WO2012010721A1 - Andamio macroporoso cerámico puro basado en apatita nanocristalina, método de preparación y aplicaciones - Google Patents

Andamio macroporoso cerámico puro basado en apatita nanocristalina, método de preparación y aplicaciones Download PDF

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Maria Vallet Regi
Daniel Arcos Navarrete
Alejandro BAEZA GARCÍA
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Definitions

  • the present invention falls within the technical field of manufacturing materials for bone tissue regeneration. More specifically, the invention relates to a bioactive, biocompatible and biodegradable, macroporous, scaffold with controlled and orderly three-dimensional porosity, as well as to its method of preparation through the rapid prototyping technique.
  • scaffolding refers to artificial structures capable of supporting the growth of living tissues in three dimensions. These are porous materials on which bone cells will be placed and act as scaffolds or molds. With the appropriate physiological conditions, it is achieved that the cells produce or regenerate the new bone tissue so that, as the scaffold degrades, it is replaced by the new bone structure. It is considered as an ideal scaffold or mold that is highly porous, without toxicity and biodegradable, but strong enough to withstand the structural load of the bone that has to replace it.
  • Scaffolds intended to act as implants for bone regeneration must meet certain requirements that include: mechanical properties similar to those of the bone site to be repaired, biocompatibility with bone tissue and biodegradability.
  • macroporosity Among the parameters that most influence mechanical properties, biocompatibility and bioabsorption of scaffolds are macroporosity, chemical composition and crystallinity.
  • the specific conditions of macroporosity, chemical composition and crystallinity that optimize the osteogenic qualities of a scaffold are the following:
  • the scaffold must have a high porosity (including an adequate pore size) that allows the colonization of the implanted material by the cells, their migration, and the diffusion and transport of nutrients and waste products inside and outside the piece. implanted For the colonization process to occur by neoformed bone tissue it is necessary that the pores have a size greater than 200 ⁇ . Likewise, the scaffold should favor the anchoring of the cells on its surface and be biocompatible to prevent the inflammatory response, promoting a good integration with the host tissue.
  • the scaffold must consist of materials suitable for osteogenic function.
  • the materials used for the regeneration of bone tissue include both synthetic and natural ceramic inorganic materials, such as hydroxyapatite and tricalcium phosphate, since these ceramics have characteristics very similar to the biological hydroxyapatite that makes up the natural bone, that is, they have a nanocrystalline character They are not stoichiometric, they are deficient in calcium and are capable of incorporating different ions depending on the nature of the reagents and the medium, and they are also characterized as biocompatible, bioactive and osteoconductive materials.
  • the ceramics that make up the scaffold must have a nanocrystalline character to resemble, as much as possible, the biological hydroxyapatite.
  • the nanocrystalline character enhances the bioactivity and biocompatibility of ceramics and induces a faster reaction rate [T. Traykova, C. Aparicio, MP Geneva, JA Planell, Nanomedicine, 2006, 1, 91; YF Chou, I. Wulur, JCY Duna, BJ Wu. Handbook of nanostructured biomaterials and their applications in nanobiotechnology. Ed HS Nalwa, American Scientific Publishers, Stevenson Collins, 2005, vol 2, pp 197-222; B. Ben-Nissan. MRS Bull, 2004, 29, 28; YF Chou, W. Huang, JCY Duna, TA Millar, BM Wu. Biomaterials, 2005, 26, 285].
  • a nanocrystalline material is a material comprised of many crystals, most of which have one or more dimensions of the order of 100 nm or less (normally, without presenting micrometric size crystals or an intergranular amorphous phase) [Sergey V. Dorozhkin, Nanodimensional and Nanocrystalline Apatites and Other Calcium Orthophosphates in Biomedical Engineering, Biology and Medicine, Materials 2009, 2, 1975-2045].
  • all ceramics comprised of many crystals are considered nanocrystalline where none of the dimensions of said crystals exceeds 50 nm (as this is, as a rule, the size maximum that apatite nanocrystals present in vertebrate bones).
  • a final parameter to take into account in the scaffolding is the morphology of the ceramic crystals that make up the scaffold.
  • the crystals of the biological apatite that make up the bone of the vertebrates have acicular morphology, therefore, one of the characteristics required in the scaffolds destined to act as implants for bone regeneration will be the acicular morphology of the crystals of the apatite that constitutes said scaffold.
  • the manufacture of scaffolds consisting exclusively of ceramics that is, scaffolds that do not include a polymer fraction
  • pure ceramic scaffolds are of great interest in the sector of the technique described.
  • the manufacture of pure ceramic scaffolding using the rapid prototyping technique is usually done by previously generating a sacrificial polymer mold that acts as a negative for the piece to be manufactured. Subsequently, the mold is filled with an aqueous suspension of the ceramic and the mold is removed by pyrolysis at temperatures of more than 1000 ° C [example description, Chu, G. et al., Hydroxyapatite implants with designed infernal architecture, j. Mater. Sci .: Mater. Med, 12, 2001, 471-478].
  • the main disadvantage of this technique is the poor control over the microporosity of the final material, since it can be altered in the process of calcination to remove the mold.
  • Another important disadvantage is the possible appearance of toxic elements as by-products in the polymer mold removal process.
  • the set of rapid prototyping techniques to design and control three-dimensional (3D) macroporosity of implantable scaffolds of polymeric origin are widely developed [Wai-Yee Yeong et al., Trends in Biotechnology, 643, 22, 2004; Peltola et al., Armáis Medicine, 40, 268, 2008].
  • a second strategy used to obtain pure ceramic scaffolding by rapid prototyping requires incorporating the ceramic particles into a soluble or fusible polymer matrix, subsequent setting of the polymer, calcination of the organic matter and final sintering of the scaffolding to provide it with consistency.
  • this strategy there are several methods described for the manufacture of 3D scaffolding with application in bone regeneration.
  • US 2004/0191292 Al refers to the preparation of 3D scaffolds for bone tissue regeneration, based on microparticles composed of Si, Ca and P vehiculized in an organic polymer matrix, where the proportion of the latter varies between 20% and 80% of the total mass of the scaffolding.
  • US 2008 / 0103227A1 patent refers to the preparation of porous materials with hierarchical structure, which involves the preparation of a ceramic paste applied to a scaffold of polymeric origin, for example polyurethanes.
  • US 2001/0016353 Al refers to the preparation of scaffolds composed of resorbable ceramics by means of a replication method. This procedure involves impregnating organic textile structures with ceramic precursors, requiring subsequent sintering to form the ceramic scaffold.
  • US Patent 6,283, 997B1 refers to the preparation of ceramic and ceramic / polymer structures where the polymer fraction is photocurable and subsequently removed by heat treatment, applying stereolithography techniques.
  • scaffolds manufactured by the method of the invention combine the excellent biocompatibility of hydroxyapatite, with the improvement of bioactivity due to the presence of silicon, which plays an important role in the process of bone formation and mineralization and, by Finally, the nanocrystalline structure of the material, more in line with the tissue where it is intended to be implanted.
  • the control over macroporosity that is achieved using the rapid prototyping technique and the possibility of designing custom pieces for each situation, make the present invention an excellent alternative to current methods.
  • the present invention describes a pure ceramic three-dimensional scaffold, of nanocrystalline, bioactive, biocompatible and biodegradable ceramic in which the ceramic comprises unsubstituted apatite or silicon substituted apatite.
  • the Scaffolding ceramic of the present invention comprises a compound of formula: Ca 10 (PO 4 ) 6- x (SiO 4 ) x (OH) 2-x , where 0 ⁇ x ⁇ 0.5.
  • the scaffolding of the present invention is more appropriate for the tissue where it is intended to be implanted (bone) than the previous scaffolds that have been prepared so far.
  • the average glass size of the ceramic composing the scaffold of the present invention is less than 50 nm. More specifically, the average glass size of the ceramic composing the scaffold of the present invention is within the range between 10 nm and 30 nm.
  • the morphology of the ceramic crystal that composes the scaffolding of the present invention is acicular, thus resembling that of the bone mineral component.
  • the average length of said ceramic glass of the invention is between 15 and 50 nm and the average width between 5 and 10 nm.
  • the scaffold of the present invention has a porosity with three-dimensional cross-linking, the volume of porosity of the scaffold is 35% or more and the thickness of the wall thereof is greater than 600 ⁇ .
  • the scaffolding of the present invention has a maximum tension value prior to fracture between 0.556 and 1.06
  • the scaffolding of the present invention combines the excellent biocompatibility of apatite, with the improvement of bioactivity due to the presence of silicon, with the nanocrystalline structure of ceramics, suitable for the tissue where it is intended to be implanted, and with the control over macroporosity that is achieved using the rapid prototyping technique.
  • the invention also describes a method for the preparation of a pure ceramic three-dimensional scaffold, of nanocrystalline, bioactive, biocompatible and biodegradable ceramic.
  • the main advantages provided by the method described in the present invention are: • control over the macroporosity of the scaffold prepared by this method. This control is achieved using the rapid prototyping technique.
  • the scaffold prepared by this method is pure ceramic, that is, it has a ceramic component but does not include a polymer component.
  • the bioceramics of the scaffold prepared by this method comprise unsubstituted apatite or silicon substituted apatite.
  • the scaffold prepared by the present method combines the excellent biocompatibility of apatite with the improvement of bioactivity due to the presence of silicon.
  • the bioceramics of the scaffold prepared by this method have a nanocrystalline character and acicular morphology (in the form of needles) to guarantee the bioactive, biodegradable and biocompatible behavior of the implant.
  • the scaffold prepared by this method does not require the subsequent calcination of polymeric vehicles, or high temperature sintering processes.
