WO2011154570A1 - Variante de la ghrelina y sus usos - Google Patents

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Definitions

  • the present invention is within molecular biology and medicine, and refers to a new variant of ghrelin / obestatin splicing, called In2-ghrelin, and its uses. Specifically, it refers to the use of this variant, in isolation and / or in combination with ghrelin-O-acyltransferase (GOAT) and / or the truncated ghrelin receptor (GHS-Rlb), to obtain useful data in the diagnosis, prognosis and monitoring of breast cancer, pituitary tumors, ovarian, endometrial and cervical tumors.
  • GOAT ghrelin-O-acyltransferase
  • GLS-Rlb truncated ghrelin receptor
  • Ghrelin is a hormone synthesized primarily by the stomach (Kojima et al., 1999. Nature. 402 (6762): 656-60), although it is also expressed in a wide range of tissues where it acts as a paracrine or autocrine factor (Lago et al., 2005. Vitam Horm. 71: 405-32 .; Tena-Sempere, 2005. Growth Horm IGF Res. 15 (2): 83-8 .; Leite- Moreira and Soares, 2007. Drug Discov Today. 12 ( 7-8): 276-88 .; Leontiou et al., 2007. Pituitary. 10 (3): 213-25 .; Leite-Moreira et al., 2008. Vitam Horm.
  • Ghrelin can be acylated by ghrelin-O-acyltransferase (GOAT) and this form of ghrelin (AG) is the main endogenous ligand of the growth hormone secretagogue receptor (GHS-R) of type (GHS-Rla) . It is currently known that the ghrelin-acylated (AG) / GHS-Rla system exerts actions in multiple tissues, many of them related to the regulation of metabolic functions (Tschop et al, 2000. Nature 407 (6806): 908-13; Horvath et al, 2001. Endocrinology. 142. (10): 4163-9; Nakazato et al, 2001. Nature. 409 (6817): 194-8; van der Lely et al, 2004. Endocr Rev. 25 (3) : 426-57).
  • GAT ghrelin-O-acyltransferase
  • AG growth hormone secretagogue receptor
  • GHS-Rla
  • Human ghrelin is encoded by the GHRL gene, whose transcription results in an immature prepropeptide of 1,117 residues (prepro-ghrelin) that, as mentioned above, can be acylated by the GOAT enzyme and which, in any case, It is subsequently processed by prohormone convertases (PCI, PC7, Furin), causing the active hormone (AG) or the theoretically inactive hormone (non-acylated ghrelin or UAG) (Zhu et al, 2006. J Biol Chem. 281 (50): 38867-70 .; Garg, 2007 ' . J Clin Endocr inol Metab. 92 (9): 3396-8).
  • PCI prohormone convertases
  • the human ghrelin gene consisted of 4 coding exons (Ex) and one non-coding Ex (ExO).
  • the signal peptide of prepro-ghrelin is encoded in Exl, and the coding sequence (CDS) of mature ghrelin is encoded by Ex2 and Ex3 (Kanamoto et al, 2004. Endocrinology. 145 (9): 4144-53 .; Nakai et al, 2004. Life Sel 75 (18): 2193-201).
  • prepro-ghrelin also encodes another peptide, obestatin (Zhang et al, 2005. Science. 310 (5750): 996-9) whose tissue expression differs from that exhibited by ghrelin and has actions Biological tests (Karaoglu et al., 2009. Mol Cell Biochem. 323 (1-2): 1 13-8 .; Tsolakis et al., 2009. Eur J Endocrinol. 160 (6): 941-9; Volante et al, 2009. J Pathol. Aug; 218 (4): 458-66).
  • prepro-ghrelin has been described that lack exon 3 and, therefore, obestatin.
  • This isoform has been called exonS-deleted-ghrelin and occurs in several types of tumors (Jeffery et al, 2002. J. Endocrinol. 172 (3): R7-11; Jeffery et al, 2005b. Endocr Relat Cancer. 12 ( 4): 839-50 .; Yeh et al, 2005. Clin Cancer Res. 11 (23): 8295-303).
  • the occurrence of the intron retention process in the murine ghrelin gene has been described (Kineman et al, 2007. J Mol Endocrinol 38 (5): 51 1-21).
  • In2-ghrelin a new mRNA isoform, called In2-ghrelin, which contains Ex2 and 3, but lacks Exl, 4 and 5.
  • In2-ghrelin a new mRNA isoform
  • its expression is between 10 and 50 times greater than that of the native ghrelin in the pituitary gland and the hypothalamus, respectively, and more importantly, the mRNA expression level of this isoform is regulated under extreme metabolic conditions ( fasting and obesity) (Kineman et al, 2007. J Mol Endocrinol. 38 (5): 51 1-21). DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • In2-ghrelin Expression levels of human In2-ghrelin are consistently increased in breast cancer samples compared to normal samples.
  • the expression levels of In2-ghrelin correlate not only with the expression levels of GOAT or GHS-Rlb, but also with the expression levels of two cell proliferation markers (Ki67 and cyclin D3).
  • two cell proliferation markers Ki67 and cyclin D3
  • overexpression of this variant causes an increase in the basal rate of cell proliferation.
  • treatments with native ghrelin, UAG and tamoxifen alter the expression levels of In2-ghrelin in these cell lines.
  • Human In2-ghrelin has a very high expression in the cell lines derived from breast tumors (MCF7, BT 549, SKBR 3, HBL 100), ovarian (SKOV 3, MDAH 2774), endometrial (SKUT1, HEC IB, AN3CA, HEC 265, KLE, ISHIKAWA) and cervix (HELA, SIHA).
  • a first aspect of the invention relates to the In2-ghrelin variant, whose amino acid sequence has an identity of at least 80, and more preferably at least 85, 90, 91, 92, a 93, 94, 95, 96, 97, 98, or 99% with the amino acid sequence peptide SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of the In2-ghrelin is the sequence collected in SEQ ID NO: 1. Therefore, SEQ ID NO: 1 constitutes the amino acid sequence of In2-ghrelin, which is caused by the alternative splicing of the human GHRL gene.
  • the mRNA sequence is collected in SEQ ID NO: 10.
  • identity refers to the proportion of identical nucleotides between two sequences. The percentage of identity existing between two sequences can be easily identified by a person skilled in the art, for example, with the help of an appropriate computer program to compare sequences.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the splicing variant of the human GHRL gene (GeneID: 51738), the mRNA encoding In2-ghrelin or its translation products, as markers for diagnosis, prognosis, and / or monitoring of breast cancer, pituitary tumors, ovarian, endometrial and cervical tumors.
  • the mRNA encoding the In2-ghrelin variant or its translation products could be used in combination with the expression products (mRNA or protein) of ghrelin-O-acyltransferase (GOAT) or truncated ghrelin receptor (GHS-Rlb).
  • Another aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data for the diagnosis and / or prognosis of breast cancer, pituitary tumors, tumors of ovary, endometrium and cervix.
  • the first method of the invention comprising:
  • step (b) of the first method of the invention further comprises detecting the expression products of ghrelin-O-acyltransferase (GOAT), of the truncated ghrelin receptor (GHS-Rlb) , or both.
  • GOAT ghrelin-O-acyltransferase
  • GLS-Rlb truncated ghrelin receptor
  • the first method of the invention further comprises:
  • step (c) compare the quantities obtained in step (b) with a reference quantity.
  • Another aspect of the invention relates to a method of diagnosing breast cancer, pituitary tumors, ovarian, endometrial and cervical tumors, hereafter referred to as the second method of the invention, comprising steps (a) - ( c) of the first method of the invention, which further comprises:
  • step (d) assign patients who present a quantity of the expression products obtained in step (b) above and statistically significant to the reference amount, to the group of individuals with breast cancer, pituitary tumors, ovarian tumors, of endometrium and cervix.
  • Another aspect of the invention relates to a method of monitoring the evolution of breast cancer, pituitary tumors, ovarian, endometrial and cervical tumors, hereinafter the third method of the invention, which comprises performing at least twice the sequence of steps (a) - (c) of the first and second method of the invention, in samples obtained from the same individual not simultaneously.
  • the post-treatment is monitored.
  • the steps (b) and / or (c) of the methods described above can be totally or partially automated, for example, by means of a robotic sensor device for the detection of the quantity in step (b) or the computerized comparison in step (c).
  • gene expression product refers to the transcription and / or translation products (RNA and / or protein) of said genes, or any form resulting from the processing of said transcription or translation products.
  • diagnosis refers to the ability to discriminate between individuals suffering from breast cancer or not, from pituitary tumors, ovarian, endometrial and cervical tumors. It also refers, but not limited to, the ability to discriminate between samples from patients and healthy individuals.
  • prognosis in the present invention refers to the ability to detect asymptomatic patients or subjects who have a high probability of suffering from breast cancer, pituitary tumors, ovarian, endometrial and cervical tumors, even when at the time of the diagnosis do not present these pathologies.
