WO2011135148A1 - Procedimiento para la obtención de células madre mesenquimales para uso biomédico - Google Patents

Procedimiento para la obtención de células madre mesenquimales para uso biomédico Download PDF

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cultures
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Pablo MENÉNDEZ BUJÁN
Gertrudis LIGERO MARTÍN
Laura SÁNCHEZ CONTRERAS
Iván GUTIÉRREZ ARANDA
René RODRÍGUEZ GONZÁLEZ
Ruth Rubio Amador
Clara Bueno Uroz
Verónica RAMOS MEJÍA
Mario Delgado Mora
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
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Fundacion Progreso Y Salud (junta De Andalucia)
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)

Definitions

  • the present invention falls within the scope of biomedicine and the pharmaceutical sector, more specifically, it relates to obtaining, by in vitro culture, mature mesenchymal cells (CMM) with multipotent capacity and presenting immunosuppressive and anti-inflammatory properties.
  • CCM mature mesenchymal cells
  • CMMs Mesenchymal stem cells
  • Mesenchymal stem cells are present in a multitude of adult tissues and represent one of the types of stem cells with the highest expectations in present and future clinical trials for various pathologies through cell and gene therapy. This is due to three essential properties, first of all due to its ability to differentiate itself towards various tissues of mesodermal origin such as bone, cartilage, fat or even muscle and, secondly, its immunosuppressive capacity that makes them little vulnerable to the system immune system (Garc ⁇ a-Castro J et al. J Cell Mol Med. 2008; 12: 2552-2565) and thirdly to their ability to migrate to damaged tissues. Obtaining CMMs generally requires human tissue obtained by invasive methods (white fat, bone marrow puncture, etc.).
  • Pluripotent stem cells offer great promise for cell replacement strategies based on CMMs.
  • the origin of the PSCs can be embryonic (ESC) although, recently, pluripotent stem cells have also been obtained from reprogramming somatic cells from a wide variety of cell types and tissues, through the insertion of critical genes getting their dedifferentiation to pluripotent stem cells (Yu, J., et al. 2007 Science. 318: 1917-1920. Takahashi k., et al 2007, Cell.131: 861-872. Park, IH, et al 2008, Nature. 451 : 141-146).
  • iPS induced pluripotent stem cells
  • PSCs pluripotent stem cells
  • the Barbieri and cois group has demonstrated the possibility of obtaining CMMs from hPSC of embryonic origin (hESCs).
  • a drawback of this study is that in it the authors do not decipher the molecular and cellular mechanisms that induce the differentiation of PSCs to CMM (Barberi T., et al 2005).
  • Another drawback shown in this work is that, obtaining CMMs from hPSC, has been very small ( ⁇ 5%) and that, the population of CMMs obtained from hPSC, subsequently had to be cultivated for at least 40 days in the presence of murine bone marrow stromal cells, which introduces xenogeneic components into the culture, which subsequently required the separation of both cell types by flow cytometry.
  • the Barbieri studies also did not show the immunosuppressive capacity of the resulting CMMs, a key feature for the therapeutic use of the CMMs.
  • the present invention describes a method of obtaining fully functional CMMs in vitro and in vivo from PSC cultures, by means of inhibition of the SMAD2 / 3 signaling pathway, a transcription pathway that plays a fundamental role in the homeostatic maintenance of cells.
  • the CMMs, obtained from PSC by inhibiting their SMAD2 / 3 signaling pathway as described in the invention are capable of differentiating into osteogenic, chondrogenic and adipogenic line cells.
  • the CMMs obtained in the present invention show potent immunosuppressive and anti-inflammatory effects, both in vitro and in vivo, in a colitis model.
  • the CMMs of the invention have unlimited growth, the cultures are kept growing for at least 200 days and can even reach more than 300 days, without the cells showing signs of senescence.
  • the term "unlimited culture” is defined as a culture of PSC-CMM cells capable of proliferating indefinitely in time without losing their morphological and phenotypic characteristics and remaining undifferentiated as CMMs, without showing senescence.
  • the term "indefinitely" applied to the growth of the PSC-CMM cells of the invention should be understood as a prolonged time of at least 200 days, without senescence traits appearing in the cells. .
  • Another advantage shown by the cells of the present invention is that since they can maintain undifferentiated cultures for an unlimited time, they become ready and prepared CMM reservoirs for when their use is necessary, without the need to extract, cultivate and differentiate CMMs , or defrosting samples of umbilical cord, fat or bone marrow to obtain the CMMs, and subsequent differentiation thereof, which would imply excessively long times to address urgent treatments of certain pathologies.
  • we cannot forget that the CMM of the present invention are genetically identical while the CMM from primary human tissue will present a great variability among donors which causes greater risks of rejections when used in regenerative medicine (implants, grafts, transplants, etc. ) in individuals other than the donor from whom it was obtained.
  • the treatment of PSCs with the SMAD2 / 3 signaling pathway inhibitor, as described in the present invention makes it possible to obtain cultures of CMMs, which in turn can be differentiated to osteocytes, adipocytes and / or chondrocytes cultured in the appropriate means of differentiation. This differentiation occurs in a very short time, approximately one week, a very short time that facilitates the replacement treatment before certain pathologies.
  • a SMAD2 / 3 signaling pathway inhibitor preferably 4- [4- (1, 3-Benzodioxol-5-) il) -5- (2-pyridinyl) -1 H-imidazol-2-yl] benzamide, also known as SB-431542, PSC-CMMs.
  • the 4- [4- (1, 3-Benzodioxol-5-yl) -5- (2-pyridinyl) -1 H-imidazol-2-yl] benzamide (SB-431542) is a potent and selective inhibitor of TGF- ⁇ family receptors: ALK4, ALK5 and ALK7, which induces blockade of cell signaling via SMAD 2/3-TGF-p.
  • the PSC-CMMs described in the present invention are capable of differentiating into osteogenic, chondrogenic and adipogenic cells, in addition to showing potent immunosuppressive and anti-inflammatory effects, both in vitro and in vivo, in a murine model of intestinal inflammation. (colitis).
  • PSC-CMMs functional differentiation of PSC-CMMs as those that once cultured in culture media that induce their differentiation in specific cell lines, are characterized as chondrocytes, osteocytes or adipocytes, by specific staining.
  • the PSC-CMMs directly obtained by the described procedure are described in the present invention.
  • the use of the inhibitor 4- [4- (1, 3- Benzodioxol-5-yl) -5- (2-pyridin) -1 H-imidazol-2-yl] benzamide is also described (SB-431542) to obtain the described PSC-CMMs, as well as the use of the PCS-CMMs themselves in regenerative medicine therapy for the treatment of autoimmune diseases such as: diabetes, multiple sclerosis, Chron disease, arthritis rheumatoid, in addition to bone and cartilage regenerations, fistulas and graft-versus-host disease (GVHD) by bone marrow transplantation.
  • autoimmune diseases such as: diabetes, multiple sclerosis, Chron disease, arthritis rheumatoid, in addition to bone and cartilage regenerations, fistulas and graft-versus-host disease (GVHD) by bone marrow transplantation.
  • chondrocytes, osteocytes or adipocytes obtained by the method described in the invention, as well as their use in regenerative medicine therapy for the treatment of the aforementioned diseases, among others.
  • Figure 1 Kinetics of the differentiation of hPSCs to CMMs by treatment with the SMAD pathway inhibitor 2/3, 4- [4- (1, 3-Benzodioxol-5-yl) -5- (2-pyridinyl) - 1 H-imidazol-2-yl] benzamide (SB-431542).
  • the percentage of cells with phenotype Oct-4 + and Tra-1-60 + respectively, represented by flow cytometry, are represented on the Y axes.
  • the continuous line represents cultures treated with 4- [4- (1, 3-Benzodioxol-5-yl) -5- (2-pyridinyl) -1 H-imidazol-2-yl] benzamide.
  • the dotted line represents cultures treated with TGF- ⁇ .
  • the dashed line represents untreated cultures (DMSO). Data are shown as mean ⁇ standard deviation of the different experiments for each cell culture.
  • Figure 2 Representative analysis by flow cytometry of cultures of hPSC-CMMs treated with 4- [4- (1,3-Benzodioxol-5-yl) -5- (2-pyridinyl) -1 H-imidazol-2-yl ] benzamide (SB-431542) or TGF- ⁇ (A) Cytometric analysis of the presence of the CD73 and CD90 membrane markers (upper panel), associated with a typical CMM phenotype, as well as the markers associated with cellular pluripotentiality Oct-3/4 (central panel) and Tra-1 -60 (lower panel) in hPSC cultures treated with 4- [4- (1, 3- Benzodioxol-5-yl) -5- (2-pyridinyl) -1 H-imidazol-2-yl] benzamide or TGF- ⁇ or DMSO (Control) for 28 days.
  • Negative controls of cells that were incubated in the presence of immunoglobulins of the same isotype linked to the same fluorochromes as the antibodies used are shown in the panels on the right-hand side.
  • the antibodies used are labeled with fluorescein (FITC) (CD90 and Oct3 / 4) or with Phycoerythrin, (PE) (CD73 and Tra-1-60).
  • FITC fluorescein
  • PE Phycoerythrin,
  • 7AAD 7-amino-actinomycin D, fluorochrome that stains dead cells.
  • SSC orthogonal light scattering in the flow cytometer.
  • FIG. 3 Western Blot assays of hPSC-CMM cell extracts cultured in the presence of 4- [4- (1,3-Benzodioxol-5-yl) -5- (2-pyridinyl) -1 H-imidazol-2- il] benzamide (SB-431542) or TGF- ⁇ (A)
  • the figure shows the dephosphorylation of SMAD2 / 3 (p-SMAD2 / 3) in hPSC cells treated with 10 ⁇ of 4- [4- (1, 3-Benzodioxol -5-yl) -5- (2-pyridinyl) -1 H-imidazol-2-yl] benzamide (+) for 60 minutes.
  • Figure 4 Phenotypic characterization of hPSC-CMMs.
  • A Isolation by flow cytometry of the cell populations of hPSC-CMMs that have the phenotypes CD73 + CD90 + and CD73-CD90 +, after 28 days of treatment with 10 ⁇ of 4- [4- (1, 3-Benzodioxol- 5-yl) -5- (2-pyridinyl) -1 H- imidazol-2-yl] benzamide (SB-431542).
  • the purity of the CD73 + CD90 + population was consistently 85% and that of the CD73-CD90 + population 90%.
  • HPSC-CMMs after 28 days of treatment with 4- [4- (1, 3- Benzodioxol-5-yl) -5- (2-pyridinyl) -1 H-imidazol-2-yl] benzamide showed the presence of markers specific for CM Ms: CD73, CD90, CD 1 05, CD44, CD 166 and the absence of hematopoiesis or endothelial markers that are not present in CMM: CD45, CD34, CD14, CD19, HLA-DR and SSEA-4.
  • FIG. 5 Functional differentiation of hPSC-CMMs.
  • A The graph shows the growth of different cell cultures of hPSC-CMMs (solid line), of CMM derived from umbilical cord (dotted line) or of CMM derived from bone marrow (dashed line) along weather.
  • the Y-axis shows the growth expressed as cumulative duplications of the population (Y-axis) and the X-axis represents the time expressed in days.
  • hPSCs-CMMs show potent immunosuppressive effects in vitro.
  • A The total number of cells (Y axis), determined by flow cytometry, present in mixed lymphocyte cultures (MLC) after 4 days in the presence of hPSC-CMMs or CB-CMM or CMM is shown in the upper panel derived from adipose tissue (Ad-CMM). The number of proliferating CD4 + lymphocytes (measured as% of CFSE mid / 10W cells) is shown in the lower panel.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cell cultures from one of the healthy donors (C) were used. Data are shown as mean ⁇ standard deviation of the different experiments for each cell culture.
