WO2011007104A2 - Compositions antifongiques et utilisation - Google Patents

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WO2011007104A2
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Gabriel Roblin
Estelle Luini
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Centre National De La Recherche Scientifique
Universite De Poitiers
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    • A01N59/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing elements or inorganic compounds
    • A01N59/16—Heavy metals; Compounds thereof

Definitions

  • the present invention relates to an antifungal composition and a method of treating a plant infected with a pathogen. More particularly, the present invention relates to an antifungal composition for the treatment of grapevines.
  • references in square brackets ([]) refer to the list of references presented at the end of the text.
  • Antimicrobial compositions have been known for several decades. These are compositions that kill microbes. Among these antimicrobial compositions some kill for example fungi and are called antifungal. There are different types of antifungals: the so-called "natural” antifungals, these are compounds or compositions derived from plants, from fruits (for example grapefruit); and antifungals produced by chemical synthesis.
  • a large number of antifungal molecules are known in the state of the art. Mention may be made, for example, of amorolfine hydrochloride, amphotericin B, benzoic acid, benzyl hydroxybenzoate, bifonazole, boric acid, bromoxyquinone, buclosamine, caprylic acid and chlormidazole hydrochloride. chlorobutanol, chlorquinol, ciclopiroxolamine, clofenoxide, cloprimazole edisilate, clotrimazol, clotrimazole chloride, dequanilium chloride, dimazol hydrochloride, econazole nitrate, fenticonazole nitrate, etc.
  • the known antifungal compositions can be used in the agronomic field, for example for the prevention or treatment of pathologies such as Esca, Eutypiose, mildew, powdery mildew.
  • the antifungal compositions of the state of the art can also be used in the food industry, for example in dairy compositions to prevent and / or inhibit the development of fungi in yoghurt etc. ; in the veterinary field, for example by topical application, intravenous administration to sheep, domestic animals, for example cats, dogs, etc., and in the medical field, for example for the treatment of mycoses, by topical application, intravenous injection, subcutaneous injection etc.
  • fungicide unisite such as benzimidazoles (Benlate (trademark)
  • multiple sites of action multisite fungicides
  • dithiocarbamates Francebam (trademark)
  • fungicides Another known disadvantage of fungicides is their toxicity. Indeed, it is known that the fungicides used in the agricultural field can be toxic towards insects, for example bees, but also with respect to aquatic organisms. This is for example the Zirane (trademark).
  • Deuteromycetes and Oomycetes have been used for the treatment and prevention of Esca, a complex pathology caused by several Ascomycetes and Basidiomycetes fungi that infect woody plants, such as vines. This compound has been banned because it is carcinogenic and toxic to humans. There are currently no compounds for the treatment of Esca.
  • Salicylic acid is a molecule involved in the defense reactions of the plant.
  • AS Systemic Acquired Resistance
  • PR proteins the pathogenesis associated or "pathogenesis related”
  • SAR Systemic Acquired Resistance
  • PR proteins the pathogenesis associated or "pathogenesis related”
  • AS stimulates the production of glucanases and chitinases that are transported to the distal parts of the plant where they degrade the wall of fungal or bacterial cells (Kessmann et al., 1996 (Ref. 6)). AS also has antifungal properties with respect to Eutypa lata. This action is pH dependent and the threshold value is estimated at 0.1 mM at pH 4.1 (Amborabé et al., 2002 (Ref 7)).
  • AS has been considered as an elector against pathogens in crop protection (Regnault-Roger C, 2006 (Ref 8)).
  • AS has a phloem and xylem system on castor seedlings. 14 C labeled AS and 10 ⁇ M concentration were detected in phloem sap at a concentration of 100 ⁇ M and xylem sap at 0.67 ⁇ M after 4 hours of absorption (Rocher et al., 2006). (Ref 9)).
  • the AS concentration factor in castor phloem is of the order of 10, for pHs between 4.6 and 5.0 (Rocher, 2004 (Ref. 10)).
  • AS analogs have also been synthesized: 2,6-dichloroisonicotinic acid (INA) and acibenzolar-S-methyl (ASM) which is a benzothiadiazole (see formulas (II) and (III)). )). These molecules are capable of inducing SAR (Dong, 1998 (Ref 11)).
  • INA 2,6-dichloroisonicotinic acid
  • ASM acibenzolar-S-methyl
  • the INA was quickly abandoned because of its phytotoxicity.
  • the efficacy of ASM has been shown in many annuals (cereals, potato, tomato) to different pathogens such as fungi, viruses and bacteria (Van Toor et al. ., 2001 (Ref 12)). It was introduced in 1996 as an activator of defenses for the control of powdery mildew in cereals. Germany and Switzerland (Ruess et al., 1996 (Ref 13)) and is also used against pyraculariosis of rice and various mildews (Ishii et al., 1999 (Ref 14), Leroux, 2003 (Ref 15)). It also has antibacterial and antiviral activities.
  • the mode of application used consists of injecting salts of salicylate into the vine stock to control Eutypa lata and Chondostereum purpureum (Spiers and Ward, 2001 (Ref 19)).
  • the injection of salicylic acid in the form of potassium salts (18.5 g / L) in the trunk of ceps cv. Sauvignon showed an interesting action with regard to Esca (45.4% efficiency), the percentage of re-expression of symptoms being much lower for the treated plants than for the control plants.
  • the efficacy of the product does not persist since eighteen months after its application, the number of Escha expressing stocks is identical in the control group and in the treated batch (Larignon and Molot, 2004 (Ref. 20)).
  • Cysteine is an amino acid that has a thiol group (formula (IV)) and is present in most proteins. Although poorly represented, its presence in the composition of proteins is very important, especially because it makes it possible to form disulfide bridges.
  • Cysteine may be involved in defense phenomena since it has been shown that during tomato root infection with Verticillium dahliae, cysteine, sulfate and glutathione concentrations increase in tissues (Williams et al., 2002 (Ref 21)).
  • cysteine has antifungal activity against certain fungi.
  • cysteine applied at concentrations of 0.9 and 9 mM, inhibits the development of Inonotus obliquus (Kahlos and Tikka, 1994 (Ref 22)).
  • Comparable results were obtained with Eutypa lata, the pathogen of grape Eutypiasis.
  • Cysteine inhibits mycelial development and also induces the death of Eutypa lata (Octave et al., 2005 (Ref 23)).
  • cysteine inhibits spore germination of $ Alternaria cassiae, Alternaria crassa, and Alternaria macrospora (Daigle and Cotty, 1991 (Ref. 24)).
  • Cysteine has another action since it causes, in Inonotus obliquus and Eutypa lata, an ergosterol release (Kahlos and Tikka, 1994 (Ref 22)); Octave et al., 2005 (Ref 23)) which is a sterol of fungal origin known to be a nonspecific elicitor capable of activating plant defense reactions (Granado et al., 1995 (Ref 24); 2000 (Ref 26), Amborabé et al., 2003 (Ref 27), Luini 2003 (Ref 28), Rossard 2003 (Ref 29)).
  • the activity of cysteine is strongly related to its structure. Indeed, a structural modification or a change in the chemical function -SH abolishes its effectiveness.
  • Leaf discs and leaves isolated from different plant species exposed to L-cysteine emit SH 2 , a volatile compound with potentially antifungal activity (Sekiya et al., 1982 (Ref 30)).
  • a Exogenous supply of cysteine on poplar leaf discs increases the content of glutathione and ⁇ -glutamylcysteine, two molecules involved in the protection of cells against active forms of oxygen in defense reactions (Noctor et al., 1996). (Ref 31)
  • cysteine alone is not sufficient in fungicidal use to the extent that even if it has an inhibitory activity of growth of pathogen in-vitro, its in-vivo activity has not been demonstrated.
  • iron chelators such as EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid) and DHBA (dihydroxy benzoic acid) increase the aggressiveness of conidia of Botrytis cinerea.
  • ferric sulfate F ⁇ 2 (SO 4) 3 inoculum treated with these chelators that reduces aggression (Brown and Swinburne, 1982 (Ref 33)).
  • the presence of iron sulphate inhibits the formation and development of necrotic lesions caused by Botrytis fabae and Botrytis cinerea on detached leaves of Vicia faba (Vedie and Le Normand, 1984 (Ref 34)).
  • iron sulfate is brought to the vineyard to fight against ferric deficiencies responsible for chlorosis.
  • the fight against chlorosis is done by a contribution at the level of the ground or at the level of the leaves. It should be noted that the recommended soil intake is 1 kg / foot with 10 L of solvent (10%) (water or vinasse) whereas in foliar spray, iron sulfate is used at 1% for water volume of 300
  • Fosetyl-aluminum (aluminum tris-o-ethylphosphonate), initially tested as antiperspirant, showed a protective effect vis-à-vis the grape downy mildew and is used against many species of
  • Phytophthora It inhibits the germination of sporangia and the penetration of mycelium in the plant. It also limits the mycelial development and sporulation of Plasmopara viticola, the agent of downy mildew (Gouot, 2006 (Ref 35)). Phosphonates do not show fungicidal or fungistatic activity when used alone but inhibition of growth of Phaeomoniella chlamydospora is noted when associated with resveratrol (Mazullo et al., 2000 (Ref. 36)).
  • the plant decomposes fosetyl-aluminum phosphorous acid and ethanol phosphonic acid during the absorption
  • Fosetyl -aluminium stimulates the plant's defense system. As a preventative, it potentiates the plant's defense reactions and prepares the cells for subsequent attack by a pathogen. Phosphonates act on the phosphatic metabolism of fungi and generate more elicitors production (Leroux, 2000 (Ref 38)).
  • This hyperelicitation causes an increased synthesis of signal molecules of the jasmonic acid, ethylene and salicylic acid type and an accelerated transcription of the defense genes resulting in the synthesis of phytoalexins (resveratrol, ⁇ -viniferine), phenolic compounds, PR proteins such as chitinases and glucanases (Dercks and Creasy, 1989 (Ref 39), Lacombe, 2003 (Ref 40), Molina et al., 1998 (Ref 40), Nemestothy and Guest, 1990 (Ref 42), Serrano et al. , 1994 (Ref 43)).
  • phytoalexins resveratrol, ⁇ -viniferine
  • PR proteins such as chitinases and glucanases (Dercks and Creasy, 1989 (Ref 39), Lacombe, 2003 (Ref 40), Molina et al., 1998 (Ref 40), Nemestothy and Guest, 1990 (Ref 42), Serrano et
  • Fosetylaluminium and phosphonic acid are ambimobile systemic products (Leconte et al., 1988 (Ref 37), Leroux, 2000).
  • the present invention specifically aims to meet the needs and disadvantages of the prior art by providing antifungal composition.
  • the present invention relates to an antifungal composition
  • an antifungal composition comprising at least two of the compounds selected from the group consisting of cysteine, salicylic acid, iron (II) sulfate and fosetyl-aluminum.
  • composition of the invention has antifungal activity which is much greater than those of the state of the art and thus makes it possible to have an antifungal effect with a composition with amounts of weak compounds.
  • the inventors have demonstrated that the compounds used in the composition of the invention have a synergistic action, which can also reduce the appearance of "resistant".
  • the composition of the invention comprises at least three compounds selected from the group consisting of cysteine, salicylic acid, iron (II) sulfate and fosetyl-aluminum.
  • composition of the invention comprises cysteine, salicylic acid, iron (II) sulphate and fosetyl-aluminum.
  • antifungal means a molecule that acts against pathologies caused by fungi, bacteria, phytoplasmas, viruses, yeasts, preferably fungi and / or yeasts.
  • the composition is a fungicidal and / or fungistatic composition.
  • fungicide is meant a composition which is capable of causing the death of fungi, bacteria, phytoplasmas, viruses, yeasts, preferably fungi and / or yeasts.
  • fungistatic means a composition which is capable of stopping the growth of fungi bacteria, phytoplasmas, viruses, yeasts, preferably fungi and / or yeasts.
  • cyste is understood to mean a natural ⁇ -amino acid or a chemically synthesized amino acid which has a sulfhydryl or thiol (SH) group.
  • it may be L-cysteine of formula (IV) below:
  • D-cysteine an amino acid derived from cysteine, for example acetylcysteine, carbocysteine or carboxymethylcysteine, or any other molecule derived from cysteine and which retains a cysteine radical.
  • the concentration of cysteine in the composition of the invention may be between 0.01 and 150 mM.
  • the concentration of cysteine is between 1 to 120 mM, even more preferably between 4 and 65 mM.
  • salicylic acid means 2-hydroxybenzoic acid or a derivative thereof.
  • salicylic acid can be synthesized naturally, for example extracted from white willow bark or by chemical synthesis, for example by Kolbe (or Kolbe-Schmitt) reaction.
  • the concentration of salicylic acid in the composition of the invention may be between 0.01 and 4 mM.
  • the concentration of salicylic acid may be between 0.1 and 3 mM, more preferably between 0.4 and 1.5 mM.
  • iron (II) sulphate means the compound of formula FeSO 4 or a derivative thereof.
  • FeSO 4 hydrated iron sulphate
  • FeSO 4 JH 2 O iron sulfate heptahydrate
  • other ferrous salts such as iron chloride (FeCl 2 ), iron acetate (Fe (CH 3 CO 2 ) 2 ).
  • the concentration of iron (II) sulfate in the composition of the invention may be between 0.01 and 160 mM.
  • the concentration of iron (II) sulphate may be between 3 and 120 mM, more preferably between 4 and 65 mM.
  • fusedyl-aluminum minium is understood to mean ethyl hydrogen phosphonate aluminum, or aluminum tris (ethylphosphonate), or aluminum tris-O-ethylphosphonate, C 6 Hi 8 AIO 9 P 3 .
  • the concentration of fosetyl aluminum in the composition of the invention may be between 0.01 and 81 mM.
  • concentration of fosetylaluminium may be between 1 and 55 mM, more preferably between 2 and 30 mM.
  • the upper limits of amounts of the different products have been determined during phytotoxicity tests. At these quantities of the first symptoms on the leaves appear.
  • the ranges of values mentioned above are those that are recommended so that there are no symptoms on the leaves in general. These amounts may be slightly different or even higher depending on the sensitivity of the plant. The skilled person will easily know how to determine the quantities.
  • the pH of the composition of the present invention can be modified to be acidic.
  • the modification can be carried out by any means known to those skilled in the art, for example by adding an acid solution, for example HCl, H 2 CO 3 .
  • the pH of the composition may be, for example less than 7, for example from 4 to 6, preferably from 4.5 to 5.
  • a pH of the composition may advantageously make it possible to further increase the antifungal efficacy.
  • the pH of the composition may be determined by any method known to those skilled in the art, for example by means of a pH meter.
  • the composition may be for agricultural, veterinary and / or medical use.
  • the composition may be in liquid form, an emulsion, an ointment, a foam, a paste, a powder or a gel.
  • composition of the invention may be manufactured by any method known to those skilled in the art. It may be for example a simple mixture, leading preferably to a homogeneous composition.
  • the invention also relates to a method of treating a plant comprising applying the composition of the present invention.
  • the invention also relates to a method of treatment and / or preventive treatment comprising the application of the composition of the present invention to a plant, infected with a pathogen and / or on a plant that presents a risk of infection. infection with a pathogen.
  • plant any living plant fixed in the ground and whose upper part blooms in the air or in fresh water.
  • it may be woody plants, for example indigenous woody species, vines, for example vines Aligoté, Auxerrois, Cabernet Franc, Cabernet Sauvignon, Carmenère, Chardonnay, Colombard, Folignan, Folle Blanche, Gamay, Gewurztraminer, Grenache, White Juran affair, Malbec, Merlot, Meslier Saint
  • treatment for example at least one application of the composition of the invention, for example in a form as described above, capable of preventing or stopping an infection, for example by stopping the growth of the pathogen and / or death of the pathogen.
  • prevention treatment it is understood for example at least one application of the composition of the invention, for example in a form as described above, capable of preventing or stopping an infection, for example by avoiding the occurrence of infection by a pathogen, by arresting the growth of the pathogen and / or death of the pathogen.
