WO2011068136A1 - ガングリオシドgd3に特異的に結合する抗体を含む医薬 - Google Patents

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WO2011068136A1
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antibody
amino acid
seq
therapeutic
acid sequence
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PCT/JP2010/071519
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English (en)
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真美 小山
光男 佐藤
茂 飯田
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協和発酵キリン株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic or prophylactic agent for bacterial infection containing an antibody that specifically binds to ganglioside GD3 as an active ingredient.
  • Ganglioside which is a kind of glycolipid having sialic acid, constitutes the cell membrane of animals, and is a molecule composed of a sugar chain that is a hydrophilic side chain, and sphingosine and a fatty acid that are hydrophobic side chains.
  • the type and expression level of ganglioside varies depending on the cell type, organ type, and animal type. It is also known that the expression of ganglioside changes quantitatively and qualitatively in the process of canceration of cells. (Non-patent document 1).
  • gangliosides GD2, GD3, GM2, etc. which are rarely found in normal cells, are expressed in neuroblastoma, small cell lung cancer and melanoma, which are said to be highly malignant.
  • Non-Patent Documents 2 to 7 antibodies against gangliosides specific for such tumor cells are considered useful for the treatment of various human cancers.
  • Antibodies that specifically bind to ganglioside GD3 include human chimeric antibodies and anti-GD3 antibodies that are human CDR-grafted antibodies (Patent Document 1), high antibody-dependent cytotoxicity An anti-GD3 antibody (Patent Document 2) having activity (hereinafter sometimes abbreviated as ADCC activity) is known.
  • GD3 ganglioside GD3
  • Patent Document 1 high antibody-dependent cytotoxicity
  • An anti-GD3 antibody (Patent Document 2) having activity hereinafter sometimes abbreviated as ADCC activity
  • Typical drug-resistant bacteria include the gram-positive bacteria penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae (PRSP), methicillin-resistant ⁇ ⁇ ⁇ Sraphylococcus aureus (MRSA), vancomycin-resistant enterococci (vancomycin- resistant enterococci (VRE), multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa (MDRP), which is a Gram-negative bacterium.
  • PRSP penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae
  • MRSA methicillin-resistant ⁇ ⁇ ⁇ Sraphylococcus aureus
  • VRE vancomycin-resistant enterococci
  • MDRP multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa
  • Non-patent Document 8 The mechanisms by which these drug-resistant bacteria acquire resistance to antibacterial agents include degradation of the antibacterial agent by enzymes produced by bacteria or inactivation by chemical modification (penicillinase, acetylated kanamycin), and mutation of the protein to which the antibacterial agent binds Decreased drug binding affinity (quinolone resistance), inhibition of drug influx into cells due to mutation of antibacterial permeation or transport system (imipenem resistance), drug excretion from cells due to enhanced bacterial drainage system (MDR), etc.
  • MIDR enhanced bacterial drainage system
  • Antibody drugs against bacterial infections are broadly divided into immunoglobulin preparations that contain monoclonal antibodies that specifically bind to bacterial antigens and polyclonal antibodies against bacteria isolated from bacteria-infected patients as active ingredients. , 1) Induction of effector functions such as phagocytic cells and complement through antibodies bound to bacteria, 2) Inhibition of infection by binding to antigen molecules necessary for entry of bacteria into the host, 3) Bacteria production There are three main categories: neutralization of toxins by binding to toxins. Among these, the effector function is caused by the formation of an antigen-antibody complex by binding of an antibody to a bacterial antigen, and bacterial opsonization by binding of a complement component to the antigen-antibody complex.
  • Opsonized bacteria are phagocytosed through Fc ⁇ receptors and complement receptors expressed in phagocytic cells such as neutrophils and macrophages (antibody-dependent cell phagocytosis, hereinafter sometimes abbreviated as ADCP).
  • ADCP antibody-dependent cell phagocytosis
  • the activated complement component formed by opsonization induces a direct damaging action (complement-dependent cell damage, hereinafter sometimes abbreviated as CDC) against bacteria.
  • Non-patent Document 10 protein mutations have been reported to occur as one of the mechanisms for acquiring bacterial resistance to the antibiotic treatment described above.
  • a monoclonal antibody effective for the treatment of bacterial infection a monoclonal antibody that recognizes the sugar chain structure or glycolipid structure of bacteria, but not a protein antigen or peptide antigen, and has a broad antibacterial spectrum can be considered.
  • a monoclonal antibody capable of binding with high specificity and high affinity to one of the in vivo glycolipids, ganglioside GD3, is known (Non-patent Document 11).
  • the present inventors have discovered that ganglioside GD3 is expressed on the surface of bacteria by an immunological technique using a recombinant anti-GD3 monoclonal antibody.
  • the present invention has been completed by finding out that it has an effect of enhancing the bacterial phagocytosis.
  • An object of the present invention is to treat or prevent bacterial infection using a recombinant antibody that specifically binds to ganglioside GD3, which is a glycolipid expressed in bacteria, and has the activity of eliminating the bacteria from the living body. It is to provide an agent.
  • the present invention relates to the following (1) to (16).
  • a therapeutic or prophylactic agent for bacterial infections which contains a recombinant antibody that has an activity to eliminate bacteria from the living body and specifically binds to ganglioside GD3 as an active ingredient.
  • Agent The bacterium according to (1) or (2), wherein the recombinant antibody that has an activity to eliminate bacteria from the living body and specifically binds to ganglioside GD3 is an antibody that induces a damaging activity against bacteria.
  • a therapeutic or prophylactic agent for infectious diseases (4) The therapeutic or preventive agent for bacterial infection according to any one of (1) to (3), wherein the disordering activity against bacteria is antibody-dependent cell phagocytosis (ADCP) activity. (5) The therapeutic or prophylactic agent for bacterial infection according to any one of (1) to (4), wherein the gene recombinant antibody is a human chimeric antibody or a human CDR-grafted antibody.
  • ADCP antibody-dependent cell phagocytosis
  • the recombinant antibody is an amino acid in which the complementarity determining region (hereinafter referred to as CDR) 1 to 3 of the heavy chain (hereinafter referred to as H chain) of the antibody is represented by SEQ ID NOs: 1 to 3
  • CDR complementarity determining region
  • H chain heavy chain
  • L chain light chain
  • SEQ ID NOs: 4 to 6 Recombinant antibody that competes with ganglioside GD3 by competing with an antibody whose CDR is 1 to 3 of the light chain (hereinafter referred to as L chain) of the antibody and having the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 4 to 6
  • the therapeutic or prophylactic agent for bacterial infection according to any one of (1) to (5), wherein (7)
  • the recombinant antibody has an amino acid sequence in which CDRs 1 to 3 of the H chain of the antibody are represented by SEQ ID NOs: 1 to 3, and CDRs 1 to 3 of the L chain of the antibody are represented by SEQ ID NOs: 4
  • the therapeutic or preventive agent for bacterial infection according to any one of (1) to (5) which is a recombinant antibody that binds to the same epitope as an antibody having an amino acid sequence.
  • the recombinant antibody is an amino acid sequence in which CDRs 1 to 3 of the H chain of the antibody are represented by SEQ ID NOs: 1 to 3, and CDRs 1 to 3 of the L chain of the antibody are represented by SEQ ID NOs: 4 to 6.
  • the therapeutic or prophylactic agent for bacterial infection according to any one of (1) to (5) which is a genetically modified antibody having an amino acid sequence.
  • the human chimeric antibody has an antibody heavy chain variable region (hereinafter referred to as VH) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and the antibody light chain variable region (hereinafter referred to as VL).
  • VH antibody heavy chain variable region
  • VL antibody light chain variable region
  • the therapeutic or preventive agent for bacterial infection according to (5) which is a human chimeric antibody that competes with the antibody having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 and binds to ganglioside GD3.
  • the human chimeric antibody binds to the same epitope as the antibody whose antibody VH is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and whose antibody VL is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8
  • the therapeutic or preventive agent for bacterial infection according to (5) which is a type chimeric antibody.
  • the human chimeric antibody is a human chimeric antibody in which the VH of the antibody is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and the VL of the antibody is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 (5) A therapeutic or prophylactic agent for bacterial infection as described in 1.
  • a human CDR-grafted antibody competes with an antibody in which the VH of the antibody is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and the VL of the antibody is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 in competition with the ganglioside GD3
  • the therapeutic or prophylactic agent for bacterial infection according to (5) which is a human CDR-grafted antibody that binds to.
  • the human CDR-grafted antibody binds to the same epitope as the antibody whose antibody VH is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and whose antibody VL is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10
  • the therapeutic or preventive agent for bacterial infection according to (5) which is a human CDR-grafted antibody.
  • the human CDR-grafted antibody is a human CDR-grafted antibody in which the VH of the antibody is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, and the VL of the antibody is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • the therapeutic or preventive agent for bacterial infection according to (5).
  • a method for treating a bacterial infection comprising administering the therapeutic agent according to any one of (1) to (14) to a patient.
  • a method for preventing a bacterial infection comprising administering the prophylactic agent according to any one of (1) to (14) to a patient.
  • a therapeutic or preventive agent for bacterial infections which contains a recombinant antibody having an activity of eliminating bacteria from the living body and specifically binding to GD3 as an active ingredient.
  • the upper row shows the results of staining with 3% BSA-PBS alone (primary antibody is untreated), and the lower row is reacted with WK704-2871 antibody.
  • Each number corresponds to the number of each bacterium shown in Table 1.
  • (A) is a Forward-scatter / Side-scatter dot plot (upper) and a fluorescent dot plot (lower).
  • the horizontal axis represents the fluorescence value of Alexa488 derived from fluorescently labeled bacteria, and the vertical axis represents the PE fluorescence value derived from anti-human CD66 antibody.
  • FIG. B shows the phagocytic activity of GD3-positive actinomycetes mediated by neutrophils induced by DG44-2871 antibody and WK704-2871 antibody, measured at 37 ° C. for 30 minutes or after 3 hours.
  • the horizontal axis represents the antibody concentration ( ⁇ g / mL), and the vertical axis represents the percentage (%) of Alexa488-positive neutrophils among all CD66-positive neutrophils.
  • ⁇ indicates DG44-2871 antibody
  • ⁇ indicates WK704-2871 antibody.
  • FIG. (A) shows the antibody concentration ( ⁇ g / mL) on the horizontal axis, the percentage (%) of Alexa488-positive neutrophils on the vertical axis, and (B) shows the antibody concentration ( ⁇ g / mL) on the horizontal axis and the vertical axis Shows the amount of bacteria taken up by neutrophils.
  • ⁇ indicates DG44-2871 antibody
  • ⁇ indicates WK704-2871 antibody.
  • White is the group to which PBS was added instead of the antibody
  • the stripe is the group to which the anti-DNP antibody was added (30 ⁇ g / mL for donor 1, 10 ⁇ g / mL for donor 2)
  • black is the WK704-2871 antibody
  • the added groups (30 ⁇ g / mL for donor 1 and 10 ⁇ g / mL for donor 2) are shown.
  • the results using granulocytes from two donors are shown. It is the figure which measured the phagocytic activity of Staphylococcus aureus via the neutrophil induced by the WK704-2871 antibody using a flow cytometry (A) and a microscope (B) after reacting at 37 ° C. for 15 minutes. .
  • the horizontal axis indicates antibody concentration ( ⁇ g / mL).
  • the vertical axis of (A) indicates the ratio (%) of S. aureus-derived FITC-positive neutrophils, and the vertical axis of (B) indicates the ratio (%) of neutrophils that have taken up bacteria.
  • ⁇ indicates anti-DNP antibody, and ⁇ indicates WK704-2871 antibody.
  • the present invention relates to a therapeutic or prophylactic agent for bacterial infections, which contains as an active ingredient a recombinant antibody that specifically binds to GD3, a glycolipid expressed in bacteria, and has the activity of eliminating the bacteria from the living body.
  • the recombinant antibody against GD3 used in the therapeutic or preventive agent for bacterial infections of the present invention may be any antibody as long as it specifically recognizes GD3, but preferably N-added to the antibody Fc region.
  • An example is a recombinant antibody in which the glycoside-linked complex sugar chain is a sugar chain in which fucose is not bound to N-acetylglucosamine at the reducing end.
  • a lectin-resistant cell that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of N-acetylglucosamine at the reducing end of N-glycoside-linked sugar chain and the 1-position of fucose are ⁇ -linked (WO02 / 31140, WO03 / 85118, WO03 / 85107
  • the antibody produced in (1) is also included.
  • the gene recombinant antibody used in the present invention may increase or decrease the CDC activity by a known method, if necessary.
  • a method for enhancing the CDC activity of an antibody for example, in a human IgG1 antibody, a polypeptide containing the CH2 domain in the Fc region is replaced with a polypeptide corresponding to the same position of the human IgG3 antibody in the EU index by Kabat et al.
  • a method for producing an antibody having higher CDC activity than human IgG1 antibody and IgG3 antibody and protein A binding activity equivalent to human IgG1 antibody (WO2007 / 11041) can be mentioned.
  • Examples of a method for attenuating the CDC activity of an antibody include a method for attenuating CDC activity by applying an amino acid mutation to the CH2 domain in the Fc region [The Journal of Immunology, 164, 4178 (2000)].
  • N-glycoside-linked sugar chain is bound to the Fc region of the antibody molecule. Therefore, two sugar chains are bound per antibody molecule.
  • the N-glycoside-linked sugar chain has one or more side chains of galactose-N-acetylglucosamine (hereinafter referred to as Gal-GlcNAc) in parallel on the non-reducing end side of the core structure.
  • Gal-GlcNAc galactose-N-acetylglucosamine
  • a complex type (complex type) sugar chain having sialic acid, bisecting N-acetylglucosamine, etc. on the non-reducing end side of GlcNAc can be mentioned.
  • the N-glycoside-linked complex type sugar chain is represented by the following structural formula (I).
  • the sugar chain to which fucose binds is the N-glycoside-bound complex in position 1 of fucose in the structural formula shown above.
  • Any sugar chain is included as long as it is ⁇ -bonded to the 6-position of N-acetylglucosamine on the reducing end side of the type sugar chain. That is, the structure of the sugar chain at the non-reducing end is not questioned.
  • a recombinant antibody composition comprising an antibody molecule having an N-glycoside-linked sugar chain in the Fc region has the above-mentioned sugar chain structure. As long as it has, it may be comprised from the antibody molecule which has single sugar chain structure, and may be comprised from the antibody molecule which has several different sugar chain structure. That is, the recombinant antibody composition used in the present invention refers to a composition composed of recombinant antibody molecules having single or plural different sugar chain structures.
  • the proportion of sugar chains in which fucose is not bound to N-acetylglucosamine at the reducing end of the sugar chain of the antibody is preferably 20% or more, more preferably 51%- The ratio is 100%, more preferably 80% -100%, particularly preferably 90% -99%, and most preferably 100%.
  • An antibody composition in which the ratio of sugar chains in the antibody composition has the ratio of these sugar chains has high bacterial phagocytic activity via neutrophils.
  • the fact that fucose is not bound to N-acetylglucosamine at the sugar chain reducing end means that fucose is not substantially bound.
  • the antibody composition substantially free of fucose refers to an antibody composition in which fucose cannot be substantially detected in the conventional sugar chain analysis (WO02 / 31140, WO03 / 85107).
  • the level that cannot be substantially detected means that it is below the detection limit of measurement.
  • the proportion of sugar chains in which fucose is not bound to N-acetylglucosamine at the reducing end of the sugar chain is known from antibody molecules such as hydrazine degradation and enzymatic digestion.
  • the sugar chain is released and the released sugar chain is labeled with a fluorescent label or an isotope. This can be determined by separating the sugar chain by a chromatographic method. Moreover, it can determine by analyzing the released sugar chain by HPAED-PAD method [J. Liq. Chromatogr., 6 , 1577 (1983)].
  • the gene recombinant antibody used in the present invention includes antibodies produced by gene recombinant technology, such as human chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies. Recombinant antibodies having antigen binding activity, low antigenicity, and extended blood half-life are preferred as therapeutic agents.
  • the heavy chain (H chain) variable region (hereinafter referred to as VH) CDR is SEQ ID NO: 1 to 3
  • light chain (L chain) Examples include recombinant antibodies in which the CDR of the variable region (hereinafter referred to as VL) is the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 4 to 6, and more specifically, VH is SEQ ID NO: 7, and VL is SEQ ID NO: A recombinant antibody having the amino acid sequence represented by 8 or a recombinant antibody having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and VL represented by SEQ ID NO: 10; In addition, a recombinant antibody having the same amino acid sequence as the variable region of these antibodies, a recombinant antibody that competes with these antibodies and binds to GD3, and a recombinant antibody that binds to the same epitope as these antibodies can give.
  • An antibody that competes with an antibody refers to an antibody that has the same or partially the same epitope (also referred to as an antigenic determinant) as that of the recombinant antibody used in the present invention in GD3 and binds to the epitope.
  • An antibody that binds to the same epitope as that to which the antibody binds refers to an antibody that recognizes and binds to the same sequence as the amino acid sequence of GD3 recognized by the recombinant antibody used in the present invention.
  • the human chimeric antibody refers to an antibody comprising VH and VL of a non-human antibody and a heavy chain constant region (hereinafter referred to as CH) and a light chain constant region (hereinafter referred to as CL) of a human antibody.
  • the human chimeric antibody against GD3 used in the present invention is obtained by obtaining cDNA encoding VH and VL from a hybridoma producing a monoclonal antibody that specifically binds to GD3, and then encoding the human antibody CH and CL. It can be prepared by constructing a human chimeric antibody expression vector by inserting it into an expression vector for animal cells having the above, and introducing it into animal cells to express the antibody.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter referred to as hIg), but is preferably of the hIgG class, and more preferably hIgG1, hIgG2, hIgG3 belonging to the hIgG class, Any of the subclasses such as hIgG4 can be used.
  • the CL of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to hIg, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • human chimeric antibody against GD3 examples include a human chimeric antibody in which VH includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and VL includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8. More specific examples of human chimeric antibodies against GD3 include KM871 described in JP-A-5-304989, human chimeric antibody chR24 described in Cancer Immunol Immunother, 39, 198 (1994), and the like.
  • a humanized antibody refers to an antibody obtained by grafting the amino acid sequences of CDRs of VH and VL of a non-human antibody into appropriate positions of VH and VL of a human antibody, and is also referred to as a human CDR-grafted antibody or a reshaped antibody.
  • the humanized antibody against GD3 used in the therapeutic or prophylactic agent for bacterial infection of the present invention is a CDR of VH and VL of a non-human antibody produced from a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically binds to GD3.
  • V region an antibody variable region in which an amino acid sequence is transplanted to a VH and VL framework (hereinafter referred to as FR) of an arbitrary human antibody is constructed, and the human antibody CH and CL are constructed. It is inserted into an expression vector for animal cells having a gene encoding, and a humanized antibody expression vector is constructed and introduced into an animal cell for expression and production.
  • VH and VL FR amino acid sequences derived from human antibodies can be used as long as they are human antibody-derived VH and VL FR amino acid sequences.
  • human antibody VH and VL FR amino acid sequences registered in databases such as Protein Data Bank, or human antibodies described in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) A common amino acid sequence of each subgroup of FR of VH and FR of VL is used.
  • the CH of the humanized antibody may be any as long as it belongs to hIg, but the hIgG class is preferred, and any of the subclasses such as hIgG1, hIgG2, hIgG3, and hIgG4 belonging to the hIgG class can be used.
  • the CL of the humanized antibody may be any as long as it belongs to hIg, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • Specific examples of humanized antibodies against GD3 include humanized antibodies in which VH includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and VL includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • humanized antibodies against GD3 include KM8869, KM8870 and KM8871 described in WO01 / 23432.
  • a human antibody originally refers to an antibody that naturally exists in the human body, but a human antibody phage library and a human antibody-producing transgene prepared by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering techniques. Also included are antibodies obtained from transgenic animals.
  • the antibody naturally present in the human body can be cultured in lymphocytes that produce the antibody by, for example, isolating human peripheral blood lymphocytes, infecting and immortalizing EB virus, and cloning.
  • the antibody can be further purified.
  • the human antibody phage library is a library in which antibody fragments such as Fab and scFv are expressed on the phage surface by inserting an antibody gene prepared from human B cells into the phage gene. From the library, phages expressing an antibody fragment having a desired antigen-binding activity on the surface can be collected using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index.
  • the antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule comprising two complete heavy chains and two complete light chains by genetic engineering techniques.
  • a human antibody-producing transgenic animal means an animal in which a human antibody gene is incorporated into cells.
  • a human antibody-producing transgenic mouse can be produced by introducing a human antibody gene into a mouse ES cell, transplanting the ES cell into an early mouse embryo, and generating the mouse embryo.
  • a human antibody production method from a human antibody-producing transgenic animal is obtained by obtaining and culturing a human antibody-producing hybridoma by a hybridoma production method performed in a normal non-human animal. Production can be accumulated.
  • An antibody having one or more amino acids deleted, added, substituted or inserted in the amino acid sequence constituting the above-mentioned antibody and having the same activity as the above-mentioned antibody is also a therapeutic or preventive agent for bacterial infection of the present invention. It is included in the recombinant antibody against GD3 used for the agent.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted and / or added is one or more, and the number is not particularly limited.
  • the number is 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 5.
  • deletion, substitution, insertion or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the above antibody indicates the following. It means that there is a deletion, substitution, insertion or addition of one or more amino acid residues in any and one or more amino acid sequences in the same sequence. In addition, deletion, substitution, insertion or addition may occur simultaneously, and the amino acid residue to be substituted, inserted or added may be either a natural type or a non-natural type.
  • Natural amino acid residues include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine , L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine and L-cysteine.
  • amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group C asparagine, glutamine
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • the conjugate used in the present invention includes the N-terminal side or C-terminal side of the H chain or L chain of the recombinant antibody that specifically binds to GD3, an appropriate substituent or side chain of the antibody, and the sugar of the antibody. It can be produced by binding a drug, protein, radioisotope, etc. to a chain or the like by a chemical method [Introduction to Antibody Engineering, Osamu Kinmitsu, Jishinshokan (1994)].
  • a DNA encoding a recombinant antibody that specifically binds to GD3 and a DNA encoding a protein to be bound are linked and inserted into an expression vector, and the expression vector is inserted into a prokaryotic or eukaryotic host. It can also be produced by genetic engineering techniques such as introduction into cells.
  • the drug to be bound to the antibody for preparing the conjugate examples include a low molecular drug, an antibody drug, an immunostimulator, and a high molecular drug.
