WO2011039629A2 - Fracción bioactiva de petiveria alliacea, composición farmacéutica que la contiene y combinación con agentes inmunoestimulantes para el tratamiento del cáncer - Google Patents

Fracción bioactiva de petiveria alliacea, composición farmacéutica que la contiene y combinación con agentes inmunoestimulantes para el tratamiento del cáncer Download PDF

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WO2011039629A2
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Maria Claudia Cifuentes Barreto
John Fredy HERNANDEZ MONTAÑO
Sandra Paola Santander Gonzalez
Claudia Patricia URUEÑA PINZON
Diana Mercedes CASTAÑEDA UVAJOA
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Pontificia Universidad Javeriana
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention belongs to the medical field and is related to a bioactive fraction of Petiveria alliacea with antitumor activity for the manufacture of medicaments for the treatment of cancer and the pharmaceutical composition comprising it together with one or more excipients.
  • the invention relates to a pharmaceutical combination for the treatment of cancer comprising a bioactive fraction of Petiveria alliacea with antitumor activity and at least one immunostimulating agent capable of producing phenotypic and / or functional maturation of dendritic cells. Also part of the invention is a new method for the treatment of cancer comprising the sequential administration of a bioactive fraction of Petiveria alliacea and an immunostimulating agent.
  • Cancer occurs when the mechanisms that maintain the normal growth rate of the cells are altered and generate an excess of cell division. This alteration is frequently due to mutations that occur in the genome of any cell in the body, which induce a cellular transformation that can generate a malignant tumor with the ability to invade adjacent normal tissue and perform metastases. During this process of malignant transformation, some of the tumor cells develop simultaneous primary or acquired resistance to multiple cytotoxic drugs (Cooper G. 2004), so the search for new antitumor compounds constitutes an area of interest.
  • Tumors are classified according to the type of cell they come from, the most frequent being carcinomas (generated from epithelial cells), followed by sarcomas (solid tumors of rare connective tissues) and leukemia or lymphomas (cells of hematopoietic origin ) (Cooper G. 2004).
  • More than 100 drugs are currently used in chemotherapy and can be classified depending on the molecular target that generates its therapeutic activity; We find among other drugs that generate the cross-linking of DNA (cisplatin), the alkylation of bases (dacarbazine), the alteration of microtubules (taxol, vinblastine), the alteration of membranes (doxorubicin), structural analogs (methotrexate) and topoisomerase inhibitors ( etoposide, topotecan).
  • doxorubicin the alteration of membranes
  • metalhotrexate structural analogs
  • topoisomerase inhibitors etoposide, topotecan
  • the primary or acquired resistance of tumor cells to multiple drugs generates a considerable decrease in the expected clinical response to drug therapy (Katzung B. Basic and clinical pharmacology).
  • Two elements are important in the elimination of tumors: (1) the destruction of the tumor cell without adverse effects on normal cells and (2) the generation of a subsequent immune response to the treatment capable of eliminating residual tumor cells.
  • cytotoxic or antiangiogenic antitumor agents has been the method of choice in the treatment of cancer, this does not ensure true protection against subsequent tumor development.
  • an effective immune response develops and the control of metastases secondary to the spread of the tumor through blood is achieved.
  • the use of a treatment method that in addition to inducing tumor death allows the subsequent control of residual tumor proliferation constitutes an advance in antitumor therapy.
  • Some herbal supplements made from plants used in traditional oriental medicine such as Sho-Saiko-to and Juzen-taiho-to, induce tumor death by inhibiting metastasis and subsequently allow the generation of an antitumor response (Kato M 1998; Day and 2001).
  • the compounds responsible for tumor death have been partially characterized but the type of death has not been studied. that tumor cells suffer, nor have dendritic cell activating compounds (CD) been clearly identified.
  • Effective antitumor therapy should take into account not only the death of the tumors, but the type of death that they will suffer. Although death from apoptosis is the most studied, it is well known that the transfer of tumor antigens to CDs occurs more efficiently if death is subsequent to cellular stress, which generates an increase in heat shock proteins that participate in the process. of cross sensitization to CDs, allowing the activation of cytotoxic T lymphocytes. Death by apoptosis with late necrosis could be one of the best ways to eliminate tumors.
  • Petiveria alliacea Linn is a perennial herb of the Phytolaccaceae family widely known in traditional medicine in the countries of Central, South America, the Caribbean and Africa (Lopes-Martins RA et al, 2002).
  • infusion of the leaves and cooking or root powder have been used in the treatment of different diseases due to their antispasmodic, anti-rheumatic, anti-inflammatory properties (López Martins RAB 2002; Morales C et al, 2001), antinociceptives (Distasi L et al, 1988), hypoglycemic agents and abortifacient agents (De Lima et al, 1991; De Sousa JR et al, 1987).
  • aqueous and alcoholic infusions have been used for the treatment of leukemia and breast cancer with good results (Gupta M, 1995; Garc ⁇ a B, 1974).
  • a bioactive fraction of Petiveria alliacea which induces cell death by different routes: it acts on the cytoskeleton inducing cell cycle arrest in the G2 phase; and subsequently, induces apoptosis by mitochondrial-dependent or independent mechanisms related to the polarity of the fraction.
  • the complexity of the fractions of the invention also allows the induction of cellular stress by altering the expression of inducible HSP70 and generating the senescence of a part of the cell population, thus allowing the amplification of the immune response. Therefore, the biological activity of the fractions of the invention on multiple molecular targets of the tumor cells opens the possibility of overcoming the mechanisms of drug resistance developed by the tumor cells.
  • the induction of the immune response depends on several factors, among these cell debris generated during apoptosis and necrosis, have been reported as a source of antigens that can be phagocytosed by CDs (professional antigen presenting cells) to be presented at immune system.
  • CDs professional antigen presenting cells
  • activation of the dendritic cell is induced with an immunostimulatory agent, which used after antitumor treatment, allows antigen presentation to T lymphocytes and the generation of an effective immune response.
  • the benefits of this type of therapy are to ensure that once the cell Tumor has been destroyed, a partial activation of the dendritic cell does not occur leading to the induction of tolerance against tumor antigens, but on the contrary, there is an effective activation of the presenting cell and therefore of the immune response.
  • the present invention teaches a method of treatment for the removal of tumor cells through the administration of a biaoactive fraction of Petiveria alliacea with antitumor activity on multiple cellular functions and on the other hand, activating the antigen presenting CDs to the immune system, which have phagocytized in vivo the remains of tumor cells, by administering an immunostimulating agent.
  • This double therapy allows the destruction of the tumor and subsequently, the activation of the specific immune response of the tumor by a mechanism of cross sensitization.
  • the invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of cancer comprising a bioactive fraction of Petiveria alliacea with antitumor activity and at least one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • Said composition may be administered independently or as part of a combination for the treatment of cancer comprising the previously defined composition and one or more immunostimulatory agents capable of inducing phenotypic and / or functional maturation of CDs.
  • the invention relates to a bioactive fraction of Petiver ⁇ a alliacea obtained by bio-directed methodologies, standardized and analytically labeled for the treatment of cancer.
  • the invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of cancer comprising: a bioactive fraction of Petiveria alliacea and at least one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • the invention provides a pharmaceutical combination for the treatment of cancer comprising a bioactive fraction of Petiveria alliacea or a pharmaceutical composition containing it and at least one immunostimulating agent capable of producing phenotypic and / or functional maturation of the cells. dendritic
  • composition comprising one or more immunostimulatory agents capable of producing phenotypic and / or functional maturation of dendritic cells and at least one or more pharmaceutically acceptable excipients and optionally, the instructions for use.
  • the invention provides a method for the treatment of cancer comprising the sequential administration of at least a bioactive fraction of Petiveria alliacea in a therapeutically effective amount or of a composition containing it and, in a time interval between 24 hours and 2 weeks, the administration of a therapeutically effective amount of at least one immunostimulatory agent capable of producing phenotypic and / or functional maturation of dendritic cells.
  • FIGURES Figure 1 shows the effect of different crude extracts of Petivena alliacea obtained with ethanol, ethyl acetate and dichloromethane on the viability of NB4 tumor cells.
  • Figure 2 shows the effect induced by the FAST bioactive fraction of Petivena alliacea on the clonogenic capacity of the 4T1 cell line.
  • Figure 3 shows the increase in Pyramva kinase mRNA in 4T1 cells treated with the FAST fraction of Petivena alliacea.
  • Figure 4 shows the mass spectrum of the FAST bioactive fraction of Petivéria alliacea obtained with an LC-TOF mass spectrometer equipped with an ESI source in positive and negative ion.
  • Figure 5 shows the arrest in the G2 / M phase of the cell cycle in A375 tumor cells induced by the bioactive fraction F4 of Petivéria alliacea.
  • TO Bioactive fraction
  • F4 of Petivéria alliacea.
  • B Diagram of the cell cycle of A375 cells treated with the bioactive fraction F4 during a kinetics of 12, 24 and 48h.
  • Figure 6 shows the reorganization of actin fibers in normal A375 cells (A) and treated with the bioactive fraction F4 of Petivéria alliacea (B).
  • Figure 7 shows the DNA fragmentation induced by the bioactive fraction F4 of Petivéria alliacea (B) compared to the control (A) in A375 cells.
  • Figure 8 shows the effect of the bioactive fraction F4 on the growth of normal mononuclear cells without treatment (A) or previously treated with PHA (B).
  • Figure 9 corresponds to the chromatogram of the bioactive fraction F4 of Petiveria alliacea obtained by HPLC (RP-18 column, 5 ⁇ (2.1 x150 mm); mobile phase H 2 0: ACN (4: 6) with PDA detector.
  • Figure 10 shows the mass spectrum of the bioactive fraction F4 of Petiveria alliacea obtained with a MALDI-TOF detector with HCCA matrix.
  • Figure 1 1 shows the induction of morphological changes and the decrease in cell viability of the NB4 (A), Mel-Rel (B) and K562 (C) lines after 24h of treatment with the bioactive fraction S3 of Petiveria alliacea.
  • Figure 12 shows the effect on the mitochondrial membrane induced by treatment with the bioactive fraction S3 of Petiveria alliacea on the NB4, Mel-Rel and K562 lines.
  • Figure 13 shows nuclear fragmentation and chromatin condensation in the NB4 lines treated with the bioactive fraction S3 of Petiveria alliacea at a concentration of 31.2pg / ml for 24 hours.
  • Figure 14 shows the decrease in the expression of Hsp70 induced by the bioactive fraction S3 of Petiveria alliacea in K562 cells with (panel A) or without thermal shock (panel B).
  • Figure 15 shows the mass spectrum of the bioactive fraction S3 of Petiveria alliacea obtained with an LC-TOF mass spectrometer equipped with an ESI source in positive and negative ion.
  • Figure 16 shows the expression of CD86 and HLA-DR costimulatory molecules on a population of CDs obtained from CMSP treated with: H 2 0 (negative control), LPS (positive control) and the immunostimulant polysaccharide.
  • Figure 17 shows the production of TNF- ⁇ by CDs stimulated by the polysaccharide determined by ELISA.
  • immunosenser refers to an agent that is capable of producing phenotypic maturation (moderate increase in CD86 and HLA-DR) and / or functional dendritic cells (TNF- ⁇ production) and are examples especially considered within of the invention polysaccharides and / or glycopeptides obtained from: Ganoderma lucidum, Astragalus membraneceus, Grifóla frondosa, Phellinus linteus, Cordyceps militaris, Lentinus edodes, Coriolus versicolor, Agaricus blazei or Petiveria alliacea.
  • standardized bioactive fraction is used to designate a complex fraction or mixture of active ingredients with biological activity obtained from Petiveria alliacea by conventional separation methods that include maceration of the plant material, heating at reflux and liquid stationary phase chromatography or solid analytical, semi-preparative or preparative type.
  • These complex mixtures have a qualitative and quantitative composition that can vary depending on factors related to the plant (climatic conditions of the crop, harvesting and handling conditions) and the extraction methodology applied to it, so that the standardization of fractions with activity Biological requires the implementation of good agricultural practices in cultivation and manufacturing at the production level.
  • the WHO international standards [WHO Guidelines on good Manufacturing Practices (GMP) for Herbal Medicines.
  • World Health Organization 2007 establish as a suitable tool to perform quality control and standardization of complex mixtures, the quantification of one or more marker compounds of the fraction by means of a profile or chromatographic fingerprint of the products by means of GC, HPLC and HPTLC that allow the construction of specific recognition patterns for multiple compounds in products [WHO Guidelines on good manufacturing practices (GMP) for herbal medicines. World Health Organization, Geneva 2007].
  • This pattern provides a complete picture of the proportion of analytes detected in the preparation, which allows a qualitative and quantitative approach to authenticate the species, evaluate the quality and ensure the stability of the preparations [Peishan Xie. 2006].
  • the analysis of this chromatographic fingerprint is carried out through a multi-varied chemometric system based on the evaluation of the similarity of the fingerprints by means of the correlation and congruence coefficients and the methods of recognition of chemical patterns such as K-nearest neighbors - KNN - and soft independent modeling of class analogy - SIMCA - [Liang Y., Xie P., Chan K., 2004].
  • bioactive fraction of Petiveria alliacea obtained by bio-directed methodologies is understood as a semi-processed extract obtained from a rational and directed fractionation process that is made from the raw extract of the plant, using biological tests as criteria for the screening and selection of the fractions, understood as a "synthesized product" in Decision 391 of the Common Regime on Access to Genetic Resources of the Cartagena Agreement Commission.
  • analytically labeled bioactive fraction refers to a bioactive fraction in which its components have been quantified to from the use of internal or external marker compounds by means of one or more chromatographic techniques.
  • sequential administration refers to the administration in a time between 24 hours and 2 weeks, preferably, between 72 and 192 hours, of two or more formulations of a bioactive fraction of Petiveria alliacea with antitumor activity and an immunostimulatory agent. This sequential administration allows phagocytosis of tumor remains by immature CDs.
  • spontaneous administration refers to the joint administration of a bioactive fraction of Petiveria alliacea with antitumor activity and a conventional drug used in antitumor therapy.
  • terapéuticaally effective amount is understood as the sufficient dosage level of the active ingredients or fractions of the invention necessary to induce a desired biological effect in the treatment of the disease within a risk / benefit balance acceptable to any medical treatment.
  • terapéutica includes the treatment or prophylaxis of a disease for a mammal including man.
  • the present invention provides a series of biologically active fractions obtained from Petiveria alliacea by methodologies conventionally used in chemical sciences through a bioguided purification approach [Scientific Research Permit on Biological Diversity No. 10 of 30042009 and Access to Derived Products RGE0053 of 06052009].
  • Standardized fractions are understood as complex mixtures of active ingredients and were named according to the extraction and purification methodology applied as: FAST fraction, fraction F4 and fraction S3.
  • Example 1 clearly shows that the extract obtained with ethyl acetate induces the highest mortality of tumor cells, compared with the crude ethanol extract (which has been the most commonly used and obtained by different laboratories) and in dichloromethane .
  • the crude extract of ethyl acetate was selected as the matrix to obtain the fractions that would be studied later.
  • the FAST fraction was obtained by refluxing in ethanol, filtration and evaporation, liquid-liquid extraction in ethyl acetate until exhaustion, drying and separation by RP-18 using as mobile phase MeOH-H 2 0 in proportions 1: 1, 7 : 3 and 9: 1.
  • the total fraction eluted with the MeOH: H 2 0 7: 3 solvent system was called FAST.
  • Fraction F4 was obtained by refluxing in ethanol, filtration and evaporation, liquid-liquid extraction in ethyl acetate until exhaustion, drying and separation by RP-18 using methane-water (MeOH-H 2 0) as mobile phase in proportions 1: 1, 7: 3 and 9: 1.
