WO2011157877A1 - Endoxilanasa termorresistente obtenida por mutagénesis y su aplicación al proceso de obtención de bioetanol - Google Patents

Endoxilanasa termorresistente obtenida por mutagénesis y su aplicación al proceso de obtención de bioetanol Download PDF

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endoxylanase
amino acid
enzyme
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Andrew Peter Mc Cabe
Julio Polaina Molina
Meritxell SÁNCHEZ HERVÁS
Salvador VALLÉS ALVENTOSA
Paloma Manzanares Mir
Patricia Martorell Guerola
Daniel RAMÓN VIDAL
Salvador GENOVÉS MARTÍNEZ
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
Biopolis, S. L.
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Definitions

  • the present invention relates to a modified endoxylanase obtained by mutagenesis directed from the sequence coding for the Aspergillus nidulans endoxylanase and to the use of this modified endoxylanase to obtain xylan which is subsequently used in bioethanol production processes. Therefore, the present invention encompasses in the field of biotechnology and more particularly industrial biotechnology.
  • bioethanol is the biofuel with the highest worldwide production, of which more than 40,000 million liters were produced during 2004 worldwide.
  • a large amount of raw materials can be used for its manufacture, mainly sugar cane, corn starch, beet, cereal or forest residues, even the possibility of growing trees with high cellulose content, such as poplar, is being studied. or the willow, with the sole purpose of producing ethanol.
  • Another alternative to crops dedicated to energy purposes is the use of agricultural, forestry or industrial waste, with a high biomass content.
  • This waste can range from cereal straw to "clean" forests, through Urban Solid Waste (MSW) or cereal or rice husks.
  • MSW Urban Solid Waste
  • the waste has the advantage of its low cost, since they are the unnecessary part of other products or processes, except when they are used in livestock feed.
  • the RSUs have a high content in organic matter, such as paper or wood, which makes them a potential source of raw material, although due to their diverse origin they may contain other materials whose separation preprocess greatly increases the price of obtaining the bioalcohol.
  • the process of degradation of plant waste is carried out through the use of industrial enzymatic reactors that are fed with said waste.
  • the degradation is carried out through the use of commercial enzymatic complexes that are a heterogeneous mixture of different enzymatic activities (mainly cellulases and hemicellulases) capable of degrading the mesh of the plant cell wall. In these reactors it is possible to degrade the plant cell wall to its constituent monosaccharides.
  • the reaction medium is transferred to a fermenter and used as a carbon source for the growth of a microorganism, in almost all cases described a strain of the yeast Saccharomyces cerevisiae, which takes advantage of it to produce bioethanol by fermentation alcoholic
  • a strain of the yeast Saccharomyces cerevisiae which takes advantage of it to produce bioethanol by fermentation alcoholic
  • One of the most important refers to the high purchase costs of enzyme complexes whose components have low specific activity and little technological adaptation to the process conditions.
  • the temperature at which these processes are carried out is one of the limiting factors of enzymatic activity, so the search for thermostable enzymes is essential.
  • xylanases are the main enzymes responsible for the degradation of xylan.
  • the ability to produce these enzymes, which have a broad spectrum of action, is widely distributed in the microbial world. Its application has been directed mainly towards the paper and pulp industry. Therefore, different patents have been developed that propose the use of xylanases in these processes, which are carried out under alkaline conditions and at temperatures at which said enzymes must be thermostable (ES2146756 (T3), US5916795 (A), US6083733 (A ), IN185709 (A1), US5736384 (A), WO2006104448 (A1), WO0068396 (A2), US6682923 (B1)).
  • xylanases also play an important role in increasing the digestibility of animal feed (US2006193843 (A1), US7060482 (B1), WO0029587 (A1).
  • the use of xylanases in the degradation processes of plant material, prior to obtaining bioethanol It is relatively less documented although there are different scientific papers that demonstrate the possibility of obtaining xylanases that adapt to their technological conditions (Menon et al., Bioresource Technology 2010, 101, 5366-5373; Kapoor et al., Biochemical Engineering Journal 2008, 38, 88-97 ,; Polizeli et al., Applied Microbiology and Biotechnology 2005, 67, 577-591.
  • the present invention describes an endoxylanase enzyme, obtained by mutagenesis directed from the Aspergillus nidulans endoxylanase, which is more thermostable than the native enzyme.
  • This enzyme is useful for degrading lignocellulosic materials to obtain sugars that serve as a carbon source for ethanol producing yeasts.
  • Endoxylanase or endo-1, 4-beta-xylanase is a type of enzyme that degrades the linear beta-1, 4- xylan polysaccharide to xylose oligomers, thus breaking the hemicellulose that makes up the cell wall of plants.