  • the drug to be conjugated to the antibody for preparing the conjugate may be in the form of a prodrug.
  • the prodrug in the present invention refers to a drug that is chemically modified by an enzyme or the like present at a bacterial infection site and converted into a substance having an action of damaging bacteria.
  • Small molecule drugs to be conjugated to antibodies for conjugate production include antibacterial drugs, alkylating agents, nitrosourea agents, antimetabolites, anticancer antibiotics, plant-derived alkaloids, topoisomerase inhibitors, hormone therapy agents, Any drug such as a hormone antagonist, aromatase inhibitor, P-glycoprotein inhibitor, platinum complex derivative, M phase inhibitor, kinase inhibitor and the like is included.
  • antibacterial drugs include ⁇ -lactam drugs (penicillin antibiotics, cephem antibiotics, carbapenem antibiotics), fosfomycin antibiotics, glycopeptide antibiotics, penem antibiotics, aminoglycoside antibiotics Substances, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics, new quinolone antibiotics, lincomycin antibiotics and the like.
  • low-molecular-weight drugs and antibodies can be conjugated using low-molecular-weight drugs and antibody amino groups via glutaraldehyde, or low-molecular-weight via water-soluble carbodiimide.
  • a method of binding an amino group of a drug and a carboxyl group of an antibody examples include antigens that induce toxic activity against bacteria due to antibody binding, antigens that are involved in the pathogenesis of bacterial infections, and antigens that regulate immune functions. .
  • Antigens that induce toxic activity against bacteria by antibody binding, antigens involved in pathogenesis by bacterial infection include lipopolysaccharide (LPS), Lipid II, tycoic acid, lipoteichoic acid, peptidoglycan, Clumping factor A, ABC transporter, Outer membrane protein (OMP), bacterial toxins (anthrax toxin, cholera toxin, botulinum toxin, staphylococcal alpha toxin, Clostridium perfringens alpha toxin, diphtheria toxin, Pseudomonas aeruginosa exotoxin, Shiga toxin, enterotoxin (LT), Pertussis toxin, tetanospam, etc.).
  • LPS lipopolysaccharide
  • OMP Outer membrane protein
  • bacterial toxins anthrax toxin, cholera toxin, botulinum toxin, staphylococcal alpha
  • Antigens that regulate immune function include CD4, CD40, CD40 ligand, B7 family molecules (CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3, B7-H4), B7 family molecule ligands (CD28 CTLA-4, ICOS, PD-1, BTLA), OX-40, OX-40 ligand, CD137, tumor ⁇ necrosiscrofactor (TNF) receptor family molecules (DR4, DR5, TNFR1, TNFR2), TNF-related apoptosis- inducing ligand receptor (TRAIL) family molecule, TRAIL family molecule receptor family (TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4), receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANK), RANK ligand, CD25 , Folate receptor 4, cytokines [interleukin-1 ⁇ (hereinafter, interleukin is referred to as IL), IL-1 ⁇ , IL-4
  • the immunostimulant that is conjugated to the antibody for the preparation of the conjugate may be a natural product known as an immunoadjuvant, and specific examples include ⁇ (1> 3) glucan (lentinan, a drug that enhances immunity). Schizofiran), ⁇ -galactosylceramide (KRN7000), bacterial powder (picibanil, BCG), bacterial cell extract (krestin) and the like.
  • Polymeric drugs that can be conjugated to antibodies for conjugate production include polyethylene glycol (hereinafter referred to as PEG), albumin, dextran, polyoxyethylene, styrene maleic acid copolymer, polyvinyl pyrrolidone, pyran copolymer, hydroxypropyl methacrylic acid.
  • Examples include amides.
  • By linking these macromolecular drugs to antibodies (1) improved stability against various chemical, physical or biological factors, (2) significant increase in blood half-life, (3) immunity Effects such as loss of originality and suppression of antibody production are expected [Bioconjugate Drug, Yodogawa Shoten (1993)].
  • a method of binding PEG and an antibody a method of reacting with a PEGylation modifying reagent can be mentioned [Bioconjugate pharmaceutical, Yodogawa Shoten (1993)].
  • PEGylation modifying agents examples include lysine ⁇ -amino group modifiers (JP-A 61-178926), aspartic acid and glutamic acid carboxyl group modifiers (JP-A 56-23587), and arginine guanidino group modification. And the like (Japanese Patent Laid-Open No. 2-117920).
  • proteins to be bound to antibodies for preparing conjugates include cytokines and growth factors.
  • the cytokine or growth factor to be bound to the antibody for preparing the conjugate may be any cytokine or growth factor that enhances effector activity such as NK cells, macrophages, and neutrophils.
  • INF cytokine or growth factor that enhances effector activity
  • NK cells NK cells
  • macrophages and neutrophils.
  • INF - ⁇ , INF- ⁇ , INF- ⁇ , INF- ⁇ , IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, granulocyte stimulating factor (G-CSF)
  • G-CSF granulocyte stimulating factor
  • Examples include granulocyte / macrophage stimulating factor (GM-CSF) and macrophage stimulating factor (M-CSF).
  • a fusion protein of a monoclonal antibody against GD3 and a cytokine examples include a fusion protein of anti-GD3 CDR-grafted antibody KM8871 and human IL-2, a fusion protein of anti-GD3 chimeric antibody KM871 and human IL-2 (WO01 / 23432 ).
  • the radioisotope to be bound to the antibody for preparing the conjugate examples include 131I, 125I, 90Y, 64Cu, 199Tc, 77Lu, 211At and the like.
  • the radioisotope can be directly bound to the antibody by the chloramine T method or the like.
  • a substance that chelates a radioisotope may be bound to the antibody.
  • chelating agents include methylbenzyldiethylene-triaminepentaacetic acid (MX-DTPA).
  • the antibodies used in the present invention can also be administered in combination with one or more other drugs.
  • the other drugs include the above-described low molecular weight drugs, antibody drugs, immunostimulants, cytokines or growth factors.
  • simultaneous administration with the antibody used in the present invention may be performed, or administration may be performed before or after administration of the antibody used in the present invention.
  • the antibody used in the present invention may be used for detecting, quantifying or diagnosing bacteria expressing GD3, and examples thereof include a method of using a specific label labeled with the antibody used in the present invention.
  • Labels include those used in normal immunological detection or measurement methods, enzymes such as alkaline phosphatase, peroxidase, luciferase, luminescent substances such as acridinium ester, lophine, fluorescein isothiocyanate (FITC) And fluorescent materials such as RITC.
  • GD3 As an antigen immunization method, a method of administering GD3 in a carrier such as Escherichia coli or the like, or administering a cancer cell line or bacterium expressing GD3, subcutaneously or intravenously or intraperitoneally in an animal, Alternatively, GD3 can be administered together with lipid A in a liposome composed of lipids such as phospholipid and cholesterol.
  • the antigen is administered 5 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Three to seven days after each administration, blood is collected from the fundus venous plexus, and the reaction of the serum with the antigen is referred to as an enzyme immunoassay [hereinafter referred to as ELISA; Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)].
  • ELISA enzyme immunoassay
  • the spleen is removed from the immunized mouse, rat or hamster, and the spleen cells are collected.
  • the spleen is shredded in MEM medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with tweezers, centrifuged (1200 rpm, 5 minutes), the supernatant was discarded, and 1 with Tris-ammonium chloride buffer (pH 7.65). Treat for ⁇ 2 minutes to remove red blood cells, wash 3 times with MEM medium and provide as spleen cells for fusion.
  • myeloma cells cell lines obtained from mice are used. For example, 8-azaguanine resistant mice (derived from BALB / c) myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81 , 1 (1987)], P3-NS1 / 1-Ag41 (NS-1) [European J.
  • These cell lines consist of 8-azaguanine medium (RPMI1640 medium with glutamine 1.5 mmol, 2-mercaptoethanol 5 ⁇ 10 -5 mol / L, gentamicin 10 ⁇ g / mL, and fetal calf serum (FCS)
  • the medium is subcultured with normal medium)) and further added with 8-azaguanine 15 ⁇ g / mL), but it was subcultured to normal medium 3-4 days before cell fusion, and 2 ⁇ 10 7 cells on the day of fusion. Ensure the number of cells above.
  • myeloma cells 5-10: 1, centrifuge (1200 rpm, 5 minutes), discard the supernatant, and loosen the sedimented cells well
  • PEG-1000 polyethylene glycol-1000
  • MEM polyethylene glycol-1000
  • dimethyl sulfoxide 0.2-1 mL / 10 8 antibody-producing cells for 1-2 minutes.
  • HAT medium normal medium with hypoxanthine (10 -4 mol / L ), Thymidine (1.5 ⁇ 10 ⁇ 5 mol / L) and aminopterin (4 ⁇ 10 ⁇ 7 mol / L)] in 100 mL.
  • HAT medium normal medium with hypoxanthine (10 -4 mol / L ), Thymidine (1.5 ⁇ 10 ⁇ 5 mol / L) and aminopterin (4 ⁇ 10 ⁇ 7 mol / L)
  • a part of the culture supernatant is collected, and one that reacts with GD3 but does not react with other gangliosides such as ganglioside GM3 is selected by a binding assay described later.
  • cloning was repeated twice by limiting dilution [first time using HT medium (medium obtained by removing aminopterin from HAT medium), and second time using normal medium], stable and strong antibody titer. Those recognized are selected as a hybridoma strain producing an anti-GD3 monoclonal antibody.
  • the subclass of the antibody is determined by an enzyme immunoassay using a subcluster epiting kit. The amount of protein is calculated from the Raleigh method and absorbance at 280 nm.
  • Binding assay A 96-well plate is dispensed with an ethanol solution containing GD3, phospholipids and cholesterol at 20 ⁇ L / well (20 pmol / well as ganglioside), air-dried, and PBS containing 1% BSA (bovine serum albumin) Dispense 100-200 ⁇ L / well of the solution (BSA-PBS) and leave it at 4 ° C. for 1-2 night to block (block) binding residues to the protein remaining on the plate.
  • BSA bovine serum albumin
  • the BSA-PBS is discarded and washed thoroughly with resin water or PBS, and then the immunized animal serum, the culture supernatant of the hybridoma producing the monoclonal antibody, or the purified antibody is dispensed and reacted as the first antibody.
  • PBS or PBS containing 0.05% Tween Tween-PBS
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance, a radiation compound or the like is dispensed and reacted as a second antibody.
  • Tween-PBS After thoroughly washing with Tween-PBS, the reaction is carried out according to the labeling substance of the second antibody.
  • a recombinant antibody expression vector is an expression vector for animal cells into which DNA encoding CH and CL of a human antibody is incorporated. It can be constructed by cloning DNAs encoding human antibodies CH and CL, respectively.
  • CH and CL of any human antibody can be used. Examples include CH of ⁇ 1 subclass and CL of ⁇ class of human antibodies.
  • DNA encoding CH and CL of human antibodies chromosomal DNA consisting of exons and introns can be used, or cDNA can be used, but cDNA is preferred.
  • Any expression vector for animal cells can be used as long as it can incorporate and express a gene encoding the C region of a human antibody. For example, pAGE107 [Cytotechnol., 3 , 133 (1990)], pAGE103 [J. Biochem., 101 , 1307 (1987)], pHSG274 [Gene, 27 , 223 (1984)], pKCR [Proc. Natl.
  • Promoters and enhancers used for animal cell expression vectors include SV40 early promoter [J. Biochem., 101 , 1307 (1987)], Moloney murine leukemia virus LTR [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149 , 960. (1987)], immunoglobulin heavy chain promoter [Cell, 41 , 479 (1985)] and enhancer [Cell, 33 , 717 (1983)].
  • Recombinant antibody expression vectors can be used with either the type in which the antibody H chain and L chain are on separate vectors, or the type on the same vector (tandem type).
  • tandem type For expression of tandem recombinant antibodies in terms of ease of construction of antibody expression vectors, ease of introduction into animal cells, and balance of expression levels of antibody H and L chains in animal cells Vectors are preferred [J. Immunol. Methods, 167 , 271 (1994)].
  • tandem recombinant antibody expression vectors include pKANTEX93 [WO97 / 10354] and pEE18 [Hybridoma, 17 , 559 (1998)].
  • MRNA is extracted from hybridoma cells producing non-human antibodies to synthesize cDNA.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or a plasmid to prepare a cDNA library.
  • a recombinant phage or recombinant plasmid having cDNA encoding VH or VL is isolated from the library using DNA encoding the C region portion or V region portion of the mouse antibody as a probe.
  • the entire base sequence of VH or VL of the mouse antibody of interest on the recombinant phage or recombinant plasmid is determined, respectively, and the entire amino acid sequence of VH or VL is estimated from the base sequence.
  • Methods for preparing total RNA from hybridoma cells include the guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)], and the kit includes RNA easy kit (manufactured by QIAGEN). Can be mentioned.
  • Methods for preparing mRNA from total RNA include oligo (dT) -immobilized cellulose column method [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)], and kits such as OligoTM-dT30 ⁇ Super> mRNA Purification Kit (manufactured by Takara).
  • kits for preparing mRNA from hybridoma cells include Fast Track mRNA Isolation Kit (manufactured by Invitrogen), Quick Prep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia), and the like.
  • any vector can be used as a vector into which cDNA synthesized using mRNA extracted from a hybridoma cell as a template can be incorporated.
  • ZAP Express [Strategies, 5 , 58 (1992)], pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17 , 9494 (1989)], ⁇ ZAPII (Stratagene), ⁇ gt10, ⁇ gt11 [DNA Cloning: A Practical Approach, 1 , 49 (1985)], Lambda BlueMid (Clontech), ⁇ ExCell, pT7T3 18U (Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol., 3 , 280 (1983)] and pUC18 [Gene, 33 , 103 (1985)].
  • Any Escherichia coli for introducing a cDNA library constructed by a phage or plasmid vector can be used as long as it can introduce, express and maintain the cDNA library.
  • XL1-Blue MRF (Strategies, 5 , 81 (1992)], C600 [Genetics, 39 , 440 (1954)], Y1088, Y1090 [Science, 222 , 778 (1983)], NM522 [J. Mol. Biol , 166 , 1 (1983)], K802 [J. Mol. Biol., 16 , 118 (1966)], JM105 [Gene, 38 , 275 (1985)] and the like.
  • cDNA clones encoding non-human antibody VH or VL from a cDNA library includes colony hybridization or plaque hybridization using isotopes or fluorescently labeled probes [Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)].
  • primers are prepared and cDNA or cDNA library synthesized from mRNA as a template, PolymerasePoChain Reaction (hereinafter referred to as PCR method; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)
  • CDNA encoding VH or VL can also be prepared by “Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34].
  • the cDNA selected by the above method is cleaved with an appropriate restriction enzyme and then cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and a commonly used nucleotide sequence analysis method such as Sanger, F .) Dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 , 5463 (1977)], etc., and analyzed using an automatic nucleotide sequence analyzer such as an ALF DNA sequencer (Pharmacia). By doing so, the base sequence of the cDNA can be determined.
  • a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene)
  • a commonly used nucleotide sequence analysis method such as Sanger, F .) Dideoxy method
  • an automatic nucleotide sequence analyzer such as an ALF DNA sequencer (Pharmacia).
  • amino acid sequences of CDRs of VH and VL are also found by comparing with the amino acid sequences of known antibodies VH and VL [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]. Can do.
  • any database for example, BLAST method [J. Mol. Biol., 215 , 403 (1990)] etc. for SWISS-PROT, PIR-Protein, etc.
  • a homology search can be performed to confirm whether the amino acid sequence used is novel.
  • the base sequence of the linking part encodes an appropriate amino acid.
  • VH and VL cDNAs designed to be appropriate restriction enzyme recognition sequences are prepared.
  • the cDNAs of VH and VL thus prepared were appropriately upstream of the respective genes encoding the human antibody CH or CL of the humanized antibody expression vector described in (2) of this section 2.
  • Each vector can be cloned so as to be expressed, and a human chimeric antibody expression vector can be constructed.
  • cDNAs encoding the non-human antibody VH or VL were amplified by PCR using synthetic DNAs having appropriate restriction enzyme recognition sequences at both ends, respectively, and the genes described in (1) of this section 2 It can also be cloned into a recombinant antibody expression vector.
  • Construction of cDNA encoding V region of humanized antibody cDNA encoding VH or VL of humanized antibody can be constructed as follows. First, the amino acid sequence of the VH or VL framework region (hereinafter referred to as FR) of the human antibody to which the VH or VL CDR amino acid sequence of the non-human antibody is transplanted is selected.
  • the amino acid sequence of FR to be selected may be any as long as it is derived from a human antibody.
  • human antibody FR amino acid sequences registered in databases such as Protein Data Bank, and common subsequences of human antibody FR subgroups [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991 )] And the like.
  • an FR amino acid sequence having as high a homology as possible (at least 60% or more) with the FR amino acid sequence of VH or VL of the original antibody is selected.
  • the CDR amino acid sequence of the original antibody is grafted to the VH or VL FR amino acid sequence of the selected human antibody to design the VH or VL amino acid sequence of the humanized antibody, respectively.
  • the designed amino acid sequence is converted into a DNA sequence in consideration of the frequency of codon usage found in the nucleotide sequence of the antibody gene [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].
  • a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH or VL is designed. Based on the designed DNA sequence, several synthetic DNAs with a length of about 100 bases are synthesized, and PCR is performed using them. In this case, it is preferable to design six synthetic DNAs for both the H chain and the L chain, from the reaction efficiency in PCR and the length of DNA that can be synthesized.
  • the humanized antibody VH can be easily added to the humanized antibody expression vector constructed in (2) of this section 2.
  • a cDNA encoding VL can be cloned.
  • the amplified products are each cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (manufactured by Stratagene), the nucleotide sequence is determined by the method described in (2) of this section 2, and the desired humanized antibody
  • a plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH or VL is obtained.
  • a humanized antibody can only have its antigen-binding activity obtained by transplanting only the CDRs of the VH and VL of the non-human antibody into the VH and VL of the human antibody. It is known that it is lower than that of non-human antibodies [BIO / TECHNOLOGY, 9 , 266 (1991)]. This is because the VH and VL of the original non-human antibody are not only CDR but also the amino acid residues in the FR are directly or indirectly involved in antigen binding activity. When the amino acid residue of FR is substituted with the FR amino acid residue of a human antibody, it is believed that the antigen-binding activity decreases.
  • humanized antibodies interact directly with the amino acid residues of CDRs and amino acid residues that are directly involved in antigen binding in the VH and VL FR amino acid sequences of human antibodies.
  • Amino acid residues and the amino acid residues that maintain the three-dimensional structure of the antibody and are indirectly involved in antigen binding are identified, and those amino acid residues are replaced with the amino acid residues of the original non-human antibody.
  • the lowered antigen binding activity is increased [BIO / TECHNOLOGY, 9 , 266 (1991)].
  • X-ray crystallography J. Mol.
  • the amino acid residues of human antibody VH and VL FRs can be modified by performing the PCR method described in (2) of this section 2 using synthetic DNA for modification. Determine the base sequence of the amplified product after PCR by the method described in (2) of this section 2 and confirm that the target modification has been performed.
  • (6) Construction of humanized antibody expression vector Recombinant antibody constructed upstream of each gene encoding the human antibody CH or CL of the recombinant antibody expression vector described in (2) of this section 2 Each of the cDNAs encoding VH or VL can be cloned to construct a humanized antibody expression vector.
  • an appropriate restriction enzyme recognition sequence at the 5 ′ end of the synthetic DNA located at both ends In order to express them in an appropriate form upstream of each gene encoding the CH or CL of the human antibody of the humanized antibody expression vector described in (1) of this section 2 can do.
  • Transient expression of recombinant antibodies In order to efficiently evaluate the antigen-binding activity of the various types of humanized antibodies, the gene recombination described in (3) and (6) of this section 2 Transient expression of a recombinant antibody can be performed using an antibody expression vector or an expression vector obtained by modifying them.
  • COS-7 cells ATCC CRL1651
  • Methods for introducing expression vectors into COS-7 cells include DEAE-dextran method [Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283 (1991)], lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 , 7413 (1987)].
  • the expression level and antigen binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant can be measured by ELISA or the like.
  • Stable expression of the recombinant antibody Characters that stably express the recombinant antibody by introducing the recombinant antibody expression vector described in (3) and (6) of this section 2 into an appropriate host cell. Convertible strains can be obtained.
  • Examples of a method for introducing an expression vector into a host cell include an electroporation method [Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891, Cytotechnology, 3 , 133 (1990)].
  • Any host cell capable of expressing a recombinant antibody can be used as a host cell into which the recombinant antibody expression vector is introduced.
  • mouse SP2 / 0-Ag14 cells ATCC CRL1581
  • mouse P3X63-Ag8.653 cells ATCC CRL1580
  • dhfr CHO cells deficient in dihydrofolate reductase gene
  • proteins such as enzymes involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose, N-acetylglucosamine at the reducing end of N-glycoside-linked complex sugar chain, position 1 of fucose is ⁇ -linked
  • a host cell in which the activity of a protein such as an enzyme involved in sugar chain modification or a protein involved in transport of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus is reduced or deleted, preferably WO05 / 35586, WO02 / 31140 CHO cells lacking the ⁇ 1,6-fucose transferase gene described in the above can also be used.
  • a transformed strain that stably expresses the recombinant antibody is obtained by following the method disclosed in JP-A-2-57891, such as G418 sulfate (hereinafter referred to as G418: manufactured by SIGMA). It can be selected by culturing in an animal cell culture medium containing a drug.
  • RPMI1640 medium manufactured by Invitrogen
  • GIT medium manufactured by Nippon Pharmaceutical
  • EX-CELL301 medium manufactured by JRH
  • IMDM medium manufactured by Invitrogen
  • Hybridoma-SFM medium Hybridoma-SFM medium
  • FCS fetal calf serum
  • the recombinant antibody can be purified from the culture supernatant of the transformant using a protein A column [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
  • purification methods usually used for protein purification can be used. For example, it can be purified by a combination of gel filtration, ion exchange chromatography, ultrafiltration and the like.
  • the molecular weight of the purified recombinant antibody H chain, L chain, or whole antibody molecule is determined by polyacrylamide gel electrophoresis (hereinafter referred to as SDS-PAGE: Nature, 227 , 680 (1970)) or Western blotting [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] and the like. 3. Evaluation of the activity of the recombinant antibody used in the therapeutic agent or prophylactic agent of the present invention The reaction specificity of the recombinant antibody used in the therapeutic agent or prophylactic agent of the present invention should be evaluated as follows after purification. Can do.