  • pathogen an agent selected from the group consisting of fungi, bacteria, phytoplasmas, viruses and yeasts.
  • they may be fungi Phaeomoniella chlamydospora, Phaeocremonium aleopholilum, Fomitiporia mediterranea, Strereum hirsutum, Phellinus igniarius, Eutypa lata, Botryosphaeria obtusa, Neofusicoccum parvum, Botryosphaeria dothidea, Botryosphaeria stevensii, Phomopsis viticola, Plasmopara viticola, Botrytis cinerea, Erysiphe necator.
  • the fungi Phaeomoniella chlamydospora and Phaeocremonium aleopholilum Preferably, the fungi Phaeomoniella chlamydospora and Phaeocremonium aleopholilum.
  • the application of the composition of the invention may be carried out by any means known to those skilled in the art.
  • the application of the composition can be carried out by sprinkling the plant, watering, misting, painting, immersion, dusting.
  • the application of the composition can be carried out with various devices, for example with any type of agricultural sprayer known to those skilled in the art.
  • the skilled person will be able to easily determine the type of sprayer that can be used, for example it may be a towed pneumatic sprayer.
  • the application of the composition can be programmed, for example via an automatic programming device with a daily, weekly, monthly application.
  • the application of the composition can be carried out in order to maintain a constant amount of composition at the plant level, for example the application can be carried out at least once a month, once per month. week, or once a day.
  • the application can be carried out at least once a month, once per month. week, or once a day.
  • FIG. 1 shows a diagram representing the mycelial growth in mm on a solid medium (YNB, 50 mM glucose, 40 mM glutamine (GIn), 10 mM MES, pH 5.5) as a function of the incubation time. More particularly, this diagram shows the kinetics of the growth of Phaeomoniella chlamydospora (Pch) and Phaeoacremonium aleophilum (Pal).
  • FIG. 2 shows a diagram showing the mycelial growth in mm of Phaeomoniella chlamydospora at 18 days (A) and Phaeoacremonium aleophilum at 12 days (B) on a solid medium (YNB, 50 mM glucose, 40 mM glutamine, HEPES 10 mM, pH 4.2) as a function of the concentration of cysteine (Cys) in the medium.
  • YNB 50 mM glucose, 40 mM glutamine, HEPES 10 mM, pH 4.2
  • FIG. 3 shows a diagram representing the mycelial growth in mm of Phaeomoniella chlamydospora at 18 days (A) and Phaeoacremonium aleophilum at 12 days (B) on a solid medium (YNB, 50 mM glucose, 40 mM glutamine, HEPES 10 mM, pH 4.2) as a function of the presence of different sulphates in the medium at the concentration of 40 mM: ammonium sulphate (NH 4 2 (SO 4 )), potassium (K 2 SO 4 ), magnesium (MgSO 4 ), iron (FeSO 4 ) and copper (CuSO 4 ).
  • YNB 50 mM glucose, 40 mM glutamine, HEPES 10 mM, pH 4.2
  • FIG. 4 shows a diagram showing mycelial growth in mm of Phaeomoniella chlamydospora at 18 days (A) and Phaeoacremonium aleophilum at 12 days (B) on a solid medium (YNB, 50 mM glucose, 40 mM glutamine, HEPES 10 mM, pH 4.2) as a function of the concentration of iron sulphate (FeSO 4 ) in the medium.
  • YNB 50 mM glucose, 40 mM glutamine, HEPES 10 mM, pH 4.2
  • FIG. 5 shows a diagram representing mycelial growth in mm of Phaeomoniella chlamydospora at 18 days (A) and Phaeoacremonium aleophilum at 12 days (B) on a solid medium (YNB, 50 mM glucose, 40 mM glutamine, HEPES 10 mM, pH 4.2) as a function of different concentrations of iron sulphate (FeSO 4 ), iron chloride (FeCl 2 ) and iron acetate (Fe (CH 3 CO 2 ) 2 ) in the medium.
  • FeSO 4 iron sulphate
  • FeCl 2 iron chloride
  • Fe (CH 3 CO 2 ) 2 iron acetate
  • FIG. 6 shows a diagram showing mycelial growth in mm of Phaeomoniella chlamydospora at 18 days (A) and Phaeoacremonium aleophilum at 12 days (B) on a solid medium (YNB, 50 mM glucose, 40 mM glutamine, HEPES 10 mM, pH 4.2) as a function of different concentrations of salicylic acid (AS) in the medium.
  • YNB 50 mM glucose, 40 mM glutamine, HEPES 10 mM, pH 4.2
  • FIG. 7 is a diagram showing the mycelial growth in mm of Phaeomoniella chlamydospora at 18 days (A) and Phaeoacremonium aleophilum at 12 days (B) on a solid medium (YNB, 50 mM glucose, 40 mM glutamine, HEPES 10 mM, pH 4.2) as a function of different fosetyl-aluminum concentrations in the medium.
  • YNB 50 mM glucose, 40 mM glutamine, HEPES 10 mM, pH 4.2
  • FIG. 8 is a diagram showing the effect of the association of cysteine with different salicylic acid concentrations on mycelial growth in mm of Phaeomoniella chlamydospora at 18 days (A) and Phaeoacremonium aleophilum at 12 days (B). on a solid medium (YNB, 50 mM glucose, 40 mM glutamine, 10 mM HEPES, pH 4.2). More particularly, the different conditions incubation are 5 mM cysteine (Cys) and different concentrations of salicylic acid (AS), used alone (I) or associated (Ma).
  • YNB 50 mM glucose, 40 mM glutamine, 10 mM HEPES, pH 4.2
  • FIG. 9 is a diagram showing the effect of the combination of cysteine and salicylic acid with different concentrations of iron sulfate on mycelial growth in mm of Phaeomoniella chlamydospora at 18 days (A) and Phaeoacremonium aleophilum at 12 days (B) on a solid medium (YNB, 50 mM glucose, 40 mM glutamine, 10 mM HEPES, pH 4.2). More particularly, the different incubation conditions are 5 mM cysteine (Cys), 0.5 mM salicylic acid (AS) and various iron sulphate (FeSO 4 ) concentrations, used alone (I) or combined with 2 (II) or 3 (III).
  • FIG. 10 is a diagram showing the effect of the combination of cysteine, salicylic acid, iron sulfate and fosetyl aluminum on mycelial growth in mm of Phaeomoniella chlamydospora at 21 days (A). ) and Phaeoacremonium aleophilum at 13 days (B) on a solid medium (YNB, 50 mM glucose, 40 mM glutamine, 10 mM HEPES, pH 4.2).
  • YNB 50 mM glucose, 40 mM glutamine, 10 mM HEPES, pH 4.2
  • the different incubation conditions are 5 mM cysteine (Cys), 0.5 mM salicylic acid (AS), 5 mM iron sulfate (FeSO 4 or Fe) and 2.7 mM fosetyl- aluminum (Fos Al), used alone (I) or associated with 2 (II), 3 (III), or 4 (IV).
  • FIG. 11 is a diagram showing the effect of the combination of cysteine, salicylic acid, iron sulfate and fosetyl-aluminum on mycelial growth in mm of Phaeomoniella chlamydospora at 18 days (A). ) and Phaeoacremonium aleophilum at 12 days (B) in a liquid medium (YNB, 50 mM glucose, 40 mM glutamine, 10 mM HEPES, pH 4.2).
  • YNB 50 mM glucose, 40 mM glutamine, 10 mM HEPES, pH 4.2
  • the different incubation conditions are 5 mM cysteine (Cys), 0.5 mM salicylic acid (AS), 5 mM iron sulfate (FeSO 4 or Fe) and 2.7 mM fosetyl- aluminum (Fos Al or Fos), used alone (I) or combined with 2 (II), 3 (III), or 4 (IV).
  • FIG. 12 is a diagram showing the effect of the combination of cysteine, salicylic acid, iron sulphate and fosetyl-aluminum on spore germination of Phaeomoniella chlamydospora (A) and Phaeoacremonium aleophilum (B) in liquid medium (YNB, glucose 50 mM, glutamine 40 mM, HEPES 10 mM, pH 4.2) after 5 days and observed by an OD modification at 595 nm.
  • YNB glucose 50 mM
  • glutamine 40 mM glutamine 40 mM
  • HEPES 10 mM pH 4.2
  • the different incubation conditions are 5 mM cysteine (Cys), 0.5 mM salicylic acid (AS), 5 mM iron sulfate (FeSO 4 or Fe) and 2.7 mM fosetyl- aluminum (Fos Al or Fos), used alone (I) or combined with 2 (II), 3 (III), or 4 (IV).
  • FIG. 13 shows a reversibility curve of the mycelial growth in mm of Phaeomoniella chlamydospora (A, B and C) and of Phaeoacremonium aleophilum (A 'and B') treated with various molecules of the invention during 8 (A). , A '), (B, B') and 21 (C) days and after passage through a nutrient medium without antifungal molecules (YNB, 50 mM glucose, 40 mM glutamine, 10 mM HEPES, pH 4.2).
  • YNB 50 mM glucose, 40 mM glutamine, 10 mM HEPES, pH 4.2
  • the different incubation conditions are 5 mM cysteine (Cys), 0.5 mM salicylic acid (AS), 5 mM iron sulfate (FeSO 4 or Fe) and 2.7 mM fosetyl- aluminum (Fos Al or Fos), associated with 2 (II), 3 (111), or 4 (IV).
  • FIG. 14 shows a diagram representing the mycelial growth in mm of different strains of Phaeomoniella chlamydospora at 18 days (A) and Phaeoacremonium aleophilum at 12 days (B) as a function of the presence of 5 mM cysteine (Cys) 0.5 mM salicylic acid (AS), 5 mM iron sulfate (FeSO4) and 2.7 mM fosetyl aluminum (Fos Al) on a solid nutrient medium (YNB, 50 mM glucose, 40 mM glutamine). , 10 mM HEPES, pH 4.2).
  • FIG. 15 shows photographs of vine leaves two weeks after foliar treatment with different compositions of the invention on Cabernet Sauvignon cuttings (A and B) and after four treatments, carried out 14 days apart, on white Ugni cuttings (C, D, E, F). More particularly, this diagram makes it possible to verify the innocuity of the invention on the vine.
  • a and C untreated cuttings
  • D Treatment with cysteine (5 mM), salicylic acid (0.5 mM) and wetting agent (Etaldyne 95, Fertiligen)
  • E treatment with iron sulfate (5 mM), fosetyl-aluminum (2.7 mM) and a wetting agent (Etaldyne 95, Fertiligen)
  • F treatment with cysteine (5 mM), salicylic acid (0.5 mM), iron sulfate (5 mM), fosetyl aluminum (2.7 mM) and a wetting agent (Etaldyne 95, Fertili subconscious).
  • Figure 16 shows the prints of shoots from cuttings inoculated with pathogens (Phaeomoniella chlamydospora) and performed 14 days after 1, 2, 3 or 4 treatments of said cuttings in the presence of different compositions of the invention. More particularly, the fingerprints are revealed with antibodies to P. chomydospora.
  • pathogens Phaeomoniella chlamydospora
  • A uninoculated cuttings
  • B untreated cuttings
  • C cuttings treated with salicylic acid (0.5 mM), cysteine (5 mM) and a wetting agent (Etaldyne 95, Fertiligen)
  • D treated cuttings with iron sulphate (5 mM), fosetyl aluminum (2.7 mM) and a wetting agent (Etaldyne 95, fertilizer)
  • E cuttings treated with iron sulphate (5 mM), fosetyl aluminum (2 , 7 mM), salicylic acid (0.5 mM), cysteine (5 mM) and a wetting agent (Etaldyne 95, Fertiligen)
  • + positive control corresponding to 5 ng of proteins (F2) of Phaeomoniella chlamydospora and arranged for each revelation.
  • Figure 17 shows the prints of shoots from cuttings inoculated with a pathogen (Phaeoacremonium aleophilum) made 14 days after 2 or 4 treatments of said cuttings in the presence of different compositions of the invention.
  • B untreated cuttings
  • C cuttings treated with salicylic acid (0.5 mM), cysteine (5 mM) and a wetting agent (Etaldyne 95, Fertiligenic)
  • D cuttings treated with iron sulfate ( 5 mM), fosetyl aluminum (2.7 mM) and a wetting agent (Etaldyne 95, Fertiligen)
  • E cuttings treated with iron (5 mM) sulfate, fosetyl-aluminum (2.7 mM), salicylic acid (0.5 mM), and cysteine (5 mM) and a wetting agent (Etaldyne 95, Fertiligen).
  • + positive control corresponding to 5 ng of proteins (F2) of Phaeoacremoni
  • fungi were also used to test the specificity of the antibodies: Alternaria sp., Botryosphae ⁇ a obtusa, Neofusicoccum parvum, Botrytis cinerea, Cladosporium sp., Cylindrocarpon destructans, Epicoccum sp., Eutypa lata, Fusa ⁇ um sp., Paecilomyces sp., Penicillium sp., Pestalotia sp., Phoma sp., Phomopsis viticola, Pullularia sp., Trichoderma atroviride, Trichoderma harzianum and Verticillium chlamydosporum. Strains were identified and provided by P. Larignon (I.F.V. Rhone-Mediterranean Pole).
  • the fungi were cultured on a totally synthetic medium consisting of YNB (Yeast Nitrogen Base without amino acid and ammonium sulfate; DIFCO 233520) at 1.7 g / L, glucose at 50 mM.
  • YNB Yeast Nitrogen Base without amino acid and ammonium sulfate
  • the above medium was solidified with agar at 20 g / L (Sigma
  • the strains were grown in a 9 cm diameter petri dish in the dark at 25 ° C, an average temperature favorable for the development of Phaeomoniella chlamydospora and Phaeoacremonium aleophilum.
  • the strains were stored as mycelial disks in sterile water in the dark at 4 ° C.
  • the cultures in liquid medium were made in Erlenmeyer flask containing 300 ml of the medium defined above, inoculated with three agar plates 1 cm in diameter on which the inoculum developed.
  • the tests with the different molecules in solid medium were made in 6-well boxes of 35 mm diameter.
  • the medium was buffered to pH 4.2 with 10 mM HEPES for the antifungal molecules.
  • the molecules to be tested were added before solidification of the medium.
  • the medium was inoculated with a 4 mm diameter mycelial disk from a solid mother culture.
  • Tests on the effect of antifungal molecules on the germination of spores were made in 96-well plate.
  • the basic nutrient medium YNB or "Yeast Nitrogen Base"
  • 50 mM glucose, 40 mM glutamine, 10 mM HEPES pH 4.2 is autoclaved for 15 min at 110 ° C.
  • the various compounds to be tested have been added to the medium. cooled. 200 ⁇ L of the test medium are deposited per well and inoculated with 50,000 spores.
  • the microplates were stirred (160 rpm) at 22 ° C and in the dark.
  • the absorbance was measured at 595 nm every two or three days using a microplate reader (Sunrise reader, Tecau). Before reading the absorbance, the plate was stirred 5 s in order to homogenize the contents of the wells. Measurement of growth parameters of fungi
  • the diameter of the development of the fungus was measured using a ruler graduated every two days for one month.
  • liquid medium Three parameters were monitored during the development of fungi in a liquid medium: the dry mass of mycelium, the pH of the culture medium and the concentration of secreted proteins in the medium.
  • the liquid culture medium was centrifuged for 30 min at 20000 xg at 4 ° C to pellet the mycelium and spores.
  • the pellet obtained after centrifugation was dried in an oven at 60 ° C. for 24 hours in order to determine the dry mass of the fungus.
  • the supernatant was recovered and passed through a filter whose pores are 0.22 ⁇ m in diameter (Whatman) in order to completely eliminate the spores and the remaining mycelium.
  • the pH of the supernatant was then measured using a pH meter (pH 526, WTW).
  • the protein concentration was measured according to the technique of Bearden (1978) (Ref 50).
