WO2011083194A1 - Microorganismo heterotrofo termofilo de la especie bacteriana brevibacillus thermoruber y su uso para la producción de sulfatos - Google Patents
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
Definitions
- the present invention relates to a microorganism of the bacterial species Brevibacillus thermoruber with accession number CECT7629. It also refers to the use of a microorganism belonging to the bacterial species Brevibacillus thermoruber or a bacterial population comprising a microorganism of the species Brevibacillus thermoruber, for the production of sulfate, where sulfate preferably forms a precipitate, or to a specific method for Sulfate production Likewise, the present invention relates to the use of said microorganisms to consolidate and / or remedy an inert material by precipitated sulfate and to a specific method for the consolidation and / or remediation of said inert material.
- the present invention relates to a microorganism of the bacterial species Brevibacillus thermoruber with accession number CECT7629.
- the present invention also relates to the use of a microorganism belonging to the bacterial species Brevibacillus thermoruber or of a bacterial population comprising a microorganism of the species Brevibacillus thermoruber, for the production of sulfate, where sulfate preferably forms a precipitate or a method concrete for sulfate production.
- the present invention relates to the use of said microorganisms to consolidate and / or remedy an inert material by precipitated sulfate and to a specific method for the consolidation and / or remediation of said inert material.
- the present invention relates to the use of a strain of the species Brevibacillus thermoruber (thermophilic heterotrophic bacteria) capable of producing sulfates during their growth.
- Brevibacillus thermoruber thermophilic heterotrophic bacteria
- This bacterium grows optimally between 50 and 60 ° C, with maximum growth temperatures of about 75 ° C.
- the medium used for its growth is nutritious broth (defined in the examples section).
- the medium can be supplemented with calcium chloride to obtain calcium sulfate or gypsum as the final product.
- the proposed bacteria produce sulfates from the sulfur present in the organic nutrients of the medium and this process does not depend on inorganic sulfur compounds in the medium.
- the proposed bacterial strain produces sulfate concentrations greater than 1 mM in solution and this amount is considerably increased by supplementing the medium, for example, but not limited to, with calcium chloride and precipitating the sulfates in solution.
- the growth of this bacterium occurs in a maximum of about five days, depending on the temperature and nutrient conditions at which said growth takes place. Under optimal conditions, the proposed thermophilic bacterium can reach its maximum growth in one or two days. After growth, a water wash of the suspension of cells and nutrients provided can be carried out to eliminate as much as possible the remains of the treatment.
- the strain selected in the present invention can be used, for example, in the conservation of rocky materials, for example buildings and monuments, or in the compaction of disaggregated materials (such as sand or sandstone) or in the waterproofing of constructed surfaces.
- One aspect of the present invention relates to a microorganism of the bacterial species Brevibacillus thermoruber with accession number CECT7629. As shown in the examples of the present invention, sequencing of 903 nucleotides of the 16S rRNA gene resulted in 99% identity with other strains of this species when comparing said sequence with the available sequences of the public databases.
- strain CECT7629 of the present invention is: Kingdom: Bacteria I Division: Firmicutes I Class: Bacilli I Order: Bacillales I Family: Paenibacillaceae I Genus: Brevibacillus I Species: thermoruber.
- the strain CECT7629 is capable of growing in nutritious broth (per liter: Meat Extract, 3.0 g; Peptone, 5.0 g; pH 6.8-7.0. For solid medium 20 g of agar), at an optimum growth temperature of 55 ° C. The minimum and maximum growth temperatures are 40 ° C and 75 ° C, respectively.
- Another aspect of the present invention relates to a bacterial population comprising the microorganism with accession number CECT7629.
- the bacterial population may be formed by other strains of microorganisms belonging to the same or a different species.
- the bacterial population is a set of at least two cells at any stage of the developmental state, among which at least one is of the mentioned microorganism.
- the microorganism of the present invention can form spores, therefore, said microorganism can refer to both a sporulated and non-sporulated cell.
- Another aspect of the present invention relates to the use of a microorganism belonging to the bacterial species Brevibacillus thermoruber, or to the use of a bacterial population comprising a microorganism of the species Brevibacillus thermoruber, for the production of sulfate. That is, this aspect of the invention relates to the use of any strain of the bacterial species Brevibacillus thermoruber or to a population comprising any strain of the microorganism of the species Brevibacillus thermoruber, for the production of sulfate
- the bacterium of the present invention is capable of growing at the expense of the oxidation of organic compounds.
- organic compounds that contain sulfur, such as proteins (in the amino acids cysteine and methionine).
- Cofactors and coenzymes such as coenzyme A and its derivatives among others
- vitamins biotin, vitamin B1, lipoic acid
- DMSO dimethyl sulfoxide
- bacteria that oxidize reduced sulfur compounds usually oxidize hydrogen sulfide (H 2 S), elemental sulfur (S °) or thiosulfate (S 2 O3 2 ⁇ ), or any other reduced inorganic sulfur compound, producing sulfate as the final product:
- the reduced sulfur compounds of the present invention have organic origin since, as the inventors demonstrate, sulphate production is only observed when a medium comprising sulfur-containing organic compounds is added and not when sulfur-containing inorganic compounds are added.
- the sulfate produced by the bacterium of the present invention is the sulfate ion (S0 4 2 " ).
- a preferred embodiment refers to the use of the microorganism belonging to the bacterial species Brevibacillus thermoruber with access number CECT7629, or to the bacterial population comprising the bacterium Brevibacillus thermoruber CECT7629, for the production of sulfate.
