WO2011115212A1 - 質量分析による糖鎖の分析方法 - Google Patents

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秀行 島岡
碧 阿部
幸太 五十嵐
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Sumitomo Bakelite Co Ltd
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    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing a sugar chain contained in a biological sample by mass spectrometry.
  • Sugar chain is a general term for molecules in which monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, sialic acid and derivatives thereof are linked in a chain form by glycosidic bonds.
  • Sugar chains are very diverse and are substances involved in various functions of naturally occurring organisms. Sugar chains often exist as complex carbohydrates bound to proteins, lipids, and the like in vivo, and are one of the important components in vivo. It is becoming clear that sugar chains in living organisms are deeply involved in cell-to-cell information transmission, protein function and coordination of interactions.
  • biopolymers having sugar chains include cell wall proteoglycans that contribute to cell stabilization, glycolipids that affect cell differentiation, proliferation, adhesion, migration, etc., and cell-cell interactions and cells Glycoproteins involved in recognition can be mentioned, but the mechanism by which these high-molecular sugar chains control advanced and precise biological reactions while acting, assisting, amplifying, regulating, or inhibiting each other's functions gradually. It is being revealed. Furthermore, if the relationship between such sugar chains and cell differentiation / proliferation, cell adhesion, immunity, and cell carcinogenesis is clarified, this sugar chain engineering and medicine, cell engineering, or organ engineering are closely related. It can be expected that a new development will be made in relation to (Non-patent Document 1).
  • Non-patent Documents 2 and 3 glycosyltransferase gene-disrupted mice involved in sugar chain biosynthesis has revealed that sugar chains are essential for maintaining the functions of various tissues and organs. It is also known that various diseases are caused when an abnormality is observed in sugar chain modification (Non-patent Document 4). Since the structure of the sugar chain changes markedly depending on the canceration of cells and various diseases, it is expected to be used as a biomarker for examining the transition of diseases.
  • MALDI-TOF MS is considered to be one of the powerful tools for searching biomarkers in recent years because it does not require complicated sample preparation and can be measured easily and quickly (Patent Documents 1 to 3). However, when analyzing glycans by MALDI-TOF MS, it is an issue to improve the sensitivity of the analysis.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object of the present invention is to analyze sugar chains contained in a biological sample with high sensitivity using mass spectrometry represented by MALDI-TOF MS. It is to provide a method.
  • the inventors of the present invention have a low ionization efficiency when performing mass spectrometry because the sugar chain contains many hydroxyl groups and is a highly polar neutral substance, and therefore the accuracy when performing mass spectrometry is low. In view of this, intensive research was conducted to solve this problem. As a result, it is possible to increase the ionization efficiency of the sugar chain by performing MALDI-TOF MS measurement after methylating the hydroxyl group of the sample sugar chain, thereby quantitatively measuring the sample sugar chain with high sensitivity. The inventors have found that analysis and structural analysis are possible, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to a method for analyzing a sugar chain by mass spectrometry after methylating a hydroxyl group of a sugar chain contained in a biological sample, and more specifically, provides the following invention.
  • a method for analyzing a sugar chain contained in a biological sample by mass spectrometry (A) a step of releasing sugar chains from a biological sample; (B) capturing the released sugar chain on a solid phase carrier; (C) a step of re-releasing the captured sugar chain; (D) a step of methylating the hydroxyl group of the re-released sugar chain, and (e) a step of analyzing the methylated sugar chain by mass spectrometry. Including methods.
  • sugar chains contained in a biological sample can be analyzed with high sensitivity using MALDI-TOF MS. Further, when a sugar chain in which a hydroxyl group is methylated is cleaved by acid hydrolysis or the like, a hydroxyl group is generated only at the cleavage site. Therefore, according to the present invention, it is possible to analyze the cleavage site and the binding mode of the sugar chain. .
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of analysis of an N-type sugar chain of bovine serum IgG by MALDI-TOF MS.
  • Step of releasing sugar chain from biological sample As a sample containing a sugar chain used in the present invention, for example, biological samples such as whole blood, serum, plasma, urine, saliva, cells, tissues, viruses, and plant tissues can be used. In addition, purified or unpurified glycoprotein can be used. The sample may be pretreated by a method such as degreasing, desalting, protein fractionation, and heat denaturation.
  • the sugar chain is released from the glycoprotein contained in the biological sample using a sugar chain releasing means.
  • a sugar chain releasing means As means for releasing the sugar chain, methods such as glycosidase treatment using N-glycosidase or O-glycosidase, hydrazine decomposition, and ⁇ elimination by alkali treatment can be used.
  • a method using N-glycosidase is preferable.
  • protease treatment may be performed using trypsin, chymotrypsin, or the like.