  • the reactivity of purified antibodies with other gangliosides such as GD3 and ganglioside GM3 was determined by ELISA, fluorescent antibody method [Cancer Immunol. Immunother., 36 , 373 (1993)] or BIAcore TM using surface plasmon resonance (SPR). Measure by etc.
  • the damaging activity against bacteria expressing the antigen is determined by measuring ADCP activity, CDC activity, etc. by a known method [J. Immunol., 167 , 6545 (2001), J. Infectious Diseases, 186 , 64 (2002)]. Can be evaluated. Four.
  • Sugar chain analysis of a recombinant antibody used in the therapeutic agent or prophylactic agent of the present invention The sugar chain structure of an antibody molecule expressed in various cells can be performed according to the analysis of the sugar chain structure of a normal glycoprotein.
  • sugar chains bound to the Fc region are composed of neutral sugars such as galactose, mannose, and fucose, amino sugars such as N-acetylglucosamine, and acidic sugars such as sialic acid. It can be carried out using a technique such as sugar chain structure analysis using a sugar chain map method or the like.
  • Neutral sugar / amino sugar composition analysis The composition analysis of the sugar chains of antibody molecules is carried out by freezing neutral sugars or amino sugars by acid hydrolysis of the sugar chains with trifluoroacetic acid or the like. The ratio can be analyzed.
  • BioLC is an apparatus for analyzing sugar composition by HPAEC-PAD (high performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection) method [J. Liq. Chromatogr., 6 , 1577 (1983)].
  • the composition ratio can also be analyzed by fluorescence labeling with 2-aminopyridine.
  • a sample hydrolyzed according to a known method [Agric. Biol. Chem., 55 , 283-284 (1991)] was fluorescently labeled with 2-aminopyridylation, and HPLC analysis was performed to calculate the composition ratio. can do.
  • sugar chain structure analysis The structure analysis of the sugar chains of antibody molecules is based on the two-dimensional sugar map method [Anal. Biochem., 171 , 73 (1988), biochemical experiment method 23-glycoprotein sugar chain research method (conference) Publication Center) Takahashi Reiko (1989)].
  • the two-dimensional sugar chain mapping method for example, the retention time or elution position of sugar chains by reverse phase chromatography is plotted on the X axis, and the retention time or elution position of sugar chains by normal phase chromatography is plotted on the Y axis. And it is the method of estimating sugar chain structure by comparing with those results of known sugar chains.
  • the antibody is hydrazine-degraded to release a sugar chain from the antibody, and fluorescent labeling of the sugar chain with 2-aminopyridine (hereinafter abbreviated as PA) [J. Biochem., 95 , 197 (1984)
  • PA 2-aminopyridine
  • the sugar chain is separated from excess PA reagent by gel filtration and subjected to reverse phase chromatography.
  • normal phase chromatography is performed on each peak of the separated sugar chain.
  • the glycan structure is plotted on a two-dimensional glycan map and compared with the glycan standard (TaKaRa) and the spot [Anal. Biochem., 171 , 73 (1988)].
  • the antibody composition is composed of antibody molecules having different sugar chain structures that bind to the Fc region of the antibody.
  • the recombinant antibody used in the therapeutic agent or prophylactic agent of the present invention has fucose not bound to N-acetylglucosamine at the reducing end of the sugar chain among all N-glycoside-linked complex sugar chains that bind to the Fc region.
  • the ratio of sugar chain is 100%, and it has a characteristic of high bacterial phagocytic activity by neutrophils.
  • Such an antibody composition is the above-mentioned 4.
  • a lectin that recognizes a sugar chain structure of an antibody molecule constituting the antibody composition is labeled, and the labeled lectin is reacted with a sample antibody composition. Next, the amount of the labeled lectin-antibody molecule complex is measured.
  • lectins used for identifying the sugar chain structure of antibody molecules include WGA (heat-germ agglutinin derived from T. vulgaris), Con A (concanavalin A derived from C. ensiformis), and RIC (toxins derived from R. communis). ), L-PHA (leukoagglutinin from P. vulgaris), LCA (lentil agglutinin from L.
  • PSA Pea lectin from P. sativum
  • AAL Aleuria aurantia Lectin
  • ACL Amaranthus caudatus Lectin
  • BPL Bauhinia purpurea Lectin
  • DSL Datura stramonium Lectin
  • DBA Dolichos biflorus Agglutinin
  • EBL Elderberry Balk Lectin
  • ECL Erythrina cristagalli Lectin
  • EEL Euonymus europaeus Lectin
  • GNL Galanthus nivalis Lectin
  • HPA Helix pomatia Agglutinin
  • HHL Hippeastrum Hybrid Lectin
  • Jacalin LTL (Lotus tetragonolobus Lectin)
  • LEL Lycopersicon esculentum Lectin
  • a lectin that specifically recognizes a sugar chain structure in which fucose is bound to N-acetylglucosamine at the N-glucoside-linked complex sugar chain reducing terminal
  • specific examples thereof include lentil lectin LCA
  • lentil lectin LCA examples include Lens Culinaris-derived Lentil Agglutinin), pea lectin PSA (Pisum sativum-derived Pea Lectin), broad bean lectin VFA (Vicia faba-derived Agglutinin), and yellow chawantake lectin AAL (Actinia aurantia-derived Lectin).
  • Method for diagnosing bacterial infection using recombinant antibody used in therapeutic or prophylactic agent of the present invention Detecting bacteria expressing GD3 using recombinant antibody used in therapeutic or prophylactic agent of the present invention Alternatively, a bacterial infection involving GD3 can be diagnosed by quantification.
  • the bacterial infection involving GD3 may be any bacterial infection involving bacteria expressing GD3, such as nosocomial infections (postoperative wound infections, urinary tract infections associated with urinary catheterization) , Pneumonia associated with tracheal tube attachment, phlebitis associated with intravascular catheter placement), skin and soft tissue infections (cellulitis, erysipelas, impetigo, red tinea), sucker infections (pneumonia, pharynx) Inflammation, laryngitis, bronchitis, otitis media, otitis externa, acute sinusitis, common cold), fire extinguisher infection (food poisoning, infectious diarrhea, infectious colitis, infectious malabsorption, proctitis, liver abscess, Cholecystitis), urinary tract infection (urethral syndrome, occult bacteriuria, cystitis, pyelonephritis, perirenal tumor, prostatitis, genitourinary tuberculo
  • Biological samples for detecting or measuring GD3-expressing bacteria include tissues, blood, plasma, serum, spinal fluid, puncture fluid, secretions, sputum, pus, abscess, pleural effusion, urine, feces, tissue fluid, culture
  • the liquid is not particularly limited as long as it may contain bacteria expressing GD3. Diagnosis of a bacterial infection using the recombinant antibody used in the therapeutic agent or prophylactic agent of the present invention can be performed as follows.
  • the above biological sample, or a separation medium blood agar medium, chocolate agar medium, mannitol salt agar medium, BTB lactose agar medium, DHL agar medium, SS agar medium, O157 separation medium, TCBS agar medium, skilow agar medium, Sabouraud agar medium, Brucella HK agar medium, BBE agar medium, etc.
  • a separation medium blood agar medium, chocolate agar medium, mannitol salt agar medium, BTB lactose agar medium, DHL agar medium, SS agar medium, O157 separation medium, TCBS agar medium, skilow agar medium, Sabouraud agar medium, Brucella HK agar medium, BBE agar medium, etc.
  • a genetically modified antibody used in the therapeutic or preventive agent for bacterial infections of the present invention, or a diagnostic agent containing a derivative thereof includes a reagent for performing an antigen-antibody reaction, the reaction, depending on the target diagnostic method
  • the detection reagent may be included.
  • the reagent for performing the antigen-antibody reaction include a buffer and a salt.
  • the detection reagent include reagents used in ordinary immunological detection or measurement methods such as antibodies, derivatives thereof, labeled secondary antibodies that recognize these derivatives, and substrates of labeled substances.
  • any known method can be mentioned. Examples include immunological detection or measurement methods.
  • the immunological detection or measurement method is a method for detecting or measuring the amount of antibody or the amount of antigen using a labeled antigen or antibody.
  • Immunological detection or measurement methods include radiolabeled immunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA or ELISA), fluorescent immunoassay (FIA), luminescent immunoassay (luminescent immunoassay), Western blot , Dot blot method and physicochemical method (TIA, LAPIA, PCIA), immunoprecipitation method, immune cell staining method, immunohistochemical staining method, fluorescent antibody staining method using FMAT8100HTS system (Applied Biosystems), etc. .
  • a radioactive substance labeled immuno-antibody method for example, after reacting the antibody of the present invention with an antigen or a bacterium expressing the antigen, and further reacting with a radiolabeled anti-immunoglobulin antibody or binding fragment And a method of measuring with a scintillation counter or the like.
  • an enzyme immunoassay for example, an antibody of the present invention is reacted with an antigen or a bacterium expressing the antigen, and further, a labeled anti-immunoglobulin antibody or a binding fragment is reacted, There is a method of measuring the coloring dye with an absorptiometer, for example, a sandwich ELISA method is used.
  • a sandwich ELISA method is used as the label used in the enzyme immunoassay.
  • any known enzyme label edited by Koji Ishikawa et al., Enzyme immunoassay, Medical School
  • alkaline phosphatase label, peroxidase label, luciferase label, biotin label and the like can be used.
  • Sandwich ELISA is a method of binding an antibody to a solid phase, trapping an antigen to be detected or measured, and reacting a second antibody with the trapped antigen.
  • two types of antibodies or antibody fragments recognizing an antigen to be detected or measured and having different antigen recognition sites are prepared, and one of the antibodies or antibody fragments is preliminarily placed on a plate (for example, 96 wells). Plate) and the second antibody or antibody fragment is labeled with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme such as peroxidase, and biotin.
  • an antibody used in the sandwich ELISA method either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used, and an antibody fragment such as Fab, Fab ′, F (ab) 2 may be used.
  • the combination of the two types of antibodies used in the sandwich ELISA method may be a combination of monoclonal antibodies or antibody fragments that recognize different epitopes, or a combination of polyclonal antibodies and monoclonal antibodies or antibody fragments.
  • Fluorescent immunoassay includes methods described in literature [Monoclonal-Antibodies-Principles-and-practice, Third-edition, Academic-Press (1996); Monoclonal antibody experiment manual, Kodansha Scientific (1987)] It is done.
  • any known fluorescent label (Akira Kawao, fluorescent antibody method, Soft Science) can be used as described above.
  • FITC label, RITC label, etc. can be used.
  • luminescent immunoassay As a luminescent immunoassay, the method described in [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)] etc. is used. Can be done. Examples of the label used in the luminescence immunoassay include, as described above, any known label [Kazuhiro Imai, Bioluminescence and Chemiluminescence, Yodogawa Shoten; Clinical Examination 42 (1998)]. For example, an acridinium ester label, a lophine label, or the like can be used.
  • an antigen, a bacterium expressing the antigen, or a disrupted solution thereof is fractionated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis [Antibodies-A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)], and then the gel is PVDF.
  • An anti-mouse IgG antibody or binding fragment that is blotted on a membrane or nitrocellulose membrane, reacted with an antibody or antibody fragment that recognizes the antigen on the membrane, and further subjected to a fluorescent substance such as FITC, an enzyme label such as peroxidase, and a biotin label After the reaction, the label is confirmed by visualizing the label.
  • antigens, antigen-expressing bacteria or their disruptions are blotted onto PVDF membranes or nitrocellulose membranes without separation by electrophoresis, etc., and antibodies or antibody fragments that recognize antigens are reacted on the membranes. And then reacting with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme label such as peroxidase, an anti-mouse IgG antibody or binding fragment provided with biotin label, etc., and then confirming the label by visualizing it.
  • a fluorescent substance such as FITC
  • an enzyme label such as peroxidase, an anti-mouse IgG antibody or binding fragment provided with biotin label, etc.
  • Bacteria culture solution is collected, centrifuged, the supernatant is removed and suspended in PBS, and reacted at room temperature for 1 hour in PBS containing 4% glutaraldehyde (manufactured by Junsei Kagaku). Centrifuge, wash with PBS, resuspend in PBS, and blot on a nitrocellulose membrane (BIO-RAD) to immobilize bacteria.
  • This bacterial solid-phased membrane was immersed in a PBS solution containing BSA at a concentration of 3% (hereinafter 3% BSA-PBS) and reacted at room temperature for 1 hour to block remaining active groups.
  • the antibody is added at a concentration of 2 ⁇ g / mL and allowed to react for 1 hour at room temperature.
  • a peroxidase-labeled goat anti-human IgG (H & L) antibody solution (American Qualex) diluted with 3% BSA-PBS solution is added as a secondary antibody solution and allowed to react at room temperature for 1 hour. .
  • 1 tablet of DAB coloring solution [3,3 diaminobenzidine tetrahydrochloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] is dissolved in 100 mL of PBS, and hydrogen peroxide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is used immediately before use. Bacteria to which a monoclonal antibody against GD3 binds can be detected by adding to the solution and adding 0.5 ⁇ L / mL solution].
  • the physicochemical method refers to the formation of an aggregate by binding a genetically modified antibody used in the therapeutic or preventive agent for bacterial infections of the present invention to the antigen GD3. This is done by detecting aggregates.
  • Other physicochemical methods include the capillary method, the one-dimensional immunodiffusion method, the immunoturbidimetric method, and the latex immunoturbidimetric method [Proposal for Clinical Laboratory Methods, Kanbara Publishing, 499 (1998)].
  • the latex immunoturbidimetric method when an antibody or antigen-sensitized carrier such as polystyrene latex having a particle size of about 0.1 to 1 ⁇ m is used and an antigen-antibody reaction is caused by the corresponding antigen or antibody, Scattered light increases and transmitted light decreases. By detecting this change as absorbance or integrating sphere turbidity, the antigen concentration and the like in the test sample can be measured.
  • an antibody or antigen-sensitized carrier such as polystyrene latex having a particle size of about 0.1 to 1 ⁇ m
  • the immunoprecipitation method is specific to immunoglobulins such as protein G-sepharose after reacting GD3-expressing bacteria with the recombinant antibody used in the therapeutic or preventive agent of the bacterial infection of the present invention.
  • a carrier having a sufficient binding ability is added to precipitate the antigen-antibody complex.
  • the following method can be used.
  • the above-described antibody is immobilized on a 96-well plate for ELISA, and then blocked with BSA-PBS.
  • the anti-mouse immunoglobulin, rat immunoglobulin, protein A or G is immobilized on an ELISA 96-well plate in advance.
  • the hybridoma strain culture supernatant is dispensed and bound. Discard the BSA-PBS and wash well with PBS, and then react with the lysate of bacteria and tissues expressing GD3. The immunoprecipitate is extracted from the well-washed plate with a sample buffer for SDS-PAGE and detected by the above Western blotting.
  • the immune cell staining method and the immunohistochemical staining method are the treatment of the bacterial infection of the present invention after treating GD3-expressing bacteria with a surfactant or methanol to improve antibody passage in some cases.
  • a genetically modified antibody used as an agent or prophylactic agent, and further reacting an anti-immunoglobulin antibody or binding fragment with a fluorescent label such as FITC, an enzyme label such as peroxidase, a biotin label, etc.
  • a fluorescent antibody staining method flow cytometry in which the sample is visualized and observed with a microscope, or a fluorescent labeled antibody is reacted with cells and analyzed with a flow cytometer.
  • the recombinant antibody used in the therapeutic or preventive agent for bacterial infection of the present invention is preferably used for detection of bacteria expressing GD3 by flow cytometry.
  • the therapeutic agent of the present invention can be used for the treatment of infections involving bacteria expressing GD3.
  • the disease involving bacteria expressing GD3 may be any disease involving bacteria expressing GD3, such as nosocomial infections (postoperative wound infections, urinary tract infections associated with urinary catheterization) , Pneumonia associated with tracheal tube attachment, phlebitis associated with placement of intravascular catheters), skin and soft tissue infections (cellulitis, erysipelas, impetigo, red tinea), sucker infections (pneumonia, pharyngitis) , Laryngitis, bronchitis, otitis media, otitis externa, acute sinusitis, common cold), fire extinguisher infection (food poisoning, infectious diarrhea, infectious colitis, infectious malabsorption, proctitis, liver abscess, gallbladder Inflammation), urinary tract infection (urethral syndrome, occult bacteriuria, cystitis, pyelonephritis, perirenal tumor, prostatitis, genitourinary tuberculo
  • the therapeutic agent of the present invention examples include a therapeutic agent for bacterial infections comprising a recombinant antibody that specifically binds to GD3 as an active ingredient.
  • a therapeutic agent for infectious diseases that damages bacteria by effector activities such as ADCC activity or CDC activity, or a therapeutic agent for infectious diseases that inhibits infection of bacteria into host cells is also included as a therapeutic agent of the present invention. Since the recombinant antibody used in the therapeutic agent or prophylactic agent of the present invention can recognize GD3 expressed in bacteria, it can recognize bacteria expressing GD3 present in the living body. Therefore, the recombinant antibody used for the therapeutic or prophylactic agent of the present invention and having effector activity can injure bacteria expressing GD3 in vivo and in vitro. In addition, such a recombinant antibody used in the therapeutic agent or prophylactic agent of the present invention can be used particularly effectively as a therapeutic agent because it can damage and reduce bacteria in the living body.
  • the therapeutic agent or prophylactic agent of the present invention may contain only the antibody as an active ingredient or a derivative thereof, but is usually mixed together with one or more pharmacologically acceptable carriers. It is desirable to provide a pharmaceutical preparation produced by any method well known in the technical field of pharmaceutics. It is desirable to use the most effective route for treatment, and oral administration or parenteral administration such as buccal, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous can be used. Alternatively, in the case of peptide preparations, intravenous administration can be desirably performed. Examples of the dosage form include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Preparations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include sugars such as water, sucrose, sorbitol and fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil, p-hydroxybenzoic acid Preservatives such as esters, and flavors such as strawberry flavor and peppermint can be used as additives.
  • excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc, polyvinyl alcohol, hydroxy A binder such as propylcellulose and gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin can be used as additives.
  • Preparations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • the injection is prepared using a carrier made of a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are prepared using a carrier such as cocoa butter, hydrogenated fat or carboxylic acid.
  • the spray is prepared using a carrier that does not irritate the antibody itself or the recipient's oral cavity and airway mucosa, and that disperses the antibody as fine particles to facilitate absorption.
  • Specific examples of the carrier include lactose and glycerin.
  • preparations such as aerosols and dry powders are possible.
  • the components exemplified as additives for oral preparations can also be added.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 10 ⁇ g / kg to 50 ⁇ mg / kg per day for an adult.
  • a 0.5 cm column is packed with 0.5 mL of Mab Select (Amersham Biosciences), 3.0 mL of purified water and 0.2 mol / L boric acid-0.15 mol / L sodium chloride buffer (pH 7.5) (hereinafter referred to as borate buffer). 3 mL) was sequentially passed through. Further, the carrier was equilibrated by washing sequentially with 2.0 mL of 0.1 mol / L citrate buffer (pH 3.5) and 1.5 mL of borate buffer.
  • the culture supernatant was passed through a column, washed with 3.0 mL of borate buffer, and then the antibody adsorbed on the carrier was eluted with 1.25 mL of 0.1 mol / L citrate buffer (pH 3.5).
  • the eluted antibody solution was neutralized with 2 mol / L Tris-HCl buffer (pH 8.5) and 10 mmo / L KH 2 PO by gel filtration using Econo-Column (R) Funnel (manufactured by BIO-RAD). After substituting the buffer with 4 buffers, the buffer was further replaced with PBS using Amicon (R) Ultra (Millipore) to obtain the final purified product.
  • the obtained purified antibody derived from the DG44-2871 strain was named DG44-2871 antibody
  • the purified antibody derived from the WK704-2871 strain was named WK704-2871 antibody.
  • 1% BSA-PBS PBS containing BSA at a concentration of 1%
  • 1% BSA-PBS PBS containing BSA at a concentration of 1%
  • Wako Pure Chemical Industries, Ltd. PBS containing BSA at a concentration of 1%
  • 1% BSA-PBS purified human IgG1 antibody with a known concentration and the culture supernatant of the antibody-producing strain obtained in (1) above or the purified antibody obtained in (2) above at 50 ⁇ L / well. For 1 hour.
  • Tween-PBS PBS containing 0.05% Tween20 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and then a peroxidase-labeled goat diluted 2000 times with 1% BSA-PBS.
  • An anti-human IgG (H & L) antibody solution (American Qualex) was added as a secondary antibody solution at 50 ⁇ L / well and reacted at room temperature for 1 hour.
  • a 2.0-4.0 ⁇ M trifluoroacetic acid solution was added and acid hydrolysis was performed at 100 ° C. for 2-4 hours to liberate neutral and amino sugars from the protein.
  • the trifluoroacetic acid solution was removed with a centrifugal concentrator, redissolved in deionized water, and analyzed using a Dionex sugar analyzer (DX-500).
  • DX-500 Dionex sugar analyzer
  • CarboPac PA-1 column and CarboPac PA-1 guard column (Dionex) are used, eluent is 10-20 mM sodium hydroxide-deionized water solution, and wash solution is 500 mM sodium hydroxide-deionized water solution.
  • Biological activity of recombinant anti-GD3 monoclonal antibody-1 (1) Measurement of anti-GD3 chimeric antibody binding activity to GD3 (ELISA method) The binding activities of DG44-2871 antibody and WK704-2871 antibody obtained in Example 1 (2) to GD3 were measured as follows. Dissolve 6.5 ⁇ g of ganglioside GD3 (manufactured by Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) in 2 mL of ethanol solution containing 10 ⁇ g of phosphatidylcholine (manufactured by Sigma) and 5 ⁇ g of cholesterol (manufactured by Sigma).
  • each well was washed with Tween-PBS, and 50 ⁇ L of a peroxidase-labeled goat anti-human IgG (H & L) antibody solution (American Qualex) diluted 2000 times with 1% BSA-PBS solution as a secondary antibody solution. / Well and allowed to react for 1 hour at room temperature. After the reaction, after washing with Tween-PBS, ABTS substrate solution was added at 50 ⁇ L / well for color development, and OD415 was measured.
