WO2011033961A1 - ホスホリパーゼａ１、ホスホリパーゼａ１をコードする遺伝子、発現ベクター、形質転換体、ホスホリパーゼａ１の製造方法 - Google Patents

ホスホリパーゼａ１、ホスホリパーゼａ１をコードする遺伝子、発現ベクター、形質転換体、ホスホリパーゼａ１の製造方法 Download PDF

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dna
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智之 諏佐
一良 矢澤
純 岩崎
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国立大学法人東京海洋大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
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    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
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    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6418—Fatty acids by hydrolysis of fatty acid esters

Definitions

  • the present invention relates to phospholipase A 1 , a gene encoding the phospholipase A 1 , an expression vector having the gene, a transformant having the gene, and a method for producing phospholipase A 1 using the transformant.
  • Phospholipases are enzymes involved in the metabolism of phospholipids in vivo, affect the metabolism, assembly and reorganization of biological membranes, are involved in signal cascades, and between prokaryotic and eukaryotic organisms. Widely distributed.
  • Phospholipase has a function of hydrolyzing the ester bond of phospholipid to produce free fatty acid and lysophospholipid.
  • phospholipases are classified into phospholipase A 1 , phospholipase A 2 , phospholipase C and phospholipase D according to the site of the ester bond to be hydrolyzed.
  • phospholipase A 1 hydrolyzes the fatty acid at the sn-1 position of glycerophospholipid to produce free fatty acid and 2-acyl lysophospholipid.
  • Phospholipase A 2 hydrolyzes the fatty acid at the sn-2 position of glycerophospholipid to produce free fatty acid and 1-acyl lysophospholipid.
  • Phospholipase C removes phosphate residues and produces 1,2-diacylglycerol and a phosphate base.
  • Phospholipase D hydrolyzes the ester bond between the phosphatidyl group of the phospholipid and the base to liberate phosphatidic acid and the base.
  • lysophospholipids produced by phospholipase have a higher surface activity than ordinary phospholipids, and are extremely effective lipid forms for use in foods. And lysophospholipid can improve the emulsification stability, food texture, and elasticity of foods more than phospholipid, and can save the use amount of other emulsifiers. In addition to food applications, it is also useful as a cosmetic emulsifier.
  • Phospholipase is also used for degumming fats and oils.
  • the process of fat degumming can be enzymatically assisted by utilizing phospholipases.
  • Phospholipase A 1 and phospholipase A 2 have been used for fat degumming in various commercial processes such as, for example, “ENZYMAX TM degumming” (LurgiLife Science Technologies GmbH, Germany).
  • phospholipase does not hydrolyze triglycerides, even if triglycerides are present in the substrate, diglycerides and monoglycerides are not formed, and purification of lysophospholipid, which is a hydrolysis product of phospholipids, is not inhibited.
  • phospholipase A 1 exists in the pancreas, liver and microorganisms of animals and contributes to phospholipid turnover together with phospholipase A 2 and is useful for analysis of fatty acid intramolecular distribution of phospholipid and lipid biochemical research. It is an enzyme.
  • Phospholipase a useful enzyme, is contained in animal pancreas, liver, and microorganisms, but it is easy to obtain industrially by extracting phospholipase contained in animal pancreas, liver, and microorganisms. Not.
  • phospholipase A 2 is obtained industrially from porcine pancreas.
  • a method for preparing phospholipase A 1 derived from fungi such as filamentous fungi has been developed. However, it takes a long time to culture, and it is not easy to industrially obtain phospholipase A 1 from a medium containing bacterial cells.
  • Commercial products of phospholipase A 1 are currently only derived from Asp ergillus sp. By Sankyo Co., Ltd. and Fusarium sp. By Novozymes Actiselskab (Denmark).
  • JP-A-6-308490 Japanese Patent Publication No. 2005-517418
  • Phospholipase A obtained from 1 with clone a gene sequence which encodes the phospholipase A 1 industrially.