  • the method of the present invention is carried out by rapid prototyping using a three-dimensional (3D) printing equipment.
  • the method of the present invention unlike the previous methods described in the state of the art, does not require the incorporation of ceramics into polymers in order for the final piece to be consistent. In this way, the polymer calcination stage and the subsequent sintering of the remaining ceramics are avoided, a process that requires temperatures above 1000 ° C that lead to the loss of the nanocrystalline character in the ceramics.
  • the method of the present invention is based on the use of a paste or aqueous ink of high ceramic load in the form of a suspension having two or more different grain size distributions.
  • a paste or aqueous ink of high ceramic load in the form of a suspension having two or more different grain size distributions.
  • To this ink is added a small quantity of a monomer component and of a surfactant or dispersant agent, so that the proportion by weight of the monomer component + surfactant sum must be less than 5% with respect to the total mass of the ceramic ink.
  • the ceramic ink reaches a point of sufficient viscosity to flow through the nozzle of the 3D printing equipment.
  • the ceramic ink presents a multimodal grain size distribution, that is, by coexisting two or more different grain size distributions in the same ceramic ink, some grains are accommodated with others depending on their different sizes.
  • the surfactant or dispersant agent favors the repulsion between the ceramic particles thus allowing the ceramic suspension to be stable in aqueous medium.
  • the monomer component covers the surface of the ceramic grains forming a polymerizing film, thus joining the grain boundaries. It is worth highlighting the fact that it is a layer or film that covers the surface of the grains and not a polymeric mass that embeds them.
  • Subsequent heat treatment to remove these organic additives involves heating at a temperature between 300 ° C and 600 ° C, but in no case above 600 ° C, since this ensures the complete elimination of organic additives without compromising the nano-crystalline character of the apatite type phase that constitutes the scaffold.
  • the present invention also claims the use of the bioceramic scaffolds of the present invention for the manufacture of implants for trauma surgery, maxillofacial surgery, periodontal surgery, orthognathic surgery, oral surgery, palatal fissure surgery, dental treatments, osteoporotic bone, regeneration honeycomb, bone fissures, bone fusions, vertical and horizontal bone filling and regeneration and tissue engineering techniques, as well as for the release of substances for therapeutic purposes.
  • the terms "nanocrystalline ceramic (s)” or “nanocrystalline ceramic (s)” or “nanoceramics (s)” are equivalent and interchangeable and refer to ceramics where none of the dimensions of the crystals that make up this ceramic exceeds 50 nm.
  • the method of the present invention comprises the following steps:
  • the ceramic that composes the scaffold manufactured according to the method claimed in the present invention has a chemical composition based on nanocrystalline hydroxyapatites or unsubstituted or substituted with silicon. More specifically, the compositions used for the preparation of the ceramics of the present method comprise a compound of chemical formula: Ca 1 or (P0 4 ) 6-x (Si0 4 ) x (OH) 2-x , where 0 ⁇ x ⁇ 0.5.
  • the ceramic is obtained in powder form according to the method detailed in the literature [D. Arcos, J. Rodr ⁇ guez-Carvajal and M. Vallet-Reg ⁇ , Silicon incorporation in hydroxylapatite obtained by controlled crystallization, Chem. Mater. 2004, 16, 2300- 2308], by the controlled precipitation of aqueous solutions of precursor salts of the main ceramic components: Ca, P (which is in the form of a phosphate ion), Si (which is in the form of an ion silicate), and OH 1_ (hydroxy ions).
  • the addition of the precursor salt of silicon or silicon alkoxide is optional, it is only required for the manufacture of scaffolds based on silicon-substituted ceramics. Therefore, if it is desired to manufacture a scaffold based on unsubstituted hydroxyapatites, the addition of the silicon precursor salt solution would be omitted.
  • the reaction is continuously adjusted to basic pH by the addition of a basifying agent to thus guarantee constant conditions throughout the entire synthesis process.
  • a basifying agent to thus guarantee constant conditions throughout the entire synthesis process.
  • the temperature of the reaction medium is varied during synthesis within a range between room temperature and the boiling temperature of the solvent (water) over a time interval between 30 minutes and three hours because during this period of time the nucleation and growth of the crystallites occurs. In this way, changes in temperature throughout that period imply heterogeneity in grain size.
  • a ceramic is obtained in the form of powder and with a multimodal grain size distribution.
  • the powder material obtained in the previous stage is dried at a temperature between 50 ° C and 80 ° C and ground in a rotary ball mill. Granulometry is monitored periodically until at least two different populations of particle size are obtained.
  • the smaller particle size distribution should be centered on a particle size value between 1 and 20 microns and the larger particle size distribution should be centered on particle size values greater than 25 microns.
  • This step begins with the preparation of a monomer solution in distilled water where the amount of monomer component to be added varies between 2 and 4% by weight with respect to the mass of the final mixture consisting of monomer component, surfactant and ceramic component.
  • Said monomer component can be selected from acrylamides, methacrylamides, methylene bisacrylamides, polyethylene glycol dimethacrylate, or combinations thereof. Polysaccharides such as agar, agarose, carrageenan, alginate, or combinations thereof can also be used. Specifically, methacrylamide and N, N'-methylenebisacrylamide have been especially effective.
  • a surfactant is incorporated in amounts between 2 and 4% by weight with respect to the mass of the final mixture consisting of monomeric component, surfactant and ceramic component.
  • Said surfactant is selected from ammonium polymethacrylate (for example, ammonium methacrylates of the Darvan type 811, Dolapix PC 67 or Dispex A40), sodium polymethacrylate, ammonium polyacrylate, sodium polyacrylate, sodium hexametaphosphate, sodium pyrophosphate decahydrate, or combinations thereof.
  • ammonium acrylates and methacrylates of the Darvan 811, Dolapix PC 67 or Dispex A40 type have proved particularly effective.
  • aqueous solution is kept under continuous stirring and the powder material obtained in step 2 is added thereto.
  • the ceramic charge of said final suspension mixture is always greater than 30% (v / v).
  • the total content of organic additives must not exceed 5% by weight with respect to the total mass of the final suspension. In this way a high viscosity ceramic paste is obtained, which is sifted through a mesh before being incorporated into the injector cartridges of the 3D printing equipment.
  • Scaffolding is manufactured by rapid prototyping using 3D printing equipment.
  • the ceramic ink in the form of a suspension obtained in step 3 is introduced into an injector being maintained at a temperature between 5 ° C and 20 ° C for the period of time it is inside the injector.
  • the ceramic ink is flowed through the injector tip and then deposited layer by layer on a heated plate at temperatures between 50 ° C and 90 ° C.
  • scaffolds with free shapes and porosity designed by the layer-by-layer deposit of the ceramic ink described are constructed.
  • the deposit period between successive layers must be equal to or greater than 30 seconds, thus preventing the collapse of the layers that constitute the scaffold.
  • the pieces obtained in the previous stage are dried in an oven at temperatures between 60 and 90 ° C for a period equal to or greater than 12 hours. These conditions are directly related to the low amount of organic additives added as well as the aqueous nature of ceramic ink.
  • the scaffolding, after that period of at least 12 hours, is thus consolidated by total drying of the ceramic ink and by the contact of the polymeric additives on the surface of the ceramic grains. 6.
  • the pieces are treated at a temperature between 300 ° C and 600 ° C, but in no case at a temperature above 600 ° C until total elimination of the organic additives incorporated. In this way we obtain pieces free of organic matter, preserving the nanocrystalline character of the ceramic that composes the scaffolding.
  • microstructural technical characteristics are the following:
  • the method of the invention began with the synthesis of the ceramic of chemical formula Caio (P0 4 ) 5 ; 7 ( Si0 4 ) 0j3 (OH) 1; 7 following the procedure detailed in the literature [D. Arcos, J. Rodr ⁇ guez-Carvajal and M. Vallet-Reg ⁇ , Silicon incorporation in hydroxylapatite obtained by controlled crystallization, Chem. Mater. 2004, 16, 2300- 2308]. It was based on three aqueous solutions: calcium nitrate tetrahydrate, ammonium monohydrogen phosphate and tetraethyl orthosilicate in the stoichiometric proportion. These solutions are the precursors of the main ceramic components: Ca, phosphate and silicate, respectively.
  • the solutions were added dropwise onto the reaction medium under continuous stirring.
  • the pH of the reaction was continuously adjusted to a value between 10 and 12 by the addition of an ammonium hydroxide solution to guarantee constant conditions throughout the entire synthesis process.
  • the temperature at the beginning of the reaction was 20 ° C and was increased at a rate of 1 ° C per minute to 80 ° C (temperature at the end of one hour). Once the final temperature was reached, it was kept for 12 hours under stirring.
  • the ceramic was obtained in powder form and with a multimodal grain size distribution.
  • This first process was followed by other milling processes identical to the first, except for the duration (in these processes, the duration was 15 minutes) until a granulometry was obtained with at least two different particle size populations: a population of small particle centered on particle size values around 10 micrometers in diameter (in particular, the median of said distribution was equal to 12 micrometers) and a larger particle size distribution centered on particle size values around 50 micrometers (specifically, the median of said distribution was equal to 48 micrometers) (see figure 1).
  • This stage began with the preparation of a solution of the monomer component.
  • 25 ml of a solution in distilled water of N, N'-methylenebisacrylamide (0.3 grams) and methacrylamide (1.5 grams) were prepared. Said solution was maintained under continuous stirring. After 6 hours of stirring, when the monomers were completely dissolved, 1.2 grams of Darvan was added 811 acting as a surfactant. The mixture was left for one hour under stirring and 30 grams of the powder material obtained in the previous stage was slowly incorporated while maintaining continuous stirring. In this way a high viscosity ceramic paste was achieved.
