCRαのためのpRS shRNAベクターをBa/F3細胞に導入した。SCRα mRNAレベルが減少しているBa/F3安定形質転換クローンのうち、5クローン (shSCR ♯1-5) を選択し、検討した。対照として、スクランブルな無効な配列を有するpRS shRNAベクターにより樹立したBa/F3形質転換細胞 (shCon) も解析した。a, Ba/F3 形質転換クローン (shSCR ♯1-5)におけるSCRα mRNAレベルをリアルタイムPCRにより測定し、対照Ba/F3 (shCon)におけるレベルに対する比として示す。b, Ba/F3 形質転換細胞 (shConおよびshSCR ♯1-5) を1.0μM A23187により37℃で15分間処理し、Cy5標識アネキシンVで染色し、フローサイトメトリーにより解析した。また、A23187処理なしで形質転換体をアネキシンVで染色し、その染色プロファイルを白抜き部分で示す。 ヒトＴＭＥＭ１６Ｆ染色体遺伝子のエクソン１２－エクソン１６の配列。 ヒトＴＭＥＭ１６ＦのｃＤＮＡ配列。開始コドン（ATG）、終止コドン（TAA）、エクソン６（ヌクレオチド番号649－762）、１１（ヌクレオチド番号1001－1323）、および１３（ヌクレオチド番号1402－1627）は太字かつ下線で示した。 ヒトＴＭＥＭ１６Ｆのアミノ酸配列。 Ｓｃｏｔｔ症候群の患者で見出された変異型ＴＭＥＭ１６ＦのｃＤＮＡ配列。エクソン１３がスキップされることにより、ヌクレオチド1402番目よりエクソン１４の配列が結合される。この配列では、４３塩基下流（ヌクレオチド番号1444-1446）にTAG終止コドンが有り、翻訳は終了する。 Ｓｃｏｔｔ症候群の患者で見出された変異型ＴＭＥＭ１６Ｆのアミノ酸配列。エクソン１２からエクソン１４にスプライスされたためにエクソン１４で新たに付加されるアミノ酸を、太字かつ下線で示した。
１．血液凝固調節物質のスクリーニング方法
　本発明者らは、８回膜貫通型タンパク質であるＴＭＥＭ１６Ｆ（transmembrane protein 16 F）が血液凝固に関与するリン脂質スクランブレース（scramblase）であることを同定した。よって、本発明は、ＴＭＥＭ１６Ｆを標的とした、血液凝固調節物質のスクリーニング方法を提供する。
　本発明の「血液凝固調節物質」には、血液凝固促進物質と血液凝固阻害物質とが含まれる。本発明において「血液凝固」とは、血小板同士や血小板と血管内皮細胞が接着し、または血液細胞が血管壁に接着し、凝固因子とともに血餅を形成する一連の分子作用をいう。本発明において「血液凝固促進」とは、前記血液凝固を促進して止血を促進することを意味し、「血液凝固阻害」とは、前記血液凝固をいずれかの段階で阻害することを意味する。
　血液凝固調節物質の候補物質は、天然に存在する物質または合成された物質のいずれであってもよく、例えば微生物、植物もしくは動物の細胞抽出物または培養上清、合成低分子化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、抗体などが挙げられる。候補物質は、合成低分子化合物ライブラリー、合成ペプチドライブラリー、抗体ライブラリー等、ライブラリーの形態であってもよい。
　本発明における「ＴＭＥＭ１６Ｆ発現細胞」および「ＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子を有する細胞」には、各種生物、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ等由来の、血小板、巨核球細胞や、巨核球由来細胞株を含む各種細胞株、ＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子を導入し発現させた細胞が含まれる。ヒトＮａｍａｌｗａ細胞、マウスＢａ／Ｆ３細胞などのＢ細胞株も利用可能である。
　ある態様において、本発明のスクリーニング方法は、ＴＭＥＭ１６Ｆの酵素活性の変化を調べることにより行われる。ＴＭＥＭ１６Ｆはホスファチジルセリン（ＰＳ）を細胞表面に露出させるスクランブレースとしての機能を有することから、ＴＭＥＭ１６Ｆの酵素活性の変化は、ＴＭＥＭ１６Ｆ発現細胞の表面におけるＰＳの露出の変化により調べることができる。血小板におけるＰＳの露出は血小板を活性化し、血液凝固を誘導することから、ＰＳの露出を増加させる候補物質は血液凝固促進物質として選択され、ＰＳの露出を減少させる候補物質は血液凝固阻害物質として選択される。
　ＰＳの露出は、ＰＳに結合する性質を有する物質、例えばアネキシンＶ（AnnexinV）やＭＦＧ－Ｅ８（ラクトアドヘリンとも呼ばれる）と細胞表面のＰＳとの結合により調べることができる。具体的には、例えば、ＴＭＥＭ１６Ｆ発現細胞を候補物質で処理し、蛍光等で標識したアネキシンＶとインキュベートして、細胞表面に結合するアネキシンＶの量を調べればよい。この場合、対照と比較してアネキシンＶの結合を増加させる候補物質は血液凝固促進物質として選択され、減少させる候補物質は血液凝固阻害物質として選択される。
　ＰＳの露出は、また、血液凝固反応の誘導によっても調べることができる。血液凝固反応を調べる方法は周知である。例えば、ＴＭＥＭ１６Ｆ発現細胞を候補物質で処理し、さらに（候補物質の処理後またはその処理と同時に）細胞内にＣａ２＋を流入させるカルシウムイオノフォアで処理した細胞を、血液凝固に必要な因子（例えば、ファクターＸａ、ファクターＶａ、プロトロンビン）と混合し、トロンビンの生成の有無を調べる。あるいは、さらにフィブリノーゲンと混合して、フィブリンの生成を調べても良い。
　別の態様において、本発明のスクリーニング方法は、候補物質がＴＭＥＭ１６Ｆの発現を変化させるか否かを調べることにより行われる。この場合、ＴＭＥＭ１６Ｆの発現を増加させる候補物質は血液凝固促進物質として選択され、ＴＭＥＭ１６Ｆの発現を減少させる候補物質は血液凝固阻害物質として選択される。
　かかる態様における血液凝固調節物質の候補物質の具体例としては、ＴＭＥＭ１６Ｆの発現を調節するプロモーターやエンハンサー等の調節配列に作用する物質、ＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子の配列に基づき作製したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡや、ｍｉＲＮＡ、リボザイムが挙げられる。
　ＴＭＥＭ１６Ｆの発現を調べる方法は特に限定されない。例えば、タンパク質の発現をウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法などにより調べてもよいし、ｍＲＮＡの発現をノーザンブロット法、ＲＴ－ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法などにより調べてもよい。
２．血液凝固調節用組成物および血液凝固調節方法
　本発明はまた、ＴＭＥＭ１６Ｆの機能を調節する物質を有効成分として含有する血液凝固調節用組成物、およびＴＭＥＭ１６Ｆの機能を調節する物質を対象に投与することを含む血液凝固を調節する方法を提供する。
　本発明における「ＴＭＥＭ１６Ｆの機能を調節する物質」には、「ＴＭＥＭ１６Ｆの機能を亢進する物質」と「ＴＭＥＭ１６Ｆの機能を抑制する物質」が含まれる。「ＴＭＥＭ１６Ｆの機能を亢進／抑制する」とは、細胞または生物におけるＴＭＥＭ１６Ｆのリン脂質スクランブレースとしての生化学的機能や生物学的機能を促進／抑制することを意味し、これにはＴＭＥＭ１６Ｆの酵素活性の促進／抑制やＴＭＥＭ１６Ｆの発現の増加／減少が含まれる。「ＴＭＥＭ１６Ｆの発現の増加／減少」には、ＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子からのｍＲＮＡの発現の増加／減少、およびＴＭＥＭ１６Ｆタンパク質の発現の増加／減少が含まれる。