  • the present invention relates to a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence SEQ ID NO: 1 of Aspergillus nidulans, wherein said amino acid sequence exhibits the substitutions of the amino acid threonine in the position 92 and of the amino acid serine at position 100 by the amino acid aspartic acid and the substitutions of the amino acid asparagine at position 102 and the amino acid alanine at position 195 by the amino acid arginine, with respect to the native sequence encoding the Aspergillus endoxylanase XlnA Nidulans
  • a preferred embodiment of the present invention relates to the nucleotide sequence according to claim 1, wherein the specific nucleotide sequence is SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 may be encoded by any nucleotide sequence whose transcription originates Messenger RNA and its subsequent translation to the amino acid sequence. Because the genetic code is degenerated, the same amino acid can be encoded by different codons (triplets), therefore, the same amino acid sequence can be encoded by different nucleotide sequences.
  • nucleotide sequence of the present invention or “nucleotide sequence of the invention” may be used.
  • expression vector refers to a DNA fragment that has the ability to replicate in a given host and, as the term implies, can serve as a vehicle to multiply another DNA fragment that has been fused to it (insert ). Insert refers to a DNA fragment that is fused to the vector;
  • the vector may comprise the nucleotide sequence of the invention which, fused thereto, can be replicated in the appropriate host.
  • the vectors can be plasmids, cosmids, bacteriophages or viral vectors, without excluding other types of vectors that correspond to the definition made of vector.
  • the expression vector is capable of expressing itself in a bacterial type microorganism.
  • Another aspect of the present invention is the expression product of the nucleotide sequence of the invention, or of the vector of the invention.
  • the expression product is the amino acid sequence SEQ ID NO: 1. This sequence gives rise to an endoxylanase with greater thermal resistance compared to the native one, after post-translation modifications have been made and after the enzyme acquires conformation in The one that is active.
  • expression product refers to any product resulting from the expression of the nucleotide sequence of the invention.
  • a product resulting from the expression of the sequence is understood, for example, the RNA that is obtained from the transcription of the sequence, the processed RNA, the protein resulting from the translation of the post-translationally modified RNA or not, or subsequent modifications of the nucleotide sequence inside the cell as long as the resulting sequence has its origin in the original sequence transferred or does not lose the functional characteristic that characterizes it in the present invention.
  • Another aspect of the present invention is a cell comprising the nucleotide sequence of the invention, or the vector of the invention or the expression product of the nucleotide sequence of the invention, or any combination of nucleotide sequence, expression vector or expression product.
  • the term "cell” as understood in the present invention refers to a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • the term cell comprises at least one differentiated or undifferentiated cell.
  • a protoplast (cell of a plant that lacks a cell wall) is also included in this definition.
  • the cell transformed with a vector comprising the nucleotide sequence of the invention can incorporate the sequence into any of the cell's DNA; nuclear, mitochondrial and / or chloroplast, or remain as part of a vector that has its own machinery to replicate itself.
  • the selection of the cell that has incorporated any of the sequences of the invention is carried out by adding antibiotics to the culture medium or by not adding to the culture medium any amino acid essential for the metabolism of said cell.
  • the resistance of these cells to substances such as antibiotics is produced by the synthesis of molecules encoded by a sequence comprised in the sequence of the vector.
  • the cells transformed with the vector of the invention must be auxotrophs for a certain essential metabolite and the expression vector must comprise at least one sequence that allows complementing the lack of said auxotrophy.
  • a further aspect of the present invention is the use of the nucleotide sequence of the invention, of the vector of the invention, of the cell of the invention, or of the expression product of the nucleotide sequence of the invention, to obtain a product Enzymatic with endoxylanase activity.
  • This product can be obtained by a heterologous expression system.
  • the term "enzymatic product with endoxylanase activity” refers to an enzyme whose activity is identified with EC number 3.2.1.8, that is, that number has been assigned by the Enzyme Commission number according to the chemical reactions it catalyzes (IUBMB Enzyme Nomenclature, CAS Registry Number 9001-42-7).
  • the enzyme capable of carrying out this type of chemical reaction is called endoxylanase or endo-1,4-beta-xylanase.
  • Said enzyme is capable of hydrolyzing xylan to xylose oligomers.
  • Another aspect of the invention is a method for obtaining an enzyme product with endoxylanase activity comprising: a) inserting at least one nucleotide sequence as described above in an expression vector capable of expressing said nucleotide sequence in a microorganism,
  • step (b) culturing the cell obtained in step (b) in a culture medium.
  • step (b) of the method is carried out by means of techniques that are part of the common general knowledge, such as, for example, electroporation-mediated genetic transformation, by lithium acetate, etc.
  • electroporation-mediated genetic transformation by lithium acetate, etc.
  • By means of these techniques it is possible to introduce, in a stable manner, a vector that includes any of the sequences of the invention, so that, after successive divisions of the cell, the incorporated sequence continues to be expressed.