  • the amino acid sequence of phospholipase A 1 derived from Moritella sp. HFHI 0014 strain is clarified, the base sequence of the gene encoding the amino acid sequence is clarified, the gene of the base sequence is incorporated into the host bacterium, and the gene is inserted into the host bacterium Expressed within.
  • the phospholipase A 1 has the amino acid sequence shown in the following (a) or (b).
  • the gene according to the present invention has the base sequence shown in the following (c) or (d).
  • C The base sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • D It encodes a protein having phospholipase A 1 activity and consists of DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to all or part of the DNA consisting of the base sequence of (c) Base sequence.
  • the phospholipase A 1 of the present invention consists of a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and It is a protein having phospholipase A 1 activity.
  • a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added and having phospholipase A 1 activity can be obtained by site-directed mutagenesis.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is a number that can be deleted, substituted, or added by a known method such as the above-mentioned site-directed mutagenesis method, and 1 to 50 , Preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10.
  • Examples of the DNA of the present invention include DNA encoding the protein of the present invention.
  • DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (2) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2, (3) a DNA encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having phospholipase A 1 activity; and (4) SEQ ID NO: Examples include DNA that hybridizes with a DNA comprising the nucleotide sequence represented by 2 under stringent conditions and encodes a protein having phospholipase A 1 activity.
  • the above stringent conditions refer to conditions in which only a specific hybrid is selectively formed and a signal is detected, but a non-specific hybrid is not formed. Such conditions vary depending on the species, but can be easily determined by examining several factors such as salt concentration and temperature during conventional hybridization and washing.
  • the filter may be washed under a condition of 65 ° C. to detect the probe.
  • the DNA capable of hybridizing is DNA having at least 75% homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, preferably DNA having 80% homology or more, more preferably 95% homology or more.
  • the expression vector according to the present invention has the above gene.
  • the transformant according to the present invention has the above gene in the host fungus.
  • Escherichia coli can be mentioned as a host fungus, it does not exclude the use of bacteria such as Bacillus subtilis, yeast, and filamentous fungi.
  • the manufacturing method of phospholipase A 1 according to the present invention is to obtain a phospholipase A 1 by expressing the gene in a host bacterium.
  • the recombinant phospholipase A 1 according to the present invention can be obtained by expressing the above gene in a host fungus.
  • a production method for producing 2-acyl lysophospholipid is obtained by a catalytic reaction using glycerophospholipid as a raw material and the above-mentioned recombinant phospholipase A 1 .
  • microorganism Moritella sp. HFHI 0014 was deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Microorganism Depositary with a receipt number of FERM AP-20806 and transferred from domestic deposit to international deposit on January 22, 2007. Accession number FERM BP-10766 is assigned.
  • the amino acid sequence of phospholipase A 1 derived from Moritella sp. HFHI 0014 strain has been clarified
  • the gene sequence encoding the amino acid sequence of phospholipase A 1 has been clarified
  • the gene sequence encoding phospholipase A 1 has Phospholipase A 1 can be obtained industrially from these clones.
  • GLC gas chromatography
  • HFHI 0014 strain DNA (2) Preparation of HFHI 0014 strain cells Glycerol stock of Moritella sp. HFHI 0014 strain (final concentration of glycerin 10%) is planted in 10 ml ⁇ 5 K28 liquid medium shown in Table 1. The cells were then cultured with shaking at a temperature of 10 ° C. and a shaking number of 100 rpm for 96 hours.
  • Genomic DNA Partial digest
  • the restriction enzyme Sau3A1 (Toyobo) was added to the purified genomic DNA solution and treated at 37 ° C for 30 minutes to partially decompose the genomic DNA.
  • the obtained solution was electrophoresed using an agarose gel.
  • a site (band) of a DNA fragment of about 6 to 23 kbp was cut out from the agarose gel, and the cut out agarose gel was purified using a DNA purification kit (TaKaRa, EASYTRAP Ver2, NO. 9410) to obtain about 6 A DNA fragment of ⁇ 23 kbp was obtained.