  • H & L peroxidase-labeled goat anti-human IgG
  • BSA-PBS solution American Qualex
  • Bacterial culture Actinomycetes (Micromonospora) were prepared in KM-368 medium (1 L of resin water, 5 g of glucose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 5 g of Soluble Starch (Nacalai Tesque), 2.5 g Beef Extract (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical), 2.5 g Yeast Extract (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical), 2.5 g of Difco Tryptone Pepton (manufactured by Difco), 0.5 g of MgSO 4 ⁇ 7H 2 O (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) Dissolve 1 g of KH 2 PO 4 (manufactured by Junsei Kagaku) and 0.5 g of Mg 3 (PO 4 ) 2 / 8H 2 O (manufactured by Nacalai Tesque) and sterilize by autoclave (121 ° C, 20 minutes) Was prepared.
  • KM-368 medium 1 L of resin water, 5 g
  • Staphylococcus aureus 1 strain Staphylococcus aureus (antibacterial test strain) 1 strain, Staphylococcus aureus (gentamicin resistance, kanamycin resistance, streptomycin resistance) 1 strain, Staphylococcus aureus (carbomycin resistance) 1 strain, yellow Staphylococci (paromomycin resistance, neomycin resistance, tetracycline resistance, kanamycin resistance, chloramphenicol resistance, streptomycin resistance) 1 strain, Staphylococcus aureus (rifampicin resistance) 1 strain, Staphylococcus aureus (protein A production) 1 strain, Pseudomonas aeruginosa A total of 15 strains including 1 strain of Pseudomonas aeruginosa, 3 strains of Bacillus eucereus, 1 strain of Pseudomonas synxantha, and 3 strains of Bacillus megaterium, YB medium
  • a total of 2 strains (Streptococcus bovis) and 1 strain of Streptococcus mutans were added to BL medium [1 L of resin water and 58 g of BL agar medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), and autoclave. After sterilization (121 ° C, 20 minutes), cool to about 60 ° C, and aseptically add 50 mL of equine defibrinated blood (manufactured by Nihon Biotest) to 30 ° C. And cultured for 3 days. The grown bacteria were collected by ase and suspended in 1 mL of PBS, and the suspension was obtained by centrifugation.
  • the membrane was immersed in a PBS solution containing BSA at a concentration of 3% (hereinafter referred to as 3% BSA-PBS) and reacted at room temperature for 1 hour to block remaining active groups.
  • the membrane after the reaction was immersed in an antibody solution prepared by adding 2% ⁇ g / mL of the WK704-2871 antibody obtained in (2) of Example 1 to 2 ⁇ g / mL with 3% BSA-PBS, or 3% BSA-PBS alone. After reacting for a period of time, the plate was washed three times with PBS containing Tween 20 at a concentration of 0.1% (hereinafter referred to as T-PBS).
  • a peroxidase-labeled goat anti-human IgG (H & L) antibody solution (American-Qualex) diluted 2000 times with 3% BSA-PBS solution was added as a secondary antibody solution and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • 1 tablet of DAB coloring solution [3,3 diaminobenzidine tetrahydrochloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] is dissolved in 100 mL of PBS, and hydrogen peroxide ( The solution was added with 0.5 ⁇ L / mL solution, and color was developed.
  • FIG. 2 shows the results
  • Table 1 shows a list of names of 18 types of bacteria and 3 types of sugar antigens. Each number corresponds to the number on the dot blot shown in FIG.
  • the WK704-2871 antibody did not react with ganglioside GM2 (GM2) and Tn antigen, but specifically bound to ganglioside GD3 (GD3).
  • the WK704-2871 antibody exhibited higher staining than that obtained when only 3% BSA-PBS was reacted with all the bacteria used. From the above, it was shown that the recombinant anti-GD3 monoclonal antibody binds to a wide range of bacteria.
  • the granulocyte layer was separated according to The fractionated granulocyte layer was washed twice with PBS and then suspended in PBS at a cell density of 1.2 ⁇ 10 6 cells / mL to obtain a human granulocyte solution.
  • C Measurement of bacterial phagocytic activity using actinomycetes 1.8 ⁇ 10 6 fluorescently labeled bacteria prepared in (a) above were added to each well of a low cell binding multi-dish 24-well cell culture plate (manufactured by Nunc).
  • the supernatant was removed by centrifugation. Suspend the pellet in 1 mL of 1% BSA-PBS, add 50 ⁇ L of fluorescent beads (BD Pharmingen) with known concentration to 500 ⁇ L as an internal standard, and use the flow cytometer FACS Calibur shown in (e) below. The sample was subjected to analysis by BD Farmingen.
  • fluorescent beads BD Pharmingen
  • the human granulocytes prepared in (b) above are cytochalasin D (manufactured by Sigma, diluted with DMSO to a final concentration of 5 ⁇ g / mL) or DMSO, which inhibits granulocyte phagocytosis by inhibiting actin polymerization.
  • cytochalasin D manufactured by Sigma, diluted with DMSO to a final concentration of 5 ⁇ g / mL
  • DMSO which inhibits granulocyte phagocytosis by inhibiting actin polymerization.
  • 60 ⁇ L of cytochalasin D or DMSO treatment solution containing 1 ⁇ 10 5 human granulocytes is added to each well (the ratio of effector cells to fluorescently labeled bacteria is 1: 4).
  • the reaction was performed at 37 ° C. for 2 hours as a ⁇ L reaction solution.
  • the cells in the gate of the Forward-scatter / Side-scatter dot plot are expanded into a fluorescence dot plot in which the abscissa indicates the Alexa488 fluorescence value derived from fluorescently labeled bacteria and the ordinate indicates the PE fluorescence value derived from anti-human CD66 antibody. .
  • this fluorescent dot plot cells positive for both Alexa488 and PE were detected as neutrophils that phagocytosed fluorescently labeled bacteria.
  • the bacterial phagocytic activity of neutrophils was evaluated by calculating the percentage (%) of Alexa488-positive neutrophils and the amount of bacteria taken up by neutrophils according to the following formula.
  • the cell concentration of CD66-positive Alexa488-positive neutrophils in the reaction solution was calculated based on the number of fluorescent beads as an internal standard.
  • FIG. 6 shows the results of measurement of bacterial phagocytic activity using Staphylococcus aureus.
  • the WK704-2871 antibody significantly increased the percentage of Alexa488-positive neutrophils (Figure 6A) and the amount of bacteria taken by neutrophils ( Figure 6B) over the DG44-2871 antibody.
  • the actin polymerization inhibitor cytochalasin D which suppresses phagocytosis of neutrophils, was added to this system, the percentage of Alexa488 positive neutrophils and the amount of bacteria taken up by neutrophils were not observed by the WK704-2871 antibody. This indicates that the WK704-2871 antibody enhances antibody-dependent phagocytosis of S. aureus by neutrophils.
  • the recombinant anti-GD3 monoclonal antibody induces antibody-dependent bacterial phagocytosis of neutrophils, and this activity is the N-glycoside-linked complex sugar chain added to the Fc region. It was clarified that the gene recombinant anti-GD3 monoclonal antibody obtained by removing fucose from N-acetylglucosamine at the reducing end was remarkably enhanced.
  • Biological activity of recombinant anti-GD3 monoclonal antibody-2 (1) Analysis of viable cell reactivity of anti-GD3 chimeric antibody by flow cytometry The reactivity of the WK704-2871 antibody obtained in (2) of Example 1 to viable bacteria was detected as follows.
  • Bacterial culture Six strains of Staphylococcus aureus were used. Specifically, Newman, Wright / ATCC 49525, MW2 / BAA-1707, HFH-30364 / BAA-1683, F-182 / 43300 and ATCC 35556 were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC).
  • FITC-labeled goat anti-human IgG antibody solution (manufactured by Southern Biotech) diluted 200 times with the above staining solution was added as a secondary antibody solution at 50 ⁇ L / well, respectively.
  • the reaction was carried out at 4 ° C for 30 minutes.
  • 10% formalin solution (manufactured by Sigma) was added at 50 ⁇ L / well and reacted at 4 ° C. for 10 minutes.
  • a gate is provided in the bacterial fraction of the Forward-scatter / Side-scatter dot plot, and the fluorescence intensity of FL1 contained in the gate is measured. It was measured.
  • the WK704-2871 antibody showed clearly higher staining than the case where the anti-DNP antibody was reacted with all the live bacteria used.
  • WK704-2871 antibody showed staining to Newman and ATCC 35556 regardless of the culture method. From the above, it was revealed that the recombinant anti-GD3 monoclonal antibody can bind not only to the immobilized bacteria shown in Example 1, but also to multiple strains of living S. aureus.
  • (2) Analysis of bactericidal activity of anti-GD3 chimeric antibody against live bacteria The bactericidal activity of WK704-2871 antibody obtained in Example 1 (2) was detected as follows.
  • HBSS containing Ca and Mg
  • PBS PBS
  • the reaction was carried out at 4 ° C overnight while inverting the tube. After washing 5 times with PBS, it was suspended in 10% glycerol / PBS and stored at ⁇ 20 ° C. until use.
  • the FITC-labeled bacterial solution is thawed, washed twice with HBSS (containing Ca and Mg), then the bacterial colony forming unit concentration (CFU / mL) is measured using a cell counter, and 2.5 ⁇ 10 8 CFU / It was prepared using HBSS (containing Ca and Mg) so as to be mL, and used as a fluorescence-labeled bacterial suspension.
  • HBSS Human granulocytes prepared by the method described in (b) of Example 2 (3) were added to HBSS (Ca and Mg free) at a cell density of 2.5 ⁇ 10 7 cells / mL. It was suspended and used as a human granulocyte solution.
  • C Measurement of bacterial phagocytic activity HBSS (containing Ca and Mg) was added to each well of a 96-well round bottom plate (Coaster Co.) so that the total volume was 100 ⁇ L, and then diluted with PBS.
  • the pellet was suspended in 10 ⁇ L of 0.1% BSA-PBS. Mix 1 ⁇ L of ethidium bromide solution diluted 20-fold into 1 ⁇ L of the suspension, and then incorporate FITC-labeled bacteria under a fluorescence microscope to obtain a green fluorescent neutrophil count (derived from bacteria bound to the outside of neutrophils). FITC measured red fluorescence by ethidium bromide). The phagocytic activity of neutrophils was calculated as the percentage (%) of neutrophils that were phagocytosed by fluorescently labeled bacteria out of the total neutrophils counted and detected as FITC positive. The results are shown in FIG. 8B.
  • the remaining 9 ⁇ L suspension was suspended in 200 ⁇ L of 0.1% BSA-PBS and subjected to analysis by a flow cytometer FACS-Calibur (BD Farmingen) shown below (d).
  • a flow cytometer FACS-Calibur (BD Farmingen) shown below (d).
  • the phagocytic activity of neutrophils identified by providing a gate in the granulocyte fraction of the Forward-scatter / Side-scatter dot plot was detected as FITC-positive by phagocytosing fluorescently labeled bacteria among all neutrophils. The percentage of neutrophils was calculated. The results are shown in FIG. 8A.
  • the phagocytic activity of neutrophils was found to be remarkable even under low anti-GD3 antibody conditions such as 0.1 ⁇ g / mL and 1 ⁇ g / mL. Even when 2.5% human plasma (complement-containing) prepared in (b) of Example 3 (2) was added, significant phagocytic activity was observed at an antibody concentration of 1 ⁇ g / mL. . From the above, it was revealed that the recombinant anti-GD3 monoclonal antibody induces bacterial phagocytic activity by neutrophils regardless of the presence or absence of complement.
  • a therapeutic or prophylactic agent for a bacterial infection containing an antibody that specifically binds to ganglioside GD3 as an active ingredient.
  • Sequence number 9 Human VH-KM8871 Sequence number 10: Human VL-KM8871

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Abstract

　細菌に発現する糖脂質であるガングリオシドGD3に特異的に結合し、該細菌を生体内から排除する活性を有する遺伝子組換え抗体を用いた、細菌感染症の治療剤または予防剤が求められている。 本発明により、ガングリオシドGD3に特異的に結合する遺伝子組換え抗体を有効成分として含有する細菌感染症の治療剤または予防剤を提供することができる。

Description

ガングリオシドGD3に特異的に結合する抗体を含む医薬
　本発明は、ガングリオシドGD3に特異的に結合する抗体を有効成分として含有する細菌感染症の治療剤または予防剤に関する。
　シアル酸を有する糖脂質の一種であるガングリオシドは、動物の細胞膜を構成しており、親水性側鎖である糖鎖と、疎水性側鎖であるスフィンゴシンおよび脂肪酸とから構成される分子である。ガングリオシドの種類と発現量は、細胞種、臓器種、動物種によって異なる。さらに細胞が癌化する過程において、ガングリオシドの発現が量的および質的に変化することも知られている。(非特許文献1)。
　例えば、悪性度が高いといわれている神経外胚葉系腫瘍である神経芽細胞腫、肺小細胞癌およびメラノーマでは、正常細胞にはほとんど認められないガングリオシドGD2、GD3、GM2等が発現していることが報告されており(非特許文献2～7)、このような腫瘍細胞に特異的なガングリオシドに対する抗体はヒトの様々な癌の治療に有用であると考えられている。
　ガングリオシドGD3(以下、GD3と略記することもある)に特異的に結合する抗体としては、ヒト型キメラ抗体およびヒト型CDR移植抗体である抗GD3抗体(特許文献1)、高い抗体依存性細胞傷害活性(以下、ADCC活性と略記することもある)を有する抗GD3抗体(特許文献2)などが知られている。
　細菌感染症は、優れた抗菌薬の開発と使用により、その多くが治療可能な疾患であるとの認識が広がった。しかし、細菌の適応力は人類の想像をはるかに超越しており、実際は次から次へと新しい薬剤耐性菌を生み出す結果となった。
　代表的な薬剤耐性菌としては、グラム陽性細菌であるペニシリン耐性肺炎球菌（penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae：PRSP）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin-resistant Sraphylococcus aureus： MRSA）、バンコマイシン耐性腸球菌（vancomycin-resistant enterococci：VRE）、グラム陰性細菌である多剤耐性緑膿菌（multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa：MDRP）などが挙げられる。これらの薬剤耐性菌は、院内感染症を引き起こす原因菌としてのみでなく、近年では市中感染の原因菌としても広がりを見せており、臨床上の問題は深刻さを増している。
　これらの薬剤耐性菌が抗菌薬に耐性を獲得するメカニズムとしては、細菌が産生する酵素による抗菌薬の分解または化学修飾による不活化（ペニシリナーゼ、アセチル化カナマイシン）、抗菌薬が結合する蛋白の変異による薬剤結合親和性の低下（キノロン耐性）、抗菌薬の透過孔または輸送系の変異による菌体内への薬剤流入阻害（イミペネム耐性）、細菌の排出システム亢進による菌体内からの薬剤排出（MDR）など、数多くの報告があり、従来の抗菌薬による細菌感染症の治療は徐々に困難さを増しつつ今日に至っている。このような状況の中、現行の抗菌薬とは異なる作用機序を有する抗体を用いた、細菌感染症に対する抗体医薬の開発が進められている(非特許文献8)。
　細菌感染症に対する抗体医薬は、細菌抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体と、細菌感染患者から分離した細菌に対するポリクローナル抗体を有効成分として含有する免疫グロブリン製剤に大別され、その作用機序としては、1）細菌に結合した抗体を介した貪食細胞や補体などのエフェクター機能の誘導、2）細菌の宿主への侵入に必要な抗原分子との結合による感染の阻害、3）細菌が産生する毒素への結合による毒素の中和、の3つに大きく分類される。このうちエフェクター機能は、細菌抗原への抗体の結合による抗原抗体複合体の形成、ならびに抗原抗体複合体への補体成分の結合による、細菌のオプソニン化によって引き起こされる。オプソニン化された細菌は、好中球やマクロファージなどの貪食細胞に発現するFcγ受容体および補体受容体を介して貪食される（抗体依存性細胞貪食、以下ADCPと略記することもある）。またオプソニン化により形成される活性化補体成分は、細菌に対して直接的な障害作用（補体依存性細胞障害、以下、CDCと略記することもある）を誘導する。
　細菌感染症に対する抗体医薬のうち、既に市販されている製剤は、米国FDAに認可されたボツリヌス菌感染に対するヒト血漿由来免疫グロブリン製剤BabyBIG(R)（Massachusetts Public Health Biologic Laboratories and Cangene Corporation）、破傷風菌感染に対するヒト血漿由来免疫グロブリン製剤BayTetTM（Bayer Corporation）の2剤のみで、モノクローナル抗体を用いた細菌感染症に対する治療薬は未だ臨床現場に届けられていないのが実状である(非特許文献9)。
　細菌感染症の治療を目的としたモノクローナル抗体の開発を困難にしている理由として、該モノクローナル抗体が標的とする細菌抗原蛋白質の変異や、該モノクローナル抗体の利用による抗菌スペクトルの縮小などにより、十分な治療効果を示せず、既存の低分子の抗菌薬やワクチンに勝る薬効を得ることが難しいことが挙げられている (非特許文献10)。このうち、蛋白質の変異は、上述の抗生物質治療に対する細菌の耐性獲得メカニズムの1つとして生じることが報告されている。従って、細菌感染症の治療に有効なモノクローナル抗体としては、蛋白質抗原やペプチド抗原ではなく細菌の糖鎖構造あるいは糖脂質構造を認識し、かつ、広い抗菌スペクトルを有するモノクローナル抗体が考えられるが、このような抗体による細菌感染症の治療剤または予防剤は知られていない。一方、生体内糖脂質のひとつガングリオシドGD3に対して高い特異性と高い親和性で結合可能なモノクローナル抗体が知られている（非特許文献11）。本発明者らは、遺伝子組換え抗GD3モノクローナル抗体を用いた免疫学的手法によって細菌表面にガングリオシドGD3が発現していることを発見し、さらに、遺伝子組換え抗GD3モノクローナル抗体には好中球の細菌貧食を亢進する作用が有ることを見出すことにより本発明を完成させるに至った。
WO01/23432 WO2005/035577
Cancer Res., 45, 2405, (1985) J. Exp. Med., 155, 1133, (1982) J. Biol. Chem., 257, 12752, (1982) Cancer Res., 47, 225, (1987) Cancer Res., 47, 1098, (1987) Cancer Res., 45, 2642, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80,5392, (1983) Expert Review of Anti-infective Therapy, 6, 21 (2008) Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery, 4, 1 (2009) Nature Drug Discovery, 5, 191, (2006) Cancer Immunol Immunother, 36,260 (1993)
