WO2012007623A2 - Sistema de liberación controlada activado por oligonucleótidos - Google Patents

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    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the present describes a new system for controlled release, preferably of active substances, in response to the presence of oligonucleotides as a specific stimulus.
  • supports such as microcapsules (M. Hamidi, et al., Adv. Drug Delivery Rev. 2008, 17, 1638;), micelles (CW Pouton, et al., Adv. Drug Delivery Rev. 2008 , 17, 625;), vesicles (CJF Rijckenet al., Controlled Relay 2007, 120, 131;), or liposomes (TL Andresen, et al., Prog. Lipid Res. 2005, 44, 69), the use of supports Inorganic mesoporous has been little used in comparison. These supports can be synthesized in a wide variety of morphologies with a defined pore size, and have a high specific surface area.
  • porous silicas of the type MCM-41, HMS, MSU-n, MSU-V, FSM-16, KSW-2, SBA-n (n 1, stand out for their use 2, 3, 8, 11-16) UVM-7, UVM-8, M-UVM-7 or M-UVM-8.
  • These are characterized by having a particle size between 1-100 and m and a specific surface area of 200-1100 m 2 / g.
  • siliceous materials whose charge is released in the presence of an enzyme that is capable of hydrolyzing certain bonds in the organic molecules that act as a gate (Patel, K. et al., J. Am. Chem. Soc, 2008, 130, 2382-2383; Schlossbauer, A. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2009, 48, 3092-3095 and Bernardo, A. et al., Angew. Chem. Int Ed.
  • the invention is within the field of controlled release system design in response to specific external stimuli. Because the use of nucleic acids has not been described as a specific stimulus in the controlled release of bioactive substances, the present invention combines the use of active substance containers with nucleic acids to develop a new controlled release system.
  • the system is based on the surface modification of the material containing the active substance, which by supramolecular interaction blocks the exit of the pores of the material by an oligonucleotide, inhibiting its release.
  • the interface between the support and the oligonucleotide occurs through a coordinating group attached to the container material by covalent bonding and by supramolecular interaction to the oligonucleotide.
  • the system is activated by contacting it with a solution containing the complementary nucleic acid, preferably under tested conditions, so that hybridization occurs between both nucleotide chains and in this way the pore will open and an exit of the substance will occur. active inside the solid nanodevice.
  • its release can be applied for the detection of an oligonucleotide hybridization that covers the pores of the support or can be applied to the controlled release of a substance biologically active when there is hybridization of the oligonucleotide.
  • Another object of the present invention is the process for the preparation of systems containing the controlled release system described in the preceding paragraphs.
  • Figure 1 shows a preferred embodiment of the invention, indicating a set of a nanodevice, in this case of the type MCM-41, loaded with fluorescein and modified superficially by reaction with aminopropyltrietaxysilane, which in turn is bound to an oligonucleotide by supramolecular interactions .
  • Figure 2 represents the reaction of the oligonucleotide attached to the nanodevice in the presence of its completely complementary oligonucleotide, leading to a more specific hybridization and freeing the pores of the nanodevice, releasing the fluorescein contained therein.
  • Figure 3 compares the reaction of the oligonucleotide bound to the nanodevice with several oligonucleotides, measured in the variation of the fluorescence of the solution measured at 516 nm (X exc 419 nm) according to the amount of fluorescein released after hybridization.
  • the first object of the present invention is a new opening system activated by the presence of specific oligonucleotides and which can be applied in new detection formats or in controlled release processes, depending on the content of the support.
  • This system is based on blocking the pores of the support by an oligonucleotide, thus containing the active substance within the support.
  • oligonucleotide For the activation of the release of the substance occurs in the presence of a second activating oligonucleotide and complementary to this first oligonucleotide, fixed to the support. Since hybridization of the second oligonucleotide with the first oligonucleotide is a stronger interaction than that existing with the active substance's container material, hybridization unlocks the exit of the pores by releasing the substance within the support.
  • the interaction of the first oligonucleotide that has to be fixed to the support occurs with it through supramolecular interactions, preferably electrostatic with the material containing the substance to be released.
  • the system is composed of:
  • the complementary oligonucleotide of the one to be recognized which is adsorbed to the surface by supramolecular interactions (such as electrostatic interactions) blocking the release of the active substance.
  • the support may consist of metals, semiconductors, organic polymers, carbons or oxides, preferably of different inorganic species, such as titanium, zirconium, silicon, magnesium or boron.
  • the MCM-41 support has been used.