  • the ⁇ phage DNA derived from 6 positive clones was analyzed by a sequencer (Applied biosystems, 3130xl Genetic analyzer) according to a conventional method, and the nucleotide sequence of the inserted fragment was determined.
  • the base sequences of the inserted phospholipase genes of 6 positive clones were all identical.
  • the base sequence was as shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence estimated from this base sequence was determined.
  • the amino acid sequence was as shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • E. coli infected with the recombinant phage vector ⁇ DASH II having the above amino acid sequence was added to the substrate solution, and phospholipase activity was confirmed.
  • Substrate and enzyme used (1) Substrate solution 5 mg of phospholipid was dissolved in 100 ⁇ l of chloroform to obtain a substrate solution for examining the activity of phospholipase A 1 .
  • egg yolk phosphatidylcholine (egg-PC) manufactured by Kyupy Corporation was used as the phospholipid.
  • FA fatty acid
  • PC phosphatidylcholine
  • L- ⁇ -phosphatidylcholine from Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.
  • LPC lysophosphatidylcholine
  • the concentration of each reaction product was determined using each chromatographic pack (CHROMATOPAC, C-R8A, Shimadzu Corporation), and each fatty acid peak area was determined based on the internal standard peak area. The number of moles of FA (fatty acid) obtained was calculated.
  • the GLC analysis conditions and GLC temperature raising program are shown in Tables 3 and 4, and the GLC analysis chart of FA standard substances with known fatty acid compositions is shown in FIG.
  • results The thin layer chromatogram of the egg yolk phospholipid hydrolyzate by the enzyme expressed by the recombinant ⁇ phage DNA is as shown in FIG.
  • results of gas chromatographic analysis of the hydrolyzate of egg yolk phospholipid are as shown in Table 5.
  • Moritella sp. HFHI 0014 strain does not have phospholipase A 2 activity but has only phospholipase A 1 activity (WO2007 / 097160). Therefore, from the above experiment, it was confirmed that the recombinant enzyme expressed by the recombinant ⁇ phage DNA has phospholipase A 1 activity.

