WO2012002328A1 - 血中ｈｄｌ増加剤または抗動脈硬化剤 - Google Patents

血中ｈｄｌ増加剤または抗動脈硬化剤 Download PDF

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高浩 上野
昇 福田
明子 常見
浩喜 永瀬
隆義 渡部
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the present invention relates to a novel pyrrole imidazole polyamide (hereinafter referred to as PI polyamide), a blood high-density lipoprotein increasing agent (hereinafter referred to as blood HDL increasing agent) or an anti-arteriosclerotic agent containing the PI polyamide as an active ingredient. .
  • PI polyamide novel pyrrole imidazole polyamide
  • blood HDL increasing agent blood high-density lipoprotein increasing agent
  • anti-arteriosclerotic agent containing the PI polyamide as an active ingredient.
  • HDL which is one of lipoproteins
  • HDL is known to exhibit an anti-arteriosclerotic action, with its blood level inversely correlated with the frequency of arteriosclerotic diseases. Therefore, various substances that raise blood levels of HDL have been developed for the purpose of treating or preventing arteriosclerotic diseases such as atherosclerosis (see, for example, Patent Document 1).
  • ABCA1 (ATP binding cassette A1) is a protein that plays a major role when HDL extracts cholesterol from cells in peripheral tissues, and the expression level is correlated with the blood level of HDL.
  • a hypoHDLemia ameliorating agent and an arteriosclerosis prophylactic / therapeutic agent having a cysteine protease inhibitor that significantly and continuously increases the expression level of ABCA1 as an active ingredient have been developed (for example, see Patent Document 2).
  • the ABCA1 stabilizer which used the bisphenol type compound as an active ingredient is developed (for example, patent document 3). Although these are useful for raising the blood level of HDL, it has been desired to provide a blood HDL increasing agent that is more stable and effective.
  • PI polyamides that are excellent in in vivo stability and transferability to tissues and cells have attracted attention.
  • the inventors have focused on this substance and are working on the development of a new PI polyamide that is effective for raising the blood level of HDL by an original method.
  • the inventors of the present invention have provided a blood HDL increasing agent and the like that are more stable and effective than the conventional hypoHDL ameliorating agent and arteriosclerosis preventing / treating agent.
  • An object of the present invention is to provide a novel PI polyamide useful for increasing the blood level of HDL. Furthermore, this invention makes it a subject to provide the anti-arteriosclerosis agent which uses this PI polyamide as an active ingredient.
  • the present inventors have increased the expression level of ABCA1 that correlates with the blood level of HDL. Seed) was synthesized to complete the present invention. These PI polyamides synthesized by the present inventors bind to the AP2 binding site, which is a negative transcription control region present in the human ABCA1 gene promoter region. These PI polyamides can increase the expression of the human ABCA1 gene by inhibiting the binding of AP2 to the AP2 binding site. The present inventors have confirmed that these PI polyamides increase the expression of the ABCA1 gene in in vitro and in vivo tests. It has also been confirmed that these PI polyamides increase blood HDL in in vivo studies.
  • blood HDL can be increased by administering a blood HDL increasing agent containing these PI polyamides as an active ingredient to animals such as mice and humans. It is also possible to treat or prevent arteriosclerotic diseases by administering anti-atherosclerotic agents containing these PI polyamides as active ingredients to animals such as mice and humans.
  • the present invention relates to the following (1) to (5) PI polyamide, an agent for increasing blood HDL containing the PI polyamide as an active ingredient, an anti-arteriosclerosis agent, and the like.
  • a blood HDL increasing agent comprising one or more PI polyamides of chemical formulas 1 to 3 as an active ingredient.
  • a method for increasing blood HDL comprising a step of administering the blood HDL increasing agent according to (1) to an animal.
  • a method for treating or preventing an arteriosclerotic disease comprising the step of administering the anti-arteriosclerotic agent of (1) above to an animal.
  • the anti-atherosclerotic agent comprising PI polyamide provided by the present invention as an active ingredient is widely used as a drug having a new action that increases the expression of ABCA1 gene and increases HDL in the prevention and treatment of arteriosclerotic diseases. Available.
  • the “blood HDL increasing agent” of the present invention refers to an agent that can increase blood HDL by administration to mammals such as humans by injection or the like.
  • the “blood HDL increasing agent” of the present invention may be any agent that contains one or a combination of PI polyamides of Chemical Formulas 1 to 3 as an active ingredient, and includes a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient. May be.
  • the PI polyamides of the chemical formulas 1 to 3 can be synthesized by any conventionally known method for synthesizing PI polyamides, but it is particularly preferred to synthesize them by the PSSM-8 synthesis program.
  • PI polyamides can be used as active ingredients of anti-arteriosclerotic agents.
  • the “anti-arteriosclerotic agent” refers to an agent for the purpose of preventing or treating arteriosclerotic diseases, and any agent may be used as long as the active ingredient is one or a combination of PI polyamides of the chemical formulas 1 to 3, In addition to the active ingredient, it may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • PI polyamide ⁇ Preparation of PI polyamide> 1.
  • Design of PI polyamide The following 1 to 3 PI polyamides (3 types) were designed to bind to a site centering on the AP2 binding site of the human ABCA1 gene promoter region.
  • FIG. 1 shows the base sequence of the human ABCA1 gene promoter region. In FIG. 1, the portion surrounded by a blue frame and described as the AP2 binding site at the top is the base sequence of the AP2 binding site.
  • PI polyamide enables recognition of a DNA double helix structure by combining two pairs, such as a combination of Py / Py and Py / Im.
  • a PI polyamide composed of a combination of Py / Py and Py / Im is structurally very rigid, and when five or more are connected, they are disengaged from the minor groove of the DNA double helix structure, and the binding force decreases.
  • a hairpin structure is incorporated into the polyamide so that the two pairs of polyamides are not displaced.