  • the ceramic paste was screened through a sieve with 100 microns in mesh size. This resulted in a high viscosity ceramic ink, capable of flowing through an injector tip of 600 microns, at a temperature of 15 ° C and with a pressure of 0.035 bar.
  • This stage began with the generation of a CAD file or file that contains the computer-assisted 3D design of the scaffolding.
  • this file the external morphology, the porosity pattern and the size of the scaffold pores were specified.
  • This file was loaded into the 3D printing equipment and each of the manufacturing parameters allowed by the equipment was also set:
  • the ceramic ink in the form of a suspension obtained in step 3 was introduced into an injector being maintained at a temperature of 15 ° C during the period of time in which the ink was inside the injector.
  • the ceramic ink was flowed through the injector tip and then deposited layer by layer on a preheated plate at a temperature of 55 ° C.
  • the printing speed was adjusted to a value that allowed a minimum of 30 seconds between layers, favoring the drying of the lower layers and avoiding the collapse of the scaffold.
  • the scaffold obtained in the previous stage was quickly taken to a preheated oven at 70 ° C, and kept inside the oven for 12 hours. After this period, the pieces were completely dry and the ceramic particles consolidated through the contact of the polymeric additives on their surface.
  • the consolidated pieces resulting from the previous stage were subjected to a temperature of 600 ° C for 2 hours, eliminating all organic matter but without modifying the nanocrystalline character of the ceramic phase, which remains as the only component of the scaffolding.
  • Table 1 shows the values of specific surface area and chemical composition by weight obtained for ten batches of scaffolds of the formula Ca) or (P0 4 ) 5 ; 7 (Si0 4 ) or , 3 (OH) 1; 7 . From the data in the table, the presence of silicon in all batches is observed first. Given the difficulty of incorporating silicon into the apatite phase, mainly due to the possibility that the silicon precursor added in the reaction can be lost with the washing liquids, the fact that the Si is present in all lots with a margin of error of ⁇ 0.09%.
  • the specific surface is a variable that is related to the crystal size.
  • the value of the specific surface is very small (less than 10 m / g).
  • the value of the specific surface ranges between 80 and 95 m / g, which is explained by the nanocrystalline nature of the ceramic.
  • Figure 1 shows the particle size distribution of a powder material of formula Ca 10 (PO 4 ) 5 j (SiO 4 ) 0 (OH) li7 obtained after the milling process corresponding to step 2 of the preparation method of Scaffolding claimed in the present invention.
  • the particle frequency values (expressed in%) are plotted against the particle size (expressed in ⁇ ).
  • two particle size populations can be easily differentiated. The first one is centered on particle size values around 10 micrometers in diameter (specifically, the median of said distribution is equal to 12 micrometers), constituting the population of small particle size. The second largest population is centered on particle size values around 50 micrometers (specifically, the median of said distribution is equal to 48 micrometers), constituting the large population.
  • This distribution is essential in the process, since during the deposition by 3D printing, the particles of the small-sized population fill the intergranular spaces left by the particles of the large-sized population.
  • Figure 2 shows an X-ray diffraction diagram (reflection intensity (beads) vs. reflection angle (2 ⁇ )) corresponding to a scaffolding of silicon substituted hydroxyapatite of formula Caio (P0 4 ) 5> 7 (Si0 4 ) or, 3 (OH) 1> 7 obtained according to the method of the present invention.
  • the width of the profile of the diffraction maxima is indicative of the small crystal size that forms this phase, in other words, by means of this diffractogram, the nanocrystalline character of the silicon-substituted hydroxyapatite is scaffold.
  • the maximum identified with the 0 0 4 indices represents a family of crystalline planes parallel to each other, perpendicular to the axis c and parallel to the axes a and b of the unit cell of the apatite phase. This maximum has an anomalously high intensity and a narrower profile, which indicates that the crystal has grown more in the direction of the c axis, which leads to an acicular morphology of the apatite crystallites thus resembling those of the mineral component of the bone .
  • Figure 3 shows a representation of the size and morphology of the crystal of the silicon substituted hydroxyapatite, of formula Ca 10 (PO 4 ) 5> 7 (SiO 4 ) 0j 3 (OH) and i7 , of the scaffold that has been obtained according to method of the present invention.
  • the graph has been constructed from the information, obtained by X-ray diffraction, about the growth of the crystal in each and every one of the directions, and is represented along the direction [001] (direction of the c axis of the unit cell of the apatite) and [100] (direction of the axis a of the unit cell of the apatite).
  • This figure demonstrates the nanocrystalline character and acicular morphology of crystals of silicon substituted hydroxyapatite, where the crystal size is 18.7 nm and 6.7 nm along the directions [001] and [100], respectively . It is important to note that the crystalline system of apatite is a hexagonal crystalline system where the magnitude a is equal to b but different from c.
  • Figure 4 presents some examples of the outer appearance of pure ceramic macroporous scaffolds, of nanocrystalline ceramic unsubstituted and substituted with silicon, obtained following the preparation method set forth in the present invention.

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Abstract

La invención describe un andamio cerámico puro, de cerámica nanocristalina, en el que la cerámica comprende apatita no sustituida o apatita sustituida con silicio. Dicho andamio combina la excelente biocompatibilidad de la apatita, con la mejora de la bioactividad debida a la presencia del silicio, con la estructura nanocristalina de la cerámica, idónea para el tejido donde se pretende implantar, y con el control sobre la macroporosidad que se consigue empleando la técnica del prototipado rápido. La invención también incluye el método de preparación de dicho andamio. Este método comprende: preparación de la biocerámica, molienda de la biocerámica hasta obtener una granulometría multimodal, preparación de la tinta cerámica en medio acuoso estabilizada con una mezcla constituida por un componente monomérico y un surfactante, fabricación del andamio macroporoso por impresión tridimensional (3D), consolidación y calcinación del mismo. La finalidad preferente de este andamio es su aplicación como implante para regeneración ósea.

Description

TÍTULO
Andamio macroporoso cerámico puro basado en apatita nanocristalina, método de preparación y aplicaciones
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de fabricación de materiales para la regeneración de tejido óseo. De forma más concreta, la invención se refiere a un andamio bioactivo, biocompatible y biodegradable, macroporoso, de porosidad tridimensional controlada y ordenada, así como a su método de preparación a través de la técnica de prototipado rápido.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La necesidad de tratar los defectos en el tejido óseo, causados por traumas, defectos congénitos o degenerativos, tumores, etc. es un problema que va en aumento debido a la mayor expectativa de vida de la sociedad actual. De especial incidencia son las fracturas osteoporóticas, que afectan a una de cada tres mujeres y a uno de cada doce hombres de edades superiores a los 50 años. Los síntomas de la osteoporosis son silenciosos en su fase temprana, pero en fases más avanzadas causa dolor en la zona afectada, pérdida de estatura con el tiempo, y por último fractura de algún hueso que conlleva la hospitalización. Como consecuencia de esas fracturas, la necesidad de diseñar andamios 3D con propiedades químico-estructurales similares al hueso y que aceleren la regeneración del tejido dañado está cobrando una enorme importancia. Una de las estrategias más habituales en clínica para tratar las fracturas o defectos óseos consiste en el autotransplante del propio paciente. Sin embargo, esta técnica plantea incrementar el proceso quirúrgico y por tanto, puede ocasionar mayor número de complicaciones post-operatorias. Por otro lado, el transplante de otro donante implica un coste elevado en tiempo y material, ya que es necesario disponer de bancos de donantes, y además conlleva el riesgo añadido de transmisión de agentes patógenos (virus o bacterias). Por esta razón es necesario trabajar en la creación de nuevos materiales alternativos que se comporten de igual forma que el hueso, y sean fáciles de producir, esterilizar y almacenar para su posterior uso. Los materiales tradicionales para reemplazo óseo presentan varias desventajas, como son las propiedades físicas no acordes con el hueso natural, escasa bioactividad o baja tolerancia a las condiciones fisiológicas, entre otras. Por consiguiente, una buena alternativa consiste en desarrollar andamios artificiales, bioactivos, de composición y microestructura similares al hueso. Estos implantes son reconocidos por el organismo receptor como material propio en una fase inicial, estableciéndose una unión fuerte al hueso sin respuesta a cuerpo extraño. Una vez integrados en el tejido óseo, son posteriormente absorbidos de forma controlada presentando además actividad osteogénica.
El término "andamio" se refiere a estructuras artificiales capaces de soportar el crecimiento de tejidos vivos en tres dimensiones. Se trata de materiales porosos sobre los que se colocarán las células óseas y que actúan como andamios o moldes. Con las condiciones fisiológicas adecuadas, se logra que las células produzcan o regeneren el nuevo tejido óseo de modo que, a medida que el andamio se degrada, es reemplazado por la nueva estructura ósea. Se considera como andamio o molde ideal aquel que sea altamente poroso, sin toxicidad y biodegradable, pero lo bastante resistente para soportar la carga estructural del hueso que lo ha de reemplazar.
Los andamios destinados a actuar como implantes para la regeneración ósea deben cumplir ciertos requisitos que incluyen: unas propiedades mecánicas similares a aquellas del sitio óseo a reparar, biocompatibilidad con el tejido óseo y biodegradabilidad.