  • Sugar chain is the only substance in the living body that has an aldehyde group. That is, in the sugar chain, a cyclic hemiacetal type and an acyclic aldehyde type exist in an equilibrium state in an aqueous solution or the like. In vivo substances other than sugar chains such as proteins, nucleic acids, and lipids do not contain aldehyde groups. From this, it is possible to selectively capture only sugar chains by using a capture carrier having a functional group that reacts specifically with an aldehyde group to form a stable bond.
  • an oxylamino group, a hydrazide group, an amino group, a semithiocarbazide group and derivatives thereof are preferable, and a hydrazide group or an oxylamino group is more preferable.
  • the oxime bond generated by the reaction between the oxylamino group and the aldehyde group and the hydrazone bond generated by the reaction between the hydrazide group and the aldehyde group are easily cleaved by acid treatment, etc.
  • amino groups are frequently used to capture and support physiologically active substances, but bonds (Schiff bases) produced by the reaction of amino groups and aldehyde groups have weak binding strength, so that a reducing agent or the like can be used.
  • An amino group is not preferable for capturing a sugar chain because a subsequent treatment is required.
  • polymer particles are preferably solid or gel particles having a functional group that specifically reacts with an aldehyde group of a sugar chain on at least a part of the surface. If the polymer particles are solid particles or gel particles, sugar chains can be captured by the polymer particles and then easily collected by means such as centrifugation or filtration. It is also possible to use polymer particles packed in a column. The method of filling the column and using it is particularly important from the viewpoint of continuous operation. By using a filter plate (for example, MultiScreen Solvinert Filter Plate manufactured by Millipore) as a reaction vessel, it is possible to process a plurality of samples at the same time. For example, conventional purification means by column operation represented by gel filtration In comparison, the throughput of sugar chain purification is greatly improved.
  • a filter plate for example, MultiScreen Solvinert Filter Plate manufactured by Millipore
  • the shape of the polymer particles is not particularly limited, but a spherical shape or a similar shape is preferable.
  • the average particle size is preferably 0.05 to 1000 ⁇ m, more preferably 0.05 to 200 ⁇ m, still more preferably 0.1 to 200 ⁇ m, and most preferably 0.1 to 200 ⁇ m. 100 ⁇ m. If the average particle diameter is less than the lower limit, when the polymer particles are packed in a column and used, liquid permeability becomes poor, and it is necessary to apply a large pressure. Moreover, it becomes difficult to collect the polymer particles by centrifugation or filtration.
  • a hydrazide group-containing polymer particles "BlotGlyco (R)" (Sumitomo Bakelite Co., Ltd., # BS-45603) can be suitably used.
  • the pH of the reaction system when capturing sugar chains by polymer particles that specifically capture sugar chains is preferably 2 to 9, more preferably 2 to 7, and even more preferably 2 to 6.
  • Various buffers can be used for pH adjustment.
  • the temperature at the time of sugar chain capture is preferably 4 to 90 ° C., more preferably 4 to 70 ° C., still more preferably 30 to 80 ° C., and most preferably 40 to 80 ° C.
  • the reaction time can be appropriately set.
  • the sample solution may be passed through a column filled with polymer particles.
  • cleaning solution it is preferable to use water, a buffer solution, water containing a surfactant or a buffer solution, an organic solvent, or the like in an appropriate combination.
  • a particularly preferred form is a method of thoroughly washing with water or a buffer containing a surfactant, then washing with an organic solvent, and finally washing with water. These washings remove nonspecific adsorbates from the polymer particle surface.
  • Excess functional groups on the carrier can be capped using, for example, acetic anhydride.
  • Step of re-releasing the captured sugar chain Next, the sugar chain bound to the polymer particle as the capture carrier is re-released to obtain a purified sugar chain sample.
  • Compound A is preferably a labeling reagent. Substitution is achieved by adding an excessive amount of Compound A to polymer particles to which sugar chains are bound. That is, the sugar chain is cleaved from the polymer particle, and at the same time, compound A is added to the sugar chain (the sugar chain is “labeled” with compound A).
  • the amount of the compound A added in excess is preferably 1.5 times or more, more preferably 3 times or more, more preferably 5 times or more of the amount of the functional group specifically reacting with the sugar chain of the polymer particles. Yes, most preferably 10 times or more.
  • the pH of the reaction system is preferably 2 to 9, more preferably 2 to 7, and further preferably 2 to 6.
  • Various buffers can be used for pH adjustment.
  • the temperature of the reaction system is preferably 40 to 90 ° C, more preferably 40 to 80 ° C. After this step, the solvent is preferably evaporated.
  • the compound A is preferably a compound having an aminooxy group or a hydrazide group, and the most preferable compound is N-aminooxyacetyl-tryptophanyl (arginine methyl ester).