  • the interface layer is covalently bound to the support and is capable of giving supramolecular, preferably electrostatic, interactions with the oligonucleotide.
  • the choice of support must be made taking into account its compatibility with the active substance to be released and the possibility of surface modification with the interface layer.
  • the interaction between this layer and the oligonucleotide must be strong enough to prevent separation of the blocking oligonucleotide in the absence of the activating oligonucleotide and 100% complementary, but weak enough compared to hybridization between the oligonucleotides so that in the presence of the activator Liberation occurs.
  • it is essential to select the species, topology and surface concentration in the composition of the interface layer.
  • this may be a DNA or RNA chain formed between 10 and 50 nucleotides.
  • said nucleotides can be covalently bound to other inorganic particles, such as cadmium sulfide nanoparticles or magnetic nanoparticles.
  • the systems thus developed can be part of polymers or scaffolds for, among other applications, tissue regeneration or cell differentiation, depending of the biological active substance present in the support and which is released after hybridization of the oligonucleotides.
  • the support comprises an indicator, dye, fluorescent substance, or the like, its release can be used for the detection of the oligonucleotide, both for monitoring and quantification.
  • the support is of the mesoporous silicon oxide type and the interface layer consists of a layer of compounds with positive charge at the test pH of the system, such as amines or guanidinium salts, and the oligonucleotide is formed by DNA strands. or RNA between 15 and 30 nucleotides.
  • the second aspect of the invention refers to the process for the preparation of controlled release systems. Said procedure comprises the following steps:
  • buffered media at physiological pH, especially pH 7.5 with a 37.5 mM MgCl 2 mixture, 20 mM Tris-HCl, are preferred.
  • the invention comprises the use of the controlled release systems set forth above for the determination of oligonucleotide chains - in the event that the materials are loaded with indicators, dyes, fluorescent or similar substances - or for controlled release in response to the presence of oligonucleotides in solution for the release of other active substances (drugs, biocides, etc.) in cellular media, or biological systems.
  • step b) Measure the macroscopic signal produced in step b) and optionally quantify said signal by interpolation in a calibration curve.
  • the signal produced will depend on the indicator present in the support and released by the hybridization of the oligonucleotides. For example, absorbance, fluorescence, etc. could be measured.
  • buffered media at physiological pH, especially pH 7.5 with a 37.5 mM MgCl 2 mixture, 20 mM Tris-HCl, are preferred.
  • 5 mg of an MCM-41 type carrier loaded with fluorescein and superficially modified with aminopropyltriethoxysilane (amine concentration determined by thermogravimetric analysis 1.98 mmol / g Si0 2 ) were weighed and suspended in 5 mL of a solution buffered to pH 7.5 (37.5 mM MgCl 2 , 20 mM Tris-HCl) and containing oligonucleotide 0-1 (5'- AATGCTAGCTAAT CAATCGGG-3 ') at a concentration of 20 nmol / g solid and allowed to stir at 37 ° C for half an hour. The suspension was then centrifuged for 5 minutes at 5000 rpm and the solution was separated, washing the solid with 5 mL of the buffered solution. This suspension was separated again by centrifugation, thus obtaining the SI set.
  • pH 7.5 37.5 mM MgCl 2 , 20 mM Tris-HCl
  • oligonucleotide 0-1
  • Figure 1 shows a diagram of this SI set obtained, where 1.1 is the first 0-1 oligonucleotide, indicated in detail in the lower part of the figure; 1.2 is the aminopropylsilane chain generated by the reaction of the aminopropyltriethoxysilane with the surface of the support, indicated in detail at the bottom right; 1.3 is the MCM-41 support; 1.4 is the fluorescein contained in the pores of the support, indicated in detail in the upper right; and 1.5 indicates the SI set.
  • a 0-1 '(5'-AATGCTAGCTAATCAATCGGG-Cy5-3') oligonucleotide was used, labeled with Cy5 at the 3 'end, attached to the support by the mechanism described above.
  • the quantification was carried out by calculating the fluorescence of the solution after the solid was anchored, having a content of 17 nanomoles / g solid.
  • oligonucleotide 0-3 (5 '- CCCGATTGATTCTCTAGCATT-3'), with two different bases with respect to oligonucleotide 0-2 in the central position, or in the presence of oligonucleotide 0-4 (5 '-CCCGATTGATTGGCTAGCATT-3 ', with only a different base with respect to oligonucleotide 0-2 in the central position) at the same concentration, or in the absence of any nucleotide.
  • the fluorescence intensity was measured for a total of 180 minutes.