  • This technique consists in adding 100 ⁇ l of Triton X-100 at 0.1% (w / v) to x ⁇ L containing the proteins to be assayed, x corresponds to 100 ⁇ L for the determination of the proteins contained in the mushroom culture medium, 10 ⁇ L for the determination of the proteins of fraction F2. After 10 min of incubation, the volume is supplemented to 1 mL with milliQ water. 1 ml of Bearden reaction medium is added. The reading of the absorbance is carried out at 595 nm after 10 minutes of waiting. The standard range is performed with serum bovine albumin (BSA).
  • BSA serum bovine albumin
  • the vines Vitis vinifera L. were white Ugni (variety mainly used for the production of Cognac since it represents 95% of the encépagement in white) and Cabernet Sauvignon (black grape variety).
  • the plants were obtained by cuttings from vines harvested from the vineyard. For this, a cutting formed of two nodes separated by an internode was removed. The lower bud was removed using a pruner.
  • the cuttings thus obtained were placed in a pot containing potting soil supplemented with pozzolan and was watered every three days with water. When the roots and leaves have been sufficiently developed (4 leaves), the cuttings are then watered with a nutritive solution composed of potassium nitrate, monoammonium phosphate, monopotassium phosphate, magnesium sulphate, calcium nitrate, trace elements (B, Cu, Mn, Mo, Zn) and Séquestrène (registered trademark) (Syngenta).
  • Plants were illuminated 16 h per day mainly with natural light and sodium vapor lamps (Philips SON-T, 423 W) when the amount of light radiation was too low.
  • the average temperature was 22 ° C ⁇ 2 ° C and the humidity was 70% ⁇ 10%.
  • the cuttings were inoculated selectively in a cavity 1 cm deep made in the apical part, with a 4 mm diameter agar disc on which developed the mycelia of Phaeomoniella chlamydospora (strain PC-PC37). or Phaeoacremonium aleophilum (strain PA-PC 24). Hydrophilic cotton was then deposited on the agar plate and the whole was surrounded by parafilm and then placed in the ground. Treatment on cuttings
  • the cuttings were treated by foliar spraying until runoff.
  • the molecules tested were L-cysteine (Sigma), salicylic acid (Sigma), iron sulfate FeS ⁇ 4 heptahydrate (7H2O) (Sigma) and fosetyl aluminum (Aliette 80, KB garden).
  • a wetting agent (Etaldyne 95, Alkylphenoloxyethylene, Fertiligen) was used at a concentration of 0.5 mL / L to optimize the contact area between the composition and the sheet. The composition was sprayed on the plant at pH 4.5.
  • the plants used in natural conditions came from a plot of Ugni white planted in 1974 located in Grande Champagne. The vines were driven in double flat Guyot. The rows were separated by 3 m and the stock of 1, 3 m. The density was 2564 ceps per hectare.
  • Two syntheses of antibodies were carried out: one directed against the proteins secreted by Phaeomoniella chlamydospora and the other against the proteins secreted by Phaeoacremonium aleophilum.
  • Two rabbits were immunized for each antibody synthesis.
  • the secreted proteins in the culture medium were lyophilized and suspended in milliQ water and then the sample was passed on Sephadex G25 resin (PD 10, GE Healthcare) in order to eliminate the salts contained in the nutrient medium. .
  • the fraction containing the proteins was lyophilized again and then suspended in PBS (saline buffer or "phosphate buffer saline”) (4.4 mM NaH 2 PO 4, 16 mM Na 2 HPO 4, 300 mM NaCl, pH 7.4).
  • PBS saline buffer or "phosphate buffer saline”
  • the proteins were assayed according to the Bearden technique. A quantity of 1 mg of proteins to be injected per rabbit was necessary in order to carry out the imm
  • the synthesis of antibodies was entrusted to the company Agrobio (La Ferté Saint Aubin).
  • the protocol for obtaining the antibodies lasts 77 days.
  • Four antigen injections of 250 ⁇ g of protein per rabbit are performed. Samples at D49, D68 and D77 (corresponding to the final sample) are taken.
  • the antibodies obtained during the final sample were then purified by protein affinity chromatography A.
  • the A proteins have the property of interacting specifically with the Fc part of the mammalian immunoglobulins.
  • Hybridization of antibodies - dot-blot method This technique was used to detect circulating proteins in the plant through an antibody directed specifically against these proteins.
  • a print of a shoot was made immediately after section, applying the sectioned area in contact with the membrane (HybondTM-ECLTM, GE Healthcare) for 10 seconds. Protein binding was performed by allowing the membrane to dry for 30 min at room temperature. The membrane was then rinsed for 5 min in 20 mM PBS pH 7.4 supplemented with 0.2% (v / v) Tween 20 and incubated overnight at 4 ° C in saturation buffer ( PBS 20 mM pH 7.4, milk protein 3%, Tween 20 0.2%) to block nonspecific sites. The rest of the protocol (antibody hybridization and revelation) was substantially identical to that of the western blot described above. The membrane was incubated for 120 minutes in contact with the primary antibody diluted in 1/250 saturation buffer.
  • cysteine slows the growth of Phaeomoniella chlamydospora and Phaeoacremonium aleophilum ( Figure 2).
  • Other fungi such as Inonotus obliquus (Kahlos and Tikka, 1994 (Ref22)), Alternaria sp. (Daigle and Cotty, 1991 (Ref. 24)), Botrytis cinerea (Leroux, 1994 (Ref. 51)) and in previous work on Eutypa lata (Amborabé et al., 2005 (Ref 52), Octave et al., 2005 (Ref 23)).
  • cysteine alone inhibits only the development of Phaeomoniella chlamydospora and Phaeoacremonium aleophilum at relatively high concentrations.
  • the sensitivity of both fungi to cysteine is different.
  • ammonium sulfate 40 mM
  • ammonium sulfate 40 mM
  • Table 3 Table of results for ammonium sulphate ((NH 4) 2 SO 4 ), potassium (K 2 SO 4 ) and magnesium (MgSO 4 ).
  • Phaeoacremonium aleophilum at concentrations of 40 mM.
  • Copper sulfate is already widely used (Bordeaux mixture) in viticulture to fight against various diseases (mildew, bacterial, bacterial necrosis).
  • iron sulfate further inhibits the growth of Phaeomoniella chlamydospora and Phaeoacremonium aleophilum at concentrations of 5 mM and 10 mM.
  • Figure 5A shows that the growth of Phaeomoniella chlamydospora is inhibited in the presence of sulfate, chloride and iron acetate in a dose dependent manner.
  • the inhibition caused by iron chloride is comparable to that obtained with iron sulfate irrespective of the concentration applied.
  • the inhibition due to iron acetate is slightly decreased to 5 mM. Indeed, it is 40% while that obtained with iron sulfate is 65%.
  • the concentration of 10 mM fungal development is completely inhibited with iron acetate, which is not the case with sulfate and iron chloride.
  • the growth of Phaeomoniella chlamydospora is totally inhibited irrespective of the ferrous molecule tested.
  • FIG. 5B shows that sulfate, chloride and iron acetate also inhibit the development of Phaeoacremonium aleophilum in a dose-dependent manner.
  • the growth of Phaeoacremonium aleophilum is more inhibited with iron sulfate than with chloride and iron acetate.
  • the inhibition caused by chloride and iron sulfate is 75%.
  • the inhibition observed with iron acetate is lower since it reaches 45%.
  • the fungal development is totally inhibited with chloride and iron acetate.
  • Phaeoacremonium aleophilum develops slightly in the medium containing iron sulphate.
  • Salicylic acid therefore has little effect on the mycelial growth of Phaeomoniella chlamydospora. Higher concentrations of salicylic acid have not been tested because at high concentrations, phytotoxicity problems can be noted.
  • Figure 6 B shows that the development of Phaeoacremonium aleophilum is slightly inhibited to 0.05 mM. At 0.5 mM growth was inhibited by 50% and at 1 mM it was completely inhibited.
  • Figure 7 B shows that fosetyl-aluminum has no effect at 0.3 mM and 1 mM on the growth of Phaeoacremonium aleophilum. A weak inhibition of the order of 6% is observed at the concentration of 1.7 mM. At higher concentrations growth is inhibited by 30% at 2.7 mM and 45% at 3.4 mM.
  • fosetyl-aluminum alone inhibits the mycelial growth of Phaeomoniella chlamydospora and more weakly that of Phaeoacremonium aleophilum.
  • the sensitivity of Phaeoacremonium aleophilum to fosetyl fosetyl-aluminum is therefore lower than that of Phaeomoniella chlamydospora.
  • the concentration used is that for which growth has been approximately 50% inhibited. Then, the molecules were associated with each other by two then by three and all together.
  • Cysteine at a concentration of 5 mM
  • salicylic acid at different concentrations ranging from 0.05 mM to 1 mM, were tested alone or in combination to study their impact on mycelial growth.
  • FIG. 8A shows that the growth of Phaeomoniella chlamydospora is inhibited by 98% (E ') in the presence of the 1mM cysteine / salicylic acid mixture, which is greater than the effect alone induced by each compound and addition of the effects produced by each compound separately.
  • E 98%
  • composition comprising cysteine and salicylic acid inhibits the growth of pathogens and has a synergistic effect.
  • composition comprising iron sulfate, cysteine and salicylic acid
  • Cysteine / iron sulfate The results presented in FIG. 9 show that the combination of cysteine and iron sulfate at 5, 10 and 20 mM makes it possible to reduce the growth of Phaeomoniella chlamydospora and Phaeoacremonium aleophilum.
  • FIG. 9B shows that the inhibition of the growth of Phaeoacremonium aleophilum due to the combination of cysteine and iron sulfate (at the various concentrations tested) is greater than the inhibition caused by the compounds alone.
  • a synergistic effect is observed in each case since the experimental efficiency (65%, 87%, 94%) is greater than the theoretical efficiency (55%, 86%, 93%) (FIG. 9B (Hb)).
  • composition comprising 0.5 mM salicylic acid with iron sulfate at 5, 10 and 20 mM completely inhibits the fungal development of both fungi irrespective of iron sulfate concentration. A synergistic effect was observed for each concentration with both fungi.
  • composition of the invention is an antifungal composition having a synergistic effect with results much higher than those observed with the compositions of the state of the art.
  • composition comprising fosetyl-aluminum, cysteine, salicylic acid, iron (IV) sulphate
  • the compounds tested include 2.7 mM fosetyl aluminum, 5 mM cysteine, 0.5 mM salicylic acid and 5 mM iron sulfate.
  • the molecules were tested associated by two, three or four. a) Inhibition of mushroom growth with compositions comprising two or three compounds
  • Certain combinations of molecules do not completely inhibit the fungal development of Phaeoacremonium aleophilum in a liquid medium (FIG. 11B (II and III)). Residual growth is observed for mixtures of salicylic acid / fosetyl-aluminum (3.5%), cysteine / salicylic acid / iron sulfate (2%), cysteine / salicylic acid / fosetyl-aluminum (0.5%), acid salicylic acid / iron sulfate / fosetyl-aluminum (10%).
  • the culture conditions of the fungus can therefore modify the effectiveness of the treatment applied with compositions comprising two or three compounds.
  • b) Inhibition of fungal growth with compositions comprising four compounds As demonstrated in this experiment (FIG. 10A and B (IV) and FIG. 11A and B (IV)), the growth of Phaeomoniella chlamydospora and Phaeoacremonium aleophilum in a liquid medium is totally inhibited in the presence of the 5mM cysteine mixture. 0.5 mM salicylic acid / 5 mM iron sulphate / 2.7 mM aluminum fosetyl in a liquid and solid medium.
  • composition according to the invention makes it possible to inhibit the growth of pathogens.
  • FIG. 12A demonstrates that all the compositions tested have an inhibitory effect on germination.
  • mixtures of salicylic acid / fosetyl-aluminum (II), cysteine / salicylic acid / iron (III) sulphate, salicylic acid / iron sulphate / fosetyl-aluminum (III), cysteine / salicylic acid / sodium sulphate iron / fosetyl-aluminum (IV) completely inhibit spore germination of Phaeomoniella chlamydospora. On the other hand, it is not completely inhibited in the presence of the salicylic acid / iron (II) sulfate mixture, whereas its growth is completely inhibited in solid and liquid media.
  • the salicylic acid / iron sulphate mixture thus seems to have mainly an effect on the growth of the mycelium and a lesser effect on the germination of the spores.
  • spore germination is not totally inhibited in the presence of cysteine / salicylic acid / iron (III) sulphate, whereas the mycelium develops weakly in a solid medium under the same conditions.
  • FIG. 12B shows that the spores of Phaeoacremonium aleophilum are completely inhibited in the presence of salicylic acid / iron sulfate, salicylic acid / fosetyl- aluminum (II), cysteine / salicylic acid / iron sulfate, cysteine / salicylic acid / fosetyl-aluminum (III), cysteine / salicylic acid / iron sulfate / fosetyl-aluminum (IV).
  • Mycelial growth is totally inhibited with the same mixtures in solid medium and very strongly in liquid medium.
  • composition of the invention used during the period of sporulation of fungi could prevent new contaminations by inhibition of sporulation.
  • Example 4 Measurement of the fonqistatic effect or fungicidal effect of the composition
  • mycelial implants used to seed the nutrient medium containing the various test molecules in a solid medium were deposited on a nutritive medium without antifungal molecules after 8, 15 and 21 days of contact with the antifungal molecules according to the protocol described above.
  • the resumption of growth indicates that the mixture has a fungistatic effect while zero growth indicates that the treatment has a fungicidal effect.
  • results also make it possible to determine the necessary contact time between the fungus and the treatment so that the fungus is killed and the germination of the conidiospores is totally inhibited.
  • This measurement was carried out by the growth of the fungus in the presence of various combinations and then after passing on a nutrient medium free of antifungal molecules after 8, 15 or
  • cysteine / salicylic acid / iron sulfate in the case of cysteine / salicylic acid / iron sulfate, salicylic acid / iron sulfate / fosetyl-aluminum and cysteine / salicylic acid / iron sulfate / fosetyl-aluminum combinations, the passage of mycelial implants on a medium without molecules. antifungals does not restore the growth of the fungus. These compositions therefore have a fungicidal effect.
  • the mycelial implants in contact with the iron sulfate / fosetyl-aluminum, cysteine / salicylic acid / fosetyl-aluminum, cysteine / iron sulfate / fosetyl-aluminum combinations respectively develop , 7 and 3 days after passage on a medium without molecules, which indicates that these associations have a fungistatic effect.
  • Mycelial implants in contact with other mixtures (salicylic acid / iron sulfate, cysteine / salicylic acid / iron sulfate, salicylic acid / iron sulfate / fosetyl-aluminum, cysteine / salicylic acid / iron sulfate / fosetyl-aluminum) do not resume their development. These compositions therefore have a fungicidal effect.
  • FIG. 13C shows that only the mycelium of Phaeomoniella chlamydospora in contact for 21 days with the cysteine / iron sulfate / fosetyl-aluminum mixture resumes its growth after passage on medium without antifungal molecules after a latency period of 7 days . All other tested associations have a fungicidal effect after 21 days of contact.
  • Figures 13 A 'and B' show the growth of Phaeoacremonium aleophilum after contact with different combinations for 8 and 15 days and transfer to a medium lacking antifungal molecules.
  • the developed mixture was developed on a strain of Phaeomoniella chlamydospora (PC-PC 37) and a strain of Phaeoacremonium aleophilum (PA-PC 24).
  • composition was tested on other strains of Phaeomoniella chlamydospora and Phaeoacremonium aleophilum in solid medium to ensure that it inhibits the growth of other strains of fungi grown in vitro.
  • the various Phaeoacremonium aleophilum strains tested were PA-PC 24, PA-PC6, PA-PC20 PA-AQ 30. As shown in FIG. 14B, the growth of the various strains is strongly inhibited with cysteine / salicylic acid and iron sulfate / aluminum fosetyl and is completely inhibited with the mixture of the four molecules.
  • composition of the invention inhibits the growth of the fungus regardless of the strain tested.
  • compositions were tested in a mixture of two (5 mM cysteine / 0.5 mM salicylic acid and 5 mM iron sulfate / 2.7 mM fosetyl aluminum) or four on white Ugni cuttings and also on Cabernet Sauvignon cuttings.