  • This compound is the above "BlotGlyco (R) for MALDI” (Sumitomo Bakelite Co., Ltd., # BS-45603) as a re-release reagent that comes with and are commercially available.
  • sample preparation method is also provided.
  • This sample preparation method is characterized in that polymer particles to which sugar chains are bonded are treated under acidic conditions to dissociate hydrazone bonds and release sugar chains.
  • the treatment under acidic conditions at this time is treatment with 0.01 to 20 volume percent acetic acid solution, preferably 0.1 to 5 volume percent acetic acid solution, and is performed at 40 to 80 ° C. for 5 to 60 minutes. . It is preferable that the solvent evaporates after this process.
  • a methylating reagent is iodomethane.
  • the amount of the methylating reagent is preferably 10 to 200 ⁇ L, more preferably 10 to 100 ⁇ L.
  • the methylating reagent is preferably a mixed solution with dimethyl sulfoxide (DMSO), and more preferably a NaOH / DMSO slurry.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • NaOH / DMSO slurry is obtained by dispersing finely divided solid NaOH in DMSO.
  • the methylation reagent solution is added to the polymer particles that have undergone the sugar chain re-releasing step, and the sugar chains are methylated by allowing to stand for a predetermined temperature and time.
  • the methylation step is usually carried out at 10 to 60 ° C., preferably 10 to 40 ° C., for 10 minutes.
  • the methylation reaction can be stopped by adding pure water.
  • the methylated sugar chain can be recovered from the reaction solution by, for example, chloroform extraction.
  • a methylation reaction solution is added to chloroform, and then the chloroform layer is recovered, washed with pure water, and then the chloroform solution is evaporated, which can be used for mass spectrometry described later.
  • the present invention provides a method for purifying and methylating sugar chains by a simple operation.
  • the obtained sugar chain can be analyzed by mass spectrometry represented by MALDI-TOF MS.
  • the mass spectrum obtained by MALDI-TOF MS measurement can be analyzed using analysis software or the like.
  • the peak of the sample sugar chain is detected by reading the mass-to-charge ratio (m / z value). From the mass-to-charge ratio and peak intensity (arbitrary index such as peak height and peak area), sugar chain quantification and sugar chain structure can be analyzed.
  • various databases for example, GlycoMod, Glycosuite, etc. can be used.
  • kits The present invention provides a kit containing a reagent for methylating a hydroxyl group of a sugar chain for carrying out the above-described method of the present invention.
  • a reagent for methylating a sugar chain for carrying out the above-described method of the present invention.
  • the kit of the present invention in addition to the methylating reagent, for example, (1) a carrier for capturing (purifying) a sugar chain (beads, etc.), (2) a sugar chain captured on the carrier is labeled and / or Reagents for re-release, (3) Carrier (column etc.) for removing reagent (2) present in excess in reaction solution, (4) Reaction tube, (5) Instructions for use be able to.
  • Example 1 Release of sugar chain from glycoprotein Take 1 mg of bovine serum immunoglobulin G (IgG, manufactured by Sigma-Aldrich, # I5506) in a tube, 1M ammonium bicarbonate aqueous solution (5 ⁇ L), pure water (50 ⁇ L), 120 mM Of dithiothreitol (5 ⁇ L) was added and completely dissolved, and then incubated at 60 ° C. for 30 minutes. Next, 123 mM iodoacetamide aqueous solution (10 ⁇ L) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour with shading, then 400 units of trypsin was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • IgG bovine serum immunoglobulin G
  • N-glycosidase F (Roche Diagnostics, # 11365193001) is added, and the sugar chain is left at 37 ° C. for 16 hours. Was released.
  • Example 2 Carbohydrate loading on polymer particles 20 ⁇ L of the obtained free sugar chain solution (equivalent to 100 ⁇ g of IgG) is added to 5 mg of polymer particles (BS-45603, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), and 2% acetic acid is contained. After adding 180 ⁇ L of acetonitrile, the mixture was reacted at 80 ° C. for 1 hour and dried. The polymer particles were washed with 2M guanidine hydrochloride solution, water, methanol, 1% triethylamine solution, 10% acetic anhydride / methanol solution was added, and reacted at room temperature for 30 minutes to cap the hydrazide group. After capping, the polymer particles were washed with methanol and water.
  • Example 3 Sugar chain re-release By adding 20 ⁇ L of pure water and 180 ⁇ L of acetonitrile containing 2% acetic acid to the sugar chain-supporting polymer particles prepared above, the mixture is reacted at 80 ° C. for 1 hour and dried. The sugar chain was released from the polymer particles.