Entre los parámetros que más influyen en las propiedades mecánicas, la biocompatibilidad y la bioreabsorción de los andamios están la macroporosidad, composición química y cristalinidad. Las condiciones específicas de macroporosidad, composición química y cristalinidad que optimizan las cualidades osteogénicas de un andamio son las siguientes:
• Respecto a la macroporosidad:
El andamio debe presentar una porosidad elevada (incluyendo un tamaño adecuado de poro) que permita la colonización del material implantado por parte de las células, la migración de éstas, y la difusión y transporte de nutrientes y productos de desecho dentro y fuera de la pieza implantada. Para que se produzca el proceso de colonización por tejido óseo neoformado es necesario que los poros tengan un tamaño superior a 200 μηι. Asimismo, el andamio debe favorecer el anclaje de las células en su superficie y ser biocompatible para prevenir la respuesta inflamatoria, propiciando una buena integración con el tejido anfitrión.
• Respecto a la composición química: El andamio debe estar constituido por materiales adecuados para la función osteogénica. Los materiales utilizados para la regeneración de tejido óseo incluyen materiales inorgánicos cerámicos tanto sintéticos como naturales, como la hidroxiapatita y el fosfato tricálcico, ya que estas cerámicas tienen características muy similares a la hidroxiapatita biológica que compone el hueso natural, es decir, presentan carácter nanocristalino, no son estequiométricas, son deficientes en calcio y son capaces de incorporar diferentes iones en función de la naturaleza de los reactivos y el medio, y además están caracterizadas como materiales biocompatibles, bioactivos y osteoconductivos.
Asimismo, en los últimos años, ha cobrado una gran importancia la sustitución de los materiales cerámicos con silicio. El interés de introducir iones de silicio (Si) en las cerámicas se basa en su presencia en cantidades traza en la hidroxiapatita ósea y en su importancia para los procesos metabólicos asociados al desarrollo de hueso y de los tejidos conjuntivos [Carlise E., Silicon as a trace nutrient, Sci. Total Environ.. 1988;73:95-106].
La sustitución iónica del fósforo por silicio se ha estudiado en hidroxiapatita (HA), fosfato tricálcico-α (a-TCP) y cementos basados en hidroxiapatita. Se ha comprobado que el modelo más sencillo que explica la incorporación del silicio en dichas estructuras consiste en la sustitución del grupo P04 3" por el grupo Si04 4" [Pietak AM, Reíd JW, Stott MJ, Sayer M., Silicon substitution in the calcium phosphate bioceramics, Biomaterials 2007;28:4023-4032]. Esta sustitución genera un déficit de carga eléctrica que es necesario compensar para recuperar la neutralidad y evitar un elevado coste energético. Como mecanismos de compensación se han propuesto fórmulas químicas de hidroxiapatita sustituida con silicio (representado abreviadamente como Si-HA) [Ca5(P04)3- x(Si04)x(OH)1-x] y de fosfato tricálcico-α sustituido con silicio (representado abreviadamente como Si-a-TCP) [Ca3(P1-xSix04.x/2)2] considerando vacantes de (OH)1" y de O2" [Pietak AM, Reid JW, Stott MJ, Sayer M., Silicon substitution in the calcium phosphate bioceramics, Biomaterials 2007;28:4023-4032].
Existe evidencia científica sobre la mejora en la bioactividad de las cerámicas de fosfato cálcico sustituidas con silicio y dicha mejora se atribuye a varios factores que actúan sinérgicamente. En primer lugar, la sustitución iónica con silicio facilita la precipitación de HA biológica in vivo y esto favorece la adsorción de proteínas, y la adhesión y proliferación de los osteoblastos [Sayer M, Stratilatov A, Reid J, Calderin L, Stott M, Yin X, et al., Structure and composition of silicon stabilized tricalcium phosphate, Biomaterials 2002;24:369-382; Vandiver J, Dean D, Patel N, Botelho C, Best S, Santos J, et al., Silicon addition to hydroxyapatite increases nanoscale electrostatic, van der Waals and adhesive interactions, J. Biomed. Res. 2005;78A:352-363]. Por otro lado, el ión silicato liberado en la matriz extracelular o presente en la superficie del implante podría influir directamente en los osteoblastos, osteoclastos y en la síntesis del colágeno [Keeting P, Oursler M, Wiegand K, Bonde S, Spelsberg T, Riggs B., Zeolite A increases proliferation, differentiation and TGF-beta production in normal adult human osteoblast-like cells in vitro, J. Biomed. Mater. Res. 1992;7: 1281-1289; Xynos I, Edger A, Buttery D, Hench L, Polak J., Gene-expression profüing of human osteoblasts following treatment with the ionic producís of Bioglass 45S5 dissolution, J. Biomed. Mater. Res. 2001 ;55: 151-157]. Asimismo, se ha demostrado que la implantación in vivo de Si-HA ha incrementado el crecimiento óseo un 14,5% más en comparación con la HA no sustituida. Se ha observado también la formación de fibrillas de colágeno en la superficie de Si-HA 6 semanas después de su implantación, en comparación con las 12 semanas necesarias para observar el mismo efecto cuando se utiliza HA no sustituida
[Patel N, Best S, Bonfield W, Gibson I, Hing K, Damien E, et al., A comparative study on the in vivo behaviour of hydroxyapatite and silicon substituted hydroxyapatite granules, J. Mater. Sci. Mater. Med. 2002; 13: 1 199-1206].
• Respecto a la cristalinidad:
Las cerámicas que componen el andamio deben presentar carácter nanocristalino para asemejarse así, en la mayor medida posible, a la hidroxiapatita biológica. El carácter nanocristalino potencia la bioactividad y biocompatibilidad de la cerámica e induce una mayor velocidad de reacción de la misma [T. Traykova, C. Aparicio, M.P. Ginebra, J.A. Planell, Nanomedicine, 2006, 1, 91; Y.F. Chou, I. Wulur, J.C.Y. Duna, B.J. Wu. Handbook of nanostructured biomaterials and their applications in nanobiotechnology. Ed H.S. Nalwa, American Scientific Publishers, Stevenson Ranch, 2005, vol 2, pp 197-222; B. Ben-Nissan. MRS Bull, 2004, 29, 28; Y.F. Chou, W. Huang, J.C.Y. Duna, T.A. Millar, B.M. Wu. Biomaterials, 2005, 26, 285].
En el ámbito de la ciencia de los materiales, un material nanocristalino es un material comprendido de muchos cristales, la mayoría de los cuales presentan una o más dimensiones del orden de 100 nm o menos (normalmente, sin presentar ni cristales de tamaño micrométrico ni de una fase amorfa intergranular) [Sergey V. Dorozhkin, Nanodimensional and Nanocrystalline Apatites and Other Calcium Orthophosphates in Biomedical Engineering, Biology and Medicine, Materials 2009, 2, 1975-2045]. Sin embargo, en el ámbito de las biocerámicas, existe un acuerdo general por el cual se considera nanocristalina a toda cerámica comprendida de muchos cristales donde ninguna de las dimensiones de dichos cristales supera los 50 nm (al ser éste, por regla general, el tamaño máximo que presentan los nanocristales de apatita en los huesos de los vertebrados). Aunque las dimensiones de los cristales de apatita biológica que aparecen en la bibliografía varían debido a los diferentes métodos de tratamiento y técnicas analíticas, éstas están generalmente alrededor del nivel nanométrico con valores en los intervalos de 30-50 nm (longitud), 15-30 nm (ancho) y 2-10 nm (espesor) [Wang, L.; Nancollas, G.H.; Henneman, Z.J.; Klein, E.; Weiner, S., Nanosized partióles in bone and dissolution insensitivity of bone mineral, Biointerphases 2006. 1, 106-111].
Un último parámetro a tener en cuenta en el andamio, además de todos los anteriormente referidos, es la morfología de los cristales de la cerámica que compone dicho andamio. Los cristales de la apatita biológica que compone el hueso de los vertebrados presentan morfología acicular, por ello, una de las características requeridas en los andamios destinados a actuar como implantes para la regeneración ósea será la morfología acicular de los cristales de la apatita que constituya dicho andamio.
La fabricación de formas libres sólidas es una tecnología de manufacturación recientemente incorporada al ámbito biomédico. Esta tecnología es también conocida como prototipado rápido o procesado en capas. Hoy en día existen diferentes técnicas de fabricación de sólidos de formas libres como la estereolitografía, sinterizado selectivo por láser, modelado por deposición de fundidos, manufacturación laminada e impresión 3D. Actualmente se ha planteado la fabricación de andamios tridimensionales utilizando polímeros naturales como el colágeno, fibrina o el quitosano [Bensaid W y col., A biodegradable fibrin scaffold for mesenchymal stem cell transplantation, Biomaterials 2003, 24, 2497-502]. La investigación con polímeros biodegradables también está arrojando un gran número de materiales prometedores, especialmente con polímeros tipo poli(hidroxiácido) tales como, policaprolactona, ácido poliláctico, ácido poliglicólico o copolímeros de los mismos [Heo et al., J. Biomed. Mater. Res., 89A, 108, 2009; Chu et al, Rapid Prototyping J, 14, 293, 2008]. Sin embargo, el uso de polímeros presenta la desventaja de que sus productos de degradación pueden originar concentraciones locales elevadas de productos de desecho ácidos, dificultando el desarrollo celular dentro del andamio, e incluso inducir una respuesta inflamatoria in vivo [Kohn D. H. y col., Effects of pH on human bone marrow stromal cells in vitro: implications for tissue engineering of bone, J Biomed Mater Res, 2002, 60, 292-9]. Recientemente se ha investigado la fabricación de andamios híbridos polímero/cerámico para regeneración tisular [Russias, J. y colaboradores, Fabrication and in vitro characterization of three-dimensional organic/inorganic scaffolds by robocasting, J. Biomed. Mater. Res., A, 83, 2, 2007, 434-445]. Sin embargo, esta técnica presenta como principales desventajas no sólo la posibilidad de que, como en los casos anteriores, puedan generarse concentraciones ácidas locales al degradarse el componente polimérico sino también el escaso control sobre la degradación de la pieza, siendo ésta muy lenta.