- a more preferred embodiment of the present invention relates to the use of any microorganism or bacterial population of the invention, for the production of a precipitated sulfate, that is, to produce an insoluble sulfate salt.
- the insoluble precipitate of the present invention can be a sulfate anion (ion with two negative charges) attached to any divalent metal (cation with two positive charges) as for example, but not limited to Be, Mg, Ca, Sr, Ba, Ra, Zn, Cd, Al, Cu, Hg, Fe, Co, Ni, Sn, Pb, Pt, Cr or Mn, or attached to any other cation that produces total or partial insolubilization of the compound that is formed, such as Na + .
- the precipitated sulfate is calcium sulfate, although other options, but not limited to, are barium sulfate (Ba) and strontium sulfate (Sr).
- barium sulfate Ba
- strontium sulfate Sr
- the term "insoluble” used herein The invention refers to said precipitate sulfate not dissolving in aqueous solutions under ambient temperature conditions and at pH values between 4 and 9 which comprises the most common pH values that are usually found in natural substrates and in buildings or constructions.
- any microorganism of the present invention or “any microorganism of the invention” is used to refer to any strain of the bacterial species Brevibacillus thermoruber or the strain belonging to the bacterial species Brevibacillus thermoruber with access number CECT7629.
- the term "population of the present invention” or “population of the invention” refers to the bacterial population comprising any strain of the bacterial species Brevibacillus thermoruber or refers to a bacterial population comprising said species and / or the strain belonging to the bacterial species Brevibacillus thermoruber with accession number CECT7629.
- An even more preferred embodiment refers to the use of any of the microorganisms or the bacterial population of the present invention, to consolidate and / or remediate an inert material through the production of precipitated sulfate.
- inert material refers to material composed mostly of minerals.
- the inert material can have a natural origin, that is, it can be any type of rock, of any mineral composition, texture or structure, such as, but not limited to, calcite, aragonite, or gypsum. It can also be an artificial inert material, such as an inert material created for construction. According to a more preferred embodiment, the inert material is a construction material.
- the construction material referred to in the present invention may be, but is not limited to, brick, concrete, mortar, clay, pottery products (for example, but not limited to, tile, brick, porcelain, earthenware)
- Consolidate as understood in the present invention refers to giving firmness and solidity to an inert material.
- regularity refers to correcting, amending or remedying damage to an inert material.
- Another aspect of the present invention relates to a method for sulfate production comprising: a) inoculating a microorganism belonging to the bacterial species Brevibacillus thermoruber, or a bacterial population comprising a microorganism of the species Brevibacillus thermoruber in a medium of crop comprising organic nutrients with sulfur, and
- step (b) incubate the culture of step (a) at a temperature between 40 ° C and 75 ° C.
- a preferred embodiment of the invention relates to the method for sulfate production, where the microorganism belonging to the bacterial species Brevibacillus thermoruber is the bacterium with accession number CECT7629, or the bacterial population is the population comprising the bacterium Brevibacillus thermoruber CECT7629 .
- Another preferred embodiment of the present invention relates to the method for sulfate production, where the incubation of step (b) is carried out at a temperature between 50 ° C and 60 ° C.
- Another more preferred embodiment refers to the method for the production of a precipitated sulfate which comprises the steps of any previous method for the production of sulfate, wherein in addition the culture medium comprises a salt whose cation joins the sulfate anion (SO 4 2 ⁇ ), forming a precipitated sulfate.
- Another even more preferred embodiment of the present invention relates to any previous method for sulfate production, where the salt cation is calcium, that is, the precipitated sulfate is calcium sulfate.
- Other salts Preferred are barium sulfate and strontium sulfate as they are insoluble in water.
- Another aspect of the present invention relates to a method for consolidating and / or remediating a material, comprising the steps of the sulfate production method of the present invention where the culture medium comprises a salt whose cation joins the sulfate anion ( SO 4 2 ⁇ ), forming a sulfate precipitated under ambient temperature conditions, or the method where the salt is calcium chloride, where in addition the microorganism or bacterial population of the present invention is contacted with said material.
- ambient temperature refers to the temperature that can be found at any time of the day, at any month of the year, in the environment in which the inert material to which it has been found is located. referenced in the present invention.
- Calcium sulfate is very poorly soluble at room temperature. Although the main form changes from plaster to anhydrite with a tipping point around 54 ° C. Calcium sulfate has an abnormal behavior in terms of its solubility and the effect of temperature and pH. The pH practically does not affect its solubility at values between 4 and 9.
- a preferred embodiment refers to the method for consolidating and / or remediating a material, which further comprises removing the microorganism and / or nutrients from the culture medium, present in said material.
- the elimination of the microorganisms and the culture medium, or the microorganisms or the culture medium, present in said material can be carried out by any method known in the state of the art such as, for example, but not limited, by washing of said material with an aqueous solution.
- the washing of said material can be carried out by an aqueous solution that can comprise at least one antimicrobial agent.
- FIG. 1 It shows the production of sulfates by different genera and bacterial cultures and the comparison of thermophilic bacteria that grow at 50 ° C and mesophilic that grow at 25 ° C.
- the bacteria shown in this graph belong to the following genera: 1: Paenibacillus (Firmicutes) / 2: Klebsiella (Proteobacteria gamma) / 3: Cellulomonas (Actinobacteria) / 4: Streptomyces (Actinobacteria) / 5: Neocosmopora (Fungus) / 6: Enterobacter (Proteobacteria gamma) / 7: Bacillus (Firmicutes) / 8: Geobacillus (Firmicutes) / 9: Geobacillus (Firmicutes) / 10: Brevibacillus (Firmicutes) / 1 1: Geobacillus (Firmicutes).