　具体的には、「ＴＭＥＭ１６Ｆの機能を促進する物質」としては、例えば、野生型ＴＭＥＭ１６Ｆタンパク質が挙げられる。また、「ＴＭＥＭ１６Ｆの機能を抑制する物質」としては、例えば、ＴＭＥＭ１６Ｆの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡやＴＭＥＭ１６Ｆの機能を抑制する抗ＴＭＥＭ１６Ｆ抗体が挙げられる。
　本発明の「血液凝固促進用組成物」は、血管損傷などによる出血を止めるために使用できる他、血友病、ｖｏｎ　ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ病、播種性血管内凝固症候群等の血液凝固作用に対する異常疾患の治療にも使用することができる。一方、本発明の「血液凝固阻害用組成物」は、血栓が血管の損傷等を原因として形成された部位以外の部位に異動して血管を塞ぐ、血栓塞栓症（例えば、静脈血栓症、心筋梗塞症、脳塞栓症等）の治療に使用することができる。また、本発明の「血液凝固阻害用組成物」は、異常な血液凝固を阻害することにより、血液循環の促進やうっ血予防に使用することができる。さらに、過剰な血液凝固や血栓の形成は動脈硬化や梗塞を誘発することから、本発明の「血液凝固阻害用組成物」は動脈硬化や梗塞の予防にも使用することができる。
　本発明はまた、ＴＭＥＭ１６Ｆの機能を調節する物質のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、前記「１．１．血液凝固調節物質のスクリーニング方法」に記載のように行えばよい。
３．Ｓｃｏｔｔ症候群の診断方法および診断用組成物
　本発明者らは、ＴＭＥＭ１６Ｆが、血小板表面へのＰＳの移動障害を原因とする出血性疾患であるＳｃｏｔｔ症候群の原因遺伝子であることを見出した。よって、本発明は、ＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子の変異を調べることによる、Ｓｃｏｔｔ症候群の診断方法を提供する。
　本明細書における「ＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子」には、ＴＭＥＭ１６Ｆのコーディング配列のみならず、ＴＭＥＭ１６Ｆの発現を調節するプロモーター等の調節配列も含まれる。また、「ＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子」には、エクソンおよびイントロンの両方が含まれる。「ＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子の変異」には、細胞または生物におけるＴＭＥＭ１６Ｆの酵素活性を失活させるあらゆる変異（例えば、１もしくは数個の塩基の欠失、置換、付加および／または挿入等による）が含まれる。かかる変異は、例えば、１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、付加および／または挿入、ｍＲＮＡの異常スプライシングによるエクソンの欠失、ｍＲＮＡの翻訳時のフレームシフト等、ＴＭＥＭ１６Ｆのアミノ酸配列の変異をもたらす。そのような変異の例としては、本願明細書に記載される変異の他、Castoldi E et al., Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome. Blood 117, 4399-4400 (2011) （非特許文献４７）に記載の変異が挙げられる。なお、本明細書において数個とは、２、３、４、５、６、７、８、９または約１０個を意味する。
　本発明者らは、Ｓｃｏｔｔ症候群の患者が、ＴＭＥＭ１６Ｆの２つの対立遺伝子の両方においてイントロン１２におけるグアニン（Ｇ）（配列番号１の１１４２３位）のチミン（Ｔ）への変異を有し、その両親が一方の対立遺伝子において当該変異を有することを見出した。よって、好ましくは、本発明の診断方法は、配列番号１の１１４２３位のＧからＴへの変異を調べることを含む。
　配列番号１（図９－１～９－９）は、ヒトＴＭＥＭ１６Ｆ染色体遺伝子のエクソン１２－エクソン１６の配列を示す。エクソン１２－エクソン１６の各配列はそれぞれイタリック体で示した。配列中の下線はＰＣＲで用いたＥｘ１２－ＦＷおよびＥｘ１６－ＲＶの位置を示す。ヒトＴＭＥＭ１６ＦのｍＲＮＡの配列はＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００１０２５３５６として、ゲノム配列は、Ｅｎｔｒｅｚ　Ｇｅｎｅに１９６５２７として (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene&cmd=search&term=196527)、またはＨＧＮＣに２５２４０  (http://www.genenames.org/data/hgnc_data.php?hgnc_id=25240) として開示されている。（これらの開示はいずれも引用により本願に含まれる）
　変異は、被験者から採取された試料から公知の方法によって調製されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質を用いて調べることができる。試料は、特に限定されず、例えば被験者の各種細胞、組織、臓器、血液、体液等が使用可能である。
　変異は、被験者のゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡの配列を直接調べることにより検出することができる。変異の検出には種々の方法を用いることができ、例えば以下が挙げられる：
TaqMan PCR法（Genet. Anal., 14, 143-149 (1999), J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)）；
インベーター（Invader）法（Science, 5109, 778-783(1993), J. Biol. Chem., 30, 21387-21394 (1999), Nat. Biotechnol., 17, 292-296 (1999)）；
モレキュラー・ビーコン（Molecular Beacons）法（Nat. Biotechnol.，1, p49-53 (1998)、遺伝子医学、4, p46-48(2000)）；
DNAマイクロアレイまたはDNAチップ法；
ダイレクトシークエンス法（Biotechniques, 11, 246-249 (1991)）；
RFLP（制限酵素切断断片長多型）法；
PCR-SSCP法（Biotechniques, 16,296-297 (1994), Biotechniques, 21, 510-514 (1996)）；
ASO（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法（Clin. Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)）；
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis、DGGE）法（（Biotechniqus, 27, 1016-1018 (1999)）；
RNaseA切断法（DNA Cell. Biol., 14, 87-94 (1995)）；
