WO2011040220A1 - 膵臓がん治療用の組成物 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a composition for treating pancreatic cancer having an action mechanism that suppresses the expression of a specific gene.
  • RNA interference means that a short complementary double-stranded RNA fragment (siRNA) promotes the degradation of mRNA having a complementary sequence, thereby causing the expression of the gene
  • siRNA short complementary double-stranded RNA fragment
  • Non-Patent Document 1 An antisense nucleic acid forms a double strand with mRNA, thereby inhibiting the synthesis of the protein that the mRNA should bear.
  • cancer occurs when a normal cell changes to a cancer cell due to a malfunction of a molecule (nucleic acid, protein) that is a gene product.
  • a molecule nucleic acid, protein
  • Many molecules are involved in the survival and proliferation of cancer cells, and it is clarified which molecules play an important role in them, and by suppressing the expression of these important molecules, It is possible to prevent survival, proliferation and tumorigenicity. Therefore, by identifying a molecule that inhibits the survival, proliferation, and tumorigenicity of cancer cells by suppressing its expression, it becomes possible to develop a molecular diagnostic method targeting it.
  • siRNA having a specific sequence can be used as a nucleic acid drug by using a specific short double-stranded RNA for suppression of molecular expression.
  • Pancreatic cancer is known worldwide as an intractable cancer, and is the 5th most common cause of cancer death by organ in Japan. As of 2000, 20045 people were affected and 19093 were dead. And most of those affected are extremely malignant diseases that die. In addition, the number of affected persons is increasing year by year, and the number of affected persons has tripled in 25 years from 1975 to 2000 (Cancer Statistics, Cancer Research Foundation). Also, globally, pancreatic cancer is the fifth leading cause of cancer death in the western world, showing the highest mortality among malignant tumors, with a 5 year survival rate of only 4% (for example, Non-patent document 2). These facts indicate that it is difficult to cure pancreatic cancer with current medical technology, and there is a need for the development of effective new medical treatment methods.
  • Patent Documents 1 and 2 Inventions related to pharmaceuticals whose mechanism is suppression of expression of specific genes for the purpose of treating pancreatic cancer are known (Patent Documents 1 and 2).
  • Patent Document 1 aims to suppress the expression of genes (Bcl-2 family) related to inhibition of apoptosis, and the subject is not limited to pancreatic cancer.
  • Patent Document 2 relates to a CST6 gene and a GABRP gene related to pancreatic cancer. Although it has been confirmed that these genes are upregulated in pancreatic cancer patients, this gene expression is enhanced. Is unconfirmed to cause pancreatic cancer. Therefore, it is possible to diagnose pancreatic cancer and predict its risk by measuring gene expression, but the possibility of treatment of pancreatic cancer by suppressing gene expression is uncertain. *
  • SON SON DNA binding protein
  • MCM5 minichromosome maintenance complex component 5
  • WDR5 WD repeat domain 5
  • PBK PDZ binding kinase
  • CENPA centromere protein A
  • histone H3 that constitutes the chromosome centromere
  • kinetocore Non-patent Document 9
  • Non-patent Document 10 a signal transmission pathway-related gene group in pancreatic cancer cells
  • Non-patent Document 10 a signal transmission pathway-related gene group in pancreatic cancer cells
  • the relationship between these genes and the growth, survival, and tumorigenicity of pancreatic cancer cells Is totally unknown.
  • Special Table 2004-519457 Special table 2009-505632 gazette Fire et al. Nature 391: 806-11, 1998 Zervos EE, et al. Cancer Control 11: 23-31, 2004 Mattioni et al. Chromosoma 101: 618-624, 1992 Wynn et al. Genomics 68: 57-62, 2000 (Ahn et al. PNAS 105: 17103-8, 2008) Snyder et al.
  • pancreatic cancer there is a need for an effective treatment method for pancreatic cancer.
  • Methods using antisense nucleic acids and siRNA are expected to be effective, but the target genes have not been fully elucidated.
  • genes relating to the growth, survival and tumorigenicity of pancreatic cancer cells are not known.
  • the present invention has been made in view of the circumstances as described above, and is for treating pancreatic cancer that effectively suppresses the growth of pancreatic cancer cells, inhibits survival and inhibits tumorigenicity by suppressing the expression of a specific gene. It is an object to provide a composition.
  • Non-patent Document 10 the signal transduction pathway-related gene group (Non-patent Document 10) previously identified in pancreatic cancer cells, and the effect of their expression suppression on the survival, proliferation, and tumorigenicity of pancreatic cancer cells. By examining in vitro and in vivo, it was confirmed that specific gene expression was effective in treating pancreatic cancer, and the present invention was completed.
  • the present invention relates to a composition for treating pancreatic cancer, which suppresses the expression of at least one gene selected from the group consisting of SON gene, MCM5 gene, WDR5 gene, PBK gene and CENPA gene
  • a composition for treating pancreatic cancer comprising a pharmaceutically effective amount of nucleic acid or siRNA.
  • the siRNA sense strand that suppresses the expression of the SON gene includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3
  • the siRNA sense strand that suppresses the expression of the MCM5 gene includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5
  • the sense strand of siRNA that suppresses the expression of WDR5 gene includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7
  • the sense strand of siRNA that suppresses the expression of PBK gene includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9
  • the expression of CENPA gene In the composition, the sense strand of the siRNA to be suppressed comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, respectively.
  • the present invention is a method for screening an active ingredient of a therapeutic drug for pancreatic cancer, wherein the expression level of at least one gene selected from the group consisting of SON gene, MCM5 gene, WDR5 gene, PBK gene and CENPA gene is measured.
  • a candidate substance that reduces or decreases the biological activity of a protein encoded by the gene is selected as a target substance.
  • pancreatic cancer cells By effectively inhibiting the growth, survival, and tumorigenicity of pancreatic cancer cells by the composition of the present invention, the progression of pancreatic cancer is suppressed, or pancreatic cancer cells are eliminated, or surgery, Prognosis with chemotherapy is good.