　本発明の目的は、細菌に発現する糖脂質であるガングリオシドGD3に特異的に結合し、該細菌を生体内から排除する活性を有する遺伝子組換え抗体を用いた、細菌感染症の治療剤または予防剤を提供することにある。
　本発明は以下の（1）～（16）に関する。
(1)細菌を生体内から排除する活性を有し、ガングリオシドGD3に特異的に結合する遺伝子組換え抗体を有効成分として含有する細菌感染症の治療剤または予防剤。
(2)細菌を生体内から排除する活性を有し、ガングリオシドGD3に特異的に結合する遺伝子組換え抗体が、細菌に反応する抗体である(1)に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
(3)細菌を生体内から排除する活性を有し、ガングリオシドGD3に特異的に結合する遺伝子組換え抗体が、細菌に対する障害活性を誘導する抗体である(1)または(2)に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
(4)細菌に対する障害活性が、抗体依存性細胞貪食（ADCP）活性である(1)～(3)のいずれか一項に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
(5)遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体またはヒト型CDR移植抗体である、(1)～(4)のいずれか一項に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
(6)遺伝子組換え抗体が、抗体の重鎖（以下、H鎖と記す）の相補性決定領域（complementarity determining region、以下CDRと記す）1～3が配列番号1～3で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体の軽鎖（以下、L鎖と記す）のCDR1～3が配列番号4～6で表されるアミノ酸配列である抗体と、競合してガングリオシドGD3に結合する遺伝子組換え抗体である、(1)～(5)のいずれか一項に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
(7)遺伝子組換え抗体が、抗体のH鎖のCDR1～3が配列番号1～3で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のL鎖のCDR1～3が配列番号4～6で表されるアミノ酸配列である抗体と、同じエピトープに結合する遺伝子組換え抗体である、(1)～(5)のいずれか一項に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
(8)遺伝子組換え抗体が、抗体のH鎖のCDR1～3が配列番号1～3で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のL鎖のCDR1～3が配列番号4～6で表されるアミノ酸配列である遺伝子組換え抗体である、(1)～(5)のいずれか一項に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
(9)ヒト型キメラ抗体が、抗体の重鎖可変領域（以下、VHと記す）が配列番号7で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体の軽鎖可変領域（以下、VLと記す）が配列番号8で表されるアミノ酸配列である抗体と、競合してガングリオシドGD3に結合するヒト型キメラ抗体である、 (5)に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
(10)ヒト型キメラ抗体が、抗体のVHが配列番号7で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のVLが配列番号8で表されるアミノ酸配列である抗体と、同じエピトープに結合するヒト型キメラ抗体である、 (5)に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
(11)ヒト型キメラ抗体が、抗体のVHが配列番号7で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のVLが配列番号8で表されるアミノ酸配列であるヒト型キメラ抗体である (5)に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
(12)ヒト型CDR移植抗体が、抗体のVHが配列番号9で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のVLが配列番号10で表されるアミノ酸配列である抗体と、競合してガングリオシドGD3に結合するヒト型CDR移植抗体である、 (5)に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
(13)ヒト型CDR移植抗体が、抗体のVHが配列番号9で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のVLが配列番号10で表されるアミノ酸配列である抗体と、同じエピトープに結合するヒト型CDR移植抗体である、 (5)に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
(14)ヒト型CDR移植抗体が、抗体のVHが配列番号9で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のVLが配列番号10で表されるアミノ酸配列であるヒト型CDR移植抗体である、 (5)に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
(15)(1)～(14)のいずれか1項に記載の治療剤を患者に投与することを特徴とする細菌感染症の治療方法。
(16)(1)～(14)のいずれか1項に記載の予防剤を患者に投与することを特徴とする細菌感染症の予防方法。
　本発明により、細菌を生体内から排除する活性を有し、GD3に特異的に結合する遺伝子組換え抗体を有効成分として含有する細菌感染症の治療剤または予防剤を提供することができる。
DG44-2871抗体およびWK704-2871抗体のGD3へのELISA法における反応性を測定した図である。横軸に抗体濃度（μg/mL）を、縦軸に各抗体濃度における吸光度（OD415-OD490）を示す。●はDG44-2871抗体、○はWK704-2871抗体をそれぞれ示す。 細菌18種類を固相化したメンブレン用い、WK704-2871抗体の反応性をドットブロット法により検討した図である。比較対照として、ガングリオシドGD3（GD3）、ガングリオシドGM2（GM2）及びTn抗原（Tn）の標品をメンブレンにブロットした。上段に3％ BSA-PBSのみ（一次抗体は未処理）、下段にWK704-2871抗体を反応させ染色した結果を示す。各番号は、表1に示す各細菌の番号に対応する。 （A）は、Forward-scatter / Side-scatterドットプロット（上段）、および蛍光ドットプロット（下段）である。横軸に蛍光標識細菌由来のAlexa488蛍光値、縦軸に抗ヒトCD66抗体由来のPE蛍光値を示す。（B）は、DG44-2871抗体及びWK704-2871抗体により誘導される好中球を介したGD3陽性放線菌の貪食活性を、37℃にて30分間または3時間反応後に測定した図である。横軸に抗体濃度（μg/mL）を、縦軸に全CD66陽性好中球に占めるAlexa488陽性好中球の割合（％）を示す。●はDG44-2871抗体、○はWK704-2871抗体をそれぞれ示す。 DG44-2871抗体及びWK704-2871抗体により誘導される好中球を介したGD3陽性放線菌の貪食活性を、4℃または37℃にて30分間または3時間反応後に測定した図である。横軸に抗体濃度（μg/mL）を、縦軸に全CD66陽性好中球に占めるAlexa488陽性好中球の割合（％）を示す。●はDG44-2871抗体、○はWK704-2871抗体をそれぞれ示す。 DG44-2871抗体及びWK704-2871抗体により誘導される好中球を介したGD3陽性放線菌の貪食活性を、4℃または37℃にて30分間または3時間反応後に測定した図である。横軸に抗体濃度（μg/mL）を、縦軸に好中球が取り込んだ細菌量を示す。●はDG44-2871抗体、○はWK704-2871抗体をそれぞれ示す。 DG44-2871抗体及びWK704-2871抗体により誘導される好中球を介したGD3陽性黄色ブドウ球菌の貪食活性を、サイトカラシンDの非存在下または存在下で37℃にて2時間反応後に測定した図である。（A）は、横軸に抗体濃度（μg/mL）、縦軸にAlexa488陽性好中球の割合（％）を、（B）は、横軸に抗体濃度（μg/mL）、縦軸に好中球が取り込んだ細菌量を示す。●はDG44-2871抗体、○はWK704-2871抗体をそれぞれ示す。 WK704-2871抗体による誘導される顆粒球を介した生きた黄色ブドウ球菌への殺菌活性を、37℃にて3時間反応後に測定した図である。縦軸に生存細菌数（x 105 CFU/mL）を示す。左に顆粒球を添加しなかった結果を、右に顆粒球を添加した結果を示す。白は、抗体の代わりにPBSを添加した群、縞は抗DNP抗体を添加した群（ドナー1の場合、30 μg/mL、ドナー2の場合10 μg/mL）、黒はWK704-2871抗体を添加した群（ドナー1の場合、30 μg/mL、ドナー2の場合10 μg/mL）を示す。なお、2名のドナーの顆粒球を用いた結果を示す。 WK704-2871抗体により誘導される好中球を介した黄色ブドウ球菌の貪食活性を、37℃にて15分間反応後に、フローサイトメトリー（A）及び顕微鏡（B）を用いて測定した図である。横軸に抗体濃度（μg/mL）を示す。（A）の縦軸は黄色ブドウ球菌由来FITC陽性好中球の割合（％）を、（B）の縦軸は細菌を取り込んだ好中球の割合（％）を示す。●は抗DNP抗体、○はWK704-2871抗体をそれぞれ示す。
　本発明は、細菌に発現する糖脂質であるGD3に特異的に結合し、該細菌を生体内から排除する活性を有する遺伝子組換え抗体を有効成分として含有する細菌感染症の治療剤または予防剤に関する。
　本発明の細菌感染症の治療剤または予防剤に用いられるGD3に対する遺伝子組換え抗体としては、GD3を特異的に認識すればいずれの抗体でもよいが、好ましくは、抗体Fc領域に付加するN-グリコシド結合複合型糖鎖が、還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である遺伝子組換え抗体があげられる。N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの6位とフコースの1位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチン耐性を有する細胞（WO02/31140、WO03/85118、WO03/85107）で生産された抗体も包含される。
　本発明で用いられる遺伝子組換え抗体は、必要に応じて、公知の方法によってCDC活性を増減させてもよい。抗体のCDC活性を増強させる方法としては、例えば、ヒトIgG1抗体において、Fc領域中のCH2ドメインを含むポリペプチドを、KabatらによるEUインデックスにおいてヒトIgG3抗体の同じ位置に相当するポリペプチドに置換することにより、ヒトIgG1抗体およびIgG3抗体よりも高いCDC活性を有し、かつヒトIgG1抗体と同等のプロテインA結合活性を有する抗体を作製する方法(WO2007/11041)があげられる。抗体のCDC活性を減弱させる方法としては、例えば、Fc領域中のCH2ドメインにアミノ酸変異を施すことによって、CDC活性を減弱させる方法[The Journal of Immunology, 164, 4178 (2000)]があげられる。
　抗体分子のFc領域には、N-グリコシド結合糖鎖が結合する。従って、抗体1分子あたり2本の糖鎖が結合している。N-グリコシド結合糖鎖としては、コア構造の非還元末端側にガラクトース-N-アセチルグルコサミン（以下、Gal-GlcNAcと表記する）の側鎖を並行して1ないしは複数本有し、更にGal-GlcNAcの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのN-アセチルグルコサミンなどを有するコンプレックス型（複合型）糖鎖を挙げることができる。
　N-グリコシド結合複合型糖鎖は、下記構造式（I）で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  
　本発明で用いられる遺伝子組換え抗体に結合するN-グリコシド結合複合型糖鎖において、フコースが結合する糖鎖としては、上記で示された構造式中のフコースの1位がN-グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端側のN-アセチルグルコサミンの6位にα結合している糖鎖であれば、いかなるものも包含される。すなわち非還元末端の糖鎖の構造は問わない。
　本発明で用いられる、GD3に特異的に結合する遺伝子抗体組成物のうち、Fc領域にN-グリコシド結合型糖鎖を有する抗体分子からなる遺伝子組換え抗体組成物は、上記の糖鎖構造を有していれば、単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。すなわち、本発明で用いられる遺伝子組換え抗体組成物とは、単一または複数の異なる糖鎖構造を有する遺伝子組換え抗体分子からなる組成物をいう。
　本発明で用いられる遺伝子組換え抗体組成物において、抗体の糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合としては、好ましくは20％以上、より好ましくは51％-100％、更に好ましくは80％-100％、特に好ましくは90％-99％、もっとも好ましくは100％の割合があげられる。抗体組成物中の糖鎖の割合がこれらの糖鎖の割合を有する抗体組成物は、好中球を介した高い細菌貪食活性を有する。
　本発明で用いられる遺伝子組換え抗体組成物において、糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していないとは、実質的にフコースが結合していないことをいう。実質的にフコースが結合していない抗体組成物とは、常法の糖鎖分析（WO02/31140、WO03/85107）において、フコースが実質的に検出できない程度の抗体組成物である場合をいう。実質的に検出できない程度とは、測定の検出限界以下であることをいう。
　Fc領域に付加するN-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合は、抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法[生物化学実験法23-糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（1989）]を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識又は同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊離させた糖鎖をHPAED-PAD法[J. Liq. Chromatogr., 6, 1577 (1983)] で分析することにより決定することができる。
　本発明で用いられる遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体など、遺伝子組換え技術により製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、抗原結合活性を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。
　本発明で用いられる、GD3に対する遺伝子組換え抗体として、具体的には、重鎖（H鎖）可変領域（以下、VHと表記する）のCDRが配列番号1～3、軽鎖（L鎖）可変領域（以下、VLと表記する）のCDRが配列番号4～6で表されるアミノ酸配列である遺伝子組換え抗体があげられ、より具体的には、VHが配列番号7、VLが配列番号8で表されるアミノ酸配列である遺伝子組換え抗体、または、VHが配列番号9、VLが配列番号10で表されるアミノ酸配列である遺伝子組換え抗体があげられる。また、これらの抗体の可変領域と同一のアミノ酸配列を有する遺伝子組換え抗体、これらの抗体と競合してGD3に結合する遺伝子組換え抗体、これらの抗体と同じエピトープに結合する遺伝子組換え抗体があげられる。
　抗体と競合する抗体とは、本発明で用いられる遺伝子組換え抗体と同一あるいは部分的に同一のエピトープ（抗原決定基ともいう）をGD3に有し、該エピトープに結合する抗体をいう。抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体とは、本発明で用いられる遺伝子組換え抗体が認識するGD3のアミノ酸配列と同じ配列を認識し結合する抗体をいう。
　ヒト型キメラ抗体は、非ヒト抗体のVHおよびVLとヒト抗体の重鎖定常領域（以下、CHと表記する）および軽鎖定常領域（以下、CLと表記する）とからなる抗体をいう。
　本発明で用いられる、GD3に対するヒト型キメラ抗体は、GD3に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより、VHおよびVLをコードするcDNAを取得し、ヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入して抗体を発現させて作製できる。
　ヒト型キメラ抗体のCHとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、hIgと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、hIgGクラスのものが好適であり、さらにhIgGクラスに属するhIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のCLとしては、hIgに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
　GD3に対するヒト型キメラ抗体として具体的には、VHが配列番号7で示されるアミノ酸配列を含み、VLが配列番号8で示されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体があげられる。
　GD3に対するヒト型キメラ抗体としてより具体例には、特開平5-304989に記載のKM871、Cancer Immunol Immunother, 39, 198 (1994)に記載のヒト型キメラ抗体chR24などがあげられる。
　ヒト化抗体は、非ヒト抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列をヒト抗体のVHおよびVLの適切な位置に移植した抗体をいい、ヒト型CDR移植抗体、再構成抗体（reshaped antibody）ともいう。
　本発明の細菌感染症の治療剤または予防剤に用いられるGD3に対するヒト化抗体は、GD3に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから産生される非ヒト抗体の、VHおよびVLのCDRのアミノ酸配列を、任意のヒト抗体のVHおよびVLのフレームワーク（以下、FRと記す）に移植した抗体可変領域（以下、V領域と記す）をコードするcDNAを構築し、ヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列は、ヒト抗体由来のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列であれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Protein Data Bankなどのデータベースに登録されているヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列、またはSequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)などに記載の、ヒト抗体のVHおよびVLのFRの各サブグループの共通アミノ酸配列などが用いられる。
　ヒト化抗体のCHとしては、hIgに属すればいかなるものでもよいが、hIgGクラスのものが好適であり、さらにhIgGクラスに属するhIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト化抗体のCLとしては、hIgに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
　GD3に対するヒト化抗体として具体的には、VHが配列番号9で示されるアミノ酸配列を含み、VLが配列番号10で示されるアミノ酸配列を含むヒト化抗体があげられる。
　GD3に対するヒト化抗体としてより具体例には、WO01/23432に記載のKM8869、KM8870、KM8871などがあげられる。
　ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。
　ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、EBウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。
　ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトB細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりFab、scFvなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により2本の完全なH鎖および2本の完全なL鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
　ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスES細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ES細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
　上述の抗体を構成するアミノ酸配列において、1つ以上のアミノ酸が欠失、付加、置換または挿入され、かつ上述の抗体と同様な活性を有する抗体も、本発明の細菌感染症の治療剤または予防剤に用いられるGD3に対する遺伝子組換え抗体に包含される。
　欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は1個以上でありその数は特に限定されないが、モレキュラー・クローニング第2版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409(1982) 、Gene, 34, 315 (1985) 、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985) 、Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985) 等に記載の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数である。例えば、1～数十個、好ましくは1～20個、より好ましくは1～10個、さらに好ましくは1～5個である。
　上記の抗体のアミノ酸配列において1つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたとは、次ぎのことを示す。同一配列中の任意、かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味する。また、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じる場合もあり、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型いずれの場合もある。天然型アミノ酸残基としては、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリンおよびL-システインなどがあげられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
　A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
　B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
　C群：アスパラギン、グルタミン
　D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
　E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
　F群：セリン、スレオニン、ホモセリン
　G群：フェニルアラニン、チロシン
　本発明の細菌感染症の治療剤または予防剤に用いられる遺伝子組換え抗体には、GD3に特異的に結合する遺伝子組換え抗体に薬剤、タンパク質、放射性同位元素などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体とのコンジュゲートも包含される。
　本発明で用いられるコンジュゲートは、GD3に特異的に結合する遺伝子組換え抗体のH鎖あるいはL鎖のN末端側あるいはC末端側、抗体の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体の糖鎖などに薬剤、タンパク質、放射性同位元素などを化学的手法［抗体工学入門、金光修著、地人書館（1994）］により結合させることにより製造することができる。または、GD3に特異的に結合する遺伝子組換え抗体をコードするDNAと、結合させたいタンパク質をコードするDNAを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを、原核生物あるいは真核生物の宿主細胞へ導入するという遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
　コンジュゲート作製のために抗体に結合させる薬剤としては、低分子の薬剤、抗体医薬、免疫賦活剤、高分子の薬剤などがあげられる。また、コンジュゲート作製のために抗体に結合させる薬剤は、プロドラッグの形態でもよい。本発明におけるプロドラッグとは、細菌感染部位に存在する酵素などによって化学的な修飾を受け、細菌を傷害する作用を有する物質に変換される薬剤をいう。
　コンジュゲート作製のために抗体に結合させる低分子の薬剤としては、抗菌薬、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物由来アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、P糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、M期阻害剤、キナーゼ阻害剤などのいかなる薬剤も包含される。抗菌薬の具体的な例としては、β-ラクタム薬（ペニシリン系抗生物質、セフェム系抗生物質、カルバペネム系抗生物質）、ホスホマイシン系抗生物質、グリコペプタイド系抗生物質、ペネム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、ニューキノロン系抗生物質、リンコマイシン系抗生物質などがあげられる。
　コンジュゲート作製のために低分子の薬剤と抗体とを結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介して低分子の薬剤と抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介して低分子の薬のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法等があげられる。
　コンジュゲート作製のために抗体に結合させる抗体医薬としては、抗体の結合により細菌に対する傷害活性が誘導される抗原、細菌感染による病態形成に関わる抗原、および免疫機能を調節する抗原に対する抗体があげられる。
　抗体の結合により細菌に対する傷害活性が誘導される抗原、細菌感染による病態形成に関わる抗原としては、リポ多糖（LPS）、Lipid II、タイコ酸、リポタイコ酸、ペプチドグリカン、Clumping factor A、ABCトランスポーター、Outer membrane protein（OMP）、細菌毒素（炭疽菌毒素、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、ブドウ球菌α毒素、ウエルシュ菌α毒素、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、志賀（ベロ）毒素、エンテロトキシン（LT）、百日咳毒素、テタノスパミン）などがあげられる。
　免疫機能を調節する抗原としては、CD4、CD40、CD40リガンド、B7ファミリー分子（CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3、B7-H4）、B7ファミリー分子のリガンド（CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、BTLA）、OX-40、OX-40リガンド、CD137、tumor necrosis factor（TNF）受容体ファミリー分子(DR4、DR5、TNFR1、TNFR2)、TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor（TRAIL）ファミリー分子、TRAILファミリー分子の受容体ファミリー（TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4）、receptor activator of nuclear factor kappa B ligand（RANK）、RANKリガンド、CD25、葉酸受容体4、サイトカイン[interleukin-1α（以下、interleukinをILと記す)、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、transforming growth factor(TGF)β、TNFα等]、これらのサイトカインの受容体、ケモカイン（SLC、ELC、I-309、TARC、MDC、CTACK等）、これらのケモカインの受容体があげられる。
　コンジュゲート作製のために抗体に結合させる免疫賦活剤としては、イムノアジュバントとして知られている天然物でもよく、具体例としては、免疫を亢進する薬剤であるβ(1>3)グルカン（レンチナン、シゾフィラン）、αガラクトシルセラミド(KRN7000)、菌体粉末（ピシバニール、BCG）、菌体抽出物（クレスチン）などがあげられる。
　コンジュゲート作製のために抗体に結合させる高分子の薬剤としては、ポリエチレングリコール（以下、PEGと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあげられる。これらの高分子薬剤を抗体に結合させることにより、（1）化学的、物理的あるいは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（2）血中半減期の顕著な延長、（3）免疫原性の消失、抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（1993)］。例えば、PEGと抗体を結合させる方法としては、PEG化修飾試薬と反応させる方法などがあげられる［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（1993）］。PEG化修飾試薬としては、リジンのε－アミノ基の修飾剤（特開昭61-178926）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基の修飾剤（特開昭56-23587）、アルギニンのグアニジノ基の修飾剤（特開平2-117920）などがあげられる。
　コンジュゲート作製のために抗体に結合させるタンパク質としては、サイトカイン、増殖因子などがあげられる。コンジュゲート作製のために抗体に結合させるサイトカインまたは増殖因子としては、NK細胞、マクロファージ、好中球などのエフェクター活性を亢進するサイトカインまたは増殖因子であればいかなるものでもよいが、例えば、インターフェロン（以下、INFと記す）-α、INF-β、INF-γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、顆粒球刺激因子(G-CSF)、顆粒球・マクロファージ刺激因子(GM-CSF)、マクロファージ刺激因子(M-CSF)などがあげられる。
　GD3に対するモノクローナル抗体とサイトカインとの融合蛋白質の具体例としては、抗GD3 CDR移植抗体KM8871とヒトIL-2との融合蛋白質、抗GD3キメラ抗体KM871とヒトIL-2との融合蛋白質（WO01/23432）があげられる。
　コンジュゲート作製のために抗体に結合させる放射性同位元素としては、131I、125I、90Y、64Cu、199Tc、77Lu、211At等があげられる。放射性同位元素は、クロラミンT法等によって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、methylbenzyldiethylene- triaminepentaacetic acid (MX-DTPA)などがあげられる。
　本発明で用いられる抗体は、1つ以上の他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。他の薬剤としては、上述の低分子の薬剤、抗体医薬、免疫賦活剤、サイトカインまたは増殖因子などがあげられる。