  • ⁇ -alanine that keeps a high degree of freedom in combination with Py or Im and flexibly responds to the bending of the spiral structure of the DNA double helix.
  • a structure in which ⁇ -alanine crosses by adding a combination of Py / ⁇ and Im / ⁇ is added. This eliminates the need for W (A or T) sequence recognition rules based on ⁇ / ⁇ ⁇ -alanine combinations for every 3 bases, and provides GC, CG, etc.
  • the present invention is the first to obtain a hairpin type PI polyamide that can enhance the selectivity of recognition of a base sequence rich in GC sequences and can be bonded with a freedom of positional relationship twisted into a helical structure. It is.
  • PI polyamide (8 base recognition) A PI polyamide of AcImPy ⁇ ImImPyPy ⁇ ImImPy ⁇ ImImPy ⁇ Dp (Chemical Formula 1) was designed so as to recognize the base sequence (8 base sequences) shown in the red part of FIG. The chemical formula of PI polyamide C 85 H 104 N 37 O 17 +, the molecular weight of 1915.97. 2) PI polyamide (12 base recognition) PI polyamide of AcImPyPy ⁇ ImPy ⁇ ImImPyPy ⁇ ImImPy ⁇ ImIm ⁇ ImImImPy ⁇ Dp (Chemical Formula 2) was designed so as to recognize the base sequence (12 base sequences) shown in the red part of FIG.
  • this PI polyamide was C 123 H 146 N 55 O 25 + and the molecular weight was 279.83.
  • a PI polyamide that recognizes a base sequence of 8 bases or more a complex with a tandem hairpin structure PI polyamide or DNA is theoretically possible. In, no one that recognizes a base sequence of 8 bases or more was known. Furthermore, these PI polyamides were novel ones that can recognize base sequences rich in GC sequences.
  • PI polyamide 7 base recognition A PI polyamide of AcPyPy ⁇ PyPyIm ⁇ PyPyPy ⁇ ImIm ⁇ Dp (Chemical Formula 3) (Chemical Formula 3) was designed so as to recognize the base sequence (7 base sequence) shown in the red part of FIG.
  • the chemical formula of this PI polyamide was 1667.77C 77 H 96 N 29 O 15 + , and the molecular weight was 1667.77.
  • Reagent 1 Monomers FmocPyCOOH (Wako, 36 mg), FmocImCOOH (Wako, 77 mg), Fmoc- ⁇ -Abu-OH (Nova Biochem, 34 mg) and Fmoc- ⁇ -Ala-OH (Nova Biochem, 32 mg), respectively
  • the required coupling amount was prepared for each PI polyamide to be synthesized, and 4 equivalents of FmocImCOOH and 2 equivalents of the other were weighed with respect to the resin, and transferred to a 1.5 mL Eppendorf tube. Further, 88 mg of HCTU was added to the FmocImCOOH tube, and 44 mg was added to the other tubes.
  • Peptide synthesis (automatic) Above 1.
  • the DIEA prepared in (1) was installed as a condensation activator in a synthesizer (PSSM-8; manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the tube containing each monomer prepared previously was arrange
  • Reaction cycle (1) The coupling treatment was performed in NMP for 30 minutes using the above activator. (2) Resin washing with 1 mL NMP was repeated 5 times to remove excess monomer and activator. (3) 1 mL of Fmoc deprotection solution (30% Piperidine / NMP) was added and reacted for 3 minutes. After removing the solution, the same cycle was repeated again. (4) To remove the Fmoc deprotection solution, washing of the resin with 1 mL of NMP was repeated 5 times to return to (1). This cycle was repeated until the desired product was obtained.
  • double-stranded DNA was prepared by slowly lowering the temperature to room temperature.
  • the double-stranded DNA of 1) above was directly used in the gel shift assay (FIGS. 4, 1.).
  • a double-stranded DNA of 1) above and an equal amount (equal mole) of PI polyamide (Chemical Formula 3) mixed at the composition shown in Table 3 were incubated at room temperature for 1 hour (FIG. 4, 2.).
  • PI polyamide Cyclonastyl-N-N-phenyl-N-N-N-phenyl-N-N-N-phenyl-N-N-N-phenyl-N-N-N-(trimethyl)
  • PI polyamide Cyclon-linked polyamide
  • Table 4 As a specific competitor, 10-fold amount of non-labeled oligo DNA (oligo DNA without FITC modification) was added to FITC conjugated oligo DNA, and double-stranded DNA and PI polyamide (Formula 3) are shown in Table 4.
  • FIGS. 1 the mobility is changed by binding of double-stranded DNA to PI polyamide. It was confirmed to shift to the position. Also, FIGS. , It was confirmed that the binding to FITC conjugated oligo DNA decreased because PI polyamide was also bound to non-labeled oligo DNA. From this result, it was shown that double-stranded DNA and PI polyamide were bound in a sequence-specific manner. Furthermore, FIGS. 2 confirmed that the double-stranded DNA and the mismatched PI polyamide do not bind to each other, and that the binding does not occur if the sequences do not match. Similarly, in the PI polyamide (Chemical Formula 1, Chemical Formula 2) synthesized in Example 1, the sequence specificity for the AP2 binding site of human ABCA1 was confirmed.
  • THP-1 cells (JCRB0112) (Human (peripheral blood, liquefied leukemia, lymphocyte-like) (RP-GBS) containing 10% of FRP in the form of 10% FIT-it BS from Human Science) Cultured on a 6-well plate. The cells were cultured at phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 3.2 ⁇ 10 ⁇ 7 M (final concentration) for 72 hours to differentiate into THP-1 macrophages. All cells were cultured at 37 ° C. with 5% CO 2 gas.