  • the results are illustrated in Figure 3, where a) represents the fluorescence measured by adding oligonucleotide 0-2; b) represents the fluorescence measured by adding oligonucleotide 0-3; c) represents the fluorescence measured by adding oligonucleotide 0-4 and d) represents the fluorescence measured in the absence of any nucleotide, but by adding the rest of the components of the mixture. A slight release of the contents of the pores is observed even when no nucleotide is present, so there may be a small and insignificant degradation of the 0-1 oligonucleotide binding to the support.

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Abstract

La invención describe un nuevo sistema para la liberación controlada, preferiblemente de sustancias activas o de detección, en respuesta a la presencia de oligonucleótidos como estímulo específico. Además se ha desarrollado una preparación de sistemas conteniendo el sistema de liberación controlada descrito anteriormente, junto con un método para la determinación de secuencias de ácidos nucleicos específicos en disoluciones acuosas.

Description

SISTEMA DE LIBERACIÓN CONTROLADA ACTIVADO POR
OLIGONUCLEÓTIDOS DESCRIPCIÓN
OBJETO DE LA INVENCIÓN
La presente describe un nuevo sistema para la liberación controlada, preferiblemente de sustancias activas, en respuesta a la presencia de oligonucleótidos como estimulo especifico.
Además se ha desarrollado una preparación de una aplicación de éste sistema, su uso para la detección de oligonucleótidos y especies biológicas, entre otros, y una metodología para su utilización.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En las últimas décadas el desarrollo de la química de coordinación y la química supramolecular ha dado lugar al nacimiento de nuevos conceptos relacionados con el diseño de dispositivos a escala nanométrica que permitan liberar sustancias químicas de forma controlada. El control de la liberación de ciertas sustancias es muy importante, ya que cuando se pretende liberar sustancias anticancerígenas, como el Taxol o la Doxorrubicina, se necesita que exista una liberación de esta sustancia únicamente en zonas localizadas, en este caso con células tumorales. La respuesta a eventos que ocurren en sistemas biológicos, de forma que estos sean autorregulados , ha sido explorada en el desarrollo de materiales de liberación controlada en respuesta a la relación glucosa/insulina o modificaciones de pH, o anticuerpos. Sin embargo, hasta el momento, el uso de la hibridación de ADN o ARN con sus complementarios no ha sido explorado como estímulo para procesos de liberación controlada .
Ciertos sistemas de liberación actuales tienen lugar mediante una simple dispersión, mientras que el mecanismo de otros sistemas, tales como la biodegradacion de soportes poliméricos requieren disolventes orgánicos durante el proceso de cargado, lo cual puede afectar a la estructura de la sustancia encapsulada.
Entre el uso de otros tipos de soportes, como microcápsulas (M. Hamidi, et al., Adv. Drug Delivery Rev. 2008, 17, 1638;), micelas (C.W. Pouton, et al., Adv. Drug Delivery Rev. 2008, 17, 625;), vesículas (C. J. F. Rijckenet al., Controlled Reléase 2007, 120, 131;), o liposomas (T. L. Andresen, et al., Prog. Lipid Res. 2005, 44, 69), el empleo de soportes mesoporosos inorgánicos ha sido en comparación poco empleado. Estos soportes pueden ser sintetizados en una amplia variedad de morfologías con un tamaño de poro definido, y presentan una elevada superficie específica. Entre los diferentes óxidos que se pueden utilizar como soporte, destacan por su uso las sílices porosas del tipo MCM-41, HMS, MSU-n, MSU-V, FSM-16, KSW-2, SBA-n (n= 1, 2, 3, 8, 11-16) UVM-7, UVM-8, M-UVM-7 o M-UVM-8. Éstas se caracterizan por tener un tamaño de partícula comprendido entre 1-100 ym y una superficie específica de 200-1100 m2/g.