  • the fractions obtained were dried and evaluated in different in vitro models to determine biological activities.
  • One of the fractions obtained during fractionation with the MeOH: H 2 O 7: 3 solvent system was called bioactive fraction F4.
  • the S3 fraction was obtained by extraction in Soxhlet with 4L of petrol, dichloromethane (CH 2 CI 2 ), ethyl acetate (EtOAc) and EtOH 96% for 48 h.
  • the extracts were filtered and evaporated to dryness.
  • the EtOAc extract was flocculated with an EtOH: H 2 O mixture and subjected to heating at 65 ° C for 20min.
  • the supernatant was recovered by filtration and was percolated through Silica Gel G-60 with CH 2 CI 2 , EtOAc and EtOH 96%.
  • the EtOAc fraction was recovered and fractionated on a Silica Gel G-60 column (30 x 4cm) and eluted with CH 2 CI 2 and EtOAc (7: 3), (1: 1), EtOAc and EtOH 96%.
  • the fraction called S3 corresponds to the fraction eluted with the solvent system CH 2 CI 2 and EtOAc (7: 3).
  • the bioactive fraction FAST decreases the clonogenic capacity in the 4T1 and K562 cell lines (example 2, figure 2), additionally inducing an alteration of the glucose metabolism reflected by an increase in the expression of Pyruvate kinase by the tumor cells treated with the fraction, determined by real-time PCR (example 3, figure 3).
  • the fraction was characterized by spectroscopic techniques, such as high efficiency liquid chromatography (HPLC) - ultraviolet (UV) and mass spectroscopy (MS) ( Figure 4) using a mass spectrometer LC-TOF (liquid chromatography coupled with flight time ) equipped with an ESI source (electro spray ion) in positive and negative ion, which allowed to establish the presence of the following compounds, by the replication technique:
  • HPLC high efficiency liquid chromatography
  • UV ultraviolet
  • MS mass spectroscopy
  • the FAST fraction comprises the following marker compounds in the following proportion:
  • the bioactive fraction F4 has multiple antitumor activities inducing an increase in the apoptotic population (Go / G) with an increase in the G 2 phase of the cell cycle of different tumor lines. It also induces reorganization of actin filaments at the cytoskeleton level and DNA fragmentation independent of the mitochondrial pathway (Examples 4 to 7, figures 5 to 8).
  • the fraction was characterized by spectroscopic techniques, such as HPLC-PDA ( Figure 9) and MS-MALDI-TOF ( Figure 10).
  • the bioactive fraction F4 has seven (7) characteristic peaks in an HPLC analysis (column C18, 5 pm (2.1 x150 mm) Waters) with PDA detector in a mobile phase H 2 O: ACN (4: 6).
  • the bioactive fraction S3 decreases cell viability in a dose-dependent manner by inducing early non-reversible depolarization of the mitochondrial membrane (without affecting the phases of the cell cycle) in different human and murine tumor lines (Examples 8 to 1, Figures 1 to 13) , likewise, decreases the expression of Hsp70 on cells subjected to shock or not thermal (Figure 14).
  • Cell death induced by the S3 fraction associated with morphological changes and coordinated DNA fragmentation suggests that apoptosis is possibly mediated by endogenous activation of endonucleases downstream of the mitochondria.
  • the fraction was characterized using an LC-TOF mass spectrometer (Micromass®, UK) equipped with an ESI source in positive and negative ion (Figure 15) and by HPLC-UV.
  • compositions of the invention can be formulated as compositions with one or more pharmaceutically acceptable excipients, said compositions can be specially designed for oral administration in solid or liquid pharmaceutical forms, for topical administration in heterodispersed forms (W / O creams, OW creams, gels and ointments among others) and for parenteral or rectal administration.
  • the compositions of the invention can be administered to humans and other mammals orally, rectally, parenterally, topically, intravaginally, orally or as a nasal or oral spray.
  • compositions for oral administration containing the fractions of the invention may include any conventionally used oral forms, such as: tablets, capsules, oral forms and oral liquids, suspensions or solutions.
  • the capsules may contain mixtures of the active agents with inert excipients and / or diluents such as: pharmaceutically acceptable starches (for example corn, potato or starch), sugars, artificial sweetening agents, cellulose powders (CMC, MC, EC, HPMC) , flours, jellies and gums among others.
  • the tablet compositions can be made by conventional compression methods, wet granulation or dry granulation and excipients such as diluents, lubricants, disintegrants, surface modifying agents (including surfactants), suspending or stabilizing agents, including but not limited to, may be used.
  • excipients such as diluents, lubricants, disintegrants, surface modifying agents (including surfactants), suspending or stabilizing agents, including but not limited to, may be used.
  • the oral compositions disclosed in the invention may be conventional formulations or delayed or
  • the invention includes a pharmaceutical combination for the treatment of cancer comprising a bioactive fraction of Petiveria alliacea or a pharmaceutical composition containing it and at least one immunostimulating agent capable of producing phenotypic and / or functional maturation of dendritic cells. .
  • Immunostimulatory agents of the immune response useful within the invention are isolated fractions or compounds of fungi or plants capable of producing phenotypic and / or functional maturation of CDs, preferred examples are polysaccharides and / or glycopeptides obtained from Ganoderma lucidum , Astragalus membraneceus, Grifóla frondosa, Phellinus linteus, Cordyceps militaris, Lentinus edodes, Coriolus versicolor, Agaricus blazei or Petiveria alliacea.
  • Ganoderma lucidum is a fungus widely used in China, Korea and Japan that has a history of use in traditional medicine exceeding four millennia. In Japan it is called Reishi or Mannetake, in China and Korea it is called
  • Ling Chu, Ling Chih and Ling Zhi (Immortality Fungus).
  • the fungus and mycelium contain steroids, lactones, alkaloids, polysaccharides and triterpenes.
  • G. lucidum has shown activity as an immune, antiviral and antitumor modulator, within its active metabolites a glycopeptide (PS-G) has been isolated, corresponding 95% to a (1 ⁇ 6) - branched D-glucan and a 5% peptide, which has shown antineoplastic activity (Wang et al., 1997), increased cytotoxic activity in NK cells and increased release of TNF- ⁇ and IFN- ⁇ in macrophages and lymphocytes, respectively (Lee et al., 1995).
  • PS-G induces significant changes in the phenotype and function of CD (Lin et al., 2005).
  • Astragalus membraneceus (Bunge) is a Chinese plant widely known for its immunomodulatory activity.
  • Several polysaccharides have been isolated from their roots, including: Astragalan I, which is a neutral 36KD heterosaccharide containing glucose, galactose and arabinose, astragalan II and III corresponding to 12 and 34kD ⁇ -glucans , respectively, AMemP a 60KD acid polysaccharide with a high content of uric acid, AMonS a 76KD acid polysaccharide composed of arabinose, galactose, galacturonic acid and glucuronic acid in 18: 18: 1: 1 ratio (Shimizu et al.
  • APSID-3 a heteropolysaccharide composed of arabinose, rhamnose and methyl galacturonate (Wang et al., 2006).
  • Different fractions of these polysaccharides induce morphological maturation of CD in vitro together with an increase in the expression of CD-11c and MHC class II on the surface, likewise, decrease the phagocytic capacity of the treated CDs (reuptake of FITC-dextran) versus to immature CDs (Shao, et al., 2006).
  • Grifóla frondosa known as Maitake is an edible mushroom with an excellent flavor and aroma, it is a component of a wide variety of traditional Chinese medicines.
  • G. frondosa a polysaccharide called fraction D is obtained, which is used as a nutritional supplement in cancer treatment.
  • This fraction is obtained from the mycelium or the fruit by means of an extraction in hot water, precipitation with ethanol and subsequently treatment with acetic acid and alkalis, it comprises ⁇ -1, 6- branched glucans in positions ⁇ -1, 3 (grifolan , sonifilan and SSG) and protein with a molecular weight of around 1000KD.
  • Fraction D has shown a increased innate and adaptive immune response in normal C3H / HeJ mice, where the results suggest that the fraction induces a dominant Th2 response through macrophage activation and increased production of IL4 and IL10 complementary to the activation of presenting cells of antigen (increased expression of CD69 and CD89) after 4h of administration of the fraction (Kodama, Muraya & Nanba, 2004).
  • Phellinus linteus is a perennial Basidiomycete originating in China and Korea from which protein-polysaccharide and acid-type polysaccharide complexes with immunostimulatory properties have been isolated
  • the protein-polysaccharide complex has a weight of 73KD and is composed of 73% polysaccharide (mainly glucose and mannose) and a 13% protein fraction (Asp, Thr, Ser, Glu, Pro, Gly, Ala, Val).
  • the PPC complex induces a dose-dependent increase in the expression of CD86 and MHC class II costimulatory molecules, as well as a phenotypic maturation accompanied by a decrease in endocytic capacity of in vitro myeloid CDs treated for 24 hours with the complex (Kim, et al. , 2006).
  • acid-type polysaccharides have shown activity as stimulants of LT proliferation, tumor growth inhibitors and inducers of phenotypic maturation of CD derived from murine bone marrow, increasing the expression of CD80, CD86, MHC I, MHC II and IL12 and reducing the reuptake of dextran (Park SK, et al, 2003).
  • Cordyceps militaris is a parasitic fungus of insects that grows on larvae of Lepidoptera, has been used for centuries in traditional Chinese medicine for its antitumor and hypoglycemic properties, within the bioactive compounds isolated from its mycelium there are nucleosides (cordicepine, opicordine), galactomannan, tryptophan and polysaccharides (Li et al., 2006). The aqueous fraction of C.
  • Lentinus edodes known as "shiitake” in Japan and Xiang gu in China is a fungus widely used as food and traditional medicine, its antitumor and immunostimulant activity has been demonstrated in different studies in animals and humans. At least five polysaccharides have been isolated from the active fractions of L.
  • edodes within these are the lentinan - commercially available in the US and Europe - is a high molecular weight polysaccharide (450KD) that chemically corresponds to a ⁇ -1, 3- branched glucan with two units of ⁇ -1, 6-D-glucopyranosyl for every five units of linear p-1, 3-glucopyranoside, is soluble in water and is found in very low concentrations (0.02%) in fresh fungi ( Sasaki and Takasuka, 1976), LEM a heteropolysaccharide associated with mycelium-derived protein and KS-2 a ⁇ -mannan peptide that contains the amino acids serine, threonine, alanine and proline.
  • 450KD high molecular weight polysaccharide
  • LEM a heteropolysaccharide associated with mycelium-derived protein
  • KS-2 a ⁇ -mannan peptide that contains the amino acids serine, threonine,
  • Aqueous extracts of L. edodes have shown in vitro cytostatic activity evaluated in MCF-7 cells (human breast adenocarcinoma) using the MTT and immunomodulatory cytotoxicity test in terms of mitogenic and co-mitogenic activity established through the lymphocyte transformation test (LTT) based on the increase in the proliferation of rat thymocytes to mitogens of LT in vitro (Konilides, et al., 2008).
  • LTT lymphocyte transformation test
  • Coriolus versicolor is a Basidiomycete fungus used in traditional Chinese medicine with immunostimulant and antitumor properties.
  • Different extracts obtained from C. versicolor are marketed in Japan and other countries such as cancer drugs (PSK) or dietary supplements (PSP and VPS).
  • PSK cancer drugs
  • PSP and VPS dietary supplements
  • PSK a protein-bound polysaccharide is mainly composed of a p-1,4-glucan isolated from strain CM-101 induces increased cytokine expression in mononuclear cells human peripheral blood in vitro and increases the expression of TNF- ⁇ and IL-8 in healthy volunteers and patients with gastric cancer.
  • PSK promotes phenotypic and functional maturation of CD derived from CD14 + mononuclear cells grown in the presence of PSK, increasing the expression of HLA class II, CD80, CD86 and CD83, decreasing the reuptake of FITC-dextran, increasing the production of IL -12, the reaction of allogeneic mixed lymphocytes and inducing specific antigen cytotoxicity (Kanazawa, et al., 2004).
  • PSP a polysaccharide-peptide isolated from strain COV-1 chemically corresponds to a heteropolysaccharide composed of a-1, 4-glucan, ⁇ -1, 3- glucan, rhamnose and arabinose, with a size of 100KD.
  • PSP has shown antitumor activity in patients with esophageal, gastric and pulmonary cancer, and also induces the production of IL-2 and IFN- ⁇ and the proliferation of LT in animal models (Ng TB, 1998).
  • Another alternative of the invention comprises the use of the bioactive fraction of Petiveria alliacea as an active ingredient for the preparation of medicaments.
  • the use of said fraction together with other compounds, fractions or extracts for the preparation of medicines is claimed.
  • Also part of the invention is the use of a bioactive fraction of Petiveria alliacea or a composition containing it, as an adjuvant agent of conventional chemotherapy for the treatment of cancer.
  • the invention encompasses a kit for the treatment of cancer comprising the composition of the bioactive fraction of Petiveria alliacea, the composition of one or more immunostimulatory agents capable of producing phenotypic or functional maturation of dendritic cells and optionally, the instructions for use.
  • the invention includes a method of treatment comprising the sequential administration of at least a bioactive fraction of Petiveria alliacea and in a time interval between 24 hours and 2 weeks, the administration of at least one immunostimulating agent capable of producing phenotypic maturation and / or functional dendritic cells.
  • the treatment method comprises the simultaneous or sequential administration of a conventional chemotherapeutic drug together with the bioactive fraction of Petiver ⁇ a alliacea.
  • the dosage levels of the immunostimulating fractions and agents in the pharmaceutical combination provided by the invention may vary to obtain the amount of active ingredient required to achieve the desired therapeutic response depending on the physiological and pathological conditions of the subject, the composition and the route of administration.
  • the dosage levels selected depend specifically on the particular potency of the fraction, the route of administration, the severity of the condition treated and the previous medical history of the patient to be treated.
  • the total daily dose of the fractions and compounds used in the compositions of the invention may vary in the range from 0.001 to 1000 mg / kg / day.
  • preferable doses are They are in the range of 0.001 to 5 mg / kg / day.
  • the effective daily dose may be divided into multiple doses for administration purposes, consequently the invention comprises single dose compositions containing the effective amount or multiple doses that reach the effective daily dose after several administrations.
  • the Mel-Rel cell line was obtained from a Re ⁇ transgenic mouse tumor, and was donated by Dr. Armell Prevost (Cochin Hospital, Paris, France).
  • the A375 line (human melanoma cells) was donated by the Research Institute of the Universidad del Rosario.
  • NB4 human myeloid leukemia
  • K562 human erythroleukemia
  • 4T1 murine mammary tumor
  • Adherent cells were suspended in RPMI-1640 medium supplemented with fetal bovine serum, L-glutamine (2mM), penicillin (100U / ml), streptomycin (100 ng / ml) and Hepes (0.01M) and maintained at 37 ° C with 5% C0 2 in a humid atmosphere. After reaching 80% confluence, the adherent cells were detached with a trypsin / EDTA mixture for 4 minutes, washed with PBS to stop the enzymatic activity and resuspended in complete medium.
  • CMSP human peripheral blood mononuclear cells
  • EXAMPLE 1 EVALUATION OF CELLULAR DEATH INDUCED BY CRUDE EXTRACTS FROM PETIVERIA ALLIACEA.