  • the different ratios of concentrations used are shown in the X-axis and in the Y-axis the lymphocytic proliferation expressed as counts per million per 10 3 (cpmxI O 3 ) is shown. Data are shown as mean ⁇ standard deviation of the different experiments for each cell culture.
  • C The figure shows that hPSC-CMMs cultures do not express CD40 or CD80 costimulatory molecules, involved in the adhesion of T cells with antigen presenting cells, analyzed by flow cytometry.
  • Figure 7 The hPSC-CMMs show potent anti-inflammatory effects in vitro.
  • A Cultures of hPSC-CMM decrease the production of cytokines by the activated lymphocytes present in the MLC.
  • hPSC-CMMs or CB-CMMs or Ad-CMMs were added to MLC.
  • the production of inflammatory cytokines: interleukin 2 (IL-2), interferon- ⁇ (INF- ⁇ ), tumor necrosis factor- ⁇ (TNF-a) as well as non-inflammatory cytokine interleukin 4 (IL-4) was analyzed by ELISA in the cell supernatant after 72 hours of culture.
  • the concentration of the mentioned cytokines expressed as pg / ml is shown on the Y axis. Data are shown as mean ⁇ standard deviation of the different experiments for each cell culture. * p ⁇ 0.001 vs MLC without CMMs.
  • hPSC-CMMs inhibit the inflammatory response of synoviocyte cultures (FLS) extracted from patients with active rheumatoid arthritis (RA). FLS were incubated in basal conditions without stimulation (black bars) or stimulated (white bars) with lipopolysaccharide (LPS 1 ug / mL) for cytokine determination (IL-6 and TNF- ⁇ ) or with TNF-a (20ng / mL ) to analyze collagenase activity in the absence (-) or presence of hPSC-CMMs, CB-CMMs or Ad-CMMs.
  • FLS synoviocyte cultures
  • RA active rheumatoid arthritis
  • Collagenase activity was determined in the culture supernatant by the EnzChek gelatinase / collagenase kit (Molecular Probes) and the concentration of inflammatory cytokines was in the cell supernatant by ELISA.
  • concentration of the IL-6 and TNF- ⁇ cytokines expressed as ng / ml and the collagenase activity expressed as units / ml / 10 6 cells are represented on the Y axis. * p ⁇ 0.001 vs LPS (-). Data are shown as mean ⁇ standard deviation of the different experiments for each cell culture.
  • FIG. 8 The treatment with hPSC-CMMs protects against an experimental model induced of colitis in mice.
  • A The graph shows the evolution of the weight of the animals over time.
  • the analysis time expressed in days and in the Y axis the weight of the animals with respect to day 0, expressed as a percentage, of the weight of the animals throughout the study is represented on the X axis.
  • the solid line represents the group of control mice that have not been treated.
  • the white squares represent the group of mice that have been treated with 50% ethanol (vehicle).
  • Black circles represent the group of animals that have been treated only with TNBS.
  • the black triangles represent the group of animals treated with TN BS + Ad-CMMs.
  • the white triangles represent the group of animals treated with TNBS + CB-CMMs.
  • the white circles represent the group of animals treated with TNBS + hPSC-CMMs.
  • the present invention describes a method of obtaining mesenchymal stem cells (PSC-CMMs) comprising:
  • a first step that consists in culturing PSC cells in the presence of a SMAD2 / 3 signaling pathway inhibitor to generate the PSC-CMMs of the present invention.
  • the PSC-CMMs obtained in the previous step are isolated.
  • the method of the invention is characterized in that the SMAD2 / 3 ization signal pathway inhibitor is 4- [4- (1,3-Benzodioxol-5-yl) -5- (2-pyridinyl) - 1 H-imidazol-2-yl] benzamide, also known as SB-431542.
  • the process of the invention is characterized in that 4- [4- (1, 3-Benzodioxol-5-yl) -5- (2-pyridinyl) -1 H-imidazol-2-yl] benzamide is used at a concentration of between 5 ⁇ to 50 ⁇ , preferably 10 ⁇ and for a period of time ranging from 7 to 40 days, preferably 28 days.
  • the process of the invention is characterized in that the PSC are of human origin and, therefore, the obtained PSC-CMMs also have said origin.
  • the process of the invention is characterized in that the characterization of the PSC-CMMs is preferably performed by phenotypic and morphological characterization.
  • morphological characterization is understood as the positive identification of cells with fibroblast, elongated, narrow and large phenotype.
  • Phenotypic characterization is understood as the identification of cells with a particular expression profile of cell surface markers which, for the present invention, comprises: being negative cells for the CD34, CD19, CD14, CD106, CD45, SSEA-4, HLA-DR, Oct-3/4 and Tra-1-60 antigens and positive for CD73, CD90, CD105, CD44 and CD166.
  • the process of the invention is characterized in that the morphological characterization is preferably performed by phase contrast microscopy.
  • the process of the invention is characterized in that, optionally, it also comprises a step c) of functional differentiation, which consists primarily in cultivating the obtained PSC-CMMs, in specific culture media to induce their differentiation in a or another cell line and secondly, in staining said PSC-CMMs with specific dyes that evidence said differentiation in a given cell line.
  • the method of the invention is characterized in that the culture media used induce the differentiation of the CMMs in cells of the osteogenic, chondrogenic and adipogenic lines.
  • the process of the invention is characterized in that the PCS-CMM cells obtained can be kept unlimitedly in culture.
  • the term "unlimited growth culture of PSC-CMMs" is defined as those cultures of PSC-CMMs that remain undifferentiated for a long time, at least 200 days.
  • the PSCs Once the PSCs have been differentiated to PSC-CMMs by the procedure described above, they can be kept in culture ready to be used, among others, in the treatments mentioned herein, in a state of unlimited growth, in between DMEM culture with 10% fetal bovine serum, 1% glutamine and 1% penicillin / streptomycin, under conditions of 37 ° C and 5% humidity, or they can also be frozen by routine biochemical procedures, such as using the solvent dimethyl sulfoxide (DMSO) in liquid nitrogen at a temperature of at least - 200 ° C, in order to maintain a continuous reservoir of PSC-CMMs.
  • DMSO solvent dimethyl sulfoxide
  • Another object of the present invention relates to CMMs, PSC-CMMs, obtainable by the procedure described above. These cells are characterized by culturing indefinitely without showing signs of senescence, in addition to, as mentioned before, being able to freeze them in liquid nitrogen, without losing any of their characteristics and properties, and having them as a reservoir of PSC-CMMs.
  • senescence is defined as the gradual and intrinsic changes of living cells or organisms that lead to an increased risk of vulnerability, loss of vigor, disease and death.
  • the PSC-CMMs cells are characterized in that, preferably, they express the markers: CD73, CD90, CD105, CD44 and CD166 and do not express the markers: CD106, CD45, CD34, CD14, CD19, HLADR, SS EA- 4, Oct3 / 4 and Tra-1-60, and because they also show immunosuppressive and anti-inflammatory properties in vitro and in vivo.
  • PSC-CMM cells are characterized in that in vitro they comprise at least one immunosuppressive or anti-inflammatory property to choose from: decrease in lymphocyte count, decrease in lymphocyte proliferation, decrease in cytokine concentration inflammatory, IL-2, IFN- ⁇ and TNF- ⁇ or decreased collagenase activity.
  • PSC-CMM cells are characterized by not showing senescence after at least 200 days of culture.
  • PSC-CMM cells are characterized in that they are of human origin.
  • Another object of the present invention relates to the use of a SMAD2 / 3 signaling pathway inhibitor in procedures for obtaining CMM.
  • the SAMD2 / 3 signaling pathway inhibitor used to obtain CMM is preferably 4- [4- (1,3-Benzodioxol-5-yl) -5- (2-pyridinyl) - 1 H-imidazol-2-yl] benzamide.
  • Another object of the present invention relates to chondrocytes, osteocytes or adipocytes obtainable by the method described in the present invention, as well as their use in the treatment of diseases of the group: autoimmune diseases, diabetes, multiple sclerosis, Chron disease, arthritis , bone diseases, cartilage diseases, fistulas, graft immune rejection and graft-versus-host disease by bone marrow transplantation.
  • Another object of the present invention relates to the use of the PSC-CMMs described in the present invention for the treatment of group diseases: autoimmune diseases, diabetes, multiple sclerosis, Chron disease, arthritis, bone diseases, cartilage diseases, fistulas , graft immune rejection and graft-versus-host disease by bone marrow transplantation.
  • group diseases autoimmune diseases, diabetes, multiple sclerosis, Chron disease, arthritis, bone diseases, cartilage diseases, fistulas , graft immune rejection and graft-versus-host disease by bone marrow transplantation.
  • the method of the invention starts with PSCs of animal origin, including PSCs of human origin (hPSCs).
  • PSCs of human origin hPSCs
  • hPSC-CMMs cells of animal origin
  • uses of the cells obtainable with the process of the invention are based on PSC-CMMs of animal origin, including cells of human origin, hPSC-CMMs.
  • SMAD2 / 3 signaling pathway inhibitors such as 4- [4- (1, 3-Benzodioxol- 5-yl) -5- (2-pyridinyl) -1 H-imidazol-2-yl] benzamide (SB-431542), in obtaining CMMs it is applied to PSC-CMMs of animal origin, including those of human origin, hPSC-CMMs
  • Example 1 Generation of hPSC-CMMs by inhibiting the SMAD2 / 3 signaling pathway
  • HPSCs cell lines were maintained in culture, in a pluripotent state, in a cell-free medium as previously described (Montes R et al Cell Res 2009; 19: 698-709).
  • hPSCs were grown in T25 culture bottles covered with Matrigel® (Becton Dickinson, San Jose, CA) in medium conditioned by foreskin fibroblasts (HFF-CM) or stromal cells (CMM-CM) supplemented with 8 ng / mL of basic fibroblast growth factor, bFGF (Miltenyi, Germany).
  • the culture medium was changed daily and the cells are passed weekly by dissociation with 200 U / mL of collagenase IV (Invitrogen, Edinburgh, Scotland).
  • TGF- ⁇ Rost-Cs, these were treated daily with: i) 10ng of TGF- ⁇ (R&D Systems, UK) to analyze the effect of activation of the SMAD 2 signaling pathway / 3 mediated by TGF- ⁇ or, ii) 10 ⁇ of 4- [4- (1, 3-Benzodioxol-5-yl) -5- (2-pyridinyl) -1 H- imidazol-2-yl] benzamide (Sigma -Aldrich, St Louise, MO), a potent and selective chemical inhibitor of the ALK4, ALK5 and ALK7 receptors that induces blockade of cell signaling via SMAD 2/3-TGF-p or, iii) DMSO as a vehicle (negative control ) for 28 days.
  • these cell populations are defined by combining various properties that characterize them, such as: a defined morphology, a phenotype determined by multiple membrane markers and a marked ability to differentiate into the mesenchymal line using means of specific cultures (Dominici M, et al The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006; 8: 315-317). Therefore, the characterization of the hPSC-CMMs obtained by the procedure described in the present invention was performed based on the following criteria:
  • CMMs are characterized by having the ability to differentiate, by means of cultures in specific media, towards cell types such as adipocytes, osteocytes and chondrocytes.
  • the differentiated cultures are analyzed by histological techniques, staining with specific dyes, such as the "Alizarin Red” for the Osteocytes, the “Oil Red O” for the adipocytes and the “Alcian blue” for the chondrocytes.
  • specific dyes such as the "Alizarin Red” for the Osteocytes, the “Oil Red O” for the adipocytes and the “Alcian blue” for the chondrocytes.
  • the specific culture media for each type of differentiation are:
  • Osteogenic differentiation Osteogenic MSCs Differentiation Bullet Kit culture medium (Lonza, Switzerland), for two weeks.