  • the culture medium suitable for the growth of transformed cells is known to the person skilled in the art.
  • a preferred embodiment of the present invention relates to the method for obtaining an enzymatic product with endoxylanase activity, where it further comprises step (d); recovering the enzyme product with endoxylanase activity from the culture medium and / or the microorganism cells.
  • Said enzymatic product can be excreted by the cells to the culture medium in which they are growing.
  • the product can also be recovered from within the cells that produce it by any technique that allows the lysis of said cells or by any technique known in the state of the art that allows the exit of said enzymatic product from the cells.
  • Another preferred embodiment of the present invention relates to the method for obtaining an enzymatic product with endoxylanase activity, where the nucleotide sequence inserted in step (a) is SEQ ID NO: 2.
  • Another preferred embodiment of the present invention relates to the enzymatic product with endoxylanase activity obtainable by the method described above.
  • a further aspect of the present invention relates to the use of the enzymatic product as described above for obtaining xylose oligomers from plant matter. For this, the enzymatic product described above is mixed with the previously conditioned xylan-rich plant material, and is maintained for a time between 20 and 80 hours, at a temperature between 30 and 60 ° C.
  • the use of the thermostable enzyme reports the following advantages:
  • Another aspect of the present invention relates to a method for obtaining bioethanol comprising:
  • step (b) incubate the mixture described in step (a) with ethanol producing microorganisms at a temperature between 30 and 60 ° C.
  • the method further comprises:
  • step (b) recover the bioethanol obtained after the incubation described in step (b).
  • the most suitable microorganisms for obtaining bioethanol are selected, but not limited to, among the yeasts of the Saccharomyces and Kluyveromyces genera, particularly Saccharomyces cerevisiae. Zymomonas mobilis bacteria are also useful.
  • Figure 1 Thermal stability of the endoxylanase at 37 ° C (A) and 50 ° C (B).
  • the characteristics that endoxylanase must meet according to the conditions of the saccharification process of lignocellulosic material are the following: be stable at 50 ° C for 34 hours and at least 72 hours at 37 ° C. It was based on an Aspergillus nidulans (XlnA) endoxylanase with a molecular weight of 22,000 Da, an optimum pH of 5.5, an optimum temperature of 60 ° C and a great hydrolytic potential on xylan of different origins. The enzyme is stable at 37 ° C but at 50 ° C it loses its activity after 10 h (see example 2), so an improvement in its thermostability was considered.
  • XlnA Aspergillus nidulans
  • Example 1 Obtaining endoxylanase with greater heat resistance.
  • XlnA endoxylanase of Aspergillus nidulans More thermostable, a modeling study of this enzyme was made. First, the GenThreader program was used to identify proteins, whose Three-dimensional structures are known, which potentially share tertiary structures with the enzyme XlnA. It was observed through this analysis that a xylanase (xyn 1 1 A) from the thermophilic fungus Chaetomium thermophilum presented the best structural alignment with the enzyme XlnA.
  • the "Deep View / Swiss PdbViewer" program was used to model XlnA using the structure of xyn 1 1A as a reference. After modeling this enzyme and comparing the two, it was observed that the main differences between them were the absence of 2 salt bridges on the surface of the Aspergillus nidulans xylanase. Since surface salt bridges can contribute to the thermal stability of the enzyme, it was decided to introduce these changes in the structure of the XlnA xylanase. To this end, an E.
  • coli transformant was obtained with the XlnA coding sequence of Aspergillus nidulans cloned in the commercial expression vector pALEX (a vector having a salicylate induction system and a strong promoter).
  • pALEX a vector having a salicylate induction system and a strong promoter.
  • a strategy of directed mutagenesis was discussed, which consisted of performing a fusion PCR of three fragments of the DNA sequence encoding XlnA by which 10 mutations were introduced to modify 4 amino acids. These mutations modified residues T92 and S100 resulting in aspartic acid and residues N102 and A195 giving rise to arginine.
  • Example 2 Biochemical characterization of modified endoxylanase versus native.
  • the tests whose results are set forth below are related to the characteristics of the process in which this endoxylanase should be used. Specifically, the enzyme must meet the following characteristics: be stable at 50 ° C for 34 hours and at least 72 hours at 37 ° C. The stability of the enzyme at these two temperatures is shown in Figure 1. Activity tests have been carried out in a buffered solution (50 mM acetate buffer pH 4.5) using 2% Azo-Xylan (Megazyme) as a substrate and measuring the activity following the supplier's specifications. As can be seen at 37 ° C, both enzymes, native and modified, are stable throughout the 80 hours of the trial. However, for the temperature of 50 ° C there is a difference in the stability between both enzymes, specifically the half-life of the modified enzyme was 9 h 45 min. in front of 2 h 15 min. corresponding to the native enzyme.
  • Example 3 industrial application.