A la vista de lo expuesto, la fabricación de andamios constituidos exclusivamente por cerámicas (es decir, andamios que no incluyen fracción polimérica), también llamados andamios cerámicos puros, es objeto de gran interés en el sector de la técnica descrito. La fabricación de andamios cerámicos puros mediante la técnica de prototipado rápido se suele hacer generando previamente un molde polimérico sacrificable que actúa como negativo de la pieza que se quiere fabricar. Posteriormente se rellena el molde con una suspensión acuosa del cerámico y se elimina el molde por pirólisis a temperaturas de más de 1000°C [descripción de ejemplo, Chu, G. et al., Hydroxyapatite implants with designed infernal architecture, j. Mater. Sci.: Mater. Med, 12, 2001, 471-478]. La principal desventaja de esta técnica es el escaso control sobre la microporosidad del material final, ya que puede verse alterada en el proceso de calcinación para eliminar el molde. Otra desventaja importante consiste en la posible aparición de elementos tóxicos como subproductos en el proceso de eliminación del molde polimérico. En general, el conjunto de técnicas de prototipado rápido para diseñar y controlar la macroporosidad tridimensional (3D) de andamios implantables de origen polimérico están ampliamente desarrolladas [Wai-Yee Yeong et al., Trends in Biotechnology, 643, 22, 2004; Peltola et al., Armáis Medicine, 40, 268, 2008].
Una segunda estrategia utilizada para obtener andamios cerámicos puros por prototipado rápido requiere incorporar las partículas cerámicas a una matriz polimérica soluble o fusible, posterior fraguado del polímero, calcinación de la materia orgánica y sinterizado final del andamio para dotarle de consistencia. En base a esta estrategia, son varios los métodos descritos para la fabricación de andamios 3D con aplicación en regeneración ósea. Por ejemplo, la patente US 2004/0191292 Al se refiere a la preparación de andamios 3D para la regeneración de tejido óseo, basados en micropartículas compuestas por Si, Ca y P vehiculizadas en una matriz polimérica orgánica, donde la proporción de ésta última varía entre un 20% y 80% de la masa total del andamio. La patente US 2008/0103227A1 se refiere a la preparación de materiales porosos con estructura jerarquizada, que implica la preparación de una pasta cerámica aplicada a un andamio de origen polimérico, por ejemplo poliuretanos. La patente US 2001/0016353 Al se refiere a la preparación de andamios compuestos por cerámicas reabsorbibles mediante un método de replicación. Este procedimiento implica la impregnación de estructuras textiles orgánicas con los precursores cerámicos, requiriendo la posterior sinterización para formar el andamio cerámico. La patente US 6,283, 997B1 se refiere a la preparación de estructuras cerámicas y cerámica/polímero donde la fracción polimérica es fotocurable y posteriormente eliminada por tratamiento térmico, aplicando técnicas de estereolitografía.
En resumen, la preparación de andamios cerámicos puros requiere la eliminación de una importante cantidad de materia orgánica, no inferior al 20%) en masa respecto a la masa total del andamio [patente US 2004/0191292A1], para lo cual existen dos opciones:
a) Calcinar a una temperatura (no superior a 600°C) suficiente para eliminar la fracción polimérica pero sin alcanzar la temperatura de sinterización de las partículas de la cerámica. En este caso, el andamio resultante conserva la nanocristalinidad pero es muy frágil y no manipulable y por lo tanto no se puede usar para fines de regeneración ósea,
b) Calcinar a una temperatura (1000-1200°C) superior a la de la opción anterior para eliminar el material polimérico y sinterizar la fase cerámica resultante procediendo posteriormente al endurecimiento del andamio obtenido. Mediante esta opción se garantiza la estabilidad mecánica del andamio a expensas de la pérdida del carácter nanocristalino (debido a la elevada temperatura a la que se trabaja). El resultado son piezas cerámicas altamente cristalinas, de baja bioactividad, no reabsorbibles y con microestructuras muy diferentes al componente mineral del hueso.
La presente invención solventa los inconvenientes del actual estado de la técnica al proporcionar un método para obtener andamios:
• con macroporosidad diseñada,
· que presentan componente cerámico basado en biocerámicas bioactivas, biodegradables, biocompatibles y nanocristalinas pero no incluyen componente polimérico,
• y que no requieren la posterior calcinación de vehículos poliméricos, ni de procesos de sinterización a alta temperatura.
Por tanto, los andamios fabricados mediante el método de la invención combinan la excelente biocompatibilidad de la hidroxiapatita, con la mejora de la bioactividad debida a la presencia del silicio, el cual juega un papel importante en el proceso de formación ósea y mineralización y, por último, la estructura nanocristalina del material, más acorde con el tejido donde se pretende implantar. Además, el control sobre la macroporosidad que se consigue empleando la técnica del prototipado rápido y la posibilidad de diseñar piezas a medida para cada situación, hacen de la presente invención una excelente alternativa a los métodos actuales.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN.
La presente invención describe un andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable en el que la cerámica comprende apatita no sustituida o apatita sustituida con silicio. En concreto, la cerámica del andamio de la presente invención comprende un compuesto de fórmula: Ca10(PO4)6-x(SiO4)x(OH)2-x, donde 0 < x < 0,5.
Entre las características que hacen que el andamio de la presente invención sea novedoso está el carácter nanocristalino de la cerámica que compone dicho andamio. Gracias a esta característica, el andamio de la presente invención es más apropiado para el tejido donde se pretende implantar (óseo) que los anteriores andamios que se han preparado hasta ahora. El tamaño medio de cristal de la cerámica que compone el andamio de la presente invención es inferior a 50 nm. De forma más concreta, el tamaño medio de cristal de la cerámica que compone el andamio de la presente invención está dentro del intervalo entre 10 nm y 30 nm.
Por otra parte, la morfología del cristal cerámico que compone el andamio de la presente invención es acicular, asemejándose así a la del componente mineral del hueso. La longitud promedio de dicho cristal cerámico de la invención está comprendida entre 15 y 50 nm y la anchura promedio entre 5 y 10 nm.
Respecto a las características técnicas relativas a la morfología del poro, el andamio de la presente invención presenta una porosidad con entrecruzamiento tridimensional, el volumen de porosidad del andamio es del 35% o superior y el grosor de la pared del mismo es superior a 600 μπι.
Respecto a las características técnicas mecánicas, el andamio de la presente invención presenta un valor de tensión máxima previa a fractura comprendido entre 0,556 y 1,06
MPa, una deformación máxima previa a fractura entre 2,85 y 6,54 % y un módulo elástico entre 100 y 200 MPa que es similar al del hueso trabecular.
En resumen, el andamio de la presente invención combina la excelente biocompatibilidad de la apatita, con la mejora de la bioactividad debida a la presencia del silicio, con la estructura nanocristalina de la cerámica, idónea para el tejido donde se pretende implantar, y con el control sobre la macroporosidad que se consigue empleando la técnica del prototipado rápido.
La invención describe, asimismo, un método para la preparación de un andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable. Las principales ventajas que proporciona el método descrito en la presente invención son: • el control sobre la macroporosidad del andamio preparado mediante este método. Este control se consigue empleando la técnica del prototipado rápido.
• el andamio preparado mediante este método es cerámico puro, es decir, presenta componente cerámico pero no incluye componente polimérico.
• la biocerámica del andamio preparado mediante este método comprende apatita no sustituida o apatita sustituida con silicio. De esta forma el andamio preparado mediante el presente método combina la excelente biocompatibilidad de la apatita con la mejora de la bioactividad debida a la presencia del silicio.
• la biocerámica del andamio preparado mediante este método presenta carácter nanocristalino y morfología acicular (en forma de agujas) para garantizar el comportamiento bioactivo, biodegradable y biocompatible del implante.
• el andamio preparado mediante este método no requiere la posterior calcinación de vehículos poliméricos, ni procesos de sinterización a alta temperatura.
El método de la presente invención se lleva a cabo mediante prototipado rápido empleando un equipo de impresión tridimensional (3D).
En los métodos de fabricación de andamios cerámicos que forman parte del estado de la técnica ha sido necesaria la incorporación de la cerámica en el seno de un componente polimérico para dar consistencia a la pieza durante el proceso de deposición 3D. El método de la presente invención, a diferencia de los métodos anteriores descritos en el estado de la técnica, no requiere la incorporación de la cerámica en el seno de polímeros para que la pieza final sea consistente. De esta forma se consigue evitar la etapa de calcinación del polímero y la posterior sinterización de la cerámica restante, proceso que requiere temperaturas superiores a 1000°C que conducen a la pérdida del carácter nanocristalino en la cerámica.
El método de la presente invención, se fundamenta en el uso de una pasta o tinta acuosa de alta carga cerámica en forma de suspensión que presenta dos o más distribuciones de tamaño de grano distintas. A dicha tinta se le añade una pequeña cantidad de un componente monomérico y de un agente surfactante o dispersante, de manera que la proporción en peso de la suma componente monomérico + surfactante debe ser inferior al 5 % respecto a la masa total de la tinta cerámica. De esta manera se consigue que la tinta cerámica alcance un punto de viscosidad suficiente para fluir por el inyector del equipo de impresión 3D. Al depositar, mediante extrusión, capas sucesivas de tinta cerámica sobre una placa caliente, el andamio solidifica basándose en tres fenómenos:
• Al presentar la tinta cerámica una distribución de tamaño de grano multimodal, es decir, al coexistir dos o más distribuciones de tamaño de grano distintas en la misma tinta cerámica, se produce la acomodación de unos granos con otros en función de sus distintos tamaños.