  • the present invention makes it possible to correctly detect the disease in a differential manner in less than 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90% of the subjects of a particular group or population analyzed.
  • an “isolated biological sample” includes, but is not limited to, cells, tissues and / or biological fluids of an organism, obtained by any method known to a person skilled in the art.
  • the biological sample may be a tissue, for example, but not limited to, a biopsy or a fine needle aspirate, or it may be a fluid sample, such as blood, plasma, serum, lymph, ascites fluid or urine.
  • the cells are tumor cells.
  • cancer or “cancerous”, as used herein, refers to any malignant tumor.
  • Detection of In2-ghrelin both mRNA and the protein itself
  • expression products of ghrelin-O-acyltransferase (GOAT), or truncated ghrelin receptor (GHS-Rlb) in an isolated biological sample of an individual in a proportion greater than the reference amount is indicative that said individual suffers from breast cancer, pituitary tumors, ovarian, endometrial and cervical tumors.
  • GOAT ghrelin-O-acyltransferase
  • GLS-Rlb truncated ghrelin receptor
  • the detection can be carried out by any means known in the state of the art.
  • the authors of the present invention have demonstrated that the detection of mRNA levels of these transcripts in a quantitative manner, by means of real-time quantitative PCR (qrtRT-PCR), could be useful for the diagnosis of breast cancer.
  • the measurement of the amount or concentration can be carried out directly or indirectly.
  • Direct measurement refers to the measure of the quantity or concentration of expression products, based on a signal that is obtained directly from the products of expression, and that is correlated with the number of molecules of said expression products.
  • Said signal - which we can also refer to as an intensity signal - can be obtained, for example, by measuring an intensity value of a chemical or physical property of said expression products.
  • the indirect measurement includes the measurement obtained from a secondary component or a biological measurement system (for example the measurement of cellular responses, ligands, "tags" or enzymatic reaction products).
  • Quantity refers to, but is not limited to, the absolute or relative quantity of the expression products, as well as any other value or parameter related thereto or that may be derived of these.
  • Said values or parameters comprise values of signal intensity obtained from any of the physical or chemical properties of the expression products obtained by direct measurement. Additionally, said values or parameters include all those obtained by indirect measurement, for example, any of the measurement systems described elsewhere in this document.
  • the "determination of the level of expression" of the genes can be carried out by any method of determining the amount of the product of the expression of the genes known in the state of the art.
  • the detection of the gene expression product is performed by determining the level of mRNA derived from its transcription, where the analysis of the mRNA level of In2-ghrelin, ghrelin-O-acyltransferase (GOAT) and / or the mRNA encoding the truncated ghrelin receptor (GHS-Rlb) can be performed, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, by polymerase chain reaction (PCR) amplification, back transcription in combination with polymerase chain reaction (RT-PCR), retrotranscription in combination with ligase chain reaction (RT-LCR), or any other nucleic acid amplification method; DNA chips made with oligonucleotides deposited by any mechanism; DNA microarrays made with oligonucleotides synthesized in situ by photolithography or by any other mechanism; in situ hybridization using specific probes labeled with any method of marking; by electrophoresis gels; by membrane transfer and hybridization with PCR
  • the mRNA can be analyzed, for example, but not limited, in samples of fresh tissue, frozen tissue, fixed tissue or tissue fixed and embedded in paraffin.
  • samples of tissue fixed and embedded in paraffin have important advantages over fresh or frozen tissue samples: they are stable at room temperature, easy to store and there is a large archive of clinical samples available along with their clinical information and disease monitoring. Therefore, in a preferred embodiment the one analyzed is extracted from samples of fixed tissue and embedded in paraffin.
  • RNA obtained from tissue samples fixed and embedded in paraffin is often very degraded. While studies using microarrays are very sensitive to RNA degradation, the use of RT-PCR, and in particular, quantitative RT-PCR (qRT-PCR) has proven to be a technique that offers better results in the face of degradation of the RNA. In addition, expression analysis using microarrays is a complex technique that requires sophisticated equipment that is not available in many laboratories. Therefore, in a preferred embodiment, the detection of the mRNA of the genes is performed by the RT-PCR technique; and in a more preferred embodiment, the detection is performed by the qRT-PCR technique.
  • the detection of the gene expression product is performed by determining the level of protein derived from its transcription and translation, where the analysis of the level of the peptide products of the In2-ghrelin, of the ghrelin-O- acyltransferase (GOAT) and / or the mRNA encoding the truncated ghrelin receptor (GHS-Rlb) can be performed, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, by incubation with a specific antibody in an immunoassay.
  • immunoassay refers to any analytical technique that is based on the reaction of conjugation of an antibody with the sample obtained. Examples of immunoassays known in the state of the art are, for example, but not limited to: immunoblot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), immunohistochemistry or protein microarrays.
  • antibody refers to immunoglobulin molecules and immunologically active portions of immunoglobulin molecules, that is, molecules that contain an antigen binding site that specifically binds (immunoreacts) with any of the peptide products of In2-ghrelin, ghrelin-O-acyltransferase (GOAT), or the truncated ghrelin receptor (GHS-Rlb).
  • portions of immunologically active immunoglobulin molecules include F (ab) and F (ab ') 2 fragments that can be generated by treating the antibody with an enzyme such as pepsin.
  • the antibodies can be polyclonal (typically include different antibodies directed against different determinants or epitopes) or monoclonal (directed against a single determinant in the antigen).
  • the monoclonal antibody may be biochemically altered, by genetic manipulation, or it may be synthetic, possibly lacking the antibody in whole or in part, from portions that are not necessary for the recognition of the peptide products of In2-ghrelin, of ghrelin-O-acyltransferase (GOAT), and of the truncated ghrelin receptor (GHS-Rlb) and being substituted by others that communicate additional advantageous properties to the antibody.
  • the antibody can also be recombinant, chimeric, humanized, synthetic or a combination of any of the foregoing.
  • a "recombinant antibody or polypeptide” is an antibody that has been produced in a host cell that has been transformed or transfected with the nucleic acid encoding the polypeptide, or produces the polypeptide as a result of homologous recombination.
  • the antibodies used to carry out the methods of the present invention may be polyclonal or monoclonal antibodies capable of recognizing the peptide products of In2-ghrelin, GOAT, and the truncated ghrelin receptor (GHS-Rlb).
  • Antibodies that recognize the peptide products of In2-ghrelin and GOAT can be used to carry out the methods of the present invention by, for example, but not limited to, immunoblot, ELISA, RIA, immunhistochemistry or protein microarray.
  • the immunoassay is an immunoblot or Western blot.
  • a protein extract is obtained from an isolated biological sample of a subject and the proteins are separated in a support medium capable of retaining them by electrophoresis. Once the proteins are separated, they are transferred to a different support where they can be detected through the use of specific antibodies that recognize the peptide products of In2-ghrelin, GOAT and / or the truncated ghrelin receptor (GHS-Rlb).
  • the immunoassay is an immunhistochemistry (IHQ).
  • IHQ immunhistochemistry
  • Immunohistochemical techniques allow the identification, on tissue or cytological samples of characteristic antigenic determinants. Immunohistochemical analysis is performed on tissue sections, either frozen or included in paraffin, from an isolated biological sample of a subject. These sections hybridize with a monoclonal or polyclonal antibody that recognizes the peptide products of In2-ghrelin, GOAT and / or the truncated ghrelin receptor (GHS-Rlb).
  • GLS-Rlb truncated ghrelin receptor
  • TMA Tissue microarray
  • Another aspect of the invention relates to a kit comprising the suitable means for carrying out the methods of the invention.
  • it comprises the means for detecting the expression products of the GHRL genes (the mRNA of the In2-ghrelin variant and its peptide products), and preferably of GOAT and / or the truncated ghrelin receptor (GHS-Rlb) , in an isolated biological sample.
  • the GHRL genes the mRNA of the In2-ghrelin variant and its peptide products
  • GGS-Rlb truncated ghrelin receptor
  • Said kit may comprise primers, probes, poly or monoclonal antibodies, and all those reagents necessary to analyze the techniques described above in this document and / or known in the state of the art.
  • the kit can also include, without any limitation, the use of buffers, enzymes, polymerase enzymes, cofactors to obtain optimal activity of these, agents to prevent contamination, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization.
  • the kit may also contain other molecules, genes, proteins or probes of interest, which serve as positive and negative controls.
  • the kit further comprises the instructions for carrying out the first method of the invention.
  • the kit comprises the elements necessary to detect the expression products of the In2-murelin variant by RT-PCR.
  • the expression products are detected by sequence primers SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
  • the kit of the invention also comprises the primers necessary for the detection of GOAT (SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5), and even more preferably, for the detection of GHS-Rlb (SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7). Another aspect of the invention relates to the sequence primer SEQ ID NO: 2. Another aspect of the invention relates to the sequence primer SEQ ID NO: 3.