  • Table 1 Composition of the soluble and insoluble fraction of the slurry obtained after steam pretreatment of wheat straw (210 ° C, 2.5 min).
  • the assay was carried out by mixing the modified enzyme at a concentration of 26 U / ml with a buffered solution (50 mM sodium acetate pH 5) of the pre-hydrolyzate as a substrate and incubating at 37 and 50 ° C.
  • a buffered solution 50 mM sodium acetate pH 5
  • the modified enzyme was able to carry out hydrolysis.

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Abstract

La presente invención describe una secuencia peptídica a la se han sustituido una serie de aminoácidos por mutagénesis dirigida a partir de la secuencia codificante de endoxilanasa de Aspergillus nidulans para obtener una endoxilanasa que presenta una mayor estabilidad térmica. Además, la presente invención se refiere al uso de esta endoxilanasa para la obtención de xilano a partir de materia vegetal y al posterior uso de este xilano en procesos de obtención de bioetanol.

Description

E N DOXI LANAS A TERMORRESISTENTE OBTENIDA POR MUTAGÉNESIS Y SU APLICACIÓN AL PROCESO DE OBTENCIÓN DE BIOETANOL.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una endoxilanasa modificada obtenida por mutagénesis dirigida a partir de la secuencia que codifica para la endoxilanasa de Aspergillus nidulans y al uso de esta endoxilanasa modificada para obtener xilano que posteriormente se emplea en procedimientos de obtención de bioetanol. Por tanto, la presente invención se engloba en el campo de la biotecnología y más particularmente a la biotecnología industrial.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR Actualmente, el bioetanol es el biocombustible con mayor producción mundial, del que se elaboraron más de 40.000 millones de litros durante el año 2004 en todo el mundo. Para su fabricación se pueden utilizar una gran cantidad de materias primas, principalmente caña de azúcar, almidón de maíz, remolacha, cereal o residuos forestales, incluso se está estudiando la posibilidad de cultivar árboles, con alto contenido de celulosa, como pueden ser el chopo o el sauce, con el único fin de producir etanol,.
Otra alternativa a las cosechas dedicadas a fines energéticos, es el uso de residuos de procesos agrícolas, forestales o industriales, con alto contenido en biomasa. Estos residuos pueden ir desde la paja de cereal a las "limpias" forestales, pasando por los Residuos Sólidos Urbanos (RSU) o las cáscaras de cereal o de arroz. Los residuos tienen la ventaja de su bajo coste, ya que son la parte no necesaria de otros productos o procesos, salvo cuando son utilizados en la alimentación del ganado. Los RSU tienen un alto contenido en materia orgánica, como papel o madera, que los hace una potencial fuente de materia prima, aunque debido a su diversa procedencia pueden contener otros materiales cuyo preproceso de separación incremente mucho el precio de la obtención del bioalcohol.
El proceso de degradación de los residuos vegetales se lleva a cabo mediante el empleo de reactores enzimáticos industriales que se alimentan con dichos residuos. La degradación se realiza mediante el uso de complejos enzimáticos comerciales que son una mezcla heterogénea de distintas actividades enzimáticas (fundamentalmente celulasas y hemicelulasas) capaces de degradar la malla de la pared celular vegetal. En estos reactores es posible degradar la pared celular vegetal a sus monosacáridos constituyentes. Tras esta degradación, el medio de reacción se transfiere a un fermentador y se usa como fuente de carbono para el crecimiento de un microorganismo, en casi todos los casos descritos una cepa de la levadura Saccharomyces cerevisiae, que lo aprovecha para producir bioetanol mediante la fermentación alcohólica. Sin embargo, a pesar de la metodología desarrollada, aun existen algunas barreras tecnológicas para el uso a gran escala de estas tecnologías. Una de las más importantes hace referencia a los altos costes de compra de los complejos enzimáticos cuyos componentes presentan baja actividad específica y poca adecuación tecnológica a las condiciones del proceso. La temperatura a la que se llevan a cabo estos procesos es uno de los factores limitantes de la actividad enzimática, por lo que la búsqueda de enzimas termoestables resulta imprescindible.
Dentro de las hemicelulasas, las xilanasas son las principales enzimas responsables de la degradación del xilano. La capacidad de producir estas enzimas, que poseen un amplio espectro de acción, está ampliamente distribuida en el mundo microbiano. Su aplicación se ha dirigido principalmente hacia la industria del papel y de la pulpa. Por ello, se han desarrollado diferentes patentes que proponen el uso de xilanasas en estos procesos, que se llevan a cabo en condiciones alcalinas y a temperaturas a las cuales dichas enzimas deben ser termoestables (ES2146756(T3), US5916795(A), US6083733(A), IN185709(A1 ), US5736384(A), WO2006104448(A1 ), WO0068396(A2), US6682923(B1 )). Estas xilanasas también juegan un papel importante para aumentar la digestibilidad de piensos animales (US2006193843(A1 ), US7060482(B1 ), WO0029587(A1 ). El empleo de las xilanasas en los procesos de degradación del material vegetal, previos a la obtención de bioetanol, esta relativamente menos documentado aunque existen diferentes trabajos científicos que demuestran la posibilidad de obtener xilanasas que se adecúen a las condiciones tecnológicas de los mismos (Menon et al., , Bioresource Technology 2010, 101 , 5366-5373 ; Kapoor et al., Biochemical Engineering Journal 2008, 38, 88-97,; Polizeli et al., Applied Microbiology and Biotechnology 2005, 67, 577-591 .