  • Example 4 Preparation of methylating reagent solution
  • 1 g of granular sodium hydroxide was placed in a mortar and quickly ground with a pestle. To this, 1 mL of DMSO was added and mixed to prepare a slurry solution. 100 ⁇ L of this solution and 100 ⁇ L of iodomethane (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., # 131-02661) were mixed to prepare a methylating reagent solution.
  • Example 5 Methylation of sugar chain 100 ⁇ L of a methylating reagent solution was added to the polymer particles after the re-release of sugar chains. After reacting by allowing to stand at 25 ° C. for 10 minutes, 200 ⁇ L of pure water was added to stop the reaction. The solution and polymer particles were separated by filtration, and the solution was recovered. The solution was transferred to a sample tube, 400 ⁇ L of chloroform was added, and the mixture was stirred for 1 minute to collect methylated sugar chains in the chloroform layer. After leaving the sample tube to separate the chloroform layer and the aqueous layer, the chloroform layer was recovered in another sample tube.
  • Example 6 MALDI-TOF MS measurement The obtained methylated sugar chain was dissolved in 100 ⁇ L of methanol. This solution was diluted 10-fold with a matrix solution (10 mg / mL aqueous solution of 2,5-dihydroxybenzoic acid), 1 ⁇ L of which was spotted on a sample stage, dried and crystallized. This was analyzed by a matrix-assisted laser ionization-time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF MS) ('autoflex III' manufactured by Bruker Daltonics). The measurement was performed in positive ion detection mode and reflectron mode.
  • MALDI-TOF MS matrix-assisted laser ionization-time-of-flight mass spectrometer
  • the obtained mass spectrum is shown in FIG.
  • the sugar chain composition was estimated from the mass number to charge ratio (m / z value) obtained from the spectrum.
  • the estimation of the sugar chain composition was carried out using GlycoMod tool (http://www.expasy.org/tools/glycomod/) and GlycoSuite database (http://glycosuitedb.expasy.org/glycosuite/glycodb).
  • GlycoMod tool http://www.expasy.org/tools/glycomod/
  • GlycoSuite database http://glycosuitedb.expasy.org/glycosuite/glycodb.
  • a schematic diagram of the estimated sugar chain is shown in the mass spectrum of FIG.