  • Another aspect of the invention relates to the sequence primer SEQ ID NO: 4 Another aspect of the The invention relates to the sequence primer SEQ ID NO: 5. Another aspect of the invention relates to the sequence primer SEQ ID NO: 6. Another aspect of the invention relates to the sequence primer SEQ ID NO: 7.
  • Another aspect of the invention relates to a method for identifying chemical substances useful in the treatment of breast cancer, pituitary tumors, ovarian, endometrial and cervical tumors, comprising:
  • step (c) assign the chemical test according to (c) to the group of chemical substances useful in the treatment of breast cancer, pituitary tumors, ovarian, endometrial and cervical tumors when the quantity of expression products of the In2-ghrelin variant detected in step (d) is less and statistically significant than that detected in step (b).
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides (RNA or RNA) and deoxyribonucleotides (DNA or DNA).
  • amino acid sequence refers to a polymeric form of amino acids of any length, which may be coding or non-coding, chemically or biochemically modified.
  • word “comprises” and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps.
  • other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention.
  • the following examples and drawings are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
  • FIG. 1 Schematic representation of the human variant In2-ghrelin.
  • A Classical organization of the human ghrelin / obestatin gene consisting of 5 exons (EX0-4) and 4 introns (Inl-4). Prepro-ghrelin / obestatin structure, prepro-In2-ghrelin precursor mRNAs are also indicated.
  • B Schematic diagram showing the position of the primers (indicated by arrows, s: sense, ace; antisense) used to detect, clone and / or quantitatively amplify human In2-ghrelin. Exons are represented as boxes and introns as lines.
  • C-H PCR products separated on agarose gel.
  • II Nucleotide and amino acid sequences of In2-ghrelin. Putative start and stop codons are indicated.
  • A Quantitative expression levels of In2-ghrelin.
  • B PCR bands of the ghrelin transcripts amplified from human tissues, where the order of the tracks corresponds to the order shown in panel A.
  • C Correlation between In2-ghrelin and GOAT
  • D the expression in human tissues of the native ghrelin
  • E Correlation values between expression in human tissues of In2-ghrelin and / or native ghrelin with GOAT and GHSRla / lb.
  • FIG. 3 Human variant In2-ghrelin in breast samples.
  • A Quantitative expression levels of In2-ghrelin in normal and cancerous samples.
  • B Correlations between the expression of In2-ghrelin and ghrelin, GOAT, GHSRla / lb in breast cancer samples.
  • C Quantitative expression levels of Ki67 and cyclin D3 in normal and cancerous samples.
  • D Correlation values between the expression of In2-ghrelin and GOAT with Ki67 or cyclin-D3 in breast cancer samples: Values are shown as means ⁇ SEM (** P ⁇ 0.01; indicates difference versus controls).
  • FIG. 4 Effect and regulation of the expression of the In2-ghrelin variant in MDA-MB-231 cells in vitro.
  • A Proliferation kinetics of MDA-MB-231 transfected with In2-ghrelin or control.
  • B Regulation of native ghrelin and In2-ghrelin expression in MDA-MB-231. Data represent means ⁇ SEM. Asterisks (* P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01, *** ⁇ , ⁇ ; indicate differences in controls).
  • Figure. 5. Analysis of the expression of In2-ghrelin in pituitary tumors.
  • MCF-7 and MDA-MB-231 (ATCC, Manassas, VA) cell lines were maintained in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% antibiotic-antifungal and 2 mM of L-glutamine. Both cell lines were maintained at 37 ° C and 5% C0 2 .
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • Both cell lines were maintained at 37 ° C and 5% C0 2 .
  • the cells were cultured for 24 h with DMEM supplemented with serum treated with activated carbon and 10-7M of SST, CST, ghrelin, DAG, estradiol or tamoxifen.
  • RNA isolation and reverse transcription (RT)
  • Nucleic acids were isolated with Trizol (Invitrogen, Barcelona, Spain) according to the manufacturer's instructions and treated with DNase as previously. described (Luque et al., 2006. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291 (2): E395-403.; Luque et al., 2006. J Mol Endocrinol. 37 (1): 25-38; Luque et al, 2006. J Mol Endocrinol. 36 (3): 547-56).
  • the Ribogreen RNA quantification kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) was used to determine the amount of RNA recovered. Reverse transcription was carried out with 2 g of total RNA, using the First-Strand Synthesis cDNA kit (Fermentas, Hanover, MD, USA).
  • Ghrelin fabric GOAT GHSRla GHSRlb ⁇ -actin ghrelin
  • the PCR program consisted of a 94 ° C cycle for 4 min, followed by 30-40 94 ° C cycles for 30 s, 58-62 ° C (depending on the primer pair) for 30 s, and 72 ° C for 30-60 s (depending on product size), and a final cycle of 72 ° C for 5 min.
  • the expression levels of ghrelin, In2-ghrelin, GOAT and GHSRla / b were determined by qrtRT-PCR using primers specific for each transcript (Table 2). The selection of the primers, as well as verification of their specificity, and confirmation of their efficiency has been carried out in a manner similar to that previously described for other genes (Taboada et al., 2007.
  • the amplification was carried out with the iCycler IQ system (Bio-Rad, Madrid) and to confirm that a single band of the expected size was amplified, the products were run on an agarose gel stained with ethidium bromide . This band was purified and subsequently sequenced to confirm that it corresponded with the expected sequence.
  • the values represent the average number of copies of each transcript per 100 ng of total mRNA.
  • In2-ghrelin encodes for a completely different C-terminal tail.
  • several possible proteolytic processing sites e.g., Arg-42 and Lys-63 in the In2-ghrelin sequence were identified, whose processing could originate various peptides derived from In2-ghrelin.
  • In2-ghrelin increases the proliferation of the cell line derived from mammary carcinomas MDA-MB-231 and its expression is regulated by ghrelin and tamoxifen
  • In2-ghrelin expression was regulated by native ghrelin (both acylated and non-acylated reduced their expression levels) and by tamoxifen (a drug antihormonal widely used for the treatment of breast tumors that increases the expression of In2-ghrelin).
  • In2-ghrelin is expressed in a wide variety of human tissues, suggesting that it could have physiological relevance.
  • the expression levels of this variant did not correlate with the levels of normal ghrelin expression in these tissues, indicating that the regulation of the expression of both transcripts is tissue-dependent, which could be controlled by recognition factors of splicing sites as RNA regulatory elements or proteins.
  • a close relationship is observed between the levels of expression of In-ghrelin and GOAT in these tissues. Since In2-ghrelin retains Ser3, it seems reasonable to suggest that this variant could be a primary substrate of GOAT in human tissues.
  • In2-ghrelin may have a relevant role in breast cancer. Specifically, its expression is increased in a sample of ductal breast cancer, where it correlates with higher levels of expression of two important markers of cell proliferation (cyclin D3 and Ki67).
  • In2-ghrelin is closely correlated with that of GOAT, supporting the idea that In2-ghrelin can be a primary substrate of GOAT.
  • GHS-Rlb truncated ghrelin receptor
  • MDA-MB-231 breast tumor cell lines with an expression pattern of the ghrelin system similar to that observed in primary tumors, native ghrelin and tamoxifen (an antihormonal drug for the treatment of breast tumors) alter the In2-ghrelin expression. This last observation could have pathophysiological implications, since tamoxifen is currently used for the treatment of breast cancers positive for estrogen receptors (ER).
  • ER estrogen receptors

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Abstract

La presente invención se refiere a una nueva variante de splicing de la ghrelina/obestatina, denominada In2-ghrelina, y a su uso de manera aislada y/o en combinación con la ghrelin-O-aciltransferasa (GOAT) y/o el receptor truncado de ghrelina (GHS-R1b), para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico y seguimiento del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix.

Description

VARIANTE DE LA GHRELINA Y SUS USOS
La presente invención se encuentra dentro de la biología molecular y la medicina, y se refiere a una nueva variante de splicing de la ghrelina/obestatina, denominada In2- ghrelina, y sus usos. En concreto, se refiere al uso de esta variante, de manera aislada y/o en combinación con la ghrelin-O-aciltransferasa (GOAT) y/o el receptor truncado de ghrelina (GHS-Rlb), para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico y seguimiento del cáncer de mama, de tumores hipofísarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La ghrelina es una hormona sintetizada fundamentalmente por el estómago (Kojima et al., 1999. Nature. 402 (6762): 656-60), aunque también se expresa en un amplio rango de tejidos donde actúa como factor paracrino o autocrino (Lago et al., 2005. Vitam Horm. 71 : 405-32.; Tena-Sempere, 2005. Growth Horm IGF Res. 15 (2): 83-8.; Leite- Moreira and Soares, 2007. Drug Discov Today. 12 (7-8): 276-88.; Leontiou et al., 2007. Pituitary. 10 (3): 213-25.; Leite-Moreira et al , 2008. Vitam Horm. 77: 207-38). La ghrelina puede ser acilada por la ghrelin-O- aciltransferasa (GOAT) y esta forma de ghrelina (AG) es el principal ligando endógeno del receptor de secretagogos de la hormona del crecimiento (GHS-R) de tipo la (GHS-Rla). Actualmente se sabe que el sistema ghrelina-acilada (AG)/GHS-Rla ejerce acciones en múltiples tejidos, muchos de ellos relacionados con la regulación de las funciones metabólicas (Tschop et al, 2000. Nature 407 (6806): 908-13; Horvath et al, 2001. Endocrinology. 142. (10): 4163- 9; Nakazato et al, 2001. Nature. 409 (6817): 194-8; van der Lely et al, 2004. Endocr Rev. 25 (3): 426-57).