  • PMA phorbol 12-myristate 13-acetate
  • THP-1 macrophages were cultured in a 6-well plate in 10% FBS-containing RPMI-1640 medium supplemented with PI polyamide 1 uM, doxazosin 10 uM (positive control) or Go6983 10 nM (positive control), respectively, for 24 hours. After 24 hours of culturing, the medium was discarded, the cells were washed with PBS, and then lysed with a RIPA buffer (manufactured by nacalai tesque (08714)) containing 1% Triton X-100, 2 mM 2-mercaptoethanol.
  • RIPA buffer manufactured by nacalai tesque (08714)
  • Anti-sclerosis agent An anti-arteriosclerotic agent was produced using one or more PI polyamides synthesized in Example 1 as active ingredients.
  • mice 9-week-old male (Oriental yeast stock) reared with feed MF (Oriental Yeast Co., Ltd.) and water for mouse rat hamster at room temperature 22 ⁇ 5 ° C. Company).
  • mABC1 PI polyamide
  • PI polyamide that binds to the site centering on the AP2 binding site of the mouse ABCA1 gene promoter region increases blood HDL and increases the expression level of the liver ABCA1 gene (mRNA) in vivo. It was confirmed to have an action. Therefore, based on these results, it was predicted that PI polyamide (chemical formulas 1 to 3) that binds to a site centered on the AP2 binding site of the human ABCA1 gene promoter region prepared in the present invention also has the same action.
  • the PI polyamide provided by the present invention can be used as an active ingredient of a blood HDL increasing agent and an anti-arteriosclerotic agent that are stable and effective. Further, provision of a drug containing PI polyamide as an active ingredient makes it possible to synthesize PI polyamide that is more useful in the prevention and treatment of arteriosclerotic diseases.

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Abstract

　ＨＤＬの血中レベルを上げるために有用な新規のＰＩポリアミドの提供。該ＰＩポリアミドを有効成分とする抗動脈硬化剤の提供。　ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の発現を制御し得るＰＩポリアミド（３種）を合成し、ＰＩポリアミドを有効成分とする抗動脈硬化剤を得た。

Description

血中ＨＤＬ増加剤または抗動脈硬化剤
　本発明は、新規のピロールイミダゾールポリアミド（以下、ＰＩポリアミドと示す）、該ＰＩポリアミドを有効成分として含む血中高比重リポ蛋白増加剤（以下、血中ＨＤＬ増加剤と示す）または抗動脈硬化剤に関する。
　リポ蛋白のひとつであるＨＤＬは、その血中レベルと動脈硬化性疾患の頻度が逆相関し、抗動脈硬化作用を示すことが知られている。そこで、アテローム性動脈硬化症等の動脈硬化性疾患の治療や予防を目的として、ＨＤＬの血中レベルを挙げる様々な物質が開発されている（例えば、特許文献１参照）。
　ＡＢＣＡ１（ＡＴＰ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅ　Ａ１）は、ＨＤＬが末梢組織の細胞からコレステロールを引き抜く際に主要な役割を担う蛋白であり、この発現量とＨＤＬの血中レベルは相関している。そこで、ＡＢＣＡ１の発現量を大幅かつ持続的に上昇させるシステインプロテアーゼインヒビターを有効成分とした低ＨＤＬ血症改善剤および動脈硬化症予防・治療剤が開発されている（例えば、特許文献２参照）。また、ビスフェノール型化合物を有効成分としたＡＢＣＡ１安定化剤が開発されている（例えば、特許文献３）。これらはＨＤＬの血中レベルを挙げるために有用であるが、さらに安定かつ効果的な血中ＨＤＬ増加剤の提供が望まれていた。
　近年、遺伝子発現制御技術において、生体内での安定性、組織・細胞への移行性に優れたＰＩポリアミドが注目されている。本発明者らはこの物質に着目し、独自の方法により、ＨＤＬの血中レベルを挙げるために効果的な、新たなＰＩポリアミドの開発に取り組んでいる。その結果、本発明者らは、本発明において、従来の低ＨＤＬ血症改善剤および動脈硬化症予防・治療剤等よりも安定かつ効果的な血中ＨＤＬ増加剤等を提供するに至った。
特表２００９－５２２２９３号公報 国際公開第２００３／０３３０２３号パンフレット 国際公開第２００５／０６７９０４号パンフレット
　本発明はＨＤＬの血中レベルを上げるために有用な新規のＰＩポリアミドの提供を課題とする。さらに、本発明は該ＰＩポリアミドを有効成分とする抗動脈硬化剤の提供を課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＨＤＬの血中レベルに相関するＡＢＣＡ１の発現量を上昇させるため、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の発現を制御し得るＰＩポリアミド（３種）を合成し、本発明を完成するに至った。