  • NB4 cells were treated with 250 pg / ml of the different Petiveria alliacea extracts for 24 hours, and the cell viability was calculated with trypan blue. Etoposide at 100 pg / ml was used as a positive control. The results are expressed as a percentage of viability (Figure 1). The figure clearly shows that the ethanolic crude extract (used in the state of the art) induces only 50% mortality of the tumor cells while the extract obtained with ethyl acetate (base of the present invention) induces a near mortality 80%, showing the biological superiority of the invention with respect to the extracts used conventionally.
  • the murine 4T.1 cell line (2.5x10 5 cells / well) was seeded in 24-well plates, treated with the FAST 7: 3 fraction at 40 and 20 pg / ml, 100nM Vincristine (conventional chemotherapeutic drug) as a positive control or Ethanol 0.2%, and incubated for 6 hours in a humid atmosphere 37 ° C and 5% CO2. After treatment, the cells were seeded on 0.5% agar plates (20,000 cells / 60mm plates), incubated for 14 days in a humid atmosphere 37 ° C and 5% C02 and stained with violet crystal (0, 4% in ethanol). Colonies with more than 50 cells were counted. The treatments took in triplicate, and the results were expressed as the mean ⁇ SD ( Figure 2).
  • the bioactive fraction FAST8 induces a statistically significant decrease in the number of colonies of the 4T1 and K562 lines at concentrations of 40 and 20pg / mL showing the activity of the P. alliacea fraction as an inhibitor of the clonogenic capacity of tumor lines.
  • EXAMPLE 3 EXPRESSION OF THE GENE FOR PINUVATO KINASA ISOFORM P-KL IN 4T.1 CELLS TREATED WITH FAST IN KINETICS.
  • 4T.1 cells were treated with ETOH (negative control) and FAST (20 pg / ml) for 4, 6, 12, 16 and 24H.
  • the RNA from the cells was extracted using trizol and cDNA synthesis was performed using the superscript III enzyme.
  • the LightCycler FastStart DNA Master Plus SYBR Green I kit was used for the amplification of the pyruvate kinase gene by PCR-TR.
  • a 20-fold increase in mRNA expression encoding the protein was observed. This result confirms the activity of the fraction on glucose metabolism that explains the reported antitumor activity for the fraction of P. alliacea ( Figure 3).
  • the cytotoxic activity of the bioactive fraction F4 of Petiveria alliacea was evaluated on the A375 tumor line at concentrations from 125pg / ml to 3.9pg / ml in serial dilutions. Evaluations were performed when more than 50% of the cells were dead or had morphological alterations. After 24h treatment, the cytotoxic activity of the F4 fraction is observed at a concentration of 31.2pg / ml. Similarly, the fraction induces morphological alterations (deformed, elongated and detached cells) at the same concentration (Data not shown).
  • the effect on the cell cycle was evaluated for which the cells were synchronized (growth for 3 days in the absence of fetal bovine serum), washed and resuspended in complete medium.
  • Adherent cells (4.0 x 10 5 cells / well) were adhered for 24 hours in a 12-well plate and cultured in the presence of the fraction for 24 hours or 48 hours at a concentration of 31.2 pg / ml. In some experiments the cells were analyzed at times of 12, 18, 24 and 48h in order to establish the kinetics of the arrest produced by F4 on the cell cycle.
  • the adherent and suspension cells were washed with PBS (with Ca ++ and Mg ++ ) containing 100U / ml RNAse and 5 (g / ml propidium iodide (Sigma, St. Louis, MO ) and incubated at room temperature for 30 minutes
  • the DNA content per cell was estimated by flow cytometry in a FACScalibur (Becton Dickinson, Fullerton, CA).
  • Figure 5B shows the effect of the F4 fraction at a concentration of 31.2 ⁇ g / ml on the cell cycle of the A375 line, analyzed by flow cytometry.
  • the graph shows the accumulation in the G2 phase (60%) for cells treated with F4 compared to 18% of cells without treatment. Vincristine induces an arrest in G2 close to 80%.
  • EXAMPLE 5 CHANGES IN THE ORGANIZATION OF THE CYTOSKELETE OF A375 CELLS INDUCED BY FRACTION F4.
  • A375 and Mel-Rel cells (5x10 4 ) were placed on glass sheets (13 mm diameter) and coated with 6-10 ⁇ g / cm 2 of collagen (SIGMA) for 16h. After 16h the cells were incubated in the presence of the extract for 24h at 37 ° C in a humid atmosphere with 5% C0 2 . The cells were washed with PBS and fixed with 2% paraformaldehyde in PBS for 30 minutes at 4 ° C. The cells are then washed twice with 1% PBS-BSA and incubated with cold acetone for 1min and with Oregon-green conjugated phalloidin (Molecular Probes) diluted in 1% PBS-BSA (1/40) for 30min. The cells were observed by fluorescence microscopy (Olympus, Japan).
  • Figure 6 shows in panel B the effect induced by fraction F4 on the architecture and organization of the actin filaments of the cytoskeleton.
  • Cells treated with the fraction do not spread and filamentous structures are seen disassembled or reorganized and accumulated in submembrane areas.
  • Actin filaments are observed as granules, mainly located at the edges of A375 cells.
  • Control cells show considerable organization in the cytoskeleton architecture.
  • A375 and Mel-Rel cells (5x10 4 ) were placed on glass sheets (13mm diameter) and coated with 6-10pg / cm 2 of collagen (SIGMA) for 16h. After 80% confluence, the cells were exposed to treatment with the F4 fraction at 31.2pg / ml for 24 h. To perform DAPI staining, the cells were washed with PBS and fixed with 2% paraformaldehyde in PBS. for 30min at 4 ° C. The cells are then washed twice with 1% PBS-BSA and incubated with cold acetone for 1min and with 300nM DAPI (Sigma, St. Louis, MO) for 5min. Changes in cell nuclei after staining were observed by fluorescence microscopy (Olympus, Japan).
  • Figure 7 shows the effect of the F4 fraction on DNA fragmentation possibly induced by the activation of endogenous endonucleases in a manner independent of mitochondria.
  • a total of 2x10 5 human mononuclear cells per well were cultured in 96-well plates in the presence of phytohemagglutinin (PHA, GibcoBRL). After 12 h of incubation, different concentrations of the F4 fraction (250, 125, 62.5, 31, 2, 15.6, 7.8 and 3.9 pg / ml) or vincristine were added. The cells were then incubated for 30h and 10 ⁇ of 12mM MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide] (Molecular Probes) in PBS was added to each well and incubated for 4h at 37 ° C. The formazan generated was dissolved in 0.01 M SDS-HCI and the optical density was measured at 540 nm using a Multiskan MCC / 340 (Labsystems).
  • PHA phytohemagglutinin
  • Figure 8 shows the effect of the bioactive fraction on mononuclear cells without treatment with PHA (A) or previously treated with the mitogen (B). It is clearly seen that the F4 fraction has no effect on normal mononuclear cells like vincristine. The lack of effect of vincristine is explained by its specific activity on the cytoskeleton of cells with a high replication rate, such as tumor cells. In other words, the F4 fraction and vincristine have a high specificity of action on tumor cells.
  • EXAMPLE 8 EFFECT OF FRACTION S3 ON THE MORPHOLOGY AND VIABILITY OF LINES NB4, MEL-REL AND K562.
  • Tumor lines NB4 (A), Mel-Rel (B) and K562 (C) were treated for 24 hours with serial dilutions of fraction S3 (125 to 7.8 pg / ml) of P. alliacea in 96-well plates and observed In inverted microscope (Olympus CH3) to establish morphological changes (determination of intracellular vesicles) and cell viability test (trypan blue).
  • the bioactive fraction S3 induces morphological changes on the three cell lines, suggesting cell death via apoptosis and / or necrosis according to the presence of apoptotic bodies and burst cells ( Figure 11).
  • the figure shows the activity of the S3 fraction (gray bars) against the positive control - etoposide - (black bars) and the negative control (ethanol).
  • the IC50 value (50% cell growth inhibition) calculated using Minitab 14 Probit analysis (MINITAB® Relay 14.1. Minitab Inc. 2003 Statistical Software) was 45pg / ml for the different tumor lines.
  • EXAMPLE 9 INDUCTION OF DEPOLARIZATION ON THE MITOCONDRIAL MEMBRANE OF THE NB4, MEL-REL AND K562 LINES BY TREATMENT WITH THE S3 BIOACTIVE FRACTION
  • EXAMPLE 10 EFFECT OF S3 BIOACTIVE FRACTION ON DNA FRAGMENTATION.
  • Cells stained with Hematoxylin-eosin and DAPI (4 ', 6-diamidin-2-phenylindole) were analyzed by microscopy to study the type of cell death induced by the bioactive fraction S3.
  • the cells were treated with the S3 fraction for 24h at 37 ° C and 5% CO2 atmosphere, then they were placed on slide sheets by cyto-centrifugation (cytospin) for 5 min at 500 rpm, fixed with EtOH and stained with hematoxylin ( 2 min) and eosin (45sec). The excess dye is removed with EtOH (3 washes) and the sheets are analyzed and photographed by optical microscopy (Olympus CH30) in 100X magnification.
  • the cells were placed on glass sheets (13 mm) previously coated with collagen (6-10 pg / cm2) at a density of 5x10 4 cells per 16h, treated with the S3 fraction for 24h at 37 ° C and atmosphere of CO 2 at 5%. Subsequently washed with (PBS) and fixed with para-formaldehyde (2% in PBS) for 30 min at 4 ° C. After washing twice with PBS-BSA (1%) the cells were incubated in cold acetone 1 min and again washed (PBS-BSA, 1%) and incubated for 5 min with 300nM DAPI (Sigma, St. Louis, MO) . The sheets were observed under the fluorescence microscope (Olympus, Japan).
  • NB4 cells were treated under the conditions mentioned with the S3 fraction (31.2pg / ml) and the drug staurosporine as a positive control
  • Figure 13 exemplifies the tumor cells with the vehicle (0.2% EtOH) in active mitosis without interference of the normal cell cycle (A), cells treated with fraction S3 (B) and staurosporine (C), which show fragmentation nuclear and chromatin condensation, essential characteristics of cell death by apoptosis.
  • K562 cells were incubated in 6-well plates (2 x 10 6 cells / well) in 3 ml of supplemented medium and treated with the S3 fraction (6.2 pg / ml) or quercetin (100 ⁇ ) as a positive control.
  • the treated cells were divided into two groups: the first group was incubated for 10 h at 37 ° C and subjected to thermal shock (42 ° C 60 min) in a serological bath and subsequently put into recovery for 4h at 37 ° C.
  • the second group was incubated for 15h at 37 ° C. During the procedure the two groups were maintained with the treatment.
  • TDLB buffer (1M Tris-HCI pH 8, 5M NaCI, 20% sodium azide, 10% SDS, 10% NP40, 10% sodium deoxycholate, 1% PMSF) for 30 min at 4 ° C.
  • the proteins (10 pg / ml) quantified by Bradford (BIORAD) were subjected to electrophoresis (10% polyacrylamide gel) and transferred to PVDF membranes.
  • Protein identification was performed using a primary anti-Hsp70 monoclonal antibody (Hsp70 clone 283-48). Protein detection was performed using a West Dura Extended Duration Substrate (Pierce Lab) chemiluminescence kit.
  • Figure 14 shows the decrease in the expression of the Hsp70 chaperone protein on K562 cells treated with the S3 fraction subjected to thermal shock (panel A) or without thermal shock (panel B), showing a behavior similar to those treated with quercetin , a flavonoid known for its effect on the decrease on the expression of the Hsp70 protein.
  • fraction S3 reduces the expression of Hsp70 with or without thermal shock, it can be assumed that fraction S3 acts on thermal shock factor 1 (HSF1) or its promoter, a mechanism reported in the regulation of expression of Hsp70 for quercetin.
  • HSF1 thermal shock factor 1
  • dendritic cells are obtained according to the following protocol.
  • CMSP From 40 ml of blood anticoagulated with heparin, CMSP were obtained by density gradients with FICOLL-HYPAQUE. Monocytes were separated with anti-CD14 monoclonal antibodies coupled to magnetic beads using the MiniMaCs system (Myltenyi). The cells obtained were washed in RPMI 1640 medium supplemented with 1% autologous serum. The viability and number of cells were evaluated by trypan blue staining and cell count in Newbauer chamber, respectively.
  • the CD14 + cells thus obtained were incubated in RPMI 1640 medium supplemented with 1% autologous serum in the presence of 35 ng / ml of inteleucine (IL-4) and 50 ng / ml of granulocyte and monocyte growth factor GM-CSF (R&D system) during 5 days of culture, verifying its morphology by light microscopy.
  • IL-4 inteleucine
  • R&D system granulocyte and monocyte growth factor GM-CSF
  • LPS lipopolysaccharide
  • EXAMPLE 12 EFFECT OF AN ARIS POLISAC OBTAINED FROM PETIVERIA ALLIACEA ON THE EXPRESSION OF CO-STIMULATING MOLECULES FROM A CD POPULATION OBTAINED FROM CMSP.
  • CDs derived from human monocytes were stimulated for 48 hours with the solvent, lipopolysaccharide (LPS) and a purified polysaccharide from the aqueous fraction of the aerial part of P. alliacea - PACO - (25pg / ml) in the presence of polymyxin B (PolB ).
  • LPS lipopolysaccharide
  • Polymyxin B Polymyxin B
  • LPS lipopolysaccharide
  • mice Eight Balb / c mice were taken per group, to which the tumor was established by inoculation of 10 4 4T1 cells in the breast pad and an equal group of mice in which saline solution was inoculated. After verifying the tumor installation, the mice were treated by intraperitoneal (IP) inoculation of 2mg of the Petiveria alliacea fraction per week, verifying the tumor size weekly. From the second week, the treatment was carried out with the Petiveria fraction and 24 hours later in the second group, the immunostimulating agent was also administered IP at low doses. After 3 weeks, a significant reduction in the size of the tumor in both groups. The analysis of the proliferative response against tumor antigens, performed by a classic proliferation assay, showed that the group of mice treated with the immunostimulatory agent showed a significantly different proliferation from the group treated only with the Petiveria alliacea fraction.
  • IP intraperitoneal
  • the bioactive fractions of Petiveria alliacea induce cell death by different mechanisms: starting with an alteration in the cytoskeleton, arrest in the G2 phase of the cell cycle and subsequent death by apoptosis with DNA fragmentation.
  • the remains of the tumor cells (apoptotic bodies) can be phagocytosed by the CD, which will subsequently be activated by the immunostimulatory agent, allowing the presentation of the tumor antigens to both CD4 and CD8 T lymphocytes, thereby inducing a immune response that allows the control of metastasis developed by tumor cells that have escaped direct antitumor treatment.

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Abstract

La presente invención está relacionada con una fracción bioactiva de Petivería alliacea con actividad antitumoral y el uso de Ia misma para Ia fabricación de medicamentos para el tratamiento del cáncer. Adicionalmente, Ia solicitud incluye una combinación farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende Ia fracción bioactiva de Petiveria alliacea y al menos un agente inmunoestimulante capaz de producir Ia maduración fenotípica y/o funcional de las células dendríticas. Asimismo, se incluye un método para el tratamiento del cáncer que comprende Ia administración secuencial de Ia fracción bioactiva de Petiveria alliacea o de Ia composición que Ia contiene y un agente inmunoestimulante.

Description

FRACCIÓN BIOACTIVA DE PETIVERIA ALLIACEA, COMPOSICIÓN FARMACEUTICA QUE LA CONTIENE Y COMBINACIÓN CON AGENTES INMUNOESTIMULANTES PARA EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención pertenece al campo de la medicina y está relacionada con una fracción bioactiva de Petiveria alliacea con actividad antitumoral para la fabricación de medicamentos para el tratamiento del cáncer y la composición farmacéutica que la comprende junto a uno o más excipientes.