La ghrelina humana es codificada por el gen GHRL, cuya transcripción da lugar a un prepro-péptido inmaduro de 1 17 residuos (prepro-ghrelina) que, como se menciona anteriormente, puede ser acilado por la enzima GOAT y que, en todo caso, es procesado posteriormente por convertasas de prohormonas (PCI, PC7, Furin), originando la hormona activa (AG) o la teóricamente inactiva (ghrelina no-acilada o UAG) (Zhu et al, 2006. J Biol Chem. 281 (50): 38867-70.; Garg, 2007 '. J Clin Endocr inol Metab. 92 (9): 3396-8). Clásicamente se ha considerado que el gen de la ghrelina humana consistía en 4 exones codificantes (Ex) y un Ex (ExO) no codificante. El péptido señal de la prepro-ghrelina es codificado en Exl, y la secuencia codificante (CDS) de la ghrelina madura es codificada por Ex2 y Ex3 (Kanamoto et al, 2004. Endocrinology. 145 (9): 4144-53.; Nakai et al , 2004. Life Sel 75 (18): 2193-201).
Sin embargo, estudios recientes han demostrado que la prepro-ghrelina también codifica otro péptido, la obestatina (Zhang et al, 2005. Science. 310 (5750): 996-9) cuya expresión tisular difiere de la exhibida por la ghrelina y posee acciones biológicas específicas (Karaoglu et al., 2009. Mol Cell Biochem. 323 (1-2): 1 13-8.; Tsolakis et al, 2009. Eur J Endocrinol. 160 (6): 941-9; Volante et al, 2009. J Pathol. Aug;218(4):458- 66). Además, un examen exhaustivo de la estructura genómica de la GHRL humana ha revelado que este gen, en realidad, ocupa 7,2 kb del DNA genómico (Seim et al, 2007. BMC genomics 8:298) y de hecho, se ha identificado un nuevo Ex (-1) y varias regiones de los ExO y Exl . La expresión de estas recientemente identificadas regiones exónicas origina múltiples transcritos tejido-específicos que pueden carecer de ghrelina u obestatina e incluso codificar nuevos péptidos (Seim I et al., 2009. Clin Exp Pharmacol Physiol. 37(1): 125-31.; Seim I et al, 2007. BMC Genomics 8:298). Además, se han descrito variantes de la prepro-ghrelina que carecen del exón 3 y, por lo tanto, de la obestatina. Esta isoforma se ha denominado exonS-deleted-ghrelin y se presenta en varios tipos de tumores (Jeffery et al, 2002. J. Endocrinol. 172 (3): R7-11; Jeffery et al, 2005b. Endocr Relat Cáncer. 12 (4): 839-50.; Yeh et al, 2005. Clin Cáncer Res. 11(23): 8295-303). Por último, se ha descrito la ocurrencia del proceso de retención de intrones en el gen de la ghrelina murina (Kineman et al, 2007. J Mol Endocrinol 38 (5): 51 1-21). Específicamente, la retención del intrón 2 (In2) da lugar a una nueva isoforma de ARNm, denominada In2-ghrelina, que contiene los Ex2 y 3, pero carece de los Exl , 4 y 5. Aunque la traducción del ARNm de la In2-ghrelina no está aún demostrada, su expresión es entre 10 y 50 veces mayor que la de la ghrelina nativa en la hipófisis y el hipotálamo, respectivamente, y más importante, el nivel de expresión del ARNm de esta isoforma se regula bajo condiciones metabólicas extremas (ayuno y obesidad) (Kineman et al , 2007. J Mol Endocrinol. 38 (5): 51 1-21). DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En la presente invención se demuestra la existencia de una nueva variante de splicing del gen GHRL humano, originada por la retención del In2, lo que da lugar a un transcrito alternativo que contiene ExO, Exl, In2, y Ex2 pero que carece de Ex3 y 4, denominado In2-ghrelina humana. Su traducción originaría un prepro-péptido de 117 aa que comparte con la prepro-ghrelina nativa el péptido señal (24 aa) y los 12 primeros aa y, por lo tanto, conserva el posible sitio de acilación por la GOAT en la Ser3. Este transcrito se expresa a diferentes niveles en los 22 tejidos humanos analizados, donde su expresión se correlaciona con la de GOAT (R =0,921). Estos datos sugieren que la In2- ghrelina podría ser un sustrato primario de esta enzima en tejidos humanos. La secuencia peptídica inferida a partir del ARNm de la In2-ghrelina posee varios sitios de procesamiento por convertasas de prohormonas, lo que sugiere que, a partir del prepro- péptido codificado por la In2-ghrelina, se podrían originar diferentes productos peptídicos.
Los niveles de expresión de la In2-ghrelina humana están consistentemente aumentados en muestras de cáncer de mama en comparación con muestras normales. Además, en estas muestras tumorales, los niveles de expresión de la In2-ghrelina se correlacionan no solo con los niveles de expresión de la GOAT o el GHS-Rlb, sino también con los niveles de expresión de dos marcadores de proliferación celular (Ki67 y ciclina D3). En líneas celulares derivadas de cáncer de mama, la sobreexpresión de esta variante provoca un incremento de la tasa basal de proliferación celular. Por último, tratamientos con la ghrelina nativa, la UAG y el tamoxifeno (la terapia endocrina estándar (antiestrogénica) usada en el tratamiento cáncer de mama) alteran los niveles de expresión de la In2-ghrelina en dichas líneas celulares.
Los niveles de expresión de la In2-ghrelina humana están consistentemente aumentados en muestras de tumores hipofosarios de distintos tipos (incluidos acromegalias, Cushing, prolactinoma, TSHoma (adenoma hipofisario secretor de tirotropina), así como tumores ectópicos) en comparación con muestras normales. La In2-ghrelina humana presenta una expresión muy elevada en las líneas celulares derivadas de tumores de mama (MCF7, BT 549, SKBR 3, HBL 100), de ovario (SKOV 3, MDAH 2774), de endometrio (SKUT1, HEC IB, AN3CA, HEC 265, KLE, ISHIKAWA) y de cérvix (HELA, SIHA).
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a la variante In2-ghrelina, cuya secuencia aminoacídica presenta una identidad de, al menos, un 80, y más preferiblemente al menos un 85, un 90, un 91, un 92, un 93, un 94, un 95, un 96, un 97, un 98, o un 99% con el péptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1. Aún más preferiblemente, la secuencia aminoacídica de la In2-ghrelina es la secuencia recogida en la SEQ ID NO: 1. Por tanto, la SEQ ID NO: 1 constituye la secuencia aminoacídica de la In2-ghrelina, que es originada por el splicing alternativo del gen GHRL humano. La secuencia de ARNm se recoge en la SEQ ID NO: 10. El término "identidad", tal y como se utiliza en la presente descripción, hace referencia a la proporción de nucleótidos idénticos entre dos secuencias. El tanto por ciento de identidad existente entre dos secuencias puede ser identificado fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, con la ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la variante de splicing del gen GHRL humano (GeneID: 51738), el ARNm que codifica para la In2-ghrelina o sus productos de traducción, como marcadores para el diagnóstico, pronóstico, y/o seguimiento del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix.. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el ARNm que codifica para la variante In2-ghrelina o sus productos de traducción se podrían usar en combinación con los productos de expresión (ARNm o proteína) de la ghrelin-O- aciltransferasa (GOAT) o del receptor truncado de ghrelina (GHS-Rlb). Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o pronóstico de cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix. de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende:
(a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y
(b) detectar el AR m de la variante In2-ghrelina, o sus productos peptídicos.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el paso (b) del primer método de la invención además comprende detectar los productos de expresión de la ghrelin-O-aciltransferasa (GOAT), del receptor truncado de ghrelina (GHS-Rlb), o de ambos.