• El agente surfactante o dispersante favorece la repulsión entre las partículas de la cerámica permitiendo así que la suspensión cerámica sea estable en medio acuoso.
• El componente monomérico recubre la superficie de los granos de cerámica formando una película que polimeriza uniendo de esta forma las fronteras de grano. Conviene resaltar el hecho de que se trata de una capa o película que recubre la superficie de los granos y no de una masa polimérica que embute a los mismos.
El posterior tratamiento térmico para eliminar dichos aditivos orgánicos implica calentar a una temperatura entre 300°C y 600°C, pero en ningún caso superior a 600°C, ya que de esta forma se asegura la eliminación completa de los aditivos orgánicos sin comprometer el carácter nanocristalino de la fase tipo apatita que constituye el andamio.
En la presente invención se reivindica asimismo el uso de los andamios biocerámicos de la presente invención para la fabricación de implantes para cirugía traumatológica, cirugía maxilofacial, cirugía periodontal, cirugía ortognática, cirugía oral, cirugía de fisura palatina, tratamientos dentales, hueso osteoporótico, regeneración alveolar, fisuras óseas, fusiones óseas, relleno y regeneración ósea vertical y horizontal y técnicas de ingeniería de tejidos, así como para la liberación de sustancias con fines terapéuticos. En la presente invención, las expresiones "cerámica(s) nanocristalina(s)" o "cerámica(s) de carácter nanocristalino" o "nanocerámica(s)" son equivalentes e intercambiables y se refieren a cerámicas donde ninguna de las dimensiones de los cristales que componen dicha cerámica supera los 50 nm.
Se debe tener en cuenta que el uso en esta descripción y en las reivindicaciones de los artículos el/la, un/a/o incluye la referencia al plural a no ser que en el contexto se indique explícitamente lo contrario.
De forma más detallada, el método de la presente invención comprende las siguientes etapas:
1. SÍNTESIS DEL MATERIAL EN POLVO
Tal y como se ha comentado anteriormente en la presente invención, la cerámica que compone el andamio fabricado según el método reivindicado en la presente invención presenta una composición química basada en hidroxiapatitas nanocristalinas o bien no sustituidas o bien sustituidas con silicio. De forma más específica, las composiciones utilizadas para la preparación de la cerámica del presente método comprenden un compuesto de fórmula química: Ca1o(P04)6-x(Si04)x(OH)2-x, donde 0 < x < 0,5.
La cerámica se obtiene en forma de polvo según el método detallado en la literatura [ D. Arcos, J. Rodríguez-Carvajal and M. Vallet-Regí, Silicon incorporation in hydroxylapatite obtained by controlled crystallization, Chem. Mater. 2004, 16, 2300- 2308], mediante la precipitación controlada de disoluciones acuosas de sales precursoras de los componentes principales de la cerámica: Ca, P (que se encuentra en forma de ión fosfato), Si (que se encuentra en forma de ión silicato), y OH1_(iones hidroxi). La adición de la sal precursora de silicio o alcóxido de silicio es opcional, únicamente se requiere para la fabricación de andamios basados en cerámicas sustituidas con silicio. Por tanto, en el caso de que se desee fabricar un andamio basado en hidroxiapatitas no sustituidas se omitiría la adición de la disolución de la sal precursora del silicio.
La reacción se ajusta continuamente a pH básico mediante la adición de un agente basificante para garantizar así unas condiciones constantes a lo largo de todo el proceso de síntesis. Con la finalidad de obtener una distribución de tamaño de partícula multimodal, la temperatura del medio de reacción se hace variar durante la síntesis dentro de un intervalo entre la temperatura ambiente y la temperatura de ebullición del disolvente (agua) durante un intervalo de tiempo entre 30 minutos y tres horas pues durante este periodo de tiempo se produce la nucleación y crecimiento de los cristalitos. De esta forma, cambios en la temperatura a lo largo de ese período implican heterogeneidad en el tamaño del grano. Se obtiene así una cerámica en forma de polvo y con una distribución de tamaño de grano multimodal.
2. RECOGIDA Y MOLIENDA DEL MATERIAL EN POLVO
El material en polvo obtenido en la etapa anterior se seca a una temperatura entre 50°C y 80°C y se muele en un molino de bolas rotatorio. La granulometría se controla periódicamente hasta obtener al menos dos poblaciones diferentes de tamaño de partícula. La distribución de menor tamaño de partícula debe estar centrada en un valor de tamaño de partícula comprendido entre 1 y 20 mieras y la distribución de mayor tamaño de partícula debe estar centrada en valores de tamaño de partícula superiores a 25 mieras. Estas distribuciones de tamaño garantizan el acomodamiento de las partículas durante el posterior depósito en el proceso de impresión 3D.
3. PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN CERÁMICA
Esta etapa comienza con la preparación de una disolución monomérica en agua destilada donde la cantidad de componente monomérico a añadir varía entre el 2 y 4% en peso respecto a la masa de la mezcla final constituida por componente monomérico, surfactante y componente cerámico. Dicho componente monomérico se puede seleccionar entre acrilamidas, metacrilamidas, metilenbisacrilamidas, dimetacrilato de polietilenglicol, o combinaciones de los mismos. También pueden utilizarse polisacáridos como agar, agarosa, carragenina, alginato, o combinaciones de los mismos. En concreto, han demostrado ser especialmente eficaces metacrilamida y N,N ' -metilenbisacrilamida.
Sobre esta disolución se incorpora un surfactante en cantidades entre el 2 y 4% en peso respecto a la masa de la mezcla final constituida por componente monomérico, surfactante y componente cerámico. Dicho surfactante se selecciona entre polimetacrilato de amonio (por ejemplo, metacrilatos de amonio del tipo Darvan 811, Dolapix PC 67 o Dispex A40), polimetacrilato de sodio, poliacrilato de amonio, poliacrilato de sodio, hexametafosfato de sodio, pirofosfato de sodio decahidratado, o combinaciones de los mismos. En concreto, han demostrado ser especialmente eficaces los acrilatos y metacrilatos de amonio del tipo Darvan 811, Dolapix PC 67 o Dispex A40.
Se mantiene dicha disolución acuosa en agitación continua y se añade sobre ella el material en polvo obtenido en la etapa 2. La carga cerámica de dicha mezcla final en suspensión es siempre superior al 30% (v/v). El contenido total de aditivos orgánicos (monómero + surfactante) no debe superar el 5% en peso respecto a la masa total de la suspensión final. De esta forma se obtiene una pasta cerámica de elevada viscosidad, que se tamiza a través de una malla antes de incorporarse a los cartuchos inyectores del equipo de impresión 3D.
4. FABRICACIÓN DEL ANDAMIO POR PROTOTIPADO RÁPIDO
La fabricación del andamio se lleva a cabo mediante prototipado rápido usando un equipo de impresión 3D. La tinta cerámica en forma de suspensión obtenida en la etapa 3 se introduce en un inyector manteniéndose a una temperatura entre 5°C y 20°C durante el periodo de tiempo en el que se encuentra en el interior del inyector. Mediante extrusión con presión por medio de aire comprimido o pistón mecánico se hace que la tinta cerámica fluya a través de la punta inyectora para luego depositarse capa a capa sobre una placa calentada a temperaturas entre 50°C y 90°C.
De esta forma se construyen los andamios con formas libres y porosidad diseñada mediante el depósito capa a capa de la tinta cerámica descrita. El periodo de depósito transcurrido entre capas sucesivas debe ser igual o superior a 30 segundos, evitando así el colapso de las capas que constituyen el andamio.
5. CONSOLIDACIÓN DEL ANDAMIO
Las piezas obtenidas en la etapa anterior se secan en estufa a temperaturas de entre 60 y 90°C durante un periodo igual o superior a 12 horas. Estas condiciones están directamente relacionadas con la baja cantidad de aditivos orgánicos añadidos así como con la naturaleza acuosa de la tinta cerámica. El andamio, después de ese periodo de, como mínimo, 12 horas, queda así consolidado por secado total de la tinta cerámica y por el contacto de los aditivos poliméricos en la superficie de los granos de cerámica. 6. CALCINACIÓN DEL ANDAMIO
Una vez que las piezas han adquirido suficiente consistencia, se tratan a una temperatura entre 300°C y 600°C, pero en ningún caso a una temperatura superior a 600°C hasta eliminación total de los aditivos orgánicos incorporados. De este modo obtenemos piezas libres de materia orgánica, conservando el carácter nanocristalino de la cerámica que compone el andamio.
A continuación se adjunta un resumen de las características técnicas principales medidas en los andamios fabricados mediante el método reivindicado en la presente invención:
a) Las características técnicas microestructurales son las siguientes:
• Tamaño de cristal promedio: 10 a 30 nm
• Morfología del cristal: acicular, similar por tanto a la apatita biológica que se encuentra en el tejido óseo:
> Longitud promedio: 15 - 50 nm
> Anchura promedio: 5 - 10 nm
b) Las características técnicas relativas a la morfología del poro son las siguientes:
• Porosidad diseñada con entrecruzamiento tridimensional
• Volumen de porosidad diseñada: 35% o superior
• Grosor de la pared del andamio: superior a 600 μιη
c) Las características técnicas mecánicas son las siguientes:
• Tensión máxima previa a fractura: 0,556 - 1 ,06 MPa
• Deformación máxima previa a fractura: 2,85 - 6,54 %
• Módulo elástico: 100 - 200 MPa (similar al hueso trabecular) MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
A continuación se detalla un ejemplo de un modo de realización de la invención para la preparación de andamios macroporosos de hidroxiapatita sustituida con silicio de fórmula Caio(P04)5,7(Si04)0,3(OH)ls7.