  • a wetting agent (Etaldyne 95, Fertiligen) was added to the mixture which was applied to the cuttings by foliar spraying.
  • the mixture of the four molecules causes a slight anthocyanin synthesis (FIG. 15B) in the older Cabernet Sauvignon leaves.
  • This anthocyanin synthesis is characteristic of the activation of the secondary metabolism of the plant and does not correspond to a phytotoxic effect.
  • white Ugni cuttings show no sign of phytotoxicity whether for treatments made from a mixture of two (FIGS. 15D and 15E) or four molecules (FIGS. Figure 15F).
  • composition of the invention therefore makes it possible to inhibit mycelial growth without deleterious effect for the plant, unlike the compositions of the state of the art.
  • Example 7 Verification of the effectiveness of compositions on cuttings with the technique of fingerprinting on membrane and antibodies developed
  • the first treatment was performed on cuttings inoculated for two and a half months.
  • the membrane imprint method was used. Fingerprints were performed 14 days after each treatment.
  • the signals revealed correspond to the presence of proteins synthesized by the fungi and detected by means of specific antibodies secreted proteins.
  • the fingerprints of the basal and apical portions of the shoots of untreated cuttings have a high signal.
  • a signal is detected for all fingerprints of treated cuttings ( Figures 16C, D and E).
  • the signal is much weaker for fingerprints made from cuttings treated with the iron / fosetyl-aluminum sulfate mixture ( Figure 16D) and the mixture of the four molecules with the fingerprints of untreated cuttings ( Figure 16). E).
  • a signal is still obtained with the cuttings treated with the salicylic acid / cysteine mixture.
  • the signal for fingerprints of cuttings treated with iron / fosetyl-aluminum sulphate mixture is much lower than for untreated cuttings. No signal is no longer detected for 4 out of 5 cuttings treated with the mixture of the four molecules.
  • FIG. 17 shows the results obtained with a composition comprising two or four compounds after two or four treatments of cuttings inoculated with Phaeoacremonium aleophilum and makes it possible to compare the intensity of the observed signal with that of untreated inoculated cuttings.
  • a signal is recorded for all the impressions made from the basal portion and the apical portion of the branches of the untreated cuttings. Treatments carried out with the association of two molecules do not make it possible to reduce the intensity of the signal.
  • the signal obtained with cuttings fingerprints treated by the combination of the four molecules (Figure 17 E) is weaker than that obtained with untreated cuttings ( Figure 17B).
  • the signal intensity for fingerprints made from cuttings treated with compositions comprising two or four compounds is much lower than for untreated cuttings.
  • composition of the invention has an anti-fungal effect and allows in particular to inhibit the secretion of proteins by the fungi in the plant.

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Abstract

La présente invention se rapporte à une composition antifongique comprenant au moins deux des composés choisis dans le groupe constitué par la cystéine, l'acide salicylique, le sulfate de fer (II) et le fosétyl-aluminium et à un procédé de traitement d'une plante infectée ou non par un agent pathogène. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à une composition antifongique pour le traitement de vignes.

Description

COMPOSITIONS ANTIFONGIQUES ET UTILISATION
DESCRIPTION Domaine technique
[0001] La présente invention se rapporte à une composition antifongique et à un procédé de traitement d'une plante infectée par un agent pathogène. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à une composition antifongique pour le traitement des vignes.
[0002] Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentées à la fin du texte.
Etat de la technique
[0003] Les compositions antimicrobiennes sont connues depuis plusieurs dizaines d'années. Il s'agit de compositions permettant de tuer des microbes. Parmi ces compositions antimicrobiennes certaines tuent par exemple des champignons et sont dites antifongiques. Il existe différents types d'antifongiques : les antifongiques dits « naturels », il s'agit de composés ou de compositions provenant de plantes, de fruits (par exemples les pamplemousses) ; et les antifongiques produits par synthèse chimique.
[0004] Un nombre important de molécules antifongiques sont connues dans l'état de la technique. On peut citer par exemple le chlorhydrate d'amorolfine, l'amphotéricine B, l'acide benzoïque, l'hydroxybenzoate de benzyle, le bifonazole, l'acide borique, la bromoxyquinone, la buclosamine, l'acide caprylique, le chlorhydrate de chlormidazole, le chlorobutanol, la chlorquinole, la ciclopiroxolamine, le clofénoxyde, l'édisilate de cloprothiazole, le clotrimazol, le chlorure de clotrimazole, le chlorure de dequanilium, le chlorhydrate de dimazol, le nitrate d'éconazole, le nitrate de fenticonazole, etc. [0005] Les compositions antifongiques connues peuvent être utilisées dans le domaine agronomique, par exemple pour la prévention ou le traitement de pathologies telles que l'Esca, l'Eutypiose, le mildiou, l'oïdium.
[0006] Dans le domaine agricole, la vigne est une plante qui nécessite un recours massif aux traitements phytosanitaires pour endiguer de nombreuses maladies. Ainsi, 30 % du tonnage des fongicides consommés dans l'Union Européenne sont utilisés pour la viticulture qui ne représente qu'environ 1 % des surfaces cultivées (Daire et al., 2002 (Réf 1 )). Ces traitements sont dus à la forte pression parasitaire qui s'exerce sur les vignobles du fait que seules des variétés de Vitis vinifera d'origine européenne, beaucoup plus sensibles aux maladies, sont autorisées dans la plupart des régions viticoles et que les vignobles sont situés en zones tempérées et humides favorables au développement de champignons pathogènes responsables de maladies.
[0007] Les compositions antifongiques de l'état de la technique peuvent être également utilisées dans le domaine agroalimentaire, par exemple dans des compositions laitières afin de prévenir et/ou d'inhiber le développement de champignons dans des yaourts etc. ; dans le domaine vétérinaire, par exemple par application topique, administration intraveineuse sur des ovins, des animaux domestiques, par exemple les chats, les chiens, etc., et dans le domaine médical, par exemple pour le traitement de mycoses, par application topique, injection intraveineuse, injection sous-cutanée etc..
[0008] Un des problèmes liés à l'utilisation des fongicides est l'apparition de phénomène de résistance. En effet, l'utilisation massive des fongicides entraîne l'apparition de « résistants » tel que cela est observé pour les antibiotiques. Ces résistants nécessitent une recherche continue de nouveaux composés susceptibles d'inhiber la croissance des champignons.
[0009] De plus, il est bien connu que les fongicides possédant un seul site d'action (fongicide unisite) comme les benzimidazoles (Benlate (marque de commerce)), favorisent le développement de résistances, alors que les fongicides possédant de multiples sites d'action (fongicides multisites) comme les dithiocarbamates (Ferbam (marque de commerce)) permettent de limiter l'apparition du phénomène de résistance.
[0010] Un autre inconvénient connu des fongicides est leur toxicité. En effet, il est connu que les fongicides utilisés dans le domaine agricole peuvent être toxiques vis à vis des insectes, par exemple les abeilles, mais également vis à vis des organismes aquatiques. Il s'agit par exemple du Zirane (marque de commerce).
[0011] Enfin, du fait de leur toxicité, certains fongicides ont été retirés du commerce, par exemple l'arsénite de sodium. Ce composé est doté d'un large spectre, avec une efficacité contre quatre familles de champignons pathogènes (Ascomycètes, Basidiomycètes,
Deutéromycètes et Oomycètes). Il a été utilisé pour le traitement et la prévention de l'Esca, pathologie complexe causée par plusieurs champignons de la classe des Ascomycètes et des Basidiomycètes qui infectent les ligneux, par exemple les vignes. Ce composé a été interdit car il est cancérigène et toxique pour l'homme. Il n'existe pas actuellement de composés permettant le traitement de l'Esca.
[0012] L'acide salicylique (AS) est une molécule impliquée dans les réactions de défense de la plante. Initialement, il a été montré que l'aspirine, un dérivé de l'AS, pouvait induire la SAR (Résistance acquise de manière systémique ou « Systemic acquired résistance ») et la synthèse de protéines PR (la pathogenèse associée ou « pathogenesis related ») (White, 1979 (Réf 2)), mimant l'action d'un composé benzoïque naturel agissant en tant que signal de défense (Van Loon, 1983 (Réf 3)). Ce n'est qu'en 1990 qu'il a été montré que l'AS est un élément essentiel dans l'induction de la SAR (Malamy et al., 1990 (Réf 4) ; Métraux et al., 1990 (Réf 5)). L'AS stimule la production de glucanases et de chitinases qui sont transportées dans les parties distales de la plante où elles dégradent la paroi des cellules fongiques ou bactériennes (Kessmann et al., 1996 (Réf 6)). L'AS possède également des propriétés antifongiques à l'égard ό'Eutypa lata. Cette action est dépendante du pH et la valeur seuil est estimée à 0,1 mM à pH 4,1 (Amborabé ét al., 2002 (Réf 7)).
[0013] L'utilisation de l'AS a été envisagée comme éliciteur contre les agents pathogènes dans la protection des cultures (Regnault-Roger C, 2006 (Réf 8)). L'AS possède une systémie phloémienne et xylémienne sur plantules de ricins. De l'AS marqué au 14C et à la concentration de 10 μM est détectée dans la sève phloémienne à une concentration de 100 μM et dans la sève xylémienne à 0,67 μM après 4 heures d'absorption (Rocher et al., 2006 (Réf 9)). Le facteur de concentration de l'AS dans le phloème de ricin est de l'ordre de 10, pour des pH compris entre 4,6 et 5,0 (Rocher, 2004 (Réf 10)).
[0014] Des analogues de l'AS ont également été synthétisés : l'acide 2,6-dichloroisonicotinique (INA) et l'acibenzolar-S-méthyl (ASM) qui est un benzothiadiazole (voir les formules (II) et (III)). Ces molécules sont capables d'induire la SAR (Dong, 1998 (Réf 11 )).
Figure imgf000006_0001
[0015] L'INA a rapidement été abandonné en raison de sa phytotoxicité. Par contre, l'efficacité de l'ASM a été montrée chez de nombreuses plantes annuelles (céréales, pomme de terre, tomate) vis-à- vis de différents agents pathogènes comme des champignons, des virus et des bactéries (Van Toor et al., 2001 (Réf 12)). Il a été introduit en 1996 en tant qu'activateur de défenses pour le contrôle de l'oïdium des céréales en Allemagne et en Suisse (Ruess et al., 1996 (Réf 13)) et est également utilisé contre la pyraculariose du riz et différents mildious (Ishii et al., 1999 (Réf 14); Leroux, 2003 (Réf 15)). Il possède également des activités antibactériennes et antivirales. Sur plantes pérennes, peu d'études ont été réalisées (Brisset et al., 2005 (Réf 16)). L'ASM a été mis sur le marché sous le nom commercial de « Bion » mais dans la pratique, cette molécule n'a pas montré l'efficacité espérée (Alabouvette et al., 2003 (Réf 17)). Il a été démontré que NNA et l'ASM n'induisent pas directement des réactions de défense mais abaissent le seuil de réponse à un éliciteur fongique (Conrath et al., 2002 (Réf 18)).
[0016] Actuellement, le mode d'application utilisé consiste à injecter des sels de salicylate dans le bois de cep de vigne pour lutter contre Eutypa lata et Chondostereum purpureum (Spiers et Ward, 2001 (Réf 19)). L'injection d'acide salicylique sous forme de sels de potassium (18,5 g/L) dans le tronc de ceps cv. Sauvignon a montré une action intéressante à l'égard de l'Esca (45,4 % d'efficacité), le pourcentage de réexpression des symptômes étant beaucoup plus faible pour les plantes traitées que pour les plantes témoins. Cependant, l'efficacité du produit ne persiste pas puisque dix-huit mois après son application, le nombre de ceps exprimant l'Esca est identique dans le lot témoin et dans le lot traité (Larignon et Molot, 2004 (Réf 20)).
[0017] La cystéine est un acide aminé qui possède un groupement thiol (formule (IV)) et qui est présent dans la plupart des protéines. Bien que faiblement représenté, sa présence dans la composition des protéines est très importante, notamment parce qu'elle permet de former des ponts disulfures.
Figure imgf000008_0001
[0018] La cystéine peut intervenir dans les phénomènes de défense puisqu'il a été montré que lors de l'infection de pieds de tomate avec Verticillium dahliae, les concentrations en cystéine, sulfate et glutathion augmentent dans les tissus (Williams et al., 2002 (Réf 21 )).
[0019] Différents travaux ont montré que la cystéine possède une activité antifongique contre certains champignons. Ainsi, la cystéine, appliquée aux concentrations de 0,9 et 9 mM, inhibe le développement de Inonotus obliquus (Kahlos et Tikka, 1994 (Réf 22)). Des résultats comparables ont été obtenus avec Eutypa lata, l'agent pathogène de l'Eutypiose de la vigne. La cystéine inhibe le développement mycélien et induit également la mort de Eutypa lata (Octave et al., 2005 (Réf 23)). Il a également été montré que la cystéine inhibe la germination des spores $ Alternaria cassiae, Alternaria crassa et Alternaria macrospora (Daigle et Cotty, 1991 (Réf 24)).
[0020] La cystéine possède une autre action puisqu'elle provoque, chez Inonotus obliquus et chez Eutypa lata, un relargage d'ergostérol (Kahlos et Tikka, 1994 (Réf 22)) ; Octave et al., 2005 (Réf 23)) qui est un stérol d'origine fongique connu pour être un éliciteur non spécifique capable d'activer les réactions de défense de la plante (Granado et al., 1995 (Réf 24) ; Amborabé, 2000 (Réf 26) ; Amborabé et al., 2003 (Réf 27); Luini, 2003 (Réf 28) ; Rossard, 2003 (Réf 29)). L'activité de la cystéine est fortement liée à sa structure. En effet, une modification structurale ou un changement de la fonction chimique -SH abolit son efficacité. Des disques foliaires et des feuilles isolées de différentes espèces de plante exposés à de la L-cystéine émettent du SH2, un composé volatil, possédant potentiellement une activité antifongique (Sekiya et al., 1982 (Réf 30)). Un apport exogène de cystéine sur des disques de feuille de peuplier augmente la teneur en glutathion et en α-glutamylcystéine, deux molécules impliquées dans la protection des cellules contre les formes actives de l'oxygène lors des réactions de défense (Noctor et al., 1996 (Réf 31 )).
[0021] Cependant, la cystéine seule n'est pas suffisante dans une utilisation fongicide dans la mesure où même si elle présente une activité inhibitrice de la croissance de pathogène in-vitro, son activité in-vivo n'a pas été démontrée.
[0022] L'importance du fer dans les relations s'établissant entre divers micro-organismes pathogènes (bactéries, champignons) et leurs hôtes a été soulignée dans de nombreuses études (Weinberg, 1966 (Réf 32)). Dans l'interaction Botrytis cinerea I Vicia faba, des chélateurs de fer tels que l'EDTA (Acide éthylène diamine tétra acétique) et le DHBA (Acide dihydroxy benzoïque) augmentent l'agressivité des conidies de Botrytis cinerea. L'addition de sulfate ferrique (Fβ2(SO4)3) à l'inoculum traité par ces chélateurs réduit cette agressivité (Brown et Swinburne, 1982 (Réf 33)). La présence de sulfate de fer inhibe la formation et le développement de lésions nécrotiques provoquées par Botrytis fabae et Botrytis cinerea sur des feuilles détachées de Vicia faba (Vedie et Le Normand, 1984 (Réf 34)).
[0023] En viticulture, le sulfate de fer est apporté à la vigne pour lutter contre des carences ferriques responsables de chloroses. La lutte contre les chloroses se fait par un apport au niveau du sol ou au niveau des feuilles. Il est à noter que l'apport recommandé par le sol est de 1 kg/pied avec 10 L de solvant (10 %) (eau ou vinasse) alors qu'en pulvérisation foliaire, le sulfate de fer est utilisé à 1 % pour un volume d'eau de 300
L/ha.