MALDI-TOF/MS（Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry）法（Genome Res., 7, 378-388 (1997), Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 35, 545-548 (1997)）；
RCA法（Nat. Genet., 19, 225-232(1998)）。
（上記文献は引用により本明細書に含まれる。）
　本発明者らの同定したＳｃｏｔｔ症候群の患者における変異は、ＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子のイントロン１２のスプライスアクセプターサイトに位置するため、当該変異を有する被験者ではｍＲＮＡのスプライシングが正常に行われず、その結果エクソン１３が欠損する。よって、変異の有無は、被験者のＴＭＥＭ１６ＦのｍＲＮＡにおけるエクソン１３の欠損の有無を調べることによっても調べることができる。
　野生型ＴＭＥＭ１６ＦのｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号２および３に示す。また、本発明者らの同定したＳｃｏｔｔ症候群の患者における変異型ＴＭＥＭ１６ＦのｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、配列番号４および５に示す。
　例えば、ＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行ってエクソン１３を含む領域を増幅し、被験者の試料から増幅されるＤＮＡの長さを対照（健常人）と比較する。被験者が当該変異を有する場合、対照と比較して短いＤＮＡ断片の増幅が観察される。あるいは、ＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子のエクソン１３に特異的にハイブリダイズするプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行った場合、当該被験者の試料からはＤＮＡ断片が増幅されない。また、ＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子のエクソン１３に特異的にハイブリダイズするプローブを作製し、被験者の試料から調製したｍＲＮＡとハイブリダイズさせた場合、当該変異を有する被験者の試料ではハイブリダイゼーションシグナルが観察されない。このようにして、被験者における当該変異を検出することができる。
　本発明者らの同定した変異以外のＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子の変異も、同様に変異に応じたプライマーやプローブを作製することによって、検出することができる。
　また、本発明者らの同定した変異の存在により、エクソン１３の欠損に加えてエクソン１４におけるフレームシフトが起こり、その結果ＴＭＥＭ１６Ｆの第３膜貫通ドメインをコードするエクソン１４内においてタンパク質の翻訳が終了する。よって、被験者における未成熟な変異型ＴＭＥＭ１６Ｆの発現を調べることによっても、当該変異の有無を調べることができる。
　変異型ＴＭＥＭ１６Ｆの発現は、ＴＭＥＭ１６Ｆを特異的に認識する抗体を用いて調べることができる。例えば、野性型ＴＭＥＭ１６Ｆと変異型ＴＭＥＭ１６Ｆの両方に共通するアミノ酸配列部分を抗原として、野生型ＴＭＥＭ１６Ｆと変異型ＴＭＥＭ１６Ｆの両方を認識する抗体を作製し、ウエスタンブロット法により被験者で発現するタンパク質のサイズを調べ、これを野性型ＴＭＥＭ１６Ｆのサイズと比較すればよい。あるいは、変異型ＴＭＥＭ１６Ｆに存在しない領域のアミノ酸配列部分を抗原として、野生型ＴＭＥＭ１６Ｆを認識するが変異型ＴＭＥＭ１６Ｆを認識しない抗体を作製し、被験者が当該抗体に認識されるタンパク質を有するか否かをウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、ドットブロット法により調べてもよい。
　本発明者らの同定した変異以外のＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子の変異も、変異が野生型ＴＭＥＭ１６Ｆと異なるアミノ酸配列を有する変異型ＴＭＥＭ１６Ｆをもたらす場合、同様にして検出することができる。
　本発明はまた、ＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子の変異を検出するためのプローブまたはプライマーとして使用される前記遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、Ｓｃｏｔｔ症候群の診断用組成物を提供する。本発明の診断用組成物は、上記診断方法に使用されるものである。
　ある態様において、本発明の診断用組成物は、以下のいずれかを含む：
（１）配列番号１の１１４２３位を含む領域に特異的にハイブリダイズする、プローブとして使用されるオリゴヌクレオチド；
（２）配列番号１の１１４２４～１１６４９位の配列に特異的にハイブリダイズする、プローブとして使用されるオリゴヌクレオチド；および
（３）配列番号１の配列に特異的にハイブリダイズし、かつ配列番号１の１１４２４～１１６４９位の全体または一部を含む領域を増幅するためのプライマーとして使用される、オリゴヌクレオチド。
　別の態様において、本発明の診断用組成物は、配列列番号２の配列に特異的にハイブリダイズし、かつ配列番号２の全体または一部を増幅するためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号２の１４０２－１６２７位の全体または一部を含む領域を増幅するものである。別の態様において、本発明の診断用組成物は、配列番号２の１４０２－１６２７位の配列に特異的にハイブリダイズする、プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドを含む。
　オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１または２の配列と特異的にハイブリダイズしうる限り前記配列に完全に相補的である必要はないが、好ましくは配列番号１または２の配列の一部に相補的である。本発明において「特異的にハイブリダイズする」とは、オリゴヌクレオチドのＴｍ値に基づきMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (2001)などの教示にしたがい決定されるストリンジェントな条件下（例えば、6×SSC、0.5%SDS、50% ホルムアミド中）で目的の配列にハイブリダイズすることを意味する。
　プライマーとして使用される場合、オリゴヌクレオチドは、通常１５～１００塩基、好ましくは１５～３０塩基、より好ましくは１８～２４塩基である。プローブとして使用される場合、オリゴヌクレオチドは、通常１０～１００塩基、好ましくは１０～５０塩基、より好ましくは１５～２５塩基である。オリゴヌクレオチドは、それが使用される方法に応じて、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、酵素、ビオチン等によって修飾されていてもよい。また、プローブとして使用される場合、固相、例えばガラス板、ナイロンメンブラン、マイクロビーズ、キャピラリー等に固定されていてもよい。