De manera preferida, la invención se relaciona con una combinación farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende una fracción bioactiva de Petiveria alliacea con actividad antitumoral y al menos un agente inmunoestimulante capaz de producir la maduración fenotípica y/o funcional de las células dendríticas. También es parte de la invención un nuevo método para el tratamiento del cáncer que comprende la administración secuencial de una fracción bioactiva de Petiveria alliacea y un agente inmunoestimulante.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
El cáncer se presenta cuando los mecanismos que mantienen la tasa de crecimiento normal de las células, se alteran y generan un exceso de división celular. Esta alteración es debida frecuentemente a mutaciones que ocurren en el genoma de cualquier célula del cuerpo, las cuales inducen una transformación celular que puede generar un tumor maligno con la capacidad de invadir tejido normal adyacente y realizar metástasis. Durante este proceso de transformación maligna, algunas de las células tumorales desarrollan resistencia simultánea primaria o adquirida a múltiples fármacos citotóxicos (Cooper G. 2004), por lo que la búsqueda de nuevos compuestos antitumorales constituye un área de interés. Los tumores se clasifican de acuerdo al tipo de célula del que proceden, siendo los más frecuentes los carcinomas (generados de células epiteliales), seguidos por los sarcomas (tumores sólidos de tejidos conectivos poco frecuentes) y las leucemias o linfomas (células de origen hematopoyético) (Cooper G. 2004).
A pesar de los esfuerzos realizados en programas de investigación experimental y clínica, la mortalidad causada por el cáncer se mantiene en valores extremadamente altos; de acuerdo con las estadísticas del American Cáncer Society para el año 2006, el cáncer es la segunda causa de muerte en Estados Unidos - 564830 defunciones/año - posicionado solo por debajo de las enfermedades cardiovasculares (American Cáncer Society Statistics for 2007). Con los tratamientos disponibles actualmente una tercera parte de los pacientes se alivian con medidas locales cuando el tumor no ha logrado metástasis durante el curso del tratamiento, no obstante, en los casos restantes la micrometástasis temprana es una característica del neoplasma, lo que indica el requerimiento de un método sistémico como la quimioterapia (a menudo junto con cirugía o radiación) para el control efectivo del cáncer (Katzung B. Farmacología básica y clínica).
Más de 100 fármacos son usados actualmente en quimioterapia y se pueden clasificar dependiendo del blanco molecular que genera su actividad terapéutica; encontramos entre otros fármacos que generan el entrecruzamiento del ADN (cisplatino), la alquilación de bases (dacarbazina), la alteración de microtubulos (taxol, vinblastina), la alteración de membranas (doxorubicina), análogos estructurales (metotrexato) e inhibidores de topoisomerasas (etopósido, topotecan). Sin embargo, la resistencia primaria o adquirida de las células tumorales a múltiples fármacos genera una disminución considerable en la respuesta clínica esperada a la terapia farmacológica (Katzung B. Farmacología básica y clínica). Múltiples mecanismos han sido implicados en el desarrollo de la resistencia a los fármacos que actúan sobre un único blanco, entre los que se incluyen la expresión de transportadores de xenobióticos, la superfamilia de proteínas ABC, modificaciones de enzimas y defectos en la inducción de apoptosis por quimioterapia (Marie, Jean-Pierre, 2006), por lo que se requiere el desarrollo de nuevos agentes antitumorales con diferentes blancos moleculares, que permitan superar los mecanismos de resistencia de las células tumorales. En este sentido, los productos naturales pueden servir como reserva de nuevos compuestos con diferentes mecanismos de acción y como alternativa terapéutica a partir de la estandarización de extractos complejos que proporcionen un efecto sinérgico y aseguren la actividad sobre múltiples blancos moleculares al mismo tiempo.
Dos elementos son importantes en la eliminación de los tumores: (1) la destrucción de la célula tumoral sin efectos adversos sobre las células normales y (2) la generación de una respuesta inmune subsiguiente al tratamiento capaz de eliminar las células tumorales residuales. Aunque el uso de agentes antitumorales citotóxicos o antiangiogénicos ha sido el método de elección en el tratamiento del cáncer, esto no asegura una verdadera protección frente al desarrollo posterior del tumor. Lo deseado es que además de la muerte tumoral, se desarrolle una respuesta inmune efectiva y se logre el control de las metástasis secundarias a la diseminación del tumor por vía sanguínea. La utilización de un método de tratamiento que además de inducir la muerte tumoral permita el control posterior de la proliferación tumoral residual constituye un avance en la terapia antitumoral. Algunos suplementos herbales elaborados a partir de plantas utilizadas en la medicina tradicional oriental, como el Sho-Saiko-to y el Juzen-taiho-to, inducen muerte tumoral inhibiendo la metástasis y subsecuentemente permiten la generación de una respuesta antitumoral (Kato M 1998; Day Y 2001). Dentro de estas preparaciones herbales se han caracterizado parcialmente los compuestos responsables de la muerte tumoral pero no se ha estudiado el tipo de muerte que sufren las células tumorales, ni se han identificado claramente los compuestos activadores de las células dendríticas (CD).
La terapia antitumoral efectiva debe tener en cuenta no solo la muerte de los tumores, sino el tipo de muerte que ellos van a sufrir. Aunque la muerte por apoptosis es la más estudiada, es bien sabido que la transferencia de antígenos tumorales a las CD ocurre más eficientemente si la muerte es posterior a un estrés celular, el cual genera un aumento de proteínas de choque térmico que participan en el proceso de sensibilización cruzada a las CD, permitiendo la activación de los linfocitos T citotóxicos. La muerte por apoptosis con necrosis tardía podría ser una de las mejores formas de eliminar los tumores.
Petiveria alliacea Linn es una hierba perenne de la familia Phytolaccaceae ampliamente conocida en la medicina tradicional de los países de Centro, Sur América, el Caribe y África (Lopes-Martins RA et al, 2002). Tradicionalmente se ha utilizado la infusión de las hojas y la cocción o el polvo de la raíz en el tratamiento de diferentes enfermedades por sus propiedades antiespasmódicas, antirreumáticas, antiinflamatorias (López Martins RAB 2002; Morales C et al, 2001), antinociceptivas (Distasi L et al, 1988), hipoglicemiantes y abortifacientes (De lima et al, 1991 ; De Sousa JR et al, 1987). En algunos países de Centro y Sur América las infusiones acuosas y alcohólicas han sido utilizadas para el tratamiento de leucemias y cáncer de seno con buenos resultados (Gupta M, 1995; García B, 1974).
Diferentes compuestos han sido aislados y reportados para P. alliacea incluyendo flavonoides como la astilbina, miricitrina y engeletina; triterpenos como el ácido barbinérvico y α-friedelinol; lípidos como ácido lignocérico, ácido nonadecanoico y ácido oleico; otros compuestos como alantoína, cumarina, daucosterol (De Sousa JR, 1990; Delle-Monache F, 1996; Cuca LE 1992), diversos dipéptidos glutámicos (Kubec R, 2005), amino ácidos que contienen azufre tales como S-bencilcistein sulfóxidos y S-(2-hidroxietil) cistein sulfóxidos (Kubec R, 2001 ; Kubec R, 2002) y el dibencil trisulfuro (DTS) un compuesto lipofílico que presenta actividad inmunomoduladora (Rosner H, 2001) y citotóxica relacionada con el citoesqueleto (Williams LA, 2007). Aun cuando el DTS mostró excelente actividad citotóxica, su alta toxicidad que incluso afecta células normales no ha permitido su uso a nivel clínico y terapéutico (Williams LA., 2007).
En la presente invención se divulga una fracción bioactiva de Petiveria alliacea, que induce la muerte celular por diferentes vías: actúa sobre el citoesqueleto induciendo detención del ciclo celular en la fase G2; y posteriormente, induce apoptosis por mecanismos dependientes o independientes de la mitocondria relacionados con la polaridad de la fracción. La complejidad de las fracciones de la invención permite además la inducción de estrés celular alterando la expresión de HSP70 inducible y generando la senescencia de una parte de la población celular, permitiendo así la amplificación de la respuesta inmune. Por tanto, la actividad biológica de las fracciones de la invención sobre múltiples blancos moleculares de las células tumorales, abre la posibilidad de superar los mecanismos de resistencia a fármacos desarrollados por las células tumorales.
La inducción de la respuesta inmune depende de varios factores, dentro de estos los restos celulares generados durante la apoptosis y la necrosis, han sido reportados como fuente de antígenos que pueden ser fagocitados por las CD (células presentadoras de antígeno profesionales) para ser presentados al sistema inmune. En la presente invención, aseguramos que la célula dendrítica inmadura pueda fagocitar y procesar los antígenos tumorales, lo cual se realiza de una forma menos eficiente por una célula activada. Posteriormente, se induce la activación de la célula dendrítica con un agente inmunoestimulante, que utilizado luego del tratamiento antitumoral, permite la presentación antigénica a los linfocitos T y la generación de una respuesta inmune efectiva. Los beneficios de este tipo de terapia son el asegurar que una vez la célula tumoral haya sido destruida, no ocurra una activación parcial de la célula dendrítica conllevando a la inducción de tolerancia frente a los antígenos tumorales, sino por el contrario, se produce una activación efectiva de la célula presentadora y por tanto de la respuesta inmune.
Basándose en lo anteriormente presentado, la presente invención enseña un método de tratamiento para la eliminación de células tumorales a través de la administración de una fracción biaoctiva de Petivería alliacea con actividad antitumoral sobre múltiples funciones celulares y por otro lado, activando las CD presentadoras de antígeno al sistema inmune, las cuales han fagocitado in vivo los restos de las células tumorales, mediante la administración de un agente inmunoestimulante. Esta doble terapia permite la destrucción del tumor y posteriormente, la activación de la respuesta inmune específica del tumor por un mecanismo de sensibilización cruzada.
Así mismo, la invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende una fracción bioactiva de Petivería alliacea con actividad antitumoral y al menos uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Dicha composición puede ser administrada independientemente o como parte de una combinación para el tratamiento del cáncer que comprende la composición previamente definida y uno o más agentes inmunoestimulantes capaces de inducir la maduración fenotípica y/o funcional de las CD
OBJETOS DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la invención se refiere a una fracción bioactiva de Petivería alliacea obtenida por metodologías bio-dirigidas, estandarizada y marcada analíticamente para el tratamiento del cáncer. En un segundo aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende: una fracción bioactiva de Petiveria alliacea y al menos uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
En un tercer aspecto, la invención proporciona una combinación farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende una fracción bioactiva de Petiveria alliacea o una composición farmacéutica que la contiene y al menos un agente inmunoestimulante capaz de producir la maduración fenotípica y/o funcional de las células dendríticas.
Igualmente, es parte de la invención el uso de dicha fracción en la producción de medicamentos para el tratamiento del cáncer y el kit de tratamiento que comprende una composición que contiene la fracción bioactiva de Petiveria alliacea y al menos uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, una composición que comprende uno o más agentes inmunoestimulantes capaces de producir la maduración fenotípica y/o funcional de las células dendríticas y al menos uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y opcionalmente, las instrucciones de uso.
Finalmente, la invención proporciona un método para el tratamiento del cáncer que comprende la administración secuencial de al menos una fracción bioactiva de Petiveria alliacea en una cantidad terapéuticamente efectiva o de una composición que la contiene y, en un intervalo de tiempo entre 24 horas y 2 semanas, la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un agente inmunoestimulante capaz de producir la maduración fenotípica y/o funcional de las células dendríticas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra el efecto de diferentes extractos crudos de Petivena alliacea obtenidos con etanol, acetato de etilo y diclorometano sobre la viabilidad de células tumorales NB4.
La figura 2 muestra el efecto inducido por la fracción bioactiva FAST de Petivena alliacea sobre la capacidad clonogénica de la línea celular 4T1.
La figura 3 muestra el incremento del RNAm de la Piruvato kinasa en células 4T1 tratadas con la fracción FAST de Petivena alliacea.
La figura 4 muestra el espectro de masas de la fracción bioactiva FAST de Petivéria alliacea obtenido con un espectrómetro de masas LC-TOF equipado con una fuente ESI en ión positivo y negativo.
La figura 5 muestra la detención en la fase G2/M del ciclo celular en células tumorales A375 inducido por la fracción bioactiva F4 de Petivéria alliacea. (A). Distribución del ciclo celular para los tratamientos: etanol (control negativo) fracción bioactiva F4 y vincristina (control positivo). (B) Diagrama del ciclo celular de las células A375 tratadas con la fracción bioactiva F4 durante una cinética de 12, 24 y 48h.
La figura 6 muestra la reorganización de las fibras de actina en células A375 normales (A) y tratadas con la fracción bioactiva F4 de Petivéria alliacea (B).
La figura 7 muestra la fragmentación del ADN inducida por la fracción bioactiva F4 de Petivéria alliacea (B) comparado con el control (A) en células A375.
La figura 8 muestra el efecto de la fracción bioactiva F4 sobre el crecimiento de células mononucleares normales sin tratamiento (A) o tratadas previamente con PHA (B). La figura 9 corresponde al cromatograma de la fracción bioactiva F4 de Petiveria alliacea obtenido por HPLC (columna RP-18, 5 μητι (2.1 x150 mm); fase móvil H20: ACN (4:6) con detector PDA.
La figura 10 muestra el espectro de masas de la fracción bioactiva F4 de Petiveria alliacea obtenido con un detector MALDI-TOF con matriz HCCA.
La figura 1 1 muestra la inducción de cambios morfológicos y la disminución en la viabilidad celular de las líneas NB4 (A), Mel-Rel (B) y K562 (C) después de 24h de tratamiento con la fracción bioactiva S3 de Petiveria alliacea.
La figura 12 muestra el efecto sobre la membrana mitocondrial inducido por tratamiento con la fracción bioactiva S3 de Petiveria alliacea sobre las líneas NB4, Mel-Rel y K562.
La figura 13 muestra la fragmentación nuclear y la condensación de la cromatina en la líneas NB4 tratada con la fracción bioactiva S3 de Petiveria alliacea a una concentración de 31 ,2pg/ml durante 24h.
La figura 14 muestra la disminución en la expresión de la Hsp70 inducida por la fracción bioactiva S3 de Petiveria alliacea en células K562 con (panel A) o sin choque térmico (panel B).
La figura 15 muestra el espectro de masas de la fracción bioactiva S3 de Petiveria alliacea obtenido con un espectrómetro de masas LC-TOF equipado con una fuente ESI en ión positivo y negativo.
La figura 16 muestra la expresión de moléculas coestimuladoras CD86 y HLA- DR sobre una población de CD obtenidas de CMSP tratadas con: H20 (control negativo), LPS (control positivo) y el polisacárido inmunoestimulante. La figura 17 muestra la producción de TNF-α por las CD estimuladas por el polisacárido determinada por ELISA.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Para facilitar la descripción de los componentes de la presente invención, se establecen las siguientes definiciones para los términos utilizados en la memoria descriptiva de la presente invención.
La expresión "agente inmunoestimulante" hace referencia a un agente que es capaz de producir la maduración fenotípica (aumento moderado de CD86 y HLA-DR) y/o funcional de las células dendríticas (producción de TNF-α) y son ejemplos especialmente considerados dentro de la invención polisacáridos y/o glicopéptidos obtenidos a partir de: Ganoderma lucidum, Astragalus membranaceus, Grifóla frondosa, Phellinus linteus, Cordyceps militaris, Lentinus edodes, Coriolus versicolor, Agaricus blazei o Petiveria alliacea.