  • sugar chain analysis method of the present invention it becomes possible to perform quantitative analysis (quantitative profiling) and structural analysis of glycoprotein sugar chains contained in biological samples such as serum and tissues of disease patients with high sensitivity. They can be used in the medical field, such as searching for disease marker sugar chains and studying sugar chain dynamics during drug administration.

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Abstract

　試料糖鎖の水酸基をメチル化した上で、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ　ＭＳ測定を行うことにより、糖鎖のイオンか効率を高めることが可能であり、これにより、高い精度で試料糖鎖の定量的分析や構造解析が可能であることを見出した。

Description

質量分析による糖鎖の分析方法
　本発明は、生体試料中に含まれる糖鎖を質量分析により分析する方法に関する。
　糖鎖とは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸などの単糖およびこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子の総称である。
　糖鎖は非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能に関与する物質である。糖鎖は生体内でタンパク質や脂質などに結合した複合糖質として存在することが多く、生体内の重要な構成成分の一つである。生体内の糖鎖は細胞間情報伝達、タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていることが明らかになりつつある。
　例えば、糖鎖を有する生体高分子としては、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロテオグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響を与える糖脂質、および細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等が挙げられるが、これらの高分子の糖鎖が、互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。さらに、このような糖鎖と細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、および細胞の癌化との関係が明確にされれば、この糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学とを密接に関連させて新たな展開を図ることが期待できる（非特許文献１）。
　病気を早期発見して生活の質（ＱＯＬ）を高く保つためには、病気の発症の予防や推移を診断できるバイオマーカーが必要である。糖鎖生合成にかかわる糖転移酵素の遺伝子破壊マウスの解析から、糖鎖はさまざまな組織・器官の機能維持に必須であることが明らかにされている（非特許文献２、３）。また、糖鎖修飾に異常がみられるとさまざまな疾病が引き起こされることも知られている（非特許文献４）。糖鎖の構造は細胞の癌化やさまざまな疾病によって著しく変化するので、疾病の推移を調べるためのバイオマーカーとしての利用が期待されている。
　ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ　ＭＳは、複雑なサンプル調製が不要で、簡便迅速に測定が行えることから、近年、バイオマーカー探索の強力なツールの一つと考えられている（特許文献１～３）。しかしながら、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ　ＭＳにより糖鎖の分析を行う場合、分析の感度の向上を図ることが一つの課題となっている。
特開２００９－１４２２３８号公報 特開２００９－２１６６０９号公報 特開２００９－２２９４２６号公報
糖鎖生物学入門　化学同人　2005年11月1日発行　第1版 Ioffe　E.,　Stanley　P.,　Proc.　Natl.　Acad.　Sci.,　91,　pp.728-732　(1994) Metzler　M.,　Gertz　A.,　Sarker　M.,　Schachter　H.,　Schrader　J.W.,　Marth　J.D.,　EMBO　J.,　13,　pp.2056-2065　(1994) Powell　L.D.,　Paneerselvam　K.,　Vij　R.,　Diaz　S.,　Manzi　A.,　Buist　N.,　Freeze　H.,　Varki　A.,　J.　Clin.　Invest.,　94,　pp.1901-1909　(1994)
　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体試料中に含まれる糖鎖を、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ　ＭＳに代表される質量分析法を用いて高い感度で分析する方法を提供することにある。