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención describe una enzima endoxilanasa, obtenida por mutagénesis dirigida a partir de la endoxilanasa de Aspergillus nidulans, que es más termoestable que la enzima nativa. Esta enzima es útil para degradar materiales lignocelulósicos para obtener azúcares que sirvan como fuente de carbono para levaduras productoras de etanol. La endoxilanasa o endo-1 ,4- beta-xilanasa es un tipo de enzima que degrada el polisacárido lineal beta-1 ,4- xilano a oligómeros de xilosa, rompiendo así la hemicelulosa que compone la pared celular de las plantas. Aspergillus nidulans es un hongo filamentoso del filum Ascomycota En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 de Aspergillus nidulans, donde dicha secuencia aminoacídica presenta las sustituciones del aminoácido treonina en la posición 92 y del aminoácido serina en la posición 100 por el aminoácido ácido aspártico y las sustituciones del aminoácido asparagina en la posición 102 y del aminoácido alanina en la posición 195 por el aminoácido arginina, respecto a la secuencia nativa que codifica la endoxilanasa XlnA de Aspergillus nidulans. Una realización preferida de la presente invención se refiere a la secuencia nucleotídica según la reivindicación 1 , donde la secuencia nucleotídica específica es SEQ ID NO: 2. La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 puede estar codificada por cualquier secuencia nucleotídica cuya transcripción origine un ARN mensajero y su posterior traducción a la secuencia de aminoácidos. Debido a que el código genético es degenerado, un mismo aminoácido puede ser codificado por diferentes codones (tripletes), por ello, la misma secuencia de aminoácidos puede ser codificada por distintas secuencias de nucleótidos.
En adelante, para hacer referencia a cualquiera de las secuencias nucleotídicas descritas en los párrafos anteriores, se puede usar la expresión "secuencia nucleotídica de la presente invención" o "secuencia nucleotídica de la invención".
Otro aspecto de la presente invención es un vector de expresión que comprende la secuencia nucleotídica según se ha descrito anteriormente. El término "vector de expresión" se refiere a un fragmento de ADN que tiene la capacidad de replicarse en un determinado huésped y, como el término lo indica, puede servir de vehículo para multiplicar otro fragmento de ADN que haya sido fusionado al mismo (inserto). Inserto se refiere a un fragmento de ADN que se fusiona al vector; en el caso de la presente invención, el vector puede comprender la secuencia nucleotídica de la invención que, fusionada al mismo puede replicarse en el huésped adecuado. Los vectores pueden ser plásmidos, cósmidos, bacteriófagos o vectores virales, sin excluir otro tipo de vectores que se correspondan con la definición realizada de vector. Preferiblemente el vector de expresión es capaz de expresarse en un microorganismo tipo bacteria. Otro aspecto de la presente invención es el producto de expresión de la secuencia nucleotídica de la invención, o del vector de la invención. Preferiblemente, el producto de expresión es la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1. Esta secuencia da lugar a una endoxilanasa con mayor resistencia térmica respecto a la nativa, una vez realizadas las modificaciones post- traduccción y después de que la enzima adquiera la conformación en la que es activa.