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Abstract

　ホスホリパーゼＡ1をコードする遺伝子配列を持ったクローンからホスホリパーゼＡ1を工業的に得る。　Moritella sp. HFHI 0014株由来のホスホリパーゼＡ1のアミノ酸配列を明らかにし、該アミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列を明らかにし、該塩基配列の遺伝子を宿主菌内に組み込み、該遺伝子を該宿主菌内で発現させ、ホスホリパーゼＡ1を工業的に得る。ホスホリパーゼＡ1のアミノ酸配列は配列表の配列番号１示す通りであり、遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号２に示す通りである。

Description

ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ１をコードする遺伝子、発現ベクター、形質転換体、ホスホリパーゼＡ１の製造方法
　本発明は、ホスホリパーゼＡ1、該ホスホリパーゼＡ1をコードする遺伝子、該遺伝子を有する発現ベクター、該遺伝子を有する形質転換体、該形質転換体を利用するホスホリパーゼＡ1の製造方法に関する。
　ホスホリパーゼは、生体内におけるリン脂質の代謝に関係する酵素であり、生物学的な膜の代謝、構築及び再構成に影響を与え、シグナルカスケードに関与しており、原核生物及び真核生物間に広く分布している。
　ホスホリパーゼはリン脂質のエステル結合を加水分解して遊離の脂肪酸とリゾリン脂質を生成させる働きを有している。ここで、ホスホリパーゼは加水分解するエステル結合の部位によってホスホリパーゼＡ1、ホスホリパーゼＡ2、ホスホリパーゼＣ及びホスホリパーゼDに分類される。
　図４に示すように、ホスホリパーゼＡ1は、グリセロリン脂質のｓｎ－１位の脂肪酸を加水分解して、遊離の脂肪酸及び２－アシルリゾリン脂質を産生する。ホスホリパーゼＡ2は、グリセロリン脂質のｓｎ－２位の脂肪酸を加水分解して、遊離の脂肪酸及び１－アシルリゾリン脂質を産生する。ホスホリパーゼＣはリン酸残基を取り除き、１，２－ジアシルグリセロール及びリン酸ベースを産生する。ホスホリパーゼＤは、リン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエステル結合を加水分解してホスファチジン酸と塩基とを遊離させるものである。
　ホスホリパーゼによって産生されたリゾリン脂質は通常のリン脂質より高い界面活性を有し、食品への利用に際して極めて効果的な脂質形態であることが知られている。そして、リゾリン脂質は食品の乳化安定性、食感、弾力性をリン脂質以上に改善できるとともに、他の乳化剤の使用量を節約することができる。また、食品用途の他に化粧品用乳化剤としても利用価値がある。
　また、ホスホリパーゼは油脂の脱ガム化のために使用されている。油脂の脱ガム化のプロセスは、ホスホリパーゼを利用することにより、酵素学的に補助することができる。ホスホリパーゼＡ1及びホスホリパーゼＡ2は、例えば、"ENZYMAXTM脱ガム化"(LurgiLife Science Technologies GmbH、ドイツ)のような種々の商業的な過程における油脂の脱ガム化のために使用されている。
　また、ホスホリパーゼはトリグリセリドを加水分解しないので、基質中にトリグリセリドが存在していても、ジグリセリドやモノグリセリドが生成せず、リン脂質の加水分解生成物であるリゾリン脂質の精製を阻害しない。
　更に、ホスホリパーゼＡ1は動物の膵臓や肝臓、微生物に存在し、ホスホリパーゼＡ2と共にリン脂質の代謝回転に寄与しており、リン脂質の脂肪酸分子内分布の解析や脂質生化学研究においても有用な酵素である。
　このように有用な酵素であるホスホリパーゼは動物の膵臓や肝臓、微生物中に含まれているが、動物の膵臓や肝臓、微生物中に含まれているホスホリパーゼを抽出して工業的に得ることは容易でない。
　現在、豚膵臓からホスホリパーゼＡ2だけが工業的に得られている。また、糸状菌等の真菌に由来するホスホリパーゼＡ1の調製法も開発されているが、培養に長時間を要し、菌体を含む培地からホスホリパーゼＡ1を工業的に得るのは容易でない。ホスホリパーゼＡ1の市販品は、現在のところ、三共株式会社によるAsp ergillus sp.及びノボザイムス　アクティーゼルスカブ(デンマーク)によるFusarium sp.由来のものしかない。
特開平６－３０８４９０号公報 特公表２００５－５１７４１８号公報
鎌田正純　他、海洋細菌が産生するホスホリパーゼＡ1、油化学討論会講演要旨集、１９９８，ｐ．９４ 西原政晃　他、海洋生物由来のホスホリパーゼＡ1産生菌の単離、日本農芸化学会大会講演要旨集、２００５，ｐ．２０５ 矢澤一良　他、ＤＨＡ産生菌が生産するホスホリパーゼＡ1とその利用、脂質栄養学、１９９８，ｐ．１０３
　ホスホリパーゼＡ1をコードする遺伝子配列を持ったクローンからホスホリパーゼＡ1を工業的に得る。