  • Adipogenic differentiation Culture medium Adipogenic MSCs Differentiation Bullet Kit (Lonza, Switzerland), for two weeks.
  • Phenotypic characterization by flow cytometry of the cultures of hPSC-CMMs was performed, by trypsinization for 5 min (0.5% trypsin and 0.2% EDTA) of the cells present in the cultures. They were subsequently washed with saline buffer (centrifuging at 600 g, 5 minutes, room temperature) and resuspended in 100 uL of saline buffer. In different tubes, the same cell concentration was incubated with 10 uL of monoclonal antibodies: CD34, CD19, CD14, HLA-DR, CD73, CD90, CD105, CD166 (BD Biosciences, United States) labeled with FITC or PE fluorochromes.
  • the cells were incubated with immunoglobulins of the same isotype bound to the same fluorochromes. After 45 minutes of incubation at 4 ° C in darkness the cells were washed and resuspended in 200 uL of saline buffer. The analysis of cell populations was performed on a flow cytometer.
  • the cells were washed in PBS and labeled with 7-amino- actinomycin D (7AAD) during 15 minutes at room temperature. Live cells are identified as negative for 7AAD.
  • 7AAD 7-amino- actinomycin D
  • the co-expression of CD90 and CD73 was analyzed using the FACSCanto II flow clitometer equipped with the FACS Diva analysis program (Becton Dickinson).
  • TGFpi did not affect the homeostasis of the cultures or the appearance of cells with CMMs phenotype, since the culture medium is already rich in TGFpi (Montes ef to 2009 Cell Res; 19: 698-709) .
  • the differentiation of hPSCs to CMM cells by inhibiting the SMAD2 / 3 signaling pathway, occurs in parallel with the loss of markers associated with pluripotency, such as Oct3 / 4 ( Figure 1B ) and Tra-1-60 ( Figure 1C).
  • cultures of hPSC treated with TGFpi or DMSO show an increase in the number of cells that have the markers associated with pluripotentiality mentioned.
  • Figure 2A shows a representative cytometric analysis of the co-expression of the CD73 and CD90 markers, in the absence of the CD34 marker, in cultures of hPSCs treated for 28 days with 4- [4- (1, 3-Benzodioxol-5- il) -5- (2-pyridinyl) -1 H-imidazol-2-yl] benzamide (10 ng / mL) or with TGF- ⁇ (10 ⁇ ) or with DMSO (control).
  • treatment with 4- [4- (1,3-Benzodioxol-5-yl) -5- (2-pyridinyl) -1 H-imidazol-2-yl] benzamide increases the number of cells that they have a CMM phenotype, expressing the CD73 + and CD90 + markers.
  • treatment with TGF- ⁇ did not increase the expression of said markers in cell cultures, thus keeping the cells in an undifferentiated state.
  • CMMs presented for use in therapy were that they eventually transformed into tumor cells, due to the presence in undifferentiated cultures of CMMs.
  • the present invention demonstrates that hPSC is treated by treatment with 4- [4- (1,3-Benzodioxol-5-yl) -5- (2-pyridinyl) -1 H-imidazol-2-yl] benzamide.
  • -CMMs obtained do not present plutipotentiality markers, suggesting that all hPCS-CMM cells present in the cultures are differentiated to mesenchymal lineage, thus avoiding their possible transformation into tumor cells.
  • the membranes were blocked with 5% bovine albumin serum (BSA) in phosphate buffer and subsequently incubated with the following antibodies: anti-phospho-SMAD2 / 3 rabbit, anti-phospho rabbit -SMAD1 / 5/8 or anti-rabbit Total SMAD2 / 3 and rabbit anti-SMAD1 / 5/8 total (Cell Signaling Technologies, 1: 10,000). All secondary antibodies were conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and protein expression was detected using chemiluminescence (ECL; Pierce). The chemiluminescent signal was detected using an image detection station (Alpha-lnnotech Corp).
  • HRP horseradish peroxidase
  • ECL chemiluminescence
  • ECL chemiluminescence
  • the chemiluminescent signal was detected using an image detection station (Alpha-lnnotech Corp).
  • Example 2 Morphological, phenotypic and functional characterization of hPSC-CMMs.
  • hPSC-CMMs with phenotype CD73 + CD90 + CD34-, obtained by inhibiting the SMAD2 / 3 signaling pathway as described in the present invention, are CMMs with full potential.
  • cell cultures of hPSCs in differentiation were incubated with anti-CD90 and anti-CD73 antibodies conjugated to FITC or PE respectively.
  • the cell population that presented double positivity (CD90 + CD73 +) was separated with the FACSAria separator (Becton Dickinson) using the Automatic Cellular Deposition Unit (ACDU). Between 2-3x10 5 of isolated cells were cultured in fibronectin-coated culture plates to facilitate adhesion. After 24 hours, the non-adherent cells were removed and new DMEM culture medium with 10% serum, 1% Glutamax and 1% Penicillin / Streptomycin was added and allowed to grow to almost 100% confluence.
  • FACSAria separator Becton Dickinson
  • ACDU Automatic Cellular Deposition Unit
  • hPCS-CMMs cells with a CD73 + CD90 + phenotype had a morphological appearance, a fibroblastoid appearance and a typical CMMs phenotype analyzed by flow cytometry.
  • hPSC-CMMs were trypsinized, washed in PBS and suspended in PBS + 1% BSA. A total of 2x10 5 cells were incubated 30 minutes in the dark with the following antibodies directly conjugated with FITC or PE: CD73, CD90, CD105, CD44, CD166, CD106, CD45, CD34, CD14, CD19, HLA-DR (Becton Dickinson ) and SSEA-4 (Chemicon).
  • hPSC-CMMs were grown at a density of 1x10 4 cells / cm 2 in Advance-DMEM with 10% serum, 1% Glutamax and 1% Penicillin / Streptomycin and were allowed to grow until confluence.
  • the culture medium was replaced by means of culture inducing specific differentiation to adipogenesis, osteogenesis and chondrogenesis.
  • adipogenic differentiation cultures of hPSC-CMMs were grown in the presence of the Adipogenic MSCs Differentiation Bullet Kit medium (Lonza, Basel, Switzerland) for 2 weeks.
  • osteogenic differentiation For osteogenic differentiation, they were grown in the presence of Osteogenic MSCs Differentiation Bullet Kit (Lonza, Basel, Switzerland) for 2 weeks as well.
  • Osteogenic MSCs Differentiation Bullet Kit Lico, Basel, Switzerland
  • Chondrogenic MSCs Differentiation Bullet Kit Lico, Basel, Switzerland
  • Example 3 Immunotolerant and anti-inflammatory capacity, in vitro and in vivo, of hPSC-CMMs.
  • the therapeutic potential of CMMs in regenerative medicine is, in part due to their immunomodulatory properties, which makes CMM attractive candidates for the treatment of immune diseases. Therefore, the ability of hPSC-CMMs to inactivate T cell responses and inhibit the inflammatory response is shown in the present invention.
  • the possible potential immunomodulator delash PS C-CMM was compared with the immunomodulatory potential of CMMs derived from umbilical cord (CB-CMM) and with CMMs derived from adipose tissue (Ad-CMM), which has been previously reported as a potent cellular immunosuppressant (Garc ⁇ a-Castro J et al. J. Cell Mol Med.
  • Ad-CMM and CB-CMM have been purchased from InbioBank (Inbiomed, San Sebastián, Spain). Ad-CMM and CB-CMM were grown in DMEM with 1% FBS, 2mM L-Glutamine and 1% penicillin / streptomycin under conditions of 95% humidity, 5% CO2 at 37 ° C. For the analysis of the immunotolerant and anti-inflammatory capacity, co-cultures of hPSC-CMMs, AD-CMMs and CB-CMMs were performed together with mixed cultures of primary lymphocytes (MLCs).
  • MLCs primary lymphocytes
  • MLCs were carried out in 96-well culture plates in the presence of 10 5 peripheral blood mononuclear response cells (PBMC) from a donor A with another 10 5 PBMC cells from a donor B, treated with mitomycin C (to induce stop of its cellular cycle in phase S), in a volume of 200uL of complete medium in the presence or absence of different concentrations of the aforementioned CMMs (hPSC-CMMs, AD-CMMs or CB-CMMs).
  • PBMCs peripheral blood mononuclear response cells
  • hPSC-CMMs, AD-CMMs or CB-CMMs CMMs
  • the cultures were labeled with 5 ⁇ of thymidine tritiated per well during the last 12 hours of the culture.
  • the cells were collected in membranes and proliferation was determined by measuring the incorporation of tritiated thymidine into a scintillation counter.
  • the concentration in the supernatants of the cytokines IL-2, IL-4, TNF- ⁇ and I FN- ⁇ was determined by ELISA.
  • the responding PBMCs were labeled with 2.5 ⁇ of carboxy-fluorescein-diacetate-succinimidyl ester (CFSE, Molecular Probes) before establishing co-cultures.
  • CFSE carboxy-fluorescein-diacetate-succinimidyl ester
  • cells were labeled with an anti-CD4-PerCP antibody, they were fixed with 1% paraformaldehyde and proliferating cells were determined by diluting CFSE in the CD4 + population in a FACSCalibur cytometer (Becton Dickinson) .
  • the number of cells in cycle was calculated as % of CFSE cells "/
  • hPSC-CMM significantly inhibited the production of Th1 cytokines such as IL-2, ⁇ -IFN and TFN-a in MLCs analyzed by ELISA in the culture supernatant ( Figure 7A).
  • Th1 cytokines such as IL-2, ⁇ -IFN and TFN-a
  • IL-4 a Th2 cytokine
  • hPSC-CMM The effects induced by hPSC-CMM are not a consequence of cell death since hPSC-CMM did not affect cell death / cell survival of PBMCs in MLCs.
  • the Immunosuppressive effects of hPSC-CMM on T cells are very similar to those observed in CB-CMM, but slightly less pronounced than those observed in Ad-CMM.
  • hPSC-CMM fibroblast-like synoviocytes
  • cytokines IL-6 and TNF- ⁇
  • concentration of cytokines was determined by ELISA and by means of the EnzChek gelatinase / collagenase kit (Molecular Probes) the collagenase activity (degradation of the extracellular matrix) in the supernatants of the crops.
  • Th1 and Th17 cells promote an infiltration and exaggerated activation of macrophages and neutrophils, leading to a severe and prolonged inflammation of the intestinal mucosa, which is characterized by uncontrolled production of inflammatory cytokines and chemokines (Bouma and Strober, 2003).
  • Inflammatory mediators such as cytokines and free radicals, produced by infiltrating cells and resident macrophages, play a critical role in the destruction of colon tissues in these pathologies.
  • mice treated with TNBS developed a serious disease characterized by bloody diarrhea, rectal prolapse, pancolitis accompanied by extensive wear syndrome (Figure 8B) and sustained and profound weight loss (Figure 8A), which It resulted in a 60% mortality rate (Figure 8C).
  • the macroscopic examination showed striking colonic hyperemia, inflammation and necrosis.
  • mice treated with hPSC-CMMs or those treated with CB-CMMs or Ad-CMMs show an increase in survival rate (Figure 8C), in rapid recovery of lost weight (Figure 8A), in improvement of cachexia, and in the recovery of a healthy appearance, and only showed slight signs of inflammation in the colon, similar to those found in control mice treated with 50% ethanol (Figure 8B).