　組み合わせて投与する方法としては、本発明で用いられる抗体との同時投与でもよいし、また、本発明で用いられる抗体の投与と前後して投与しても構わない。
　本発明で用いられる抗体は、GD3を発現する細菌を検出、定量または診断に用いてもよく、例えば、特定の標識体を本発明で用いられる抗体に標識して用いる方法があげられる。標識体としては、通常の免疫学的検出または測定法で用いられる標識体があげられ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステル、ロフィンなどの発光物質、フルオレシン・イソチアネート（FITC）、RITCなどの蛍光物質などがあげられる。
　以下に、本発明の細菌感染症の治療剤または予防剤に用いられる遺伝子組換え抗体の製造方法および使用方法について説明する。
1．抗GD3モノクローナル抗体の作製
（1）動物の免疫と抗体生産細胞の調製
　3～20週令のマウス、ラットまたはハムスターにGD3抗原を免疫し、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血中の抗体生産細胞を採取する。抗原の免疫方法としては、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、GD3を大腸菌などの菌体などの担体に保持させて投与する方法、GD3を発現する癌細胞株または細菌を投与する方法、またはGD3をリピッドAと共に、リン脂質、コレステロールなどの脂質から成るリポソームに保持させて投与する方法などがあげられる。
　抗原の投与は、1回目の投与の後1～2週間おきに5～10回行う。各投与後3～7日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法［以下、ELISA法と表記する； Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック (1987)］などで調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス、ラットまたはハムスターを脾臓細胞の供給源として提供する。
　脾臓細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後3～7日目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓を摘出し、脾臓細胞を採取する。脾臓をMEM培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1200rpm、5分間）した後、上清を捨て、トリス－塩化アンモニウム緩衝液（pH7.65）で1～2分間処理し赤血球を除去し、MEM培地で3回洗浄して融合用脾臓細胞として提供する。
（2）骨髄腫細胞の調製
　骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。例えば、8－アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1（P3-U1）［Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1 (1987)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)［European J. Immunology, 6, 511 (1976)］、SP2/0-Ag14（SP2/0）[Nature, 276, 269 (1978)]、P3-X63-Ag8653 (653) [J.Immunol., 123, 1548 (1979)]、P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495 (1975)] などが用いられる。これらの細胞株は、8-アザグアニン培地（RPMI1640培地にグルタミン 1.5 mmol、2-メルカプトエタノール 5×10-5 mol/L、ゲンタマイシン 10 μg/mL、および牛胎児血清（FCS）を加えた培地（以下、正常培地という。）に、さらに8-アザグアニン 15 μg/mLを加えた培地）で継代するが、細胞融合の3～4日前に正常培地に継代し、融合当日に2×107個以上の細胞数を確保する。
（3）細胞融合
　前述した抗体生産細胞と骨髄腫細胞をMEM培地またはPBS（リン酸二ナトリウム1.83 g、リン酸一カリウム0.21 g、食塩7.65 g、蒸留水1リットル、pH7.2）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞 ＝ 5～10：1となるよう混合し、遠心分離（1200 rpm、5分間）した後、上清を捨て、沈殿した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール－1000（PEG-1000）2 g、MEM 2 mLおよびジメチルスルホキシド 0.7 mLの混液0.2～1 mL/108 抗体産生細胞を加え、1～2分間毎にMEM培地 1～2 mLを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50 mLになるようにする。遠心分離（900 rpm、5分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞をHAT培地［正常培地にヒポキサンチン（10-4 mol/L）、チミジン（1.5×10-5 mol/L）およびアミノプテリン（4×10-7 mol/L）を加えた培地］100 mL中に懸濁する。この懸濁液を96穴培養用プレートに100 μL/ウェルずつ分注し、5％ CO2インキュベータ中、37℃で7～14日間培養する。
　培養後、培養上清の一部を採取し、後で述べるバインディングアッセイなどにより、GD3に反応し、ガングリオシドGM3などの他のガングリオシドには反応しないものを選択する。また、ついで、限界希釈法によりクローニングを2回繰り返し［1回目は、HT培地（HAT培地からアミノプテリンを除いた培地）、2回目は、正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものを、抗GD3モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
（4）モノクローナル抗体の調製
　プリスタン処理［2，6，10，14－テトラメチルペンタデカン（Pristane）0.5 mLを腹腔内投与し、2週間飼育する］した8～10週令のマウスまたはヌードマウスに、（3）で得られた抗GD3モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞2×106～5×107細胞／匹を腹腔内注射する。10～21日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（3000 rpm、5分間）して固形分を除去後、40～50 ％ 硫酸アンモニウムで塩析した後、カプリル酸沈殿法、DEAE－セファロースカラム、プロテインA－カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、IgGあるいは、IgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
　抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法および280 nmでの吸光度より算出する。
（5）バインディングアッセイ
　96穴プレートにGD3、リン脂質およびコレステロールを含むエタノール溶液を20 μL／穴（ガングリオシドとして20 pmol／穴）分注し、風乾後、1% BSA（ウシ血清アルブミン）を含むPBS溶液（BSA-PBS）を100～200 μL／穴分注し、4℃で1～2晩放置してプレート上に残った蛋白質との結合残基をブロック（ブロッキング）する。その後、BSA-PBSを捨て、レジン水あるいはPBSでよく洗浄した後、第1抗体として、被免疫動物血清、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清もしくは精製抗体を分注して反応させる。PBSまたは0.05% Tweenを含むPBS（Tween-PBS）でよく洗浄した後、第2抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。Tween-PBSでよく洗浄した後、第2抗体の標識物質に応じた反応を行なう。
2．遺伝子組換え抗GD3モノクローナル抗体の作製
　遺伝子組換え抗GD3モノクローナル抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の作製方法を示す。
（1）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のCHおよびCLをコードするDNAが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のCHおよびCLをコードするDNAをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
　ヒト抗体のC領域は任意のヒト抗体のCHおよびCLを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ1サブクラスのCHおよびκクラスのCLなどがあげられる。ヒト抗体のCHおよびCLをコードするDNAとしてはエキソンとイントロンからなる染色体DNAを用いることも、cDNAを用いることもできるが、cDNAを用いるのが好ましい。動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のC領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、pAGE107［Cytotechnol., 3, 133 (1990)］、pAGE103［J.Biochem., 101, 1307 (1987)]、pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)]、pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)]、pSG1bd2-4 [Cytotechnol., 4, 173 (1990)]、pSE1UK1Sed1-3 [Cytotechnol., 13, 79 (1993)〕などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、SV40の初期プロモーター[J.Biochem., 101, 1307 (1987)]、モロニーマウス白血病ウイルスのLTR [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149,960 (1987)]、免疫グロブリンH鎖のプロモーター［Cell, 41, 479 (1985)]とエンハンサー [Cell, 33, 717 (1983)］などがあげられる。
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、抗体H鎖およびL鎖が別々のベクター上に存在するタイプ、あるいは同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いることができるが、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体H鎖およびL鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点からタンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターの方が好ましい[J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)]。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターとしては、pKANTEX93［WO97/10354]、pEE18 [Hybridoma, 17, 559 (1998)]などがあげられる。
（2）ヒト以外の動物由来の抗体のV領域をコードするcDNAの取得およびアミノ酸配列の解析
　非ヒト抗体のVH及びVLをコードするcDNAは以下の様にして取得することができる。
　非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりmRNAを抽出し、cDNAを合成する。合成したcDNAをファージ或いはプラスミドなどのベクターにクローニングしてcDNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のC領域部分或いはV領域部分をコードするDNAをプローブとして用い、VHまたはVLをコードするcDNAを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のVHまたはVLの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりVHまたはVLの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
　ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどのハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
　ハイブリドーマ細胞から全RNAを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン－トリフルオロ酢酸セシウム法［Methods in Enzymol.,154,3(1987)］等、またキットとしてはRNA easy kit（QIAGEN社製）等が挙げられる。全RNAからmRNAを調製する方法としては、オリゴ（dT）固定化セルロースカラム法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)］等、またキットとしてはOligoTM-dT30 <Super> mRNA Purification Kit（Takara社製）等があげられる。ハイブリドーマ細胞からmRNAを調製するキットとしては、Fast Track mRNA Isolation Kit（Invitrogen社製）、Quick Prep mRNA Purification Kit（Pharmacia社製）等があげられる。
　cDNAの合成及びcDNAライブラリー作製法としては、常法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)； Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34]、或いは市販のキット、例えば、Super ScriptTMPlasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning （Invitrogen社製）やZAP-cDNA Synthesis Kit（Stratagene社製）を用いる方法等があげられる。
　cDNAライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したmRNAを鋳型として合成したcDNAを組み込むベクターは、該cDNAを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ZAP Express [Strategies, 5, 58 (1992)］、pBluescript II SK(+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)]、λZAPII（Stratagene社製）、λgt10、λgt11［DNA Cloning: A Practical Approach, 1, 49 (1985)］、Lambda BlueMid （Clontech社製）、λExCell、pT7T3 18U（Pharmacia社製）、pcD2 ［Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)］及びpUC18 [Gene, 33, 103 (1985)］等が用いられる。
　ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるcDNAライブラリーを導入する大腸菌としては該cDNAライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、XL1-Blue MRF [Strategies, 5, 81 (1992)]、C600 [Genetics, 39, 440 (1954)]、Y1088、Y1090 [Science, 222, 778 (1983)]、NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)]、K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)]及びJM105 [Gene, 38, 275 (1985)]等が用いられる。
　cDNAライブラリーからの非ヒト抗体のVHまたはVLをコードするcDNAクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]により選択することができる。また、プライマーを調製し、mRNAから合成したcDNA或いはcDNAライブラリーを鋳型として、Polymerase Chain Reaction［以下、PCR法と表記する；Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34］によりVHまたはVLをコードするcDNAを調製することもできる。
　上記方法により選択されたcDNAを、適当な制限酵素等で切断後、pBluescript SK(-)（Stratagene社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Sanger, F.）らのジデオキシ法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、A.L.F.DNAシークエンサー（Pharmacia社製）等を用いて解析することで該cDNAの塩基配列を決定することができる。
　決定した塩基配列からVH及びVLの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のVH及びVLの全アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］と比較することにより、取得したcDNAが分泌シグナル配列を含む抗体のVH及びVLの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認することができる。分泌シグナル配列を含む抗体のVH及びVLの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のVH及びVLの全アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びN末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、VH及びVLの各CDRのアミノ酸配列についても、既知の抗体のVH及びVLのアミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］と比較することによって見出すことができる。
　更にVH及びVLの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、SWISS-PROTやPIR-Protein等に対してBLAST法［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)］等の配列の相同性検索を行い、用いるアミノ酸配列が新規なものであるかどうかを確認することができる。
（3）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
　本項2の（1）に記載の遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHまたはCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のVHまたはVLをコードするcDNAをそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、非ヒト抗体のVHまたはVLをコードするcDNAの3’末端側と、ヒト抗体のCHまたはCLの5’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計した、VHおよびVLのcDNAを作製する。作製されたVHおよびVLのcDNAを、それぞれを本項2の（1）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHまたはCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、非ヒト抗体VHまたはVLをコードするcDNAを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成DNAを用いてPCR法によりそれぞれ増幅し、それぞれを本項2の（1）に記載の遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
（4）ヒト化抗体のV領域をコードするcDNAの構築
　ヒト化抗体のVHまたはVLをコードするcDNAは、以下の様にして構築することができる。まず、非ヒト抗体のVHまたはVLのCDRのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のVHまたはVLのフレームワーク領域（以下、FRと表記する）のアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するFRのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも良い。例えば、Protein Data Bank等のデータベースに登録されているヒト抗体のFRのアミノ酸配列、ヒト抗体のFRの各サブグループの共通アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］等があげられる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のVHまたはVLのFRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも60％以上）のFRのアミノ酸配列を選択する。次に、選択したヒト抗体のVHまたはVLのFRのアミノ酸配列に、もとの抗体のCDRのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト化抗体のVHまたはVLのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］を考慮してDNA配列に変換し、ヒト化抗体のVHまたはVLのアミノ酸配列をコードするDNA配列をそれぞれ設計する。設計したDNA配列に基づき、100塩基前後の長さからなる数本の合成DNAを合成し、それらを用いてPCR法を行う。この場合、PCRでの反応効率及び合成可能なDNAの長さから、H鎖、L鎖とも6本の合成DNAを設計することが好ましい。
　また、両端に位置する合成DNAの5’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項2の（1）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にヒト化抗体のVHまたはVLをコードするcDNAをクローニングすることができる。PCR反応後、増幅産物をpBluescript SK(-)（Stratagene社製）等のプラスミドにそれぞれクローニングし、本項2の（2）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のVHまたはVLのアミノ酸配列をコードするDNA配列を有するプラスミドを取得する。
（5）ヒト化抗体のV領域のアミノ酸配列の改変
　ヒト化抗体は、非ヒト抗体のVH及びVLのCDRのみをヒト抗体のVH及びVLのFRに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下してしまうことが知られている［BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)］。この原因としては、元の非ヒト抗体のVH及びVLでは、CDRだけでなく、FR内のアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しているため、ヒト化により非ヒト抗体のFRのアミノ酸残基が、ヒト抗体のFRのアミノ酸残基に置換されると、結抗原合活性が低下してしまうと考えられている。この問題を解決するため、ヒト化抗体では、ヒト抗体のVH及びVLのFRのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、CDRのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、および抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている［BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)］。ヒト化抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるFRのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するために、X線結晶解析［J. Mol. Biol., 112, 535 (1977)]或いはコンピューターモデリング[Protein Engineering, 7, 1501 (1994)]等による抗体の立体構造の構築及び解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト化抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト化抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
　ヒト抗体のVH及びVLのFRのアミノ酸残基は、改変用合成DNAを用いて本項2の（4）に記載のPCR法を行うことにより、改変させることができる。PCR後の増幅産物について本項2の（2）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（6）ヒト化抗体発現ベクターの構築
　本項2の（1）に記載の遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHまたはCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のVHまたはVLをコードするcDNAをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。
　例えば、本項2の（4）及び（5）でヒト化抗体のVHまたはVLを構築する際に用いる合成DNAのうち、両端に位置する合成DNAの5’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項2の（1）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHまたはCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングすることができる。
（7）遺伝子組換え抗体の一過性発現
　作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、本項2の（3）及び（6）に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクター、或いはそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、COS-7細胞（ATCC CRL1651）が一般に用いられる［Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283 (1991)］。COS-7細胞への発現ベクターの導入法としては、DEAE-デキストラン法［Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283 (1991)］、リポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)］等があげられる。
　発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性はELISA法等により測定できる。
（8）遺伝子組換え抗体の安定発現
　本項2の（3）及び（6）に記載の遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
　宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平2-257891、Cytotechnology, 3, 133 (1990)］等があげられる。
　遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスSP2/0-Ag14細胞（ATCC CRL1581）、マウスP3X63-Ag8.653細胞（ATCC CRL1580）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、dhfrと表記する）が欠損したCHO細胞［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)］、レクチン耐性を獲得したLec13 [Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55 (1986)]、α1,6-フコース転移酵素遺伝子が欠損したCHO細胞（WO05/35586、WO02/31140）、ラットYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞（ATCC CRL1662）などがあげられる。
　上記宿主細胞の他、細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素などの蛋白質、N-グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素などの蛋白質または細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質などの活性が低下または欠失した宿主細胞、好ましくはWO05/35586 、WO02/31140等に記載のα1,6-フコース転移酵素遺伝子が欠損したCHO細胞などを用いることもできる。
　発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株は、特開平2-257891に開示されている方法に従い、G418硫酸塩（以下、G418と表記する：SIGMA社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。動物細胞培養用培地としては、RPMI1640培地（Invitrogen社製）、GIT培地（日本製薬社製）、EX-CELL301培地（JRH社製）、IMDM培地（Invitrogen社製）、Hybridoma-SFM培地（Invitrogen社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、FCSと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性はELISA法等により測定できる。また、形質転換株は、特開平2-257891に開示されている方法に従い、DHFR増幅系等を利用して遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。
　遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインAカラムを用いて精製することができる[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製した遺伝子組換え抗体のH鎖、L鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、SDS-PAGEと表記する：Nature, 227, 680 (1970)］やウエスタンブロッティング法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］等で測定することができる。
3．本発明の治療剤または予防剤に用いられる遺伝子組換え抗体の活性評価
　本発明の治療剤または予防剤に用いられる遺伝子組換え抗体の反応特異性は、精製後、下記のようにして評価することができる。
　GD3およびガングリオシドGM3などの他のガングリオシドと精製抗体との反応性を、ELISA法、蛍光抗体法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)］または表面プラズモン共鳴（SPR）を利用したBIAcoreTM等により測定する。抗原を発現している細菌に対する傷害活性は、ADCP活性、CDC活性等を、公知の方法［J. Immunol., 167, 6545 (2001)、J. Infectious Diseases, 186, 64 (2002)で測定し、評価することができる。
4．本発明の治療剤または予防剤に用いられる遺伝子組換え抗体の糖鎖分析