- the nutrient broth concentration shown refers to the culture broth whose composition has been shown in examples (1), a culture broth with twice the concentration of each of the components as medium 1 (2) and a broth of culture with a concentration 10 times lower of each of the components than medium 1 (0,1).
- the bacteria shown in this graph belong to the following genera: 7: Bacillus (Firmicutes) / 8: Geobacillus (Firmicutes) / 9: Geobacillus (Firmicutes) / 10: Brevibacillus (Firmicutes) / 11: Geobacillus (Firmicutes).
- EXAMPLE 1 Isolation and identification of sulfate producing strains.
- thermophilic bacterial strains 1.1. Isolation and identification of thermophilic bacterial strains.
- Soil samples from the provinces of Teruel and Seville were processed for the isolation of bacteria with growth capacity either at 25 ° C or 50 ° C, corresponding to the growth ranges of mesophilic and thermophilic bacteria, respectively.
- the cultures were prepared in nutrient agar (3 g of meat extract, 5 g of peptone and 20 g of agar brought to a volume of 1 L with water. The pH was adjusted to 7.0 and autoclaved), inoculated with the natural sample and incubated at the selected temperature.
- the colonies obtained were plaque isolated and identified by sequencing their 16S rRNA genes following standard procedures previously described (González et al. 2003).
- the amplification conditions consist of a step at 95 ° C of 3 minutes, followed by 35 cycles with steps of 95 ° C 15 seconds, 55 ° C 15 seconds and 72 ° C 1 minute, using ExTaq DNA polymerase (Takara, Japan ).
- the amplification products were purified with the PCR product purification kit (JetQuick, Germany) and sent to the sequencing service of the Secugen company (Madrid).
- the sequences obtained were edited with the Chromas software and the sequence in fasta format was sent for comparison in the DNA databases with the Blastn program in the National Center for Biotechnology Information
- the isolated bacteria were used in experiments in which sulfate production was determined for each of said cultures.
- the isolated strains were inoculated in sterile flasks with nutrient broth and incubated at their optimum growth temperature (25 or 50 ° C). Throughout the incubation time, specifically in the exponential and stationary growth phases of each strain, the sulfate concentration in the medium was measured. The procedure for estimating sulfate concentration is that described by Kolmet et al. (Kolmet et al., 2000. J. Microbiol. Meth., 41: 179-184). Sulfate production was estimated as the difference between the calculated concentration and its initial concentration.
- the temperature range that allows the growth of the isolated strains was determined by incubating the cultures corresponding to different temperatures in thermostated incubators with stirring (150 rpm) and calculating the growth rate at each of those temperatures based on absorbance measures (at 600 nm) of cell suspensions.
- absorbance measures at 600 nm
- experiments were performed as described but in cultures with concentrations of a nutrient broth concentrated twice (2), at standard concentration (1) and diluted ten times (0, 1) (FIG. 2).
- the level of bacterial growth in these cultures at different concentrations of nutrients was monitored by determining the amount of bacterial protein following the method of Bradford (BioRad Protein Assay kit).
- thermophilic bacteria have resulted in increases in sulfate concentration during their growth. These results are shown in FIG. 1. The strains tested are shown in Table 1. Among the sulphate producing thermophilic bacteria, the strain of the present invention of the species Brevibacillus thermoruber with deposit No. CECT7629 stands out.
- the sulfate produced came from sulfur contained in organic compounds, such as proteins and their amino acids (Cysteine and Methionine), coenzymes (such as coenzyme A and its derivatives), and vitamins (biotin, thiamine, vitamin B1, lipoic acid) among other compounds.
- organic compounds such as proteins and their amino acids (Cysteine and Methionine), coenzymes (such as coenzyme A and its derivatives), and vitamins (biotin, thiamine, vitamin B1, lipoic acid) among other compounds.
- the strains studied showed no growth, so their growth is heterotrophic.
- the Sulfate production was proportional to the concentration of organic nutrients present in the culture as seen in FIG. 2.
- the strain described with No. 10 that is, the strain selected from the present invention belonging to the species Brevibacillus thermoruber with deposit No. CECT7629 has a sulphate production significantly higher than the sulfate production of mesophilic bacteria strains (whose optimum growth temperature is 25 ° C) and, even more important, whose sulfate production is significantly higher than that of other strains of thermophilic bacteria (whose optimum growth temperature is between 50 and 60 ° C) belonging to the genera Bacillus and Geobacillus, but that share the same "Phylum" with the strain of Brevibacillus thermoruber.
- FIG. 2 it is observed how the production of sulfates (A) and bacterial growth (B) in relation to the concentration of organic nutrients (different concentrations of nutrient broth) is significantly higher with the strain Brevibacillus thermoruber with deposit number CECT7629 selected here invention.
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Abstract
La presente invención se refiere a un microorganismo de la especie bacteriana Brevibacillus thermoruber con número de acceso CECT7629. También se refiere al uso de un microorganismo que pertenece a la especie bacteriana Brevibacillus thermoruber o de una población bacteriana que comprende un microorganismo de la especie Brevibacillus thermoruber, para la producción de sulfato, donde preferiblemente el sulfato forma un precipitado, o a un método concreto para la producción de sulfato. Asimismo, la presente invención se refiere al uso de dichos microorganismos para consolidar y/o remediar un material inerte mediante el sulfato precipitado y a un método concreto para la consolidación y/o remediación de dicho material inerte.