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Abstract

Procedimiento de obtención de células madre mesenquimales para uso biomédico. La presente invención describe un procedimiento de obtención de CMMs a partir de cultivos de PSC, mediante la inhibición de la via de señalización SMAD2/3, preferentemente con el inhibidor químico 4-[4-(1,3- Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida. Las PSC-CMMs descritas en la presente invención, son capaces de diferenciarse a células de la línea osteogénica, condrogénica y adipogénica, además de mostrar potentes efectos inmunosupresores y anti-inflamatorios, tanto in vitro como in vivo en modelos de colitis. Además, en la presente invención se describen las células madre mesenquimales (PSC-CMMs) directamente obtenibles mediante el procedimiento descrito. Por otro lado, también se describe el uso de inhibidores de la vía de señalización SMAD2/3, preferentemente del inhibidor 4-[4- (1,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida, en procesos de obtención de CMM, así como el uso de las propias células PCS-CMMs en medicina regenerativa para el tratamiento de diferentes patologías.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES PARA USO
BIOMEDICO.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuadra en el ámbito de la biomedicina y el sector farmacéutico, más específicamente, se refiere a la obtención, mediante cultivo in vitro, de cél ulas mad re mesenquimales (CMM) con capacidad multipotente y que presentan propiedades inmunosupresoras y anti-inflamatorias. ANTECEDENTES
Las células madre mesenquimales (CMMs) están presentes en multitud de tejidos adultos y representan uno de los tipos de células madre con mayores expectativas en presentes y futuros ensayos clínicos para diversas patologías mediante terapia celular y génica. Esto es debido a tres propiedades esenciales, en primer l ugar a su capacidad de diferenciarse hacía diversos tejidos de origen mesodérmico tales como hueso, cartílago, grasa o incluso músculo y, en segundo lugar, a su capacidad inmunosupresora que las hace poco vulnerables al sistema inmune del receptor (García- Castro J et al J Cell Mol Med. 2008; 12:2552-2565) y en tercer lugar a su capacidad de migrar a tejidos dañados. La obtención de CMMs requiere generalmente tejido humano obtenido por métodos invasivos (grasa blanca, punción de médula ósea, etc). Además, distintos estudios han indicado que las CMMs humanas entran en senescencia tras varios pases y, aquellas que logran superar la senescencia, se transforman convirtiéndose en CMMs tumorales (Li H et al Cáncer Res 2007; 67:10889-10898; Rosland GV et al Cáncer Res 2009; 69:5331-5339; Rubio D et al Cáncer Res 2005; 69: 3035-3039). Estos inconvenientes, animan a buscar nuevas fuentes de CMMs humanas, que no requieran de métodos invasivos para su obtención y que además crezcan en cultivo indefinidamente, sin mostrar senescencia, ni transformación en células tumorales, convirtiéndose así en una fuente potencialmente ilimitada para usos experimentales y clínicos.
Las células madre pluripotentes (PSCs) ofrecen una gran promesa para las estrategias de reemplazo celular basadas en CMMs. El origen de las PSCs puede ser embrionario (ESC) aunque, recientemente se han obtenido también células madre pluripotentes a partir de la reprogramación de células somáticas procedentes de una amplia variedad de tipos celulares y tejidos, a través de la inserción de genes críticos consiguiendo su dediferenciación hacia células madre pluripotentes (Yu, J., et al. 2007 Science. 318:1917-1920. Takahashi k., et al 2007, Cell.131 :861-872. Park, I.H., et al 2008, Nature. 451 :141-146). Estas células, conocidas como células madre pluripotentes inducidas (iPS), han abierto nuevas vías para la generación de células específicas extraídas de los propios donantes, y su utilización en medicina regenerativa, evitando los rechazos inmunológicos. Las cél u las i PS se comportan de la misma manera que las células madre pluripotentes (PSCs), es decir, comparten las capacidades de autorrenovacion, proliferación ilimitada y pluripotentes, es decir son capaces de originar tejido de las tres capas germinales, representando, ambas, una fuente de enorme interés para producir distintos tipos celulares para su posible uso terapéutico.
El grupo de Barbieri y cois, ha demostrado la posibilidad de obtener CMMs a partir de hPSC de origen embrionario (hESCs). Un inconveniente de dicho estudio es que en el mismo los autores no descifran los mecanismos moleculares y celulares que inducen la diferenciación de las PSCs a CMM (Barberi T., et al 2005). Otro inconveniente mostrado en dicho trabajo es que, la obtención de CMMs a partir de hPSC, ha sido muy pequeña (< 5%) y que, la población de CMMs obtenida a partir de hPSC, posteriormente tenía que ser cultivada durante al menos 40 días en presencia de células estromales de médula ósea murinas, lo que introduce componentes xenogénicos en el cultivo, que requerían posteriormente, la separación de ambos tipos celulares mediante citometría de flujo. Los estudios de Barbieri, tampoco mostraron la capacidad inmunosupresora de las CMMs resultantes, característica clave para el uso terapéutico de las CMMs.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Breve descripción de la invención
Para solventar los inconvenientes para la obtención de CMMs a partir de PSCs, puestos de manifiesto en el estado de la técnica, la presente invención describe un procedimiento de obtención de CMMs totalmente funcionales in vitro e in vivo a partir de cultivos de PSC, mediante la inhibición de la vía de señalización SMAD2/3, una vía de transcripción que juega un papel fundamental en el mantenimiento homeostático de las células. Así, las CMMs, obtenidas a partir de PSC mediante la inhibición de su vía de señalización SMAD2/3 según se describe en la invención, son capaces de diferenciarse en células de la línea osteogénica, condrogénica y adipogénica. La caracterización morfológica, fenotípica y la diferenciación funcional realizadas, en la presente invención, de las células descritas, pone de manifiesto que son CMMs con todo su potencial de autorrenovacion, proliferación ilimitada y capacidad de originar cualquiera de los tejidos de las tres capas germinales. Por otro lado, las CMMs obtenidas en la presente invención muestran potentes efectos inmunosupresores y antiinflamatorios, tanto in vitro como in vivo, en un modelo de colitis. Una de las principales características que diferencian a las CMM de la presente invención del resto de CMMs conocidas en el estado de la técnica, con origen adipogénico, de médula ósea o de cordón umbilical, es que éstas tienen crecimiento limitado en cultivo, aproximadamente de 30 a 50 días al cabo de los cuáles, las células comienzan a mostrar signos de senescencia. Sin embargo, las CMMs de la invención presentan un crecimiento ilimitado, los cultivos se mantienen en crecimiento al menos 200 días pudiendo llegar incluso, hasta más de 300 días, sin que las células presenten signos de senescencia. A los efectos de la presente invención, el término "cultivo ilimitado" se define como cultivo de células PSC-CMMs capaz de proliferar indefinidamente en el tiempo sin perder sus características morfológicas y fenotípicas y permaneciendo indiferenciadas como CMMs, sin mostrar senescencia. También a los efectos de la presente invención, el término "indefinidamente" aplicado al crecimiento de las células PSC-CMMs de la invención, debe entenderse como un tiempo prolongado, de al menos 200 d ías, sin que aparezcan rasgos de senescencia en las células. Otra de las ventajas mostradas por las células de la presente invención es que al poder mantener los cultivos indiferenciados durante tiempo ilimitado, estos se convierten en reservónos de CMM listos y preparados para cuando sea necesaria su utilización, sin necesidad de extraer, cultivar y diferenciar CMMs, o de descongelar muestras de cordón umbilical, grasa o médula ósea para la obtención de las CMMs, y posterior diferenciación de las mismas, lo que implicaría tiempos excesivamente largos para abordar tratamientos urgentes de determinadas patologías. Además, no podemos olvidar que las CMM de la presente invención son genéticamente idénticas mientras que las CMM procedentes de tejido humano primario presentarán una gran variabilidad entre donantes lo que provoca mayores riesgos de rechazos al utilizarse en medicina regenerativa (implantes, injertos, transplantes, etc) en individuos distintos al donante de quien se ha obtenido. El tratamiento de las PSC con el inhibidor de la vía de señalización SMAD2/3, según se describe en la presente invención, hace posible la obtención de cultivos de CMMs, que a su vez pueden diferenciarse a osteocitos, adipocitos y/o condrocitos cultivados en los medios de diferenciación apropiados. Dicha diferenciación se produce en muy poco tiempo, aproximadamente una semana, tiempo muy corto que facilita el tratamiento de reemplazo ante determinadas patologías.
A los efectos de la presente invención se denominan las CMM humanas obtenidas por cultivo de células madre pluripotentes, en presencia de un inhibidor de la vía de señalización SMAD2/3, preferentemente e l 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida, también conocido como SB-431542, PSC-CMMs.
E l 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida (SB-431542) es un potente y selectivo inhibidor de los receptores de la familia del TGF-β: ALK4, ALK5 y ALK7, lo que induce el bloqueo de la señalización celular vía SMAD 2/3-TGF-p. Las PSC-CMMs descritas en la presente invención, son capaces de diferenciarse a células de la línea osteogénica, condrogénica y adipogénica, además de mostrar potentes efectos inmunosupresores y anti-inflamatorios, tanto in vitro como in vivo, en un modelo murino de inflamación intestinal (colitis). A los efectos de la presente invención se define como diferenciación funcional de las PSC-CMMs como aquellas que una vez cultivadas en medios de cultivo que induzcan su diferenciación en líneas celulares específicas, se caracterizan como condrocitos, osteocitos o adipocitos, por tinción específicas.
Además, en la presente invención se describen las PSC-CMMs directamente obtenidas mediante el procedimiento descrito. Por otro lado, también se describe el uso del inhibidor 4-[4-(1 ,3- Benzodioxol-5-il)-5-(2-pirid¡n¡l)-1 H-imidazol-2-il] benzamida (SB-431542) para la obtención de las PSC- CMMs descritas, así como el uso de las propias células PCS-CMMs en terapia de medicina regenerativa para el tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como: diabetes, esclerosis múltiple, enfermedad de Chron, artritis reumatoide, además de regeneraciones óseas y de cartílago, fístulas y enfermedad- injerto-contra-huésped (EICH) por transplante de médula ósea.
También en la presente invención se describen los condrocitos, osteocitos o adipocitos obtenidos mediante el procedimiento descrito en la invención, así como su uso en terapia de medicina regenerativa para el tratamiento de las enfermedades citadas anteriormente, entre otras.
Descripción de las figuras
Figura 1 : Cinética de la diferenciación de hPSCs a CMMs mediante el tratamiento con el inhibidor de la ruta SMAD 2/3, 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida (SB- 431542). (A) Diferenciación de líneas celulares hPSCs a CMMs mediante el tratamiento con 10 μΜ de 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida, o 1 0 ng de TGF-βΙ o vehículo, durante 28 días. En el eje X se representan los días que se mantuvieron en cultivo las hPSC en presencia de cada uno de los tratamientos mencionados. En el eje Y se representa el porcentaje de células CMMs, representadas por aquellas que presentan fenotipo CD73+ CD90+ CD34- analizado mediante citometría de flujo. Las figuras 1B y 1C muestran la pérdida de la expresión de marcadores asociados a la pluripotencialidad celular, Oct-4 (B) y Tra-1-60 (C), en los mismos cultivos celulares de hPSCs en presencia de los diferentes tratamientos mencionados anteriormente. En los ejes X se representan los días que se mantuvieron en cultivo las hPSC en presencia de los tratamientos mencionados. En los ejes Y se representan el porcentaje de células con fenotipo Oct-4+ y Tra-1-60+ respectivamente, analizado mediante citometría de flujo. La línea continua represénta los cultivos tratados con 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida. La línea punteada representa los cultivos tratados con TGF-βΙ . La línea discontinua representa los cultivos no tratados (DMSO). Los datos se muestran como media±desviación estándar de los distintos experimentos para cada cultivo celular.