La expresión "fracción bioactiva estandarizada" es utilizada para denominar una fracción o mezcla compleja de principios activos con actividad biológica obtenida a partir de Petiveria alliacea por métodos de separación convencionales que incluyen maceración del material vegetal, calentamiento a reflujo y cromatografía en fase estacionaria liquida o sólida de tipo analítico, semipreparativo o preparativo. Estas mezclas complejas presentan una composición cualitativa y cuantitativa que puede variar dependiendo de factores relacionados con la planta (condiciones climáticas del cultivo, condiciones de recolección y manipulación) y la metodología de extracción aplicada a la misma, por lo que la estandarización de fracciones con actividad biológica requiere de la implementación de las buenas prácticas de agricultura en el cultivo y de manufactura a nivel de producción. En este sentido, las normas internacionales de la OMS [WHO Guidelines on good Manufacturing Practices (GMP) for Herbal Medicines. World Health Organization 2007] establecen como herramienta idónea para realizar el control de calidad y estandarización de las mezclas complejas, la cuantificación de uno o más compuestos marcadores de la fracción mediante un perfil o huella cromatográfica de los productos por medio de GC, HPLC y HPTLC que permiten la construcción de patrones específicos de reconocimiento para múltiples compuestos en los productos [WHO Guidelines on good manufacturing practices (GMP) for herbal medicines. World Health Organization, Geneva 2007].
Este patrón brinda una fotografía completa de la proporción de los analitos detectados en la preparación, la cual permite realizar una aproximación cualitativa y cuantitativa para autenticar las especies, evaluar la calidad y asegurar la estabilidad de las preparaciones [Peishan Xie. 2006]. El análisis de esta huella cromatográfica se realiza mediante un sistema multi-variado quimiométrico a partir de la evaluación de la similaridad de las huellas mediante los coeficientes de correlación y congruencia y los métodos de reconocimiento de patrones químicos tales como K-nearest neighbors - KNN - y soft independent modeling of class analogy - SIMCA - [Liang Y., Xie P., Chan K., 2004].
La expresión "fracción bioactiva de Petiveria alliacea obtenida por metodologías bio-dirigidas" se entiende como un extracto semiprocesado obtenido a partir de un proceso de fraccionamiento racional y dirigido que se realiza a partir del extracto crudo de la planta, utilizando pruebas biológicas como criterio para la tamización y selección de las fracciones, entendido como un "producto sintetizado" en la Decisión 391 del Régimen Común sobre Acceso a los Recursos Genéticos de la Comisión del Acuerdo De Cartagena.
La expresión "fracción bioactiva marcada analíticamente" hace referencia a una fracción bioactiva en la cual sus componentes han sido cuantificados a partir de la utilización de compuestos marcadores internos o externos por medio de una o más técnicas cromatográficas.
La expresión "administración secuencial" hace referencia a la administración en un tiempo entre 24 horas y 2 semanas, preferiblemente, entre 72 y 192 horas, de dos o más formulaciones de una fracción bioactiva de Petiveria alliacea con actividad antitumoral y un agente inmunoestimulante. Esta administración secuencial permite la fagocitosis de los restos tumorales por las CD inmaduras.
La expresión "administración simultánea" hace referencia a la administración conjunta de una fracción bioactiva de Petiveria alliacea con actividad antitumoral y un medicamento convencional utilizado en la terapia antitumoral.
La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se entiende como el nivel de dosificación suficiente de los principios activos o fracciones de la invención necesarios para inducir un efecto biológico deseado en el tratamiento de la enfermedad dentro de un balance riesgo/beneficio aceptable a cualquier tratamiento médico.
La expresión "terapéutico" incluye el tratamiento o profilaxis de una enfermedad para un mamífero incluyendo el hombre.
La presente invención proporciona entonces, una serie de fracciones biológicamente activas obtenidas a partir de Petiveria alliacea por metodologías convencionalmente utilizadas en las ciencias químicas mediante un enfoque de purificación bioguiado [Permiso de Investigación Científica en Diversidad Biológica No. 10 de 30042009 y Acceso a Productos Derivados RGE0053 de 06052009]. Las fracciones estandarizadas se entienden como mezclas complejas de principios activos y se denominaron de acuerdo con la metodología de extracción y purificación aplicada como: fracción FAST, fracción F4 y fracción S3. Para la obtención de las diferentes fracciones de Petiveria alliacea se realizaron como actividades preliminares la recolección del material vegetal, el lavado y descontaminación de la planta, secado, fragmentación y pulverización al tamaño de partícula requerido.
Inicialmente, se obtuvieron los extractos crudos de la planta en solventes orgánicos (Etanol, Diclorometano y Acetato de Etilo) para evaluar cuál de estos permitía la obtención de la mezcla con mayor actividad biológica sobre líneas celulares tumorales. El ejemplo 1 (figura 1) muestra claramente que el extracto obtenido con acetato de etilo induce la mayor mortalidad de las células tumorales, comparado con el extracto crudo etanolico (el cual ha sido el más comúnmente utilizado y obtenido por diferentes laboratorios) y en diclorometano.
A partir de estos resultados, se selecciono el extracto crudo de acetato de etilo como matriz para la obtención de las fracciones que serían estudiadas posteriormente. La fracción FAST fue obtenida por extracción a reflujo en etanol, filtración y evaporación, extracción líquido-líquido en acetato de etilo hasta agotamiento, secado y separación por RP-18 usando como fase móvil MeOH-H20 en proporciones 1 :1 , 7:3 y 9:1. La fracción total eluída con el sistema de solventes MeOH:H20 7:3 se denominó FAST.
La fracción F4 fue obtenida por extracción a reflujo en etanol, filtración y evaporación, extracción líquido-líquido en acetato de etilo hasta agotamiento, secado y separación por RP-18 usando como fase móvil metanohagua (MeOH- H20) en proporciones 1 :1 , 7:3 y 9:1. Las fracciones obtenidas fueron secadas y evaluadas en diferentes modelos in vitro para determinar actividades biológicas. Una de las fracciones obtenidas durante el fraccionamiento con el sistema de solventes MeOH:H2O 7:3 se denominó fracción bioactiva F4. La fracción S3 fue obtenida por extracción en Soxhlet con 4L de petrol, diclorometano (CH2CI2), acetato de etilo (EtOAc) y EtOH 96% durante 48 h. Los extractos fueron filtrados y evaporados hasta sequedad. El extracto EtOAc se floculo con una mezcla EtOH:H2O y se sometió a calentamiento a 65°C durante 20min. El sobrenadante se recupero por filtración y se percolo a través de Silica Gel G-60 con CH2CI2, EtOAc y EtOH 96%. La fracción EtOAc fue recuperada y sometida a fraccionamiento en una columna de Silica Gel G-60 (30 x 4cm) y eluída con CH2CI2 y EtOAc (7:3), (1 :1), EtOAc y EtOH 96%. La fracción denominada S3 corresponde a la fracción eluída con el sistema de solventes CH2CI2 y EtOAc (7:3).
La fracción bioactiva FAST disminuye la capacidad clonogénica en las líneas celulares 4T1 y K562 (ejemplo 2, figura 2), induciendo adicionalmente una alteración del metabolismo de la glucosa reflejado por un aumento en la expresión de la Piruvato kinasa por las células tumorales tratadas con la fracción, determinada por PCR en tiempo real (ejemplo 3, figura 3). La fracción fue caracterizada mediante técnicas espectroscópicas, tales como cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) - ultravioleta (UV) y espectroscopia de masas (MS) (Figura 4) usando un espectrómetro de masas LC-TOF (cromatografía liquida acoplada con tiempo de vuelo) equipado con una fuente ESI (ión electro aspersión) en ión positivo y negativo, lo que permitió establecer la presencia de los siguientes compuestos, por la técnica de dereplicación:
Figure imgf000016_0001
A parir de los resultados obtenidos por MS se estableció la abundancia relativa de los compuestos marcadores de la fracción bioactiva FAST de Petiveria alliacea como parámetro de caracterización de la misma.
Figure imgf000017_0001
Preferiblemente, la fracción FAST comprende los siguientes compuestos marcadores en la siguiente proporción:
Figure imgf000017_0002
Petiveral / leridol 20.6-38.2
Pinitol 0.01-5
S-bencil cistein sulfóxido 0.01-5
Senfol 0.01-5
La fracción bioactiva F4 presenta múltiples actividades antitumorales induciendo un aumento en la población apoptótica (Go/G) con un incremento en la fase G2 del ciclo celular de diferentes líneas tumorales. Así mismo, induce reorganización de los filamentos de actina a nivel del citoesqueleto y fragmentación del ADN independiente de la vía mitocondrial (Ejemplos 4 a 7, figuras 5 a 8). La fracción fue caracterizada mediante técnicas espectroscópicas, tales como HPLC-PDA (Figura 9) y MS-MALDI-TOF (Figura 10). La fracción bioactiva F4 presenta siete (7) picos característicos en un análisis por HPLC (columna C18, 5 pm (2.1 x150 mm) Waters) con detector PDA en una fase móvil H 2 O: ACN (4:6).
Figure imgf000018_0001
Para realizar la identificación de los compuestos presentes en la fracción bioactiva de Petiveria alliacea se realizó la determinación por MS-MALDI-TOF, y mediante la técnica de dereplicación se estableció la presencia de los siguientes compuestos:
Figure imgf000018_0002
206 Leridal Chalcona
213 Dibencil disulfuro
270 Dibencil trisulfuro
340 4-etil petiveral
369 Acido Lignocerico
468 Miricitrina
A partir de los resultados obtenidos por diferentes técnicas espectroscópicas se estableció la abundancia relativa de los compuestos marcadores dentro de la fracción bioactiva F4 de Petivería alliacea como parámetro de caracterización de la misma.
Figure imgf000019_0001
La fracción bioactiva S3 disminuye la viabilidad celular en forma dosis- dependiente induciendo depolarización temprana no reversible de la membrana mitocondrial (sin afectar las fases del ciclo celular) en diferentes líneas tumorales humanas y murinas (Ejemplos 8 a 1 1 , figuras 1 a 13), así mismo, disminuye la expresión de Hsp70 sobre células sometidas o no a choque térmico (Figura 14). La muerte celular inducida por la fracción S3 asociada a cambios morfológicos y fragmentación coordinada del DNA sugiere que la apoptosis es posiblemente mediada por activación endógena de endonucleasas corriente abajo de la mitocondria. La fracción fue caracterizada usando un espectrómetro de masas LC-TOF (Micromass®, UK) equipado con una fuente ESI en ión positivo y negativo (Figura 15) y por HPLC-UV.
Figure imgf000020_0001
A partir de los resultados obtenidos por MS se estableció la abundancia relativa de los compuestos marcadores de la fracción bioactiva S3 de Petiveria alliacea como parámetro de caracterización de la misma.
Figure imgf000020_0002
Miricitrina 0.01-5
Petiveral 32-55
Pinitol 0.01-5
S-bencil cistein sulfoxido 2-4
Senfol 0.01-5
Las fracciones de la invención pueden ser formuladas como composiciones con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, dichas composiciones pueden ser especialmente diseñadas para administración oral en formas farmacéuticas sólidas o líquidas, para administración tópica en formas heterodispersas (cremas W/O, cremas O W, geles y ungüentos entre otros) y para administración parenteral o rectal. Las composiciones de la invención pueden ser administradas a humanos y otros mamíferos oralmente, rectalmente, parenteralmente, tópicamente, intravaginalmente, bucalmente o como spray nasal u oral.
Las composiciones para administración oral que contienen las fracciones de la invención, pueden incluir cualquier forma oral usada convencionalmente, tales como: tabletas, cápsulas, formas bucales y líquidos orales, suspensiones o soluciones. Las cápsulas pueden contener mezclas de los agentes activos con excipientes inertes y/o diluyentes tales como: almidones farmacéuticamente aceptables (por ejemplo maíz, papa o almidón), azúcares, agentes endulzantes artificiales, celulosas en polvo (CMC, MC, EC, HPMC), harinas, gelatinas y gomas entre otros.
Las composiciones en tabletas pueden elaborarse por métodos de compresión convencional, granulación húmeda o granulación seca y pueden utilizarse excipientes tales como: diluyentes, lubricantes, desintegrantes, agentes de modificación de superficie (incluyendo surfactantes), agentes de suspensión o estabilización, incluyendo pero no limitado al estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, laurilsulfato de sodio, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, gelatina, ácido alginico, goma acacia, goma xantana, citrato de sodio, silicatos complejos, carbonato de calcio, lactosa, caolín, manitol, cloruro de sodio, almidones secos y azúcar en un grado farmacéuticamente aceptable. Así mismo, las composiciones orales reveladas en la invención pueden ser formulaciones convencionales o formulaciones de liberación retardada o controlada que alteren la absorción de los agentes activos.
En otra modalidad, la invención incluye una combinación farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende una fracción bioactiva de Petiveria alliacea o una composición farmacéutica que la contiene y al menos un agente inmunoestimulante capaz de producir la maduración fenotípica y/o funcional de las células dendríticas.
Los agentes inmunoestimulantes de la respuesta inmune útiles dentro de la invención, son fracciones o compuestos aislados de hongos o plantas capaces de producir la maduración fenotípica y/o funcional de las CD, son ejemplos preferidos polisacáridos y/o glicopéptidos obtenidos a partir de Ganoderma lucidum, Astragalus membranaceus, Grifóla frondosa, Phellinus linteus, Cordyceps militaris, Lentinus edodes, Coriolus versicolor, Agaricus blazei o Petiveria alliacea.
Ganoderma lucidum es un hongo ampliamente utilizado en China, Corea y Japón que cuenta con un historial de uso en la medicina tradicional superior a cuatro milenios. En Japón es llamado Reishi o Mannetake, en China y Corea es llamado
Ling Chu, Ling Chih y Ling Zhi (Hongo de Inmortalidad). El hongo y el micelio contienen esteroides, lactonas, alcaloides, polisacáridos y triterpenos. G. lucidum ha mostrando actividad como modulador inmune, antiviral y antitumoral, dentro de sus metabolitos activos ha sido aislado un glicopéptido (PS-G) que corresponde en un 95% a un (1→6)- -D-glucano ramificado y un 5% a péptido, el cual ha mostrado actividad antineoplásica (Wang et al., 1997), aumento de la actividad citotóxica en células NK e incremento en la liberación de TNF-α y IFN-γ en macrófagos y linfocitos, respectivamente (Lee et al., 1995). Así mismo, ha sido mostrado que PS-G induce importantes cambios en el fenotipo y función de CD (Lin et al., 2005).
Astragalus membranaceus (Bunge) es una planta china ampliamente conocida por su actividad inmunomoduladora. Diversos polisacáridos han sido aislados a partir de su raíz, entre los que se tienen: Astragalan I, el cual es un heterosacárido neutral de 36KD que contiene glucosa, galactosa y arabinosa, astragalan II y III que corresponden a β-glucanos de 12 y 34kD, respectivamente, AMemP un polisacárido de carácter acido de 60KD con un alto contenido de ácido uránico, AMonS un polisacárido ácido de 76KD compuesto por arabinosa, galactosa, ácido galacturonico y ácido glucuronico en relación 18:18:1 : 1 (Shimizu et al., 1991 ) y APSID-3 un heteropolisácarido compuesto de arabinosa, ramnosa y metil galacturonato (Wang et al., 2006). Diferentes fracciones de estos polisacáridos inducen maduración morfológica de CD in vitro junto a un incremento en la expresión de CD-11c y MHC clase II sobre la superficie, así mismo, disminuyen la capacidad fagocitica de las CD tratadas (recaptación de FITC-dextrano) frente a CD inmmaduras (Shao, et al., 2006).