Description
MICROORGANISMO HETERÓTROFO TERMÓFILO DE LA ESPECIE BACTERIANA BREVIBA CILL US THERMORUBER Y SU USO PARA LA
PRODUCCIÓN DE SULFATOS
La presente invención se refiere a un microorganismo de la especie bacteriana Brevibacillus thermoruber con número de acceso CECT7629. También se refiere al uso de un microorganismo que pertenece a la especie bacteriana Brevibacillus thermoruber o de una población bacteriana que comprende un microorganismo de la especie Brevibacillus thermoruber, para la producción de sulfato, donde preferiblemente el sulfato forma un precipitado, o a un método concreto para la producción de sulfato. Asimismo, la presente invención se refiere al uso de dichos microorganismos para consolidar y/o remediar un material inerte mediante el sulfato precipitado y a un método concreto para la consolidación y/o remediación de dicho material inerte.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Frente al deterioro de materiales rocosos, por ejemplo edificios y monumentos, se ha propuesto que podrían ser útil diversos mecanismos de compactacion de materiales disgregados (como por ejemplo, arenas o areniscas) o la impermeabilización de superficies construidas es de importancia para consolidar estructuras y materiales o evitar un progresivo deterioro de superficies y edificios. En este sentido, son conocidos diversos procedimientos para la consolidación de piedras de construcción o superficies de materiales usando bacterias calcinogénicas productoras de CaCÜ3 como es el caso de los géneros Micrococcus y Bacillus para el refuerzo de piedra por precipitación y formación de cristales de CaCÜ3 (Tiano et al., 1999. Journal of Microbiological Methods, 36 [1-2]: 139-145), por biomineralización bacteriana usando bacterias productoras de carbonatos, como Myxococcus xanthus, que producen la precipitación de carbonato cálcico en la piedra (Jiménez-López et al., 2007. Chemosphere, 68 [10]: 1929-1936) o un procedimiento de protección y/o
tratamiento de superficies artificiales por revestimiento de la superficie, preferiblemente roca calcárea, mediante la incrustación de carbonatos de calcio llevada a cabo por microorganismos, preferiblemente de los géneros Bacillus o Pseudomonas (ES2064673 T3).
Uno de los inconvenientes del uso de carbonatos es que la precipitación y disolución de los mismos depende del pH, por tanto, agua de lluvia (generalmente con un pH ácido, por debajo de 7) puede dar lugar a la disolución de esos precipitados. Esto es lo que ocurre en muchos monumentos y edificios debido al lavado o disolución de minerales. Además, las bacterias propuestas para la remediación de dichos materiales son capaces de crecer a temperaturas ambientales lo que podría originar consecuencias secundarias como resultado de su crecimiento posterior.
También es conocido el uso de especies del género Pseudomonas en procesos de restauración como frescos o monumentos (Ranalli et al., 2005. Journal of Applied Microbiology, 98: 73-83) o utilizando la enzima Proteasa purificada de dicha bacteria. En dicha publicación, Ranalli et al., propusieron eliminar compuestos orgánicos (pegamentos, por ejemplo, utilizando Pseudomonas).
Por tanto, existe la necesidad de compactar materiales excesivamente porosos, remediar materiales que tras erosión o disolución hayan perdido parte de sus componentes minerales, así como impermeabilizar los substratos, superficies, o edificios, entre otras estructuras, por medio de un procedimiento biológico que solucione el problema planteado sin generar efectos derivados, es decir, evitando el crecimiento posterior de los microorganismos así como la disolución de los complejos precipitados.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un microorganismo de la especie bacteriana Brevibacillus thermoruber con número de acceso CECT7629. La presente invención también se refiere al uso de un microorganismo que pertenece a la especie bacteriana Brevibacillus thermoruber o de una población bacteriana que comprende un microorganismo de la especie Brevibacillus thermoruber, para la producción de sulfato, donde preferiblemente el sulfato forma un precipitado o a un método concreto para la producción de sulfato. Asimismo, la presente invención se refiere al uso de dichos microorganismos para consolidar y/o remediar un material inerte mediante el sulfato precipitado y a un método concreto para la consolidación y/o remediación de dicho material inerte.
La presente invención se refiere al uso de una cepa de la especie Brevibacillus thermoruber (bacteria heterótrofa termófila) capaz de producir sulfatos durante su crecimiento. Aunque los inventores han observado la existencia de especies bacterianas que presentan esas propiedades, han seleccionado la cepa Brevibacillus thermoruber CECT7629 porque produce cantidades de sulfatos en una concentración más alta que el resto de cepas ensayadas o conocidas en el estado de la técnica. Esta bacteria crece óptimamente entre 50 y 60°C, con temperaturas máximas de crecimiento de unos 75°C. El medio empleado para su crecimiento es caldo nutritivo (definido en el apartado de ejemplos). Para obtener sulfatos precipitados se puede complementar el medio con cloruro de calcio para obtener sulfato de calcio o yeso como producto final. Las bacterias propuestas producen sulfatos a partir del azufre presente en los nutrientes orgánicos del medio y este proceso no depende de compuestos inorgánicos de azufre en el medio.