Figura 2. Análisis representativo mediante citometría de flujo de cultivos de hPSC-CMMs tratados con 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida (SB-431542) o TGF-β (A) Análisis citométrico de la presencia de los marcadores de membrana CD73 y CD90 (panel superior), asociados a fenotipo típico de CMM, así como los marcadores asociados a la pluripotencialidad celular Oct-3/4 (panel central) y Tra-1-60 (panel inferior) en cultivos de hPSC tratados con 4-[4-(1 ,3- Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida o TGF-βΙ o DMSO (Control) durante 28 días. En los paneles de más a la derecha se muestran los controles negativos de las células que se incubaron en presencia de inmunoglobulinas del mismo isotipo unidas a los mismos fluorocromos que los anticuerpos utilizados. Los anticuerpos utilizados están marcados con fluoresceína (FITC) (CD90 y Oct3/4) o con Ficoeritrina, (PE) (CD73 y Tra-1-60). 7AAD: 7-amino-actinomicina D, fluorocromo que tiñe células muertas. SSC: dispersión de la luz ortogonal en el citómetro de flujo. (B) Fotografías tomadas mediante microscopio de contraste de fase, de cultivos celulares de hPSCs cultivados durante 28 días en presencia de (DMSO) (panel izquierdo), de 10 μΜ de 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H- imidazol-2-il] benzamida (panel central) o de 10 ng de TGF-βΙ (panel derecho). Las fotografías muestran un aumento de 10x.
Figura 3. Ensayos de Western Blot de extractos celulares de hPSC-CMMs cultivadas en presencia de 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida (SB-431542) o TGF-β (A) La figura muestra la defosforilación de SMAD2/3 (p-SMAD2/3) en células hPSC tratadas con 10 μΜ de 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida (+) durante 60 minutos. En cambio, dicho tratamiento no modificó la fosforilación de SMAD1/5/8 (p-SMAD1/5/8). Como control de carga se utilizaron los anticuerpos totales de SMAD2/3 y de SMAD1/5/8 respectivamente. El símbolo - se refiere a las células control tratadas con DMSO. (B) La figura muestra que el tratamiento de cultivos de hPSC con 10 ng de TGF-βΙ (+) durante 60 minutos, no modificó el estado de fosforilación de SMAD2/3 (p- SMAD2/3) ni de SMAD1/5/8 (p-SMAD1/5/8). Como control de carga se utilizaron los anticuerpos totales de SMAD2/3 y de SMAD1/5/8 respectivamente. El símbolo - se refiere a las células control tratadas con DMSO.
Figura 4: Caracterización fenotípica de las hPSC-CMMs. (A) Aislamiento mediante citometría de flujo dé las poblaciones celulares de hPSC-CMMs que presentan los fenotipos CD73+CD90+ y CD73- CD90+, después de 28 días de tratamiento con 10 μΜ de 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H- imidazol-2-il] benzamida (SB-431542). La pureza de la población CD73+CD90+ fue consistentemente del 85% y la de la población CD73-CD90+ del 90%. Para el mareaje y posterior caracterización de los extractos celulares mediante citometría de flujo, se utilizaron: un anticuerpo anti-CD73 marcado con PE y un anticuerpo anti-CD90 marcados con FITC. (B) Gráficas obtenidas mediante citometría de flujo mostrando el perfil fenotípico de cultivos de hPSC-CMMs. Se analizó la expresión de diferentes marcadores específicos de las CMMs. Las hPSC-CMMs tras 28 días de tratamiento con 4-[4-(1 ,3- Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida mostraron la presencia de marcadores específicos de CM Ms: CD73, CD90, CD 1 05, CD44, CD 166 y la ausencia de marcadores de hematopoyesis o endotelio que no están presentes en CMM: CD45, CD34, CD14, CD19, HLA-DR y SSEA-4.
Figura 5. Diferenciación funcional de las hPSC-CMMs. (A) La gráfica muestra el crecimiento de diferentes cultivos celulares de hPSC-CMMs (línea continua), de CMM derivadas a partir de cordón umbilical (línea de puntos) o de CMM derivadas a partir de médula ósea (línea discontinua) a lo largo del tiempo. En el eje Y se muestra el crecimiento expresado como duplicaciones acumulativas de la población (eje Y) y en el eje X se representa el tiempo expresado en días. (B) Fotografías obtenidas mediante microscopio óptico que muestran la diferenciación de las hPSC-CMMs cultivadas en presencia de medios de cultivos específicos que favorecen la diferenciación de dichas células hacía la línea osteogénicas (panel inferior de la izquierda), adipogénica (paneles inferior central) y condrogénica (panel inferior de la derecha). Los cultivos celulares se tiñeron con colorantes específicos para cada tipo de diferenciación celular: Alizarin Red que tiñe osteocitos (fotografías de la izquierda), Oil Red que tiñe adipocitos (fotografías centrales) y Alcian Blue que tiñe condrocitos (fotografías de la derecha). Las fotografías de la parte superior se corresponden con los controles negativos cultivados en presencia de medio de cultivo que no induce diferenciación. Las fotografías muestran un aumento de 20x.
Figura 6: Las hPSCs-CMMs muestran potentes efectos inmunosupresores in vitro. (A) En el panel superior se muestra el número total de células (Eje Y), determinado mediante citometría de flujo, presentes en cultivos mixtos de linfocitos (MLC) después de 4 días en presencia de hPSC-CMMs o CB- CMM o CMM derivadas de tejido adiposo (Ad-CMM). En el panel inferior se muestra el número de linfocitos CD4+ en proliferación (medido como el % de células CFSEmid/l0W). Como control basal se utilizaron cultivos de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de uno de los donantes sanos (C). Los datos se muestran como media±desviación estándar de los distintos experimentos para cada cultivo celular. *p<0.001 vs MLC sin CMMs (-). (B) Efecto dosis-dependiente de la participación de los cultivos de hPSC-CMMs en la proliferación de linfocitos. hPSC-CMMs, CB-CMMs y Ad-CMMs se añadieron a MLC a diferentes ratios (desde 1 :2 a 1 :100). La proliferación se determinó midiendo la incorporación de timidina tritiada tras 96 horas de cultivo. Los cuadrados negros representan la proliferación basal para cada tipo de CMMs. PBMCs de un donante sano se utilizaron control de la proliferación basal (columna gris). *p<0.001 vs MLC sin CMMs. En el Eje X se muestran los diferentes ratios de concentraciones utilizados y en el Eje Y se muestra la proliferación linfocítica expresada como cuentas por millón por 103 (cpmxI O3). Los datos se muestran como media±desviación estándar de los distintos experimentos para cada cultivo celular. (C) La figura muestra que los cultivos de hPSC-CMMs no expresan las moléculas coestimuladoras CD40 ni CD80, implicadas en la adhesión de las células T con las células presentadoras de antígeno, analizado mediante citometría de flujo. Figura 7: Las hPSC-CMMs muestran potentes efectos anti-inflamatorios in vitro. (A) Los cultivos de hPSC-CMM disminuyen la producción de citoquinas por parte de los linfocitos activados presentes en los MLC. hPSC-CMMs o CB-CMMs o Ad-CMMs fueron añadidos a MLC. La producción de citoquinas inflamatorias: interleuquina 2 (IL-2), interferón-γ (INF-γ), factor de necrosis tumoral-α (TNF-a) así como la citoquina no inflamatoria interleuquina 4 (IL-4) fue analizada mediante ELISA en el sobrenadante celular tras 72 horas de cultivo. En el eje Y se muestra la concentración de las citoquinas mencionadas expresada como pg/ml. Los datos se muestran como media±desviación estándar de los distintos experimentos para cada cultivo celular. *p<0.001 vs MLC sin CMMs. (B) Las hPSC-CMMs inhiben la respuesta inflamatoria de cultivos de sinoviocitos (FLS) extraídos de pacientes con artritis reumatoide activa (AR). FLS se incubaron en condiciones básales sin estimulación (barras negras) o estimulados (barras blancas) con lipopolisacárido (LPS 1 ug/mL) para la determinación de citoquinas (IL-6 y TNF-α) o con TNF-a (20ng/mL) para analizar la actividad colagenasa en ausencia (-) o presencia de hPSC- CMMs, CB-CMMs o Ad-CMMs. La actividad colagenasa se determinó en el sobrenadante de los cultivos mediante el Kit EnzChek gelatinasa/colagenasa (Molecular Probes) y la concentración de las citoquinas inflamatorias se en el sobrenadante celular mediante ELISA. En el eje Y se representa la concentración de las citoquinas IL-6 y TNF-α expresada como ng/ml y la actividad colagenasa expresada como unidades/ml/106 células. *p<0.001 vs LPS (-). Los datos se muestran como media±desviación estándar de los distintos experimentos para cada cultivo celular.
Figura 8. El tratamiento con hPSC-CMMs protege frente a un modelo experimental inducido de colitis en ratones. La colitis se indujo en los animales mediante una administración intrarectal de ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (TNBS). Transcurridas 12 horas, a los animales (n=10/grupo) se les administró intraperitonealmente una concentración de 106 hPSC-CMMs o CB-CMMs o Ad-CMM. Se utilizaron dos grupos control, uno de ellos al que no se le administró nada y al otro se le administró como vehículo etanol al 50%. (A) La gráfica muestra la evolución del peso de los animales a lo largo del tiempo. En el eje X se representa el tiempo de análisis expresado en días y en el eje Y el peso de los animales respecto a día 0, expresados como porcentaje, del peso de los animales a lo largo del estudio. La línea continua representa el grupo de ratones control que no han sido tratados. Los cuadrados blancos representan el grupo de ratones que ha sido tratado con etanol al 50% (vehículo). Los círculos negros representan el grupo de animales que ha sido tratado únicamente con TNBS. Los triángulos negros representan el grupo de animales tratado con TN BS+Ad-CMMs. Los triángulos blancos representan el grupo de animales tratado con TNBS+CB-CMMs. Los círculos blancos representan el grupo de animales tratado con TNBS+hPSC-CMMs. (B) En el panel superior se muestra el grado de colitis (eje Y) que presentaron los animales. En el panel inferior se muestra el análisis macroscópico (en una escala graduada de 0-10) (eje Y) realizado en muestras de colon de los animales. Los datos se muestran como media±desv¡ación estándar de los distintos experimentos para cada cultivo celular. (C) La gráfica muestra el porcentaje de animales vivos, expresado como porcentaje de supervivencia (eje Y) a lo largo del tiempo de ensayo (10 días) (eje X). Los cuadrados blancos representan el grupo de ratones que ha sido tratado con etanol al 50%. Los círculos negros representan el grupo de animales que ha sido tratado únicamente con TNBS. Los triángulos negros representan el grupo de animales tratado con TNBS+Ad-CMMs. Los triángulos blancos representan el grupo de animales tratado con TNBS+CB-CMMs. Los círculos blancos representan el grupo de animales tratado con TNBS+hPSC- CMMs. *p<0.001 vs ratones tratados con TNBS. Descripción detallada de la invención
En la presente invención se describe u n procedimiento de obtención de cél ulas madre mesenquimales (PSC-CMMs) que comprende:
Un primer paso que consiste en cultivar células PSC en presencia de un inhibidor de la vía de señalización SMAD2/3 para generar las PSC-CMMs, de la presente invención.
En un segundo paso, se procede al aislamiento de las PSC-CMMs obtenidas en el paso anterior.
Una vez obtenidas las PSC-CMMs de la presente invención se muestra su eficacia in vivo, en un modelo murino de colitis.
En una realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza porque el inhibidor d e l a vía de señal ización SMAD2/3 es el 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida, también conocido como SB-431542.
En otra realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza porque el 4-[4- (1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida se utiliza a una concentración de entre 5μΜ a 50μΜ, preferentemente 10μΜ y d u rante u n tiem po q ue varía de entre 7 a 40 días, preferentemente 28 días.
En otra realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza porque las PSC son de origen humano y, por ende, las PSC-CMMs obtenidas también tienen dicho origen.