El término "producto de la expresión" tal como se entiende en la presente invención hace referencia a cualquier producto resultante de la expresión de la secuencia de nucleótidos de la invención. Así pues, como producto resultante de la expresión de la secuencia se entiende, por ejemplo, el ARN que se obtiene de la transcripción de la secuencia, el ARN procesado, la proteína resultante de la traducción del ARN modificada postraduccionalmente o no, o posteriores modificaciones de la secuencia nucleotídica en el interior de la célula siempre que la secuencia resultante tenga su origen en la secuencia original transferida o no pierda la característica funcional que la caracteriza en la presente invención. Otro aspecto de la presente invención es una célula que comprende la secuencia nucleotídica de la invención, o el vector de la invención o el producto de expresión de la secuencia nucleotídica de la invención, o cualquiera de las combinaciones de secuencia nucleotídica, vector de expresión o producto de expresión. El término "célula" tal como se entiende en la presente invención hace referencia a una célula procariótica o eucariótica. Así pues, el término célula comprende, al menos, una célula diferenciada o indiferenciada. Asimismo, también se incluye en esta definición un protoplasto (célula de una planta que carece de pared celular). La célula transformada con un vector que comprende la secuencia nucleotídica de la invención, puede incorporar la secuencia en alguno de los ADN de la célula; nuclear, mitocondrial y/o cloroplástico, o permanecer como parte de un vector que posee su propia maquinaria para autoreplicarse. La selección de la célula que ha incorporado cualquiera de las secuencias de la invención se lleva a cabo por medio de la adición de antibióticos al medio de cultivo o por medio de la no adición al medio de cultivo de algún aminoácido esencial para el metabolismo de dicha célula. En el primer caso, la resistencia de estas células a sustancias como los antibióticos está producida por la síntesis de moléculas codificadas por una secuencia comprendida en la secuencia del vector. En el segundo caso, las células transformadas con el vector de la invención deben ser auxótrofas para un determinado metabolito esencial y el vector de expresión debe comprender al menos una secuencia que permita complementar la falta de dicha auxotrofia
Un aspecto más de la presente invención es el uso de la secuencia nucleotídica de la invención, del vector de la invención, de la célula de la invención, o del producto de expresión de la secuencia nucleotídica de la invención, para la obtención de un producto enzimático con actividad endoxilanasa. Este producto puede ser obtenido mediante un sistema heterólogo de expresión. El término "producto enzimático con actividad endoxilanasa" se refiere a una enzima cuya actividad es identificada con el número EC 3.2.1.8, es decir, dicho número ha sido asignado por la Enzyme Commission number de acuerdo a las reacciones químicas que cataliza (IUBMB Enzyme Nomenclature, CAS Registry Number 9001-42-7). La enzima capaz de llevar a cabo este tipo de reacción química se denomina endoxilanasa o endo-1 ,4-beta-xilanasa. Dicha enzima es capaz de hidrolizar el xilano a oligomeros de xilosa.
Otro aspecto de la invención es un método para la obtención de un producto enzimático con actividad endoxilanasa que comprende: a) insertar al menos una secuencia nucleotídica según se ha descrito anteriormente en un vector de expresión capaz de expresar dicha secuencia nucleotídica en un microorganismo,
b) transformar al menos una célula de dicho microorganismo con el producto obtenido en el paso (a), y
c) cultivar la célula obtenida en el paso (b) en un medio de cultivo.
La transformación a la que se hace referencia en el paso (b) del método se lleva a cabo por medio de técnicas que forman parte del conocimiento general común, como por ejemplo, transformación genética mediada por electroporación, mediante acetato de litio, etc. Mediante estas técnicas se puede conseguir introducir, de forma estable, un vector que incluye cualquiera de las secuencias de la invención, de forma que, tras sucesivas divisiones de la célula, la secuencia incorporada sigue expresándose. El medio de cultivo adecuado para el crecimiento de las células transformadas es conocido por el experto en la materia.
Una realización preferida de la presente invención se refiere al método para la obtención de un producto enzimático con actividad endoxilanasa, donde además comprende el paso (d); recuperar el producto enzimático con actividad endoxilanasa del medio de cultivo y/o de las células del microorganismo. Dicho producto enzimático puede ser excretado por las células al medio de cultivo en el que están creciendo. El producto también puede recuperarse del interior de las células que lo producen mediante cualquier técnica que permita la lisis de dichas células o mediante cualquier técnica conocida en el estado de la técnica que permita la salida de dicho producto enzimático de las células.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere al método para la obtención de un producto enzimático con actividad endoxilanasa, donde la secuencia nucleotídica insertada en el paso (a) es SEQ ID NO: 2. Otra realización preferida de la presente invención se refiere al producto enzimático con actividad endoxilanasa obtenible por el método anteriormente descrito. Otro aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso del producto enzimático según descrito anteriormente para la obtención de oligómeros de xilosa a partir de materia vegetal. Para ello, el producto enzimático anteriormente descrito se mezcla con el material vegetal rica en xilano previamente acondicionado, y se mantiene durante un tiempo entre 20 y 80 horas, a una temperatura entre 30 y 60°C. La utilización de la enzima termoestable reporta las siguientes ventajas:
1 ) aumenta la eficacia del proceso al ser posible trabajar a 50°C.
2) reduce la carga de enzima necesaria para llevar a cabo el proceso. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para la obtención de bioetanol que comprende:
a) poner en contacto, in vitro, el producto enzimático descrito anteriormente con materia vegetal, e
b) incubar la mezcla descrita en el paso (a) con microorganismos productores de etanol a una temperatura de entre 30 y 60°C.
En una realización preferida, el método además comprende:
c) recuperar el bioetanol obtenido tras la incubación descrita en el paso (b).