La modificación química de este tipo de materiales permite desarrollar sistemas de liberación controlada más sofisticados, ya que se pueden diseñar válvulas moleculares que contengan en su interior sustancias químicas que pueden ser transportadas a un sitio específico del organismo y ser liberadas de forma controlada mediante estímulos externos (Descalzo AB, et al., Angew. Chem Int. Ed 2006, 45, 5924- 48; y Ariga K, et al., Chem Rev 2007, 251, 2562-91;) o provocados a nivel celular. Recientemente se han descrito algunos materiales funcionalizados con puertas moleculares mediante el empleo de estructuras sólidas nanoscópicas organizadas (mesoporosos del tipo MCM-41) en las que se han anclado moléculas orgánicas funcionales en su superficie externa. De esta manera se han descrito materiales funcionalizados con puertas moleculares cuyos ciclos de apertura/cierre están controlados por la presencia de ciertos aniones, cambios en el pH del medio, temperatura, reacciones redox y la irraduación con luz (Casasús, R. Et al., J. Am. Chem. Soc , 2008, 130, 1903-1917; Angelos, S. Et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 2222-2226; Fu, Q. Et al., Adv Mater. 2003, 15, 1262; Trewyn, B.G. Et al., Acc. Chem. Res, 2007, 40, 846-853; Radu, D.R. et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 13216-13217; Slowing, I.I. et al., Adv Funct. Mater., 2007, 17, 1225-1236; Liu, N. et al., Nano Lett., 2004, 4, 551-554; Vivero-Escoto, J. L. et al., J. Am. Chem. Soc, 2009, 131, 3462-3463 y Aznar, E. Et al., J. Am. Chem, Soc, 2009, 131, 6833-6843). Adicionalmente, hay muy pocos materiales híbridos con puertas moleculares que muestren una liberación selectiva en presencia de bio-moléculas , pero en ningún caso ha sido descrito un sistema parecido en el que el estimulo sea la presencia de un oligonucleótido (ADN o ARN) . Asi, muy recientemente, se han descrito tres ejemplos de materiales silíceos cuya carga es liberada en presencia de una enzima que es capaz de hidrolizar determinados enlaces en las moléculas orgánicas que actúan como puerta (Patel, K. et al., J. Am. Chem. Soc, 2008, 130, 2382-2383; Schlossbauer, A. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2009, 48, 3092-3095 y Bernardo, A. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 5884- 5887), y un ejemplo en el cual se emplean anticuerpos que interaccionan con un hapteno anclado a la superficie del material y que permiten la liberación de especies bioactivas en presencia del antigeno correspondiente, debido a que la afinidad del anticuerpo por el antigeno es mayor que por el hapteno anclado a la superficie del material híbrido diseñado (Climent, E. Et al., J. Am. Chem. Soc, 2009, 131, 14075-14080).
De entre los sistemas patentados existentes, en las patentes descritas por J. Zink, F. Stoddart y colaboradores (WO 2009/094580 y WO 2009/097439) utilizan nanodispositivos para producir una liberación controlada empleando reacciones de oxidación-reducción o cambios de pH como estímulos para el mecanismo de apertura/cierre, mientras que en otros ejemplos, tales como los descritos por V. Lin y colaboradores en US2006/154069 o US2009/0252811 utilizan nanoparticulas de CdS o diferentes polímeros para recubrir el material sintetizado. Así, no existen demasiados estímulos específicos descritos para producir nuevos sistemas de liberación controlada, siendo un campo que debido a sus potenciales aplicaciones es de gran interés.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La invención se encuentra dentro del campo del diseño de sistemas de liberación controlada en respuesta a estímulos externos específicos. Debido a que el empleo de ácidos nucleicos no ha sido descrito como un estímulo específico en la liberación controlada de sustancias bio- activas, la presente invención combina el uso de contenedores de sustancias activas con ácidos nucleicos para desarrollar un nuevo sistema de liberación controlada.
En esta invención, el sistema se basa en la modificación superficial del material que contiene la sustancia activa, el cual por interacción supramolecular bloquea la salida de los poros del material mediante un oligonucleótido, inhibiendo su liberación. La interfase entre el soporte y el oligonucleótido se produce a través de un grupo coordinante unido al material contenedor por enlace covalente y por interacción supramolecular al oligonucleótido. El sistema es activado al ponerlo en contacto con una disolución que contenga el ácido nucléico complementario, preferiblemente en condiciones ensayadas, para que se produzca una hibridación entre ambas cadenas de nucleótidos y de esa manera se abrirá el poro y se producirá una salida de la sustancia activa del interior del nanodispositivo sólido.
Según el contenido del soporte, se puede aplicar la liberación del mismo para la detección de una hibridación del oligonucleótido que tapa los poros del soporte ó se puede aplicar a la liberación controlada de una sustancia activa biológica cuando haya una hibridación del oligonucleótido.
Otro objeto de la presente invención es el procedimiento para la preparación de sistemas conteniendo el sistema de liberación controlada descrito en los párrafos anteriores.
Además, es objeto de la presente invención el desarrollo de un método para la determinación de secuencias de ácidos nucleicos especificas en disoluciones acuosas.