　各種細胞で発現させた抗体分子の糖鎖構造は、通常の糖タンパク質の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。例えば、Fc領域に結合している糖鎖はガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、N-アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
（1）中性糖・アミノ糖組成分析
　抗体分子の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
　具体的な方法として、Dionex社製糖組成分析装置を用いる方法があげられる。BioLCはHPAEC-PAD（high performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection）法［J. Liq. Chromatogr., 6, 1577 (1983)］によって糖組成を分析する装置である。
　また、2-アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［Agric. Biol. Chem., 55, 283-284 (1991)］に従って酸加水分解した試料を2-アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、HPLC分析して組成比を算出することができる。
（2）糖鎖構造解析
　抗体分子の糖鎖の構造解析は、2次元糖鎖マップ法［Anal. Biochem., 171, 73 (1988)、生物化学実験法23-糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（1989年）］により行うことができる。2次元糖鎖マップ法は、例えば、X軸には逆相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、Y軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
　具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、2-アミノピリジン（以下、PAと略記する）による糖鎖の蛍光標識［J. Biochem., 95, 197 (1984)］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のPA化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、2次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（TaKaRa社製）、文献［Anal. Biochem., 171, 73 (1988)］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
　さらに各糖鎖のMALDI-TOF-MSなどの質量分析を行い、2次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
5．抗体分子の糖鎖構造を識別する免疫学的定量方法
　抗体組成物は、抗体のFc領域に結合する糖鎖構造が異なった抗体分子から構成されている。本発明の治療剤または予防剤に用いられる遺伝子組換え抗体は、Fc領域に結合する全N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が100%であり、好中球による高い細菌貪食活性を示す特徴を有している。このような抗体組成物は、上記4．に記載の抗体分子の糖鎖構造の分析法を用いることにより識別できる。また、レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いることによっても識別できる。
　レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いた抗体分子の糖鎖構造の識別は、文献［Monoclonal Antibodies: Principles and Applications), Wiley-Liss, Inc., (1995); 酵素免疫測定法，第3版，医学書院（1987）; 改訂版，酵素抗体法，学際企画（1985）］等に記載のウエスタン染色、RIA（Radioimmunoassay）、VIA（Viroimmunoassay）、EIA（Enzymoimmunoassay）、FIA（Fluoroimmunoassay）、MIA（Metalloimmunoassay）などの免疫学的定量方法に準じて、例えば、以下のように行うことができる。
　抗体組成物を構成する抗体分子の糖鎖構造を認識するレクチンを標識し、標識したレクチンと試料である抗体組成物を反応させる。次に、標識したレクチンと抗体分子の複合体の量を測定する。
　抗体分子の糖鎖構造を識別に用いられるレクチンとしては、例えば、WGA（T. vulgaris由来のwheat-germ agglutinin）、Con A（C. ensiformis由来のconcanavalin A）、RIC（R. communis由来の毒素）、L-PHA（P.vulgaris由来のleukoagglutinin）、LCA（L. culinaris由来のlentil agglutinin）、PSA（P. sativum由来のPea lectin）、AAL（Aleuria aurantia Lectin）、ACL（Amaranthus caudatus Lectin）、BPL（Bauhinia purpurea Lectin）、DSL（Datura stramonium Lectin）、DBA（Dolichos biflorus Agglutinin）、EBL（Elderberry Balk Lectin）、ECL（Erythrina cristagalli Lectin）、EEL（Euonymus europaeus Lectin）、GNL（Galanthus nivalis Lectin）、GSL（Griffonia simplicifolia Lectin）、HPA（Helix pomatia Agglutinin）、HHL（Hippeastrum Hybrid Lectin）、Jacalin、LTL（Lotus tetragonolobus Lectin）、LEL （Lycopersicon esculentum Lectin）、MAL（Maackia amurensis Lectin）、MPL（Maclura pomifera Lectin）、NPL（Narcissus pseudonarcissus Lectin）、PNA（Peanut Agglutinin）、E-PHA（Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin）、PTL（Psophocarpus tetragonolobus Lectin）、RCA（Ricinus communis Agglutinin）、STL（Solanum tuberosum Lectin）、SJA（Sophora japonica Agglutinin）、SBA（Soybean Agglutinin）、UEA（Ulex europaeus Agglutinin）、VVL（Vicia villosa Lectin）、WFA（Wisteria floribunda Agglutinin）があげられる。
　N-グルコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合している糖鎖構造を特異的に認識するレクチンを用いることが好ましく、その具体的な例としては、レンズマメレクチンLCA（Lens Culinaris由来のLentil Agglutinin）、エンドウマメレクチンPSA（Pisum sativum由来のPea Lectin）、ソラマメレクチンVFA（Vicia faba由来のAgglutinin）、ヒイロチャワンタケレクチンAAL（Aleuria aurantia由来のLectin）を挙げることができる。
6．本発明の治療剤または予防剤に用いられる遺伝子組換え抗体を用いた細菌感染症の診断方法
　本発明の治療剤または予防剤に用いられる遺伝子組換え抗体を用いて、GD3を発現する細菌を検出または定量することにより、GD3が関与する細菌感染症を診断することができる。
　GD3が関与する細菌感染症としては、GD3を発現する細菌が関与する細菌感染症であればいかなるものでもよく、例えば院内感染症（術後創感染症、尿路カテーテル留置に付随する尿路感染症、気管チューブ装着に付随する肺炎、血管内カテーテル留置に付随する静脈炎）、皮膚・軟部組織感染症（蜂窩織炎、丹毒、膿痂疹、紅色陰癬）、吸器感染症（肺炎、咽頭炎、喉頭炎、気管支炎、中耳炎、外耳炎、急性副鼻腔炎、普通感冒）、消火器感染症（食中毒、感染性下痢症、感染性大腸炎、感染性吸収不全、直腸炎、肝膿瘍、胆嚢炎）、尿路感染症（尿道症候群、不顕性細菌尿、膀胱炎、腎盂腎炎、腎周囲腫瘍、前立腺炎、泌尿生殖器結核）、生殖器感染症（子宮内感染症、副睾丸炎、骨盤内炎症性疾患、頸管炎）、中枢神経系感染症（細菌性髄膜炎、脳膿瘍）、眼感染症（細菌性結膜炎、角膜炎、眼内炎、眼窩蜂巣炎）、骨・間接感染症（骨髄炎、化膿性関節炎、反応性関節炎）、新生児感染症（敗血症、新生児眼炎、臍炎、壊死性腸炎、ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群）などが挙げられる。
　GD3を発現する細菌を検出または測定する対象となる生体試料としては、組織、血液、血漿、血清、髄液、穿刺液、分泌物、喀痰、膿汁、膿瘍、胸水、尿、糞便、組織液、培養液など、GD3を発現する細菌を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。
　本発明の治療剤または予防剤に用いられる遺伝子組換え抗体を用いた細菌感染症の診断は以下のようにして行うことができる。
　被験者の検体から、上記の生体試料、または該生体試料を分離培地（血液寒天培地、チョコレート寒天培地、マンニット食塩寒天培地、BTB乳糖寒天培地、DHL寒天培地、SS寒天培地、O157分離用培地、TCBS寒天培地、スキロー寒天培地、サブロー寒天培地、ブルセラHK寒天培地、BBE寒天培地など）で培養して発育させた細菌を含む試料を調製し、これらの試料に、下記の免疫学的手法に従い、本発明の治療剤または予防剤に用いられる遺伝子組換え抗体、またはこれらの誘導体を反応させ、試料中に含まれるGD3またはGD3を発現する細菌を検出または測定することにより診断を行う。
　本発明の細菌感染症の治療剤または予防剤に用いられる遺伝子組換え抗体、またはこれらの誘導体を含有する診断薬は、目的の診断法に応じて、抗原抗体反応を行なうための試薬、該反応の検出用試薬を含んでもよい。抗原抗体反応を行なうための試薬としては、緩衝剤、塩などがあげられる。検出用試薬としては、抗体、またはこれらの誘導体、またはこれらの誘導体を認識する標識された二次抗体、標識物の基質など、通常の免疫学的検出または測定法に用いられる試薬があげられる。
　本発明の治療剤または予防剤に用いられる遺伝子組換え抗体により、GD3を発現する細菌のGD3の量を検出または測定する方法としては、任意の公知の方法があげられる。例えば、免疫学的検出または測定方法などがあげられる。
　免疫学的検出または測定方法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。免疫学的検出または測定方法としては、放射性物質標識免疫抗体法（RIA）、酵素免疫測定法（EIAまたはELISA）、蛍光免疫測定法（FIA）、発光免疫測定法（luminescent immunoassay）、ウエスタンブロット法、ドットブロット法および物理化学的手法（TIA、LAPIA、PCIA）、免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法、FMAT8100HTSシステム（アプライドバイオシステム社製）を用いる蛍光抗体染色法などがあげられる。
　放射性物質標識免疫抗体法（RIA）としては、例えば、抗原または抗原を発現した細菌などに、本発明の抗体を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法があげられる。
　酵素免疫測定法（EIAまたはELISA）としては、例えば、抗原または抗原を発現した細菌などに、本発明の抗体を反応させ、さらに標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法があげられ、例えばサンドイッチELISA法などが用いられる。酵素免疫測定法で用いる標識体としては、前述のとおり、任意の公知（石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院）の酵素標識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識、ビオチン標識などを用いることができる。
　サンドイッチELISA法は、固相に抗体を結合させた後、検出または測定したい抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第2の抗体を反応させる方法である。該ELISA法では、検出または測定したい抗原を認識する抗体または抗体断片であって、抗原認識部位の異なる2種類の抗体を準備し、そのうち、一方の抗体または抗体断片を予めプレート（例えば、96ウェルプレート）に吸着させ、第2の抗体または抗体断片をFITCなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素、ビオチンなどで標識しておく。上記の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された、細菌またはその破砕液、組織またはその破砕液、細菌培養上清、血清、胸水、腹水、眼液などを反応させた後、標識したモノクローナル抗体または抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。該方法により、被験サンプル中の抗原濃度を測定する場合には、濃度既知の抗原を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出することができる。サンドイッチELISA法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Fab、Fab’、F(ab)2などの抗体フラグメントを用いてもよい。サンドイッチELISA法で用いる2種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体または抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体または抗体断片の組み合わせでもよい。
　蛍光免疫測定法（FIA）としては、文献［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)；単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（1987)］などに記載された方法があげられる。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、前述のとおり、任意の公知（川生明著、蛍光抗体法、ソフトサイエンス社）の蛍光標識を用いることができる。例えば、FITC標識、RITC標識などを用いることができる。
　発光免疫測定法（luminescent immunoassay）としては、［Monoclonal Antibodies- Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（1987）］などに記載された方法を用いて行うことができる。発光免疫測定法で用いる標識体としては、前述のとおり、任意の公知［今井一洋編、生物発光と化学発光、廣川書店；臨床検査 42 (1998)］の発光体標識があげられる。例えば、アクリジニウムエステル標識、ロフィン標識などを用いることができる。
　ウエスタンブロット法は、抗原、抗原を発現する細菌またはその破砕液などをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動［Antibodies-A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory,1988)］で分画した後、該ゲルをPVDF膜またはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原を認識する抗体または抗体断片を反応させ、さらにFITCなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、ビオチン標識などを施した抗マウスIgG抗体または結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって確認する方法である。
ドットブロット法は、抗原、抗原を発現する細菌またはその破砕液などを、電気泳動などにより分離することなくPVDF 膜またはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原を認識する抗体または抗体断片を反応させ、さらにFITCなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、ビオチン標識などを施した抗マウスIgG抗体または結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって確認する方法である。ドットブロット法の一例を以下に示す。
　細菌培養液を採取し、遠心して上清を除きPBSに懸濁した後、グルタルアルデヒド(純正化学社製)を4％の濃度で含むPBS中で室温にて1時間反応させる。遠心しPBSで洗浄後、PBSに再懸濁し、ニトロセルロース膜（BIO-RAD社製）にブロットし細菌を固相化する。この細菌固相化膜を、BSAを3％の濃度で含むPBS溶液(以下3%BSA-PBS)に浸し、室温にて1時間反応させることにより残存する活性基をブロックした後、GD3に対するモノクローナル抗体を2 μg/mLの濃度で加え、室温で1時間反応させる。反応後、Tween-PBSで洗浄後、3％BSA-PBS溶液で希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG(H&L)抗体溶液（American Qualex社製）を二次抗体溶液として加え、室温で1時間反応させる。反応後、Tween-PBSで洗浄後、DAB発色溶液 [3,3ジアミノベンジジン四塩酸塩(和光純薬社製)1錠を100 mLのPBSに溶解し、使用直前に過酸化水素（和光純薬社製）を0.5 μL/mL添加した溶液] を加えて発色させることにより、GD3に対するモノクローナル抗体が結合する細菌を検出することができる。
　物理化学的手法とは、具体的には、本発明の細菌感染症の治療剤または予防剤に用いられる遺伝子組換え抗体を、抗原であるGD3と結合させることにより凝集体を形成させて、この凝集体を検出することにより行う。この他に物理化学的手法としては、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法あるいはラテックス免疫比濁法等があげられる［臨床検査法提要、金原出版，499 (1998)]。
　例えば、ラテックス免疫比濁法では、抗体または抗原を感作させた粒径0.1～1 μm程度のポリスチレンラテックス等の担体を用い、対応する抗原あるいは抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度あるいは積分球濁度として検出することにより被験サンプル中の抗原濃度などを測定することができる。
　免疫沈降法とは、GD3を発現する細菌などを、本発明の細菌感染症の治療剤または予防剤に用いられる遺伝子組換え抗体と反応させた後、プロテインG－セファロースなどのイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる方法である。あるいは以下のような方法によっても行なうことができる。
　ELISA用96ウェルプレートに上述した抗体を固相化した後、BSA-PBSによりブロッキングする。抗体が精製されていない状態の例えばハイブリドーマ株培養上清などの精製されていない状態である場合には、抗マウスイムノグロブリンあるいはラットイムノグロブリンまたはプロテインAあるいはGなどをあらかじめELISA用96ウェルプレートに固相化しBSA-PBSでブロッキングした後、ハイブリドーマ株培養上清を分注して結合させる。BSA-PBSを捨てPBSでよく洗浄した後、GD3を発現する細菌や組織の溶解液を反応させる。よく洗浄した後のプレートより免疫沈降物をSDS-PAGE用サンプルバッファーで抽出し、上記のウエスタンブロッティングにより検出を行う。
　免疫細胞染色法および免疫組織染色法とは、GD3を発現する細菌などを、場合によっては抗体の通過性を良くするため界面活性剤やメタノールなどで処理した後、本発明の細菌感染症の治療剤または予防剤に用いられる遺伝子組換え抗体を反応させ、さらにFITCなどの蛍光標識、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、ビオチン標識などを施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、該標識を可視化し、顕微鏡にて顕鏡するか、あるいは蛍光標識の抗体と細胞を反応させ、フロ－サイトメーターにて解析する蛍光抗体染色法（フローサイトメトリー）である。例えば、文献［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（1987）］などに記載された方法を用いて行うことができる。特に、本発明の細菌感染症の治療剤または予防剤に用いられる遺伝子組換え抗体は、フローサイトメトリーによりGD3を発現する細菌の検出に好ましく用いられる。
　また、蛍光抗体染色法の原理を利用したFMAT8100HTSシステム（アプライドバイオシステム社製）を用いることにより、形成された抗体－抗原複合体と、抗体－抗原複合体の形成に関与していない遊離の抗体または抗原とを分離することなく、抗原量または抗体量を測定することができる。
7．本発明の治療剤を用いた細菌感染症の治療方法
　本発明の治療剤は、GD3を発現する細菌が関与する感染症の治療に用いることができる。
　GD3を発現する細菌が関与する疾患としては、GD3を発現する細菌関与する疾患であればいかなるものでもよく、例えば院内感染症（術後創感染症、尿路カテーテル留置に付随する尿路感染症、気管チューブ装着に付随する肺炎、血管内カテーテル留置に付随する静脈炎）、皮膚・軟部組織感染症（蜂窩織炎、丹毒、膿痂疹、紅色陰癬）、吸器感染症（肺炎、咽頭炎、喉頭炎、気管支炎、中耳炎、外耳炎、急性副鼻腔炎、普通感冒）、消火器感染症（食中毒、感染性下痢症、感染性大腸炎、感染性吸収不全、直腸炎、肝膿瘍、胆嚢炎）、尿路感染症（尿道症候群、不顕性細菌尿、膀胱炎、腎盂腎炎、腎周囲腫瘍、前立腺炎、泌尿生殖器結核）、生殖器感染症（子宮内感染症、副睾丸炎、骨盤内炎症性疾患、頸管炎）、中枢神経系感染症（細菌性髄膜炎、脳膿瘍）、眼感染症（細菌性結膜炎、角膜炎、眼内炎、眼窩蜂巣炎）、骨・間接感染症（骨髄炎、化膿性関節炎、反応性関節炎）、新生児感染症（敗血症、新生児眼炎、臍炎、壊死性腸炎、ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群）などがあげられる。
　本発明の治療剤としては、GD3に特異的に結合する遺伝子組換え抗体を有効成分とする細菌感染症の治療剤があげられる。ADCC活性やCDC活性などのエフェクター活性により細菌を傷害する感染症治療剤、あるいは細菌の宿主細胞への感染を阻害する感染症治療剤等も、本発明の治療剤として包含される。
　本発明の治療剤または予防剤に用いられる遺伝子組換え抗体は、細菌に発現するGD3を認識することができるので、生体内に存在するGD3を発現する細菌を認識することができる。従って、本発明の治療剤または予防剤に用いられる遺伝子組換え抗体で、かつエフェクター活性を有する抗体は、in vivoおよびin vitroにおいて、GD3を発現する細菌を傷害することができる。また、このような本発明の治療剤または予防剤に用いられる遺伝子組換え抗体は、生体内の細菌を傷害し、減少させることができるので、治療剤として特に有効に用いられる。
　本発明の治療剤または予防剤は、有効成分としての該抗体、またはそれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される1以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
　投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、抗体またはペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。
　経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、p－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
　非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該抗体自体、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。該抗体および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
　投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人1日当たり10 μg/kg～50 mg/kgである。
遺伝子組換え抗GD3モノクローナル抗体の作製
（1）抗GD3キメラ抗体生産株の培養
　VHが配列番号7、VLが配列番号8で表される抗GD3キメラ抗体をコードするベクターを導入した、WO02/31140に記載のCHO/DG44細胞（以下、DG44-2871株と記す）、およびWO03/085107に記載のFUT8遺伝子ダブルノックアウトクローンWK704細胞（以下、WK704-2871株と記す）を、G418添加培地[ウシ胎児透析血清（インビトロジェン社製）を10%、ゲンタマイシン（ナカライテスク社）を50 μg/mL、およびG418（シグマ社製）を500 μg/mLの濃度で添加したIscove's Modified Dulbecco's Medium（インビトロジェン社)]にそれぞれ懸濁し、細胞懸濁液30 mLを182cm2接着細胞用フラスコ（グライナー社製）に播種して5% CO2インキュベータで培養した。細胞密度がコンフルエントになった時点で、無血清培地EXCELL301（JRH Biosciences社製）に培地交換を行い、1週間培養後、培養上清を回収し、下記に記載の方法で精製を行った。
（2）抗GD3キメラ抗体の精製
　（1）で取得した培養上清を、3000 rpm、4℃の条件で5分間の遠心分離を行い、上清を回収した後、0.22 μm孔径 Millex GVフィルター（ミリポア社製）を用いて上清を濾過した。0.8 cm径のカラムにMab Select（Amersham Biosciences社製）0.5 mLを充填し、精製水3.0 mLおよび0.2 mol/Lホウ酸－0.15 mol/L塩化ナトリウム緩衝液（pH 7.5）（以下、ホウ酸バッファーと記す）3.0 mLを順次通筒した。さらに、0.1 mol/Lクエン酸緩衝液（pH 3.5）2.0 mLおよびホウ酸バッファー1.5 mLで順次洗浄することによって担体の平衡化をいった。次に、上記培養上清をカラムに通筒し、ホウ酸バッファー3.0 mLで洗浄した後、0.1 mol/Lクエン酸緩衝液（pH 3.5）1.25 mLを用いて担体に吸着した抗体を溶出した。溶出した抗体溶液は2 mol/L トリス-塩酸緩衝液（pH 8.5）で中和し、Econo-Column(R) Funnel（BIO-RAD社製）を用いたゲル濾過により10 mmo/L KH2PO4緩衝液にバッファー置換したのち、さらにAmicon(R) Ultra（ミリポア社製）を用いてPBSにバッファー置換し、最終精製品とした。取得したDG44-2871株由来の精製抗体をDG44-2871抗体、WK704-2871株由来の精製抗体をWK704-2871抗体と名付けた。
（3）抗GD3キメラ抗体濃度の測定（ELISA法）
　ヤギ抗ヒトIgG（H&L）抗体（American Qualex社製）をPBS（インビトロジェン社製）で希釈して1 μg/mLとし、96穴のELISA用プレート（グライナー社製）に50 μL/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。PBSで洗浄後、BSAを1％の濃度で含むPBS（以下、1％ BSA-PBSと表記する）（和光純薬社製）を100 μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させて残存する活性基をブロックした。1％ BSA-PBSを捨て、濃度既知の精製ヒトIgG1抗体、および上記（1）で取得した抗体生産株の培養上清または上記（2）で取得した精製抗体を50 μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、Tween20を0.05％の濃度で含むPBS（以下、Tween-PBSと表記する）（和光純薬社製）で各ウェルを洗浄後、1％ BSA-PBSで2000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG（H&L）抗体溶液（American Qualex社製）を二次抗体溶液として、それぞれ50 μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、Tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液[2,2'-アジノ-ビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）アンモニウム（和光純薬社製）の0.55 gを1 Lの0.1 mol/Lクエン酸緩衝液（pH 4.2）に溶解し、使用直前に過酸化水素（和光純薬社製）を1 μL/mLで添加した溶液]を50 μL/ウェルで加えて発色させ、415 nmの吸光度（以下、OD415と表記する）を測定した。
（4）抗GD3キメラ抗体の中性糖・アミノ糖組成分析
　実施例1の（2）で取得したDG44-2871抗体およびWK704-2871抗体の中性糖・アミノ糖組成分析を以下のようにして行った。
　抗体を遠心濃縮機で減圧下乾固した後、2.0-4.0 Mのトリフルオロ酢酸溶液を加えて100℃、2-4時間酸加水分解を行い、タンパク質から中性糖・アミノ糖を遊離した。トリフルオロ酢酸溶液を遠心濃縮機で除去し、脱イオン水に再溶解してDionex社製糖分析装置（DX-500）を用いて分析を行った。CarboPac PA-1カラム、CarboPac PA-1ガードカラム（Dionex社製）を用い、溶離液として10-20 mM水酸化ナトリウム－脱イオン水溶解液、洗浄液として500 mM水酸化ナトリウム－脱イオン水溶解液を使用して、溶出プログラムで分析した。得られた溶出プロファイルの中性糖・アミノ糖成分のピーク面積から、N-アセチルグルコサミン比を4とした場合のフコースの組成比を算出した。その結果、DG44-2871抗体ではフコースが結合していない糖鎖の割合が1.1％であった。一方、WK704-2871抗体ではフコースのピークは検出限界以下であったことから、フコースが結合していない糖鎖の割合はほぼ100％と見積もられた。
遺伝子組換え抗GD3モノクローナル抗体の生物活性-1
（1）抗GD3キメラ抗体のGD3に対する結合活性の測定 （ELISA法）
実施例1の（2）で取得したDG44-2871抗体およびWK704-2871抗体のGD3に対する結合活性を、以下の様にして測定した。
ガングリオシドGD3（雪印乳業社製）6.5 μgを、10 μgのフォスファチジルコリン（シグマ社製）と5 μgのコレステロール（シグマ社製）とを含む2 mLのエタノール溶液に溶解し、この溶液20 μLを96穴のELISA用プレート（グライナー社製）の各ウェルにそれぞれ分注し、風乾後、1% BSA-PBS溶液を100 μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させて残存する活性基をブロックした。1％ BSA-PBSを捨て、実施例2の（2）で精製したDG44-2871抗体またはWK704-2871抗体の各種希釈溶液を50 μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、Tween-PBSで各ウェルを洗浄後、1％ BSA-PBS溶液で2000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG（H&L）抗体溶液（American Qualex社製）を二次抗体溶液として50 μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、Tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液を50 μL/ウェルで加えて発色させ、OD415を測定した。
　その結果、DG44-2871、WK704-2871はGD3に対して抗体濃度依存的に結合し、同等の結合活性を示した（図1）。
（2）ドットブロットによる抗GD3キメラ抗体の細菌反応性の解析 
　実施例1の（2）で取得したDG44-2871抗体およびWK704-2871抗体の細菌への反応性を以下の様にして検出した。
（a）細菌の培養