　Moritella sp. HFHI 0014株由来のホスホリパーゼＡ1のアミノ酸配列を明らかにし、該アミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列を明らかにし、該塩基配列の遺伝子を宿主菌内に組み込み、該遺伝子を該宿主菌内で発現させた。
　すなわち、本発明に係るホスホリパーゼＡ1は以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなる。
（ａ）配列表の配列番号１のアミノ酸配列。
（ｂ）ホスホリパーゼＡ1活性を有し、（ａ）の１から数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
　また、本発明に係る遺伝子は以下の（ｃ）または（ｄ）に示す塩基配列からなる。
（ｃ）配列表の配列番号２の塩基配列。
（ｄ）ホスホリパーゼＡ1活性を有するタンパク質をコードし、（ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡの全部または一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる塩基配列。
　本発明のホスホリパーゼＡ1は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、および配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつホスホリパーゼＡ1活性を有するタンパク質である。
　１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつホスホリパーゼＡ1活性を有するタンパク質は、部位特異的変異導入法などにより取得することができる。
　欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の方法により欠失、置換、または付加できる程度の数であり、１個から５０個、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個である。
　本発明のＤＮＡとしては、上記本発明のタンパク質をコードするＤＮＡをあげることができる。具体的には、
　(1)配列番号１で示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
　(2)配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、
　(3)配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつホスホリパーゼＡ1活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、および
　(4)配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズし、かつホスホリパーゼＡ1活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡをあげることができる。
　上記のストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのみが選択的に形成され、シグナルが検出されるが、非特異的なハイブリッドは形成されない条件をいう。このような条件は、生物種により異なるが、常法のハイブリダイゼーションと洗いの際の塩濃度、温度など各要素をいくつか検討するのみで容易に決定することができる。
　このような条件としては、例えば、０．５～１ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）溶液を用いて、室温から６５℃の条件下でフィルターを洗浄し、プローブの検出を行うことが挙げられる。
　ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号２で示される塩基配列と少なくとも７５％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０%以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
　また、本発明に係る発現ベクターは上記遺伝子を有してなる。また、本発明に係る形質転換体は上記遺伝子を宿主菌内に有してなる。宿主菌としては大腸菌を挙げることができるが、枯草菌などの細菌や酵母、糸状菌などの使用を排除するものではない。
　また、本発明に係るホスホリパーゼＡ1の製造方法は上記遺伝子を宿主菌内で発現させることによりホスホリパーゼＡ1を得るものである。また、本発明に係る組換えホスホリパーゼＡ1は上記遺伝子を宿主菌内で発現させることにより得られる。２－アシルリゾリン脂質を製造する製造方法はグリセロリン脂質を原料として、上記組換えホスホリパーゼＡ1を用いた触媒反応により得られる。