　別の態様において、本発明の診断用組成物は、ＴＭＥＭ１６Ｆを特異的に認識する抗体を含む。本発明の抗体は、ＴＭＥＭ１６Ｆの全体または一部を抗原として作製すればよく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。また、本発明の抗体には、Fab、F(ab')2、およびFvのような抗体断片も含まれる。抗体の作製方法は当業界にて周知である（例えば”Antibodies: A Laboratory Manual”, Lane, H. D. et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989を参照）。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
１．方法
（１）細胞株、組換タンパク質、抗体、血清
　マウスインターロイキン(IL-3)依存性Ba/F3細胞は、RPMI（10%ウシ胎児血清 (FCS, Gibco)、45ユニット/ml 組換マウスIL-3、および50μM β-メルカプトエタノール含有）中で維持した。Scott症候群患者およびその両親由来のEBV形質転換ヒト細胞株は、RPMI1640（10% FCS、および50μM β-メルカプトエタノール含有）中で増殖させた。ヒト293T細胞は、10% FCS含有DMEM中で培養した。Plat-E パッケージング細胞（非特許文献４２）は、10% FCS含有DMEM中で増殖させた。組換マウスIL-3は、既報のとおり（非特許文献４３）、マウスIL-3 cDNAを有するウシパピローマウイルス発現ベクターにより形質転換されたマウスC127I細胞により産生された。Flag標識マウスMFG-E8は、既報のとおり（非特許文献４４）、ヒト293T細胞において産生され、分泌型MFG-E8は抗Flag M2ビーズ(Sigma-Aldrich)を用いて精製した。
　Ca2+/Mg2+不含RPMI1640培地は、Cell Science & Technology Instituteより購入した。Ca2+不含RPMI培地は0.5 mM MgSO4を含有した。Ca2+不含FCSは、FCSを2日間PBSに対してバッファーを4回交換して透析することで調製した。
（２）Ca2+イオノフォアによる処理、フローサイトメトリー、および細胞ソーティング
　ホスファチジルセリン(PS)を細胞表面に露出させるため、96ウェルマイクロタイタープレート中の細胞 (2 x 105 細胞)をPBSで洗浄し、200 μlのHank's Balanced Salt Solution (HBSS, Gibco)に再懸濁し、A23187 (Sigma Aldrich)により37℃で15分間処理した。この細胞を氷上で15分間2500-5000倍に希釈したCy5標識アネキシンV (Biovision) （染色バッファー（10 mM Hepes-NaOHバッファー [pH7.4]、140 mM NaClおよび2.5 mM CaCl2含有）中）により5μg/mlのヨウ化プロピジウム(PI)の存在下で染色した。フローサイトメトリーをFACSAria (BD Bioscience)またはFACSCalibur (BD Bioscience)で行い、データをFlowJoソフトウェア (True Star)で解析した。
　Ca2+イオノフォア誘発PS露出に感受性のBa/F3細胞のサブラインは、FACSソーティングを繰り返すことで選択した。簡単に説明すると、2 x 107個のBa/F3細胞（HBSS中）を37℃で15分間A23187により処理し、これを事前に4℃に冷却した1 mlのアネキシンV染色バッファーに懸濁した。この細胞を前述のようにCy5-アネキシンVにより氷上で染色し、インジェクションチャンバーを4℃に維持したFACSAriaを用いてソーティングした。最も高いレベルのCy5蛍光シグナルを提供する細胞(上位0.5-5.0%)を回収し、1.0 x 105 細胞/mlよりも高い密度でCa2+不含RPMI（5% 透析FCS、45 ユニット/ml IL-3、および50μM β-メルカプトエタノール含有）に再懸濁した。24時間後、細胞を通常のCa2+含有RPMI培地に再懸濁し、次のソーティングのため増殖した。
（３）cDNAライブラリーの構築
　全RNAをBa/F3 PS19細胞からRNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いて調製し、ポリ(A) RNAをmRNA Purification Kit (GE Healthcare)によりオリゴ(dT)セルロースカラムクロマトグラフィーを2サイクル行って精製した。二本鎖cDNAをランダムなヘキサマーをプライマーとして用いてcDNA合成キット (SuperScriptTM Choice System for cDNA Synthesis, Invitrogen)により合成した。Bst XIアダプターを付加し、このフラグメントを1% アガロースゲル(SeakemR GTG agarose, Lonza)における電気泳動によってサイズに応じて分画した。2.5 kbよりも長いDNAフラグメントをゲルからDNA抽出キット (WizardR SV Gel and PCR Clean-up System, Promega)により回収し、Bst XI消化pMXsベクター（非特許文献４５）にライゲートした。大腸菌 DH10B細胞(ElectroMax DH10B; Invitrogen)をGene Pulser (Bio-Rad)を用いてエレクトロポレーションにより形質転換した。約9.3 x 105 個のクローンが産生され、プラスミドDNAをQIAfilter Plasmid Maxi Kit (Qiagen)により調製した。
（４）細胞融合
　Ba/F3-PS0細胞およびBa/F3-PS19細胞にpMXs-puro EGFPおよびpMXs-neo DsRedをそれぞれ導入し、1μg/mlのピューロマイシンまたは1 mg/mlのG418の存在下で培養した。Ba/F3-PS0 EGFP細胞とBa/F3-PS19 DsRed細胞をPEG1500の存在下で融合し、1μg/mlのピューロマイシンおよび1 mg/mlのG418の存在下で培養した。EGFP/DsRed二重陽性細胞をFACSAriaを用いてソーティングした。
（５）cDNAライブラリーのスクリーニング
　cDNAライブラリー由来のプラスミドDNA (108μg) を、FuGENE6 (Roche Diagnostics)を用いたリポフェクションにより、18枚の10 cmディッシュで増殖させた7.2 x 107 個のPLAT-E パッケージング細胞（非特許文献４２）に導入した。トランスフェクションの2日後、培養上清中のウイルスを6,000 x gで16時間遠心して4℃で遠沈させ、RPMI1640培地（10% FCS および45 ユニット/ml IL-3含有）に再懸濁し、これを使用して7.2 x 106 個のBa/F3細胞に8μg/mlのポリブレン (Sigma-Aldrich)の存在下で感染させた。24時間培養した後、培地を新鮮培地と置き換え、細胞をさらに2時間培養した。イオノフォア誘発PS露出に感受性の細胞のソーティングは、前述のとおり行った。
（６）アネキシンV陽性Ba/F3細胞からのcDNAフラグメントの単離
　レトロウイルスベクターに組み込まれたcDNAを単離するため、Ba/F3形質転換細胞からWizardR Genomic DNA Purification System (Promega)を用いてゲノムDNAを抽出し、Expand Long Template PCR System (Roche Diagnostics)を用いてPCRにかけた。PCR プライマー (5'-CCCGGGGGTGGACCATCCTCT-3' （配列番号６）および5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAAT-3' （配列番号７）)はpMXsベクター由来の配列を有しており、PCRの条件は、96℃10秒、58℃30秒、および68℃4分、35サイクルであった。PCRフラグメントをpGEM-T Easy vector (Promega)にクローニングし、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)を使用してDNA配列解析を行った。