　放線菌（Micromonospora）は、KM-368培地[レジン水1 L に、5 gのグルコース（和光純薬社製）、5 gのSoluble Starch（ナカライテスク社製）、2.5 gのBeef Extract（極東製薬工業製）、2.5 gのYeast Extract（極東製薬工業製）、2.5 gのDifco Tryptone Pepton（Difco社製）、0.5 gのMgSO4・7H2O（和光純薬社製）、1 gのKH2PO4（純正科学社製）、0.5 gのMg3(PO4)2・8H2O（ナカライテスク社製）を溶解し、オートクレーブ滅菌（121℃、20分）して作製]を用いて培養した。まずKM-368培地を太型試験管に10 mL分注し加熱滅菌後、-80℃にてグリセロールストックした細菌を100 μL程度植菌し、好気条件下で28℃にて4日間振とう培養することにより行った。生育した放線菌は、培養液を遠心分離することにより取得した。
　黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）1株、黄色ブドウ球菌（抗菌試験用菌株）1株、黄色ブドウ球菌（ゲンタマイシン耐性、カナマイシン耐性、ストレプトマイシン耐性）1株、黄色ブドウ球菌（カルボマイシン耐性）1株、黄色ブドウ球菌（パロモマイシン耐性、ネオマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性、ストレプトマイシン耐性）1株、黄色ブドウ球菌（リファンピシン耐性）1株、黄色ブドウ球菌（プロテインA生産）1株、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）1株、セレウス菌（Bacillus cereus）3株、シュードモナス・シンキサンタ（Pseudomonas synxantha）1株、巨大菌（Bacillus megaterium）3株の計15株は、YB培地（Yeast Bouillon培地）[レジン水1 Lに、普通ブイヨン培地（極東製薬社製）20 g、Yeast extract（Difco社製）5 g、Bacto Agar（Becton Dickinson 社製）15 gを溶解後、NaOH（ナカライテスク社製）またはHCl（和光純薬社製）でpH 7.2に調整し、オートクレーブ滅菌（121℃、20分）して作製]で作製した寒天培地プレートを用いて、30℃にて3日間培養した。生育した細菌は、エーゼで集めてPBS 1 mLに懸濁し、懸濁液を遠心分離することにより取得した。
　ルーメン内細菌（Streptococcus bovis）1株、ミュータンス菌（Streptococcus mutans）1株の計2株は、BL培地 [レジン水1 Lに、BL寒天培地（日水製薬社製）58gを添加し、オートクレーブ滅菌（121℃、20分）後、約60℃まで放冷し、馬脱繊維血液（日本バイオテスト社製）50 mLを無菌的に添加]で作製した寒天培地プレートを用いて、30℃にて3日間培養した。生育した細菌は、エーゼで集めてPBS 1 mLに懸濁し、懸濁液を遠心分離することにより取得した。
（b）細菌の固定
　上記（a）で取得した細菌を、10 mLのPBSに懸濁して10,000 rpmにて10分間遠心（以下、遠心洗浄と記す）した後、グルタルアルデヒド（純正化学社製）を4％の濃度で含むPBS 1 mLに再懸濁し、室温で1時間反応させて固定した。PBSで2回の遠心洗浄を行った後、PBS 1 mLに再懸濁し、固定化細菌溶液とした。
（c）ドットブッロット法
　ニトロセルロースメンブレン（BIO-RAD社製）に、上記（b）で調製した固定化細菌溶液、ガングリオシドGD3（雪印乳業社製）またはガングリオシドGM2（シグマ社製）をメタノール（和光純薬社製）：クロロホルム（純正化学社製）＝ 3：1に0.5 mg/mLとなるように溶解した溶液、ならびにヒト結腸癌由来細胞株LS180 細胞よりムチン蛋白として精製したTn抗原を含む溶液を、それぞれ5 μLずつ、表1に示す番号順にてスポットして風乾させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　次いで、BSAを3％の濃度で含むPBS溶液（以下、3％ BSA-PBSと記す）にメンブレンを浸し、室温にて1時間反応させて残存する活性基をブロックした。反応後のメンブレンを、実施例1の（2）で取得したWK704-2871抗体を3％ BSA-PBSで2 μg/mLに調製した抗体溶液、または3％ BSA-PBSのみに浸し、室温で1時間反応させた後、Tween20を0.1％の濃度で含むPBS（以下、T-PBSと記す）で3回洗浄した。さらに、3％ BSA-PBS溶液で2000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG（H&L）抗体溶液（American Qualex社製）を二次抗体溶液として加え、室温で1時間反応させた。反応後、T-PBSで3回洗浄後、DAB発色溶液[3,3ジアミノベンジジン四塩酸塩（和光純薬社製）1錠を100 mLのPBSに溶解し、使用直前に過酸化水素（和光純薬社製）を0.5 μL/mLで添加した溶液]を加えて発色させた。
　図2に結果を、表1に使用した細菌18種類及び糖抗原3種類の名称一覧を示す。各番号は、図2に示すドットブロット上の番号に対応する。WK704-2871抗体は、ガングリオシドGM2（GM2）及びTn抗原には反応せず、ガングリオシドGD3（GD3）に特異的に結合した。また、WK704-2871抗体は、使用した全ての細菌に対して、3% BSA-PBSのみを反応させた場合よりも高い染色性を示した。以上より、遺伝子組換え抗GD3モノクローナル抗体が幅広い細菌に結合することが示された。
（3）抗体を介した細菌貪食活性の測定 
　実施例1の（2）で取得したDG44-2871抗体およびWK704-2871抗体のin vitro細菌貪食活性を以下の様にして測定した。
（a）蛍光標識細菌の調製
　実施例2の（2）（b）で調製した固定化細菌溶液0.5 mLに、1 mol/LのNaHCO3溶液50 μLを加え、さらにAlexa Fluor(R) 488タンパク質標識キット（Molecular Probe社製）を添付の説明書に従って添加し、室温で1時間攪拌しながら反応させた。反応後、PBSで4回洗浄した後、0.5 mLのPBSに懸濁し、蛍光標識細菌溶液とした。
（b）ヒト顆粒球の調製
　健常人静脈血50 mLを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）0.5 mLを加え穏やかに混ぜた。15 mL遠心チューブ（ファルコン社製）にMono-Poly Resolving Medium（大日本製薬社製）を3 mLずつ分注し、ヘパリンナトリウム添加健常人静脈血を3.5 mLずつ穏やかに重層し、添付の説明書に従って顆粒球層を分離した。分取した顆粒球層をPBSで2回洗浄した後、1.2×106細胞/mLの細胞密度でPBSに懸濁し、ヒト顆粒球溶液とした。
（c）放線菌を用いた細菌貪食活性の測定
　ローセルバインディングマルチディッシュ24ウェル細胞培養用プレート（Nunc社製）の各ウェルに、上記（a）で調製した蛍光標識細菌1.8×106個を含む50 μLの溶液を播種し、さらにPBSで希釈したDG44-2871抗体またはWK704-2871抗体50 μLを最終濃度1～30 μg/mLとなるように加え、室温で30分間反応させた。次いで上記（b）で調製したヒト顆粒球6×105個を含む溶液500 μLを各ウェルに添加（エフェクター細胞と蛍光標識細菌の比は1：3となる）し、全量600 μLの反応液として37℃または4℃で0.5時間または3時間反応させた。反応後、均一に懸濁した各ウェルの反応液150 μLを15 mL遠心チューブに分取し、さらに1% BSA-PBS 3 mLを加えて遠心し上清を除いたのち、ペレットを1% BSA-PBS 500 μLに懸濁し、PE標識抗ヒトCD66抗体（BDファーミンジェン社製）20 μLを加えて室温にて30分間反応させた。反応後、Lysing solution（BDファーミンジェン社製）3 mLを添加して室温10分間放置し顆粒球を固定したのち、遠心して上清を除き、ペレットを1% BSA-PBS 10 mLに懸濁し、遠心して上清を除いた。ペレットを1% BSA-PBS 1 mLに懸濁し、この500 μLに濃度既知の蛍光ビーズ（BDファーミンジェン社製）50 μLを内部標準として添加し、下記（e）に示すフローサイトメーターFACS Calibur（BDファーミンジェン社製）による解析に供した。
（d）黄色ブドウ球菌を用いた細菌貪食活性の測定
　ローセルバインディングマルチディッシュ96ウェル細胞培養用プレート（Nunc社製）の各ウェルに、上記（a）で蛍光標識した固定化黄色ブドウ球菌（抗菌試験用菌株）4×105個を含む30 μLの溶液を播種し、さらにPBSで希釈したDG44-2871抗体またはWK704-2871抗体30 μLを最終濃度0.3～30 μg/mLとなるように加え、室温で30分間反応させた。次いで上記（b）で調製したヒト顆粒球をアクチン重合阻害により顆粒球の貪食を阻害するサイトカラシンD（シグマ社製、最終濃度5 μg/mLとなるようにDMSOで希釈し調製）またはDMSOで1時間処理した後、ヒト顆粒球1×105個を含むサイトカラシンDまたはDMSO処理溶液60 μLを各ウェルに添加（エフェクター細胞と蛍光標識細菌の比は1：4となる）し、全量120 μLの反応液として37℃で2時間反応させた。反応後、均一に懸濁した各ウェルの反応液120 μLを15 mL遠心チューブに分取し、さらに1% BSA-PBS 3 mLを加えて遠心し上清を除いたのち、ペレットを1% BSA-PBS 500 μLに懸濁し、PE標識抗ヒトCD66抗体（BDファーミンジェン社製）20 μLを加えて室温にて30分間反応させた。反応後、Lysing solution（BDファーミンジェン社製）3 mLを添加して室温10分間放置し顆粒球を固定したのち、遠心して上清を除き、ペレットを1% BSA-PBS 10 mLに懸濁し、遠心して上清を除いた。ペレットを1% BSA-PBS 500 μLに懸濁し、下記（e）に示すフローサイトメーターFACS Calibur（BDファーミンジェン社製）による解析に供した。
（e）フローサイトメーターによる解析
　Forward-scatter / Side-scatter ドットプロットの好中球画分にゲートを設け、ゲート内に5000～10000個の細胞が得られるまで各サンプルを測定した。図3Aに典型的な図を示す。まず、Forward-scatter / Side-scatterドットプロットのゲート内の細胞を、横軸に蛍光標識細菌由来のAlexa488蛍光値、縦軸に抗ヒトCD66抗体由来のPE蛍光値を示す蛍光ドットプロットに展開する。この蛍光ドットプロットにおいて、Alexa488、PEともに陽性となる細胞を、蛍光標識細菌を貪食した好中球として検出した。好中球の細菌貪食活性は、Alexa488陽性好中球の割合（％）、ならびに好中球が取り込んだ細菌量を、以下の式に従って算出することにより評価した。なお、下記の式において、反応液中におけるCD66陽性Alexa488陽性好中球の細胞濃度は、内部標準である蛍光ビーズの数を元に算出した。
 
　Alexa488陽性好中球（％）：蛍光標識細菌由来のAlexa488に陽性となる好中球の割合
＝（CD66陽性Alexa488陽性好中球の数）×100/（CD66陽性好中球の数）
 
　好中球が取り込んだ細菌量：好中球が取り込んだ細菌由来Alexa488の総蛍光強度
＝（CD66陽性Alexa488陽性好中球におけるAlexa488平均蛍光強度）×（細菌貪食を誘導した反応液中におけるCD66陽性Alexa488陽性好中球の数※）
 
※ 細菌貪食を誘導した反応液中におけるCD66陽性Alexa488陽性好中球の数
　　放線菌の場合：
（反応液中におけるCD66陽性Alexa488陽性好中球の細胞濃度）×150 μL
黄色ブドウ球菌の場合：
（Alexa488陽性好中球（％））÷100×100000個（反応液中の全顆粒球数）
 
　図3～5に、放線菌を用いた細菌貪食活性の測定結果を示す。DG44-2871抗体では、30分後、3時間後のいずれにおいても、Alexa488陽性好中球の割合は増加しなかった（図3）。一方、WK704-2871抗体を添加すると、30分後においてもAlexa488陽性好中球の割合が抗体濃度依存的に顕著に増え、3時間後では抗体低濃度でのAlexa488陽性好中球の割合がさらに増加することが明らかとなった。本活性は、好中球の貪食が起こらない4℃では著しく減弱したことから（図4）、WK704-2871抗体は、好中球による抗体依存的な放線菌の貪食を亢進することが示された。また、WK704-2871抗体は、好中球が取り込む細菌量も、DG44-2871に比べて顕著に増加させることが明らかとなった（図5）。
　図6に、黄色ブドウ球菌を用いた細菌貪食活性の測定結果を示す。WK704-2871抗体は、放線菌の場合と同様に、Alexa488陽性好中球の割合（図6A）、ならびに好中球が取り込む細菌量（図6B）をDG44-2871抗体よりも顕著に増加させた。本系に、好中球の貪食を抑制するアクチン重合阻害剤サイトカラシンDを添加すると、WK704-2871抗体によるAlexa488陽性好中球の割合ならびに好中球が取り込む細菌量の増加が認められなかったことから、WK704-2871抗体は、好中球による抗体依存的な黄色ブドウ球菌の貪食を亢進することが示された。
　以上のことから、遺伝子組換え抗GD3モノクローナル抗体が、好中球の抗体依存的な細菌貪食を誘導することを見出し、また本活性が、Fc領域に付加するN-グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンからフコースを除いた遺伝子組換え抗GD3モノクローナル抗体ではより顕著に亢進することを明らかにした。
遺伝子組換え抗GD3モノクローナル抗体の生物活性-2
（1）フローサイトメトリーによる抗GD3キメラ抗体の生菌反応性の解析 
　実施例1の（2）で取得したWK704-2871抗体の生菌への反応性を以下の様にして検出した。
（a）細菌の培養
　黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）6株を用いた。具体的には、American Type Culture Collection (ATCC)から購入したNewman、Wright/ATCC 49525、MW2/BAA-1707、HFH-30364/BAA-1683、F-182/43300、ATCC 35556の6株である。なお、Newmanはペニシリン耐性、HFH-30364/BAA-1683はメチシリンとエリスロマイシン耐性、F-182/ATCC 43300はメチシリン、オキサシリン耐性であることが報告されている。これらの6株は、CNA培地[レジン水1 L に、25 gのグルコース（シグマ社製）、1 gのNaCl （Fisher Biotech社製）、42.5 g のBBL Columbia CNA寒天培地（BD社製）を添加し、オートクレーブ滅菌（121℃、20分）後、約60℃まで放冷して作製]で作製した寒天培地プレートを用いて、37℃にて1日間培養した。振とう培養については、上記で培養した細菌の一部をTSB（Trypticase Soy Broth）[レジン水1 L に、25 gのTrypticase Soy Broth（BD社製）を添加し、オートクレーブ滅菌（121℃、20分）して作製]培地に添加し、OD600 が 0.3 程度に達するまで数時間培養した。
（b）細菌懸濁液の調製
　上記（a）に記載の寒天培地で生育した黄色ブドウ球菌は、エーゼで集めてPBS 10 mLに懸濁し、さらにPBS 15 mLを添加し、懸濁液を遠心した。さらに、PBS 25 mLで1回洗浄し、PBSに懸濁した。液体培地で生育した黄色ブドウ球菌は、培養液を遠心分離した後、PBS 25 mLで2回洗浄し、PBSに懸濁した。両懸濁液のOD600 が 0.5 となるよう、PBSを用いて希釈し、細菌懸濁液とした。
（c）抗体溶液の調製
　実施例2の（2）で精製したWK704-2871抗体及び陰性対照抗体として、抗ジヒドロフェニル（dihydrophenyl;略称DNP）抗体（The Journal of Immunology, 1999, 162: 195-202.）を100 μg/mLとなるように、ラビット血清溶液（Equitech Bio社製、4 mg/mLにPBSで希釈したもの。以下、染色溶液と記載する）を用いて調製した。
（d）染色方法
　96穴のプレート（コースター社製）に上記記載の黄色ブドウ球菌懸濁液を200 μL/ウェルで分注し、遠心した後、ブロッキング剤としてPBSを用いて調製した40 mg/mLのラビット血清（Equitech Bio社製） 200 μL/ウェルを添加し、4℃で1時間反応させた。上清を捨て、上記(c)で調製した抗体溶液を50 μL/ウェルで分注し、4℃で1時間反応させた。反応後、PBSで各ウェルを洗浄後、上記の染色溶液で200倍に希釈したFITC標識ヤギ抗ヒトIgG抗体溶液（Southern Biotech社製）を二次抗体溶液として、それぞれ50 μL/ウェルで加え、4℃で30分間反応させた。反応後、10％ホルマリン溶液（シグマ社製）を50 μL/ウェルで加え、4℃で10分間反応させた。PBSで洗浄後、フローサイトメーターFACS Calibur (BDファーミンジェン社製)を用いて、Forward-scatter / Side-scatterドットプロットの細菌画分にゲートを設け、そのゲートに含まれるFL1の蛍光強度を測定した。
　その結果、WK704-2871 抗体は、使用した全ての生菌に対して、抗 DNP 抗体を反応させた場合よりも明らかに高い染色性を示した。また、WK704-2871 抗体は培養方法にかかわらずNewman、ATCC 35556に染色性を示した。以上より、実施例1に示す固定化細菌だけでなく、生きた黄色ブドウ球菌の複数株に対しても、遺伝子組換え抗GD3モノクローナル抗体が結合できることが明らかとなった。
（2）抗GD3キメラ抗体の生菌に対する殺菌活性の解析
　実施例1の（2）で取得したWK704-2871抗体の生菌に対する殺菌活性を以下の様にして検出した。
（a）細菌懸濁液の調製
　実施例3の（1）の(a)に記載の方法に従って寒天培養したNewmanを HBSS （Ca、Mg不含）を用いて回収し、HBSS （Ca、Mg不含）で合計2回洗浄後、HBSS （Ca、Mg不含）に懸濁した。吸光度OD600 が 0.875 になるようにHBSS （Ca、Mg不含）に懸濁し（2.5 × 108 CFU（コロニーフォーミングユニット）/mLとなる）、細菌懸濁液とした。
（b）黄色ブドウ球菌に対する抗体を除去した非働化血漿の調製
　実施例2の（3）の（b）に記載した方法により採取した健常人静脈血 40 mLを2回遠心し、血漿に実施例3の（1）の（a）に記載する寒天培養方法により培養したNewman及びATCC 35556をそれぞれ血漿10 mL当たり5 × 1011 CFU/mLずつ添加し、4℃で1時間チューブを転倒させながら反応させた。反応液を遠心して得られた上清に、再びNewman及びATCC 35556をそれぞれ血漿10 mL当たり5 × 1011 CFU/mLずつ添加し、4℃で1時間チューブを転倒させながら反応させた。同様に反応後の上清とNewman及びATCC 35556を反応させた後、上清を回収し、0.22 μmのフィルターを通し、使用時まで -20℃で凍結保存した。使用時に、凍結融解後、56℃で45分間反応させ、遠心して得られた上清を非働化血漿として用いた。
（c）ヒト顆粒球の調製
　実施例2の（3）の（b）に記載する方法により調製したヒト顆粒球を1.25 × 107 細胞/mLの細胞密度でHBSS （Ca、Mg不含）に懸濁し、ヒト顆粒球溶液とした。
（d）殺菌活性の測定
　96ウェル丸底プレート（コースター社製）の各ウェルに、全量が100 μL の反応液となるよう予めHBSS (Ca、Mg含有) を添加し、次いで PBS で希釈した抗 DNP 抗体または WK704-2871 抗体 10 μL を最終濃度 10～30 μg/mL となるように添加し、さらに上記（b）で調製したヒト顆粒球 2.5×105 個を含む溶液 10 μL、又はコントロールとしてHBSS （Ca、Mg不含）を添加した。さらに、上記（b）で記載の非働化血漿 10 μL、及び上記（a）で調製した細菌 2.5×106 個を含む 20 μL の溶液を播種し（エフェクター細胞と細菌の比は1：10となる）、37℃で 3 時間反応させた。反応後、10～10000 倍希釈した反応液 5 μL を TSA （Trypticase Soy Agar） 寒天培地[レジン水1 L に、25 gのTrypticase Soy Agar（BD社製）を添加し、オートクレーブ滅菌（121℃、20分）後、約60℃まで冷却して作製]に播種し、一晩 37℃で培養した。翌日、生存したコロニー数を測定した。
　結果を図7に示す。ドナーにかかわらず、顆粒球存在下では、抗 DNP 抗体に比べ WK704-2871 抗体を添加すると、反応後の生存細菌数が明らかに減少することが明らかとなった。なお、検定を行った結果、P < 0.05で有意差があることを確認した。以上より、遺伝子組換え抗GD3モノクローナル抗体は、抗生物質に耐性を有する生きた黄色ブドウ球菌に対して顆粒球依存的な殺菌活性を発揮することを明らかにした。
（3）抗GD3キメラ抗体の細菌貪食活性の解析
　実施例1の（2）で取得したWK704-2871抗体の細菌貪食活性を以下の様にして検出した。
（a）蛍光標識細菌懸濁液の調製
　実施例3の（1）の(a)に記載の方法に従って寒天培養したATCC 35556を、HBSS（Ca、Mg不含）を用いて回収し、HBSS （Ca、Mg不含）で合計2回洗浄後、HBSS （Ca、Mg不含）に懸濁した。56℃で45分間反応させ、細菌を死滅させた後、PBSで2回洗浄した。吸光度 OD600 が 2.0 になるようにPBSに懸濁し、FITC（Molecular Probe社製）の終濃度が100 μg/mLとなるようにFITC溶液（DMSOを用いて100 mg/mLに調製）を添加後、4℃で一晩チューブを転倒させながら反応させた。PBSで5回洗浄後、10％グリセロール/PBSに懸濁し、使用時まで－20℃で保存した。
使用時に、FITC標識細菌溶液を解凍し、HBSS （Ca、Mg含有）で2回洗浄後、セルカウンターを用いて細菌のコロニーフォーミングユニット濃度（CFU/mL）を測定し、2.5 × 108 CFU/mLとなるようにHBSS (Ca、Mg含有)を用いて調製し、蛍光標識細菌懸濁液とした。
（b）ヒト顆粒球の調製
　実施例2の（3）の（b）に記載する方法により調製したヒト顆粒球を2.5 × 107 細胞/mLの細胞密度でHBSS（Ca、Mg不含）に懸濁し、ヒト顆粒球溶液とした。
（c）細菌貪食活性の測定
　96ウェル丸底プレート（コースター社製）の各ウェルに、全量が 100 μLの反応液とるよう予めHBSS (Ca、Mg含有) を添加し、次いで PBS で希釈した抗 DNP 抗体または WK704-2871 抗体 10 μLを最終濃度 0.01～10 μg/mL となるように加え、さらに上記（b）で調製したヒト顆粒球 5×105 個を含む溶液 20 μL を各ウェルに添加した。次いで、上記（a）で調製した蛍光標識細菌 5×106 個を含む 20 μL の溶液を播種し（エフェクター細胞と蛍光標識細菌の比は1：10となる）、37℃で15分間反応させた。反応後、冷却した 0.1% BSA-PBS 90 μL を加えて遠心し上清を除いたのち、0.1% BSA-PBS で2回洗浄した。ペレットを 10 μL の 0.1% BSA-PBS に懸濁した。懸濁液 1 μL に 20 倍希釈したエチジウムブロマイド溶液 1 μL を混合した後、蛍光顕微鏡下でFITC 標識細菌を取り込み緑色の蛍光を帯びた好中球数（好中球の外側に結合した細菌由来のFITC はエチジウムブロマイドによって赤い蛍光を帯びるようになる）を測定した。好中球の貪食活性はカウントした総好中球のうち蛍光標識細菌を貪食し、FITC陽性として検出される好中球の割合（％）として算出した。結果を図8B に示した。
　残り 9 μLの懸濁液は 200 μL の 0.1% BSA-PBS に懸濁後、下記（d）に示すフローサイトメーターFACS Calibur（BDファーミンジェン社製）による解析に供した。具体的には、Forward-scatter / Side-scatterドットプロットの顆粒球画分にゲートを設け同定した好中球の貪食活性は、全好中球のうち蛍光標識細菌を貪食しFITC陽性として検出される好中球の割合(％)として算出した。結果を図8Aに示した。
　その結果、好中球の貪食活性は 0.1 μg/mL や 1 μg/mL といった抗 GD3　抗体低濃度の条件においても顕著な貪食活性が認められた。なお、実施例3の（2）の(b) で調製した 2.5% ヒト血漿（補体含有）を添加した場合においても、抗体濃度が1 μg/mLの条件において顕著な貪食活性が認められた。
　以上のことから、遺伝子組換え抗GD3モノクローナル抗体は、補体の有無にかかわらず、好中球による細菌貪食活性を誘導することが明らかとなった。
　本発明により、ガングリオシドGD3に特異的に結合する抗体を有効成分として含有する細菌感染症の治療剤または予防剤を提供することができる。
配列番号9：Human VH-KM8871
配列番号10：Human VL-KM8871

Claims (16)

  1. 細菌を生体内から排除する活性を有し、ガングリオシドGD3に特異的に結合する遺伝子組換え抗体を有効成分として含有する細菌感染症の治療剤または予防剤。
  2. 細菌を生体内から排除する活性を有し、ガングリオシドGD3に特異的に結合する遺伝子組換え抗体が、細菌に反応する抗体である請求項1に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
  3. 細菌を生体内から排除する活性を有し、ガングリオシドGD3に特異的に結合する遺伝子組換え抗体が、細菌に対する障害活性を誘導する抗体である請求項1または2に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
  4. 細菌に対する障害活性が、抗体依存性細胞貪食（ADCP）活性である請求項1～3のいずれか一項に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
  5. 遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体またはヒト型CDR移植抗体である、請求項1～4のいずれか一項に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
  6. 遺伝子組換え抗体が、抗体の重鎖（以下、H鎖と記す）の相補性決定領域（complementarity determining region、以下CDRと記す）1～3が配列番号1～3で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体の軽鎖（以下、L鎖と記す）のCDR1～3が配列番号4～6で表されるアミノ酸配列である抗体と、競合してガングリオシドGD3に結合する遺伝子組換え抗体である、請求項1～5のいずれか一項に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
  7. 遺伝子組換え抗体が、抗体のH鎖のCDR1～3が配列番号1～3で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のL鎖のCDR1～3が配列番号4～6で表されるアミノ酸配列である抗体と、同じエピトープに結合する遺伝子組換え抗体である、請求項1～5のいずれか一項に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
  8. 遺伝子組換え抗体が、抗体のH鎖のCDR1～3が配列番号1～3で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のL鎖のCDR1～3が配列番号4～6で表されるアミノ酸配列である遺伝子組換え抗体である、請求項1～5のいずれか一項に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
  9. ヒト型キメラ抗体が、抗体の重鎖可変領域（以下、VHと記す）が配列番号7で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体の軽鎖可変領域（以下、VLと記す）が配列番号8で表されるアミノ酸配列である抗体と、競合してガングリオシドGD3に結合するヒト型キメラ抗体である、請求項5に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
  10. ヒト型キメラ抗体が、抗体のVHが配列番号7で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のVLが配列番号8で表されるアミノ酸配列である抗体と、同じエピトープに結合するヒト型キメラ抗体である、請求項5に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
  11. ヒト型キメラ抗体が、抗体のVHが配列番号7で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のVLが配列番号8で表されるアミノ酸配列であるヒト型キメラ抗体である、請求項5に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
  12. ヒト型CDR移植抗体が、抗体のVHが配列番号9で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のVLが配列番号10で表されるアミノ酸配列である抗体と、競合してガングリオシドGD3に結合するヒト型CDR移植抗体である、請求項5に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
  13. ヒト型CDR移植抗体が、抗体のVHが配列番号9で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のVLが配列番号10で表されるアミノ酸配列である抗体と、同じエピトープに結合するヒト型CDR移植抗体である、請求項5に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
  14. ヒト型CDR移植抗体が、抗体のVHが配列番号9で表されるアミノ酸配列であり、かつ抗体のVLが配列番号10で表されるアミノ酸配列であるヒト型CDR移植抗体である、請求項5に記載の細菌感染症の治療剤または予防剤。
  15. 請求項1～14のいずれか1項に記載の治療剤を患者に投与することを特徴とする細菌感染症の治療方法。
  16. 請求項1～14のいずれか1項に記載の予防剤を患者に投与することを特徴とする細菌感染症の予防方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014027656A1 (ja) * 2012-08-13 2014-02-20 協和発酵キリン株式会社 補体Ｃ３ｂによる細菌の菌体表面への沈着および貪食細胞による貪食活性を増加させる方法、並びに細菌感染症の治療方法および治療剤
WO2016185035A1 (en) * 2015-05-20 2016-11-24 Cellectis Anti-gd3 specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001002704A (ja) * 1999-06-18 2001-01-09 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 大腸菌感染防止剤
WO2003085107A1 (fr) * 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellules à génome modifié
WO2005035740A1 (ja) * 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 無血清馴化したゲノム改変細胞

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001002704A (ja) * 1999-06-18 2001-01-09 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 大腸菌感染防止剤
WO2003085107A1 (fr) * 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellules à génome modifié
WO2005035740A1 (ja) * 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 無血清馴化したゲノム改変細胞

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
USUKI S. ET AL: "Molecular mimicry: sensitization of Lewis rats with Campylobacter jejuni lipopolysaccharides induces formation of antibody toward GD3 ganglioside", JOURNAL OF NEUROSCIENCE RESEARCH, vol. 83, no. 2, 2006, pages 274 - 284, XP009137107, DOI: doi:10.1002/jnr.20717 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014027656A1 (ja) * 2012-08-13 2014-02-20 協和発酵キリン株式会社 補体Ｃ３ｂによる細菌の菌体表面への沈着および貪食細胞による貪食活性を増加させる方法、並びに細菌感染症の治療方法および治療剤
WO2016185035A1 (en) * 2015-05-20 2016-11-24 Cellectis Anti-gd3 specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy

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