　なお、微生物Moritella sp. HFHI 0014株は独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに受領番号がＦＥＲＭ　ＡＰ－２０８０６として寄託され、２００７年１月２２日に国内寄託から国際寄託へ移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１０７６６が付与されている。
　本発明により、Moritella sp. HFHI 0014株由来のホスホリパーゼＡ1のアミノ酸配列が明らかにされ、このホスホリパーゼＡ1のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が明らかにされ、ホスホリパーゼＡ1をコードする遺伝子配列を持ったクローンからホスホリパーゼＡ1が工業的に得られるようになった。
組換えホスホリパーゼＡ1による卵黄リン脂質の加水分解物の薄層クロマトグラムである。 脂肪酸(FA)標準物質のガスクロマトグラフィー(GLC)による分析チャートである。 組換えホスホリパーゼＡ1による卵黄リン脂質の加水分解の前後における脂肪酸(FA)、ホスファチジルコリン(PC)、リゾホスファチジルコリン(LPC)の割合（％）を示すグラフである。 ホスホリパーゼによるリン脂質の加水分解の態様を説明するための説明図である。
　ホスホリパーゼＡ1を工業的に得るという目的を、ホスホリパーゼＡ1をコードする遺伝子配列を持ったクローンにより、容易に実現した。
○HFHI 0014株ＤＮＡの抽出
　(1)HFHI 0014株菌体の準備
　Moritella sp. HFHI 0014株のグリセロールストック(グリセリンの最終濃度１０%)を表１に記載のK２８液体培地１０ ml×５本に植菌し、温度１０℃、振とう数１００ rpmで９６時間、振とう培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　(2)HFHI 0014株ゲノムＤＮＡの抽出・精製
　Moritella sp. HFHI 0014株の培養終了後、培養液５０ mlを、温度４℃、回転数３５００ rpmで２０分間、遠心し、菌体ペレットを得た。菌体ペレットは５６７μlのTris-ＥＤＴＡ溶液（ＴＥ溶液）で再懸濁し、１０%ＳＤＳを３０μl 、２０ mg/ml Proteinase Kを３μl加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、５M NaCl溶液を１００μl加え、攪拌後、ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を８０μl加え、６５℃で１０分間インキュベートした。
　上記インキュベートした溶液に、タンパク質を除去するために、この溶液と等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液を加え、室温で、回転数１３５００ rpmで５分間遠心し、ＤＮＡを含む上清を得た。この上清に、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（ＰＣＩ）溶液を等量加え、室温で、回転数１３５００ rpmで５分間遠心し、上清を得た。上清に２－プロパノールを加え、遠心し、上清を除去し、ＤＮＡペレットを得た。得られたＤＮＡペレットをＴＥ溶液に溶解し、精製されたゲノムＤＮＡ溶液（５．１ mg/ml）を得た[Ausubel et al.]。
○ゲノムＤＮＡファージライブラリーの構築
　(1)ゲノムＤＮＡ・・・パーシャルダイジェスト
　精製された上記ゲノムＤＮＡ溶液に制限酵素Sau3A1（東洋紡）を加え、３７℃、３０分間処理し、ゲノムＤＮＡを部分分解させ、得られた溶液はアガロースゲルを用いて電気泳動させた。そして、このアガロースゲルから約６～２３kbpのＤＮＡ断片の部位（バンド）を切り出し、この切り出したアガロースゲルを、DNA精製キット(TaKaRa社、EASYTRAP Ver2，NO.9410)を用いて精製し、約６～２３kbpのＤＮＡ断片を得た。　
　(2)ライゲーション(Ligation)
　制限酵素BamHIで消化したファージベクターλDASH II (Stratagene社、Lambda DASH II/BamHI Vector Kit Catalog#24211))に上記DNA断片を、１６℃で一晩ライゲーションし、得られた組換えλファージＤＮＡをパッケージング(packaging)し、組換えλファージを得た。そして、この組換えλファージを大腸菌XL1-Blue MRA(-P2) (Stratagene社)株に感染させ、ゲノムライブラリー(３．１×１０５pfu/ml)を作製した。大腸菌の培養にはドラッグフリーＬＢ培地を使用した。
○スクリーニング
　(1)卵黄寒天培地の準備
　卵黄はリン酸緩衝溶液に溶解して卵黄溶解液とし、プレート一枚につき、卵黄が最終濃度５%となるように卵黄溶解液を寒天培地に混ぜた(Fiore et al.)。
　(2)ホスホリパーゼ産生(陽性)クローンの選択