（７）SCRαおよびその変異体のための発現ベクター
　Flag標識配列をレトロウイルスベクターpMXs-puroのEco RI部位とXho I部位に組み込み、pMXs-puro c-Flagを得た。マウス(m)TMEM16Fの完全長コード配列 (GenBank NM_175344) およびヒト(h)TMEM16Fの完全長コード配列(GenBank NM_001025356)を、(mTMEM16Fにつき)Ba/F3細胞または(hTMEM16Fにつき)Namalwa細胞由来のmRNAを用いてRT-PCRにより調製した。使用したプライマーは以下である(各プライマーにおいて、Eco RI認識部位を下線で示す。)：
mTMEM16F, 5'-ATATGAATTCGACATGCAGATGATGACTAGGAA-3' （配列番号８）および5'-ATATGAATTCGACATGCAGATGATGACTAGGAA-3' （配列番号９）；
hTMEM16F, 5'-ATATGAATTCGACATGAAAAAGATGAGCAGGAA-3' （配列番号１０）および5'-ATATGAATTCTTCTGATTTTGGCCGTAAAT-3' （配列番号１１）。
　PCR フラグメントをpMXs-puro c-FlagのEco RI部位に挿入し、cDNAの信頼性をDNA配列決定により検証した。
　発現プラスミドSCRα-mRFPのため、pcDNA-mRFP (Invitrogen)中のmRFPのコード配列をマウスTMEM16FのC末にフレームをあわせて結合し、pMXsベクターに導入した。
（８）マウスBa/F3細胞およびヒト293T細胞における発現
　Flag標識SCRαのためのpMXs-puroにおける発現ベクターをPlatE細胞に導入した。産生されたレトロウイルスを前述のように濃縮し、Ba/F3に感染させ安定な形質転換体を樹立するために使用した。ピューロマイシン (1.0μg/ml)を含む培地中で細胞を培養することで形質転換体を選択した。SCRα-mRFPを発現させるため、ヒト293T細胞にFuGENE6を用いたリポフェクションによりSCRα-mRFP配列を有するpMXsベクターを導入した。一日後、導入細胞を蛍光顕微鏡(BioRevo BZ-9000, Keyence)により観察した。
（９）ウェスタンブロッティング
　細胞をRIPAバッファー (50 mM Hepes-NaOH バッファー [pH 8.0]、1% NP-40、0.1% SDS、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、150 mM NaCl、および10% プロテアーゼインヒビターカクテル [Complete Mini, Roche Diagnostics]含有)に溶解した。溶解物を5 x SDS サンプルバッファー [200 mM Tris-HCl (pH 6.8)、10% SDS、25% グリセロール、0.5% β-メルカプトエタノール、および0.05% ブロモフェノールブルー]と混合し、5分間煮沸し、10% ポリアクリルアミドゲル (Bio Craft)における電気泳動により分離した。タンパク質をPVDFメンブレン (Millipore)に転写した後、メンブレンにHRP結合マウス抗FLAG M2 (Sigma)を結合させ、ペルオキシダーゼ活性をWestern LightningR-ECL system (PerkinElmer)により検出した。
（１０）SCRα cDNAのRT-PCRおよびScott症候群患者におけるSCRα染色体遺伝子の配列決定
　Scott患者およびその両親、並びに健常人対照に由来するEBV形質転換細胞株から全RNAを調製した。このRNAをSuperscript III (Invitrogen)を用いて製造元のプロトコールにしたがい逆転写し、SCRα cDNAを以下のプライマーセットを用いたPCRにより解析した (各プライマーにおいて、付加的な制限酵素部位を含む配列を下線で示す。)：
Ex1-FW (5'-ATATGAATTCGACATGAAAAAGATGAGCAGGAA-3') （配列番号１２）およびEx11/12-RV (5'-GCGTTCTTCTTCCTGAGTAA-3') （配列番号１３）; 
Ex11/12-FW (5'-TTACTCAGGAAGAAGAACGC -3') （配列番号１４） および
Ex20-RV (5'-ATATGAATTCTTCTGATTTTGGCCGTAAAAT-3') （配列番号１５）; 
Ex12-FW (5'- TCTGTGCCAGTGCTGTCTTT-3') （配列番号１６）およびEx16-RV (5'- CTGCAGATGGTAGTCCTGTT-3') （配列番号１７）。
　ヒトSCRα染色体遺伝子の配列解析のため、ゲノムDNAをヒト細胞株から調製し、226-bpのエクソン13およびその5'-および3'-フランキング領域(各々約370-bp)を有する964-bpのDNAフラグメントを以下のプライマーを用いてPCRにより増幅した：5'-CCAGAGTATGCTACTAGTTG-3' （配列番号１８） および5'-TCTCAGCAACCGAGGAACAT-3' （配列番号１９）。PCR産物をWizardR SV PCRおよびGel Clean-up Systemにより精製した。BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kitを用いてプライマー 5'-ACATATGTGGATGCGCCTTC-3' （配列番号２０）によりサイクルシークエンシングを行い、ABI PRIZM 3100 Genetic Analyzerにより解析した。
（１１）PSおよびPEの露出の解析
　PSおよびPEの露出を解析するため、初期指数増殖期の細胞 (1. 0 x 105) をPBSで洗浄し、1.0 mlの冷アネキシンV染色バッファーに2500-5000倍希釈のCy5標識アネキシンVまたは800倍希釈のビオチン-Ro09-0198（非特許文献２６）とともに懸濁し、次いで1.0μg/ml APC標識ストレプトアビジン、および5μg/ml PIを加えた。サンプルを氷上で15分間インキュベートし、FACSAriaまたはFACSCaliburにより前述のとおりフローサイトメトリーを行った。MFG-E8の結合のため、細胞を10% FCS含有RPMI1640に懸濁し、氷上で20分間0.4μg/ml のFlag標識MFG-E8 D89E変異体（非特許文献４４）とインキュベートした。細胞を上記培地で洗浄し、氷上で20分間1.0μg/mlのマウスMFG-E8に対するハムスターモノクローナル抗体（mAb） (クローン2422)とインキュベートし、次いでPE標識マウス抗ハムスターIgG (BD Bioscience)とともにインキュベートし、FACSAriaを用いたフローサイトメトリーにより解析した。
　細胞内Ca2+の必要性を調べるため、細胞(1.0 x 105 細胞) を10μMのBAPTA-AM（10% FCS含有RPMI1640培地中）と37℃でPS露出のため5分間またはPE露出のため60分間インキュベートした。この細胞をアネキシンV染色バッファーで洗浄し、Cy5-アネキシンVまたはビオチン-Ro09-0198で前述のとおり染色した。