En otra realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza porque la caracterización de las PSC-CMMs se realiza preferentemente mediante caracterización fenotípica y morfológica. En el contexto de la presente invención, se entiende por caracterización morfológica, la identificación positiva de células con fenotipo fibroblastoide, alargadas, estrechas y de gran tamaño. Por caracterización fenotípica se entiende, la identificación de células con un particular perfil de expresión de marcadores de superficie celular que para la presente invención comprende: ser células negativas para los antígenos CD34, CD19, CD14, CD106, CD45, SSEA-4, HLA-DR, Oct-3/4 y Tra-1-60 y positivas para CD73, CD90, CD105, CD44 y CD166.
En otra realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza porque la caracterización morfológica se realiza preferentemente mediante microscopía de contraste de fase.
En otra realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza porque opcionalmente, comprende además un paso c) de diferenciación funcional, que consiste en primer lugar, en cultivar las PSC-CMMs obtenidas, en medios de cultivo específicos para inducir su diferenciación en una u otra línea celular y en segundo lugar, en teñir dichas PSC-CMMs con colorantes específicos que evidencien dicha diferenciación en una línea celular determinada.
En otra realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza porque los medios de cultivo utilizados, inducen la diferenciación de las CMMs en células de las líneas osteogénica, condrogénica y adipogénica.
En otra realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza porque las células PCS-CMMs obtenidas pueden mantenerse ilimitadamente en cultivo. En la presente invención se define el término cultivo de crecimiento ilimitado de PSC-CMMs como aquellos cultivos de PSC-CMMs que se mantienen indiferenciados por un largo tiempo, al menos 200 días. Una vez que las PSC han sido diferenciadas a PSC-CMMs mediante el procedimiento descrito anteriormente, pueden mantenerse en cultivo listas para ser utilizadas, entre otros, en los tratamientos que se mencionan en la presente memoria, en un estado de crecimiento ilimitado, en medio de cultivo DMEM con 10% de suero bovino fetal, 1% de glutamina y 1% de penicilina/estreptomicina, en condiciones de 37°C y 5% de humedad, o también pueden congelarse mediante procedimientos bioquímicos de rutina, como por ejemplo, utilizando el disolvente dimetil sulfóxido (DMSO) en nitrógeno líquido a una temperatura de al menos - 200°C, para así mantener un reservorio continuo de PSC-CMMs. Una vez descongeladas dichas Células PSC-CMMs, conservan sus características morfológicas, fenotípicas y funcionales inalteradas. Al ser descongeladas, pueden utilizarse en tratamientos de medicina regenerativa como los que se mencionan de forma no exhaustiva en la presente memoria.
Otro objeto de la presente invención se refiere a las CMM, PSC-CMMs, obtenibles mediante el procedimiento descrito anteriormente. Dichas células se caracterizan por cultivarse indefinidamente sin mostrar signos de senescencia, además de, como se ha mencionada antes, poder congelarlas en nitrógeno líquido, sin que pierdan ninguna de sus características y propiedades, y tenerlas como reservorio de PSC-CMMs. En la presente invención se define el término senescencia como los cambios graduales e intrínsecos de las células u organismos vivos que conducen a un riesgo creciente de vulnerabilidad, pérdida de vigor, enfermedad y muerte. En una realización preferida, las células PSC-CMMs se caracterizan porque, preferentemente, expresan los marcadores: CD73, CD90, CD105, CD44 y CD166 y no expresan los marcadores: CD106, CD45, CD34, CD14, CD19, HLADR, SS EA-4, Oct3/4 y Tra-1-60, y porque además, muestran propiedades inmunosupresoras y anti-inflamatorias in vitro e in vivo.
En otra realización preferida, las células PSC-CMMs se caracterizan porque in vitro comprenden al menos una propiedad inmunosupresora o anti-inflamatoria a elegir de entre: disminución del número de linfocitos, disminución de la proliferación de linfocitos, disminución de la concentración de las citoquinas inflamatorias, IL-2, IFN-γ y TNF-α o disminución de la actividad colagenasa.
En otra real ización preferida, las cél ulas PSC-CMMs se caracterizan por no mostrar senescencia al cabo de, al menos, 200 días de cultivo.
En otra realización preferida, las células PSC-CMMs se caracterizan porque son de origen humano.
Otro objeto de la presente invención se refiere al uso de un inhibidor de la vía de señalización SMAD2/3 en procedimientos de obtención de CMM.
En una realización preferida, el inhibidor de la via de señalización SAMD2/3 utilizado para la obtención de CMM, preferentemente es el 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida.
Otro objeto de la presente invención se refiere a los condrocitos, osteocitos o adipocitos obtenibles mediante el procedimiento descrito en la presente invención, así como su uso en el tratamiento de enfermedades del grupo: enfermedades autoinmunes, diabetes, esclerosis múltiple, enfermedad de Chron, artritis, enfermedades óseas, enfermedades de cartílago, fístulas, rechazo inmune a injerto y enfermedad-injerto-contra-huésped por transplante de médula ósea.
Otro objeto de la presente invención se refiere al uso de las PSC-CMMs descritas en la presente invención para el tratamiento de enfermedades del grupo: enfermedades autoinmunes, diabetes, esclerosis múltiple, enfermedad de Chron, artritis, enfermedades óseas, enfermedades de cartílago, fístulas, rechazo inmune a injerto y enfermedad-injerto-contra-huésped por transplante de médula ósea.
El procedimiento de la invención parte de PSCs de origen animal, incluyendo PSCs de origen humano (hPSCs). Lo mismo ocurre con las células madre mesenquimales obtenibles, son células de origen animal, incluyendo células de origen humano, hPSC-CMMs. De forma análoga, los usos de las células obtenibles con el procedimiento de la invención, se basan en PSC-CMMs de origen animal, incluyendo las cél ulas de origen hu mano, hPSC-CMMs. Por últi mo, sigu iendo con el mismo razonamiento, el uso de inhibidores de la vía de señalización SMAD2/3, como el 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol- 5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida (SB-431542), en la obtención de CMMs se aplica a PSC- CMMs de origen animal, incluyendo las de origen humano, hPSC-CMMs
Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar la invención y no pretenden limitar el alcance de la misma.
Ejemplo 1. Generación de hPSC-CMMs mediante la inhibición de la vía de señalización SMAD2/3
Líneas celulares de hPSCs se mantuvieron en cultivo, en estado pluripotente, en un medio libre de soporte celular como se ha descrito previamente (Montes R et al Cell Res 2009; 19: 698-709). Para la realización de los ensayos se obtuvo la aprobación de los Comités Regionales y Nacionales de Investigación con hPSCs. Brevemente, las hPSCs se cultivaron en frascos de cultivo T25 cubiertos con Matrigel® (Becton Dickinson, San José, CA) en medio condicionado por fibroblastos de prepucio (HFF- CM) o células estromales (CMM-CM) suplementado con 8 ng/mL de factor de crecimiento fibroblástico básico, bFGF (Miltenyi, Alemania). El medio de cultivo se cambió a diario y las células se pasan semanalmente mediante disociación con 200 U/mL de colagenasa IV (Invitrogen, Edimburgo, Escocia). Para la obtención de cultivos diferenciados de CMMs a partir de los cultivos de hPSCs, éstos se trataron a diario con: i) 10ng de TGF-βΙ (R&D Systems, UK) para analizar el efecto de la activación de la vía de señalización SMAD 2/3 mediada por TGF-β o, ii) 10μΜ de 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H- imidazol-2-il] benzamida (Sigma-Aldrich, St Louise, MO), un inhibidor químico potente y selectivo de los receptores ALK4, ALK5 y ALK7 que induce el bloqueo de la señalización celular vía SMAD 2/3-TGF-p o, iii) DMSO como vehículo (control negativo) durante 28 días.
Ante la ausencia de un marcador específico de las CMMs, estas poblaciones celulares se definen combinando diversas propiedades que les caracterizan, como son: una morfología definida, un fenotipo determinado por múltiples marcadores de membrana y una marcada capacidad de diferenciación hacia línea mesenquimal utilizando medios de cultivo específicos (Dominici M, et al The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006; 8: 315-317). Por lo tanto, la caracterización de las hPSC-CMMs obtenidas mediante el procedimiento descrito en la presente invención se realizó basándose en los siguientes criterios:
- Caracterización morfológica: células con forma fibroblastoide, alargadas y estrechas, de gran tamaño.
- Caracterización fenotípica: mediante citometría de flujo con lo que se obtuvo una población celular homogénea con el siguiente perfil: células negativas para los antígenos CD34, CD19, CD14, CD106, CD45, SSEA-4 y HLA-DR y positivas para CD73, CD90, CD105, CD44 y CD166. - Caracterización funcional: las CMM se caracterizan por poseer la capacidad de diferenciarse, mediante cultivos en medios específicos, hacia tipos celulares como adipocitos, osteocitos y condrocitos. Posteriormente, los cultivos diferenciados se analizan por técnicas histológicas, tiñéndose con colorantes específicos, como son el "Alizarin Red" para los Osteocitos, el "Oil Red O" para los adipocitos y el" Alcian blue" para los condrocitos. Los medios de cultivo específicos para cada tipo de diferenciación son:
* Diferenciación osteogénica: Medio de cultivo Osteogenic MSCs Differentiation Bullet Kit (Lonza, Suiza), durante dos semanas.
* Diferenciación adipogénica: Medio de cultivo Adipogenic MSCs Differentiation Bullet Kit (Lonza, Suiza), durante dos semanas.
* Diferenciación condrogénica: Medio de cultivo Chondrogenic MSCs Differentiation Bullet Kit (Lonza, Suiza), durante dos semanas
La caracterización fenotípica mediante citometría de flujo de los cultivos de hPSC-CMMs se realizó, mediante la tripsinización durante 5 min (0,5% tripsina y 0,2% EDTA) de las células presentes en los cultivos. Posteriormente se lavaron con buffer salino (centrifugando a 600 g, 5 minutos, temperatura ambiente) y se resuspendieron en 100 uL de buffer salino. En tubos distintos, la misma concentración celular se incubó con 10 uL de anticuerpos monoclonales: CD34, CD19, CD14, HLA-DR, CD73, CD90, CD105, CD166 (BD Biosciences, Estados Unidos) marcados con los fluorocromos FITC o PE. Como control de isotipo las células se incubaron con inmunoglobulinas del mismo isotipo unidas a los mismos fluorocromos. Tras 45 minutos de incubación a 4°C en oscuridad las células se lavaron y se resuspendieron en 200 uL de buffer salino. El análisis de las poblaciones celulares se realizó en un citómetro de flujo.
Los resultados obtenidos después de todo el procedimiento muestran que tras 28 días de cultivo en condiciones básales, sin tratamiento, los cultivos indiferenciados de hPSCs presentan de forma basal alrededor de un 10% de células con un fenotipo candidato de CMM humana (CD73+CD90+CD34-). La morfología de los cultivos celulares de hPSCs se visualiza mediante microscopía óptica de contraste de fase.
La caracterización fenotípica de los cultivos indiferenciados de hPSCs, tras el tratamiento con 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida o TGF-βΙ , se realizó mediante citometría de flujo, como se ha mencionado anteriormente. Dicha caracterización se llevó a cabo semanalmente (días 4, 14, 21 y 28) para así analizar cuando se producía la aparición en los cultivos de las hPSC-CMMs, caracterizados por presentar un fenotipo CD73+CD90+CD34-. Tras el mareaje de los cultivos celulares con los anticuerpos correspondientes (CD73, CD90, CD34, Oct-3/4 y Tra-1-60) unidos a FITC o PE, las células se lavaron en PBS y se marcaron con 7-amino-actinomicina D (7AAD) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células vivas se identifican como negativas para 7AAD. Dentro de la fracción viable se anal izó la co-expresión de CD90 y CD73 usando el clitómetro de flujo FACSCanto II equipado con el programa de análisis FACS Diva (Becton Dickinson). En paralelo, se determinó la expresión de los marcadores asociados a pluripotencia Tra-1-60-FITC (Chemicon) y Oct3/4-PE (Pharmingen) y el marcador hemato-endotelial CD34 (Becton Dickinson).