La cepa bacteriana propuesta produce concentraciones de sulfatos superiores a 1 mM en solución y esta cantidad se aumenta considerablemente al complementar el medio, por ejemplo, pero sin limitarse, con cloruro de calcio y precipitar los sulfatos en solución. El crecimiento de esta bacteria se produce
en un máximo de unos cinco días, dependiendo de las condiciones de temperatura y nutrientes a que se lleva a cabo dicho crecimiento. En condiciones óptimas, la bacteria termófila propuesta puede alcanzar su máximo crecimiento en uno o dos días. Tras el crecimiento, se puede llevar a cabo un lavado con agua de la suspensión de células y nutrientes proporcionados para eliminar en lo posible los restos del tratamiento.
La cepa seleccionada en la presente invención puede usarse, por ejemplo, en la conservación de materiales rocosos, por ejemplo edificios y monumentos, o en la compactacion de materiales disgregados (como por ejemplo, arenas o areniscas) o en la impermeabilización de superficies construidas.
Un aspecto de la presente invención se refiere a un microorganismo de la especie bacteriana Brevibacillus thermoruber con número de acceso CECT7629. Tal como se muestra en los ejemplos de la presente invención, la secuenciación de 903 nucleótidos del gen 16S rRNA dió como resultado un 99% de identidad con otras cepas de esta especie al comparar dicha secuencia con las secuencias disponibles de las bases de datos públicas.
La clasificación científica de la cepa CECT7629 de la presente invención es: Reino: Bacteria I División: Firmicutes I Clase: Bacilli I Orden: Bacillales I Familia: Paenibacillaceae I Género: Brevibacillus I Especie: thermoruber.
Dicho microorganismo ha sido depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) el 27 de noviembre de 2009 y le correspondió el n° de depósito CECT7629. La dirección de dicha Autoridad Internacional de depósito es: Universidad de Valencia / Edificio de investigación / Campus de Burjassot / 46100 Burjassot (Valencia).
La cepa CECT7629 es capaz de crecer en caldo nutritivo (por litro: Extracto de Carne, 3,0 g; Peptona, 5,0 g; pH 6,8-7,0. Para medio sólido se añaden 20 g de
agar), a una temperatura óptima de crecimiento de 55°C. Las temperaturas mínima y máxima de crecimiento son 40°C y 75°C, respectivamente.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una población bacteriana que comprende el microorganismo con número de acceso CECT7629. La población bacteriana puede estar formada por otras cepas de microorganismos pertenecientes a la misma especie o a una especie distinta. La población bacteriana es un conjunto de al menos dos células en cualquier fase del estado de desarrollo, entre las cuales al menos una es del microorganismo mencionado. El microorganismo de la presente invención puede formar esporas, por tanto, dicho microorganismo puede referirse tanto a una célula esporulada como no esporulada.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un microorganismo que pertenece a la especie bacteriana Brevibacillus thermoruber, o al uso de una población bacteriana que comprende un microorganismo de la especie Brevibacillus thermoruber, para la producción de sulfato. Es decir, este aspecto de la invención se refiere al uso de cualquier cepa de la especie bacteriana Brevibacillus thermoruber o a una población que comprenda cualquier cepa del microorganismo de la especie Brevibacillus thermoruber, para la producción de sulfato
La bacteria de la presente invención es capaz de crecer a expensas de la oxidación de compuestos orgánicos. Existen distintos compuestos orgánicos que contienen azufre, como por ejemplo, las proteínas (en los aminoácidos cisteina y metionina). Cofactores y coenzimas (como la coenzima A y sus derivados entre otros), vitaminas (biotina, vitamina B1 , ácido lipoico), o una variedad de compuestos encontrados en la naturaleza como DMSO (sulfóxido de dimetilo) o ácidos húmicos entre otros muchos. En estudios previos, las bacterias que oxidan compuestos reducidos del azufre suelen oxidar comúnmente ácido sulfhídrico (H2S), azufre elemental (S°) o tiosulfato (S2O32~),
o cualquier otro compuesto inorgánico reducido del azufre, produciendo sulfato como producto final:
S2" + 2 02 S04 2"
S° + 2 H20 + 1/2 02 S04 2" + 2 H+
S2O32" + H20 + 2 02 2 S04 2" + 2 H+
Los compuestos reducidos del azufre de la presente invención tienen origen orgánico ya que, como demuestran los inventores, sólo se observa producción de sulfatos cuando se añade un medio que comprende compuestos orgánicos que contengan azufre y no cuando se añaden compuestos inorgánicos que contienen azufre.
Por tanto, el sulfato producido por la bacteria de la presente invención es el ión sulfato (S04 2").
Una realización preferida se refiere al uso del microorganismo que pertenece a la especie bacteriana Brevibacillus thermoruber con número de acceso CECT7629, o a la población bacteriana que comprende la bacteria Brevibacillus thermoruber CECT7629, para la producción de sulfato.
Una realización más preferida de la presente invención se refiere al uso de cualquier microorganismo o de la población bacteriana de la invención, para la producción de un sulfato precipitado, es decir, para producir una sal insoluble de sulfato. El precipitado insoluble de la presente invención puede ser un anión sulfato (ión con dos cargas negativas) unido a cualquier metal divalente (catión con dos cargas positivas) como por ejemplo, pero sin limitarse Be, Mg, Ca, Sr, Ba, Ra, Zn, Cd, Al, Cu, Hg, Fe, Co, Ni, Sn, Pb, Pt, Cr o Mn, o unido a cualquier otro catión que produzca la insolubilización total o parcial del compuesto que se forma, como por ejemplo el Na+. Generalmente, el sulfato precipitado es sulfato de calcio, aunque otras opciones, pero sin limitarse, son el sulfato de bario (Ba) y el sulfato de estroncio (Sr). El término "insoluble" empleado en la presente
invención se refiere a que dicho sulfato precipitado no se disuelve en soluciones acuosas en condiciones de temperatura ambiente y a valores de pH entre 4 y 9 que comprende los valores más comunes de pH que suelen encontrarse en substratos naturales y en edificios o construcciones.