  • the screening method of the present invention makes it possible to identify low molecular compounds that can be active ingredients of therapeutic drugs for pancreatic cancer.
  • Example 1 it is the result of having verified the effect of siRNA with respect to the proliferation of a pancreatic cancer cell.
  • Example 2 it is the result of having verified the effect of siRNA with respect to survival and proliferation of pancreatic cancer cells.
  • Example 3 it is the result of having verified the effect of siRNA with respect to the tumorigenicity of a pancreatic cancer cell.
  • Example 4 it is the result of having verified the effect of siRNA with respect to each proliferation of a normal pancreatic duct epithelial cell and a pancreatic cancer cell.
  • composition for treating pancreatic cancer of the present invention comprises an anti-antibody that suppresses expression of at least one gene of a SON gene, an MCM5 gene, a WDR5 gene, a PBK gene, and a CENPA gene (hereinafter sometimes collectively referred to as “target gene”). It comprises a pharmaceutically effective amount of sense nucleic acid or siRNA.
  • mRNA sequences of these target genes are known (SON: GenBank / NM_138927, MCM5: GenBank / NM_006739, WDR5: GenBank / NM_017588, PBK: GenBank / NM_018492, CENPA: GenBank / NM_001809), and based on these sequence information Sense nucleic acids and siRNA can be prepared.
  • the antisense nucleic acid of the present invention binds to a nucleic acid of a target gene or mRNA corresponding thereto, inhibits transcription or translation of the gene, promotes degradation of mRNA, and / or promotes expression of a protein encoded by the target gene. Inhibits and ultimately suppresses protein function.
  • This antisense nucleic acid is a nucleotide that is completely complementary to the target sequence as long as it can specifically hybridize to the target gene or its mRNA sequence (hereinafter sometimes referred to as “target sequence”), Alternatively, it may be a nucleotide having one or more nucleotide mismatches.
  • the antisense nucleic acid of the present invention contains at least 15 consecutive nucleotide sequences of at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more with respect to the target sequence.
  • the antisense nucleic acid of the present invention may be a modified oligonucleotide.
  • nuclease resistance can be imparted to an antisense nucleic acid.
  • the antisense nucleic acid of the present invention binds to DNA or mRNA encoding a target protein, inhibits transcription or translation, promotes degradation of mRNA, suppresses expression of the target protein, and suppresses function of the target protein. Affects the growth, survival, and tumorigenicity of pancreatic cancer cells.
  • composition of the present invention may be substantially the antisense nucleic acid itself, but if necessary, an excipient, an isotonic agent, a solubilizer, a stabilizer, a preservative, an analgesic, etc. By adding, it can be prepared as a dosage form such as tablet, powder, granule, capsule, liposome capsule, injection, solution and the like.
  • composition containing the antisense nucleic acid of the present invention is administered to a patient by injecting it directly into the affected area or by injecting it into a blood vessel so as to reach the affected area.
  • Antisense encapsulants are also used to increase persistence and membrane permeability. For example, liposomes, poly-L-lysine, lipids, cholesterol, lipofectin or derivatives thereof are included.
  • the dose of the antisense nucleic acid of the present invention can be, for example, in the range of 0.1 to 100 mg / kg, preferably 0.1 to 50 mg / kg depending on the patient's pathological condition.
  • the siRNA of the present invention is a double-stranded RNA molecule that prevents translation of the target gene mRNA, and consists of a sense strand and an antisense strand for the target mRNA.
  • siRNA can be introduced into cells by standard methods. For example, there is a method of introducing a DNA molecule as a template for RNA into a cell. At that time, the structure in which the sense strand and the antisense strand are integrated in a hairpin shape may be used so that the transcript from the DNA molecule becomes a single body.
  • the siRNA preferably has a length of 500, 200, 100, 50, or 25 nucleotides or less in the sense strand and the antisense strand. More preferably, the siRNA is 19-25 nucleotides in length.
  • the siRNA sequence can be designed using a siRNA design computer program available from the Ambion website (http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html).
  • siRNA may be appropriately modified.
  • cholesterol-binding siRNA has been shown to improve pharmacological properties (Song et al. Nature Med. 9: 347-51, 2003).
  • siRNA for each target gene as the sense strand, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 for SON, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 for MCM5, and the sequence of SEQ ID NO: 7 for WDR5
  • the nucleotide sequence includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 for PBK and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 for CENPA.
  • the antisense strand can be selected from nucleotide sequences that are substantially the same length as the sense strand and hybridize with the sense strand. More specifically, each siRNA is a double-stranded RNA having the following nucleotide sequence.
  • Sense strand-1 5'-gcaucuagacguucuaugaug-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • Antisense strand-1 5'-ucauagaacgucuagaugcua-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • Sense strand-2 5'-gauucuuacaccgauucuuac-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • Antisense strand-2 5'-aagaaucgguguaagaaucag-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • MCM5 Sense strand: 5'-gaacucaagcggcauuacaac-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • Antisense strand 5'-uguaaugccgcuugaguucau-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • WDR5 Sense strand: 5'-gaggccccuucagucuuguuc-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • Antisense strand 5'-a
  • shRNA short hairpin RNA
  • pSUPER vector, Oligoengine each 19 ′ base on the 5 ′ side of the sense strand and the antisense strand.
  • shRNA short hairpin RNA
  • siRNAs can be directly introduced into cells in a form capable of binding to the target mRNA.
  • a method of introducing an expression vector incorporating a DNA encoding siRNA into a cell may be employed.
  • transfection promoters such as FuGENE (Rochediagnostices), Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Oligofectamine (Invitrogen), Nucleofector (Wako Pure Chemical Industries) can be used.
  • the antisense strand against the target mRNA is transcribed by a first promoter (e.g., a promoter sequence on the 3 ′ side of the cloned DNA), and the sense strand is transcribed by a second promoter (e.g., Transcribed by a promoter sequence on the 5 ′ side of the cloned DNA).
  • a first promoter e.g., a promoter sequence on the 3 ′ side of the cloned DNA
  • a second promoter e.g., Transcribed by a promoter sequence on the 5 ′ side of the cloned DNA
  • the sense strand and the antisense strand hybridize in the cell to form a double strand.