Grifóla frondosa conocido como Maitake es un hongo comestible de un excelente sabor y aroma, es componente de una amplia variedad de medicinas tradicionales Chinas. A partir G. frondosa se obtiene un polisacárido denominado fracción D, el cual es utilizado como suplemento nutricional en el tratamiento contra el cáncer. Esta fracción es obtenida a partir del micelio o el fruto por medio de una extracción en agua caliente, precipitación con etanol y posteriormente tratamiento con ácido acético y álcalis, comprende β-1 ,6- glucanos ramificados en posiciones β-1 ,3 (grifolan, sonifilan y SSG) y proteína con un peso molecular de alrededor de 1000KD. La fracción D ha mostrado un aumento de la respuesta inmune innata y adaptativa en ratones normales C3H/HeJ, donde los resultados sugieren que la fracción induce una respuesta dominante Th2 a través de la activación de macrofagos e incremento en la producción de IL4 e IL10 complementario a la activación de células presentadoras de antígeno (incremento en la expresión de CD69 y CD89) después de 4h de la administración de la fracción (Kodama, Muraya & Nanba, 2004).
Phellinus linteus es un Basidiomiceto perenne originario de la China y Corea a partir del cual se han aislado complejos de proteína-polisacárido y polisacáridos de tipo ácido con propiedades inmunoestimulatorias, el complejo proteína- polisacárido (PPC) tiene un peso de 73KD y está compuesto por polisacárido 73% (principalmente glucosa y mañosa) y una fracción proteica 13% (Asp, Thr, Ser, Glu, Pro, Gly, Ala, Val). El complejo PPC induce un aumento dosis dependiente en la expresión de las moléculas coestimulatorias CD86 y MHC clase II, así como una maduración fenotípica acompañada de disminución en la capacidad endocitica de CD mieloides in vitro tratadas por 24h con el complejo (Kim, et al., 2006). De la misma forma, polisacáridos de tipo ácido han mostrado actividad como estimulantes de la proliferación de LT, inhibidores de crecimiento tumoral e inductores de la maduración fenotípica de CD derivadas de medula ósea murina incrementando la expresión de CD80, CD86, MHC I, MHC II e IL12 y reduciendo la recaptación de dextrano (Park SK, et al,. 2003).
Cordyceps militaris es un hongo parasitario de insectos que crece en larvas de Lepidoptera, ha sido usado por siglos en la medicina tradicional China por sus propiedades antitumorales e hipoglicemiantes, dentro de los compuestos bioactivos aislados de su micelio se tienen nucleósidos (cordicepina, opicordina), galactomanano, triptófano y polisacáridos (Li et al,. 2006). La fracción acuosa de C. militaris rica en polisacáridos ha mostrado actividad antitumoral e inmunomoduladora in vivo e in vitro, así mismo esta fracción induce la maduración fenotípica y funcional de CD murinas mieloides, incrementando la expresión de CD40, CD54, CD80, CD86, MHC II y la secreción de IL-12. De la misma forma la promueve la citotoxicidad de LT citotóxicos inducida por CD tratadas con la fracción y pulsadas con lisado tumoral P815 (Gi-Young, et al,. 2006).
Lentinus edodes conocido como "shiitake" en Japón y Xiang gu en China es un hongo ampliamente utilizado como alimento y medicina tradicional, su actividad antitumoral e inmunoestimulante ha sido demostrada en diferentes estudios realizados en animales y humanos. Al menos cinco polisacáridos han sido aislados de las fracciones activas de L. edodes, dentro de estos se tienen el lentinan - disponible comercialmente en US y Europa- es un polisacárido de alto peso molecular (450KD) que corresponde químicamente a un β-1 ,3- glucano ramificado con dos unidades de β-1 ,6-D-glucopiranosil por cada cinco unidades de p-1 ,3-glucopiranosido lineal, es soluble en agua y se encuentra en muy bajas concentraciones (0.02%) en hongos frescos (Sasaki and Takasuka, 1976), LEM un heteropolisacárido asociado a proteína derivado del micelio y el KS-2 un péptido β-manano que contiene los amino ácidos serina, treonina, alanina y prolina. Los extractos acuosos de L. edodes han mostrado actividad citostatica in vitro evaluada en células MCF-7 (adenocarcinoma humano de mama) mediante el test de citotoxicidad MTT e inmunomoduladora en términos de actividad mitógenica y co-mitógenica establecida a través del test de transformación linfocitaria (LTT) basado en el aumento de la proliferación de timocitos de rata a mitógenos de LT ¡n vitro (Israilides, et al., 2008).
Coriolus versicolor es un hongo Basidiomiceto utilizado en la medicina tradicional China con propiedades inmunoestimulantes y antitumorales. Diferentes extractos obtenidos a partir de C. versicolor son comercializados en Japón y otros países como medicamentos contra el cáncer (PSK) o suplementos dietarios (PSP y VPS). PSK un polisacárido unido a proteína está compuesto principalmente por un p-1 ,4-glucano aislado de la cepa CM-101 induce aumento en la expresión de citocinas en células mononucleares humanas de sangre periférica in vitro y aumenta la expresión de TNF-α e IL-8 en voluntarios sanos y pacientes con cáncer gástrico. Así mismo, PSK promueve la maduración fenotípica y funcional de CD derivadas de células mononucleares CD14+ cultivadas en presencia de PSK, incrementando la expresión de HLA clase II, CD80, CD86 y CD83, disminuyendo la recaptación de FITC-dextrano, aumentando la producción de IL-12, la reacción de linfocitos mixtos alogénicos e induciendo citotoxicidad antígeno especifica (Kanazawa, et al., 2004). PSP un polisacárido-péptido aislado de la cepa COV-1 corresponde químicamente a un heteropolisacárido compuesto por a-1 ,4-glucano, β-1 ,3- glucano, ramnosa y arabinosa, con un tamaño de 100KD. PSP ha mostrado actividad antitumoral en pacientes con cáncer esofágico, gástrico y pulmonar, así mismo induce la producción de IL-2 e IFN-γ y la proliferación de LT en modelos animales (Ng TB, 1998).
Agaricus blazei Murril conocido popularmente como "Cogumelo do Sol' en Brasil o 'Himematsutake' en Japón, es un hongo nativo de Brasil tradicionalmente utilizado en enfermedades como .aterosclerosis, hepatitis, hiperlipidemia, diabetes, dermatitis y cáncer (Firenzouli, et al., 2007). Dentro de sus metabolitos activos aislados se tiene un proteoglicano soluble en agua compuesto por proteína (45%) y p-1 ,6-glucano ramificado β-1 ,3 (50%) el cual induce la activación policlonal de LB y ejerce una potente actividad como inhibidor del crecimiento tumoral y de la metástasis. Así mismo, aumenta la expresión de moléculas coestimulatorias (CD80 y CD86) y MHC clase II, disminuye la recaptación de FITC-dextrano e incrementa la proliferación de LT alogénicos en CD murinas derivadas de médula ósea por tratamiento con el proteoglicano durante 24h (Kim, et al., 2005).
Otra alternativa de la invención comprende el uso de la fracción bioactiva de Petiveria alliacea como ingrediente activo para la preparación de medicamentos. Asimismo, se reclama el uso de dicha fracción junto con otros compuestos, fracciones o extractos para la preparación de medicamentos. También es parte de la invención, el uso de una fracción bioactiva de Petivería alliacea o una composición que la contenga, como agente coadyuvante de la quimioterapia convencional para el tratamiento del cáncer.
Igualmente, la invención abarca un kit para el tratamiento del cáncer que comprende la composición de la fracción bioactiva de Petivería alliacea, la composición de uno o más agentes inmunoestimulantes capaces de producir la maduración fenotípica o funcional de las células dendríticas y opcionalmente, las instrucciones de uso.
Finalmente, la invención incluye un método de tratamiento que comprende la administración secuencial de al menos una fracción bioactiva de Petivería alliacea y en un intervalo de tiempo entre 24 horas y 2 semanas, la administración de al menos un agente inmunoestimulante capaz de producir la maduración fenotípica y/o funcional de las células dendríticas. Opcionalmente el método de tratamiento comprende la administración simultanea o secuencial de un medicamento quimioterapéutico convencional junto con la fracción bioactiva de Petivería alliacea.
Los niveles de dosificación de las fracciones y agentes inmunoestimulantes en la combinación farmacéutica proporcionada por la invención pueden variar para obtener la cantidad de principio activo requerida para alcanzar la respuesta terapéutica deseada dependiendo de las condiciones fisiológicas y patológicas del sujeto, la composición y la ruta de administración. Los niveles de dosificación seleccionados dependen específicamente de la potencia particular de la fracción, la ruta de administración, la severidad de la condición tratada y la historia médica previa del paciente a ser tratado.
La dosis diaria total de las fracciones y compuestos usados en las composiciones de la invención puede variar en el rango desde 0.001 a 1000 mg/Kg/día. Para propósitos de administración oral, las dosis preferibles se encuentran en el rango de 0.001 a 5 mg/Kg/día. Si se requiere, la dosis efectiva diaria puede ser dividida en dosis múltiples para propósitos de administración, consecuentemente la invención comprende composiciones de dosis simples que contienen la cantidad efectiva o dosis múltiples que alcanzan la dosis diaria efectiva tras varias administraciones.
A continuación se presentan a titulo ilustrativo los hechos científicos que sustentan la presente invención y no debe entenderse como una limitante de la invención.
LÍNEAS CELULARES
La línea celular Mel-Rel fue obtenida a partir de un tumor de ratón transgénico Reí, y fue donada por la Dra. Armell Prevost (Cochin Hospital, Paris, France). La línea A375 (células de melanoma humano) fue donada por el Instituto de Investigaciones de la Universidad del Rosario. Las células NB4 (leucemia mieloide humana) y K562 (eritroleucemia humana) y la línea 4T1 (tumor mamario murino) pertenecen al stock del laboratorio. Las células adherentes fueron suspendidas en medio RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino, L-glutamina (2mM), penicilina (100U/ml), estreptomicina (100 ng/ml) y Hepes (0.01 M) y mantenidas a 37°C con 5% C02 en atmósfera húmeda. Después de alcanzar 80% de confluencia, las células adherentes fueron despegadas con una mezcla de tripsina/EDTA por 4 minutos, lavadas con PBS para detener la actividad enzimática y resuspendidas en medio completo. El análisis de susceptibilidad de las líneas a los extractos fue realizado en placas de 96 pozos y los extractos fueron resuspendidos en etanol o DMSO en porcentajes inferiores al 0.2% de concentración final en el cultivo. Para los ensayos en células normales, células mononucleares de sangre periférica humanas (CMSP) fueron obtenidas de sangre venosa periférica de voluntarios sanos. Las CMSP fueron separadas por centrifugación en gradiente de densidad FICOLL-HIPAQUE (Amersham Biosciences) y mantenidas en medio RPMI- 1640 suplementado.
EJEMPLO 1. EVALUACION DE LA MUERTE CELULAR INDUCIDA POR EXTRACTOS CRUDOS DE PETIVERIA ALLIACEA.
Las Células NB4 fueron tratadas con 250 pg/ml de los diferentes extractos de Petiveria alliacea por 24 horas, y la viabilidad celular fue calculada con azul de tripano. Como control positivo se utilizó etoposido a 100 pg/ml. Los resultados se expresan como porcentaje de viabilidad (Figura 1). La figura muestra claramente que el extracto crudo etanólico (utilizado en el estado de la técnica) induce solamente un 50% de mortalidad de las células tumorales mientras que el extracto obtenido con acetato de etilo (base de la presente invención) induce una mortalidad de cerca del 80%, mostrando la superioridad biológica de la invención con respecto a los extractos utilizados convencionalmente.
A partir de estos resultados, se selecciono el extracto crudo de acetato de etilo como matriz para la obtención de las fracciones que serán descritas a continuación y que son reclamadas en la presente invención.
EJEMPLO 2. EFECTO DE LA FRACCIÓN FAST SOBRE LA CAPACIDAD CLONOGÉNICA DE LAS LÍNEAS CELULARES 4T1 Y K562
La línea celular murina 4T.1 (2.5x105 células/pozo) fue sembrada en placas de 24 pozos, tratadas con la fracción FAST 7:3 a 40 y 20 pg/ml, Vincristina 100nM (fármaco quimioterapéutico convencional) como control positivo o Etanol 0,2%, e incubadas por 6 horas en atmosfera húmeda 37°C y 5% CO2. Después del tratamiento, las células fueron sembradas sobre placas de agar al 0,5% (20.000 células/placas de 60mm), se incubaron por 14 días en atmosfera húmeda 37°C y 5% C02 y se tiñeron con cristal violeta (0,4% en etanol). Las colonias con más de 50 células fueron contadas. Los tratamientos se llevaron a cabo por triplicado, y los resultados se expresaron como la media ± DS (figura 2).
La fracción bioactiva FAST8 induce una disminución estadísticamente significativa en el número de colonias de las líneas 4T1 y K562 a concentraciones de 40 y 20pg/mL mostrando la actividad de la fracción de P. alliacea como inhibidor de la capacidad clonogénica de líneas tumorales.
EJEMPLO 3. EXPRESIÓN DEL GEN PARA PIRUVATO KINASA ISOFORMA P-KL EN CÉLULAS 4T.1 TRATADAS CON FAST EN CINÉTICA.
Células 4T.1 fueron tratadas con ETOH (control negativo) y FAST (20 pg/ml) por 4, 6, 12, 16 y 24H. El RNA de las células fue extraído utilizando trizol y la síntesis del cDNA fue realizada utilizando la enzima superscript III. Para la amplificación del gen de la piruvato kinasa por PCR-TR se utilizó el kit LightCycler FastStart DNA Master Plus SYBR Green I. Se observo un aumento superior a 20 veces en la expresión del RNAm codificando para la proteína. Este resultado confirma la actividad de la fracción sobre el metabolismo de la glucosa que explica la actividad antitumoral reportada para la fracción de P. alliacea (Figura 3).
EJEMPLO 4. ARRESTO EN LA FASE G2/M DEL CICLO CELULAR DE LA LÍNEA TUMORAL A375 INDUCIDO POR LA FRACCIÓN F4
La actividad citotóxica de la fracción bioactiva F4 de Petiveria alliacea fue evaluada sobre la línea tumoral A375 a concentraciones desde 125pg/ml hasta 3,9pg/ml en diluciones seriadas. Las evaluaciones fueron realizadas cuando más del 50% de las células estaban muertas o presentaban alteraciones morfológicas. Después del tratamiento por 24h se observa la actividad citotóxica de la fracción F4 a una concentración de 31 ,2pg/ml. De igual forma, la fracción induce alteraciones morfológicas (células deformadas, alargadas y despegadas) a la misma concentración (Datos no mostrados).
A partir de estos resultados se evaluó el efecto sobre el ciclo celular para lo cual las células fueron sincronizadas (crecimiento durante 3 días en ausencia de suero fetal bovino), lavadas y resuspendidas en medio completo. Las células adherentes (4.0 x 105 células/pozo) fueron adheridas durante 24h en una placa de 12 pozos y cultivadas en presencia de la fracción por 24h o 48h a una concentración de 31 ,2 pg/ml. En algunos experimentos las células fueron analizadas a tiempos de 12, 18, 24 y 48h con el objetivo de establecer la cinética de la detención producida por F4 sobre el ciclo celular. Al tiempo respectivo de análisis, las células adherentes y en suspensión fueron lavadas con PBS (con Ca++ y Mg++) que contiene 100U/ml RNAsa y 5( g/ml de yoduro de propidio (Sigma, St. Louis, MO) e incubadas a temperatura ambiente por 30 minutos. El contenido de DNA por célula fue estimado por citómetria de flujo en un FACScalibur (Becton Dickinson, Fullerton, CA). Los datos de citómetria fueron recolectados para 50.000 eventos celulares por muestra y analizados usando CELLQuest software (Becton Dickinson). Los porcentajes de distribución de núcleos con tinción (2N y 4N) en el ciclo celular fueron calculados usando Modfit LT software. Los estándares de calibración DNA QC Partióle Kit para la verificación del instrumento fueron obtenidos de Beckton Dickinson. La figura 5A muestra claramente la detención de las células tumorales en fase G2 del ciclo celular al igual que la vincristina utilizada como control positivo.