En la presente invención se usa el término "cualquier microorganismo de la presente invención" o "cualquier microorganismo de la invención" para referirse a cualquier cepa de la especie bacteriana Brevibacillus thermoruber o a la cepa que pertenece a la especie bacteriana Brevibacillus thermoruber con número de acceso CECT7629.
Asimismo, el término "población de la presente invención" o "población de la invención" se refiere a la población bacteriana que comprende cualquier cepa de la especie bacteriana Brevibacillus thermoruber o se refiere a una población bacteriana que comprende a dicha especie y/o a la cepa que pertenece a la especie bacteriana Brevibacillus thermoruber con número de acceso CECT7629.
Una realización aún más preferida se refiere al uso de cualquiera de los microorganismos o de la población bacteriana de la presente invención, para consolidar y/o remediar un material inerte por medio de la producción de sulfato precipitado. El término "material inerte" tal como se entiende en la presente invención se refiere a material compuesto en su mayor parte por minerales. El material inerte puede tener procedencia natural, es decir, puede ser cualquier tipo de roca, de cualquier composición mineral, textura o estructura, como por ejemplo, pero sin que sirva para limitarse, calcita, aragonito, o yesos. También puede ser un material inerte artificial, como por ejemplo un material inerte creado para la construcción. Según una realización más preferida el material inerte es un material de construcción. El material de construcción al que se hace referencia en la presente invención puede ser, pero sin limitarse, ladrillo, hormigón, mortero, arcilla, productos de alfarería (por ejemplo pero sin limitarse, teja, ladrillo, porcelana, loza)
El término "consolidar" tal como se entiende en la presente invención se refiere a dar firmeza y solidez a un material inerte. El término "remediar" se refiere a corregir, enmendar o poner remedio a un daño de un material inerte.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para la producción de sulfato que comprende: a) inocular un microorganismo que pertenece a la especie bacteriana Brevibacillus thermoruber, o de una población bacteriana que comprende un microorganismo de la especie Brevibacillus thermoruber en un medio de cultivo que comprende nutrientes orgánicos con azufre, e
b) incubar el cultivo del paso (a) a una temperatura de entre 40°C y 75°C.
Una realización preferida de la invención se refiere al método para la producción de sulfato, donde el microorganismo que pertenece a la especie bacteriana Brevibacillus thermoruber es la bacteria con número de acceso CECT7629, o la población bacteriana es la población que comprende la bacteria Brevibacillus thermoruber CECT7629.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere al método para la producción de sulfato, donde la incubación del paso (b) se lleva a cabo a una temperatura de entre 50°C y 60°C.
Otra realización más preferida se refiere al método para la producción de un sulfato precipitado que comprende los pasos de cualquier método anterior para la producción de sulfato, donde además el medio de cultivo comprende una sal cuyo catión se una al anión sulfato (SO4 2~), formando un sulfato precipitado.
Otra realización aún más preferida de la presente invención se refiere a cualquier método anterior para la producción de sulfato, donde el catión de la sal es calcio, es decir, el sulfato precipitado es sulfato de calcio. Otras sales
preferidas son el sulfato de bario y el sulfato de estroncio ya que son insolubles en agua.
En adelante se podrá hacer referencia a cualquier método para la producción de sulfato mediante el término "método de producción de sulfatos de la presente invención" o "método de producción de sulfatos de la invención",
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para consolidar y/o remediar un material, que comprende los pasos del método de producción de sulfatos de la presente invención donde el medio de cultivo comprende una sal cuyo catión se una al anión sulfato (SO4 2~), formando un sulfato precipitado en condiciones de temperatura ambiental, o el método donde la sal es cloruro de calcio, donde además el microorganismo o la población bacteriana de la presente invención se pone en contacto con dicho material. El término "temperatura ambiental" tal como se entiende en la presente invención se refiere a la temperatura que se puede encontrar en cualquier momento del día, en cualquier mes del año, en el ambiente en el que se encuentre el material inerte al que se ha hecho referencia en la presente invención.. El sulfato de calcio es muy poco soluble a temperatura ambiental. Aunque la forma principal cambia de yeso a anhidrita con un punto de inflexión alrededor de los 54°C. El sulfato de calcio tiene un comportamiento anormal en cuanto a su solubilidad y el efecto de la temperatura y pH. El pH, prácticamente no afecta su solubilidad a valores entre 4 y 9.
Una realización preferida se refiere al método para consolidar y/o remediar un material, que además comprende eliminar el microorganismo y/o nutrientes del medio de cultivo, presentes en dicho material. La eliminación de los microorganismos y del medio de cultivo, o de los microorganismos o del medio de cultivo, presentes en dicho material se puede llevar a cabo mediante cualquier método conocido en el estado de la técnica como por ejemplo, pero sin limitarse, mediante lavado de dicho material con una solución acuosa.
Además, el lavado de dicho material puede llevarse a cabo mediante una solución acuosa que puede comprender al menos un agente antimicrobiano.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Con la intención de complementar la descripción que se ha llevado a cabo, así como de ayudar a un mejor entendimiento de las características de la invención, de acuerdo con algunos ejemplos realizados, se muestran aquí, con carácter ilustrativo y no limitante, las siguientes figuras:
FIG. 1. Muestra la producción de sulfatos por distintos géneros y cultivos bacterianos y la comparación de las bacterias termófilas que crecen a 50°C y mesófilas que crecen a 25°C.