  • the siRNA sense strand and antisense strand can be transcribed separately using two vectors.
  • the template DNA may encode a siRNA having a secondary structure such as a hairpin, in which case a single transcript has both a sense strand and an antisense strand.
  • a hairpin loop structure an arbitrary loop sequence is arranged between the sense strand and the antisense strand.
  • the loop sequence can be selected from the list on the Abion website.
  • the screening method of the present invention is a candidate substance that reduces the expression level of at least one of the SON gene, MCM5 gene, WDR5 gene, PBK gene, and CENPA gene, or reduces the biological activity of the protein encoded by the gene. Is identified as an active ingredient of a therapeutic agent for pancreatic cancer.
  • the screening method of the present invention includes a target gene, a protein encoded by the gene, or a compound that suppresses the expression of the gene or the biological activity of the protein encoded by the gene using the transcriptional regulatory region of the gene, etc. To screen.
  • a screening method for a target protein includes the following steps. (1) contacting a candidate substance with a target protein; (2) detecting the binding activity between the target protein and the candidate substance; and (3) A step of selecting a substance that binds to the target protein.
  • Detection of the binding activity between the target protein and the candidate substance in the step (2) is performed by immunoprecipitation (for example, Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988), West-Western blot Analysis (Skolnik et al., Cell 65: 83-90, 1991), two-hybrid system (Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612, 1992, Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92, 1994) It can be carried out. Screening can also be performed using affinity chromatography or a biosensor using the surface plasmon resonance phenomenon.
  • a method for screening immobilized substances by contacting an immobilized target protein with a low molecular compound library, a natural substance bank, or a random phage peptide display library, for isolating a substance that binds to a target protein High-throughput screening method (Wrighton et al., Science 273: 458-64, 1996; Verdine, Nature 384: 11-13, 1996; Hogan, Nature 384: 17-9, 1996) etc. You can also
  • the target protein in the present invention is responsible for the growth, survival and tumorigenicity of pancreatic cancer cells, substances that inhibit these activities can be identified.
  • the substance specified by this screening is, for example, an antagonist for the target protein.
  • the screening method of the present invention screens substances that reduce the expression level of the target gene.
  • the method includes the following steps: (1) contacting a candidate substance with a cell expressing the target gene; (2) measuring a target gene expression level of the cell; and (3) selecting a substance that reduces the expression level of the target gene compared to the control; including.
  • the cells that express the target gene include, for example, cell lines established from pancreatic cancer cells (for example, KLM1, PK1, PK59, MIA-PACa-2, etc.).
  • target cells may be transfected with normal cells.
  • the expression level can be detected by a method known in the art.
  • the screening method of the present invention can also target an agent for the transcriptional regulatory region of the target gene.
  • the method includes the following steps: (1) A step of bringing a candidate substance into contact with a cell into which a vector containing a fusion DNA in which a reporter gene is linked downstream of a transcription control region of a target gene is introduced; (2) measuring the expression of the reporter gene; and (3) selecting a substance that reduces reporter gene expression, including.
  • Such a reporter assay is a method known in the art, and a reporter gene and a host cell can be appropriately selected.
  • the candidate substances in the screening method include, for example, cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, extracts from marine organisms, plant extracts, purified proteins or crude proteins, peptides, non-peptide compounds, Synthetic low molecular weight compounds, natural compounds, and the like.
  • SiRNA for SON sense strand-1 (SEQ ID NO: 1) and antisense strand-1 (SEQ ID NO: 2)
  • SiRNA against MCM5 sense strand (SEQ ID NO: 5) and antisense strand (SEQ ID NO: 6)
  • SiRNA against WDR5 sense strand (SEQ ID NO: 7) and antisense strand (SEQ ID NO: 8)
  • SiRNA for PBK sense strand (SEQ ID NO: 9) and antisense strand (SEQ ID NO: 10)
  • SiRNA against CENPA sense strand (SEQ ID NO: 11) and antisense strand (SEQ ID NO: 12)
  • the introduced cells are cultured in DMEM + 10% FBS for 5 days, and the degree of cell proliferation is determined by a colorimetric method using 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT method).
  • FIG. 1 shows the degree of proliferation on the fourth day after introduction.
  • siRNA Negative control
  • siRNA against SON consisting of sense strand-2 (SEQ ID NO: 3) and antisense strand-2 (SEQ ID NO: 4) has the same cell growth inhibitory effect as siRNA consisting of sense strand-1 and antisense strand-1. Indicated.
  • siRNA of the present invention effectively suppresses the proliferation of pancreatic cancer cells.
  • pSUPER vector which expresses short hairpin RNA (shRNA), SEQ ID NOs: 1, 2, and 5
  • shRNA short hairpin RNA
  • SEQ ID NOs: 1, 2, and 5 A vector expressing shRNA containing the same sequence as the 5'-side 19 bases of each of 6, 7, and 8, 9 and 10, 11 and 12, was constructed according to the Oligoengine instruction manual.
  • Each shRNA expression vector was introduced into pancreatic cancer cell lines MIA PACa-2 and PCI-35 using Lipofectamine (Invitrogen), and selective culture with G418 was performed for 4 weeks to determine the number of surviving colonies. The details of the introduction method depended on the instruction manual of Invitrogen.
  • siRNA of the present invention effectively inhibits the survival of pancreatic cancer cells.
  • shRNA containing the same sequence as the 19 'base of 5' side of each siRNA of SEQ ID NO: 1 and 2, 7 and 8, 9 and 10, 11 and 12 MIA-PACa-2 cells into which the expression vector was introduced were selected with a selective medium containing G418 to establish a shRNA constant expression clone, transplanted subcutaneously into nude mice, observed for 6 weeks, and the formed tumor diameter was measured.
  • the siRNA of the present invention effectively inhibits the tumorigenicity of pancreatic cancer cells.
  • the clone which constitutively expresses the shRNA containing the siRNA sequence which targets MCM5 of SEQ ID NO: 5 and 6 was not obtained, the effect of the siRNA of SEQ ID NO: 5 and 6 on the tumorigenicity of pancreatic cancer cells is unknown It is.