Como se observa en la Figura 1A, el tratamiento de los cultivos de hPSCs indiferenciados con 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida, desencadena en tan sólo 28 días una rápida y robusta diferenciación a linaje mesenquimal (-42% de células CD73+CD90+CD34-). Por el contrario, el tratamiento con TGFpi o DMSO (usado como control), no modificó significativamente los niveles básales de células CD73+CD90+CD34- tras los 28 días de tratamiento. La adición de TGFpi a los cultivos no afectó la homeostasis de los cultivos ni a la aparición de células con fenotipo de CMMs, dado que el medio de cultivo ya es rico en TGFpi (Montes ef al 2009 Cell Res; 19: 698-709). Por otro lado, cabe destacar que la diferenciación de las células hPSCs a CMM, mediante la inhibición de la via de señalización SMAD2/3, ocurre en paralelo con la pérdida de marcadores asociados a pluripotencia, como son el Oct3/4 (Figura 1 B) y el Tra-1-60 (Figura 1C). En cambio, los cultivos de hPSC tratados con TGFpi o DMSO, presentan un incremento en el número de células que presentan los marcadores asociados a pluripotencialidad mencionados.
La Figura 2A muestra un análisis citométrico representativo de la co-expresión de los marcadores CD73 y CD90, en ausencia del marcador CD34, en cultivos de células hPSCs tratadas durante 28 días con 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida (10 ng/mL) o con TGF-βΙ (10μΜ) o con DMSO (control). Como se observa en dicha figura el tratamiento con 4-[4- (1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida incrementa el número de células que presentan fenotipo de CMMs, al expresar los marcadores CD73+ y CD90+. En cambio, el tratamiento con TGF-βΙ no incrementó la expresión de dichos marcadores en los cultivos celulares, permaneciendo así las células en estado indiferenciado. En los dos paneles inferiores de la Figura 2A se muestra que el trata m ie nto de l os cu l tivos h PS C co n 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida dejan de expresar los marcadores de pluripotencialidad Oct-3/4 y Tra-1-60, mientras que los cultivos de hPSC tratados con TGF-βΙ muestran aproximadamente el mismo porcentaje de expresión de dichos marcadores de pluripotencia que los cultivos control tratados con DMSO. El control isotípico está representado en los paneles de la columna de la derecha.
Como se ha mencionado anteriormente, uno de los problemas que presentaban las CMMs para su uso en terapia, era que con el tiempo se transformaban en células tumorales, debido a la presencia en los cultivos de CMMs indiferenciadas. En la presente invención se demuestra, que mediante el tratamiento con 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida, las hPSC-CMMs obtenidas, no presentan marcadores de plutipotencialidad, sugiriendo que todas las células hPCS- CMMs presentes en los cultivos están diferenciadas a linaje mesenquimal, evitándose así su posible transformación en células tumorales.
Para terminar de confirmar la caracterización de los cultivos de hPSC tratados con 4-[4-(1 ,3- Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida, se realizó un análisis morfológico, mediante microscopía de contraste de fase, de dichos cultivos tras 28 días de tratamiento con el inhibidor 4-[4- (1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-p¡ridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida. El análisis morfológico p uso de manifiesto el aspecto fibroblastoide diferenciado, típico de CMMs, que presentaban los cultivos de hPSCs (Figura 2B, panel del centro), mientras que los cultivos tratados con TGFpi no modificaron su morfología respecto a los cultivos control, tratados con DMSO, predominando la presencia de colonias indiferenciadas de hPSCs en el cultivo (Figura 2B, paneles de la derecha e izquierda, respectivamente).
Para confirmar la robustez y especificidad del inhibidor 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)- 1 H-imidazol-2-il] benzamida sobre la vía de señalización SMAD 2/3, pero no sobre la vía de señalización SMAD 1/5/7, se realizaron ensayos de western blot, utilizando anticuerpos que reconocer las formas fosforiladas de SMAD2/3 y de SMAD1/5/8, así como los anticuerpos que reconocen SMAD2/3 y SMAD1/5/8 totales. Para la obtención de las muestras para la realización de los ensayos de western blot, previamente, las hPSC se trataron durante 60 minutos con o sin 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2- piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida o TGF-β. Después del tratamiento y mediante la utilización del Kit de extracción nuclear con inhibidores de fosfatasas Active Motif (Sigma), se obtuvieron los extractos nucleares de los cultivos. Dichos extractos se separaron en geles de 10% de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas de Polivinilidenofluoruro (PVDF) mediante una transferencia semi-sólida durante 1 hora a 15 Voltios. Las membranas se bloquearon con 5% de suero de albúmina bovino (BSA) en tampón fosfato y posteriormente se incubaron con los siguientes anticuerpos: conejo anti-fosfo-SMAD2/3, conejo anti- fosfo -SMAD1 /5/8 o conejo anti- SMAD2/3 total y conejo anti-SMAD1/5/8 total (Cell Signalling Technologies, 1 :10.000). Todos los anticuerpos secundarios estaban conjugados con peroxidada de rábano (HRP) y la expresión de la proteína se detectó usando quimioluminiscencia (ECL; Pierce). La señal quimioluminiscente se detectó usando una estación de detección de imagen (Alpha-lnnotech Corp).
Como se observa en la Figura 3A, el tratamiento de cultivos celulares hPSCs durante 60 minutos con 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida, produce una completa defosforilación (inhibición) de SMAD 2/3, pero no de SMAD 1/5/8, confirmando el potente y específico efecto del inhibidor 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida en el bloqueo de la señalización de a través de SMAD2/3. Por otro lado, el tratamiento de los cultivos celulares de hPSC con TGF-βΙ no modificó el estado de fosforilación ni de SMAD2/3 ni de SMAD1/5/8 (Figura 3B). Por lo tanto, estos datos ponen de manifiesto la alta eficiencia en la diferenciación de hPSC-CMMs a través de la inhibición de la ruta de señalización SMAD2/3.
Ejemplo 2. Caracterización morfológica, fenotípica y funcional de las hPSC-CMMs.
Para confirmar que las hPSC-CMMs, con fenotipo CD73+CD90+CD34-, obtenidas mediante la inhibición de la vía de señalización SMAD2/3 según se describe en la presente invención, son CMMs con todo su potencial, se procedió, en primer lugar, al aislamiento mediante citometría de flujo de la fracción celular CD73+ y CD73-. Para ello, los cultivos celulares de hPSCs en diferenciación (cultivados en presencia de 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida), se incubaron con anticuerpos anti-CD90 y anti-CD73 conjugados a FITC o PE respectivamente. La población celular que presentó doble positividad (CD90+CD73+) se separó con el separador FACSAria (Becton Dickinson) usando la Unidad de Deposición Celular Automática (ACDU). Entre 2-3x105 de células aisladas se cultivaron en placas de cultivo cubiertas de fibronectina para facilitar la adherencia. Tras 24 horas, las células no adherentes se eliminaron y se añadió nuevo medio de cultivo DMEM con 10% de suero, 1 % Glutamax y 1% Penicilina/Estreptomicina y se dejaron crecer hasta alcanzar prácticamente un 100% de confluencia. Como se puede observar en la Figura 4A, la pureza de los cultivos obtenidos (células CD73+CD90+) fue superior al 85% y se adhirió perfectamente a la placa de cultivo pudiendo ser expandida con éxito, en cambio, la fracción CD73 negativa apenas logró adherirse a la placa de cultivo y tras varios días de cultivo dicha población desaparecía, posiblemente por apoptosis.
Tras múltiples (>10) pases de cultivo, las células hPCS-CMMs con fenotipo CD73+CD90+, presentaban morfológicamente, un aspecto fibroblastoide y un fenotipo típico de CMMs analizado mediante citometría de flujo. Brevemente, las hPSC-CMMs se tripsinizaron, lavaron en PBS y se suspendieron en PBS+1%BSA. Un total de 2x105 células se incubaron 30 minutos en la oscuridad con los siguientes anticuerpos directamente conjugados con FITC o PE: CD73, CD90, CD105, CD44, CD166, CD106, CD45, CD34, CD14, CD19, HLA-DR (Becton Dickinson) y SSEA-4 (Chemicon). Las células se lavaron en PBS+1%BSA y se analizaron en un FACSCanto II con el programa de análisis FACSDiva (Becton Dickinson). En la figura 4B se pueden observar los histogramas obtenidos mediante el análisis de citometría de flujo, mostrando los marcadores fenotipicos típicos de las CMMs: CD73+ CD90+ CD105+ CD44+ CD166+ CD106- CD45- CD34- CD14- CD19- HLADR- SSEA-4- (Figura 4B).
Posteriormente, con las células hPSC-CMMs descritas en la presente invención, se realizó un estudio comparativo analizando la capacidad de crecimiento de dichas CMMs frente a la capacidad de crecimiento de otras CMMs de origen diferente, en este caso, CMMs somáticas derivadas de cordón umbilical (CB-CMM) y CMMs derivadas de médula ósea humana (BM-CMM). En la Figura 5A se observa que las hPSC-CMMs mostraron un patrón de crecimiento similar a las CMM de cordón umbilical.
Finalmente, analizamos la capacidad de las hPSC-CMMs de diferenciarse a línea osteogénica, adipogénica y condrogénica (Figura 5B). Para ello, las hPSC-CMMs se cultivaron a una densidad de 1x104 células/cm2 en Advance-DMEM con 10% de suero, 1% Glutamax y 1% Penicilina/Estreptomicina y se dejaron crecer hasta alcanzar la confluencia. El medio de cultivo se reemplazó por medio de cultivo inductor de la diferenciación específica a adipogénesis, osteogénesis y condrogénesis. Para la diferenciación adipogénica, los cultivos de hPSC-CMMs se cultivaron en presencia del medio Adipogenic MSCs Differentiation Bullet Kit (Lonza, Basel, Suiza) durante 2 semanas. Para la diferenciación osteogénica, se cultivaron en presencia del medio comercial Osteogenic MSCs Differentiation Bullet Kit (Lonza, Basel, Suiza) durante 2 semanas también. Para la diferenciación condrocítica, se cultivaron en presencia del medio comercial Chondrogenic MSCs Differentiation Bullet Kit (Lonza, Basel, Suiza) durante 2 semanas también. Como se ha comentado previamente, para demostrar que los cultivos de hPSC-CMMs en presencia de los medios de cultivos mencionados, son capaces de diferenciarse a adipocitos, osteocitos y condrocitos, se procedió al tratamiento de dichos cultivos con los colorantes: Oil Red (Sigma) que tiñe adipocitos o Alizarin Red (Sigma) que tiñe las células procedentes de linaje óseo (Sigma) y Azul Alcian (Sigma) que marca capacidad condrogénica. Como se muestra en la Figura 5B, los cultivos de hPSC-CMMs cultivados en presencia de los medios de cultivo específicos, fueron capaces de diferenciarse hacia hueso, grasa y cartílago, incluso un mes después del establecimiento de los cultivos de hPSC-CMMs. En conjunto, estos datos muestran que las hPSC-CMMs, presentan un fenotipo, crecimiento celular y diferenciación, típica de las CMMs.
Ejemplo 3. Capacidad inmunotolerante y anti-inflamatoria, in vitro e in vivo, de las hPSC-CMMs.