　本発明者らは、糖鎖が多くの水酸基を含み、極性の高い中性物質であることから質量分析を行う際のイオン化効率が低く、それゆえに、質量分析を実施した場合の精度が低くなることに鑑み、この問題を解決すべく鋭意研究を重ねた。その結果、試料糖鎖の水酸基をメチル化した上で、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ　ＭＳ測定を行うことにより、糖鎖のイオン化効率を高めることが可能であり、これにより、高い感度で試料糖鎖の定量的分析や構造解析が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、生体試料に含まれる糖鎖の水酸基をメチル化した上で質量分析法により糖鎖を分析する方法に関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
　[１]　生体試料に含まれる糖鎖を質量分析法により分析する方法であって、
（ａ）生体試料から糖鎖を遊離する工程、
（ｂ）遊離させた糖鎖を固相担体に捕捉する工程、
（ｃ）捕捉した糖鎖を再遊離する工程、
（ｄ）再遊離した糖鎖の水酸基をメチル化する工程、および
（ｅ）メチル化した糖鎖を質量分析法により分析する工程、
を含む方法。
　[２]　[１]に記載の方法を実施するための、糖鎖の水酸基をメチル化するための試薬を含むキット。
　本発明によれば、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ　ＭＳを用いて、生体試料中に含まれる糖鎖を高い感度で分析することが可能となる。また、水酸基をメチル化した糖鎖を酸加水分解などにより切断した場合、切断部位のみ水酸基が生じるため、本発明によれば、糖鎖の切断部位や結合様式をも解析することが可能となる。
図１は、ウシ血清ＩｇＧのＮ型結合糖鎖をＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ　ＭＳにより分析した結果を示す図である。
（生体試料から糖鎖を遊離する工程）
　本発明において使用する糖鎖を含む試料としては、例えば全血、血清、血漿、尿、唾液、細胞、組織、ウイルス、植物組織などの生体試料を用いることができる。また、精製された、あるいは未精製の糖タンパク質を用いることができる。試料は脱脂、脱塩、タンパク質分画、熱変性などの方法により前処理されていてもよい。
　糖鎖遊離手段を用いて上記生体試料に含まれる糖タンパク質から糖鎖を遊離させる。糖鎖を遊離させる手段としては、Ｎ－グリコシダーゼあるいはＯ－グリコシダーゼを用いたグリコシダーゼ処理、ヒドラジン分解、アルカリ処理によるβ脱離などの方法を用いることができる。Ｎ型糖鎖の分析を行う場合は、Ｎ－グリコシダーゼを用いる方法が好ましい。グリコシダーゼ処理に先立って、トリプシンやキモトリプシンなどを用いてプロテアーゼ処理を行ってもよい。
（遊離した糖鎖を固相担体に捕捉する工程）
　糖鎖を含む溶液を糖鎖と特異的に結合する捕捉担体に接触させて捕捉担体上に糖鎖を捕捉する。
　糖鎖は生体内物質のなかで唯一、アルデヒド基をもつ物質である。すなわち、糖鎖は水溶液などの状態で環状のヘミアセタール型と、非環状型のアルデヒド型とが平衡で存在する。タンパク質や核酸、脂質など糖鎖以外の生体内物質にはアルデヒド基が含まれていない。このことから、アルデヒド基と特異的に反応して安定な結合を形成する官能基を有する捕捉担体を利用すれば、糖鎖のみを選択的に捕捉することが可能である。アルデヒド基と特異的に反応する官能基としては、例えば、オキシルアミノ基、ヒドラジド基、アミノ基、セミチオカルバジド基ならびにそれらの誘導体を好ましく、ヒドラジド基あるいはオキシルアミノ基がより好ましい。オキシルアミノ基とアルデヒド基との反応によって生じるオキシム結合およびヒドラジド基とアルデヒド基との反応によって生じるヒドラゾン結合は、酸処理などによって容易に切断されるため、糖鎖を捕捉したのち、糖鎖を担体から簡単に切り離すことができる。一般的に、生理活性物質の捕捉・担持にはアミノ基が多用されているが、アミノ基とアルデヒド基の反応によって生じる結合（シッフ塩基）は結合力が弱いため、還元剤などを用いた二次処理が必要であることから、アミノ基は糖鎖の捕捉には好ましくない。
　糖鎖を捕捉するための担体としては、ポリマー粒子を用いることが好ましい。ポリマー粒子は、少なくとも表面の一部に糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有した固体あるいはゲル粒子であることが好ましい。ポリマー粒子が固体粒子あるいはゲル粒子であれば、ポリマー粒子に糖鎖を捕捉させたのち、遠心分離やろ過などの手段によって容易に回収することができる。また、ポリマー粒子をカラムに充填して用いることも可能である。カラムに充填して用いる方法は、特に連続操作化の観点から重要となる。反応容器としてフィルタープレート（例えば、Millipore社製のMultiScreen　Solvinert　Filter　Plate）を用いることにより、複数のサンプルを同時に処理することが可能となり、例えば、ゲルろ過に代表されるカラム操作による従来の精製手段と比較して、糖鎖精製のスループットが大幅に向上される。
　ポリマー粒子の形状は特に限定しないが、球状またはそれに類する形状が好ましい。ポリマー粒子が球状の場合、平均粒径は好ましくは０．０５～１０００μｍであり、より好ましくは０．０５～２００μｍであり、さらに好ましくは０．１～２００μｍであり、最も好ましくは０．１～１００μｍである。平均粒径が下限値未満では、ポリマー粒子をカラムに充填して用いる際、通液性が悪くなるために大きな圧力を加える必要がある。また、ポリマー粒子を遠心分離やろ過で回収することも困難となる。平均粒径が上限値を超えると、ポリマー粒子と試料溶液の接触面積が少なくなり、糖鎖捕捉の効率が低下する。本発明においては、ヒドラジド基含有ポリマー粒子である「BlotGlyco(Ｒ)」（住友ベークライト株式会社製、#BS-45603）を好適に用いることができる。