  • siRNA The effect of siRNA on the proliferation of normal pancreatic duct epithelial cells and pancreatic cancer cells was verified.
  • Each siRNA was introduced into normal pancreatic duct epithelial cells (HPDE) and pancreatic cancer cell line (MIA PACa-2) in the same manner as in Example 1, and the degree of cell proliferation was determined in the same manner as in Example 1. It was measured.
  • HPDE pancreatic duct epithelial cells
  • MIA PACa-2 pancreatic cancer cell line

Abstract

　SON遺伝子、MCM5遺伝子、WDR5遺伝子、PBK遺伝子およびCENPA遺伝子からな る群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸またはsiRNAの薬学的有効量を含み、特定遺伝子の発現抑制により、膵臓がん細胞の増殖抑制、生存阻害および造腫瘍性阻止を効果として現す膵臓癌治療用の組成物を提供する。

Description

膵臓がん治療用の組成物
　本願発明は、特定遺伝子の発現抑制を作用機序とする膵臓がん治療用の組成物に関するものである。
　遺伝子が転写するmRNAを標的として、遺伝子の発現を抑制する技術が知られている。RNA干渉法(RNA interference：以下「RNAi」と記載することがある)とは、短い相補的二重鎖RNA断片（siRNA）が相補的配列を有するmRNAの分解を促すことにより当該遺伝子の発現が特異的に抑制される現象を利用する方法である（非特許文献１）。また、アンチセンス核酸は、mRNAと２本鎖を形成することで、そのmRNAが担うべきタンパク質の合成を阻害するといった働きを持つ。これらの方法により、塩基配列が判明している任意の遺伝子の発現を人為的に特異的に抑制することが可能となり、アンチセンス核酸やsiRNAは核酸薬物としての有用性を示すことが明らかとなった。アンチセンス核酸やsiRNAの合成方法は既存の技術として確立しており、比較的安価に製造することが可能である。
　一方、がんは遺伝子の産物である分子(核酸、タンパク)の機能異常によって正常細胞ががん細胞に変化することによりおこる。がん細胞の生存、増殖には多くの分子が関与しており、それらの中でどの分子が重要な役割を果たすかを明らかにし、それら重要な分子の発現を抑制することによってがん細胞の生存、増殖、造腫瘍性を阻止することが可能となる。よって、発現を抑制することによりがん細胞の生存、増殖、造腫瘍性を阻止する分子を同定することで、それを標的とした分子診療法の開発が可能となる。また、分子発現の抑制に特異的短二重鎖RNAを用いることにより、特異的配列を持つsiRNAを核酸薬物として使用することができる。
　膵臓がんは世界的に難治性のがんとして知られており、日本における統計において臓器別がん死因の第5位であり、2000年の時点で罹患者は20045人、死亡者は19093人であり、罹患者のほとんどは死亡する極めて悪性の疾患である。また、罹患者は年々増加しており、1975-2000年の25年間に罹患者は3倍となっている（がんの統計、がん研究振興財団）。
また、世界的にみても、膵臓がんは西側世界において第5位のがん死因であり、悪性腫瘍の中で最も高い死亡率を示し、5年生存率は4％でしかない（例えば、非特許文献２）。これらの事実は現在の医療技術では膵臓がんを治癒させるのは困難であり、効果的な新しい診療法の開発が求められていることを示している。
　膵臓がんの治療を目的として特定遺伝子の発現抑制を機序とする医薬に関する発明が知られている（特許文献１、２）。ただし、特許文献１は、アポトーシスの阻害に関連する遺伝子（Bcl-2ファミリー）の発現抑制を目的とするものであり、対象は膵臓がんに限定されない。また、がん細胞特異的にアポトーシスを生じさせるためには（すなわち、正常細胞を死滅させないためには）、RNA分子をがん細胞にのみ正確に導入する必要がある。一方、特許文献２は、膵臓がんに関連するCST6遺伝子およびGABRP遺伝子に関するものであり、これらの遺伝子が膵臓がん患者において発現亢進していることは確認されているものの、この遺伝子発現の亢進が膵臓がんの原因であることは未確認である。したがって、遺伝子発現を測定することによって膵臓がんの診断やその危険性の予見は可能であるが、遺伝子発現を抑制することによる膵臓がんの治療の可能性については全く不確定である。　
　なお、SON遺伝子、MCM5遺伝子、WDR5遺伝子、PBK遺伝子およびCENPA遺伝子についてはそれぞれ以下が知られている。SON（SON DNA binding protein）はDNA結合分子として報告されているがその詳細な機能は明らかになっていない(非特許文献３－５)。MCM5（minichromosome maintenance complex component 5）はDNA 複製因子として機能する分子である（非特許文献６）。WDR5（WD repeat domain 5）はヒストンH3リジン4と相互作用し、発生に必須の機能を有している（非特許文献７）。PBK（PDZ binding kinase）はMAP2K群に属するリン酸化酵素であり、DNA障害性の反応に関与する（非特許文献８）。CENPA（centromere protein A）は染色体動原体を構成するヒストンH3に相当し、キネトコアに必須の働きをする（非特許文献９）。ただし、これらの遺伝子が膵臓がん細胞の生存、増殖、造腫瘍性に関係することは知られていない。
　さらに、本願発明者は膵臓がん細胞における信号伝達経路関連遺伝子群を同定しているが(非特許文献１０)、これらの遺伝子と膵臓がん細胞の増殖、生存、造腫瘍性との関連性は全く未知である。
特表2004-519457号公報 特表2009-505632号公報 Fire et al. Nature 391:806-11, 1998 Zervos EE, et al. Cancer Control 11:23-31, 2004 Mattioni et al. Chromosoma 101:618-624, 1992 Wynn et al. Genomics 68:57-62, 2000 Ahn et al. PNAS 105:17103-8, 2008) Snyder et al. PNAS 102:14539-44, 2005 Wysocka et al. Cell 121:859-72, 2005 Nandi et al. Biochem Biophys Res Commun 358:181-188, 2007 McClelland et al. EMBO J 26:5033-5047, 2007 Furukawa et al. Oncogene 25:4831-9, 2006
　前記のとおり、膵臓がんに対する有効な治療方法が求められている。アンチセンス核酸やsiRNAを使用する方法はその有効性が期待されているが、標的となる遺伝子については十分に解明されていない。特に、膵臓がん細胞の増殖、生存、造腫瘍性に関する遺伝子については知られていない。