El potencial terapéutico de las CMMs en medicina regenerativa es, en parte debido a sus propiedades inmunomoduladores lo que convierte a las CMM en candidatos atractivos para el tratamiento de enfermedades inmunes. Por ello, en la presente invención se muestra la capacidad de las hPSC-CMMs de inactivar las respuestas de las células T e inhibir la respuesta inflamatoria. El posible potencial inmunomodulador d e l a s h P S C-CMM fue com parado co n el poten cial inmunomodulador de las CMMs derivadas de cordón umbilical (CB-CMM) y con las CMMs derivadas de tejido adiposo (Ad-CMM), el cual ha sido previamente reportado como potente inmunosupresor celular (García-Castro J et al. J. Cell Mol Med. 2008; 12:2552-2565; Yañez R et al Stem Cells 2006; 24: 2582- 2591). Las Ad-CMM y las CB-CMM se han comprado a InbioBank (Inbiomed, San Sebastián, España). Las Ad-CMM y las CB-CMM se cultivaron en DMEM con 1 % de FBS, 2mM de L-Glutamina y 1 % de penicilina/estreptomicina en condiciones de 95% de humedad, 5% de CO2 a 37°C. Para el análisis de la capacidad inmunotolerante y anti-inflamatoria se realizaron co-cultivos de las hPSC-CMMs, AD-CMMs y CB-CMMs junto con cultivos mixtos de linfocitos primarios (MLCs). Los MLCs se llevaron a cabo en placas de cultivo de 96 pocilios en presencia de 105 células respondedoras mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un donante A con otras 105 células PBMC de un donante B, tratadas con mitomicina C (para inducir parada de su ciclo celular en fase S), en un volumen de 200uL de medio completo en presencia o ausencia de diferentes concentraciones de las CMMs antes mencionadas (hPSC-CMMs, AD-CMMs o CB-CMMs). Las PBMCs se aislaron de muestras de sangre total procedentes de diferentes donantes sanos mediante centrifugación de gradiente con Ficoll-Hipaque (20 mins, 600g). Las células fueron recogidas tras el Ficoll y lavadas con RPMI 160 y plantadas en cultivo inmediatamente.
Los cultivos se marcaron con 5μΟί de timidina tritiada por pocilio durante las últimas 12 horas del cultivo. A continuación, las células se recogieron en membranas y la proliferación se determinó midiendo la incorporación de timidina tritiada en un contador de centelleo. Tras 48 horas, se determinó por ELISA la concentración en los sobrenadantes de las citoquinas IL-2, IL-4, TNF-α e I FN-γ. En experimentos similares, las PBMCs respondedoras se marcaron con 2.5μΜ de carboxy-fluoresceina- diacetato-succinimidil-ester" (CFSE, Molecular Probes) antes de establecer los co-cultivos. Tras el establecimiento de los co-cultivos, las células se marcaron con un anticuerpo anti-CD4-PerCP, se fijaron con 1 % de paraformaldehido y las células en proliferación se determinaron mediante la dilución de CFSE en la población CD4+ en un citómetro FACSCalibur (Becton Dickinson). El número de células en ciclo fue calculado como el % de células CFSE"/|0W que se habían dividido por el número total de células.
Los resultados obtenidos demuestran que la adicción de hPSC-CMMs a cultivos mixtos de linfocitos (MLC) redujo significativamente el número total de células en el cultivo y, en especial, el número de linfocitos T CD4+ en proliferación (Figura 6A). Por otro lado, las hPSC-CMM inhibieron fuertemente la respuesta proliferativa de linfocitos T activados, mostrando un efecto dosis-dependiente con respuestas inmunosupresoras significativas a ratios tan bajos como 1 :10 (hPSC-CMM:PBMCs) (Figura 6B). Es probable que la ausencia de expresión de moléculas MHC clase II (datos no mostrados) y de moléculas co-estimuladoras como por ejemplo CD80 y CD40 (Figura 6C), en las hPSC-CMM sea la responsable de la no estimulación de la proliferación de las PBMCs alogénicas. Además, las hPSC- CMM inhibieron de forma significativa la producción de citoquinas Th1 tales como IL-2, γ-IFN y TFN-a en MLCs analizados mediante ELISA en el sobrenadante de los cultivos (Figura 7A). Sin embargo, los niveles de IL-4, una citoquina Th2, no se vieron afectados por la presencia de hPSC-CMM (Figura 7A). Los efectos inducidos por las hPSC-CMM no son consecuencia de muerte celular dado que las hPSC- CMM no afectaron a la muerte celular/supervivencia celular de las PBMCs en los MLCs. En general, los efectos ¡nmunosupresores de las hPSC-CMM sobre las células T son muy similares a los observados en las CB-CMM, pero un poco menos pronunciados que los observados en las Ad-CMM.
A continuación, investigamos la capacidad de las hPSC-CMM de regular la respuesta antiinflamatoria de células residentes en la membrana sinovial de pacientes con artritis reumatoide activa (AR). 2x105 sinoviocitos de aspecto fibroblastoide (FLS) fueron aislados de las rodillas de pacientes independientes con AR activa. Los FLS fueron estimulados con lipopolisacárido (LPS; 1 ug/mL) o con TNF-α (20ng/mL) en presencia o ausencia de 105 Ad-MSCs, CB-MSCs o hPSC-MSCs. Tras 24-48 horas, se determinó mediante ELISA la concentración de citoquinas (IL-6 y TNF-α) y mediante el Kit EnzChek gelatinasa/colagenasa (Molecular Probes) la actividad colagenasa (degradación de la matriz extracelular) en los sobrenadantes de los cultivos.
El tratamiento de cultivos de FLS de pacientes con AR activa con hPSC-CMM disminuyó la secreción de TFN-α pero no de IL-6 tras la estimulación con LPS y también redujo la actividad colagenasa tras la estimulación con TFN-α (Figura 7B). Estos datos demuestran que las hPSC-CMMs presentan potentes propiedades inmunosupresoras y anti-inflamatorias, características de CMMs somáticas funcionales.
Sobre la base de las propiedades inmunosupresoras y anti-inflamatorias demostradas por los cultivos in vitro de las hPSC-CMMs obtenidas mediante el procedimiento descrito en la presente invención, se procedió al análisis de la potencial acción terapéutica de las hPSC-CMMs in vivo, en un modelo experimental de enfermedad inflamatoria intestinal (colitis) en ratones, inducido por la infusión intrarrectal de ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (TNBS), que muestra características clínicas, histopatológicas e inmunológicas propias de la enfermedad de Crohn humana (Bouma y Strober, 2003). En ambas enfermedades, enfermedad de Crohn y en la colitis inducida por TNBS, las células Th1 y Th17 activadas, promueven una infiltración y activación exagerada de macrofagos y neutrófilos, dando lugar a una grave y prolongada inflamación de la mucosa intestinal, que se caracteriza por la producción incontrolada de citoquinas y quimioquinas inflamatorias (Bouma y Strober, 2003). Los mediadores inflamatorios como las citoquinas y los radicales libres, producidos por las células infiltrantes y los macrofagos residentes, desempeñan un papel crítico en la destrucción de los tejidos del colon en dichas patologías.
Para la inducción del modelo experimental de inflamación intestinal (colitis) en ratones BALB/c machos de 7 semanas de edad, se les administró de manera intrarrectal 3 mg de TNBS (Sigma) resuspendidos en 50% de etanol (100 μΙ). Los ratones control recibieron etanol al 50% solamente. Los animales fueron posteriormente divididos en cuatro grupos y 12 horas después del tratamiento con TNBS, cada grupo fue tratado con una inyección intraperitoneal que contenía medio de cultivo solo o medio de cultivo que incluía una concentración de 106 células hPSC-CMM o de CB-CMM o de Ad-CMM, respectivamente. Posteriormente, se realizó un seguimiento de los animales para observar la aparición de diarrea, pérdida de peso corporal, así como la supervivencia de los mismos. El colon de los animales se utilizó para analizar el daño macroscópico (en una escala graduada de 0-10), basándonos en criterios de inflamación (por ejemplo, hiperemia, engrasamiento intestinal y ulceración). También se analizó la consistencia de las heces así como el sangrado rectal.
Como se muestra en la Figura 8, los ratones tratados con TNBS desarrollaron una enfermedad grave caracterizada por diarrea con sangre, prolapso rectal, pancolitis acompañada de síndrome de desgaste extensivo (Figura 8B) y pérdida de peso sostenida y profunda (Figura 8A), que resultó en un índice de mortalidad del 60% (Figura 8C). El examen macroscópico mostró hiperemia de colones en huelga, la inflamación y necrosis. Sin embargo, los ratones tratados con hPSC-CMMs o los tratados con CB-CMMs o Ad-CMMs, muestran un incremento en la tasa de supervivencia (Figura 8C), en la recuperación rápida del peso perdido (Figura 8A), en la mejora de la caquexia, y en la recuperación de una apariencia saludable, y sólo mostraron leves signos de inflamación en el colon, similares a los encontrados en los ratones control tratados con etanol al 50% (Figura 8B). En conjunto, estos datos confirman el efecto terapéutico in vivo de las hPSC-CMMs en un modelo experimental de colitis, demostrando, por primera vez, que los cultivos de hPSC-CMMs exhiben potentes propiedades antiinflamatorias e inmunosupresoras, tanto in vivo como in vitro.

Claims

REIVINDICACIONES
1. - Procedimiento de obtención de células madre mesenquimales (PSC-CMMs) que comprende:
a) Cultivar células PSC en presencia de un inhibidor de la vía de señalización SMAD2/3.
b) Aislar las PSC-CMMs obtenidas en el paso anterior
2. - Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque el inhibidor de la vía de señalización SMAD2/3 es el 4-[4-(1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida. 3.- Procedimiento según la reivindicación 2 caracterizado porque el 4-[4-(1 ,
3-Benzodioxol-5-il)-5-(2- piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida se utiliza a una concentración de entre 5μΜ a 50μΜ y durante un tiempo que varía de entre 7 a 40 días, preferentemente a una concentración de 10 μΜ durante 28 días.
4. - Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque comprende además un paso c) de diferenciación funcional que consiste en:
d ) Cultivar las PSC-CMMs obtenidas en medios de cultivo específicos para inducir su diferenciación en líneas osteogénica, condrogénica y adipogénica
c2) Teñir las PSC-CMMs cultivadas en el paso anterior con colorantes específicos que evidencian su diferenciación.
5. - Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque las PSC son de origen humano.
6. - Células madre mesenquimales (PSC-CMMs) obtenibles mediante el procedimiento de las reivindicaciones 1-3 y 5.
7. - Células madre mesenquimales (PSC-CMMs) según la reivindicación 6 caracterizadas por no mostrar senescencia al cabo de, al menos, 200 días de cultivo.
8.- Condrocitos, osteocitos o adipocitos obtenibles mediante el procedimiento de las reivindicaciones 1 a 5.
9.- Uso de un inhibidor de la vía de señalización SMAD2/3 en procedimientos de obtención de células madre mesenquimales.
10. - Uso según la reivindicación 10, donde el inhibidor de la vía de señalización SMAD2/3, es el 4-[4- (1 ,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il] benzamida.
11. - Uso de las células madre mesenquimales (PSC-CMMs) de las reivindicaciones 6 y 7 en el tratamiento de enfermedades del grupo: enfermedades autoinmunes, diabetes, esclerosis múltiple, enfermedad de Chron, artritis, enfermedades óseas, enfermedades de cartílago, fístulas y rechazo inmune a injerto.
12. - Uso de los condrocitos, osteocitos o adipositos de la reivindicación 8 en el tratamiento de enfermedades del grupo: enfermedades autoinmunes, diabetes, esclerosis múltiple, enfermedad de Chron, artritis, enfermedades óseas, enfermedades de cartílago, fístulas y rechazo inmune a injerto.
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