Se considera incluidos en esta descripción por referencia los distintos modos particulares de llevar a cabo esta invención definidos por las reivindicaciones dependientes 2 a 14, 16 a 18, 20 a 23 y 25 a 27.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Se complementa la presente memoria descriptiva con planos, ilustrativos de un ejemplo preferente y nunca limitativo de la invención.
La Figura 1 muestra una realización preferente de la invención, indicando un conjunto de un nanodispositivo, en este caso del tipo MCM-41, cargado con fluoresceina y modificado superficialmente por reacción con aminopropiltrietaxisilano, que a su vez está unido a un oligonucleótido por interacciones supramoleculares .
La Figura 2 representa la reacción del oligonucleótido unido al nanodispositivo en presencia de su oligonucleótido completamente complementario, llevando a una hibridación más especifica y dejando libre los poros del nanodispositivo, liberando la fluoresceina contenida del mismo .
La Figura 3 compara la reacción del oligonucleótido unido al nanodispositivo con varios oligonucleótidos , medido en la variación de la fluorescencia de la disolución medida a 516 nm (Xexc 419 nm) según la cantidad de fluoresceina liberada tras la hibridación.
EXPOSICIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El primer objeto de la presente invención es un nuevo sistema de apertura activado por la presencia de oligonucleótidos específicos y que pueda ser aplicado en nuevos formatos de detección o en procesos de liberación controlada, dependiendo del contenido del soporte.
Este sistema se basa en el bloqueo de los poros del soporte mediante un oligonucleótido, conteniendo de esta forma la sustancia activa dentro del soporte. Para la activación de la liberación de la sustancia se produce en presencia de un segundo oligonucleótido activante y complementario a este primer oligonucleótido, fijado al soporte. Como la hibridación del segundo oligonucleótido con el primer oligonucleótido es una interacción más fuerte que la existente con el material contenedor de la sustancia activa, la hibridación desbloquea la salida de los poros liberando la sustancia dentro del soporte.
La interacción del primer oligonucleótido que se tiene que fijar al soporte, se produce con este mismo a través de interacciones supramoleculares , preferentemente electrostáticas con el material que contiene la sustancia a liberar .
Obtenemos mediante este sistema una innovadora aproximación para el desarrollo de sistemas de liberación controlada, que es además de gran selectividad dado que se basa en la hibridación de hebras complementarias de ADN ó ARN.
En una realización particular, el sistema se encuentra compuesto por:
- un soporte poroso con capacidad para contener la sustancia activa o el indicador;
una capa interfaz entre el soporte poroso y el oligonucleótido que asegura su fijación en la superficie y
- el oligonucleótido complementario de aquél que se desea reconocer, el cual se encuentra adsorbido a la superficie por interacciones supramoleculares (tales como interacciones electrostáticas) bloqueando la liberación de la sustancia activa.
El soporte puede estar formado por metales, semiconductores, polímeros orgánicos, carbones u óxidos, preferiblemente de diferentes especies inorgánicas, tales como el titano, zirconio, silicio, magnesio o boro. Entre las sílices de elevada superficie específica que se pueden emplear como soporte, existe el tipo MCM-41, HMS, MSU-n, MSU-V, FSM-16, KSW-2, SBA-n (n=l, 2, 3, 8, 11-16) UVM-7, UVM-8, M-UVM-7 ó M-UVM-8, entre otros. Preferiblemente se ha usado el soporte MCM-41.
La capa interfaz se encuentra unida covalentemente al soporte y es capaz de dar interacciones supramoleculares , preferentemente electrostáticas, con el oligonucleótido .
La elección del soporte ha de realizarse teniendo en cuenta su compatibilidad con la sustancia activa a liberar y la posibilidad de modificación superficial con la capa de interfaz. La interacción entre esta capa y el oligonucleótido ha de ser lo suficientemente fuerte para evitar la separación del oligonucleótido bloqueante en ausencia del oligonucleótido activador y complementario al 100%, pero lo suficientemente débil en comparación con la hibridación entre los oligonucleótidos para que en presencia del activador se produzca la liberación. Así pues, es fundamental seleccionar la especie, topología y concentración superficial en la composición de la capa interfaz .
En relación con el oligonucleótido bloqueante, este puede ser una cadena de ADN ó ARN formada por entre 10 y 50 nucleótidos. En una realización particular, dichos nucleótidos pueden ir unidos de forma covalente a otras partículas inorgánicas, tales como nanopartículas de sulfuro de cadmio o nanopartículas magnéticas.