　本願発明は、以上の通りに事情に鑑みてなされたものであって、特定遺伝子の発現抑制により、膵臓がん細胞の増殖抑制、生存阻害および造腫瘍性阻止を効果として現す膵臓がん治療用の組成物を提供することを課題としている。
　本願発明者は膵臓がん細胞において先に同定した信号伝達経路関連遺伝子群(非特許文献１０)を対象に、それらの発現抑制が膵臓がん細胞の生存、増殖、造腫瘍性に及ぼす効果を試験管内及び生体内で調べ、特定の遺伝子発現が膵臓がん治療に有効であることを確認して本願発明を完成させた。
　本願発明は、膵臓がんを治療するための組成物であって、SON遺伝子、MCM5遺伝子、WDR5遺伝子、PBK遺伝子およびCENPA遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸またはsiRNAの薬学的有効量を含む膵臓がん治療用の組成物である。
　さらに詳しくは、SON遺伝子の発現を抑制するsiRNAのセンス鎖が、配列番号１または３のヌクレオチド配列を含み、MCM5遺伝子の発現を抑制するsiRNAのセンス鎖が、配列番号５のヌクレオチド配列を含み、WDR5遺伝子の発現を抑制するsiRNAのセンス鎖が、配列番号７のヌクレオチド配列を含み、PBK遺伝子の発現を抑制するsiRNAのセンス鎖が、配列番号９のヌクレオチド配列を含み、そしてCENPA遺伝子の発現を抑制するsiRNAのセンス鎖が、配列番号１１のヌクレオチド配列をそれぞれ含む組成物である。
　さらに本願発明は、膵臓がん治療薬の有効成分をスクリーニングする方法であって、SON遺伝子、MCM5遺伝子、WDR5遺伝子、PBK遺伝子およびCENPA遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを低下させるか、または当該遺伝子がコードするタンパク質の生物活性を低下させる候補物質を目的物質として選択することを特徴とする方法である。
　本願発明の組成物によって、膵臓がん細胞の増殖、生存、造腫瘍性を効果的に阻害することによって、膵臓がんの進行を抑制し、あるいは膵臓がん細胞を消滅させ、または外科手術や化学療法なとの予後を良好なものとすることができる。
　また、本願発明のスクリーニング方法によって、膵臓がんの治療薬物の有効成分となりえる低分子化合物等を同定することが可能となる。
実施例１において、膵臓がん細胞の増殖に対するsiRNAの効果を検証した結果である。 実施例２において、膵臓がん細胞の生存、増殖に対するsiRNAの効果を検証した結果である。 実施例３において、膵臓がん細胞の造腫瘍性に対するsiRNAの効果を検証した結果である。 実施例４において、正常膵管上皮細胞と膵臓がん細胞のそれぞれの増殖に対するsiRNAの効果を検証した結果である。
　本願発明の膵臓癌治療用の組成物は、SON遺伝子、MCM5遺伝子、WDR5遺伝子、PBK遺伝子およびCENPA遺伝子（以下、「標的遺伝子」と総称することがある）の少なくとも１つの遺伝子発現を抑制するアンチセンス核酸またはsiRNAの薬学的有効量を含むことを特徴とする。
　これら標的遺伝子のmRNA配列は公知であり（SON: GenBank/NM_138927、MCM5: GenBank/NM_006739、WDR5：GenBank/NM_017588、PBK：GenBank/NM_018492、CENPA：GenBank/NM_001809）、これらの配列情報に基づいてアンチセンス核酸やsiRNAを調製することができる。
　本願発明のアンチセンス核酸は、標的遺伝子の核酸またはそれに対応するmRNAに結合して、遺伝子の転写もしくは翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、および／または標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を抑制して、最終的にタンパク質の機能を抑制する。このアンチセンス核酸は、標的遺伝子またはそのmRNAの配列（以下、「標的配列」と記載することがある）に特異的にハイブリダイズすることができる限り、標的配列と完全に相補的であるヌクレオチド、または１以上のヌクレオチドのミスマッチを有するヌクレオチドであってもよい。例えば、本発明のアンチセンス核酸は、少なくとも15個連続したヌクレオチド配列において、標的配列に対して少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上の相同性を有するポリヌクレオチドである。なお、相同性は、当技術分野で周知のアルゴリズムを用いて決定することができる。
　また、本発明のアンチセンス核酸は、修飾オリゴヌクレオチドであってもよい。例えば、チオエート化オリゴヌクレオチドを用いることで、アンチセンス核酸にヌクレアーゼ抵抗性を付与することができる。
　本発明のアンチセンス核酸は、標的タンパク質をコードするDNAまたはmRNAに結合し、転写または翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、標的タンパク質の発現を抑制し、標的タンパク質の機能を抑制することによって、膵臓がん細胞の増殖、生存、造腫瘍性に作用する。
　本願発明の組成物は、実質的にこのアンチセンス核酸それ自体であってもよいが、必要に応じて、賦形剤、等張剤、溶解剤、安定化剤、保存剤、鎮痛剤等を加えることによって、錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル、注射剤、溶液などの剤形として調製することができる。
　本願発明のアンチセンス核酸を含有する組成物は、患部に直接注入すること、または患部に達するように血管に注入することによって、患者に投与される。アンチセンス封入剤も、持続性および膜透過性を増加させるために使用される。例えば、リポソーム、ポリ-L-リジン、脂質、コレステロール、リポフェクチンまたはこれらの誘導体が含まれる。
　本発明のアンチセンス核酸の用量は、患者の病態に応じて、例えば、0.1～100 mg/kg、好ましくは0.1～50 mg/kgの範囲とすることができる。
　本願発明のsiRNAは、標的遺伝子mRNAの翻訳を防止する二本鎖RNA分子であり、標的mRNAに対するセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる。siRNAは標準的な方法によって細胞に導入することができる。例えば、RNAの鋳型となるDNA分子を細胞内に導入する方法などである。その際に、DNA分子からの転写物が単一体となるように、センス鎖およびアンチセンス鎖がヘアピン型に一体化した構造であってもよい。
　本願発明において、siRNAは好ましくは、センス鎖およびアンチセンス鎖が500、200、100、50、もしくは25ヌクレオチドまたはそれ未満の長さを有する。より好ましくは、siRNAは19～25ヌクレオチド長である。
　siRNAの配列は、Ambionのウェブサイト（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）から入手できるsiRNA設計コンピュータープログラムを用いて設計することができる。
　また、siRNAに対しては、適宜に修飾をおこなってもよい。例えば、コレステロール結合siRNAは薬理学的特性を改善することが示されている（Song et al. Nature Med. 9：347-51, 2003）。