Los microorganismos más adecuados para la obtención de bioetanol se seleccionan, pero sin limitarse, entre las levaduras de los géneros Saccharomyces y Kluyveromyces, particularmente Saccharomyces cerevisiae. También son útiles las bacterias Zymomonas mobilis.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1.- Estabilidad térmica de la endoxilanasa a 37°C (A) y a 50°C (B). Endoxilanasa nativa (■), endoxilanasa modificada (·)
EJEMPLOS A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad y efectividad de la endoxilanasa de la presente invención.
Las características que la endoxilanasa debe reunir según las condiciones del proceso de sacarificación del material lignocelulósico son las siguientes: ser estable a 50°C durante 34 horas y al menos 72 horas a 37°C. Se partió de una endoxilanasa de Aspergillus nidulans (XlnA) con un peso molecular de 22.000 Da, un pH óptimo de 5.5, una temperatura óptima de 60°C y un gran potencial hidrolítico sobre xilano de diferentes orígenes. La enzima es estable a 37°C pero a 50°C pierde su actividad transcurridas 10 h (ver ejemplo 2), por lo que se planteó una mejora de su termoestabilidad.
Ejemplo 1 : obtención de la endoxilanasa con mayor termorresistencia. Con la finalidad de hacer más termoestable la endoxilanasa XlnA de Aspergillus nidulans, se hizo un estudio de modelización de esta enzima. En primer lugar se uso el programa GenThreader para identificar proteínas, cuyas estructuras tridimensionales se conocen, que potencialmente comparten estructuras terciarias con la enzima XlnA. Se observó a través de este análisis, que una xilanasa (xyn 1 1 A) proveniente del hongo termófilo Chaetomium thermophilum presentó la mejor alineación estructural con la enzima XlnA. Se usó el programa "Deep View/Swiss PdbViewer" para modelar XlnA empleando la estructura de xyn 1 1A como referencia. Tras hacer la modelización de esta enzima y comparar las dos, se observó que las principales diferencias entre ellas eran la ausencia de 2 puentes salinos en la superficie de la xilanasa de Aspergillus nidulans. Dado que los puentes salinos superficiales pueden contribuir a la estabilidad térmica de la enzima, se decidió introducir estos cambios en la estructura de la xilanasa XlnA. Con este fin se obtuvo un transformante de E. coli con la secuencia codificante de XlnA de Aspergillus nidulans clonada en el vector comercial de expresión pALEX (un vector que dispone de un sistema de inducción por salicilato y un promotor fuerte). Se abordó una estrategia de mutagénesis dirigida que consistió en realizar una PCR de fusión de tres fragmentos de la secuencia de ADN que codifica XlnA mediante la cual se introdujeron 10 mutaciones para modificar 4 aminoácidos. Estas mutaciones modificaron los residuos T92 y S100 dando lugar a ácido aspártico y los residuos N102 y A195 dando lugar a arginina.
Ejemplo 2: caracterización bioquímica de la endoxilanasa modificada frente a la nativa.
Los ensayos cuyos resultados se exponen a continuación están relacionados con las características del proceso en que debe emplearse esta endoxilanasa. Concretamente, la enzima debe reunir las siguientes características: ser estable a 50 °C durante 34 horas y al menos 72 horas a 37 °C. En la Figura 1 se muestra la estabilidad de la enzima a estas dos temperaturas. Los ensayos de actividad se han realizado en una solución tamponada (tampón acetato 50 mM pH 4.5) empleando como sustrato Azo-Xilano (Megazyme) al 2% y midiendo la actividad siguiendo las especificaciones del proveedor. Como puede observarse para 37 °C ambas enzimas, la nativa y la modificada, son estables a lo largo de las 80 horas que duró el ensayo. Sin embargo para la temperatura de 50 °C sí que se observa una diferencia en cuanto a la estabilidad entre ambas enzimas, concretamente la vida media de la enzima modificada fue de 9 h 45 min. frente a las 2 h 15 min. correspondientes a la enzima nativa.
Ejemplo 3: aplicación industrial.
Con estos ensayos se pretende conocer la capacidad hidrolítica de la endoxilanasa modificada para degradar el pre-hidrolizado (slurry) resultante del tratamiento de explosión con vapor de la paja de trigo, liberando oligomeros de xilosa susceptibles de ser hidrolizados a xilosa, que puede servir como fuente de carbono para el crecimiento de las levaduras productoras de etanol. La composición de este pre-hidrolizado, tanto de la fracción soluble como insoluble, se detalla en la Tabla 1 .
Compuesto Reactor 10 I (NRef 9)
210°C 2,5 min.