[0024] Le fosétyl-aluminium (tris-o-éthylphosphonate d'aluminium), testé initialement comme anti transpirant, a montré un effet protecteur vis- à-vis du mildiou de la vigne et est utilisé contre de nombreuses espèces de
Phytophtora. Il inhibe la germination du sporange et la pénétration du mycélium dans la plante. Il limite également le développement mycélien et la sporulation de Plasmopara viticola, l'agent du mildiou de la vigne (Gouot, 2006 (Réf 35)). Les phosphonates ne montrent pas d'activité fongicide ou fongistatique lorsqu'ils sont utilisés seuls mais une inhibition de la croissance de Phaeomoniella chlamydospora est notée lorsqu'ils sont associés avec le resvératrol (Mazullo et al., 2000 (Réf 36)).
[0025] La plante décompose le fosétyl -aluminium en acide phosphoreux et en éthanol puis en acide phosphonique lors de l'absorption
(Leconte et al., 1988 (Réf 37)) (voir le schéma V).
Figure imgf000010_0001
[0026] Le fosétyl -al u minium stimule le système de défense des plantes. En préventif, il potentialise les réactions de défense de la plante et prépare les cellules à une attaque ultérieure par un agent pathogène. Les phosphonates agissent au niveau du métabolisme phosphaté des champignons et engendrent une production d'éliciteurs en plus grande quantité (Leroux, 2000 (Réf 38)). Cette hyper-élicitation provoque une synthèse accrue de molécules signal de type acide jasmonique, éthylène et acide salicylique et une transcription accélérée des gènes de défense aboutissant à la synthèse de phytoalexines (resvératrol, ε-viniférine), de composés phénoliques, de protéines PR telles que des chitinases et des glucanases (Dercks et Creasy, 1989 (Réf 39) ; Lacombe, 2003 (Réf 40); Molina et al., 1998 (Réf 40) ; Nemestothy et Guest, 1990 (Réf 42) ; Serrano ét al., 1994 (Réf 43)).
[0027] Le fosétyl -al u minium et l'acide phosphonique sont des produits systémiques ambimobiles (Leconte et al., 1988 (Réf 37) ; Leroux, 2000
(Réf 38) ; Leroux, 2003 (Réf 44)). Le transport du fosétyl-aluminium, étudié sur cotylédons de Ricinus communis L., est similaire à celui du saccharose dans la plante. Il est détecté dans l'exsudat phloémien 30 min après application. L'absorption maximale a lieu à pH 5,0. Il est également détecté dans les exsudats racinaires de Lycopersicon esculentum Mil. et Persea indica L. en culture hydroponique (Ouimette et Coffey, 1990 (Réf 45)).
[0028] Différents travaux portant sur l'effet du fosétyl-alu minium sur des vignes atteintes d'Esca ont été réalisés. Des essais en serre ont montré que cinq traitements réalisés avec du fosétyl-alu minium (Aliette 80 WP) sur des vignes âgées de 2 ans et ensuite inoculées par Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum permettent de diminuer la surface des nécroses dans le bois par rapport à des vignes non traitées. Les deux champignons sont isolés après traitement (Di Marco et al., 2000 (Réf 46); Mazullo et al., 2000 (Réf 47); Di Marco et Osti, 2005 (Réf 48)). Des expériences associant le fosétyl-aluminium au mancozèbe, au cimoxanil et/ou à l'oxychlorure de cuivre et réalisées au vignoble conduisent à une diminution du nombre de ceps exprimant des symptômes foliaires. Par contre, le fosétyl-aluminium n'influe pas sur le nombre de pieds morts (Di Marco et Osti, 2005 (Réf 48)). Ces résultats démontrent que ce composé n'est pas fongicide vis-à-vis des champignons impliqués dans les maladies du bois.
[0029] II existe donc un réel besoin de trouver de nouvelles compositions fongicides palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un procédé permettant de maîtriser les quantités de fongicides administrés, de réduire les coûts, d'améliorer l'efficacité des fongicides afin d'inhiber totalement le développement des agents pathogènes. Cela permet aussi de limiter la quantité des différentes matières actives utilisées afin de diminuer la toxicité et l'impact environnemental des fongicides. Description de l'invention
[0030] La présente invention a précisément pour but de répondre aux besoins et inconvénients de l'art antérieur en fournissant une composition antifongique.
[0031] La présente invention a pour objet une composition antifongique comprenant au moins deux des composés choisis dans le groupe constitué par la cystéine, l'acide salicylique, le sulfate de fer (II) et le fosétyl- aluminium.
[0032] Les inventeurs ont découvert de manière surprenante et inattendue que la composition de l'invention a une activité antifongique bien supérieure à celles de l'état de la technique et permet ainsi d'avoir un effet antifongique avec une composition avec des quantités de composés faibles.
[0033] En outre, les inventeurs ont démontré que les composés utilisés dans la composition de l'invention présentent une synergie d'action, qui peut permettre également de diminuer l'apparition de « résistants ».
[0034] De manière préférée, la composition de l'invention comprend au moins trois composés choisis dans le groupe constitué par la cystéine, l'acide salicylique, le sulfate de fer (II) et le fosétyl-aluminium.
[0035] De manière encore plus préférée, la composition de l'invention comprend la cystéine, l'acide salicylique, le sulfate de fer (II) et le fosétyl- aluminium.
[0036] Dans la présente par « antifongique », on entend une molécule qui agit contre les pathologies provoquées par des champignons, des bactéries, des phytoplasmes, des virus, des levures, de manière préférée des champignons et/ou levures.
[0037] De manière préférée, la composition est une composition fongicide et/ou fongistatique.
[0038] Selon la présente invention, par « fongicide » il est entendu une composition qui est capable de provoquer la mort des champignons, des bactéries, des phytoplasmes, des virus, des levures, de manière préférée des champignons et/ou levures.
[0039] Selon la présente invention, par « fongistatique », il est entendu une composition qui est capable de stopper la croissance des champignons des bactéries, des phytoplasmes, des virus, des levures, de manière préférée des champignons et/ou levures.
[0040] Dans la présente par « cystéine », on entend un acide-α-aminé naturel ou un acide aminé obtenu par synthèse chimique qui possède un groupement sulfhydryle ou thiol (SH). Par exemple il peut s'agir de la L- cystéine de formule (IV) suivante :
Figure imgf000013_0001
de la D-cystéine, d'un acide aminé dérivé de la cystéine, par exemple de l'acétylcystéine, de la carbocystéine ou carboxyméthylcystéine, ou toute autre molécule dérivant de la cystéine et qui conserve un radical cystéine.
[0041] Selon l'invention, la concentration de la cystéine dans la composition de l'invention peut être comprise entre 0,01 et 150 mM. De manière préférée, la concentration de cystéine est comprise entre 1 à 120 mM, de manière encore plus préférée entre 4 et 65 mM.
[0042] Dans la présente par « acide salicylique » on entend l'acide 2- hydroxybenzoïque ou un dérivé de celui-ci. Par exemple, l'acide salicylique peut être synthétisé naturellement, par exemple extrait de l'écorce de saule blanc ou par synthèse chimique, par exemple selon réaction de Kolbe (ou Kolbe-Schmitt).
[0043] Selon l'invention, la concentration de l'acide salicylique dans la composition de l'invention peut être comprise entre 0,01 et 4 mM. De manière préférée, la concentration de l'acide salicylique peut être comprise entre 0,1 et 3 mM, de manière plus préférée entre 0,4 et 1 ,5 mM. [0044] Dans la présente par « sulfate de fer (II) » on entend le composé de formule FeSO4 ou un dérivé de celui-ci. Par exemple, il peut d'agir du sulfate de fer hydraté (FeSO4,nH2O), du sulfate de fer heptahydraté (FeSO4JH2O), ou d'autres sels ferreux tels que du chlorure de fer (FeCI2), de l'acétate de fer (Fe(CH3CO2)2).
[0045] Selon l'invention, la concentration du sulfate de fer (II) dans la composition de l'invention peut être comprise entre 0,01 et 160 mM. De manière préférée, la concentration du sulfate de fer (II) peut être comprise entre 3 et 120 mM, de manière plus préférée entre 4 et 65 mM.
[0046] Dans la présente par « fosétyl-alu minium », on entend l'éthyl hydrogène phosphonate d'aluminium, ou l'aluminium tris(éthylphosphonate), ou l'aluminium tris-O-éthylphosphonate, C6Hi8AIO9P3.
[0047] Selon l'invention, la concentration du fosétyl-alu minium dans la composition de l'invention peut-être comprise entre 0,01 et 81 mM. De manière préférée, la concentration du fosétyl-alu minium peut être comprise entre 1 et 55 mM, de manière plus préférée entre 2 et 30 mM.
[0048] Selon l'invention, les limites supérieures de quantités des différents produits ont été déterminées lors de tests de phytotoxicité. A ces quantités des premiers symptômes sur les feuilles apparaissent. Les fourchettes de valeurs précitées sont donc celles qui sont préconisées pour qu'il n'y ait pas de symptômes sur les feuilles de manière générale. Ces quantités peuvent être légèrement différentes voir supérieures en fonction de la sensibilité de la plante. L'homme du métier saura aisément comment déterminer les quantités.
[0049] Selon l'invention, le pH de la composition de la présente invention peut être modifié pour être acide
[0050] Selon l'invention, la modificahon peut être réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier, par exemple par addition d'une solution acide, par exemple HCI, H2CO3. [0051] Selon l'invention, le pH de la composition peut être, par exemple inférieur à 7, par exemple de 4 à 6, de préférence de 4,5 à 5.
[0052] Un pH de la composition peut permettre avantageusement d'augmenter encore l'efficacité antifongique.
[0053] Selon l'invention, le pH de la composition peut être déterminé par tout procédé connu de l'homme du métier, par exemple au moyen d'un pH-mètre.
[0054] Selon l'invention, la composition peut être à usage agricole, vétérinaire et/ou médical.
[0055] Selon l'invention, la composition peut être sous une forme liquide, une émulsion, un onguent, une mousse, une pâte, une poudre ou un gel.
[0056] La composition de l'invention peut être fabriquée par toute méthode connue de l'homme du métier. Il peut s'agir par exemple d'un simple mélange, conduisant de préférence à une composition homogène.
[0057] L'invention a également pour objet un procédé de traitement d'une plante comprenant l'application de la composition de la présente invention.
[0058] L'invention a également pour objet un procédé de traitement et/ou traitement préventif comprenant l'application de la composition de la présente invention sur une plante, infectée par un agent pathogène et/ou sur une plante qui présente un risque d'infection par un agent pathogène.
[0059] L'application est telle que définie ci-dessous.
[0060] Dans la présente par « plante », il est entendu tout végétal vivant fixé en terre et dont la partie supérieure s'épanouit dans l'air ou dans l'eau douce. Par exemple, il peut s'agir de plantes ligneuses, par exemple des essences ligneuses indigènes, de vignes, par exemple des ceps des cépages Aligoté, Auxerrois, Cabernet franc, Cabernet-Sauvignon, Carmenère, Chardonnay, Colombard, Folignan, Folle blanche, Gamay, Gewurztraminer, Grenache, Jurançon blanc, Malbec, Merlot, Meslier Saint
François, Montils, Muscadelle, Muscadet, Petit verdot, Pinots, Poulsard, Riesling, Sauvignon, Savagnin, Sélect, Sémillon, Sylvaner, Syrah, Tokay, Trousseau, Ugni blanc.
[0061] Selon l'invention par « traitement », il est entendu, par exemple au moins une application de la composition de l'invention, par exemple sous une forme telle que décrite précédemment, susceptible de prévenir ou d'arrêter une infection, par exemple par arrêt de la croissance de l'agent pathogène et/ou par mort de l'agent pathogène.
[0062] Selon l'invention par « traitement préventif », il est entendu par exemple au moins une application de la composition de l'invention, par exemple sous une forme telle que décrite précédemment, susceptible de prévenir ou d'arrêter une infection, par exemple en évitant l'apparition d'une infection par un agent pathogène, par arrêt de la croissance de l'agent pathogène et/ou par mort de l'agent pathogène.
[0063] Dans la présente invention par « agent pathogène », il est entendu un agent choisi dans le groupe comprenant les champignons, les bactéries, les phytoplasmes, les virus et les levures. Par exemple, il peut s'agir des champignons Phaeomoniella chlamydospora, Phaeocremonium aleopholilum, Fomitiporia mediterranea, Strereum hirsutum, Phellinus igniarius, Eutypa lata, Botryosphaeria obtusa, Neofusicoccum parvum, Botryosphaeria dothidea, Botryosphaeria stevensii, Phomopsis viticole, Plasmopara viticola, Botrytis cinerea, Erysiphe necator. De manière préférée, les champignons Phaeomoniella chlamydospora et Phaeocremonium aleopholilum.
[0064] Selon le procédé de l'invention, l'application de la composition de l'invention peut être effectuée par tout moyen connu de l'homme du métier. Par exemple, l'application de la composition peut être effectuée par aspersion de la plante, arrosage, brumisation, badigeonnage, immersion, saupoudrage.
[0065] Selon l'invention, l'application de la composition peut être effectuée, avec des dispositifs divers, par exemple avec tout type de pulvérisateur agricole connu de l'homme du métier. L'homme du métier saura aisément déterminer le type de pulvérisateur susceptible d'être utilisé, par exemple il peut s'agir d'un pulvérisateur pneumatique tracté.
[0066] Selon l'invention, l'application de la composition peut être programmée, par exemple via un dispositif de programmation automatique avec une application quotidienne, hebdomadaire, mensuelle.
[0067] Selon l'invention, l'application de la composition peut être effectuée afin de maintenir une quantité constante de composition au niveau de la plante, par exemple l'application peut être effectuée au moins, une fois par mois, une fois par semaine, ou une fois par jour. L'homme du métier saura aisément adapter l'application de la composition en fonction de la plante et/ou de la quantité constante à maintenir.
[0068] D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.
Brève description des figures
[0069] La figure 1 présente un diagramme représentant la croissance mycélienne en mm sur milieu solide (YNB, glucose 50 mM, glutamine (GIn) 40 mM, MES 10 mM, pH 5,5) en fonction du temps d'incubation. Plus particulièrement, ce diagramme montre la cinétique de la croissance de Phaeomoniella chlamydospora (Pch) et Phaeoacremonium aleophilum (Pal).
[0070] La figure 2 présente un diagramme représentant la croissance mycélienne en mm de Phaeomoniella chlamydospora à 18 jours (A) et Phaeoacremonium aleophilum à 12 jours (B) sur un milieu solide (YNB, glucose 50 mM, glutamine 40 mM, HEPES 10 mM, pH 4,2) en fonction de la concentration en cystéine (Cys) dans le milieu.
[0071] La figure 3 présente un diagramme représentant la croissance mycélienne en mm de Phaeomoniella chlamydospora à 18 jours (A) et Phaeoacremonium aleophilum à 12 jours (B) sur un milieu solide (YNB, glucose 50 mM, glutamine 40 mM, HEPES 10 mM, pH 4,2) en fonction de la présence de différents sulfates dans le milieu à la concentration de 40 mM : sulfates d'ammonium (NH42(SO4)), de potassium (K2SO4), de magnésium (MgSO4), de fer (FeSO4) et de cuivre (CuSO4).
[0072] La figure 4 présente un diagramme représentant la croissance mycélienne en mm de Phaeomoniella chlamydospora à 18 jours (A) et Phaeoacremonium aleophilum à 12 jours (B) sur un milieu solide (YNB, glucose 50 mM, glutamine 40 mM, HEPES 10 mM, pH 4,2) en fonction de la concentration en sulfate de Fer (FeSO4) dans le milieu.
[0073] La figure 5 présente un diagramme représentant la croissance mycélienne en mm de Phaeomoniella chlamydospora à 18 jours (A) et Phaeoacremonium aleophilum à 12 jours (B) sur un milieu solide (YNB, glucose 50 mM, glutamine 40 mM, HEPES 10 mM, pH 4,2) en fonction de différentes concentrations en sulfate de fer (FeSO4), chlorure de fer (FeCI2) et acétate de fer (Fe(CH3CO2)2) dans le milieu.