　Ca2+誘発PS露出および同PE露出の速度論研究のため、細胞 (1.0 x 106 細胞) をPBSで洗浄し、1.0 mlの冷アネキシンV染色バッファーに、Cy5標識アネキシンVまたはビオチン-Ro09-0198とAPC標識ストレプトアビジンの混合物、および5μg/ml PIともに懸濁した。細胞を氷上でA23187と最終濃度0.25または0.5μMで混合し、20℃(Ba/F3細胞)または37℃(ヒト細胞株)に設定したFACSAriaのインジェクションチャンバーにアプライし、A23187反応を誘導した。データを表示の期間記録し、PI陽性細胞を解析から除いた。
（１２）NBD-PCおよびNBD-SMの取り込み
　NBD脂質アナログの取り込みは、基本的にWilliamsonら（非特許文献１７）が記載するようにフローサイトメトリーにより解析した。簡単に説明すると、細胞 (106 細胞)をHBSSで洗浄し、0.5 mlの HBSS （2 mM CaCl2含有）に再懸濁した。等量のHBSS （2 mM CaCl2 および1μM 1-オレオイル-2-{6-[(7-ニトロ-2-1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル)アミノ]ヘキサノイル}-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (NBD-PC)、または1-オレオイル-2-{6-[(7-ニトロ-2-1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル)アミノ]ヘキサノイル}-スフィンゴシン-1-ホスホコリン (NBD-SM) (Avanti Polar Lipids) 含有）を細胞懸濁液に添加し、室温でインキュベートした。各時点で、150μlの細胞懸濁液を回収し、150μlの冷却済 (4℃) HBSS （5 mg/ml 脂肪酸不含BSA (Sigma-Aldrich) （取り込まれなかった蛍光脂質を抽出するため）および500 nM Sytoxblue (Molecular Probes)含有）と混合した。全蛍光量を測定するため、サンプルをBSA非存在下でHBSSと混合した。10分間4℃でインキュベートして脂質を抽出した後、細胞をFACSAriaにより、前方散乱、側方散乱、対数緑色蛍光 (NBD)、およびSytoxblue蛍光について解析した。Sytoxblue陽性の死細胞は解析から除いた。データは、FlowJo Software (Tree Star)により解析した。BSA抽出に抵抗性のNBDリン脂質の蛍光を、細胞に取り込まれたものと評価した。
　Ca2+イオノフォアの効果を調べるため、細胞 (5 x 105 細胞)をHBSSで洗浄し、0.5 mlの冷HBSS（2 mM CaCl2含有）に再懸濁し、氷上で7分間インキュベートした。冷HBSS (0.5 ml) （0.2μM NBD-PCまたはNBD-SM含有）を細胞懸濁液に添加し、氷上でさらに3分間インキュベートした。この細胞を次いでA23187と混合し、室温でインキュベートして脂質取り込みを誘導した。150μlのアリコートを用いて、前述のように取り込まれた脂質の量を測定した。
（１３）薄層クロマトグラフィー
　細胞をNBD標識PCとインキュベートした後、クロロホルムとメタノールの混合物 (2:1, v/v)により、リン脂質を細胞から抽出した。このリン脂質をシリカゲル60プレート (Merck)における薄層クロマトグラフィーにより、クロロホルム/アセトン/メタノール/酢酸/水 (体積比5:2:1:1:0.5) を溶媒として用いて分離した。プレート上の蛍光はLAS4000 イメージアナライザー (Fuji Film)により検出した。
（１４）細胞内Ca2+およびCa2+流入
　細胞内Ca2+濃度を測定するため、細胞 (1.0 x 106 細胞) をHBSSに懸濁し、37℃で10分間、0.4μM Fluo-4-AM (Molecular Probes)とともにインキュベートし、HBSSで洗浄し、そしてFACSAriaにより解析した。
　Ca2+流入は、既報のとおり測定した（非特許文献４６）。簡単に説明すると、細胞(1.0 x 106) をFluo-4-AM (1μM) （10% FCS含有RPMI中）により30分間37℃で標識した。アネキシンV染色バッファーで洗浄した後、細胞をアネキシンV染色バッファーに懸濁し、4℃で維持した。この混合物にCa2+イオノフォアA23187を最終濃度0.5μMで添加し、平均蛍光強度(MFI)における変化をFACSCalibur システムを用いて直接記録した。データはFlowJo Softwareにより解析した。
（１５）shRNA
　ピューロマイシン耐性遺伝子を有するpRS shRNAベクターにおけるマウスSCRαのためのshRNA発現プラスミドは、OriGeneから購入した。このSCRαに対するshRNAの標的配列は5'-CATCTACTCTGTGAAGTTCTTCATTTCCT-3'（配列番号２１）であった。pRSにおけるスクランブルな無効のshRNAはOriGeneから購入した。Ba/F3細胞にshRNAを含むレトロウイルスを感染させ、1.0μg/mlのピューロマイシンの存在下で培養した。ピューロマイシン耐性細胞を限界希釈によるクローニングに供した。SCRα mRNA をリアルタイムPCRにより定量し、SCRαの発現減少を示したクローンを以降の実験に使用した。
２．結果
（１）構成的にPSを発現するマウスBa/F3細胞の樹立
　Ca2+イオノフォアで細胞を処置すると、PS露出を起こさせることができる。本発明者らは、このプロセスがマウスB細胞株であるBa/F3において低Ca2+条件下で可逆的に生じることを見出した。すなわち、Ba/F3細胞をCa2+イオノフォアであるA23187（1.0μM）により15分間0.5 mM CaCl2の存在下で処理すると、細胞がネクローシスを起こすか、破裂するか、またはヨウ化プロピジウム（PI）陽性となった。しかしながら、同じ処理をCa2+非存在条件下で行うと、大部分の細胞がPSを露出するかアネキシンV陽性となり、またPI陽性集団は少なかった（図１ａ）。細胞内Ca2+をBAPTA-AM (O,O'-ビス(2-アミノフェニル)エチレングリコール- N,N,N',N'-四酢酸、テトラアセトキシメチルエステル)でキレートすると、PS露出が阻害され（図１ｂ）、このことはPS露出のプロセスが細胞内カルシウムの移動を必要とすることを示唆する。このPS露出は37℃で少なくとも5分間（図１ｃ）、またはA23187の除去後4℃で数時間（データ非提示）、継続した。PS露出細胞をBAPTA-AMにより37℃で5分間処理する（図１ｃ）か、あるいはCa2+不含培地において37℃で12時間培養する（データ非提示）と、細胞表面からPSが除去された。これらの結果は、低Ca2+条件下において、A23187が細胞内Ca2+を移動させ、それによりリン脂質スクランブレースが活性化され、PSが露出されたことを示唆する。細胞内Ca2+濃度が減少すると、リン脂質スクランブレースは活性を消失し、フリッパーゼによりPSが内葉に戻った。
　PS露出プロセスを明らかにするため、本発明者らは、低Ca2+条件下のPS露出の可逆的性質を利用して、PSを過剰露出した細胞株を樹立した。マウスBa/F3細胞を1.0μM A23187により添加カルシウム非存在下において処理し、PS露出に基づくFACSソーティングにかけた。強いアネキシンV染色を示す集団 (0.5-5%)を回収し、15時間Ca2+不含培地中で培養し、次いで通常培地に戻した。このソーティングと増殖のサイクルを12回繰り返した後、選択された細胞 (Ba/F3-PS12)は、より低い濃度(125 nM)のA23187による処理でも元のBa/F3細胞 (Ba/F3-PS0)より約100倍高いアネキシンVによる平均染色を示した（図１ｄ）。このソーティングと増殖をさらに7回繰り返し、得られた細胞株 (Ba/F3-PS19)を以下の実験に使用した。