　組換えλファージを感染させた大腸菌を卵黄寒天培地に塗布し、３７℃で４～５時間培養した後、室温にて２～３日間培養した。培地中の卵黄がホスホリパーゼにより分解されると、コロニーの周辺が透明になるため、それを指標としてホスホリパーゼＡ1産生クローンを選択した。スクリーニングは、２回行った。結果、周辺が透明になるコロニー、すなわち陽性反応を示すプラークを持つクローン６株を取得した。
○λファージＤＮＡの抽出
　(1)λファージＤＮＡの抽出
　陽性クローン６株より、λファージＤＮＡ抽出キット (Qiagen社) (QIAGEN Lambda mini kit(25)No.12523)によりλファージＤＮＡを回収した。
　(2)インサートチェック
　λファージＤＮＡは制限酵素EcoR1で処理し、アガロースゲル電気泳動によりインサートチェックを行った。６株のクローンのインサートのサイズは、約１３．８kbpであり、目的のＤＮＡ断片が含まれていることが確認された。
○ＤＮＡシークエンス
　陽性クローン６株由来のλファージＤＮＡを常法に従い、シークエンサー(Applied biosystems社、3130xl Genetic analyzer)にて分析し、挿入されている断片の塩基配列を決定した。陽性クローン６株の、挿入されていたホスホリパーゼ遺伝子の塩基配列は全て同一であった。塩基配列は配列表の配列番号２に示す通りであった。そして、この塩基配列から予想されるアミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列は配列表の配列番号１に示す通りであった。
○相同検索
　得られたアミノ酸配列を元に、国立遺伝学研究所のDDBJ遺伝子ＤＢに対して、BLASTにて相同性検索を行った。その結果、本酵素(遺伝子)は、Molitella sp PE36株の機能未知タンパク質と、９２％の相同性が見られた。
　上記アミノ酸配列をもつ組換えファージベクターλDASH II を感染させた大腸菌を基質溶液に加え、ホスホリパーゼ活性を確認した。
○使用した基質及び酵素
　(1)基質溶液
　リン脂質５mgをクロロホルム１００μlに溶解し、ホスホリパーゼＡ1の活性を調べる基質溶液とした。ここで、リン脂質としては、キユ－ピ－(株)製の卵黄ホスファチジルコリン(egg-PC)を用いた。
　(2)酵素
　上記アミノ酸配列をもつ組換えファージベクターλDASH II を感染させた大腸菌XL1-Blue MRA-P2をＬＢプレートで３７℃、１晩培養し、ファージが溶原化した溶原菌(プラーク)をこそぎ採り、表２記載の２ mlのＳＭ溶液を加え、遠心して上清を得た。この上清には、組換えλファージＤＮＡにより発現した、前記アミノ酸配列の酵素が含まれていると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
○酵素によるリン脂質の加水分解
　基質溶液１００ μlをバイアル瓶に入れ、窒素気流下で脱溶媒した。このバイアル瓶に、上記上清（酵素）０．５ ml、ジエチルエーテル０．５ mlを加え、振とう培養機(２００ rpm)で振とうしながら、１０℃で４時間、８時間、１２時間、基質溶液中のリン脂質に対し、上清に含まれる酵素を作用させた。
○リン脂質の抽出
　酵素を作用させた基質溶液にFolch溶媒（クロロホルム：メタノ－ル：水＝８：４：３の下層）３ mlを加え、酵素反応を停止させた。反応を停止させた基質溶液を３０００ rpmで２０分間遠心分離を行い、下層のクロロホルム層を分取した。
　下層分取後の残りの上層部分にFolch溶媒２ml加え、同様の条件で遠心分離を行い、再度下層のクロロホルム層を分取し、先に分取したクロロホルム層に加えた。この作業は繰り返し２回行った。
　このクロロホルム層を窒素気流下にて脱溶媒し、反応生成物（酵素が作用して得られたもの）を得た後、これを１５０ μlのクロロホルム：メタノ－ル＝２：１に溶解し、冷凍保存した。
○薄層クロマトグラフィー（TLC）による全脂質の定性分析
　薄層クロマトグラフィー（TLC）による定性分析では、全脂質の検出のためにプリムリン溶液を用いた。サンプルをTLC (プレ－ト：シリカゲル60(Merk(株), 10×10 cm)にて一次元二重展開(１st展開溶媒 へキサン:ジエチルエ－テル＝１：４、２nd展開溶媒 クロロホルム：メタノ－ル：アンモニア水＝１３：７：１．６）した。
　プレ－トに0.0005%プリムリン溶液を噴霧し、紫外線(３６５ nm)下で発色させたところ、図１に示す通りの薄層クロマトグラムが得られた。そして、この薄層クロマトグラムから、組換えλファージＤＮＡにより発現した酵素によって卵黄リン脂質がＦＡ、ＰＣ、ＬＰＣに加水分解されることがわかった。なお、脂肪酸（ＦＡ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）はこれらのスポットを標準物質とＲｆ値とを比較することにより確認した。
　ここで、脂肪酸（ＦＡ）の標準物質としては、Wako(株)のオレイン酸を、ホスファチジルコリン（ＰＣ）の標準物質としては、シグマアルドリッチジャパン(株)のL－α－ホスファチジルコリンを、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）の標準物質としては、シグマアルドリッチジャパン(株)のL－α－リゾホスファチジルコリンを使用した。