Los sistemas así desarrollados pueden formar parte de polímeros o andamios para, entre otras aplicaciones, regeneración tisular o diferenciación celular, dependiendo de la sustancia activa biológica presente en el soporte y que es liberada tras la hibridación de los oligonucleótidos . Si el soporte comprende un indicador, colorante, sustancia fluorescente, o parecido, su liberación puede ser utilizada para la detección del oligonucleótido, tanto para su seguimiento como para su cuantificación .
En una realización preferente el soporte es de tipo óxido de silicio mesoporoso y la capa interfaz consiste en una capa de compuestos con carga positiva al pH de ensayo del sistema, tales como aminas o sales de guanidinio, y el oligonucleótido está formado por cadenas de ADN ó ARN de entre 15 y 30 nucleótidos.
El segundo aspecto de la invención hace referencia al procedimiento para la preparación de los sistemas de liberación controlada. Dicho procedimiento comprende las siguientes etapas:
a) Suspender en una disolución acuosa conteniendo el oligonucleótido un material poroso capaz de formar interacciones supramoleculares con oligonucleótidos ;
b) Agitar entre 10 minutos y 3 horas preferentemente 30 minutos, la suspensión manteniendo simultáneamente la temperatura constante entre 15 y 50°C, preferentemente a 37°C;
c) Eliminar la disolución, preferentemente mediante centrifugación durante 5 minutos a 5.000 rmp y d) Lavar con disolución acuosa.
Aunque se pueden utilizar diferentes medios como disolución acuosa, son preferidos los medios tamponados a pH fisiológico, en especial a pH 7.5 con una mezcla MgCl2 37.5 mM, Tris-HCl 20 mM.
En tercer lugar, la invención comprende el uso de los sistemas de liberación controlada anteriormente expuestos para la determinación de cadenas de oligonucleótidos - en el caso de que los materiales se hallen cargados con indicadores, colorantes, sustancias fluorescentes o parecidos - o para la liberación controlada en respuesta a la presencia de oligonucleótidos en disolución para la liberación de otras sustancias activas (fármacos, biocidas, etc.) en medios celulares, o sistemas biológicos.
Finalmente se encuentra comprendido en la invención el procedimiento para la detección de oligonucleótidos que comprende las siguientes etapas:
a) Suspender en disolución acuosa el material con propiedades de liberación controlada;
b) Mezclar la disolución a ensayar que contiene el oligonucleotido con la disolución preparada en la etapa a) Y
c) Medir la señal macroscópica producida en la etapa b) y opcionalmente cuantificar dicha señal por interpolación en una curva de calibrado. La señal producida dependerá del indicador presente en el soporte y liberado por la hibridación de los oligonucleótidos. Por ejemplo, se podría medir la absorbancia, la fluorescencia, etc.
Aunque se pueden utilizar diferentes medios como disolución acuosa, son preferidos los medios tamponados a pH fisiológico, en especial a pH 7.5 con una mezcla MgCl2 37.5 mM, Tris-HCl 20 mM.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención.
Ejemplo 1
Obtención del soporte con el oligonucleotido especifico absorbido (SI)
En una realización concreta de la invención se pesaron 5 mg de un soporte tipo MCM-41 cargado con fluoresceína y modificado superficialmente con aminopropiltrietoxisilano (concentración de aminas determinada por análisis termogravimétrico 1.98 mmoles/g Si02) y se suspendieron en 5 mL de una disolución tamponada a pH 7.5 (MgCl2 37.5 mM, Tris-HCl 20 mM) y conteniendo el oligonucleotido 0-1 (5'- AATGCTAGCTAAT CAATCGGG-3 ' ) en una concentración de 20 nmol/g sólido y se dejó agitar a 37°C durante media hora. A continuación se centrifugó la suspensión durante 5 minutos a 5000 rpm y se separó la disolución, lavando el sólido con 5 mL de la disolución tamponada. Esta suspensión se separó nuevamente por centrifugación, obteniendo asi el conjunto SI .
En la figura 1 se muestra un esquema de este conjunto SI obtenido, donde el 1.1 es el primer oligonucleótido 0-1, indicado en detalle en la parte inferior de la figura; 1.2 es la cadena de aminopropilsilano generada por la reacción del aminopropilatrietoxisilano con la superficie del soporte, indicado en detalle en la parte inferior a la derecha; 1.3 es el soporte MCM-41; 1.4 es la fluoresceina contenida en los poros del soporte, indicado en detalle en la parte superior a la derecha; y 1.5 indica el conjunto SI .