[0074] La figure 6 présente un diagramme représentant la croissance mycélienne en mm de Phaeomoniella chlamydospora à 18 jours (A) et Phaeoacremonium aleophilum à 12 jours (B) sur un milieu solide (YNB, glucose 50 mM, glutamine 40 mM, HEPES 10 mM, pH 4,2) en fonction de différentes concentrations d'acide salicylique (AS) dans le milieu.
[0075] La figure 7 présente un diagramme représentant la croissance mycélienne en mm de Phaeomoniella chlamydospora à 18 jours (A) et Phaeoacremonium aleophilum à 12 jours (B) sur un milieu solide (YNB, glucose 50 mM, glutamine 40 mM, HEPES 10 mM, pH 4,2) en fonction de différentes concentrations en fosétyl -aluminium dans le milieu.
[0076] La figure 8 présente un diagramme montrant l'effet de l'association de la cystéine avec différentes concentrations en acide salicylique sur la croissance mycélienne en mm de Phaeomoniella chlamydospora à 18 jours (A) et Phaeoacremonium aleophilum à 12 jours (B) sur un milieu solide (YNB, glucose 50 mM, glutamine 40 mM, HEPES 10 mM, pH 4,2). Plus particulièrement, les différentes conditions d'incubation sont 5 mM de cystéine (Cys) et différentes concentrations d'acide salicylique (AS), utilisés seuls (I) ou associés (Ma).
[0077] La figure 9 présente un diagramme montrant l'effet de l'association de la cystéine et de l'acide salicylique avec différentes concentrations en sulfate de fer sur la croissance mycélienne en mm de Phaeomoniella chlamydospora à 18 jours (A) et Phaeoacremonium aleophilum à 12 jours (B) sur un milieu solide (YNB, glucose 50 mM, glutamine 40 mM, HEPES 10 mM, pH 4,2). Plus particulièrement, les différentes conditions d'incubation sont 5 mM de cystéine (Cys), 0,5 mM d'acide salicylique (AS) et différentes concentrations en sulfate de fer (FeSO4), utilisés seuls (I) ou associés par 2 (II) ou 3 (III).
[0078] La figure 10 présente un diagramme montrant l'effet de l'association de la cystéine, de l'acide salicylique, du sulfate de fer et du fosétyl-aluminium sur la croissance mycélienne en mm de Phaeomoniella chlamydospora à 21 jours (A) et Phaeoacremonium aleophilum à 13 jours (B) sur un milieu solide (YNB, glucose 50 mM, glutamine 40 mM, HEPES 10 mM, pH 4,2). Plus particulièrement, les différentes conditions d'incubation sont 5 mM de cystéine (Cys), 0,5 mM d'acide salicylique (AS), 5 mM de sulfate de fer (FeSO4 ou Fe) et 2,7 mM de fosétyl-aluminium (Fos Al), utilisés seuls (I) ou associés par 2 (II), 3 (III), ou 4 (IV).
[0079] La figure 11 présente un diagramme montrant l'effet de l'association de la cystéine, de l'acide salicylique, du sulfate de fer et du fosétyl-aluminium sur la croissance mycélienne en mm de Phaeomoniella chlamydospora à 18 jours (A) et Phaeoacremonium aleophilum à 12 jours (B) en milieu liquide (YNB, glucose 50 mM, glutamine 40 mM, HEPES 10 mM, pH 4,2). Plus particulièrement, les différentes conditions d'incubation sont 5 mM de cystéine (Cys), 0,5 mM d'acide salicylique (AS), 5 mM de sulfate de fer (FeSO4 ou Fe) et 2,7 mM de fosétyl-aluminium (Fos Al ou Fos), utilisées seuls (I) ou associés par 2 (II), 3 (III), ou 4 (IV).
[0080] La figure 12 présente un diagramme montrant l'effet de l'association de la cystéine, de l'acide salicylique, du sulfate de fer et du fosétyl-aluminium sur la germination des spores de Phaeomoniella chlamydospora (A) et Phaeoacremonium aleophilum (B) en milieu liquide (YNB, glucose 50 m M, glutamine 40 m M, HEPES 10 m M, pH 4,2) après 5 jour et observé par une modification de DO à 595 nm. Plus particulièrement, les différentes conditions d'incubation sont 5 mM de cystéine (Cys), 0,5 mM d'acide salicylique (AS), 5 mM de sulfate de fer (FeSO4 ou Fe) et 2,7 mM de fosétyl-aluminium (Fos Al ou Fos), utilisés seuls (I) ou associés par 2 (II), 3 (III), ou 4 (IV).
[0081] La figure 13 présente une courbe de réversibilité de la croissance mycélienne en mm de Phaeomoniella chlamydospora (A, B et C) et de Phaeoacremonium aleophilum (A' et B') traités par différentes molécules de l'invention pendant 8 (A, A'), 15 (B, B') et 21 (C) jours et après passage sur un milieu nutritif sans molécules antifongiques (YNB, glucose 50 mM, glutamine 40 mM, HEPES 10 mM, pH 4,2). Plus particulièrement, les différentes conditions d'incubation sont 5 mM de cystéine (Cys), 0,5 mM d'acide salicylique (AS), 5 mM de sulfate de fer (FeSO4 ou Fe) et 2,7 mM de fosétyl-aluminium (Fos Al ou Fos), associés par 2 (II), 3 (111), ou 4 (IV).
[0082] La figure 14 présente un diagramme représentant la croissance mycélienne en mm de différentes souches de Phaeomoniella chlamydospora à 18 jours (A) et de Phaeoacremonium aleophilum à 12 jours (B) en fonction de la présence de 5 mM de cystéine (Cys), 0,5 mM d'acide salicylique (AS), 5 mM de sulfate de fer (FeSO4) et 2,7 mM de fosétyl-aluminium (Fos Al) sur un milieu nutritif solide (YNB, glucose 50 mM, glutamine 40 mM, HEPES 10 mM, pH 4,2).
[0083] La figure 15 présente des photographies de feuilles de vigne deux semaines après un traitement foliaire avec différentes compositions de l'invention sur des boutures de Cabernet Sauvignon (A et B) et après quatre traitements, réalisés à 14 jours d'intervalle, sur des boutures d'Ugni blanc (C, D, E, F). Plus particulièrement, ce diagramme permet de vérifier l'innocuité de l'invention sur la vigne. A et C : boutures non traitées, D : Traitement avec cystéine (5 mM), acide salicylique (0,5 mM) et un mouillant (Etaldyne 95, Fertiligène), E : traitement avec sulfate de fer (5 mM), fosétyl-aluminium (2,7 mM) et un mouillant (Etaldyne 95, Fertiligène), F : traitement avec cystéine (5 mM), acide salicylique (0,5 mM), sulfate de fer (5 mM), fosétyl-aluminium (2,7 mM) et un mouillant (Etaldyne 95, Fertiligène).
[0084] La figure 16 présente les empreintes de sarments provenant de boutures inoculées avec un agents pathogènes (Phaeomoniella chlamydospora) et réalisées 14 jours après 1 , 2, 3 ou 4 traitements desdites boutures en présence de différentes compositions de l'invention. Plus particulièrement, les empreintes sont révélées avec des anticorps ant\-Phaeomoniella chlamydospora. A : boutures non inoculées, B : boutures non traitées, C : boutures traitées avec de l'acide salicylique (0,5 mM), de la cystéine (5 mM) et un mouillant (Etaldyne 95, Fertiligène), D : boutures traitées avec du sulfate de fer (5 mM), du fosétyl-aluminium (2,7 mM) et un mouillant (Etaldyne 95, Fertiligène), E : boutures traitées avec du sulfate de fer (5 mM), du fosétyl-aluminium (2,7 mM), de l'acide salicylique (0,5 mM), de la cystéine (5 mM) et un mouillant (Etaldyne 95, Fertiligène), + : témoin positif correspondant à 5 ng de protéines (F2) de Phaeomoniella chlamydospora et disposé pour chaque révélation.
[0085] La figure 17 présente les empreintes de sarments provenant de boutures inoculées avec un agent pathogène (Phaeoacremonium aleophilum) réalisées 14 jours après 2 ou 4 traitements desdites boutures en présence de différentes compositions de l'invention. B : bouture non traitées, C : boutures traitées avec de l'acide salicylique (0,5 mM), de la cystéine (5 mM) et un mouillant (Etaldyne 95, Fertiligène), D : boutures traitées avec du sulfate de fer (5 mM), du fosétyl-aluminium (2,7 mM) et un mouillant (Etaldyne 95, Fertiligène), E : boutures traitées avec du sulfate de fer (5 mM), du fosétyl-aluminium (2,7 mM), de l'acide salicylique (0,5 mM), et de la cystéine (5 mM) et un mouillant (Etaldyne 95, Fertiligène). + : témoin positif correspondant à 5 ng de protéines (F2) de Phaeoacremonium aleophilum et disposé pour chaque révélation.
EXEMPLES
[0086] Dans les exemples ci-dessous, les différentes mesures ou expériences ont été réalisées selon les protocoles décrits ci-dessous. Matériels biologiques et conditions de culture
Matériels fongiques
[0087] Les souches de Phaeomoniella chlamydospora W. Gams, Crous et Phaeoacremonium aleophilum W. Gams, Crous, MJ. Wingfield, L. Mugnaï utilisées ont été isolées et référencées dans le cadre du projet européen « Maîtrise de l'Esca et respect de l'environnement ». Elles ont été fournies par P. Larignon (ITV de Nîmes) et J. -P. Péros (INRA de Montpellier). Parmi les différentes souches, deux ont été principalement utilisées dans le cadre de nos recherches : PC-PC 37 et PA-PC 24. Ces souches ont été isolées à la fondation Fougerat sur la commune de Graves (16), à partir de ceps de vigne cv. Ugni blanc atteints d'Esca. Le tableau 1 présente les références des souches utilisées ainsi que la commune et le cépage sur lequel elles ont été isolées.
Tableau 1 : Référence et origine des différentes souches utilisées
(Borie et al., 2002 (Réf 49))
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[0088] D'autres champignons ont été également utilisés afin de tester la spécificité des anticorps : Alternaria sp., Botryosphaeήa obtusa, Neofusicoccum parvum, Botrytis cinerea, Cladosporium sp., Cylindrocarpon destructans, Epicoccum sp., Eutypa lata, Fusaήum sp., Paecilomyces sp., Pénicillium sp., Pestalotia sp., Phoma sp., Phomopsis viticola, Pullularia sp., Trichoderma atroviride, Trichoderma harzianum et Verticillium chlamydosporum. Les souches ont été identifiées et fournies par P. Larignon (I.F.V. Pôle Rhône-Méditerranée).
Conditions de culture in vitro des champignons.
Composition du milieu nutritif de base
[0089] Les champignons ont été cultivés sur un milieu totalement synthétique composé de YNB (Yeast Nitrogen Base sans acide aminé et sulfate d'ammonium ; DIFCO 233520) à 1 ,7 g/L, de glucose à 50 mM
(Sigma G5767) et de glutamine à 40 mM (Sigma P0380). Le pH a été ajusté à 5,5 ou à 4,2 pour le test de molécules, et le milieu est autoclave
15 min à 1100C.
Milieu solide
[0090] Le milieu ci-dessus a été solidifié par de l'agar à 20 g/L (Sigma
A1296). Les souches ont été cultivées en boîte de Pétri de 9 cm de diamètre à l'obscurité et à 25°C, température moyenne favorable au développement de Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum. Les souches ont été conservées sous forme de disques mycéliens dans de l'eau stérile à l'obscurité à 4°C.
Milieu liquide
[0091] Les cultures en milieu liquide ont été réalisées en erlenmeyer contenant 300 mL du milieu défini précédemment, inoculé avec trois disques de gélose de 1 cm de diamètre sur lesquels s'est développé l'inoculum.
Test d'activité biologique
[0092] Les tests avec les différentes molécules en milieu solide (sources azotées, sources carbonées et molécules antifongiques) ont été réalisés en boîtes 6 puits de diamètre 35 mm. Le milieu a été tamponné à pH 4,2 avec de l'HEPES 10 mM pour les molécules antifongiques. Les molécules à tester ont été ajoutées avant solidification du milieu. Le milieu a été inoculé avec un disque mycélien de 4 mm de diamètre à partir d'une culture mère en milieu solide.
[0093] Les tests sur l'effet des molécules antifongiques sur la germination des spores ont été réalisés en plaque 96 puits. Le milieu nutritif de base (YNB ou « Yeast Nitrogen Base »), glucose 50 mM, glutamine 40 mM, HEPES 10 mM pH 4,2) est autoclave 15 min à 1100C. Les différents composés à tester ont été ajoutés au milieu refroidi. 200 μL du milieu d'essai sont déposés par puits et ensemencés avec 50 000 spores. Les microplaques ont été mises sous agitation (160 rpm) à 22°C et à l'obscurité. L'absorbance a été mesurée à 595 nm tous les deux ou trois jours à l'aide d'un lecteur de microplaques (Sunrise reader, Tecau). Avant la lecture de l'absorbance, la plaque a été mise en agitation 5 s afin d'homogénéiser le contenu des puits. Mesure des paramètres de croissance des champignons
En milieu solide
[0094] Le diamètre du développement du champignon a été mesuré à l'aide d'une règle graduée tous les deux jours pendant un mois.
En milieu liquide [0095] Trois paramètres ont été suivis au cours du développement des champignons en milieu liquide : la masse sèche de mycélium, le pH du milieu de culture et la concentration en protéines sécrétées dans le milieu.
[0096] Au moment choisi, le milieu de culture liquide a été centrifugé 30 min à 20000 x g à 4°C afin de mettre en culot le mycélium et les spores. Le culot obtenu après centrifugation a été mis à sécher à l'étuve à 600C pendant 24 h afin de déterminer la masse sèche du champignon. Le surnageant a été récupéré et passé sur filtre dont les pores font 0,22 μm de diamètre (Whatman) afin d'éliminer totalement les spores et le mycélium restant. Le pH du surnageant a été alors mesuré grâce à un pH- mètre (pH 526, WTW). La concentration en protéines a été mesurée selon la technique de Bearden (1978) (Réf 50). Cette technique consiste à ajouter 100 μL de Triton X-100 à 0,1 % (p/v) à x μL contenant les protéines à doser, x correspond à 100 μL pour le dosage des protéines contenues dans le milieu de culture des champignons, 10 μL pour le dosage des protéines de la fraction F2. Après 10 min d'incubation, le volume est complété à 1 mL avec de l'eau milliQ. 1 mL de milieu réactionnel de Bearden est ajouté. La lecture de l'absorbance est effectuée à 595 nm après 10 min d'attente. La gamme étalon est réalisée avec l'albumine bovine sérique (BSA).
Conditions de culture du matériel végétal
[0097] Les vignes Vitis vinifera L. étaient de l'Ugni blanc (cépage majoritairement utilisé pour la production de Cognac puisqu'il représente 95 % de l'encépagement en blanc) et du Cabernet Sauvignon (cépage noir).
[0098] Les plantes ont été obtenues par bouturage à partir de sarments prélevés au vignoble. Pour cela, une bouture formée de deux nœuds séparés par un entre-nœud a été prélevée. Le bourgeon inférieur a été supprimé à l'aide d'un sécateur. La bouture ainsi obtenue a été mise dans un pot contenant du terreau additionné de pouzzolane et a été arrosée tous les trois jours avec de l'eau. Lorsque les racines et les feuilles ont été suffisamment développées (4 feuilles), les boutures sont alors arrosées avec un solution nutritive composée de nitrate de potassium, phosphate monoammonique, phosphate monopotassique, sulfate de magnésium, nitrate de calcium, d'oligoéléments (B, Cu, Mn, Mo, Zn) et de Séquestrène (marque enregistrée) (Syngenta). Les plantes ont été éclairées 16 h par jour principalement avec la lumière naturelle et des lampes à vapeur de sodium (Philips SON-T, 423 W) lorsque la quantité de radiations lumineuses était trop faible. La température moyenne était de 22°C ± 2°C et l'humidité de 70 % ± 10 %.