　各標的遺伝子に対するsiRNAの具体例としては、センス鎖として、SONに対しては配列番号１または３のヌクレオチド配列、MCM5に対しては配列番号５のヌクレオチド配列、WDR5に対しては配列番号７のヌクレオチド配列、PBKに対しては配列番号９のヌクレオチド配列、そしてCENPAに対しては配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。アンチセンス鎖は、上記のセンス鎖と略同一長であり、かつセンス鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列を選択することができる。より具体的には、それぞれのsiRNAは以下のヌクレオチド配列からなる２本鎖RNAである。
SON：
センス鎖-1：　　　5'-gcaucuagacguucuaugaug-3'（配列番号１）
アンチセンス鎖-1：5'-ucauagaacgucuagaugcua-3'（配列番号２）
センス鎖-2：　　　5'-gauucuuacaccgauucuuac-3'（配列番号３）
アンチセンス鎖-2：5'-aagaaucgguguaagaaucag-3'（配列番号４）
MCM5：
センス鎖：　　　　5'-gaacucaagcggcauuacaac-3'（配列番号５）
アンチセンス鎖：　5'-uguaaugccgcuugaguucau-3'（配列番号６）
WDR5：
センス鎖：　　　　5'-gaggccccuucagucuuguuc-3'（配列番号７）
アンチセンス鎖：　5'-acaagacugaaggggccucgc-3'（配列番号８）
PBK：
センス鎖：　　　　5'-cugugauguaggagucucucu-3'（配列番号９）
アンチセンス鎖：　5'-agagacuccuacaucacagau-3'（配列番号１０）
CENPA：
センス鎖：　　　　5'-ggguauuuuuguaguuucuuu-3'（配列番号１１）
アンチセンス鎖：　5'-agaaacuacaaaaauacccau-3'（配列番号１２）
　また、本願発明のsiRNAは、アンチセンス鎖として前記の配列番号２、４、６、８、１０、１２のそれぞれのヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、アンチセンス鎖と略同一長であり、かつアンチセンス鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列を選択することができる。さらに、後記の実施例に示したように、短ヘアピン型RNA(shRNA)を発現するベクター（例えば、pSUPERベクター、Oligoengine）を用いて、前記のセンス鎖とアンチセンス鎖の各々5'側19塩基を含むshRNAとして発現させるようにしてもよい。shRNAは細胞内でプロセスされてsiRNAに変換される事が知られている。
　これらのsiRNAは、標的mRNAと結合し得る形態で、細胞内に直接導入することができる。または、siRNAをコードするDNAを組込んだ発現ベクターを細胞内に導入する方法を採用することもできる。ベクターを細胞に導入するために、FuGENE(Rochediagnostices)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)、Nucleofector(和光純薬工業)等のトランスフェクション促進剤を使用することができる。
　発現ベクターを使用する場合は、例えば、標的mRNAに対するアンチセンス鎖を第1のプロモーター(例えば、クローニングされたDNAの3'側にあるプロモーター配列)によって転写させ、センス鎖を第2のプロモーター(例えば、クローニングされたDNAの5'側にあるプロモーター配列)によって転写させる。この場合、センス鎖とアンチセンス鎖は、細胞内においてハイブリダイズして2本鎖を構成する。または、2つのベクターを利用して、siRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ別個に転写させることもできる。鋳型となるDNAは、例えばヘアピンのような二次構造を有するsiRNAをコードしてもよく、この場合は単一の転写産物がセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する。なお、ヘアピンループ構造を形成させるためには、任意のループ配列をセンス鎖とアンチセンス鎖との間に配置する。ループ配列は、前記Abionのウェブサイトのリストから選択することができる。
　次に、本願発明のスクリーニング方法について説明する。
　本願発明のスクリーニング方法は、SON遺伝子、MCM5遺伝子、WDR5遺伝子、PBK遺伝子およびCENPA遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを低下されるか、または当該遺伝子がコードするタンパク質の生物活性を低下させる候補物質を膵臓がん治療薬の有効成分として特定する。
　すなわち、本願発明のスクリーニング方法は、標的遺伝子、その遺伝子がコードするタンパク質、もしくはその遺伝子の転写調節領域を利用して、遺伝子の発現もしくは遺伝子がコードするタンパク質の生物学的活性を抑制する化合物等をスクリーニングする。
　例えば、標的タンパク質を対象とするスクリーニング方法は、以下の工程を含む。
(1)候補物質を、標的タンパク質と接触させる工程；
(2)標的タンパク質と候補物質との結合活性を検出する工程；および
(3)標的タンパク質へ結合する物質を選択する工程。
　工程(2)における標的タンパク質と候補物質との結合活性の検出は、免疫沈降法（例えば、Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988）、ウェスト-ウェスタンブロット解析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90, 1991）、ツーハイブリッドシステム（Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612, 1992、Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92, 1994）などによって行うことができる。また、アフィニティークロマトグラフィーや、表面プラズモン共鳴現象を用いたバイオセンサーを用いてスクリーニングすることもできる。
　さらに、固定化された標的タンパク質を、低分子化合物ライブラリー、天然物質バンク、またはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーと接触させ、結合する物質をスクリーニングする方法、標的タンパク質に結合する物質を単離するためのコンビナトリアルケミストリー技術に基づくハイスループットスクリーニング法（Wrighton et al., Science 273: 458-64, 1996; Verdine, Nature 384: 11-13, 1996; Hogan, Nature 384: 17-9, 1996）等を採用することもできる。
　さらに、標的タンパク質の生物活性を低下させる物質をスクリーニングする場合には、例えば、以下の工程：
(1)候補物質を標的タンパク質と接触させる工程；
(2)標的タンパク質の生物学的活性を検出する工程；および