　糖鎖を特異的に捕捉するポリマー粒子によって糖鎖を捕捉する際の反応系のｐＨは、好ましくは２～９、より好ましくは２～７であり、さらに好ましくは２～６である。ｐＨ調整のためには、各種緩衝液を用いることができる。糖鎖捕捉時の温度は、好ましくは４～９０℃、より好ましくは４～７０℃、さらに好ましくは３０～８０℃であり、最も好ましくは４０～８０℃である。反応時間は適宜設定することができる。ポリマー粒子をカラムに充填して試料溶液を通過させてもよい。
　ポリマー粒子を用いた場合、担体表面には糖鎖以外の莢雑物が非特異的に吸着しているため、これらを洗浄除去する必要がある。洗浄液としては、水、緩衝液、界面活性剤を含む水または緩衝液、有機溶剤などを適宜組み合わせて用いることが好ましい。特に好ましい形態は、界面活性剤を含む水または緩衝液で十分に洗浄したのち、有機溶剤で洗浄し、最後に水で洗浄する方法である。これらの洗浄により、非特異的吸着物がポリマー粒子表面から除去される。
　担体上の余剰官能基は、例えば、無水酢酸などを利用して、キャッピングすることができる。
（捕捉した糖鎖を再遊離する工程）
　次いで、捕捉担体であるポリマー粒子に結合した糖鎖を再遊離し、精製された糖鎖試料を得る。
　ポリマー粒子に結合した糖鎖を別の化合物（以下、「化合物Ａ」と称す）に置換する工程に関して説明する。化合物Ａはラベル化試薬であることが好ましい。糖鎖が結合しているポリマー粒子に対して化合物Ａを過剰量加えることで置換が成される。すなわち、糖鎖はポリマー粒子から切り離され、それと同時に糖鎖に化合物Ａが付加する（糖鎖は化合物Ａで「ラベル化」される）。過剰に加える化合物Ａの量は、好ましくはポリマー粒子が有する糖鎖と特異的に反応する官能基量の１．５倍量以上、より好ましくは３倍量以上、さらに好ましくは５倍量以上であり、最も好ましくは１０倍量以上である。反応系のｐＨは、好ましくは２～９、より好ましくは２～７であり、さらに好ましくは２～６である。ｐＨ調整のためには、各種緩衝液を用いることができる。反応系の温度は、好ましくは４０～９０℃、より好ましくは４０～８０℃である。本工程後、溶媒は蒸発していることが好ましい。
　化合物Ａとしては、アミノオキシ基またはヒドラジド基を有する化合物が好ましく、最も好ましい化合物は、Ｎ-アミノオキシアセチル－トリプトファニル(アルギニン　メチル　エステル)である。この化合物は、上記の「BlotGlyco(Ｒ)　for　MALDI」（住友ベークライト株式会社製、#BS-45603）に付属の再遊離試薬として、市販されている。
　ここでは、糖鎖捕捉物質に捕捉された糖鎖を遊離して標識化サンプルを得る方法を説明したが、下記の方法によれば、非標識サンプルを得ることができ、本発明はこのような試料調製方法をも提供する。この試料調製方法は、糖鎖が結合しているポリマー粒子を酸性条件で処理することにより、ヒドラゾン結合を解離させ、糖鎖を遊離させることを特徴としている。このときの酸性条件での処理は、０．０１～２０体積パーセントの酢酸溶液、好ましくは０．１～５体積パーセントの酢酸溶液、による処理であり、４０～８０℃で５～６０分間行われる。本工程後、溶媒が蒸発していることが好ましい。
（再遊離した糖鎖の水酸基をメチル化する工程）
　次いで、再遊離した糖鎖の水酸基をメチル化する。メチル化試薬としては、例えば、ヨードメタンが挙げられる。メチル化試薬の量は、好ましくは１０～２００μＬ、より好ましくは１０～１００μＬである。メチル化試薬は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）との混合液であることが好ましく、ＮａＯＨ／ＤＭＳＯスラリーであることがより好ましい。ここでＮａＯＨ／ＤＭＳＯスラリーとは、微粉化した固体のＮａＯＨを、ＤＭＳＯに分散させたものである。
　メチル化試薬溶液を上記糖鎖再遊離工程を経たポリマー粒子に添加し、所定の温度、時間静置することにより、糖鎖のメチル化が行われる。メチル化工程は、通常、１０～６０℃、好ましくは１０～４０℃で、１０分間行われる。
　メチル化反応は、純水を添加することにより、停止することができる。反応液からのメチル化糖鎖の回収は、例えば、クロロホルム抽出により行うことができる。例えば、メチル化反応の反応液をクロロホルムに添加し、その後、クロロホルム層を回収し、これを純粋で洗浄後、クロロホルム溶液を蒸発させたものを、後述の質量分析に用いることができる。
　上記のように、本発明の方法によれば、再遊離した糖鎖をポリマー粒子と分離する必要がなく、糖鎖とポリマー粒子が混在したままでメチル化が可能である。また、メチル化反応は禁水反応であるため、通常、糖鎖溶液を凍結乾燥などの方法で乾燥させたものを、この反応に使用するが、本発明の方法では、糖鎖再遊離工程後には溶媒が蒸発しているため、乾燥工程は必要ない。このように、本発明は、簡便な操作で糖鎖の精製とメチル化を行う方法を提供するものである。
（メチル化した糖鎖を質量分析法により分析する工程）
　得られた糖鎖は、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ　ＭＳに代表される質量分析法で分析することができる。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ　ＭＳ測定により得られたマススペクトルは、解析ソフト等を用いて解析することができる。質量電荷比（m/z値）を読み取ることにより、試料糖鎖のピークが検出される。質量電荷比やピーク強度（ピーク高さ、ピーク面積など任意の指標）から、糖鎖の定量や糖鎖の構造を分析することができる。糖鎖の分析においては、各種データベース（例えば、GlycoMod、Glycosuiteなど）を利用することができる。
（キット）