1. Síntesis del material en polvo
El método de la invención comenzó con la síntesis de la cerámica de fórmula química Caio(P04)5;7(Si04)0j3(OH)1;7 siguiendo el procedimiento detallado en la literatura [D. Arcos, J. Rodríguez-Carvajal and M. Vallet-Regí, Silicon incorporation in hydroxylapatite obtained by controlled crystallization, Chem. Mater. 2004, 16, 2300- 2308]. Se partió de tres disoluciones acuosas: nitrato de calcio tetrahidrato, monohidrógeno fosfato de amonio y tetraetil ortosilicato en la proporción estequiométrica. Estas soluciones son las precursoras de los componentes principales de la cerámica: Ca, fosfato y silicato, respectivamente. Las disoluciones se incorporaron gota a gota sobre el medio de reacción en agitación continua. El pH de la reacción se ajustó continuamente a un valor entre 10 y 12 mediante la adición de una disolución de hidróxido de amonio para garantizar así unas condiciones constantes a lo largo de todo el proceso de síntesis. La temperatura al inicio de la reacción era de 20°C y se incrementó a una velocidad de 1°C por minuto hasta 80°C (temperatura al término de una hora). Una vez alcanzada la temperatura final, se mantuvo durante 12 horas en agitación. Se obtuvo la cerámica en forma de polvo y con una distribución de tamaño de grano multimodal.
2. Molienda y granulometría
El material en polvo obtenido en la etapa 1 se lavó con agua destilada hasta obtener pH = 7 en los líquidos de lavado. Una vez lavado, el material en polvo se secó a 60°C en estufa y se molió en molino de bolas. Para ello se incorporaron 65 gramos de material en un vaso de ágata de 250 mi de capacidad con 3 bolas de ágata de 2 cm de diámetro. Se llevó a cabo un primer proceso de molienda de 60 minutos de duración. A este primer proceso le siguieron otros procesos de molienda idénticos al primero salvo por el tiempo de duración (en estos procesos la duración era de 15 minutos) hasta obtener una granulometría con al menos dos poblaciones de tamaño de partícula distinto: una población de tamaño de partícula pequeño centrada en valores de tamaño de partícula en torno a 10 micrómetros de diámetro (en concreto, la mediana de dicha distribución era igual a 12 micrómetros) y una distribución de tamaño de partícula mayor centrada en valores de tamaño de partícula en torno a 50 micrómetros (en concreto, la mediana de dicha distribución era igual a 48 micrómetros) (ver figura 1).
3. Preparación de la tinta cerámica
Esta etapa comenzó con la preparación de una disolución del componente monomérico. Para ello se prepararon 25 mi de una disolución en agua destilada de N,N'-metilenbisacrilamida (0,3 gramos) y metacrilamida (1,5 gramos). Se mantuvo dicha disolución en agitación continua. Tras 6 horas de agitación, cuando los monómeros se encontraban totalmente disueltos, se añadieron 1,2 gramos de Darvan 811 que actuaba en calidad de agente surfactante. La mezcla se dejó durante una hora en agitación y se incorporaron lentamente 30 gramos del material en polvo obtenido en la etapa anterior manteniendo la agitación continua. De esta forma se consiguió una pasta cerámica de alta viscosidad.
Para eliminar las partículas de tamaño superior a 100 mieras, la pasta cerámica se cribó a través de un tamiz con 100 mieras de tamaño de malla. Con ello se consiguió una tinta cerámica de alta viscosidad, capaz de fluir por una punta inyectora de 600 mieras, a una temperatura de 15°C y con una presión de 0,035 bares.
4. Fabricación del andamio cerámico
Esta etapa comenzó con la generación de un fichero CAD o fichero que contiene el diseño en 3D asistido por ordenador del andamio. En dicho fichero se especificó la morfología externa, el patrón de porosidad y el tamaño de los poros del andamio. Dicho fichero se cargó en el equipo de impresión 3D y se fijaron asimismo cada uno de los parámetros de fabricación que permitía el equipo:
Temperatura de la pasta: 15°C
Temperatura de la placa de depósito (donde se depositan las capas de pasta cerámica): 55°C
Velocidad de impresión: 300 mieras/segundo
Presión de inyección: 0,035 bares
Ancho de la punta inyectora: 600 mieras
La tinta cerámica en forma de suspensión obtenida en la etapa 3 se introdujo en un inyector manteniéndose a una temperatura de 15°C durante el periodo de tiempo en el que la tinta se encontraba en el interior del inyector. Mediante extrusión con presión por medio de aire comprimido o pistón mecánico se hizo que la tinta cerámica fluyera a través de la punta inyectora para luego depositarse capa a capa sobre una placa precalentada a una temperatura de 55°C. La velocidad de impresión se ajustó a un valor que permitiera un mínimo de 30 segundos entre capa y capa, favoreciendo así el secado de las capas inferiores y evitando el colapso del andamio.
5. Consolidación del andamio
El andamio obtenido en la etapa anterior se llevó rápidamente a una estufa precalentada a 70°C, y se mantuvo dentro de la estufa durante 12 horas. Tras este periodo, las piezas estaban totalmente secas y las partículas de cerámica consolidadas a través del contacto de los aditivos poliméricos en su superficie.
6. Calcinación del andamio
Las piezas consolidadas resultantes de la etapa anterior se sometieron a una temperatura de 600°C durante 2 horas, eliminando toda la materia orgánica pero sin modificar el carácter nanocristalino de la fase cerámica, que queda como único componente del andamio.
La tabla 1 recoge los valores de superficie específica y composición química en peso obtenidos para diez lotes de andamios de la fórmula Ca)o(P04)5;7(Si04)o,3(OH)1;7. A partir de los datos de la tabla se observa, en primer lugar, la presencia del silicio en todos los lotes. Dada la dificultad que supone la incorporación de silicio a la fase apatita, principalmente por la posibilidad de que el precursor de silicio añadido en la reacción pueda perderse con los líquidos de lavado, resulta especialmente notorio y satisfactorio el hecho de que el Si esté presente en todos los lotes con un margen de error de ± 0,09%.
Por otra parte, la superficie específica es una variable que se relaciona con el tamaño de cristal. Cuando la cerámica está tratada a alta temperatura y, como resultado de ello, los cristales de la misma son grandes, el valor de la superficie específica es muy pequeño (inferior a 10 m /g). Para los diez lotes de andamios preparados mediante el método de la presente invención, el valor de la superficie específica oscila entre 80 y 95 m /g, hecho que se explica por la naturaleza nanocristalina de la cerámica.
Asimismo queda demostrada la reproducibilidad del método pues las diferencias en porcentajes, entre los distintos lotes, para cada uno de los distintos elementos de cada lote están dentro del rango de incertidumbre del método de análisis utilizado.
Superficie
especifica % Ca % H % o % P % Si
(m2/g)
1 94,92 42,13 0,18 38,49 18,66 0,47
2 90,2 41,84 0,18 38,64 18,83 0,45
3 95,35 39,82 0,18 41 ,38 18,21 0,37
4 89,14 40,00 0,18 40,84 18,56 0,37
5 95,39 41 ,93 0,18 38,35 19,01 0,49
6 92,05 41 ,95 0,18 38,23 19,18 0,41
7 94,62 44,84 0,18 34,89 19,65 0,40
8 79,85 44,73 0,18 34,65 20,18 0,34 θ 82,53 44,77 0,18 34,84 19,88 0,33
10 85,23 42,99 0,18 37,11 19,29 0,43
Tabla 1
Mediante el método de la presente invención y siguiendo específicamente el modo de realización descrito, se prepararon dos series de andamios con las siguientes características:
SERIE 1.
• Tamaño de cristal promedio: 12,7 nm
• Morfología del cristal: acicular
> Longitud promedio: 18,7 nm
> Anchura promedio: 6,7 nm
b) Las características técnicas relativas a la morfología del poro son las siguientes:
• Porosidad diseñada con entrecruzamiento tridimensional
• Volumen de porosidad del 37%
• Grosor de la pared del andamio: 700 (+/- 10) μιη
c) Las características técnicas mecánicas son las siguientes:
• Tensión máxima previa a fractura: 0,727 (+/- 0,171) MPa
• Deformación máxima previa a fractura: 3 ,98 (+/- 1,13) %
• Módulo elástico: 120 (+/- 12) MPa SERIE 2.
• Tamaño de cristal promedio: 16,1 nm
• Morfología del cristal: acicular
> Longitud promedio: 23,8 nm
Anchura promedio: 8,5 nm
b) Las características técnicas relativas a la morfología del poro son las siguientes:
• Porosidad diseñada con entrecruzamiento tridimensional
• Volumen de porosidad del 35%
· Grosor de la pared del andamio: 720 (+/- 8) μηι
c) Las características técnicas mecánicas son las siguientes:
• Tensión máxima previa a fractura: 0,926 (+/- 0,132) MPa
• Deformación máxima previa a fractura: 4,87 (+/- 1,67) %
• Módulo elástico: 122 (+/- 9) MPa
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra la distribución del tamaño de partícula de un material en polvo de fórmula Ca10(PO4)5j(SiO4)0 (OH)li7 obtenido tras el proceso de molienda correspondiente a la etapa 2 del método de preparación de andamios reivindicado en la presente invención. En dicha gráfica, los valores de frecuencia de partículas (expresados en %) se representan frente al tamaño de partícula (expresado en μπι). Al observar la figura, se pueden diferenciar fácilmente dos poblaciones de tamaño de partícula. La primera de ellas está centrada en valores de tamaño de partícula en torno a 10 micrómetros de diámetro (en concreto, la mediana de dicha distribución es igual a 12 micrómetros), constituyendo la población de tamaño de partícula pequeño. La segunda población, más amplia, está centrada en valores de tamaño de partícula en torno a 50 micrómetros (en concreto, la mediana de dicha distribución es igual a 48 micrómetros), constituyendo la población de tamaño grande. Esta distribución es esencial en el proceso, puesto que durante el depósito por impresión 3D, las partículas de la población de tamaño pequeño rellenan los espacios intergranulares dejados por las partículas de la población de tamaño grande.