Inoculation des boutures
[0099] Les boutures ont été inoculées sélectivement, dans une cavité de 1 cm de profondeur réalisée dans la partie apicale, avec un disque de gélose de 4 mm de diamètre sur lequel se sont développés les mycéliums de Phaeomoniella chlamydospora (souche PC-PC37) ou Phaeoacremonium aleophilum (souche PA-PC 24). Du coton hydrophile a été ensuite déposé sur le disque de gélose et l'ensemble a été entouré de parafilm puis mis en terre. Traitement sur boutures
[00100] Les boutures ont été traitées par pulvérisation foliaire jusqu'à ruissellement. Les molécules testées étaient la L-cystéine (Sigma), l'acide salicylique (Sigma), le sulfate de fer FeSθ4 heptahydraté (7H2O) (Sigma) et le fosétyl-aluminium (Aliette 80, KB jardin). Un mouillant (Etaldyne 95, Alkylphénoloxyéthylène, Fertiligène) a été utilisé à la concentration de 0,5 mL/L afin d'optimiser la surface de contact entre la composition et la feuille. La composition a été pulvérisée sur la plante à pH 4,5.
Plantes au vignoble
[00101] Les plantes utilisées en conditions naturelles provenaient d'une parcelle d'Ugni blanc plantée en 1974 située en Grande Champagne. Les vignes étaient conduites en Guyot double à plat. Les rangs étaient séparés de 3 m et les ceps de 1 ,3 m. La densité était de 2564 ceps à l'hectare.
Méthodes biochimiques
Synthèse des anticorps
[00102] Deux synthèses d'anticorps ont été réalisées : une dirigée contre les protéines sécrétées par Phaeomoniella chlamydospora et l'autre contre les protéines sécrétées par Phaeoacremonium aleophilum. Deux lapins ont été immunisés pour chaque synthèse d'anticorps. Les protéines sécrétées dans le milieu de culture ont été lyophilisées et mises en suspension dans de l'eau milliQ puis l'échantillon a été passé sur résine Sephadex G25 (PD 10, GE Healthcare) afin d'éliminer les sels contenus dans le milieu nutritif. La fraction contenant les protéines a été lyophilisée à nouveau puis mise en suspension dans du PBS (tampon sulfate salin ou « phosphate buffer saline ») (NaH2Pθ4 4,4 m M, Na2HPθ4 16 m M, NaCI 300 mM, pH 7,4). Les protéines ont été dosées selon la technique de Bearden. Une quantité de 1 mg de protéines à injecter par lapin a été nécessaire afin de réaliser l'immunisation.
[00103] La synthèse des anticorps a été confiée à la société Agrobio (La Ferté Saint Aubin). Le protocole d'obtention des anticorps dure 77 jours. Quatre injections d'antigènes de 250 μg de protéines par lapin sont réalisées. Des prélèvements à J49, à J68 et à J77 (correspondant au prélèvement final) sont effectués.
[00104] Les anticorps obtenus lors du prélèvement final ont été ensuite purifiés par chromatographie d'affinité sur protéines A. Les protéines A ont la propriété d'interagir spécifiquement avec la partie Fc des immunoglobulines de mammifères.
Hybridation des anticorps - Méthode des empreintes (« dot-blot ») [00105] Cette technique a été utilisée afin de détecter des protéines circulantes dans la plante grâce à un anticorps dirigé spécifiquement contre ces protéines.
[00106] Une empreinte d'un sarment a été réalisée immédiatement après section, en appliquant la zone sectionnée au contact de la membrane (HybondTM-ECLTM, GE Healthcare) pendant 10 secondes. La fixation des protéines a été réalisée en laissant sécher la membrane pendant 30 min à température ambiante. La membrane a été ensuite rincée 5 min dans du PBS 20 mM pH 7,4 additionné de Tween 20 à 0,2 % (v/v) puis elle a été mise à incuber une nuit à 4°C dans du tampon de saturation (PBS 20 mM pH 7,4 ; protéines de lait 3 % ; Tween 20 0,2 %) afin de bloquer les sites aspécifiques. La suite du protocole (hybridation des anticorps et révélation) était sensiblement identique à celle du western blot décrit précédemment. La membrane a été mise à incuber 120 minutes au contact de l'anticorps primaire dilué dans le tampon de saturation à 1/250. Trois rinçages de dix minutes avec le tampon de saturation ont été ensuite réalisés. La membrane a été alors incubée dans l'anticorps secondaire couplé à la peroxydase, dilué au 1/2000 avec le tampon de saturation pendant 90 minutes. La membrane a été rincée pendant 10 minutes avec le tampon de saturation puis deux fois 10 minutes avec du PBS 20 mM pH 7,4 protéines de lait 3 % et enfin deux fois 5 minutes avec du PBS 20 mM pH 7,4.
Révélation
[00107] La révélation des complexes antigènes-anticorps formés est réalisée grâce à un kit (kit ECL RPN 2106, GE Healthcare) contenant le substrat de la peroxydase conjuguée à l'anticorps secondaire. L'interaction entre le substrat et l'enzyme provoque l'émission de lumière capable d'impressionner un film photographique (Hyperfilm, GE Healthcare). Le film a été ensuite traité par un révélateur (llford llfotec LC 29) dilué au 1/10 puis par un fixateur (llford Rapid Fixer) dilué au 1/10. Exemple 1 : Test de composés sur Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum
1. Effet de molécules soufrées
1.a. Effet de la cvstéine
[00108] Les inventeurs ont montré que la cystéine ralentit la croissance de Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum (Figure 2). Une observation identique a été observée avec d'autres champignons tels que Inonotus obliquus (Kahlos et Tikka, 1994 (Réf22)), Alternaria sp. (Daigle et Cotty, 1991 (Réf 24)), Botrytis cinerea (Leroux, 1994 (Réf 51 )) et lors de travaux réalisés précédemment sur Eutypa lata (Amborabé et al., 2005 (Réf 52) ; Octave et al., 2005 (Réf 23)).
[00109] L'effet de différentes concentrations en cystéine sur la croissance fongique de Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum a été étudié. Les résultats obtenus sont réprésentés dans le tableau 2 ci-dessous et dans la figure 2.
Tableau 2 : Tableau des résultats concernant la cystéine
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- : pas d'inhibition ; MNB : milieu nutritif de base [00110] Ces résultats démontrent que la croissance mycélienne des deux champignons est inhibée par la cystéine aux concentrations de 5 mM et 10 mM malgré la présence d'une autre source azotée (glutamine à 40 mM) dans le milieu nutritif. Le ralentissement du développement mycélien est donc lié à un effet inhibiteur de la cystéine et pas à un problème d'assimilation par les champignons.
[00111] Tel que démontré ici, la cystéine seule inhibe uniquement le développement de Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum à des concentrations relativement élevées. La sensibilité des deux champignons à la cystéine est différente.
1.b. Effet des sulfates
[00112] Parmi les différentes sources azotées ralentissant le développement des champignons, les inventeurs ont observé que le sulfate d'ammonium (40 mM), utilisé comme seule source azotée, ralentit la croissance de Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum. (résultats non présentés).
[00113] Afin de savoir si d'autres sulfates possèdent la même propriété que le sulfate d'ammonium, les sulfates de potassium, de magnésium, de fer ferreux (Fe2+) et de cuivre ont été testés à la concentration de 40 mM et ajoutés au milieu nutritif de base (MNB).
[00114] Les résultats sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous et dans la figure 3. Tableau 3 : Tableau des résultats concernant le sulfates d'ammonium ((NH4J2SO4), potassium (K2SO4) et magnésium (MgSO4).
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000031_0001
- : pas d'inhibition
[00115] Le sulfate de fer et le sulfate de cuivre inhibent totalement la croissance mycélienne de Phaeomoniella chlamydospora et
Phaeoacremonium aleophilum à des concentrations de 40 mM.
[00116] Le sulfate de cuivre est déjà largement utilisé (bouillie bordelaise) en viticulture afin de lutter contre différentes maladies (mildiou, bactériose, nécrose bactérienne).
[00117] Néanmoins, la grande utilisation du cuivre (famille des métaux lourds) fait que les sols sont de plus en plus pollués (Brun et Geoffrion,
2003 (Réf 53)). De plus, le sulfate de cuivre ne peut pas être mélangé au fosétyl-aluminium. De ce fait, le sulfate de cuivre n'a pas été retenu.
1.c. Effet de différentes concentrations en sulfate de fer (FeSO4) sur la croissance mvcélienne
[00118] Les résultats sont présentés dans le tableau 4 et dans la figure 4 (A et B).
Tableau 4 : résultats concernant différentes concentrations en sulfate de fer (FeSO4).
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Figure imgf000032_0001
[00119] Tel que démontré ci-dessus, le sulfate de fer inhibe plus fortement la croissance de Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum à des concentrations de 5 mM et 10 mM.
[00120] Le soufre ne semble pas jouer un rôle dans l'efficacité des différents sulfates puisqu'il n'y a pas inhibition de la croissance des champignons en présence de sulfate d'ammonium, de potassium et de magnésium. Afin de savoir si l'efficacité de la molécule provient du fer, d'autres molécules présentant du fer sous forme ferreux (Fe2+) ont été testées : chlorure de fer (FeCI2) et acétate de fer (Fe(CH3CO2)2) aux concentrations de 5, 10 et 20 mM.
[00121] La figure 5 A montre que la croissance de Phaeomoniella chlamydospora est inhibée en présence de sulfate, de chlorure et d'acétate de fer d'une manière dose dépendante. L'inhibition provoquée par le chlorure de fer est comparable à celle obtenue avec le sulfate de fer quelle que soit la concentration appliquée. L'inhibition due à l'acétate de fer est légèrement diminuée à 5 mM. En effet, elle est de 40 % alors que celle obtenue avec le sulfate de fer est de 65 %. A la concentration de 10 mM, le développement fongique est totalement inhibé avec l'acétate de fer, ce qui n'est pas le cas avec le sulfate et le chlorure de fer. A 20 mM, la croissance de Phaeomoniella chlamydospora est totalement inhibée quelque soit la molécule ferreuse testée.
[00122] La figure 5 B montre que le sulfate, le chlorure et l'acétate de fer inhibent également le développement de Phaeoacremonium aleophilum de façon dose dépendante. A 5 mM, la croissance de Phaeoacremonium aleophilum est plus inhibée avec le sulfate de fer qu'avec le chlorure et l'acétate de fer. A la concentration de 10 mM, l'inhibition provoquée par le chlorure et le sulfate de fer est de 75 %. Par contre, l'inhibition observée avec l'acétate de fer est plus faible puisqu'elle atteint 45 %. A la concentration de 20 mM, le développement fongique est totalement inhibé avec le chlorure et l'acétate de fer. Phaeoacremonium aleophilum se développe légèrement dans le milieu contenant le sulfate de fer.
[00123] Tel que démontré ci-dessus, les expériences réalisées avec différents sels ferreux montre que l'efficacité de la molécule peut donc être attribuée à l'atome de fer puisque toutes les molécules ferreuses testées possèdent la même capacité à inhiber le développement mycélien de Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum.
2. Effet de l'acide salicylique
[00124] Les résultats présentés figure 6 A montrent que l'acide salicylique n'inhibe pas le développement fongique de Phaeomoniella chlamydospora aux concentrations de 0,05 mM et 0,1 mM. A 0,5 mM, la croissance a été inhibée de 10 % et à 1 mM de 28 %.
[00125] L'acide salicylique a donc peu d'effet sur la croissance mycélienne de Phaeomoniella chlamydospora. Des concentrations supérieures en acide salicylique n'ont pas été testées car à fortes concentrations, des problèmes de phytotoxicité peuvent être notés.
[00126] La figure 6 B montre que le développement de Phaeoacremonium aleophilum est légèrement inhibé à 0,05 mM. A 0,5 mM, la croissance a été inhibée de 50 % et à 1 mM, elle est totalement inhibée.
[00127] Tel que démontré dans cette expérience, l'acide salicylique seul inhibe faiblement le développement de Phaeomoniella chlamydospora et plus fortement celui de Phaeoacremonium aleophilum.
3. Effet du fosétyl d'aluminium
[00128] Différentes concentrations en fosétyl-alu minium ont été testées sur la croissance de Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum (Figure 7).
[00129] Les résultats présentés dans la figure 7 A montrent que le fosétyl -al u minium n'a pas d'effet sur la croissance de Phaeomoniella chlamydospora à 0,3 mM. Le développement mycélien de Phaeomoniella chlamydospora est faiblement inhibé à 1 mM (6 %) et 1 ,7 mM (14 %). A des concentrations supérieures, l'inhibition est plus importante : elle atteint 46 % à 2,7 mM et 86 % à 3,4 mM.
[00130] La figure 7 B montre que le fosétyl -aluminium n'a pas d'effet à 0,3 mM et 1 mM sur la croissance de Phaeoacremonium aleophilum. Une faible inhibition de l'ordre de 6 % est observée à la concentration de 1 ,7 mM. A des concentrations supérieures, la croissance est inhibée de 30 % à 2,7 mM et 45 % à 3,4 mM.
[00131] Tel que démontré ci-dessus, le fosétyl -aluminium seul inhibe la croissance mycélienne de Phaeomoniella chlamydospora et plus faiblement celle de Phaeoacremonium aleophilum. La sensibilité de Phaeoacremonium aleophilum vis-à-vis du fosétyl fosétyl-aluminium est donc plus faible que celle de Phaeomoniella chlamydospora.
Exemple 2 : Test de l'activité fongicide d'exemples de composition de l'invention sur Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum
[00132] Dans cet exemple, pour chaque molécule, la concentration utilisée est celle pour laquelle la croissance a été environ inhibée de 50 %. Ensuite, les molécules ont été associées les unes aux autres par deux puis par trois puis toutes ensemble.
[00133] Une analyse de la synergie du mélange des différentes molécules a été réalisée. Cette analyse consiste à comparer l'efficacité du mélange observée expérimentalement (E') à l'efficacité théorique calculée
(E) grâce à la formule de Colby (1967) (Réf 54), ceci en connaissant l'efficacité de chacun des produits.
E = (x + y) -(x . y)/100
E : pourcentage d'efficacité théorique de l'association du 1er produit et du 2ème produit
x : pourcentage d'efficacité du 1er produit y : pourcentage d'efficacité du 2eme produit
[00134] Lorsqu'il y a une synergie des produits, l'efficacité expérimentale (E') du mélange est supérieure à l'efficacité théorique calculée (E). 1. Association cystéine/acide salicylique
[00135] L'inhibition a été mesurée sur une culture en milieu solide. Le milieu ainsi que les conditions de culture sont décrits dans la partie précédente.
[00136] La cystéine, à la concentration de 5 mM, et l'acide salicylique, à différentes concentrations allant de 0,05 mM à 1 mM, ont été testés seuls ou associés afin d'étudier leur impact sur la croissance mycélienne.
[00137] La figure 8 A montre que la croissance de Phaeomoniella chlamydospora est inhibée de 98 % (E') en présence du mélange cystéine/acide salicylique 1 mM ce qui est supérieur à l'effet seul induit par chaque composé et à l'addition des effets produits par chaque composés séparément. Le calcul par la formule de Colby (E=60 %) démontre qu'il s'agit d'un effet synergique.
[00138] De même, pour Phaeoacremonium aleophilum (Figure 8 B), l'association des deux molécules cystéine/acide salicylique permet de diminuer la croissance mycélienne. Cet effet est dans chaque cas dû à un effet de synergie des molécules (E'=35>E=34 pour cystéine/acide salicylique 0,05 mM ; E'=52>E=45 pour cystéine/acide salicylique 0,1 mM ;
E'=80 %>E=64 % pour cystéine/acide salicylique 0,5 mM ; E'=E=100 pour cystéine/acide salicylique 1 mM).
[00139] La composition comprenant la cystéine et l'acide salicylique inhibe la croissance des agents pathogènes et présente un effet synergique.