(3) 候補物質の非存在下で検出される標的タンパク質の生物学的活性と比較して、標的タンパク質の生物学的活性を抑制する物質を選択する工程、
を含む。
　すなわち、本願発明における標的タンパク質は、膵臓がん細胞の増殖、生存、造腫瘍性を担っているため、これらの活性を阻害する物質を特定することができる。
　このスクリーニングによって特定される物質は、例えば、標的タンパク質に対するアンタゴニストである。
　本願発明のスクリーニング方法は、標的遺伝子の発現レベルを低下させる物質をスクリーニングする。この方法は、例えば、以下の工程：
(1)標的遺伝子を発現する細胞に候補物質を接触させる工程；
(2)細胞の標的遺伝子発現レベルを測定する工程；および
(3)標的遺伝子の発現レベルを、対照と比較して低下させる物質を選択する工程、
を含む。
　標的遺伝子を発現する細胞には、例えば、膵臓がん細胞から樹立された細胞株が含まれる（例えば、KLM1、PK1、PK59、MIA PACa-2など）。また、正常細胞に標的遺伝子DNAをトランスフェクションしてもよい。発現レベルは、当該技術分野における公知の方法によって検出することができる。
　本願発明のスクリーニング方法は、標的遺伝子の転写制御領域に対する作用物質を対象とすることもできる。この方法は、例えば、以下の工程：
(1)標的遺伝子の転写制御領域の下流にレポーター遺伝子を連結した融合DNAを含むベクターを導入した細胞に候補物質を接触させる工程；
(2)レポーター遺伝子の発現を測定する工程；および
(3)レポーター遺伝子の発現を低下させる物質を選択する工程、
を含む。
　このようなレポーターアッセイは、当該技術分野において公知の方法であり、レポーター遺伝子や宿主細胞は適宜に選択することができる。
　なお、前記のスクリーニング方法における候補物質は、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物の産物、海洋生物からの抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、天然化合物などである。
　以下、実施例を示して本願発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本願発明は以下の例に限定されるものではない。
　膵臓がん細胞の増殖に対するsiRNAの効果を検証した。
ヒト膵臓がん細胞株MIA PaCa-2を5x103/wellの濃度で96-well plateに播き、10% fetal bovine serum 入りDulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM+10% FBS) を用いて37°C, 5% CO2下で一晩培養した。翌日、以下のsiRNAをoligofectamine (Invitrogen)を用いて10、 50、100nMの濃度で導入した。導入方法の詳細はInvitrogen社の使用説明書に依った。
SONに対するsiRNA:センス鎖-1（配列番号１）とアンチセンス鎖-1（配列番号２）
MCM5に対するsiRNA：センス鎖（配列番号５）とアンチセンス鎖（配列番号６）
WDR5に対するsiRNA：センス鎖（配列番号７）とアンチセンス鎖（配列番号８）
PBKに対するsiRNA：センス鎖（配列番号９）とアンチセンス鎖（配列番号１０）
CENPAに対するsiRNA：センス鎖（配列番号１１）とアンチセンス鎖（配列番号１２）
　導入した細胞についてDMEM+10% FBSで5日間培養し、細胞増殖の程度を3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromideを用いた比色測定法(MTT法)により毎日計測した。
結果として図１に導入4日目の増殖程度を示す。いかなるヒト遺伝子に対しても相補的でない配列を持つsiRNA (Negative control)導入細胞と比較して、各siRNAを導入した細胞の増殖は有意に抑制された。
　また、センス鎖-2（配列番号３）とアンチセンス鎖-2（配列番号４）からなるSONに対するsiRNAも、センス鎖-1およびアンチセンス鎖-1からなるsiRNAと同様の細胞増殖抑制効果を示した。
　以上の結果から、本願発明のsiRNAは膵臓がん細胞の増殖を効果的に抑制することが確認された。
　比較的長期にわたる膵臓がん細胞の生存、増殖に対するsiRNAの効果を検証するため、短ヘアピン型RNA(shRNA)を発現するベクターであるpSUPERベクター(Oligoengine)を用いて配列番号1と2、5と6、7と8、9と10、11と12の各siRNAの5'側19塩基と同様の配列を含むshRNAを発現するベクターをOligoengine社使用説明書に沿って構築した。各々のshRNA発現ベクターを膵臓がん細胞株MIA PACa-2, PCI-35にLipofectamine (Invitrogen)を用いて導入し、G418による選択培養を4週間行って生存コロニー数を測定した。導入方法の詳細はInvitrogen社の使用説明書に依った。
　結果として図２にMIA PaCa-2細胞の生存コロニー数を示す。Negative controlのsiRNAに相当するshRNA発現ベクターを導入した細胞と比較して、配列番号1-2、5-6、7-8、9-10、11-12のsiRNAに相当するshRNA発現ベクターを導入した細胞の生存コロニー数は有意に抑制された。
　以上の結果から、本願発明のsiRNAは膵臓がん細胞の生存を効果的に阻害することが確認された。
　膵臓がん細胞の造腫瘍性に対するsiRNAの効果を検証するため、配列番号1と2、7と8、9と10、11と12の各siRNAの5'側19塩基と同様の配列を含むshRNA発現ベクターを導入したMIA PACa-2細胞をG418入り選択培地で選択してshRNA恒常発現クローンを樹立し、それをヌードマウス皮下に移植して6週間観察し、形成された腫瘍径を測定した。
　結果は図３に示したとおりである。Negative controlのsiRNAに相当するshRNA発現クローンと比較して、各shRNA発現ベクターを導入した細胞の造腫瘍性は有意に抑制された。
　以上の結果から、本願発明のsiRNAは膵臓がん細胞の造腫瘍性を効果的に阻止することが確認された。なお、配列番号5と6のMCM5を標的とするsiRNA配列を含むshRNAを恒常的に発現するクローンは得られなかったため配列番号5と6のsiRNAの膵臓がん細胞の造腫瘍性に対する効果は不明である。
　正常膵管上皮細胞と膵臓がん細胞のそれぞれの増殖に対するsiRNAの効果を検証した。
　正常膵管上皮細胞（HPDE）と膵臓がん細胞株（MIA PACa-2）のそれぞれに、実施例１と同様の方法で各siRNAを導入し、実施例１と同様の方法で細胞増殖の程度を測定した。
　結果は図４に示したとおりであり、各siRNAは正常細胞の増殖には有意な抑制効果を示さなかった。

Claims (7)

  1. 膵臓がんを治療するための組成物であって、SON遺伝子、MCM5遺伝子、WDR5遺伝子、PBK遺伝子およびCENPA遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸またはsiRNAの薬学的有効量を含む膵臓がん治療用の組成物。
  2. SON遺伝子の発現を抑制するsiRNAのセンス鎖が、配列番号１または３のヌクレオチド配列を含む請求項１の組成物。
  3. MCM5遺伝子の発現を抑制するsiRNAのセンス鎖が、配列番号５のヌクレオチド配列を含む請求項１の組成物。