En otra realización más preferida, el primer método de la invención además comprende:
(c) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de diagnóstico de cáncer de mama, de tumores hipofísarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos (a) - (c) del método primero de la invención, que además comprende:
(d) asignar los pacientes que presentan una cantidad de los productos de expresión obtenidas en el paso (b) superior y estadísticamente significativa a la cantidad de referencia, al grupo de individuos con cáncer de mama, de tumores hipofísarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de seguimiento de la evolución del de cáncer de mama, de tumores hipofísarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix, de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende realizar al menos dos veces la secuencia de pasos (a) - (c) del primer y segundo método de la invención, en muestras obtenidas de un mismo individuo de manera no simultánea. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el seguimiento se realiza posttratamiento. Los pasos (b) y/o (c) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la cantidad en el paso (b) o la comparación computerizada en el paso (c). El término "producto de expresión de los genes...", tal y como se utiliza en la presente descripción, hace referencia a los productos de transcripción y/o de traducción (ARN y/o proteína) de dichos genes, o a cualquier forma resultante del procesamiento de dichos productos de transcripción o traducción. El término "diagnóstico", tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a la capacidad de discriminar entre individuos que padecen o no cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix. También se refiere, pero sin limitarnos, a la capacidad de discriminar entre muestras procedentes de pacientes y de individuos sanos.
El término "pronóstico" en la presente invención se refiere a la capacidad de detectar pacientes o sujetos asintomáticos que presentan una alta probabilidad de padecer cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix, aún cuando en el momento del diagnóstico no presenten dichas patologías.
Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es significativamente estadística puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, test de Student o funciones discriminantes de Fisher. Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1 , de 0,05, de 0,01, de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60%, en al menos el 70%, en al menos el 80%, o en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.
Una "muestra biológica aislada" incluye, pero sin limitarnos, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. La muestra biológica puede ser un tejido, por ejemplo, pero sin limitarse, una biopsia o un aspirado por aguja fina, o puede ser una muestra de fluido, como sangre, plasma, suero, linfa, fluido ascítico u orina. Preferiblemente, las células son células tumorales. Los términos "tumor" o "tumoral", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a células transformadas que presentan un crecimiento incontrolado. Dependiendo de su posible evolución puede tratarse de un tumor benigno, que permanece en su lugar de inicio y no produce metástasis; o tumor maligno, invasivo o que produce metástasis. El término "cáncer" o "canceroso" tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a cualquier tumor maligno.
La detección de la In2-ghrelina (tanto del ARNm como la propia proteína) y de los productos de expresión de la ghrelin-O-aciltransferasa (GOAT), o del receptor truncado de ghrelina (GHS-Rlb) en una muestra biológica aislada de un individuo en una proporción superior a la cantidad de referencia es indicativa de que dicho individuo padece cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix. El término "individuo" no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.
La detección puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica. Los autores de la presente invención han demostrado que la detección de los niveles de ARNm de estos transcritos de manera cuantitativa, mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qrtRT-PCR), podría ser útil para el diagnóstico del cáncer de mama.
La medida de la cantidad o la concentración, preferiblemente de manera semi- cuantitativa o cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración de los productos de expresión, basada en una señal que se obtiene directamente de los productos de expresión, y que está correlacionada con el número de moléculas de dichos productos de expresión. Dicha señal - a la que también podemos referirnos como señal de intensidad - puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos de expresión. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de reacción enzimática).
El término "cantidad", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los productos de expresión, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de los productos de expresión obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.
Así pues, la "determinación del nivel de expresión" de los genes puede ser llevada a cabo por cualquier método de determinación de la cantidad del producto de la expresión de los genes conocido en el estado de la técnica.
En una realización preferida, la detección del producto de la expresión de los genes se realiza determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción, donde el análisis del nivel de ARNm de In2-ghrelina, de la ghrelin-O-aciltransferasa (GOAT) y/o del ARNm que codifica el receptor truncado de ghrelina (GHS-Rlb) se puede realizar, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; chips de DNA elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; microarrays de DNA elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de mareaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante resonancia magnética nuclear o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio.
El ARNm puede ser analizado, por ejemplo, pero sin limitarse, en muestras de tejido fresco, tejido congelado, tejido fijado o tejido fijado y embebido en parafina. El uso de muestras de tejido fijado y embebido en parafina presenta importantes ventajas con respecto a las muestras de tejido fresco o congelado: son estables a temperatura ambiente, fáciles de almacenar y existe un amplio archivo de muestras clínicas disponibles junto con su información clínica y el seguimiento de la enfermedad. Por tanto, en una realización preferida el analizado en se extrae de muestras de tejido fijado y embebido en parafina.
El ARN obtenido de muestras de tejido fijadas y embebidas en parafina suele encontrarse muy degradado. Mientras que los estudios mediante microarrays son muy sensibles a la degradación del ARN, el uso de la RT-PCR, y en particular, de RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) ha demostrado ser una técnica que ofrece mejores resultados ante la degradación del ARN. Además, el análisis de expresión mediante microarrays es una técnica compleja que requiere de equipos sofisticados que no están disponibles en muchos laboratorios. Por tanto, en una realización preferida, la detección del ARNm de los genes se realiza mediante la técnica de RT-PCR; y en una realización, más preferida, la detección se realiza mediante la técnica de qRT-PCR.
En otra realización preferida, la detección del producto de la expresión de los genes se realiza determinando el nivel de proteína derivado de su transcripción y traducción, donde el análisis del nivel de los productos peptídicos de la In2-ghrelina, de la ghrelin- O-aciltransferasa (GOAT) y/o del ARNm que codifica el receptor truncado de ghrelina (GHS-Rlb) se puede realizar, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, mediante la incubación con un anticuerpo específico en un inmunoensayo. El término "inmunoensayo", tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a cualquier técnica analítica que se basa en la reacción de la conjugación de una anticuerpo con la muestra obtenida. Ejemplos de inmunoensayos conocidos en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse: inmunoblot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunohistoquímica o microarrays de pro teína.
El término "anticuerpo" tal como se emplea en la presente descripción, se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con cualquiera de los productos peptídicos de la In2-ghrelina, de la ghrelin-O-aciltransferasa (GOAT), o del receptor truncado de ghrelina (GHS-Rlb). Ejemplos de porciones de moléculas de inmunoglobulinas inmunológicamente activas, incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2 que pueden ser generados tratando el anticuerpo con una enzima tal como la pepsina. Los anticuerpos pueden ser policlonales (incluyen típicamente anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes o epítopos distintos) o monoclonales (dirigidos contra un único determinante en el antígeno). El anticuerpo monoclonal puede ser alterado bioquímicamente, por manipulación genética, o puede ser sintético, careciendo, posiblemente, el anticuerpo en su totalidad o en partes, de porciones que no son necesarias para el reconocimiento de los productos peptídicos de la In2-ghrelina, de la ghrelin-O-aciltransferasa (GOAT), y del receptor truncado de ghrelina (GHS-Rlb) y estando sustituidas por otras que comunican al anticuerpo propiedades ventajosas adicionales. El anticuerpo puede ser también recombinante, quimérico, humanizado, sintético o una combinación de cualquiera de los anteriores. Un "anticuerpo o polipéptido recombinante" (rAC) es un anticuerpo que ha sido producido en una célula hospedadora que ha sido transformada o transfectada con el ácido nucleico codificante del polipéptido, o produce el polipéptido como resultado de la recombinación homologa. Los anticuerpos empleados para llevar a cabo los métodos de la presente invención pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales capaces de reconocer a los productos peptídicos de In2-ghrelina, GOAT, y el receptor truncado de ghrelina (GHS-Rlb). Los anticuerpos que reconocen a los productos peptídicos de In2-ghrelina y GOAT pueden ser empleados para llevar a cabo los métodos de la presente invención mediante, por ejemplo, pero sin limitarse, inmunoblot, ELISA, RIA, inmunhistoquímica o microarray de proteínas.
En otra realización preferida, el inmunoensayo es un inmunoblot o Western blot. Para llevar a cabo un inmunoblot o Western blot, se obtiene un extracto de proteínas a partir de una muestra biológica aislada de un sujeto y se separan las proteínas en un medio de soporte capaz de retenerlas mediante electroforesis. Una vez separadas las proteínas se transfieren a un soporte diferente donde pueden ser detectadas mediante el uso de anticuerpos específicos que reconocen a los productos peptídicos de In2-ghrelina, GOAT y/o el receptor truncado de ghrelina (GHS-Rlb).