Fracción soluble Fracción insoluble
(g/L) (% sobre muestra seca)
Celulosa - 59,4 ± 2,7
Hemicelulosa - 8,6 ± 0,4
Lignina - 29,1 ± 0,7
Glucosa 0,860 -
Xilosa 4,290 -
Galactosa 0,220 -
Arabinosa 0,700 -
Mañosa 0,090 -
Furfural 1 ,520 -
HMF 0,780 -
Benzaldehído 0,110 -
Vainillina 0,076 -
Siringaldehído 0,022 -
Acido Cumárico 0,039 -
Acido Ferúlico 0,068 - pH 3,5 -
Tabla 1. Composición de la fracción soluble e insoluble del slurry obtenida tras el pretratamiento de explosión por vapor de paja de trigo (210 °C, 2,5 min).
El ensayo se llevó a cabo mezclando la enzima modificada a una concentración de 26 U/ml con una solución tamponada (acetato sódico 50 mM pH 5) del pre-hidrolizado como sustrato e incubando a 37 y 50°C. Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 2. Condiciones de Hidrólisis3
37°C 72 h 50°C 34 h
1 b 2,5b 5b 1 b 2,5b 5b
19 [ig/m\ 12 g/ml 12 g/ml 14 μ9/ηιΙ 9 μ9/ηιΙ 3 μ9/ηιΙ (64%) (62%) (61 %) (47%) (45%) (20%) aConcentración de enzima: 26 U/ml
Concentración de slurry (%) en tampón acetato 50mM pH 5. Tabla 2. Azúcares reductores liberados tras el tratamiento del slurry con la endoxilanasa modificada (μ9 equivalentes de xilosa /mi) y su incremento relativo (%) con respecto a los tratamientos sin enzima.
En las condiciones 37 °C y 72 horas, con unas concentraciones del pre- hidrolizado de paja de trigo (slurry) de 1 , 2.5 y 5%, la endoxilanasa modificada fue capaz de incrementar los equivalentes de xilosa aproximadamente en un 60%, tomando como referencia la cantidad inicial presente en el pre- hidrolizado. En el caso de 50°C y 34 horas de ensayo, considerando las mismas concentraciones del pre-hidrolizado, el incremento en equivalentes de xilosa fue del orden del 45% para las concentraciones del 1 y 2.5%, mientras que para el 5% este incremento fue del 20%. Cabe destacar que a pesar de que el slurry contiene una serie de compuestos tales como ácido acético, fórmico, cumárico, ferúlico, HMF, catecol, vainillina, siringaldehido y 4- hidroxibenzaldehido que pueden tener carácter inhibidor, la enzima modificada fue capaz de llevar a cabo la hidrólisis.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 de Aspergillus nidulans, donde dicha secuencia aminoacídica presenta las sustituciones del aminoácido treonina en la posición 92 y del aminoácido serina en la posición 100 por el aminoácido ácido aspártico y las sustituciones del aminoácido asparagina en la posición 102 y del aminoácido alanina en la posición 195 por el aminoácido arginina.
2. Secuencia según la reivindicación 1 , donde la secuencia nucleotídica es SEQ ID NO: 2.
Vector de expresión que comprende la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
Producto de expresión de la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, o del vector de expresión según la reivindicación 3.
Producto según la reivindicación 4, donde el producto de expresión es SEQ ID NO: 1 .
Célula que comprende la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, el vector de expresión según la reivindicación 3, el producto de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, o cualquiera de sus combinaciones.
7. Uso de la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, para la obtención de un producto enzimático con actividad endoxilanasa mediante un sistema heterólogo de expresión.
Uso del vector de expresión según la reivindicación 3, para la obtención de un producto enzimático con actividad endoxilanasa.
Uso de la célula según la reivindicación 6, para la obtención de un producto enzimático con actividad endoxilanasa.
10. Método para la obtención de un producto enzimático con actividad endoxilanasa que comprende: a) insertar al menos una secuencia nucleotídica según la reivindicación
1 en un vector de expresión capaz de expresar dicha secuencia nucleotídica en un microorganismo,
b) transformar al menos una célula de dicho microorganismo con el producto obtenido en el paso (a), y
c) cultivar la célula obtenida en el paso (b) en un medio de cultivo.
1 1 . Método según la reivindicación 10, que además comprende:
d) recuperar el producto enzimático con actividad endoxilanasa del medio de cultivo y/o de las células del microorganismo.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 1 1 , donde la secuencia nucleotídica es SEQ ID NO: 2.
13. Uso del producto de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, donde dicho producto de expresión es una enzima con actividad endoxilanasa, para la obtención de oligómeros de xilosa a partir de materia vegetal.
14. Método para la obtención de bioetanol que comprende:
a) poner en contacto, in vitro, producto de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, donde dicho producto de expresión es una enzima con actividad endoxilanasa, con materia vegetal, e incubar la mezcla descrita en el paso (a) con microorganismos productores de etanol a una temperatura de entre 30 y 60°C.
15. Método según la reivindicación 14, que además comprende:
c) recuperar el bioetanol obtenido tras la incubación descrita en el paso
(b).
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