　本発明は、上記本発明の方法を実施するための、糖鎖の水酸基をメチル化するための試薬を含むキットを提供する。本発明のキットには、メチル化試薬以外に、例えば、（１）糖鎖を捕捉（精製）するための担体（ビーズなど）、（２）担体に捕捉された糖鎖を標識化および／または再遊離するための試薬、（３）反応液中に過剰に存在する（２）の試薬を除去するための担体（カラムなど）、（４）反応用チューブ、（５）使用説明書、を含むことができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　[実施例１]　糖タンパク質からの糖鎖遊離
　ウシ血清イムノグロブリンＧ（IgG，シグマアルドリッチ製，#I5506）１ｍｇをチューブに取り、１Ｍの重炭酸アンモニウム水溶液(５μＬ)、純水(５０μＬ)、１２０ｍＭのジチオスレイトール水溶液(５μＬ)を加え、完全に溶解させた後、６０℃で３０分間インキュベートした。次に、１２３ｍＭのヨードアセトアミド水溶液（１０μＬ）を加え、遮光して室温で１時間静置したのち、トリプシン４００ユニットを加え、３７℃で１時間静置した。９５℃で５分間加熱することでトリプシンを失活させた後、Ｎ-グリコシダーゼＦ（ロシュ・ダイアグノスティックス製，#11365193001）５ユニットを加え、３７℃で１６時間静置することで糖鎖を遊離させた。
　[実施例２]　ポリマー粒子への糖鎖担持
　得られた遊離糖鎖溶液２０μL（ＩｇＧ　１００μｇ相当）を、ポリマー粒子（住友ベークライト株式会社製、BS-45603）５ｍｇに添加し、２％酢酸を含むアセトニトリル１８０μＬを加えたのち、８０℃で１時間反応させ、乾固させた。２Ｍグアニジン塩酸塩溶液、水、メタノール、１％トリエチルアミン溶液にてポリマー粒子を洗浄後、１０％無水酢酸／メタノール溶液を添加し、室温で３０分間反応させヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、メタノールおよび水でポリマー粒子を洗浄した。　
[実施例３]　糖鎖再遊離
　上記で調製した糖鎖担持ポリマー粒子に、純水２０μＬ、２％酢酸を含むアセトニトリルを１８０μＬを加えたのち、８０℃で１時間反応させ、乾固させることにより、糖鎖をポリマー粒子から遊離させた。
　[実施例４]　メチル化試薬溶液の調製
　粒状の水酸化ナトリウム約１ｇを乳鉢にとり、乳棒ですみやかに粉砕した。これにＤＭＳＯ　１ｍＬを加えて混合し、スラリー状の溶液を調製した。この溶液１００μＬとヨードメタン（和光純薬工業製，#131-02661）１００μＬを混合し、メチル化試薬溶液を調製した。
　[実施例５]　糖鎖のメチル化
　上記、糖鎖再遊離後のポリマー粒子に、メチル化試薬溶液１００μＬを添加した。２５℃で１０分間静置し反応させた後、純水２００μＬを加えて反応を停止した。フィルトレーションにより溶液とポリマー粒子を分離し、溶液を回収した。溶液をサンプルチューブに移し、４００μＬのクロロホルムを加え、１分間撹拌することにより、メチル化された糖鎖をクロロホルム層に回収した。サンプルチューブを静置してクロロホルム層と水層を分離させたのち、クロロホルム層を別のサンプルチューブに回収した。これに純水８００μＬを加え、１分間撹拌することにより、クロロホルム層に含まれる水溶性不純物を除去した。サンプルチューブを静置してクロロホルム層と水層を分離させたのち、クロロホルム層を別のサンプルチューブに回収し、遠心乾燥機で乾燥させ、メチル化糖鎖を得た。
　[実施例６]　ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ　ＭＳ測定
　得られたメチル化糖鎖を１００μＬのメタノールに溶解させた。この溶液をマトリックス溶液（２，５－ジヒドロキシ安息香酸の１０ｍｇ/ｍＬ水溶液）で１０倍希釈し、うち１μＬを試料台にスポット、乾燥・結晶化させた。これをマトリックス支援レーザーイオン化－飛行時間型質量分析器（ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ　ＭＳ）（ブルカー・ダルトニクス社製'　autoflex　III'）により分析した。測定はポジティブイオン検出モード、リフレクトロンモードにて行った。
　得られたマススペクトルを（図１）に示す。スペクトルから得られた質量数対電荷比（m/z値）から糖鎖組成を推定した。糖鎖組成の推定は、ＧｌｙｃｏＭｏｄ　ｔｏｏｌ（http://www.expasy.org/tools/glycomod/）およびＧｌｙｃｏＳｕｉｔｅデータベース(http://glycosuitedb.expasy.org/glycosuite/glycodb)を使用して行った。推定した糖鎖の模式図を図１のマススペクトル中に示す。
　以上のように、試料糖鎖の水酸基をメチル化した上で、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ　ＭＳ測定を行うことにより、高い感度で試料糖鎖の定量的分析や構造解析が可能であることが示された。
　本発明の糖鎖分析法を用いると、生体試料、たとえば疾患患者の血清、組織などに含まれる糖タンパク質糖鎖の定量的分析（定量的プロファイリング）や構造解析を高い感度で行うことが可能となり、疾患マーカー糖鎖の探索や、薬剤投与時の糖鎖動態研究など、医療の分野での利用可能性がある。

Claims (2)

  1. 　生体試料に含まれる糖鎖を質量分析法により分析する方法であって、
    （ａ）生体試料から糖鎖を遊離する工程、
    （ｂ）遊離させた糖鎖を固相担体に捕捉する工程、
    （ｃ）捕捉した糖鎖を再遊離する工程、
    （ｄ）再遊離した糖鎖の水酸基をメチル化する工程、および
    （ｅ）メチル化した糖鎖を質量分析法により分析する工程、
    を含む方法。
  2. 　請求項１に記載の方法を実施するための、糖鎖の水酸基をメチル化するための試薬を含むキット。
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