En otra realización preferida, el inmunoensayo es una inmunhistoquímica (IHQ). Las técnicas de inmunohistoquímica permiten la identificación, sobre muestras tisulares o citológicas de determinantes antigénicos característicos. El análisis mediante inmunohistoquímica se realiza sobre cortes de tejido, ya sea congelado o incluido en parafina, procedente de una muestra biológica aislada de un sujeto. Estos cortes se hibridan con un anticuerpo monoclonal o policlonal que reconoce a los productos peptídicos de la In2-ghrelina, GOAT y/o el receptor truncado de ghrelina (GHS-Rlb). Entre las técnicas inmunohistoquímicas que pueden emplearse para obtener los perfiles de expresión se encuentra el microarray tisular. El microarray tisular (TMA) es considerado hoy en día una potente herramienta para el análisis masivo del perfil molecular del cáncer de múltiples muestras de tejido simultáneamente, proporcionando la posibilidad de estudiar nuevos marcadores, o los ya existentes de manera masiva. A su vez, el TMA preserva las muestras originales de tejido que con los métodos tradicionales disminuyen en cuantía y se deterioran por el uso frecuente. Los términos "perfil de expresión génica" o "perfil de expresión de los genes", tal y como se utilizan en la presente descripción, se refieren a los niveles de expresión del ARNm y/o de la pro teína producida por los genes de interés en una muestra biológica. Otro aspecto de la invención se refiere a un kit que comprende los medios adecuados para llevar a cabo los métodos de la invención. En una realización preferida, comprende los medios para detectar los productos de expresión de los genes GHRL (el ARNm de la variante In2-ghrelina y sus productos peptídicos), y preferiblemente de GOAT y/o el receptor truncado de ghrelina (GHS-Rlb), en una muestra biológica aislada.
Dicho kit puede comprender cebadores, sondas, anticuerpos poli o monoclonales, y todos aquellos reactivos necesarios para analizar las técnicas descritas anteriormente en este documento y/o conocidos en el estado de la técnica. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, el uso de tampones, enzimas, enzimas polimerasas, cofactores para obtener una actividad óptima de éstas, agentes para prevenir la contaminación, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. El kit puede contener además otras moléculas, genes, proteínas o sondas de interés, que sirvan como controles positivos y negativos. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo el primer método de la invención.
En otra realización más preferida, el kit comprende los elementos necesarios para detectar los productos de expresión de la variante In2 -ghrelina mediante RT-PCR. En otra realización más preferida, los productos de expresión se detectan mediante los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3. En otra realización aún más preferida, el kit de la invención también comprende los cebadores necesarios para la detección de GOAT (SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5), y aún más preferiblemente, para la detección de GHS-Rlb (SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7). Otro aspecto de la invención se refiere al cebador de secuencia SEQ ID NO: 2. Otro aspecto de la invención se refiere al cebador de secuencia SEQ ID NO: 3. Otro aspecto de la invención se refiere al cebador de secuencia SEQ ID NO: 4. Otro aspecto de la invención se refiere al cebador de secuencia SEQ ID NO: 5. Otro aspecto de la invención se refiere al cebador de secuencia SEQ ID NO: 6. Otro aspecto de la invención se refiere al cebador de secuencia SEQ ID NO: 7.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para identificar sustancias químicas útiles en el tratamiento del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix, que comprende:
a. establecer líneas celulares de cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix,
b. detectar la cantidad de ARNm de la variante In2-ghrelina o sus productos peptídicos en dichas células,
c. administrar la sustancia química test a las líneas celulares de (a), d. detectar la cantidad de ARNm de la variante In2-ghrelina o sus productos peptídicos según (b) tras la administración de la sustancia química test según (c), y
e. asignar la sustancia química test según (c) al grupo de sustancias químicas útiles en el tratamiento del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix cuando la cantidad de los productos de expresión de la variante In2-ghrelina detectada en el paso (d) es menor y estadísticamente significativa a la detectada en el paso (b).
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxiribonucleótidos (ADN ó DNA).
Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "productos peptídicos" "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura. 1. Representación esquemática de la variante humana In2-ghrelina. (A) Organización clásica del gen humano ghrelina/obestatina consistente en 5 exones (EX0- 4) y 4 intrones (Inl-4). Estructura de la prepro-ghrelina/obestatina, también están indicados los ARNm precursores prepro-In2-ghrelina. (B) Diagrama esquemático mostrando la posición de los cebadores (indicada con flechas, s: sentido, as; antisentido) empleados para detectar, clonar y/o amplificar cuantitativamente la In2-ghrelina humana. Los exones se representan como cajas y los intrones como líneas. (C-H) Productos de PCR separados en gel de agarosa. (I) Secuencias nucleotídica y aminoacídica de la In2-ghrelina. Se indican los codones putativos de inicio y parada.
Figura. 2. Distribución en tejidos de la variante humana In2-ghrelina. (A) Niveles de expresión cuantitativa de la In2-ghrelina. (B) Bandas de PCR de los transcritos de ghrelina amplificados de tejidos humanos, donde el orden de las pistas corresponde con el orden mostrado en el panel A. Correlación entre In2-ghrelina y GOAT (C) o la expresión en tejidos humanos de la ghrelina nativa (D). (E) Valores de correlación entre la expresión en tejidos humanos de la In2-ghrelina y/o ghrelina nativa con GOAT y GHSRla/lb.
Figura. 3. Variante humana In2-ghrelina en muestras de mama. (A) Niveles de expresión cuantitativa de la In2-ghrelina en muestras normales y cancerosas. (B) Correlaciones entre la expresión de In2-ghrelina y ghrelina, GOAT, GHSRla/lb en muestras de cáncer de mama. (C) Niveles de expresión cuantitativa de Ki67 y ciclina D3 en muestras normales y cancerosas. (D) Valores de correlación entre la expresión de In2-ghrelina y GOAT con Ki67 o ciclin-D3 en muestras de cáncer de mama: Los valores se muestran como medias ± S.E.M (** P<0,01 ; indica diferencia frente a los controles).
Figura. 4. Efecto y regulación de la expresión de la variante In2-ghrelina en células MDA-MB-231 in vitro. (A) Cinética de proliferación de MDA-MB-231 transfectadas con In2-ghrelina o control. (B) Regulación de la ghrelina nativa y de la expresión de In2-ghrelina en MDA-MB-231. Los datos representan las medias ± SEM. Asteriscos (* P<0,05, ** P<0,01 , *** ΡΟ,ΟΟΙ ; indican diferencias de los controles). Figura. 5. Análisis de la expresión de la In2-ghrelina en tumores hipofísarios. Un total de 68 tumores hipofísarios fueron incluidos en este estudio (23 tumores no funcionantes, 35 acromegalias, 4 cushing, 1 prolactinoma y 1 TSHoma, así como 3 tumores ectópicos). De forma paralela se analizaron mediante PCR cuantitativa los niveles de expresión de esta isoforma en hipófisis normal (n=3). Los valores representan número total de copias del transcrito de la In2-ghrelina ajustado con un factor de normalización (obtenido a partir de los niveles de expresión de 3 genes constitutivos: GAPDH, HPRT y β-actina). Las diferencias se consideraron significativas con una p<0,005. Figura. 6. Análisis de la expresión de la In2-ghrelina en líneas celulares derivadas de tumores ginecológicos mediante PCR convencional. Un total de 14 líneas celulares fueron incluidas en este estudio (4 líneas derivadas de tumores de mama, 2 derivadas de tumores de ovario, 5 de tumores de endometrio y 2 de cérvix). Como control, se analizaron, de forma paralela, los niveles de expresión del ARN ribosómico 18s.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad y efectividad de los métodos de la invención.
Pacientes y muestras Las muestras de carcinomas mamarios ductales esporádicos de 40 pacientes así como 4 muestras de mama normal se obtuvieron del Banco de Tumores del CNIO (Madrid). La media de edad de las pacientes en el momento de la cirugía fue de 53 años (rango, de 27 a 87 años). El panel comercial de ARN total de varios tejidos humanos se obtuvo de Clontech (Human Total Master Panel II y human pituitary gland poly-A RNA; Palo Alto, CA). La muestras de tumores hipofísarios se obtuvieron tras la cirugía transfenoidal de 35 pacientes y correspondían a: 22 adenomas hipofísarios no funcionantes (NFPAs), 6 GHomas, 5 corticotropinomas, 1 prolactinoma, y 1 TSHoma. Tras la cirugía, los tumores se congelaron inmediatamente hasta la extracción de ARN, tal y como se ha descrito previamente (Martinez-Fuentes et al., 2006). Este estudio fue aprobado por los Comités de Ética de la Universidad de Córdoba, del Banco de Tumores del CNIO (Madrid) y de los hospitales Reina Sofía (Córdoba), Virgen del Rocío (Sevilla), y Sant Pau (Barcelona). Antes de entrar en el estudio, cada paciente firmó el consentimiento informado.
Líneas celulares
Las líneas celulares MCF-7 y MDA-MB-231 (ATCC, Manassas, VA) se mantuvieron en Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de antibiótico-antimicótico y 2 mM de L-glutamina. Ambas líneas celulares se mantuvieron a 37° C y 5% C02. Para los tratamientos in vitro, las células se cultivaron durante 24 h con DMEM complementado con suero tratado con carbón activo y 10-7M de SST, CST, ghrelina, DAG, estradiol o tamoxifeno.