　本発明者らが合成したこれらのＰＩポリアミドは、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域に存在する負の転写制御領域であるＡＰ２結合部位に結合するものである。これらのＰＩポリアミドが、ＡＰ２のＡＰ２結合部位への結合を阻害することで、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の発現を上昇させることができる。本発明者らは、これらのＰＩポリアミドが、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、ｉｎ　ｖｉｖｏの試験においてＡＢＣＡ１遺伝子の発現を増加させることを確認している。また、これらのＰＩポリアミドが、ｉｎ　ｖｉｖｏの試験において血中ＨＤＬを増加させることも確認している。
　従って、これらのＰＩポリアミドを有効成分として含む血中ＨＤＬ増加剤をマウス、ヒト等の動物に投与することにより、血中ＨＤＬを増加させることが可能である。また、これらのＰＩポリアミドを有効成分として含む抗動脈硬化剤をマウス、ヒト等の動物に投与することにより、動脈硬化性疾患の治療または予防をすることも可能である。
　すなわち、本発明は次の（１）～（５）の、ＰＩポリアミド、該ＰＩポリアミドを有効成分とする血中ＨＤＬ増加剤および抗動脈硬化剤等に関する。
（１）化学式１～３のいずれか一種以上のＰＩポリアミドを有効成分として含む血中ＨＤＬ増加剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  
（２）化学式１～３のいずれか一種以上のＰＩポリアミドを有効成分として含む抗動脈硬化剤。
（３）化学式１または２に記載のＰＩポリアミド。
（４）動物に上記（１）の血中ＨＤＬ増加剤を投与する工程を含む血中ＨＤＬ増加方法。
（５）動物に上記（１）の抗動脈硬化剤を投与する工程を含む動脈硬化性疾患の治療または予防方法。
　本発明によって提供されるＰＩポリアミドを有効成分とする抗動脈硬化剤は、動脈硬化性疾患の予防、治療において、ＡＢＣＡ１遺伝子の発現を増加させ、ＨＤＬを増加させる、新たな作用を有する薬剤として広く利用できる。
ヒトＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域の塩基配列を示した図である（実施例１）。 ＰＩポリアミドが認識するＡＰ２結合部位を中心とした部位の塩基配列を示した図である（実施例１）。 ＰＩポリアミドの精製結果を示した図である（実施例１）。 ＰＩポリアミドの配列特異性を確認した図である（試験例１）。 ＡＢＣＡ１遺伝子の発現に対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例２）。 ＡＢＣＡ１遺伝子の発現に対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例２）。 細胞外への脂質の引き抜きに対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例３）。 細胞外への脂質の引き抜きに対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例３）。 ＡＢＣＡ１タンパク質の発現に対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例４）。 ＰＩポリアミドの配列特異性を確認した図である（試験例５）。 ＡＢＣＡ１遺伝子の発現に対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例５）。 細胞外への脂質（遊離コレステロール）の引き抜きに対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例５）。 細胞外への脂質（リン脂質）の引き抜きに対するＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例５）。 Ｉｎ　ｖｉｖｏでの血中ＨＤＬ増加作用におけるＰＩポリアミドの効果を示した図である（試験例５）。
　本発明の「血中ＨＤＬ増加剤」とは、ヒト等の哺乳類に注射等によって投与することによって、血中のＨＤＬを増加させることができる剤のことをいう。
　本発明の「血中ＨＤＬ増加剤」は、化学式１～３のＰＩポリアミドを一種または組み合わせて有効成分とする剤であれば良く、有効成分以外に薬物的に許容されている担体等を含んでいても良い。
　化学式１～３のＰＩポリアミドは、従来知られているいずれのＰＩポリアミドの合成方法によっても合成することができるが、特にＰＳＳＭ－８の合成プログラムによって合成することが好ましい。
　これらのＰＩポリアミドは、抗動脈硬化剤の有効成分とすることができる。この「抗動脈硬化剤」とは、動脈硬化性疾患の予防や治療を目的とする剤のことをいい、化学式１～３のＰＩポリアミドを一種または組み合わせて有効成分とする剤であれば良く、有効成分以外に薬物的に許容されている担体等を含んでいても良い。
　以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜ＰＩポリアミドの作製＞
１．ＰＩポリアミドの設計
　次の１～３のＰＩポリアミド（３種）を、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域のＡＰ２結合部位を中心とした部位に結合するように設計した。図１にヒトＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域の塩基配列を示した。図１において、青色の枠で囲われた、上部にＡＰ２結合部位と記載された部分がＡＰ２結合部位の塩基配列である。以下、化学式における各記号は次の意味を示す（Ａｃ：アセチル、Ｐｙ：ピロール、Ｉｍ：イミダゾール、β：β－アラニン、γ：γ－酪酸、Ｄｐ：Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン）。
　ＰＩポリアミドは、Ｐｙ／ＰｙやＰｙ／Ｉｍの組み合わせのように、２つを組み合わせて対をなすことでＤＮＡ二重螺旋構造の認識を可能としたものである。しかし、Ｐｙ／ＰｙやＰｙ／Ｉｍの組み合わせからなるＰＩポリアミドは構造的に非常に剛直であり、５つ以上連結するとＤＮＡ二重螺旋構造の副溝から外れてしまい、結合力が低下する。そのため、３つ置きにＷ（ＡまたはＴ）を認識する柔軟なβ－アラニンペア（β／βの組み合わせ）を導入しなければ、ＤＮＡ二重螺旋構造の副溝に結合出来ないという大きな制限がある。そのため、従来からＧＣ配列が豊富な塩基配列を認識できるＰＩポリアミドの構築は困難であった。また、４－８塩基の塩基配列を認識するＰＩポリアミドは得られているものの、ゲノム上のユニーク遺伝子を認識するには、少なくとも１２塩基以上が必要とされていることから、より長い塩基配列を認識できるＰＩポリアミドの提供が求められていた。