Las bacterias mostradas en dicha gráfica pertenecen a los siguientes géneros: 1 : Paenibacillus (Firmicutes) / 2: Klebsiella (Proteobacteria gamma) / 3: Cellulomonas (Actinobacteria) / 4: Streptomyces (Actinobacteria) / 5: Neocosmopora (Hongo) / 6: Enterobacter (Proteobacteria gamma) / 7: Bacillus (Firmicutes) / 8: Geobacillus (Firmicutes) / 9: Geobacillus (Firmicutes) / 10: Brevibacillus (Firmicutes) / 1 1 : Geobacillus (Firmicutes).
FIG. 2. Muestra la producción de sulfatos (A) y crecimiento bacteriano (B) en relación con la concentración de nutrientes orgánicos (distintas concentraciones de caldo nutritivo) por distintos géneros y cultivos bacterianos termófilos que crecen a 50°C.
La concentración de caldo nutritivo mostrada hace referencia al caldo de cultivo cuya composición se ha mostrado en los ejemplos (1 ), a un caldo de cultivo con el doble de concentración de cada uno de los componentes que el medio 1 (2) y a un caldo de cultivo con una concentración 10 veces menor de cada uno de los componentes que el medio 1 (0,1 ).
Las bacterias mostradas en dicha gráfica pertenecen a los siguientes géneros: 7: Bacillus (Firmicutes) / 8: Geobacillus (Firmicutes) / 9: Geobacillus (Firmicutes) / 10: Brevibacillus (Firmicutes) / 11 : Geobacillus (Firmicutes).
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos ilustrativos y de carácter no limitante, realizados por los inventores que describen el aislamiento e identificación de las cepas de la presente invención así como su capacidad para la producción de sulfatos.
EJEMPLO 1. Aislamiento e identificación de cepas productoras de sulfatos.
1.1. Aislamiento e identificación de cepas bacterianas termófilas.
Muestras de suelos de las provincias de Teruel y Sevilla se procesaron para el aislamiento de bacterias con capacidad de crecimiento bien a 25°C bien a 50°C, correspondiendo a los rangos de crecimiento de bacterias mesófilas y termófilas, respectivamente. Los cultivos se prepararon en agar nutritivo (3 g de
extracto de carne, 5 g de peptona y 20 g de agar llevado hasta un volumen de 1 L con agua. Se ajustó el pH a 7.0 y se esterilizó en autoclave), se inocularon con la muestra natural e incubaron a la temperatura seleccionada.
Las colonias obtenidas se aislaron en placa y se identificaron por secuenciación de sus genes 16S rRNA siguiendo procedimientos estándar previamente descritos (González et al. 2003).
Para identificar las cepas bacterianas aisladas, éstas se cultivaron en caldo nutritivo (3 g de extracto de carne y 5 g de peptona llevado hasta un volumen de 1 L con agua. Se ajustó el pH a 7.0 y se esterilizó en autoclave) se centrifugaron en un tubo eppendorf (1 .5 mi) y se descartó el sobrenadante. Las células se lisaron y su ADN genómico se extrajo utilizando el kit de purificación de ADN NucleospinFood (Mackerey-Nügel, Alemania). El ADN obtenido se utilizó directamente como ADN molde en una reacción de PCR (Polymerase Chain Reaction) para amplificar un fragmento del gen ARNr 16S. Los cebadores utilizados fueron el 616F (SEQ ID NO: 1 ) y 907R (SEQ ID NO: 2). Las condiciones de amplificación consisten en un paso a 95°C de 3 minutos, seguido de 35 ciclos con pasos de 95°C 15 segundos, 55°C 15 segundos y 72°C 1 minuto, utilizando la ADN polimerasa ExTaq (Takara, Japón). Los productos de amplificación se purificaron con el kit de purificación de productos de PCR (JetQuick, Alemania) y se enviaron al servicio de secuenciación de la empresa Secugen (Madrid). Las secuencias obtenidas se editaron con el software Chromas y la secuencia en formato fasta se envió para su comparación en las bases de datos de ADN con el programa Blastn en el National Center for Biotechnology Information
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/).
El fragmento obtenido mediante la reacción PCR descrita, perteneciente a la cepa CECT7629 de la presente invención, se secuenció, obteniendo una secuencia de 903 nucleótidos del gen que codifica para el 16S rRNA cuya secuencia se facilita en la lista de secuencias adjunta como SEQ ID NO: 3.
Dicho fragmento tiene un 99% identidad con otras cepas pertenecientes a la especie Brevibacillus thermoruber.
1.2. Producción de sulfatos de las cepas bacterianas.
Las bacterias aisladas se utilizaron en experimentos en los que se determinó la producción de sulfatos por cada uno de dichos cultivos. Las cepas aisladas se inocularon en matraces estériles con caldo nutritivo y se incubaron a su temperatura óptima de crecimiento (25 o 50°C). A lo largo del tiempo de incubación, específicamente en las fases exponencial y estacionaria de crecimiento de cada cepa, se midió la concentración de sulfatos en el medio. El procedimiento para estimar la concentración de sulfatos es el descrito por Kolmet et al. (Kolmet et al., 2000. J. Microbiol. Meth., 41 : 179-184). La producción de sulfato se estimó como la diferencia entre la concentración calculada y su concentración inicial.