La figura 5B muestra el efecto de la fracción F4 a una concentración de 31 ,2 μg/ml sobre el ciclo celular de la línea A375, analizado por citómetria de flujo. La gráfica muestra la acumulación en la fase G2 (60%) para las células tratadas con el F4 comparado con el 18% de las células sin tratamiento. La vincristina induce un arresto en G2 cercano al 80%. EJEMPLO 5. ALTERACIONES EN LA ORGANIZACIÓN DEL CITOESQUELETO DE LAS CÉLULAS A375 INDUCIDAS POR LA FRACCIÓN F4.
Células A375 y Mel-Rel (5x104) fueron colocadas sobre láminas de vidrio (13 mm diámetro) y recubiertas con 6-10^g/cm2 de colágeno (SIGMA) por 16h. Después de 16h las células fueron incubadas en la presencia del extracto por 24h a 37°C en atmósfera húmeda con 5% de C02. Las células fueron lavadas con PBS y fijadas con paraformaldehido al 2% en PBS por 30 minutos a 4°C. Posteriormente las células son lavadas dos veces con PBS-BSA 1% e incubadas con acetona fría por 1min y con phalloidina conjugada con Oregon- green (Molecular Probes) diluido en PBS-BSA 1% (1/40) por 30min. Las células fueron observadas por microscopía de fluorescencia (Olympus, Japan).
La figura 6 muestra en el panel B el efecto inducido por la fracción F4 sobre la arquitectura y organización de los filamentos de actina del citoesqueleto. Las células tratadas con la fracción no se extienden y las estructuras filamentosas se observan desensambladas o reorganizadas y acumuladas en las áreas submembranosas. Los filamentos de actina se observan como gránulos, principalmente localizados en los bordes de las células A375. Las células control (panel A) muestran una considerable organización en la arquitectura del citoesqueleto.
EJEMPLO 6. FRAGMENTACION DEL DNA DE LAS CÉLULAS A375 INDUCIDO POR LA FRACCIÓN F4.
Células A375 y Mel-Rel (5x104) fueron colocadas sobre láminas de vidrio (13mm diámetro) y recubiertas con 6-10pg/cm2 de colágeno (SIGMA) por 16h. Después de un 80% de confluencia, las células fueron expuestas al tratamiento con la fracción F4 a 31 ,2pg/ml por 24 h. Para realizar la tinción de DAPI, las células fueron lavadas con PBS y fijadas con paraformaldehido al 2% en PBS por 30min a 4°C. Posteriormente las células son lavadas dos veces con PBS- BSA 1% e incubadas con acetona fría por 1min y con DAPI 300nM (Sigma, St. Louis, MO) por 5min. Los cambios en los núcleos de las células después de la tinción fueron observados por microscopía de fluorescencia (Olympus, Japón).
La figura 7 (panel B) muestra el efecto de la fracción F4 sobre la fragmentación del DNA inducida posiblemente por la activación de endonucleasas endógenas de una forma independiente de la mitocondria.
EJEMPLO 7. EFECTO DE LA FRACCIÓN F4 SOBRE EL CRECIMIENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES NORMALES
Un total de 2x105 células mononucleares humanas por pozo fueron cultivadas en placas de 96 pozos en presencia de fitohemaglutinina (PHA, GibcoBRL). Después de 12h de incubación, fueron adicionadas diferentes concentraciones de la fracción F4 (250, 125, 62,5, 31 ,2, 15,6, 7,8 y 3,9 pg/ml) o de la vincristina. Luego las células fueron incubadas por 30h y se adicionaron 10μΙ de MTT 12mM [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromuro] (Molecular Probes) en PBS a cada pozo e incubadas por 4h a 37°C. El formazan generado fue disuelto en SDS-HCI 0.01 M y la densidad óptica fue medida a 540nm usando un Multiskan MCC/340 (Labsystems).
La figura 8 muestra el efecto de la fracción bioactiva sobre las células mononucleares sin tratamiento con PHA (A) o previamente tratadas con el mitógeno (B). Se observa claramente que la fracción F4 no tiene efectos sobre las células mononucleares normales al igual que la vincristina. La falta de efecto de la vincristina es explicada por su actividad específica sobre el citoesqueleto de las células con una alta tasa de replicación, tales como las células tumorales. Es decir que la fracción F4 y la vincristina presentan una alta especificidad de acción sobre las células tumorales. EJEMPLO 8. EFECTO DE LA FRACCIÓN S3 SOBRE LA MORFOLOGIA Y LA VIABILIDAD DE LÍNEAS NB4, MEL-REL Y K562.
Líneas tumorales NB4 (A), Mel-Rel (B) y K562 (C) fueron tratadas por 24h con diluciones seriadas de la fracción S3 (125 a 7,8 pg/ml) de P. alliacea en placas de 96 pozos y observadas en microscopio invertido (Olympus CH3) para establecer cambios morfológicos (determinación de vesículas intracelulares) y test de viabilidad celular (azul tripan). La fracción bioactiva S3 induce cambios morfológicos sobre las tres líneas celulares, sugiriendo la muerte celular vía apoptosis y/o necrosis de acuerdo a la presencia de cuerpos apoptóticos y células estalladas (figura 11). En la figura se evidencia la actividad de la fracción S3 (barras grises) frente al control positivo - etoposido - (barras negras) y el control negativo (etanol). El valor de IC50 (50% de inhibición del crecimiento celular) calculado usando Minitab 14 Probit analysis (MINITAB® Reléase 14.1. Minitab Inc. 2003 Statistical Software) fue de 45pg/ml para las diferentes líneas tumorales.
EJEMPLO 9. INDUCCIÓN DE DEPOLARIZACIÓN SOBRE LA MEMBRANA MITOCONDRIAL DE LAS LÍNEAS NB4, MEL-REL Y K562 POR TRATAMIENTO CON LA FRACCIÓN BIOACTIVA S3
3 X 105 células fueron marcadas con 10 g/ml of JC-1 (5,5',6,6'-tetracloro- 1 ,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolcarbocianina yoduro, Sigma, St. Louis, MO), incubadas por 10 min a 37°C y analizadas por citómetria de flujo (FACScalibur Cell Quest software Becton Dickinson, Fullerton, CA). Los experimentos fueron desarrollados por triplicado y los resultados son expresados como la media ± SD. La figura 12 muestra la depolarización inducida por la fracción S3 (31 ,2pg/ml) frente al control negativo (EtOH) sobre las células NB4, Mel-Rel y K562. Se puede observar que la depolarización inducida por la fracción S3 en las diferentes líneas celulares tumorales es mantenida en el tiempo (hasta las 8h), sugiriendo la muerte celular programada a través de la vía mitocondrial. Ensayos adicionales han permitido establecer que la depolarización de la membrana mitocondrial se genera a concentraciones de 15,6 pg/ml de la fracción S3.
EJEMPLO 10. EFECTO DE LA FRACCIÓN BIOACTIVA S3 SOBRE LA FRAGMENTACIÓN DEL ADN.
Las células teñidas con Hematoxilina-eosina y DAPI (4',6-diamidin-2-fenilindol) fueron analizadas por microscopia para estudiar el tipo de muerte celular inducida por la fracción bioactiva S3. Las células fueron tratadas con la fracción S3 por 24h a 37°C y atmosfera de CO2 al 5%, posteriormente fueron colocadas sobre láminas portaobjetos por cito-centrifugación (cytospin) por 5 min a 500 rpm, fijadas con EtOH y teñidas con hematoxilina (2 min) y eosina (45seg). El exceso de colorante es removido con EtOH (3 lavados) y las láminas son analizadas y fotografiadas por microscopia óptica (Olympus CH30) en magnificación de 100X. Para la tinción de DAPI las células fueron colocadas sobre láminas de vidrio (13 mm) previamente recubiertas con colágeno (6-10 pg/cm2) en una densidad de 5x104 células por 16h, tratadas con la fracción S3 por 24h a 37°C y atmosfera de CO2 al 5%. Subsecuentemente lavadas con (PBS) y fijadas con para-formaldehido (2% en PBS) por 30 min a 4°C. Después de lavar dos veces con PBS-BSA (1 %) las células fueron incubadas en acetona fría 1 min y nuevamente lavadas (PBS-BSA, 1%) e incubadas por 5 min con DAPI 300nM (Sigma, St. Louis, MO). Las láminas fueron observadas bajo el microscopio de fluorescencia (Olympus, Japan).
Las células NB4 fueron tratadas bajo las condiciones mencionadas con la fracción S3 (31 ,2pg/ml) y el fármaco estaurosporina como control positivo, la figura 13 ejemplifica las células tumorales con el vehículo (EtOH 0,2%) en mitosis activa sin interferencia del ciclo celular normal (A), las células tratadas con la fracción S3 (B) y estaurosporina (C), las cuales muestran fragmentación nuclear y condensación de la cromatina, características esenciales de la muerte celular por apoptosis.
La tinción con DAPI muestra resultados similares, la figura 13-D presenta núcleos normales (vehículo) y 13-E núcleos claramente fragmentados después de la activación de endonucleasas en las células tratadas con la fracción S3 (31 ,2pg/ml). La presencia de fragmentos nucleares fue confirmada por el test de fragmentación del ADN mostrando una ruptura coordinada del ADN.
EJEMPLO 11. EFECTO DE LA FRACCIÓN BIOACTIVA S3 SOBRE LA EXPRESIÓN DE PROTEINAS DE CHOQUE TÉRMICO
Las células K562 fueron incubadas en placas de 6 pozos (2 x106 cel/pozo) en 3ml de medio suplementado y tratadas con la fracción S3 (6,2 pg/ml) o quercetina (100 μΜ) como control positivo. Las células tratadas fueron divididas en dos grupos: el primer grupo fue incubado por 10 h a 37°C y sometido a choque térmico (42°C 60 min) en un baño serológico y posteriormente puestas en recuperación por 4h a 37°C. El segundo grupo fue incubado por 15h a 37°C. Durante el procedimiento los dos grupos fueron mantenidos con el tratamiento.
Después del tratamiento las células fueron lisadas usando buffer TDLB (Tris- HCI 1 M pH 8, NaCI 5M, azida sódica 20%, SDS 10%, NP40 10%, desoxicolato sódico 10%, PMSF 1%) por 30 min a 4°C. Las proteínas (10 pg/ml) cuantificadas por Bradford (BIORAD) fueron sometidas a electroforesis (gel poliacrilamida 10%) y transferidas a membranas de PVDF. La identificación de las proteínas fue realizada utilizando un anticuerpo monoclonal primario anti- Hsp70 (Hsp70 clone 283-48). La detección de la proteína fue realizada mediante un kit de quimioluminiscencia West Dura Extended Duration Substrate (Pierce Lab). La figura 14 muestra la disminución en la expresión de la proteína chaperona Hsp70 sobre las células K562 tratadas con la fracción S3 sometidas a choque térmico (panel A) o sin choque térmico (panel B), mostrando un comportamiento similar a las tratadas con la quercetina, un flavonoide conocido por su efecto en la disminución sobre la expresión de la proteína Hsp70. Dado que la fracción S3 reduce la expresión de la Hsp70 con o sin choque térmico se puede asumir que la fracción S3 actúa sobre el factor de choque térmico 1 (HSF1) o sobre su promotor, mecanismo reportado en la regulación de la expresión de la Hsp70 para la quercetina.
En los ejemplos 12 y 13 relacionados con la capacidad de diferentes compuestos o fracciones para inducir la maduración fenotípica y/o funcional de células presentadoras de antígeno, las células dendríticas son obtenidas de acuerdo al siguiente protocolo.
A partir de 40 mi de sangre anticoagulada con heparina se obtuvieron CMSP por gradientes de densidad con FICOLL-HYPAQUE. Los monocitos fueron separados con anticuerpos monoclonales anti-CD14 acoplados a perlas magnéticas utilizando el sistema MiniMaCs (Myltenyi). Las células obtenidas fueron lavadas en medio RPMI 1640 suplementado al 1 % con suero autólogo. La viabilidad y el número de células fueron evaluados por coloración con azul de tripan y conteo celular en cámara de Newbauer, respectivamente. Las células CD14+ así obtenidas fueron incubadas en medio RPMI 1640 suplementado con suero autólogo al 1 % en presencia de 35 ng/ml de inteleucina (IL-4) y 50 ng/ml de factor de crecimiento de granulocitos y monocitos GM-CSF (R&D system) durante 5 días de cultivo, verificándose su morfología por microscopía de luz. Al día 5 de cultivo, como control positivo de maduración se adiciona 1 pg/ml de lipopolisacarido (LPS). Como control negativo se utilizaron células sin estimulo de maduración. EJEMPLO 12. EFECTO DE UN POLISAC ARIDO OBTENIDO DE PETIVERIA ALLIACEA SOBRE LA EXPRESIÓN DE MOLÉCULAS COESTIMULADORAS DE UNA POBLACIÓN DE CD OBTENIDAS DE CMSP.
Las CDs derivadas de monocitos humanos fueron estimuladas por 48h con el solvente, el lipopolisacarido (LPS) y un polisacárido purificado de la fracción acuosa de la parte aérea de P. alliacea - PACO - (25pg/ml) en presencia de polimixina B (PolB). Los análisis de la expresión de marcadores de maduración realizados por citometría de flujo, evidencian el fenotipo maduro de las CDs estimuladas, aumentando la expresión de moléculas inductoras de la respuesta inmune efectora como CD86 y HLA-DR (figura 16, panel A y B, respectivamente). Adicionalmente, el análisis de la secreción de TNF-a realizado por la técnica de ELISA utilizando los sobrenadantes de las CDs estimuladas por 48 horas con el solvente, 1 pg/ml de lipopolisacarido (LPS) y 25μg/ml del polisacárido PACO, muestra un aumento en la secreción de la citoquina, lo que concuerda con el estado de maduración fenotípica observada por citometría (figura 17).
EJEMPLO 13. EFECTOS IN VIVO DE LA TERAPIA DE COMBINACIÓN CON LA FRACCIÓN FAST DE P. ALLIACEA Y UN AGENTE INMUNOESTIMULANTE.
Se tomaron 8 ratones Balb/c por grupo, a los cuales se les estableció el tumor por inoculación de 104 células 4T1 en el cojín mamario y un grupo igual de ratones a los cuales se les inoculó solución salina. Luego de verificar la instalación del tumor, los ratones fueron tratados por inoculación intraperitoneal (IP) de 2mg de la fracción de Petiveria alliacea por semana, verificando semanalmente el tamaño del tumor. A partir de la segunda semana, el tratamiento se realizó con la fracción de Petiveria y 24 horas después en el segundo grupo, se administró también por vía IP el agente inmunoestimulante a bajas dosis. Luego de 3 semanas, se observó una reducción significativa en el tamaño del tumor en ambos grupos. El análisis de la respuesta proliferativa frente a los antígenos tumorales, realizado por un ensayo clásico de proliferación, mostró que el grupo de ratones tratados con el agente inmunoestimulante, presentaba una mayor proliferación significativamente diferente del grupo tratado solamente con la fracción de Petiveria alliacea.