Para la caracterización y cuantificación del conjunto SI se utilizó un oligonucleótido 0-1' (5'- AATGCTAGCTAATCAATCGGG-Cy5-3 ' ) , marcado con Cy5 en el extremo 3', unido al soporte mediante el mecanismo anteriormente descrito. La cuantificación se realizó mediante el cálculo de la fluorescencia de la disolución después de producirse el anclado al sólido, teniendo un contenido de 17 nanomoles/g sólido.
Ejemplo 2
Comportamiento del conjunto SI en presencia del oligonucleótido complementario y oligonucleotidos
similares .
En una realización concreta de la invención se suspendieron 5 mg del conjunto SI descrito anteriormente en 5 mL de la disolución tamponada a pH 7.5 (MgCl2 37.5 mM, Tris-HCl 20 mM) . De esta suspensión se pipetearon 100 yL y se añadieron 300 yL de la disolución tamponada conteniendo el oligonucleótido 0-2 (5 ' -CCCGATTGATTAGCTAGCATT-3 ' ) en concentración 15 nmol/g sólido, el cual es complementario al 100% con el oligonucleótido 0-1 unido al soporte. En la Figura 2 se ilustra el funcionamiento de la hibridación del oligonucleótido 0-1 unido al soporte en presencia del oligonucleótido 0-2 100% complementario. Al hibridarse las dos hebras de los que comprenden los oligonucleótidos , se destapa el poro del soporte y se libera la sustancia que estaba contenida en el mismo. Se han utilizado las mismas indicaciones numéricas para los mismos componentes comprendidos en la Figura 1 y se ha añadido 2.1 que indica el oligonucleótido 0-2, complementario al 100% con el oligonucleótido 0-1; 2.2 es la hebra que forman los oligonucleótidos 0-1 y 0-2 después de su hibridación, destapando el poro del soporte 1.3, dejando el aminopropiltrietoxisilano 1.2 anclado al soporte y liberando la fluoresceina 1.4 contenida en los poros del soporte 1.3.
Esta experiencia se repitió en presencia del oligonucleótido 0-3 (5' - CCCGATTGATTCTCTAGCATT-3 ' ) , con dos bases diferentes respecto al oligonucleótido 0-2 en posición central, ó en presencia del oligonucleótido 0-4 (5 ' -CCCGATTGATTGGCTAGCATT-3 ' , con solo una base diferente respecto al oligonucleótido 0-2 en posición central) en la misma concentración, ó en ausencia de cualquier nucleótido.
Se midió la intensidad de la fluorescencia durante un total de 180 minutos. Los resultados se ilustran en la Figura 3, donde a) representa la fluorescencia medida añadiendo el oligonucleótido 0-2; b) representa la fluorescencia medida añadiendo el oligonucleótido 0-3; c) representa la fluorescencia medida añadiendo el oligonucleótido 0-4 y d) representa la fluorescencia medida en ausencia de cualquier nucleótido, pero si añadiendo el resto de los componentes de la mezcla. Se observa una ligera liberación del contenido de los poros incluso cuando no hay ningún nucleótido presente, por lo que puede haber una pequeña e insignificante degradación de la unión del oligonucleótido 0-1 con el soporte. La liberación del contenido de los poros es luego mucho menor al añadir el oligonucleótido 0-4 con respecto a la liberación con la presencia del oligonucleótido 0-3. La respuesta más eficaz se observa añadiendo el oligonucleótido 0-2, indicando la especificidad del oligonucleótido 0-1 para hibridar con su pareja complementaria al completo y a un nivel significativamente menor con oligonucleótidos que se difieren en una u dos bases.
Todas estas realizaciones no son limitativas y presentan ejemplos de las posibilidades de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
1. - Un sistema de liberación controlada caracterizado por que la activación de la liberación se produce por la hibridación de un oligonucleótido unido a y tapando poros de un soporte, activando la liberación de una sustancia contenida en los poros del soporte.
2. - Un sistema de liberación controlada según la reivindicación 1 caracterizado por que el oligonucleótido unido a y tapando poros de un soporte se encuentra unido a la superficie del soporte mediante interacciones supramoleculares .
3. - Un sistema de liberación controlada según la reivindicación 2 caracterizado por que la unión entre el oligonucleótido y la superficie del soporte se debe a fuerzas electrostáticas.
4. - Un sistema de liberación controlada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado por que la unión entre el oligonucleótido y el soporte es lo suficientemente fuerte para unir un oligonucleótido a la superficie del soporte, bloqueando los poros del soporte y lo suficiente débil para que pueda hibridar el oligonucleótido unido al soporte con el oligonucleótido complementario .