Las líneas celulares derivadas de tumores de mama (BT 549, SKBR 3, HBL 100), de ovario (SKOV 3, MDAH 2774), de endometrio (SKUT1, HEC IB, AN3CA, HEC 265, KLE, ISHIKAWA) y de cérvix (HELA, SIHA) se mantuvieron en Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de antibiótico-antimicótico y 2 mM de L-glutamina a 37° C y 5% C02. Aislamiento de ARN y transcripción reversa (RT)
Los ácido nucleicos se aislaron con Trizol (Invitrogen, Barcelona, Spain) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se trataron con DNasa tal y como está previamente descrito (Luque et al., 2006. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291 (2): E395-403. ; Luque et al , 2006. J Mol Endocrinol. 37 (1): 25-38; Luque et al, 2006. J Mol Endocrinol. 36 (3): 547-56). Para la determinación de la cantidad de ARN recuperado se usó el kit de Ribogreen RNA quantification (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). La transcripción reversa se llevó a cabo con 2 g de ARN total, usando el kit cDNA First-Strand Synthesis (Fermentas, Hanover, MD, USA).
Selección de cebadores y RT-PCR convencional o cuantitativa en tiempo real (qrtRT- PCR)
La selección de los cebadores empleados en RT-PCR convencional o cuantitativa (Tabla 1) se realizó usando como molde la secuencia génica de la ghrelina humana (Genebank accession # NM_016362) y el software primer3 (http://frodo.wi.mit.edu; Steve Rozen, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, CA, USA). Para la PCR convencional, se usó ADNc de los tejidos de interés y los reactivos de la 2X Master Mix PCR (MRI Fermentas). El volumen final de estas reacciones de PCR fue de 25 μΐ: 1 μΐ molde (50 ng ADNc), 12,5 μΐ de 2X Master Mix, 1 μΐ de cada cebador, y 9,5 μΐ H2Od.
Tabla 1. Número absoluto de copias de ARNm en tejidos humanos
In2-
Tejido Ghrelina GOAT GHSRla GHSRlb β-actina ghrelina
Médula ósea 4.750 720 1.150 n.d. 2 1.880.000
Cerebro 1.783 1.140 1.170 13 1 2.680.000
Cerebro fetal 879 1.740 2.500 259 23 5.470.000
Hígado fetal 1.287 84 1.360 n.d. n.d. 1.010.000
Corazón 1.689 365 1.400 n.d. 2 677.000
Riñon 6.235 1.140 972 n.d. 1 2.430.000
Hígado 788 295 658 n.d. n.d. 837.000
Pulmón 3.427 778 2.360 12 3 5.330.000
Placenta 928 512 1.680 3 19 2.150.000
Próstata 1.434 969 953 n.d. 4 1.370.000
Músculo
esquelético 433 361 154 n.d. 2 243.000
Bazo 4.498 615 2.580 n.d. 1 2.440.000
Testículos 2.341 2.490 1.270 186 19 2.900.000
Timo 3.618 6.520 17.200 2 3 6.690.000
Tráquea 2.100 510 421 5 3 1.730.000
Útero 1.218 . 975 1.510 n.d. 2 5.730.000
Colon 980 641 1.080 1 1 3 3.460.000
Intestino
delgado 18.516 985 1.040 1 1 2 3.350000
Médula espinal 2.756 1.050 907 292 1 1 3.570.000
Estómago 44.229 680 1.630 15 8 2.360.000
Pituitaria 634 129 732 3.060 554 313.000
El programa de la PCR consistió en un ciclo de 94° C durante 4 min, seguido de 30-40 ciclos de 94°C durante 30 s, 58-62° C (dependiendo de la pareja de cebadores) durante 30 s, y 72° C durante 30-60 s (dependiendo del tamaño del producto), y un ciclo final de 72° C durante 5 min. La determinación de los niveles de expresión de ghrelina, In2-ghrelina, GOAT y GHSRla/b se realizó mediante qrtRT-PCR usando cebadores específicos para cada transcrito (Tabla 2). La selección de los cebadores, así como verificación de su especificidad, y la confirmación de su eficiencia se ha realizado de manera similar a lo descrito previamente para otros genes (Taboada et al., 2007. Eur J Endocrinol. 156 (1): 65-74; Neto et al., 2009. J Clin Endocrinol Metab. 94 (6) 1931-7). El volumen final de la reacción de PCR fue de 25 μΐ incluyendo 100 ng de muestra y 12,5 mi de IQ™ SYBR Green Supermix (Biorad). El programa de la PCR consistió en 40 ciclos a 94° C durante 30 s, 61° C durante 30 s, y 72° C durante 30 s. Además, en cada placa se corrió un control sin ADN para monitorizar posibles contaminaciones exógenas. En todos los casos, la amplificación se llevó a cabo con el sistema iCycler IQ (Bio-Rad, Madrid) y para confirmar que se amplificó una sola banda del tamaño esperado, los productos se corrieron en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. Esta banda fue purificada y secuenciada posteriormente para confirmar que correspondía con la secuencia esperada.
Tabla 2. Nivel de expresión en tejidos y líneas celulares de mama.
In2-ghrelina Ghrelina GOAT GHSRla GHSRlb
Mama normal 595 442 202 3 n.d.
Mama tumoral 5.155 664 991 6 373
MDA-MB-231 5.783 3 552 3 193
Los valores representan la media del número de copias de cada transcrito por 100 ng de ARNm total.
Análisis estadístico
Se procesaron al mismo tiempo (qrtRT-PCR) las muestras de todos los pacientes, tejidos o líneas celulares del mismo experimento, se determinaron las variaciones dentro del mismo tumor mediante el test de la t de Student, y se determinó la correlación entre la expresión tisular de los transcritos mediante el test de correlación de Pearson. P<0,05 fue considerado como significativo. Todos los valores se expresaron como medias ± SEM. Identificación de la variante In2-ghrelina humana usando RT-PCR
Para esta identificación se diseñaron varios sets de cebadores en los Exl (sentido) y Ex2 (antisentido) del gen de la ghrelina humana (GHRL) de manera que flanqueaban al In2. Utilizando ADNc de cerebro humano como molde, se amplificaron dos bandas con cada set de cebadores, una de ellas correspondía a la ghrelina nativa (99pb y 239pb, respectivamente) y otra a la In2-ghrelina (293pb y 433pb, respectivamente). La secuenciación de estas bandas confirmó que las bandas de menor tamaño correspondían con la ghrelina nativa y las de mayor tamaño con una variante de ARNm que retiene el intrón 2. Además, se diseñó una pareja de cebadores que exclusivamente amplificaría la In2-ghrelina, lo que resultó en un única banda del tamaño esperado (215pb), mientras que no aparecieron bandas en los controles no retrotranscritos o sin ADNc, demostrando que lo observado no era consecuencia de contaminación genómica o externa, respectivamente. Ya que la In2-ghrelina comparte con la ghrelina nativa el Exl, se postuló que ambas podrían compartir el codón de inicio (ATG) localizado en dicho Ex. Si esto fuera así, la transcripción de la In2-ghrelina originaría una proteína de 117aa (prepro-In2-ghrelina) que compartiría con la prepro-ghrelina nativa el péptido señal y los 12 primeros aa de la ghrelina madura. Sin embargo, la retención del In2 altera el marco de lectura y, por lo tanto, la In2-ghrelina codifica para una cola C-terminal completamente diferente. Además, se identificaron varios posibles sitos de procesamiento proteolítico (p.e., Arg-42 y Lys-63) en la secuencia de la In2-ghrelina, cuyo procesamiento podría originar diversos péptidos derivados de la In2-ghrelina.
Niveles de expresión de la In2-ghrelina en tejidos humanos
Usando una pareja de cebadores específicos para la In2-ghrelina se encontró que esta variante de splicing se expresa en los 22 tejidos humanos analizados. Sin embargo, los niveles de expresión eran bastante variables, siendo más abundante en tejidos endocrinos como la hipófisis o el estómago. Se observó que estos niveles de expresión no se correlacionaron con los de la ghrelina nativa, pero sí con los de la GOAT (R2=0,921).
La In2-ghrelina se sobre-expresa en muestras de cáncer de mama Los datos de PCR cuantitativa demuestran que la In2-ghrelina se expresa en glándula mamaria normal pero que su expresión está 8 veces aumentada en una batería de 40 muestras de carcinomas de mama ductales invasivos (p=0,0042). Por el contrario, la ghrelina nativa que también se expresa en mama normal, no ve alterada su expresión en las muestras tumorales. También se observó una sobreexpresión de la GOAT y el GHSRlb en esta batería de muestras y, en ambos casos, sus niveles de expresión estuvieron positivamente correlacionados con los de la In2-ghrelina.