　Ba/F3-PS19における強いPS露出の原因には2つの可能性があった。1つはリン脂質スクランブレースの過剰発現または過活性化であり、もう1つはフリッパーゼの不活性化であった。いずれの可能性が正しいのか調べるため、DsRed発現Ba/F3-PS19をGFP標識親Ba/F3 (Ba/F3-PS0) 細胞と融合した。このハイブリッド細胞の1.0μM A23187に対するPS露出応答は、Ba/F3-PS19と同様か、あるいはわずかに低く（図１ｅ）、このことはBa/F3-PS19の表現型がBa/F3-PS0の表現型より優勢であること、およびリン脂質スクランブレースがBa/F3-PS19において過活性化されていることを示唆する。この明らかに増強されたリン脂質スクランブレース活性に関与する遺伝子（「スクランブレースα」(SCRα)と称する）を同定するため、レトロウイルスベクターにおけるcDNAライブラリー (9.3 x 105 個の独立クローン) をBa/F3-PS19から調製し、親Ba/F3細胞に導入した。安定な形質細胞を125 nM A23187で処理し、アネキシンVにより強く染色された集団（約0.6%）をソーティングし、増殖した（図１ｆ）。ソーティングと増殖の3回目のサイクル (ライブラリー由来 (LD)-PS3)において、約35%の細胞が構成的に（すなわち、A23187処理なしで）PSを露出し、この細胞集団(LD-PS4)をさらなる特徴決定のため増殖した。
（２）SCRαの分子クローニングおよびPS露出に対するその効果
　LD-PS4細胞には2-3の異なるcDNAが組み込まれていたが、TMEM16F cDNAは2つの独立した実験（独立したcDNAライブラリーによる形質転換およびFACSソーティング）において存在し、このことからTMEM16FがSCRαであることが示唆された。異なる実験で同定された2つのSCRαcDNAは、異なる5'末端を有していたにも関わらず、第2の細胞内ループに位置するコドン409のアスパラギン酸をグリシンに置換するヌクレオチド1226のAからGへの移行変異をいずれも有していた（図２ａ）。
　最近、TMEM16ファミリーの別のメンバーであるTMEM16AがCa2+依存的Cl-チャンネルであることが示された（非特許文献１９－２１）。しかしながら、TMEM16FのCl-チャンネル活性はTMEM16Aと比較して非常に低かった（非特許文献２２）。SCRαの機能を調べるため、SCRαの野生型フォームおよび変異(D409G)型フォームのC末端にFlagまたはmRFPを付加し、Ba/F3細胞またはヒト293T細胞において発現させた。Ba/F3細胞由来の細胞溶解物の抗Flag抗体によるウェスタンブロッティングによって、SDS-PAGEにおいて125 kDaと500 kDaに幅の広いバンドが示され（図２ｂ）、マウスSCRα(計算分子量106,000)がグリコシル化されており、加えて／あるいは、凝集していることが示唆された。SCRα-mRFPキメラタンパク質を発現する293T細胞の観察により、SCRαが細胞膜に存在することが示唆された（図２ｃ）。
　アネキシンVは、D409G変異体を発現するBa/F3細胞には結合したが、野生型SCRαを発現するBa/F3細胞には結合せず（図２ｄ）、SCRα変異体を発現する細胞が構成的にPSを露出していることが示唆された。このことは、ホスファチジルセリンに特異的に結合するMFG-E8（ラクトアドヘリン）（非特許文献２３、２４）がD409G変異体発現細胞に結合したことにより確認された（図６）。細胞内Ca2+をBAPTA-AMによりキレートすると、SCRα変異体発現細胞における露出PSのレベルが減少した（図２ｄ）。野生型SCRαを発現する細胞をA23187で処理すると、PSが遅滞なく露出し、ベクターで形質転換したBa/F3よりも迅速に飽和レベルに到達した（図２ｅ）。Fluo-4-AM染色により決定された細胞内Ca2+濃度は、ベクター、野生型SCRα、およびD409G変異体SCRα発現細胞の間で類似していた(図２ｆ）。A23187処理後のCa2+流入速度は、ベクター導入細胞とSCRα導入細胞とで差がなかった（図２ｇ）。これらの結果は、SCRαがPSのためのCa2+依存的スクランブレース活性を仲介すること、および、そのD409G変異体が正常な細胞内Ca2+濃度にさえも反応しPS露出を起こさせることを示唆する。
（３）PE、PC、およびSMのスクランブリングに対するSCRαの効果
　リン脂質スクランブレースは、頭部基に関する特異性なく、あらゆるリン脂質の細胞膜葉間の2方向性の輸送を仲介する。SCRαがこの性質を有するかを調べるため、D409G変異体SCRαを発現する細胞を、Ca2+依存的にPEに特異的に結合する四環性ポリペプチドであるRo09-0198 (RO)（非特許文献２５、２６）で染色した。図３ａに示すように、この変異体を発現する細胞はROにより染色され、PSのように通常は内葉に隔離されているリン脂質であるPEを構成的に露出していることが示唆された。Ba/F3のA23187による処理もまた、PS露出を起こさせた。このプロセスは、野生型SCRαを過剰発現させることにより促進された（図３ｂ）。
　前述のとおり、リン脂質スクランブレースはリン脂質の2方向性の輸送を仲介するはずである。1-オレオイル-2-[6-[(7-ニトロ-2-1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル)アミノ]ドデカノイル]-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (NBD-PC)を培養物に添加すると、D409G変異体発現細胞に迅速に取り込まれた（図３ｃ）。すなわち、細胞に結合したNBD-PCのうち、40%を超えるNBD-PCが6分以内にBSA抽出に対して抵抗性となった。野生型SCRαを過剰発現する細胞をA23187で処理すると、これら細胞は親細胞よりも速くNBD-PCを取り込み、細胞に結合したNBD-PCの約25%が4分以内に細胞内に観察された（図３ｄ）。取り込まれたNBD-PCは細胞内で無傷であり（図７）、その取り込みが細胞内における迅速なNBD-PCの分解によるものでないことが示唆された。同様の結果、すなわち、変異体SCRα発現細胞による構成的取り込みと、野生型SCRα発現細胞による増強されたA23817誘発取り込みが、NBD-SMについて得られた（図３ｅおよび３ｆ）。これら結果から、SCRαがCa2+依存的に様々なリン脂質の細胞膜外葉から内葉への内向きの輸送を仲介しうることが示唆された。
　リン脂質のスクランブリングにおける内因性の細胞SCRαの役割を確認するため、マウスSCRα特異的shRNA発現プラスミドを野生型Ba/F3細胞に導入することにより、内因性SCRαの発現をノックダウンした。図４ａおよび図８に示すように、リアルタイムPCRで評価した5つの形質転換体におけるSCRαmRNAの発現レベルは、対照のshRNAを発現する細胞の発現レベルの20-35%に減少した。1.0 μMのA23187の15分間の処理により誘導されるこれら形質転換体のPS露出は、対照のshRNAにより形質転換されたBa/F3と比較してそれほど顕著ではなかった。アネキシンVとRo09-0198の結合により検出されるPSおよびPEのA23817誘導露出の割合は、SCRαノックダウン細胞において減少した（図４ｂおよび４ｃ）。同様に、NBD-PCとNBD-SMの取り込みは、shRNA形質転換細胞の方が低かった（図４ｄおよび４ｅ）。