5. - Un sistema de liberación controlada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado por que el sistema comprende un soporte poroso con capacidad para contener una sustancia activa o un indicador, un oligonucleótido bloqueante de los poros del soporte y una capa interfaz entre el soporte poroso y el oligonucleótido que asegura la fijación entre estos elementos.
6. - Un sistema de liberación controlada según la reivindicación 5, caracterizado por que el soporte poroso está compuesto por metales, semiconductores, polímeros orgánicos, carbones u óxidos de especies tales como el silicio, aluminio, titanio, zirconio, magnesio o boro, entre otros.
7. - Un sistema de liberación controlada según la reivindicación 6, caracterizado por que el soporte poroso es una sílice de elevada superficie específica.
8. - Un sistema de liberación controlada según la reivindicación 7, caracterizado por que el soporte poroso es una sílice tipo MCM-41, HMS, MSU-n MSU-V, FSM-16, KSW-2, SBA-n (n = 1, 2, 3, 8, 11-16) UVM-7, UVM-8, M-UVM-7 o M- UVM-8, entre otros.
9. - Un sistema de liberación controlada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado por que el oligonucleótido bloqueante de los poros del soporte es una cadena de ADN o ARN formada por entre 10 y 50 nucleótidos.
10. - Un sistema de liberación controlada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 caracterizado por que el oligonucleótido bloqueante de los poros del soporte es complementario a un oligonucleótido a ser detectado.
11.- Un sistema de liberación controlada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 caracterizado por que el oligonucleótido bloqueante de los poros del soporte puede ir unido de forma covalente a otras partículas inorgánicas, tales como nanopartículas de sulfuro de cadmio o nanopartículas magnéticas.
12.- Un sistema de liberación controlada, según la reivindicación 5, caracterizado por que la capa interfaz está compuesta por compuestos con carga positiva covalentemente unidos a la superficie del soporte poroso.
13.- Un sistema de liberación controlada según la reivindicación 12, caracterizado por que los compuestos con carga positiva comprendidos en la capa interfaz son aminas, sales de amonio o sales de guanidinio.
14. - Un sistema de liberación controlada, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, caracterizado por que comprende además un polímero o andamio.
15. - Procedimiento de preparación de un sistema de liberación controlada según las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por que comprende :
a) Suspender en una disolución acuosa conteniendo el oligonucleótido un material poroso capaz de formar interacciones supramoleculares con oligonucleótidos;
b) Agitar entre 10 minutos y 3 horas, la suspensión manteniendo simultáneamente la temperatura constante entre 15 y 50°C;
c) Eliminar la disolución y
d) Lavar con disolución acuosa.
16.- Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado por que la disolución se agita durante 30 minutos y se mantiene la suspensión a una temperatura constante de 37°C en el paso b) y se elimina la disolución mediante centrifugación durante 5 minutos a 5000 rpm en el paso c) .
17. - Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16 caracterizado por que la disolución acuosa está tamponada.
18. - Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado por que la disolución acuosa tamponada tiene un pH de 7.5 y comprende una mezcla de MgCl2 37.5 mM y Tris-HCl 20 mM.
19. - Uso de un sistema de liberación controlada descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para la detección de oligonucleótidos, especies biológicas o restos de especies biológicas, entre otros.
20. - Uso de un sistema de liberación controlada descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para la liberación de sustancias activas en disolución.
21. - Uso de un sistema de liberación controlada según la reivindicación 20, donde la disolución acuosa es un medio celular o biológico.
22. - Uso de un sistema de liberación controlada según cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21, donde la sustancia a liberar tiene actividad.
23. - Uso de un sistema de liberación controlada según la reivindicación 22 donde la sustancia a liberar es un fármaco, un biocida, un aroma, o parecido.
24.- Procedimiento de uso del sistema de liberación controlada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, caracterizado por que comprende: a) Suspender el material con propiedades de liberación controlada según las reivindicaciones 1 a 14 en disolución acuosa;
b) B) Mezclar la disolución a ensayar que contiene el oligonucleótido con la disolución preparada en la etapa a) y
c) Medir la señal macroscópica producida en la etapa b)
25. Procedimiento según la reivindicación 24, caracterizado por que además se cuantifica la señal macroscópica producida en la etapa b) por interpolación en una curva de calibrado.
26.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 24 ó 25, caracterizado por que la disolución acuosa está tamponada.
27.- Procedimiento según la reivindicación 17 a 26 caracterizado por que la disolución acuosa tamponada tiene un pH de 7.5 y comprende una mezcla de MgCl2 37.5 mM y
Tris-HCl 20 mM.
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