　本発明では自動合成機ＰＳＳＭ－８を用い、その最適化によることで１２塩基を認識するＰＩポリアミドの自動合成に初めて成功した。本発明ではＰＩポリアミドの設計において、ポリアミドにヘアピン構造を取り込み、ポリアミドの２つの対がずれない構造にした。また、これと共に、従来のＰｙ／Ｐｙ、Ｐｙ／Ｉｍの組み合わせの他に、ＰｙまたはＩｍとの組み合わせで自由度を高く保ち、ＤＮＡ二重螺旋のスパイラル構造の曲がりに柔軟に対応するβ－アラニンを取り入れた。即ち、本発明では、Ｐｙ／β、Ｉｍ／βの組み合わせを連続させることでβ－アラニンがクロスする構造を加えた。これによって、３塩基毎のβ／βのβ－アラニンの組み合わせによるＷ（ＡまたはＴ）の配列認識の規則を必要とせず、ＧＣ、ＣＧ等の認識を配することで、ＧＣ配列が豊富な塩基配列を認識できるＰＩポリアミドの構築が可能となった。すなわち、本発明は、ＧＣ配列が豊富な塩基配列の認識の選択性を高めることができ、かつ螺旋構造にねじれた位置関係の自由度を持たせて結合できるヘアピン型ＰＩポリアミドを初めて得たものである。
１）ＰＩポリアミド（８塩基認識）
　図２（２）の赤字部分に示した塩基配列（８塩基配列）を認識するように、ＡｃＩｍＰｙβＩｍＩｍＰｙＰｙγＩｍＩｍＰｙβＩｍＩｍＰｙβＤｐ（化学式１）のＰＩポリアミドを設計した。このＰＩポリアミドの化学式はＣ８５Ｈ１０４Ｎ３７Ｏ１７ ＋、分子量は１９１５．９７であった。
２）ＰＩポリアミド（１２塩基認識）
　図２（３）赤字部分に示した塩基配列（１２塩基配列）を認識するように、ＡｃＩｍＰｙＰｙβＩｍＰｙβＩｍＩｍＰｙＰｙγＩｍＩｍＰｙβＩｍＩｍβＩｍＩｍＩｍＰｙβＤｐ（化学式２）のＰＩポリアミドを設計した。このＰＩポリアミドの化学式はＣ１２３Ｈ１４６Ｎ５５Ｏ２５ ＋、分子量は２７９４．８３であった。
　８塩基以上の塩基配列を認識するＰＩポリアミドとして、タンデムなヘアピン構造のＰＩポリアミドやＤＮＡとの複合体は理論上可能とされているが、化学式１、２のような単純なヘアピン構造のＰＩポリアミドにおいては、８塩基以上の塩基配列を認識するものは知られていなかった。さらに、これらのＰＩポリアミドはＧＣ配列が豊富な塩基配列を認識できる新規なものであった。
３）ＰＩポリアミド（７塩基認識）
　図２（１）赤字部分に示した塩基配列（７塩基配列）を認識するように、ＡｃＰｙＰｙβＰｙＰｙＩｍγＰｙＰｙＰｙβＩｍＩｍβＤｐ（化３）（化学式３）のＰＩポリアミドを設計した。このＰＩポリアミドの化学式は１６６７．７７Ｃ７７Ｈ９６Ｎ２９Ｏ１５ ＋、分子量は１６６７．７７であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
２．ＰＩポリアミドの合成
　＜ＨＣＴＵを用いたピロールイミダゾールポリアミドの合成＞
　ＨＣＴＵ（株式会社ペプチド研究所）を縮合活性化剤として、上記１．で設計したＰＩポリアミド（３種）をそれぞれ合成した。
１．試薬の調製
１）モノマー
　ＦｍｏｃＰｙＣＯＯＨ（Ｗａｋｏ，３６ｍｇ）、ＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨ（Ｗａｋｏ，７７ｍｇ）、Ｆｍｏｃ－γ－Ａｂｕ－ＯＨ（Ｎｏｖａ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，３４ｍｇ）及びＦｍｏｃ－β－Ａｌａ－ＯＨ（Ｎｏｖａ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，３２ｍｇ）をそれぞれ、合成するＰＩポリアミドごとに必要なカップリング分用意し、レジンに対してＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨを４当量、それ以外を２当量ずつ秤量し、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移した。さらにＨＣＴＵをＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨのチューブに８８ｍｇ、それ以外のチューブには４４ｍｇをそれぞれ加えた。また、ＮＭＰ（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ製）をＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨのチューブに５００μＬ、それ以外のチューブには２５０μＬ加えボルテックス及び１時間静置し完全に溶解させた。
２）合成用試薬
　合成機による合成のために、表１に記載の試薬を調製して用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
３．レジンの調製
　Ｆｍｏｃ－β－Ａｌａ－Ｗａｎｇ－Ｒｅｓｉｎ（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）をＳｍａｌｌ　Ｌｉｂｒａ　Ｔｕｂｅ（ＨｉＰｅｐ研究所製）に４０ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）取り、ペプチド合成機にセットした。これにＮＭＰ１ｍＬを加え、２０分間膨潤させた。
４．ペプチド合成（自動）
　上記１．で調製したＤＩＥＡを縮合活性化剤として合成機（ＰＳＳＭ－８；島津製作所製）にインストールした。また、先に準備しておいた各モノマーの入ったチューブをＣ末端から順番通りに合成機内ラックに配置した。ＰＳＳＭ－８の合成プログラムをセットし、合成機をスタートさせ、Ｈ２ＮＩｍＰｙβＩｍＩｍＰｙＰｙγＩｍＩｍＰｙβＩｍＩｍＰｙβ－Ｒｅｓｉｎ、Ｈ２ＮＩｍＰｙＰｙβＩｍＰｙβＩｍＩｍＰｙＰｙγＩｍＩｍＰｙβＩｍＩｍβＩｍＩｍＩｍＰｙβ－ＲｅｓｉｎまたはＨ２ＮＰｙＰｙβＰｙＰｙＩｍγＰｙＰｙＰｙβＩｍＩｍβ－Ｒｅｓｉｎまで、次の（１）～（４）の反応サイクルを繰り返すことで自動合成を行った。
反応サイクル
（１）カップリング処理を、上記活性化剤を用いてＮＭＰ中で３０分間行った。
（２）余剰のモノマー及び活性化剤を除くため、１ｍＬのＮＭＰによるレジンの洗浄を５回繰り返した。
（３）Ｆｍｏｃ脱保護溶液（３０％Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ／ＮＭＰ）を１ｍＬ加え３分間反応させ、溶液を除去後、再び同じサイクルを繰り返した。
（４）Ｆｍｏｃ脱保護溶液を除くため１ｍＬのＮＭＰによるレジンの洗浄を５回繰り返し（１）に戻った。目的産物が得られるまでこのサイクルを繰り返した。
５．精製
　合成機からレジンを取り出し、洗浄、乾燥の後、ネジ式キャップのエッペンドルフチューブに移した。これにＮ，Ｎ－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅｄｉａｍｉｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ製，２ｍＬ）を５００μＬ加えてヒートブロックにより５５℃で一晩加熱することにより、レジンからポリアミドの切り出しを行った。反応液をＬｉｂｒａ　Ｔｕｂｅに移し、濾過によりレジンを取り除き、レジンに付着している残りの反応液をＮＭＰ１ｍＬ及びメタノール１ｍＬで回収した。