（４）Scott症候群の患者におけるSCRαのスプライスサイト変異
　Scott症候群の患者から得た血小板および他の血液細胞は、Ca2+イオノフォアに応答してPSを露出する能力に欠ける（非特許文献２７）。Kojimaら（非特許文献２８）は、Scott症候群患者および患者の両親から、EBV形質転換B細胞株を樹立した。先の報告（非特許文献１７、２８）と一致して、患者由来の細胞はCa2+イオノフォアに応答してPSを露出しなかった（図５ａ）。これに対して、患者の両親由来の細胞株では、A23187は無関係な健常ボランティア由来の細胞株と同じレベルでPS露出を誘導した。患者のSCRα遺伝子の欠損を調べるため、患者および両親からRNAを調製し、SCRαmRNAを、5’側半分 (エクソン1-12に相当)と3’側半分(エクソン11-20)の2つの部分においてPCRにより解析した。5’側半分の1320-bpのDNAフラグメントは患者と両親で同一であったが、患者由来の3’側半分のフラグメントは両親のフラグメントより短かった（図５ｂ）。DNA配列解析により、患者のcDNAはエクソン13に相当する226-bpの配列が欠けていることが示唆された。染色体DNAの直接配列決定により、患者のSCRα遺伝子はイントロン12におけるコンセンサススプライスアクセプターサイトにGからTへのホモ接合性の変異を有するが、両親はこの位置の変異がヘテロ接合性であることが示唆された（図５ｃ）。エクソン12および16に結合するように設計されたプライマーを用いたSCRαmRNAのPCR解析により、対照の細胞株からは608-bpのバンドが、Scott症候群の患者の細胞株からは382-bpのバンドが示され（図５ｄ）、スプライスアクセプターサイトの変異によってエクソン13がスキップされたことが示唆された。このスキッピングは、フレームシフトを生じさせ、その結果ヒトSCRαの第3の膜貫通部分（図５ｆ）をコードするはずのエクソン14においてタンパク質が未成熟に終結する（図５ｅ）。患者の両親においてエクソン13欠損型のSCRαmRNAの濃度が低いこと（図５ｄ）は、ナンセンス変異によるmRNAの減衰（非特許文献２９）により説明できる可能性がある。
　以上のとおり、ＴＭＥＭ１６Ｆ（ＳＣＲα）が細胞膜におけるリン脂質の分布を制御するリン脂質スクランブレースであること、およびＴＭＥＭ１６Ｆが血小板表面へのＰＳの移動障害を原因とする出血性疾患であるＳｃｏｔｔ症候群の原因遺伝子であることが明らかとなった。よって、ＴＭＥＭ１６Ｆは血液凝固調節物質の新規ターゲットとして有用である。
　以下の文献は引用により本明細書に含まれる。
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Claims (17)

  1. 血液凝固調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
    （１）ＴＭＥＭ１６Ｆ発現細胞と血液凝固調節物質の候補物質とを接触させる工程、および
    （２）該細胞の表面におけるホスファチジルセリンの露出を変化させる候補物質を選択する工程、
    　ここで、ホスファチジルセリンの露出を増加させる候補物質が血液凝固促進物質として選択され、ホスファチジルセリンの露出を減少させる候補物質が血液凝固阻害物質として選択される。
  2. 工程（２）が、該細胞に対するアネキシンＶまたはＭＦＧ－Ｅ８の結合を調べることにより行われる、請求項１記載の方法。
  3. 工程（２）が、血液凝固反応を調べることにより行われる、請求項１記載の方法。
  4. 血液凝固調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
    （１）ＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子を有する細胞と血液凝固調節物質の候補物質とを接触させる工程、および
    （２）該細胞におけるＴＭＥＭ１６Ｆの発現を変化させる候補物質を選択する工程、
    　ここで、ＴＭＥＭ１６Ｆの発現を増加させる候補物質が血液凝固促進物質として選択され、ＴＭＥＭ１６Ｆの発現を減少させる候補物質が血液凝固阻害物質として選択される。
  5. ＴＭＥＭ１６Ｆの機能を亢進する物質を有効成分として含有する、血液凝固促進用組成物。
  6. ＴＭＥＭ１６Ｆの機能を抑制する物質を有効成分として含有する、血液凝固阻害用組成物。
  7. ＴＭＥＭ１６Ｆの機能を亢進する物質を対象に投与することを含む、血液凝固を促進する方法。
  8. ＴＭＥＭ１６Ｆの機能を抑制する物質を対象に投与することを含む、血液凝固を阻害する方法。
  9. ＴＭＥＭ１６Ｆの機能を調節する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
    （１）ＴＭＥＭ１６Ｆ発現細胞とＴＭＥＭ１６Ｆの機能を調節する物質の候補物質とを接触させる工程、および
    （２）該細胞の表面におけるホスファチジルセリンの露出を変化させる候補物質を選択する工程、
    　ここで、ホスファチジルセリンの露出を増加させる候補物質がＴＭＥＭ１６Ｆの機能を亢進する物質として選択され、ホスファチジルセリンの露出を減少させる候補物質がＴＭＥＭ１６Ｆの機能を抑制する物質として選択される。
  10. ＴＭＥＭ１６Ｆの機能を調節する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
    （１）ＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子を有する細胞とＴＭＥＭ１６Ｆの機能を調節する物質の候補物質とを接触させる工程、
    （２）該細胞におけるＴＭＥＭ１６Ｆの発現を変化させる候補物質を選択する工程、
    　ここで、ＴＭＥＭ１６Ｆの発現を増加させる候補物質がＴＭＥＭ１６Ｆの機能を亢進する物質として選択され、ＴＭＥＭ１６Ｆの発現を減少させる候補物質がＴＭＥＭ１６Ｆの機能を抑制する物質として選択される。
  11. 被験者のＳｃｏｔｔ症候群の素因を調べる方法であって、該被験者がＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子に変異を有するかを調べることを含む方法。
  12. 被験者から採取された試料から調製されたゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡにおける変異の存在を調べる、請求項１１記載の方法。
  13. 被験者から採取された試料における変異型ＴＭＥＭ１６Ｆの発現を調べる、請求項１１記載の方法。
  14. ＴＭＥＭ１６Ｆをコードする遺伝子の変異を検出するためのプローブまたはプライマーとして使用される該遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、Ｓｃｏｔｔ症候群の診断用組成物。
  15. 配列番号２の配列に特異的にハイブリダイズし、かつ配列番号２の全体または一部を増幅するためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１４記載の組成物。
  16. オリゴヌクレオチドが配列番号２の配列の一部に相補的である、請求項１５記載の組成物。
  17. ＴＭＥＭ１６Ｆを特異的に認識する抗体を含む、Ｓｃｏｔｔ症候群の診断用組成物。
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