Además, se observó que, como era de esperar, los niveles de expresión de los marcadores Ki67 (proliferación celular) y ciclina D3 (inductor de ciclo celular) estaban sobreexpresados en las muestras tumorales en comparación con las muestras control. Interesantemente, los niveles de expresión de la In2-ghrelina y de la GOAT se correlacionaron positivamente o tendieron a hacerlo con los niveles de Ki67 y de ciclina D3.
La In2-ghrelina incrementa la proliferación de la línea celular derivada de carcinomas mamarios MDA-MB-231 y su expresión se regula por ghrelina y tamoxifeno
Experimentos de cinética de proliferación celular in vitro realizados con MDA-MB-231 transfectadas con la In2-ghrelina mostraron que la sobreexpresión de esta variante de splicing incrementaba la tasa de proliferación basal de estas células en compasión con su control negativo (transfectadas con un plásmido vacío). Específicamente, las células que sobreexpresaban la In2-ghrelina exhibieron tiempos de duplicación inferiores a las células control, siendo estas diferencias significativas a los días 2, 3 y 4 tras la transfección.
Además, en esta línea celular que presenta un patrón de expresión del sistema de la ghrelina similar al de los tumores mamarios (es decir, altos niveles de In2-ghrelina, GOAT y GHSRlb y bajos niveles de expresión de la ghrelina nativa y el GHSRla), la expresión de la In2-ghrelina se vio regulada por la ghrelina nativa (tanto la acilada como la no acilada redujeron sus niveles de expresión) y por el tamoxifeno (una droga antihormonal ampliamente utilizada para el tratamiento de tumores de mama que incrementa la expresión de la In2-ghrelina).
Conclusiones
Los resultados de estos experimentos indican que el gen de la ghrelina humana, al igual que el gen de la ghrelina murina, puede sufrir la retención del intrón 2 (In2-ghrelina). Puesto que la ghrelina nativa y la In2-ghrelina comparten el exón 0 y 1 , se postula que ambas comparten el codón de inicio situado en el exón 1. De manera que los 36 primeros aminoácidos de la In2-ghrelina (incluyendo el péptido señal y la Ser3, sitio de acilación por la GOAT) serían idénticos a los de la ghrelina nativa. Sin embargo, la retención del intrón altera el marco de lectura y la In2-ghrelina posee una cola C- terminal totalmente nueva con varios sitios de posible corte proteolítico, lo que sugiere que se podrían originar nuevos péptidos. Los autores de la presente invención demuestran que In2-ghrelina se expresa en una amplia variedad de tejidos humanos, lo que sugiere que podría tener relevancia fisiológica. Los niveles de expresión de esta variante no se correlacionaron con los niveles de expresión de la ghrelina normal en estos tejidos, lo que indica que la regulación de la expresión de ambos transcritos es tejido-dependiente, lo que pudiera estar controlado por factores de reconocimiento de sitios de splicing como elementos o proteínas reguladoras de ARN. Sin embargo, se observa una estrecha relación entre los niveles de expresión de la In-ghrelina y la GOAT en estos tejidos. Puesto que la In2- ghrelina conserva la Ser3, parece razonable sugerir que esta variante pudiera ser un sustrato primario de la GOAT en tejidos humanos.
Además, los datos indican que la In2-ghrelina podría tener un papel relevante en cáncer de mama. Específicamente, su expresión está incrementada en muestra de cáncer de mama ductal, donde se correlaciona con unos mayores niveles de expresión de dos importantes marcadores de proliferación celular (ciclina D3 y Ki67).
Este es el primer estudio donde se demuestra que la GOAT está presente en muestras de tumores de mama y que su expresión está incrementada en comparación con muestras control, donde además, al igual que la In2-ghrelina, esta expresión se correlaciona con la de cilcina D3 y Ki67.
Además, al igual que en la batería de tejidos humanos, la expresión de In2-ghrelina está estrechamente correlacionada con la de la GOAT, apoyando la idea de que la In2- ghrelina puede ser un sustrato primario de la GOAT.
Aunque previamente se había observado una sobre-expresión del receptor truncado de ghrelina (GHS-Rlb) en cáncer de mama mediante IHC, este es el primer estudio que demuestra esta sobreexpresión mediante PCR cuantitativa, indicando además que los niveles de expresión de este receptor son mucho mayores que los del receptor clásico (GHS-Rla). Se ha demostrado que el GHS-Rlb actúa como dominante negativo del GHS-Rla; sin embargo los niveles mucho más elevados del primero con respecto al segundo mostrados en este trabajo sugieren que el GHS-Rlb debe tener un papel diferente al de dominante negativo.
Por lo tanto, estos datos serían relevantes desde un punto de vista clínico ya que los ejemplos de la invención demuestran la presencia y expresión diferencial de la In2- ghrelina, GOAT y GHS-Rlb en muestras de cáncer de mama, por lo que pueden considerarse marcadores nuevos para el diagnostico o pronostico del cáncer de mama.
En líneas celulares de tumores de mama (MDA-MB-231) con un patrón de expresión del sistema de la ghrelina similar al observado en los tumores primarios, ghrelina nativa y tamoxifeno (una droga antihormonal para el tratamiento de tumores de mama) alteran la expresión de la In2-ghrelina. Esta última observación podría tener implicaciones pato-fisiológicas, ya que el tamoxifeno es usado en la actualidad para el tratamiento de canceres de mama positivos para receptores de estrógenos (RE).
Por último, la sobreexpresión de la In2-ghrelina en esta línea celular incrementa la tasa de proliferación de dichas células. Por lo tanto, nuestros resultados extienden el papel pro-proliferativo de la ghrelina nativa a su variante de splicing (In2-ghrelina), que parece influenciar la proliferación a través de un bucle auto o paracrino.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Variante In2-ghrelina cuya secuencia aminoacídica presenta una identidad de, al menos:
a. Un 80%,
b. Un 85%,
c. Un 90%,
d. Un 95%, o
e. Un 99%
con la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.
2. Variante In2-ghrelina según la reivindicación anterior, cuya secuencia aminoacídica es la secuencia recogida en la SEQ ID NO: 1.
3. Uso del ARNm que codifica para la variante In2-ghrelina o de sus productos peptídicos según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, como marcadores para la obtención de datos útiles en el diagnóstico pronóstico, o seguimiento del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix.
4. Uso del ARNm que codifica para la variante In2-ghrelina o de sus productos peptídicos según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en combinación con los productos de expresión del gen de la ghrelin-O-aciltransferasa (GOAT), del ARNm o proteína de la variante truncada del receptor de la ghrelina (GHS-Rlb), o ambos, como marcadores para la obtención de datos útiles en el diagnóstico pronóstico, o seguimiento del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix.
5. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o pronóstico del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix que comprende:
a. obtener una muestra biológica aislada de un individuo, b. detectar el ARNm de la variante In2-ghrelina, o sus productos peptídicos según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o pronóstico del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix según la reivindicación anterior, donde el paso (b) además comprende detectar los productos de expresión del gen de la ghrelin-O-aciltransferasa (GOAT), el ARNm o proteína de la variante truncada del receptor de la ghrelina (GHS-Rlb), o ambos.
Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o pronóstico del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix según cualquiera de las reivindicaciones 5-6, que además comprende: c. comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia.
Método de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix que comprende los pasos (a) - (c) según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, que además comprende:
d. asignar los pacientes que presentan una cantidad de los productos de expresión obtenidas en el paso (b) superior y estadísticamente significativa a la cantidad de referencia, al grupo de individuos con cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix.
Método de seguimiento de la evolución del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix que comprende realizar al menos dos veces la secuencia de pasos (a) - (c) según cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en muestras obtenidas de un mismo individuo de manera no simultánea.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5-9, donde la detección de los productos de expresión se realiza mediante RT-PCR.
11. Kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para analizar la cantidad de ARNm de la variante In2-ghrelina, o la In2-ghrelina según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en una muestra biológica aislada.
12. Kit o dispositivo según la reivindicación anterior, que comprende los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
13. Kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 11-12, que además comprende los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7.
14. Método para identificar sustancias químicas útiles en el tratamiento del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix que comprende:
a. establecer líneas celulares de cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix,
b. detectar el ARNm de la variante In2-ghrelina, o sus productos peptídicos según cualquiera de las reivindicaciones 1-2,
c. administrar la sustancia química test a las líneas celulares de (a), d. detectar el ARNm de la variante In2-ghrelina, o sus productos pept según (b) tras la administración de la sustancia química test según (c), y e. asignar la sustancia química test según (c) al grupo de sustancias químicas útiles en el tratamiento del cáncer de mama, de tumores hipofisarios, tumores de ovario, de endometrio y de cérvix cuando la cantidad de ARNm de la variante In2-ghrelina, o la In2-ghrelina detectada en el paso (d) es menor y estadísticamente significativa a la detectada en el paso (b).
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