A partir de los resultados presentados se puede establecer que las fracciones bioactivas de Petiveria alliacea inducen muerte celular por diferentes mecanismos: iniciando con una alteración en el citoesqueleto, detención en la fase G2 del ciclo celular y posterior muerte por apoptosis con fragmentación del DNA. Los restos de las células tumorales (cuerpos apoptóticos) pueden ser fagocitados por la CD, las cuales van a ser posteriormente activadas por el agente inmunoestimulante, permitiendo la presentación de los antígenos tumorales tanto a los linfocitos T CD4 como CD8, induciendo de esta forma una respuesta inmune que permite el control de la metástasis desarrollada por células tumorales que hayan escapado del tratamiento antitumoral directo.
Los resultados permiten establecer que las fracciones obtenidas a partir de P. alliacea tienen actividad sobre diferentes blancos moleculares existentes en las células tumorales debido a la diversidad de compuestos presentes en las fracciones los cuales pueden actuar en sinergia potenciando la actividad antitumoral. Este hecho contrasta con la actividad de los fármacos convencionales de síntesis los cuales actúan sobre un único blanco molecular que le permite a la célula tumoral desarrollar una resistencia al tratamiento de forma más rápida que al utilizar fracciones complejas como las reclamadas en la presente solicitud. Sumado a lo anterior el costo de producción de las fracciones aquí divulgadas es notablemente inferior al requerido para la manufactura de fármacos sintéticos.

Claims

REIVINDICACIONES
Una fracción bioactiva de Petiveria alliacea obtenida por metodologías bio-dirigidas, estandarizada y marcada analíticamente para el tratamiento del cáncer que comprende:
%
4-etil petiveral 0.01-31
Ácido Lignocerico 0.01-25
Dibencil disulfuro 0.01-9
Dibencil tetrasulfuro 0.01-9.5
Dibencil trisulfuro 3.8-14
Leridal 7- demetil 0.01-7
Leridal Chalcona 0.01-16.5
Leridol 0.01-15
Miricitrina 0.01-9
Petiveral 20 - 55
Pinitol 0.01-19
S-bencil cistein sulfóxido 0.01-4
Senfol 0.01-16
2. Una fracción bioactiva de Petiveria alliacea obtenida por metodologías bio-dirigidas, estandarizada y marcada analíticamente para el tratamiento del cáncer de acuerdo a la reivindicación 1 caracterizada porque disminuye la capacidad clonogénica en células tumorales y comprende:
%
4-etil petiveral 0.01-5
Ácido Lignocerico 0.01-5
Dibencil disulfuro 0.01-5
Dibencil tetrasulfuro 0.01-5
Dibencil trisulfuro 3.8-7
Leridal 7- demetil 3.8-7 Leridal Chalcona
Miricitrina
Petiveral / leridol
Pinitol
S-bencil cistein sulfóxido
3. Una fracción bioactiva de Petiveria alliacea obtenida por metodologías bio-dirigidas, estandarizada y marcada analíticamente de acuerdo a la reivindicación 1 y 2 caracterizada por que presenta el siguiente patrón molecular en análisis por HPLC con detector DAD en una fase móvil H20: ACN (4:6) Columna C18:
Figure imgf000041_0001
4. Una fracción bioactiva de Petiveria alliacea obtenida por metodologías bio-dirigidas, estandarizada y marcada analíticamente para el tratamiento del cáncer de acuerdo a la reivindicación 1 caracterizada porque induce reorganización de los filamentos de actina a nivel del citoesqueleto, fragmentación del DNA independiente de la vía mitocondrial e incremento en la población apoptótica (Go/G) en células tumorales y comprende:
%
4-etil petiveral 17-31
Ácido Lignocerico 13-25
Dibencil disulfuro 4.5-9
Dibencil tetrasulfuro 0.01-5
Dibencil trisulfuro 8-14
Leridal Chalcona 9-16.5 Leridal-7-demetil 0.01-5
Leridol 0.01-5
Miricitrina 4.5-9
Petiveral 0.01-5
Pinitol 10-19
S-bencil cistein sulfóxido 0.01-5
Senfol 9-16
5. Una fracción bioactiva de Petiveria alliacea obtenida por metodologías bio-dirigidas, estandarizada y marcada analíticamente de acuerdo a la reivindicación 1 y 4 caracterizada porque presenta el siguiente patrón molecular en un análisis por HPLC con detector DAD en una fase móvil H 2 O: ACN (4:6) Columna C18
Figure imgf000042_0001
6. Una fracción bioactiva de Petiveria alliacea obtenida por metodologías bio-dirigidas, estandarizada y marcada analíticamente para el tratamiento del cáncer de acuerdo a la reivindicación 1 caracterizada porque induce depolarización temprana no reversible de la membrana mitocondrial y disminuye la expresión de Hsp70 sobre células tumorales y comprende:
%
4-etil petiveral 0.01-5
Ácido Lignocerico 0.01-5
Dibencil disulfuro 0.01-5 Dibencil tetrasulfuro 5-9.5
Dibencil trisulfuro 4.5-8.7
Leridal chalcona 19-36
Leridal-7-demetil 0.01-5
Leridol 8-15
Miricitrina 0.01-5
Petiveral 32-55
Pinitol 0.01-5
S-bencil cistein sulfoxido 2-4
Senfol 0.01-5
7. Una fracción bioactiva de Petiveria alliacea obtenida por metodologías bio-dirigidas, estandarizada y marcada analíticamente de acuerdo a la reivindicación 1 y 6 caracterizada porque presenta el siguiente patrón molecular en un análisis por HPLC con detector UV a 280nm en una fase móvil (A) H20 + ácido fórmico1 % y (B) MeOH + ácido fórmico 0,1 % gradiente de elución 60% de A desde 0 hasta 5min, 0% de A 45 min, 60% de A desde 52 hasta 62 min en una columna RP-C 8
Figure imgf000043_0001
Una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer caracterizada porque comprende la fracción bioactiva de Petiveria alliacea de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7 y al menos uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Una combinación farmacéutica para el tratamiento del cáncer caracterizada porque comprende una fracción bioactiva de Petiveria alliacea de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7 y uno o más agentes inmunoestimulantes capaces de producir la maduración fenotípica y/o funcional de las células dendríticas.
10. Una combinación farmacéutica para el tratamiento del cáncer de acuerdo a la reivindicación 9 caracterizada porque el agente inmunoestimulante capaz de producir la maduración fenotípica y/o funcional de las células dendríticas es seleccionado de polisacáridos y/o glicopéptidos obtenidos a partir de: Ganoderma lucidum, Astragalus membranaceus, Grifóla frondosa, Phellinus linteus, Cordyceps militaris, Lentinus edodes, Coriolus versicolor, Agaricus blazei o Petiveria alliacea.
1 1. Uso de la fracción bioactiva de Petiveria alliacea de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de medicamentos para el tratamiento del cáncer.
12. Uso de la fracción bioactiva de Petiveria alliacea de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7 o de la composición que la contiene de acuerdo con la reivindicación 8, como agente coadyuvante de la quimioterapia convencional para el tratamiento del cáncer.
13. Un kit para el tratamiento del cáncer caracterizado porque comprende una primera composición de acuerdo con la reivindicación 8, una segunda composición que comprende uno o más agentes inmunoestimulantes capaces de producir la maduración fenotípica o funcional de las células dendríticas y opcionalmente, las instrucciones de uso.
14. Un método para el tratamiento del cáncer que comprende la administración secuencial de al menos una fracción bioactiva de Petiveria alliacea de las reivindicaciones 1 a 7 o la composición de la reivindicación 8 y, en un intervalo de tiempo entre 24 horas y 2 semanas, la administración de al menos un agente inmunoestimulante o una composición que lo contenga, capaz de producir la maduración fenotípica y/o funcional de las células dendríticas.
15. Un método para el tratamiento del cáncer que comprende la administración simultanea o secuencial de al menos una fracción bioactiva de Petivería alliacea de las reivindicaciones 1 a 7 o la composición de la reivindicación 8 y un medicamento quimioterapéutico convencional, y en un intervalo de tiempo entre 24 horas y 2 semanas, la administración de al menos un agente inmunoestimulante o una composición que lo contenga, capaz de producir la maduración fenotípica y/o funcional de las células dendríticas.
16. Un método para el tratamiento del cáncer de acuerdo a la reivindicación 14 o 15 caracterizado porque el agente inmunoestimulante capaz de producir la maduración fenotípica y/o funcional de las células dendríticas es seleccionado de polisacáridos y/o glicopéptidos obtenidos a partir de: Ganoderma lucidum, Astragalus membranaceus, Grifóla frondosa, Phellinus linteus, Cordyceps militaris, Lentinus edodes, Coriolus versicolor, Agaricus blazei o Petivería alliacea.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103549386B (zh) * 2013-10-24 2015-09-16 江苏神华药业有限公司 一种复方虫草灵芝组合物及其制备方法
US9572847B2 (en) * 2013-12-23 2017-02-21 Kingland Property Corporation, Ltd. Method for treating a lung tumor in a subject in need thereof
AU2015228775B2 (en) * 2014-03-13 2020-04-02 Procare Health Iberia, S.L. Topical compositions comprising extract of Coriolus versicolor for autoimmunity enhancement
CN105974042A (zh) * 2016-07-20 2016-09-28 黑龙江省电力科学研究院 一种测定绝缘油中二苄基二硫醚含量的反向高效液相色谱方法
EP4125434A4 (en) * 2020-04-03 2024-04-03 Turtle Bear Holdings Llc COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING AN INFLAMMATORY RESPONSE

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US564830A (en) 1896-07-28 Sprocket-chain and wheel

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1997278B (zh) * 2004-04-20 2014-04-23 艾森生物(杭州)有限公司 有取代的有机硫化合物及其使用方法
US8231913B2 (en) * 2005-11-10 2012-07-31 Jose Angel Olalde Rangel Angina pectoris and ischemic heart disease and synergistic phytoceutical composition for same
US7303772B2 (en) * 2005-11-10 2007-12-04 Olalde Rangel Jose Angel Synergistic phytoceutical compositions
US7604823B2 (en) * 2006-09-07 2009-10-20 Jose Angel Olalde Rangel Synergistic HIV/AIDS and/or immune disease phyto-nutraceutical composition
US9662303B2 (en) * 2006-09-15 2017-05-30 Pg-Pharma, Llc Composition and method for treating cancer
US7390512B2 (en) * 2006-09-29 2008-06-24 Jose Angel Olalde Rangel Multiple sclerosis synergistic phyto-nutraceutical composition
US7553501B2 (en) * 2006-11-16 2009-06-30 Jose Angel Olalde Rangel Immune phyto-neutraceutical composition
HUE047118T2 (hu) * 2007-03-23 2020-04-28 Qualcomm Inc Többszenzoros adatgyûjtés és/vagy feldolgozás

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US564830A (en) 1896-07-28 Sprocket-chain and wheel

Non-Patent Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COOPER, G., THE CELL: A MOLECULAR APPROACH. TERCERA EDICI6N. CAPITULO, vol. 15, 2007, pages 631 - 667
DAI Y ET AL.: "T-cell-immunity-based inhibitory effects of orally administered herbal medicine juzen-taiho-to on the growth of primarily developed melanocytic tumors in RET-transgenic mice", J INVEST DERMATOL, vol. 117, 2001, pages 694 - 701
DE LIMA TC ET AL.: "Evaluation of antinociceptive effect of Petiveria alliacea (Guine) in animals", MEM INST OSWALDO CRUZ, vol. 86, no. 2, 1991, pages 153 - 8
DE SOUSA JR ET AL.: "Dibenzyl trisulphide and trans-N-methyl-4-methoxyproline from Petiveria alliacea", PHYTOCHEMISTRY, vol. 29, 1990, pages 3653 - 3655, XP026615920, DOI: doi:10.1016/0031-9422(90)85294-P
DE SOUSA PJ: "Guine: erva medicinal ou t6xica", CIÊNC CULT, vol. 39, 1987, pages 645 - 646
DELLE- MONACHE F; CUCA LE: "6-C-formyl and 6-C hidroxymethyl flavonones from Petiveria alliacea", PHYTOCHEMISTRY, vol. 31, 1992, pages 2481 - 2482
DELLE-MONACHE F ET AL.: "II. Further Flavonoids and Triterpenes", GAZZETA CHIMICA LTALIONE, vol. 126, 1996, pages 275 - 278
DI STASI LC ET AL.: "Screening in mice of some medicinal plants used for analogesfc purposes in the state of Sao Paulo", J ETHNOPHANNACOL, vol. 24, 1988, pages 205 - 11
GARCIA B: "Flora medicinal de Colombia", 1974, IMPRENTA NACIONAL ED. BOGOTÁ EDN. BOGOTÁ
GUPTA M.: "Petiveria alliacea in 270 plantas medicinales iberoamericanas", 1995, PRESENCIA ED EDN
KATO M ET AL.: "The herbal medicine Sho-saiko-to inhibits growth and metastasis of malignant melanoma primarily developed in ret-transgenic mice", J INVEST DERMATOL, vol. 111, 1998, pages 640 - 4
KUBEC R ET AL.: "Cysteine sulfoxide derivatives in Petiveria alliacea", PHYTOCHEMISTRY, vol. 58, 2001, pages 981 - 5, XP004311385, DOI: doi:10.1016/S0031-9422(01)00304-1
KUBEC R ET AL.: "Gamma-Glutamyl dipeptides in Petiveria alliacea", PHYTOCHEMISTRY, vol. 66, 2005, pages 2494 - 7
KUBEC R ET AL.: "S-Substituted cysteine derivatives and thiosulfinate formation in Petiveria alliacea- part", PHYTOCHEMISTRY, vol. 61, 2002, pages 675 - 80, XP004390498, DOI: doi:10.1016/S0031-9422(02)00328-X
LOPES-MARTINS RA ET AL.: "The anti- inflammatory and analgesic effects of a crude extract of Petiveria alliacea L. (Phytolaccaceae", PHYTOMEDICINE, vol. 9, 2002, pages 245 - 8, XP004956849, DOI: doi:10.1078/0944-7113-00118
LOPES-MARTINS RA ET AL.: "The anti-inflammatory and analgesic effects of a crude extract of Petiveria alliacea L . (Phytolaccaceae", PHYTOMEDICINE, vol. 9, 2002, pages 245 - 8, XP004956849, DOI: doi:10.1078/0944-7113-00118
MARIE JP: "Drug resistance in hematologic malignancies", CURR OPIN ONCOL, vol. 13, 2001, pages 463 - 469
MORALES C ET AL.: "Preliminary screening of five ethnomedicinal plants of Guatemala", FARMACO, vol. 56, 2001, pages 523 - 526
ROSNER H ET AL.: "Disassembly of microtubules and inhibition of neurite outgrowth, neuroblastoma cell proliferation, and MAP kinase tyrosine dephosphorylation by dibenzyl trisulphide", BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 1540, 2001, pages 166 - 77, XP004300835, DOI: doi:10.1016/S0167-4889(01)00129-X
See also references of EP2522356A4
WILLIAMS LA ET AL.: "A critical review of the therapeutic potential of dibenzyl trisulphide isolated from Petiveria alliacea L (guinea hen weed, anamu", WEST INDIAN MED J, vol. 56, 2007, pages 17 - 21, XP009169063, DOI: doi:10.1590/S0043-31442007000100004
WILLIAMS LA ET AL.: "A critical review of the therapeutic potential of dibenzyl trisulphide isolated from Petiveria alliacea L (guinea hen weed, anamu", WEST INDIAN MED J, vol. 56, 2007, pages 17 21

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