　溶媒を留去後、ＨＰＬＣで分取精製した。分取精製後のＨＰＬＣを図３に示した（０．１％ＡｃＯＨ：ＣＨ３ＣＮ＝１００：０～０：１００，３０ｍｉｎ）。分取精製の後、凍結乾燥をして、上記１．で設計したＰＩポリアミド（３種）をそれぞれ得た。
［試験例１］
＜ＰＩポリアミドの配列特異性の確認＞
　実施例１において合成したＰＩポリアミド（化学式３）の、ヒトＡＢＣＡ１のＡＰ２結合部位に対する配列特異性をゲルシフトアッセイによって確認した。
１．試料の作成および試験
１）ＰＩポリアミドが結合するＡＰ２結合部位を含むＦＩＴＣ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｏｌｉｇｏ　ＤＮＡ（配列表配列番号１）とその相補鎖を委託（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）により合成した。
　即ち、この相補鎖とＦＩＴＣ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｏｌｉｇｏ　ＤＮＡを、表２に記載の組成となるように混合したものを９５℃で５分間インキュベーションした。その後、ゆっくりと室温まで温度を下げることで、２本鎖ＤＮＡを作成した。
２）上記１）の２本鎖ＤＮＡをそのままゲルシフトアッセイに用いた（図４、１．）
３）上記１）の２本鎖ＤＮＡと等量（等モル）のＰＩポリアミド（化学式３）を、表３に記載の組成となるように混合したものを室温で１時間インキュベートした（図４、２．）。
４）特異的ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒとして、ＦＩＴＣ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｏｌｉｇｏ　ＤＮＡに対し１０倍量のｎｏｎ－ｌａｂｅｌｅｄ　ｏｌｉｇｏ　ＤＮＡ（ＦＩＴＣの修飾がないｏｌｉｇｏ　ＤＮＡ）を加え、２本鎖ＤＮＡとＰＩポリアミド（化学式３）を、表４に記載の組成となるように混合したものを室温で１時間インキュベートした（図４、３．）。
５）ＦＩＴＣ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｏｌｉｇｏ　ＤＮＡと実施例１と同様の方法により独自に作製したミスマッチＰＩポリアミド（ＡｃＰｙＰｙβＰｙＩｍＰｙγＰｙＰｙＰｙβＩｍＰｙβＤｐ、化学式：Ｃ８９Ｈ１０８Ｎ３３Ｏ１７、分子量：１６６６．６）を、表５に記載の組成となるように混合したものを室温で１時間インキュベートした（図４、４．）。
６）上記２）～５）をそれぞれ、あらかじめ０．５×ＴＢＥバッファー（組成：４４．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、４４．５ｍＭ　ｂｏｒｉｃ　ａｃｉｄ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で３５０Ｖ、２０分泳動しておいた２０％ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌにアプライし、３５０Ｖで３時間泳動した。
７）泳動が終わったｇｅｌをＬＡＳ３０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ製）で撮影した。結果を図４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
 　
２．結果
　図４、１．において、２本鎖ＤＮＡがＰＩポリアミドと結合することにより、移動度が変わり２．の位置にシフトすることが確認された。
　また、図４、３．において、ＰＩポリアミドがｎｏｎ－ｌａｂｅｌｅｄ　ｏｌｉｇｏ　ＤＮＡにも結合したため、ＦＩＴＣ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｏｌｉｇｏ　ＤＮＡとの結合が減少することが確認された。この結果より、２本鎖ＤＮＡとＰＩポリアミドが配列特異的に結合していることが示された。
　さらに、図４、４．において、２本鎖ＤＮＡとミスマッチＰＩポリアミドとが結合しないことが確認され、配列がマッチしていないと結合がおこらないことが示された。
　実施例１において合成したＰＩポリアミド（化学式１、化学式２）においても同様に、ヒトＡＢＣＡ１のＡＰ２結合部位に対する配列特異性が確認された。
［試験例２］
＜ＡＢＣＡ１遺伝子の発現に対するＰＩポリアミドの効果＞
１．試料
１）ＰＩポリアミド
　実施例１で合成したＰＩポリアミド（化学式１～３）をそれぞれ用いた。
２）細胞
　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｓｅｒｃｈ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　Ｂａｎｋより分譲を受けたＴＨＰ－１細胞（ＪＣＲＢ０１１２）（Ｈｕｍａｎ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ，ａｃｕｔｅ　ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍｉａ，ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ｌｉｋｅ））を、１０％ＦＢＳ含ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）で６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅで培養した。細胞はｐｈｏｒｂｏｌ　１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ　１３－ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）３．２×１０－７Ｍ（最終濃度）で７２時間培養してＴＨＰ－１マクロファージに分化させた。すべての細胞は５％ＣＯ２ガス、３７℃で培養を行った。
２．ＡＢＣＡ１遺伝子の発現の確認
　上記１．２）のＴＨＰ－１マクロファージを、ＰＩポリアミド１ｕＭ、ドクサゾシン（Ｄｏｘｓａｚｏｓｉｎ、Ｓｉｇｍａ製（Ｄ９８１５））１０ｕＭ（ポジティブコントロール）またはＧｏ６９８３（Ｓｉｇｍａ製（Ｇ１９１８））１０ｎＭ（ポジティブコントロール）をそれぞれ添加した１０％ＦＢＳ含ＲＰＭＩ－１６４０培地で６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅで１６時間培養した。
　培養１６時間後に培地を捨て、細胞をトライゾール（ＴＲＩｚｏｌ）で回収し、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを精製した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）。精製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡは　Ｈｉｇｈ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ａｐｐｌｉｅｄ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）で逆転写を行なった。