La figura 2 muestra un diagrama de difracción de rayos X (intensidad de reflexión (cuentas) frente a ángulo de reflexión (2Θ)) correspondiente a un andamio de hidroxiapatita sustituida con silicio de fórmula Caio(P04)5>7(Si04)o,3(OH)1>7 obtenido según el método de la presente invención. La anchura del perfil de los máximos de difracción es indicativa del pequeño tamaño de cristal que forma dicha fase, en otras palabras, mediante este difractograma se comprueba el carácter nanocristalino de la hidroxiapatita sustituida con silicio del andamio. El máximo identificado con los índices 0 0 4 representa una familia de planos cristalinos paralelos entre sí, perpendiculares al eje c y paralelos a los ejes a y b de la celda unidad de la fase apatita. Dicho máximo presenta una intensidad anómalamente elevada y un perfil más estrecho, lo que indica que el cristal ha crecido más en la dirección del eje c, lo que conduce a una morfología acicular de los cristalitos de apatita asemejándose así a los del componente mineral del hueso.
La figura 3 muestra una representación del tamaño y morfología del cristal de la hidroxiapatita sustituida con silicio, de fórmula Ca10(PO4)5>7(SiO4)0j3(OH)ii7, del andamio que se ha obtenido según el método de la presente invención. El gráfico se ha construido a partir de la información, obtenida por difracción de rayos X, acerca del crecimiento del cristal en todas y cada una de las direcciones, y se representa a lo largo de la dirección [001] (dirección del eje c de la celda unitaria de la apatita) y [100] (dirección del eje a de la celda unitaria de la apatita). Dicha figura demuestra el carácter nanocristalino y la morfología acicular de los cristales de hidroxiapatita sustituida con silicio, donde el tamaño de cristal es de 18,7 nm y 6,7 nm a lo largo de las direcciones [001] y [100], respectivamente. Es importante señalar que el sistema cristalino de la apatita es un sistema cristalino hexagonal donde la magnitud a es igual a b pero distinta de c.
La figura 4 presenta algunos ejemplos de la apariencia exterior de los andamios macroporosos cerámicos puros, de cerámica nanocristalina no sustituida y sustituida con silicio, obtenidos siguiendo el método de preparación expuesto en la presente invención.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable en el que la cerámica preparada en la etapa (a) comprende apatita no sustituida o apatita sustituida con silicio.
2. Andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según la reivindicación 1, en el que la cerámica comprende un compuesto de fórmula: Ca10(PO4)6-x(SiO4)x(OH)2-x, donde 0 < x < 0,5.
3. Andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según la reivindicación 2, en el que la cerámica comprende un compuesto de fórmula: Ca1o(P04)5j7(Si04)0j3(OH)1;7.
4. Andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el tamaño medio de cristal de la cerámica es inferior a 50 nm.
5. Andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según la reivindicación 4, en el que el tamaño medio de cristal de la cerámica está dentro del intervalo entre 10 nm y 30 nm.
6. Andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la morfología del cristal de la cerámica es acicular, estando comprendida la longitud promedio del cristal entre 15 y 50 nm y la anchura promedio entre 5 y 10 nm.
7. Andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en el que el volumen de porosidad del andamio es del 35% o superior.
8. Andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la tensión máxima previa a la fractura del andamio está dentro del intervalo entre 0,556 MPa y 1,060 MPa.
9. Andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la deformación máxima previa a la fractura del andamio está dentro del intervalo entre un 2,85% y un 6,54%.
10. Andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el módulo elástico del andamio está dentro del intervalo entre 100 y 200 MPa.
11. Método para la preparación de un andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable que comprende las siguientes etapas:
(a) Preparación de una biocerámica con estructura nanocristalina a partir de la precipitación controlada de disoluciones acuosas de sales precursoras de los componentes principales de la cerámica de forma que se obtenga una distribución de tamaño de grano multimodal en la cerámica.
(b) Molienda de la biocerámica nanocristalina en polvo obtenida en el apartado anterior hasta obtener una granulometría con al menos dos distribuciones diferentes de tamaño de partícula.
(c) Preparación de la tinta cerámica suspendida en medio acuoso y estabilizada con una mezcla comprendida por un componente monomérico al que se le añade un agente surfactante donde el contenido total de dicha mezcla debe ser inferior o igual al 5% en peso respecto a la masa total de la suspensión que constituye la tinta cerámica.
(d) Fabricación del andamio macroporoso por prototipado rápido mediante impresión tridimensional.
(e) Consolidación del andamio por secado de la tinta cerámica.
(f) Calcinación del andamio sometiendo la pieza a una temperatura entre 300°C y 600°C.
12. Método para la preparación de un andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según la reivindicación 1 1, en el que la biocerámica preparada en la etapa (a) comprende apatita no sustituida o apatita sustituida con silicio.
13. Método para la preparación de un andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según la reivindicación 12, en el que la biocerámica preparada en la etapa (a) comprende un compuesto de fórmula: Ca10(PO4)6-¾(SiO )^(OH)2-x, donde 0 < x < 0,5.
14. Método para la preparación de un andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según cualquiera de las reivindicaciones 1 1-13, en el que en la etapa (a) la biocerámica se obtiene con una distribución de tamaño de partícula multimodal por medio de la variación gradual de la temperatura durante el proceso de síntesis.
15. Método para la preparación de un andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según la reivindicación 14, en el que en la etapa (a) se hace variar la temperatura dentro de un intervalo entre 10°C y 95°C durante un intervalo de tiempo entre 30 minutos y tres horas.
16. Método para la preparación de un andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según la reivindicación 15, en el que en la etapa (a) la temperatura al inicio de la reacción es de 20°C y se incrementa a una velocidad de 1°C por minuto hasta 80°C (temperatura al término de una hora).
17. Método para la preparación de un andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en el que la distribución de tamaño de partícula menor obtenida en la etapa (b) está centrada en un valor de tamaño de partícula comprendido entre 1 y 20 micrómetros y la distribución de tamaño de partícula mayor obtenida en la etapa (b) está centrada en valores de tamaño superiores a 25 micrómetros.
18. Método para la preparación de un andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según cualquiera de las reivindicaciones 11-17, en el que el componente monomérico de la mezcla empleada para estabilizar la tinta cerámica en la etapa (c) se selecciona entre acrilamidas, metacrilamidas, metilenbisacrilamidas, dimetacrilato de polietilenglicol o combinaciones de los mismos, pudiéndose utilizar también polisacáridos como agar, agarosa, carragenina, alginato o combinaciones de los mismos, y la proporción de componente monomérico respecto a la mezcla total constituida por componente monomérico, surfactante y componente cerámico está comprendida entre 2 y 4% en peso.
19. Método para la preparación de un andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según cualquiera de las reivindicaciones 11-18, en el que en la etapa (c) el surfactante que se añade sobre la disolución monomérica se selecciona entre polimetacrilato de amonio, polimetacrilato de sodio, poliacrilato de amonio, poliacrilato de sodio, hexametafosfato de sodio, pirofosfato de sodio decahidratado o combinaciones de los mismos, y la proporción de surfactante respecto a la mezcla total constituida por componente monomérico, surfactante y componente cerámico está comprendida entre 2 y 4% en peso.
20. Método para la preparación de un andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según las reivindicaciones 18 y 19, en el que la carga cerámica final de la tinta preparada en la etapa (c) es superior al 30% (v/v).
21. Método para la preparación de un andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según cualquiera de las reivindicaciones 1 1 -20, en el que en la etapa (d) de fabricación del andamio la tinta cerámica se introduce en un inyector manteniéndose a una temperatura entre 5°C y 20°C mientras está en el interior del inyector y se deposita capa a capa sobre una placa calentada a temperaturas entre 50°C y 90°C teniendo en cuenta que el periodo de depósito transcurrido entre capas sucesivas debe ser igual o superior a 30 segundos.
22. Método para la preparación de un andamio tridimensional cerámico puro, de cerámica nanocristalina, bioactivo, biocompatible y biodegradable según cualquiera de las reivindicaciones 1 1-21, en el que en la etapa (e) de consolidación del andamio las piezas se secan en estufa a temperaturas de entre 60°C y 90°C durante un período igual o superior a 12 horas.
23. Uso del andamio según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para la fabricación de implantes para su aplicación en biomedicina.
24. Uso según la reivindicación 23 donde las aplicaciones biomédicas del andamio se seleccionan entre cirugía traumatológica, cirugía maxilofacial, cirugía periodontal, cirugía ortognática, cirugía oral, cirugía de fisura palatina, tratamientos dentales, hueso osteoporótico, regeneración alveolar, fisuras óseas, fusiones óseas, relleno y regeneración ósea vertical y horizontal, y técnicas de ingeniería de tejidos, así como para la liberación de sustancias con fines terapéuticos.
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