  4. WDR5遺伝子の発現を抑制するsiRNAのセンス鎖が、配列番号７のヌクレオチド配列を含む請求項１の組成物。
  5. PBK遺伝子の発現を抑制するsiRNAのセンス鎖が、配列番号９のヌクレオチド配列を含む請求項１の組成物。
  6. CENPA遺伝子の発現を抑制するsiRNAのセンス鎖が、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む請求項１の組成物。
  7. 膵臓がん治療薬の有効成分をスクリーニングする方法であって、SON遺伝子、MCM5遺伝子、WDR5遺伝子、PBK遺伝子およびCENPA遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを低下させるか、または当該遺伝子がコードするタンパク質の生物活性を低下させる候補物質を目的物質として選択することを特徴とする方法。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140141015A1 (en) 2010-09-20 2014-05-22 Douglas Lake QSOX1 as an Anti-Neoplastic Drug Target
US8946186B2 (en) 2010-09-20 2015-02-03 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Arizona State University QSOX1 as an anti-neoplastic drug target
ES2560604T3 (es) * 2011-06-09 2016-02-22 Deutsches Krebsforschungszentrum Moduladores de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPD2) para terapia
US20150072877A1 (en) * 2013-09-06 2015-03-12 Tokyo Women's Medical University Composition for treatment of pancreatic cancer

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004519457A (ja) 2001-01-09 2004-07-02 リボファルマ アーゲー 標的遺伝子の発現を阻害する方法および腫瘍を治療するための医薬
JP2009505632A (ja) 2005-07-27 2009-02-12 オンコセラピー・サイエンス株式会社 膵臓癌関連遺伝子であるｃｓｔ６およびｇａｂｒｐ

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2566286A1 (en) * 2004-05-11 2005-12-08 Rnai Co., Ltd. Polynucleotide causing rna interfere and method of regulating gene expression with the use of the same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004519457A (ja) 2001-01-09 2004-07-02 リボファルマ アーゲー 標的遺伝子の発現を阻害する方法および腫瘍を治療するための医薬
JP2009505632A (ja) 2005-07-27 2009-02-12 オンコセラピー・サイエンス株式会社 膵臓癌関連遺伝子であるｃｓｔ６およびｇａｂｒｐ

Non-Patent Citations (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AHN ET AL., PNAS, vol. 105, 2008, pages 17103 - 8
AHN, E.Y. ET AL.: "Disruption of the NHR4 domain structure in AML1-ETO abrogates SON binding and promotes leukemogenesis", PROC NATL ACAD SCI U S A, vol. 105, no. 44, 2008, pages 17103 - 17108, XP008160242 *
DALTON; TREISMAN, CELL, vol. 68, 1992, pages 597 - 612
FIELDS; STERNGLANZ, TRENDS GENET, vol. 10, 1994, pages 286 - 92
FIRE ET AL., NATURE, vol. 391, 1998, pages 806 - 11
FURUKAWA ET AL., ONCOGENE, vol. 25, 2006, pages 4831 - 9
GREENHALF, W. ET AL.: "A selection system for human apoptosis inhibitors using yeast", YEAST, vol. 15, no. 13, 1999, pages 1307 - 1321, XP002174101 *
HARLOW; LANE: "Antibodies", 1988, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PUBLICATIONS, pages: 511 - 52
HOGAN, NATURE, vol. 384, 1996, pages 17 - 9
MATTIONI ET AL., CHROMOSOMA, vol. 101, 1992, pages 618 - 624
MCCLELLAND ET AL., EMBO J, vol. 26, 2007, pages 5033 - 5047
NANDI ET AL., BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN, vol. 358, 2007, pages 181 - 188
See also references of EP2484385A4
SKOLNIK ET AL., CELL, vol. 65, 1991, pages 83 - 90
SNYDER ET AL., PNAS, vol. 102, 2005, pages 14539 - 44
SONG ET AL., NATURE MED., vol. 9, 2003, pages 347 - 51
VERDINE, NATURE, vol. 384, 1996, pages 11 - 13
WRIGHTON ET AL., SCIENCE, vol. 273, 1996, pages 458 - 64
WYNN ET AL., GENOMICS, vol. 68, 2000, pages 57 - 62
WYSOCKA ET AL., CELL, vol. 121, 2005, pages 859 - 72
ZERVOS EE ET AL., CANCER CONTROL, vol. 11, 2004, pages 23 - 31

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