　その後、委託（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により合成したＰｒｉｍｅｒ（配列表配列番号２，３）を用い、Ｐｏｗｅｒ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製（４３６７６５９））を使用してｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲを行なった。また、Ｔａｑｍａｎ　ｐｒｏｂｅ法（ｈｕｍａｎ　１８Ｓ　ｒＲＮＡ：ａｐｐｌｉｅｄ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（製品番号４３５２９３０Ｅ）ＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ＩＩ，　ｗｉｔｈ　ＵＮＧ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製（４４４００３８））にて、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７５００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用してｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲを行なった。
　得られたデータを１８ＳｒＲＮＡの結果で補正し、図５、６に示した。
３．結果
　図５に示したように、ＰＩポリアミド（化学式３）（図５、ＰｙＩｍ）を用いた場合でも、ＰＩポリアミドの濃度が１μＭという低濃度にもかかわらず、ドクサゾシン（図５、Ｄｏｘａｚｏｓｉｎ）またはＧｏ６９８３を用いた場合と同様に、ＡＢＣＡ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現が、コントロールと比べて有意に上昇することが確認された。
　また、図６に示したように、ＰＩポリアミド（化学式１～３）（図６、７ｍｅｒ：化学式３、８ｍｅｒ：化学式１、１２ｍｅｒ：化学式２）のいずれを用いた場合でも、各ＰＩポリアミドの濃度が１μＭという低濃度にもかかわらず、ＡＢＣＡ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現が上昇することが確認された。
［試験例３］
＜Ａｐｏ－ＡＩ存在下での細胞外への脂質の引き抜きに対するＰＩポリアミドの効果＞
１．試料
　実施例１で合成したＰＩポリアミド（化学式１～３）および試験例２と同様に得たＴＨＰ－１マクロファージを用いた。
２．Ａｐｏ－ＡＩ存在下での細胞外への脂質の引き抜きの確認
　ＴＨＰ－１マクロファージを、ＰＩポリアミド　１ｕＭ、ドクサゾシン　１０ｕＭ（ポジティブコントロール）またはＧｏ６９８３　１０ｎＭ（ポジティブコントロール）をそれぞれ添加した０．１％ＢＳＡ、ａｐｏ－ＡＩ　１０ｕｇ／ｍｌ含ＲＰＭＩ－１６４０培地で６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅで１６時間培養した。Ａｐｏ　Ａ－Ｉはヒトの血漿から超遠心法によりＨＤＬ画分を採取し、エタノール：エーテル（３：２）で脱脂後、Ｓｅｐｈａｃｒｙ　Ｓ－２００　ゲルクロマトグラフィーによって得たものを用いた。
　培養１６時間後に各ｗｅｌｌの培地を回収し、これに含まれる脂質をクロロホルム：メタノール（２：１）混液で抽出し、減圧乾固の後にイソプロパノールで溶解した。抽出した脂質に含まれる遊離コレステロールおよびリン脂質を遊離コレステロールＥ－テストワコー（Ｗａｋｏ　ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製（４３５－３５８０１））またはリン脂質Ｃ－テストワコー（Ｗａｋｏ　ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製（４３３－３６２０１））によって、それぞれ測定した。
　細胞はＲＩＰＡ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ製（０８７１４））で溶解し、ＢＣＡ　ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製（＃２３２２７））にてタンパク質量を測定した。測定した遊離コレステロールおよびリン脂質の量はタンパク質量で補正し、図７、８に示した。
３．結果
　図７（ＦＣ：遊離コレステロール（Ｆｒｅｅ　ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ），ＰＬ：リン脂質（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ））に示したように、ＰＩポリアミド（化学式３）を用いた場合でも、ＰＩポリアミドの濃度が１μＭという低濃度にもかかわらず、ドクサゾシン（図７、Ｄｏｘａｚｏｓｉｎ）またはＧｏ６９８３を用いた場合と同様に、遊離コレステロールおよびリン脂質の量がコントロールと比べて多かった。従ってこの結果より、ＰＩポリアミド（図７、ＰｙＩｍ）が細胞外への脂質の引き抜きに有用であることが確認された。
　また、図８に示したように、ＰＩポリアミド（化学式１～３）（図８、７ｍｅｒ：化学式３、８ｍｅｒ：化学式１、１２ｍｅｒ：化学式２）のいずれを用いた場合でも、各ＰＩポリアミドの濃度が１μＭという低濃度にもかかわらず、リン脂質の量がコントロールと比べて多かった。従ってこの結果より、ＰＩポリアミド（化学式１～３）のいずれもが細胞外への脂質の引き抜きに有用であることが確認された。
［試験例４］
＜ＡＢＣＡ１タンパク質の発現に対するＰＩポリアミドの効果＞
１．試料
　実施例１で合成したＰＩポリアミド（化学式３）および試験例２と同様に得たＴＨＰ－１マクロファージを用いた。
２．ＡＢＣＡ１タンパク質の発現確認
　ＴＨＰ－１マクロファージを、ＰＩポリアミド　１ｕＭ、ドクサゾシン　１０ｕＭ（ポジティブコントロール）またはＧｏ６９８３　１０ｎＭ（ポジティブコントロール）をそれぞれ添加した１０％ＦＢＳ含ＲＰＭＩ－１６４０培地で６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅで２４時間培養した。
　培養２４時間後に培地を捨て、細胞をＰＢＳで洗った後、１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，２ｍＭ　２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含むＲＩＰＡ　ｂｕｆｆｅｒ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ製（０８７１４））で溶解した。４－２０％　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌでＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜に転写後、抗ＡＢＣＡ１抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製（ＳＣ－５４９１））を用い、ＥＣＬ　Ｐｌｕｓ　ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製（ＲＰＮ２１３２））にて発現したＡＢＣＡ１タンパク質を検出した。