El rango de temperaturas que permite el crecimiento de las cepas aisladas se determinó incubando los cultivos correspondientes a distintas temperaturas en incubadores termostatizados con agitación (150 rpm) y calculando la tasa de crecimiento a cada una de esas temperaturas basándose en medidas de absorbancia (a 600 nm) de las suspensiones celulares. Con objeto de verificar la producción de sulfato a distintas concentraciones de nutrientes, se realizaron experimentos como se ha descrito pero en cultivos con concentraciones de un caldo nutritivo concentrado dos veces (2), a concentración estándar (1 ) y diluido diez veces (0,1 ) (FIG. 2). El nivel de crecimiento bacteriano en estos cultivos a distinta concentración de nutrientes se monitorizó determinando la cantidad de proteína bacteriana siguiendo el método de Bradford (BioRad Protein Assay kit). Las temperaturas se determinaron con un termómetro digital equipado con un termopar-K (Hanna Instruments, Ann Arbor, Michigan, USA). Las diferencias entre tratamientos se determinaron con test ANOVA (Sokal y Rohlf, 1981 . Biometry. Freeman WH & Co, New York).
Mientras que la producción de sulfato fue insignificante por parte de bacterias mesófilas, las bacterias termófilas han dado lugar a aumentos en la concentración de sulfatos durante su crecimiento. Estos resultados se muestran en la FIG.1 . Las cepas ensayadas se muestran en la Tabla 1 . Entre las bacterias termófilas productoras de sulfato destaca la cepa de la presente invención de la especie Brevibacillus thermoruber con n° de depósito CECT7629.
Tabla 1. Cepas utilizadas en la presente invención. Entre paréntesis se muestra la división bacteriana a la que pertenece cada una de las bacterias:
Tal como fue demostrado por los inventores, el sulfato producido procedía del azufre contenido en compuestos orgánicos, tales como las proteínas y sus aminoácidos (Cisteína y Metionina), coenzimas (como la coenzima A y sus derivados), y vitaminas (biotina, tiamina, vitamina B1 , ácido lipoico) entre otros compuestos. En ausencia de nutrientes orgánicos, las cepas estudiadas no mostraban crecimiento, por lo que su crecimiento es heterotrófico. La
producción de sulfato fue proporcional a la concentración de nutrientes orgánicos presentes en el cultivo tal y como se observa en la FIG. 2.
Tal como puede observarse en la FIG. 1 , la cepa reseñada con el n° 10, es decir, la cepa seleccionada de la presente invención perteneciente a la especie Brevibacillus thermoruber con n° de depósito CECT7629 presenta una producción de sulfatos significativamente superior a la producción de sulfatos de cepas de bacterias mesófilas (cuya temperatura óptima de crecimiento es de 25°C) y, todavía más importante, cuya producción de sulfato es significativamente superior a la de otras cepas de bacterias termófilas (cuya temperatura óptima de crecimiento está entre 50 y 60°C) pertenecientes a los géneros Bacillus y Geobacillus, pero que comparten el mismo "Filo" con la cepa de Brevibacillus thermoruber.
En la FIG. 2 se observa cómo la producción de sulfatos (A) y crecimiento bacteriano (B) en relación con la concentración de nutrientes orgánicos (distintas concentraciones de caldo nutritivo) es significativamente superior con la cepa Brevibacillus thermoruber con n° de depósito CECT7629 seleccionada en la presente invención.
Claims
1. Microorganismo de la especie bacteriana Brevibacillus thermoruber con número de acceso CECT7629.
2. Población bacteriana que comprende el microorganismo según la reivindicación 1 .
3. Uso de un microorganismo que pertenece a la especie bacteriana Brevibacillus thermoruber o de una población bacteriana que comprende un microorganismo de la especie Brevibacillus thermoruber, para la producción de sulfato.
4. Uso según la reivindicación 3, donde el microorganismo es la bacteria según la reivindicación 1 , o la población bacteriana es la población según la reivindicación 2.
5. Uso del microorganismo o de la población según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, donde el sulfato forma un precipitado.
6. Uso del microorganismo o de la población según la reivindicación 5 para consolidar y/o remediar un material inerte.
7. Uso del microorganismo o de la población según la reivindicación 6, donde el material inerte es un material de construcción.
8. Método para la producción de sulfato que comprende: a) inocular un microorganismo que pertenece a la especie bacteriana Brevibacillus thermoruber, o de una población bacteriana que comprende un microorganismo de la especie Brevibacillus thermoruber en un medio de cultivo que comprende nutrientes orgánicos con azufre, e
b) incubar el cultivo del paso (a) a una temperatura de entre 40°C y 75°C,
9. Método para la producción de sulfato según la reivindicación 8, donde el microorganismo es la bacteria según la reivindicación 1 , o la población bacteriana es la población según la reivindicación 2.
10. Método para la producción de sulfato según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, donde la incubación del paso (b) se lleva a cabo a una temperatura de entre 50°C y 60°C.
11 . Método para la producción de un sulfato precipitado que comprende los pasos del método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde además el medio de cultivo comprende una sal cuyo catión se une al anión sulfato, formando un sulfato precipitado.
12. Método para la producción de un sulfato precipitado según la reivindicación 1 1 , donde el catión de la sal es calcio.
13. Método para consolidar y/o remediar un material inerte, que comprende los pasos del método según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, donde el microorganismo se pone en contacto con dicho material.
14. Método según la reivindicación 13, que además comprende eliminar el microorganismo y/o nutrientes del medio de cultivo, presentes en dicho material inerte.
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