○ガスクロマトグラフィー(GLC)による脂肪酸（ＦＡ）の定量
　プリムリン溶液で発色させたスポットを標準物質と比較し、ＦＡ(脂肪酸)、ＰＣ(ホスファチジルコリン)、ＬＰＣ(リゾホスファチジルコリン)のスポットをスパチュラでＴＬＣプレ－トよりかき取った。
　これに、内部標準物質としてヘプタンに溶解したトリコサン酸(シグマアルドリッチジャパン(株))1 μg/μlを１００μl加え、塩酸メタノール法、すなわち、回収した脂質の吸着したシリカと５%塩酸メタノール(東京化成工業(株))２．０ mlを加え、フタ付き試験管に入れ、ブロックヒーターにて１００℃で３ｈ加熱し、メチルエステル化した。
　その後、１０分間静置し、室温まで冷ました。これにヘキサン２．０ mlを加えて攪拌した。回転数３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上層を回収した。このヘキサンによる抽出を２回繰り返し、上層をあわせた。ヘキサンを窒素気流下にて留去し、これに脱水メタノール(Wako(株))を１００ μl加え、抽出物を溶解し、ガスクロマトグラフィー(GLC)用サンプルとし、ガスクロマトグラフィー(GC－1700, 検出器 FID, (株)島津製作所)により分析した。
　各反応生成物の濃度は、クロマトパック(CHROMATOPAC, C－R8A, (株)島津製作所)を用い、各脂肪酸のピークのエリアを内部標準のピークのエリアを基準とすることにより、ＴＬＣの各スポットより得られたＦＡ(脂肪酸)のmol数を算出した。
　なお、GLC分析条件およびGLC昇温プログラムは表３および表４に、脂肪酸組成が既知のＦＡ標準物質のＧＬＣ分析のチャ－トは図２に示す通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
○結果
　組換えλファージＤＮＡにより発現した酵素による卵黄リン脂質の加水分解物の薄層クロマトグラムは図１に示す通りである。また、卵黄リン脂質の加水分解物のガスクロマトグラフィーによる分析結果は表５に示す通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　図３に示された結果から、反応生成物において脂肪酸（ＦＡ）の増加が見られたことから、リン脂質の加水分解の進行が確認された。また、表５より、反応１２時間において脂肪酸（ＦＡ）及びリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）の増加が確認され、フォスファチジルコリン（ＰＣ）の減少が確認された。ここで、リン脂質の加水分解率は７．９８%であった。
　なお、Moritella sp. HFHI 0014株は、ホスホリパーゼＡ2活性は有さず、ホスホリパーゼＡ1活性のみを有することが既に確認されている(WO2007/097160)。従って、以上の実験から、組換えλファージＤＮＡにより発現された組換え酵素が、ホスホリパーゼＡ1活性を有していることが確認された。

Claims (7)

  1. 　以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードするホスホリパーゼＡ1。
    （ａ）配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （ｂ）ホスホリパーゼＡ1活性を有し、（ａ）の１から数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
  2. 　以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなるホスホリパーゼＡ1遺伝子。
    （ｃ）配列表の配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ。
    （ｄ）ホスホリパーゼＡ1活性を有するたんぱく質をコードし、（ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡの全部または一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
  3. 　請求項２記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
  4. 　請求項３記載の組換えベクターを含む形質転換体。
  5. 　請求項２記載の遺伝子を宿主菌内で発現させることによりホスホリパーゼＡ1を得るホスホリパーゼＡ1の製造方法。
  6. 　請求項２記載の遺伝子を宿主菌内で発現させることにより得られる組換えホスホリパーゼＡ1。
  7. 　グリセロリン脂質を原料として、請求項６記載の組換えホスホリパーゼＡ1を用いた触媒反応により２－アシルリゾリン脂質を製造する製造方法。
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