３．結果
　図９に示したように、ＰＩポリアミド（化学式３）（図９、ＰｙＩｍ）を用いた場合でも、ＰＩポリアミドの濃度が１μＭという低濃度にもかかわらず、ドクサゾシン（図９、Ｄｏｘａｚｏｓｉｎ）またはＧｏ６９８３を用いた場合と同様に、ＡＢＣＡ１タンパク質の発現が、コントロールと比べて上昇することが確認された。
＜抗動脈硬化剤＞
　実施例１において合成した１種以上のＰＩポリアミドを有効成分として、抗動脈硬化剤を製造した。
［試験例５］
＜Ｉｎ　ｖｉｖｏでの血中ＨＤＬ増加作用におけるＰＩポリアミドの効果＞
１．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＰＩポリアミドの効果の確認
　マウスＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域のＡＰ２結合部位を中心とした部位（認識部位：図２（４）の赤字部分に示した塩基配列（７塩基配列））に結合するように設計し、実施例１と同様の方法により独自に作製したＰＩポリアミド（ＡｃＰｙＰｙＩｍβＩｍＩｍγＰｙＰｙβＰｙＰｙＩｍβＤｐ（化学式４）以下、ｍＡＢＣ１と示す）、化学式：Ｃ７６Ｈ９５Ｎ３０Ｏ１５ ＋、分子量：１６６６．９３）を用いた。
　試験例１と同様の方法で、マウスＡＢＣＡ１のＡＰ２結合部位に対するｍＡＢＣ１の配列特異性をゲルシフトアッセイによって確認した。その結果、図１０に示すように、ｍＡＢＣ１はマウスＡＢＣＡ１のＡＰ２結合部位に対する配列特異性に対し、配列特異性を有することが確認された。
　次に、理研バイオリソースセンターより分譲を受けたマウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４ｃｅｌｌ）を用いて、試験例２と同様の方法で、マウスＡＢＣＡ１遺伝子の発現を確認し、試験例３と同様の方法でＡｐｏ－ＡＩ存在下での細胞外への脂質の引き抜きに対する効果を確認した。
　その結果、図１１に示すように、コントロールに対してｍＡＢＣ１（図１１、ＰｙＩｍ）はＲＡＷ２６４ｃｅｌにおけるＡＢＣＡ１遺伝子の発現をポジティブコントロールであるドクサゾシン（図１１、Ｄｏｘ）と同様に有意に増加させた。また、ｍＡＢＣ１（図１２、１３、ＰｙＩｍ）は、細胞外への脂質の引き抜きにおいても遊離コレステロール（図１２）、リン脂質（図１３）ともに、その引き抜きを有意に増加させることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
２．Ｉｎ　ｖｉｖｏでのＰＩポリアミドの効果の確認
　室温２２±５℃でマウスラットハムスター用の飼料ＭＦ（オリエンタル酵母株式会社）と水を不断給餌にて飼育したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス９週令雄（オリエンタル酵母株式会社）を用いた。
　マウスをミスマッチＰＩポリアミド（試験例１、５）で用いているものと同じもの）を投与するコントロール群と実験（ＰＩポリアミド（以下、ｍＡＢＣ１とする）投与）群に分け（ｎ＝５）、各ＰＩポリアミドを０．１％酢酸に溶解し、１ｍｇ／ｋｇ　ＢＷを尾静脈より１日おきに４回投与した。投与開始から１０日目に各マウスから麻酔下で、心臓からの採血と肝臓の摘出を行なった。
　この血液より血漿を分離し、アガロースゲル電気泳動を行なった。その結果、図１４に示したように、ｍＡＢＣ１投与群（図１４、Ｐ－２～Ｐ－５）において、コントロール群（図１４、Ｃ－３～Ｃ－６）と比べてＨＤＬ分画の増加が認められた。さらにＨＰＬＣで詳細な変化を検討したところ、ｍＡＢＣ１投与群でｌａｒｇｅ　ＨＤＬおよびｖｅｒｙ　ｌａｒｇｅ　ＨＤＬが増加していることが確認された。
　さらにＨＰＬＣにて詳細な血漿中のリポタンパク解析を行なうとともに、各マウスの血液中の白血球と肝臓組織からｔｏｔａｌ　ＲＮＡを採取し、ＡＢＣＡ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現を調べた。その結果、白血球中のＡＢＣＡ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現は有意な差はないもののＰＩポリアミド投与群で高くなることが確認された。また肝臓におけるＡＢＣＡ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量はコントロール群に対して有意に増加することが確認された。
　これらの結果において、マウスＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域のＡＰ２結合部位を中心とした部位に結合するＰＩポリアミドがｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、血中ＨＤＬを増加させる作用や肝臓のＡＢＣＡ１遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量を増加させる作用を有することが確認できた。従って、これらの結果より、本発明において作成したヒトＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター領域のＡＰ２結合部位を中心とした部位に結合するＰＩポリアミド（化学式１～３）も同様の作用を有するものと予測された。
　本発明によって提供されるＰＩポリアミドは、安定かつ効果的な血中ＨＤＬ増加剤および抗動脈硬化剤の有効成分として利用できる。また、ＰＩポリアミドを有効成分とする薬剤の提供により、動脈硬化性疾患の予防、治療において、さらに有用なＰＩポリアミドの合成を行うことが可能となる。

Claims (3)

  1. 化学式１～３のいずれか一種以上のＰＩポリアミドを有効成分として含む血中ＨＤＬ増加剤。
    ［化学式１］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001

     
    ［化学式２］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002

    ［化学式３］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003

     
  2. 化学式１～３のいずれか一種以上のＰＩポリアミドを有効成分として含む抗動脈硬化剤。
  3. 化学式１または２に記載のＰＩポリアミド。
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