2. Composition comprenant du sulfate de fer, de la cystéine et de l'acide salicylique
2.a. Cystéi ne/sulfate de fer : [00140] Les résultats présentés dans la figure 9 montrent que l'association de la cystéine et du sulfate de fer à 5, 10 et 20 mM permet de diminuer la croissance de Phaeomoniella chlamydospora et de Phaeoacremonium aleophilum.
[00141] La figure 9 B montre que l'inhibition de la croissance de Phaeoacremonium aleophilum due à l'association de la cystéine et du sulfate de fer (aux différentes concentrations testées) est supérieure à l'inhibition provoquée par les composés seuls. Un effet de synergie est observé dans chaque cas puisque l'efficacité expérimentale (65 %, 87 %, 94 %) est supérieure à l'efficacité théorique (55 %, 86 %, 93 %) (Figure 9 B (Hb)).
2.b. Acide salicylique/sulfate de fer :
[00142] La composition comprenant de l'acide salicylique à 0,5 mM avec le sulfate de fer à 5, 10 et 20 mM inhibe totalement le développement fongique des deux champignons quelle que soit la concentration en sulfate de fer. Un effet de synergie a été observé pour chaque concentration avec les deux champignons.
[00143] Pour Phaeomoniella chlamydospora, l'efficacité expérimentale E' (100 %) est supérieure à l'efficacité théorique E qui est de 67 % pour l'association acide salicylique à 0,5 mM/sulfate de fer 5 mM, 94 % pour l'association acide salicylique à 0,5 mM/sulfate de fer 10 mM et 100 % pour l'association acide salicylique/sulfate de fer 20 mM ((Figure 9 A (Hc)).
[00144] Pour Phaeacremonium aleophilum, l'efficacité expérimentale E' (100 %) est supérieure aux efficacités théoriques E qui sont respectivement de 69 %, 91 % et 95 % pour chacune des associations avec une concentration croissante en sulfate de fer (Figure 9 B (Hc)).
[00145] Cet exemple démontre clairement que la composition de l'invention est une composition antifongique présentant un effet synergique avec des résultats bien supérieurs à ceux observés avec les compositions de l'état de la technique. 2.c. Sulfate de fer/cvstéine/acide salicylique :
[00146] Les résultats expérimentaux de cet exemple sont présentés sur les figures 9 A et 9 B et démontrent que le mélange des trois molécules aux concentrations étudiées (III) inhibe totalement la croissance mycélienne de Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum quelle que soit la concentration en sulfate de fer ajoutée.
[00147] Ces résultats confirment bien l'effet synergique de la composition de l'invention.
3. Composition comprenant du fosétyl-aluminium, la cvstéine, l'acide salicylique, du sulfate de fer (IV)
[00148] Les composés testés comprennent du fosétyl-aluminium à 2,7 mM, de la cystéine 5 mM, de l'acide salicylique 0,5 mM et du sulfate de fer 5 mM. Les molécules ont été testées associées par deux, trois ou quatre. a) Inhibition de la croissance de champignon avec des compositions comprenant deux ou trois composés
[00149] Le tableau 5 ci-dessous et la figure 10 A (II et III) et B(II et III) représentent les résultats expérimentaux obtenus sur des champignons cultivés sur milieu solide avec les différentes associations.
Tableau 5 : Tableau des résultats de différentes associations
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
[00150] Les résultats expérimentaux obtenus présentés sur la figure 11 A (II et III) et B (II et III) démontrent l'inhibition totale de la croissance de Phaeomoniella chlamydospora et de Phaeoacremonium aleophilum en milieu liquide avec les compositions comprenant acide salicylique et sulfate de fer.
[00151] Certaines associations de molécules n'inhibent pas totalement le développement fongique de Phaeoacremonium aleophilum en milieu liquide (Figure 11 B (II et III)). Une croissance résiduelle est observée pour les mélanges acide salicylique/fosétyl-aluminium (3,5 %), cystéine/acide salicylique/sulfate de fer (2 %), cystéine/acide salicylique/fosétyl-aluminium (0,5 %), acide salicylique/sulfate de fer/fosétyl-aluminium (10 %).
[00152] Les conditions de culture du champignon peuvent donc modifier l'efficacité du traitement appliqué avec des compositions comprenant deux ou trois composés. b) Inhibition de la croissance de champignon avec des compositions comprenant quatre composés [00153] Tel que démontré dans cette expérience (Figure 10 A et B (IV) et Figure 11 A et B (IV)), la croissance de Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum en milieu liquide est totalement inhibée en présence du mélange cystéine 5 mM / acide salicylique 0,5 mM / sulfate de fer 5 mM / fosétyl -aluminium 2,7 mM en milieu liquide et solide.
[00154] Tel que démontré dans cet exemple, une composition selon l'invention permet d'inhiber la croissance d'agents pathogènes.
Exemple 3 : Effet de la composition sur la germination des spores
[00155] Les différentes molécules utilisées seules ou en mélange ont été testées afin de savoir si la composition possède un effet sur la germination des spores de Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum.
[00156] La figure 12 A démontre que toutes les compositions testées ont un effet inhibiteur sur la germination.
[00157] Plus particulièrement les mélanges acide salicylique/fosétyl- aluminium (II), cystéine/acide salicylique/sulfate de fer (III), acide salicylique/sulfate de fer/fosétyl-aluminium (III), cystéine/acide salicylique/sulfate de fer/fosétyl-aluminium (IV) inhibent totalement la germination des spores de Phaeomoniella chlamydospora. Par contre, elle n'est pas totalement inhibée en présence du mélange acide salicylique/sulfate de fer (II) alors que sa croissance est complètement inhibée en milieux solide et liquide. Le mélange acide salicylique/sulfate de fer semble donc avoir surtout un effet sur la croissance du mycélium et un effet moindre sur la germination des spores. De la même façon, la germination des spores n'est pas totalement inhibée en présence de la cystéine/acide salicylique/sulfate de fer (III) alors que le mycélium se développe faiblement en milieu solide dans les mêmes conditions.
[00158] La figure 12 B montre que la germination des spores de Phaeoacremonium aleophilum est totalement inhibée en présence du mélange acide salicylique/sulfate de fer, acide salicylique/fosétyl- aluminium (II), cystéine/acide salicylique/sulfate de fer, cystéine/acide salicylique/fosétyl-aluminium (III), cystéine/acide salicylique/sulfate de fer/fosétyl-aluminium (IV). La croissance mycélienne est totalement inhibée avec les mêmes mélanges en milieu solide et très fortement en milieu liquide.
[00159] Plusieurs mélanges de molécules inhibent totalement ou partiellement la germination des spores de Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum.
[00160] Ces résultats démontrent en outre que la composition de l'invention utilisée pendant la période de sporulation des champignons pourrait permettre d'empêcher de nouvelles contaminations par inhibition de la sporulation.
Exemple 4 : Mesure de l'effet fonqistatique ou effet fongicide de la composition
[00161] Afin de mesurer l'effet fongicide et/ou l'effet fongistatique de la composition, des implants mycéliens utilisés pour ensemencer le milieu nutritif contenant les différentes molécules à tester en milieu solide ont été déposés sur un milieu nutritif sans molécules antifongiques après 8, 15 et 21 jours de contact avec les molécules antifongiques selon le protocole décrit précédemment.
[00162] La reprise de croissance indique que le mélange a un effet fongistatique alors qu'une croissance nulle indique que le traitement possède un effet fongicide.
[00163] Les résultats permettent également de déterminer la durée de contact nécessaire entre le champignon et le traitement pour que le champignon soit tué et que la germination des conidiospores soit totalement inhibée. Cette mesure a été effectuée par la croissance du champignon en présence de différentes associations puis après passage sur un milieu nutritif dépourvu de molécules antifongiques après 8, 15 ou
21 jours de traitement. [00164] Les résultats présentés dans la figure 13 A, B et C et dans le tableau 7 ci-dessous montrent l'effet fongicide ou fongistatique des compositions.
[00165] Après 8 jours de contact (Figure 13 A) avec la composition : acide salicylique/sulfate de fer, acide salicylique/fosétyl-aluminium, sulfate de fer/fosétyl-aluminium, cystéine/acide salicylique/fosétyl-aluminium, cystéine/sulfate de fer/fosétyl-aluminium, Phaeomoniella chlamydospora se développe après passage sur le milieu sans molécules antifongiques. Ces différentes associations ont donc un effet fongistatique.
[00166] Dans le cas des associations cystéine/acide salicylique/sulfate de fer, acide salicylique/sulfate de fer/fosétyl- aluminiumet cystéine/acide salicylique/sulfate de fer/fosétyl-aluminium, le passage des implants mycéliens sur un milieu sans molécules antifongiques ne rétablit pas la croissance du champignon. Ces compositions ont donc un effet fongicide.
[00167] Après 15 jours (Figure 13 B), les implants mycéliens en contact avec les associations sulfate de fer/fosétyl-aluminium, cystéine/acide salicylique/fosétyl-aluminium, cystéine/sulfate de fer/fosétyl- aluminium se développent respectivement 5, 7 et 3 jours après passage sur un milieu sans molécules, ce qui indique que ces associations ont un effet fongistatique. Les implants mycéliens en contact avec les autres mélanges (acide salicylique/sulfate de fer, cystéine/acide salicylique/sulfate de fer, acide salicylique/sulfate de fer/fosétyl-aluminium, cystéine/acide salicylique/sulfate de fer/fosétyl-aluminium) ne reprennent pas leur développement. Ces compositions ont donc un effet fongicide.
[00168] La figure 13 C montre que seul le mycélium de Phaeomoniella chlamydospora en contact pendant 21 jours avec le mélange cystéine/sulfate de fer/fosétyl-aluminium reprend sa croissance après passage sur milieu sans molécules antifongiques après un temps de latence de 7 jours. Toutes les autres associations testées possèdent un effet fongicide après 21 jours de contact. [00169] Les figures 13 A' et B' présentent la croissance de Phaeoacremonium aleophilum après contact avec différentes associations pendant 8 et 15 jours puis transfert sur un milieu dépourvu en molécules antifongiques. Après 8 jours de contact, la croissance mycélienne est totalement inhibée en présence des associations suivantes : acide salicylique/fosétyl-aluminium, cystéine/acide salicylique/fosétyl-aluminium, acide salicylique/sulfate de fer/fosétyl-aluminium, cystéine/acide salicylique/sulfate de fer/fosétyl-aluminium. Ces mélanges ont un effet fongicide. Par contre, l'inhibition de la croissance observée avec les mélange acide salicylique/sulfate de fer et cystéine/acide salicylique/sulfate de fer n'est maintenue que 5 et 7 jours après le passage sur un milieu dépourvu en molécules antifongiques. Après ce laps de temps, le champignon reprend une croissance normale ce qui indique que ces associations ont un effet fongistatique. Après 15 jours de traitement, le développement de Phaeoacremonium aleophilum en présence des différentes associations est totalement inhibé.
[00170] Une partie des résultats est récapitulée dans le tableau 6 ci- dessous.
Tableau 6 : Effets fongicide ou fongistatique de différents mélanges sur la croissance de Phaeomoniella chlamydospora et
Phaeoacremonium aleophilum après 8, 15 ou 21 jours de contact
Figure imgf000043_0001
Exemple 5 : effet de la composition sur différentes souches de Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum
[00171] Le mélange développé a été mis au point sur une souche de Phaeomoniella chlamydospora (PC-PC 37) et une souche de Phaeoacremonium aleophilum (PA-PC 24).
[00172] La composition a été testée sur d'autres souches de Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum en milieu solide afin de s'assurer qu'elle inhibe la croissance des autres souches de champignons cultivés in vitro.
[00173] Les souches et les conditions de réalisation de cette expérience sont présentées dans la partie matériel et méthode précédemment décrite.
[00174] Les différentes souches de Phaeomoniella chlamydospora testées étaient PC-PC 37, PC-PC 3, PC-PC 21 , PC-PC 32.
[00175] En présence du mélange cystéine/acide salicylique, l'inhibition de la croissance mycélienne est de 44 % pour PC-PC 37, 36 % pour PC-PC 3, 41 % pour PC-PC 21 et de 27 % pour PC-PC 32. Le traitement avec l'association sulfate de fer/fosétyl-aluminium inhibe totalement le développement des souches PC-PC 37 et PC-PC 3 alors que le développement de la souche PC-PC 21 est inhibé de 96 % et celui de PC-PC 32 de 83 %. L'association des quatre molécules inhibe totalement la croissance mycélienne de toutes les souches de Phaeomoniella chlamydospora (Figure 14 A).
[00176] Les différentes souches de Phaeoacremonium aleophilum testées étaient PA-PC 24, PA-PC6, PA-PC20 PA-AQ 30. Telle que présentée sur la figure 14 B, la croissance des différentes souches est fortement inhibée avec les associations cystéine/acide salicylique et sulfate de fer/fosétyl d'aluminium et est complètement inhibée avec le mélange des quatre molécules.
[00177] Les résultats obtenus démontrent que la composition de l'invention inhibe la croissance du champignon quelque soit la souche testée.
Exemple 6 : Vérification de l'innocuité de compositions sur des boutures
[00178] Des compositions ont été testées en mélange par deux (cystéine 5 mM/acide salicylique 0,5 mM et sulfate de fer 5 mM/fosétyl- aluminium 2,7 mM) ou par quatre sur des boutures d'Ugni blanc et également sur des boutures de Cabernet Sauvignon.
[00179] Les boutures et les conditions de réalisation sont identiques à celles présentées précédemment.
[00180] Un mouillant (Etaldyne 95, Fertiligène) a été ajouté au mélange qui a été appliqué sur les boutures par pulvérisation foliaire.
[00181] Aucun traitement phytosanitaire n'a été réalisé en parallèle de ces traitements.
[00182] L'observation des boutures a été réalisée deux semaines après un traitement pour les boutures de Cabernet Sauvignon (Figure 15 B) et deux semaines après quatre traitements, réalisés à 14 jours d'intervalle, pour les boutures d'Ugni blanc (Figures 15 D, E, F).
[00183] Le mélange des quatre molécules entraîne une légère synthèse d'anthocyanes (Figure 15 B) dans les feuilles de Cabernet Sauvignon les plus âgées. Cette synthèse d'anthocyanes est caractéristique de l'activation du métabolisme secondaire de la plante et ne correspond pas à un effet phytotoxique.
[00184] Tel que présenté dans la figure 15, les boutures d'Ugni blanc ne présentent aucun signe de phytotoxicité que ce soit pour les traitements réalisés à partir d'un mélange de deux (Figures 15 D et 15 E) ou quatre molécules (Figure 15 F).
[00185] La composition de l'invention permet donc d'inhiber la croissance mycélienne sans effet délétère pour la plante contrairement aux compositions de l'état de la technique.
Exemple 7 : Vérification de l'efficacité de compositions sur des boutures avec la technique des empreintes sur membrane et des anticorps développés
[00186] Les anticorps ainsi que les protocoles de mise en œuvre de cet exemple sont décrits dans la partie méthodes.
[00187] Quatre traitements ont été réalisés sur des boutures inoculées à un intervalle de 14 jours.
[00188] Le premier traitement a été effectué sur des boutures inoculées depuis deux mois et demi. Afin d'évaluer l'efficacité du traitement, la méthode des empreintes sur membrane a été utilisée. Les empreintes ont été réalisées 14 jours après chaque traitement.
Figure imgf000046_0001
[00189] Pour chaque champignon, trois lots de boutures ont été réalisés
un lot de boutures non inoculées (64 boutures),
un lot de boutures inoculées non traitées (32 boutures par champignon),
un lot de boutures inoculées et traitées avec le mélange de deux molécules (acide salicylique 0,5 mM/cystéine 5 mM ou sulfate de fer 5 mM/fosétyl -aluminium 2,7 mM) ou des quatre molécules (60 boutures pour chaque champignon).
[00190] Les anticorps et le protocole d'incubations et de révélation des résultats sont identiques à ceux présentés précédemment.
1. Boutures inoculées avec Phaeomoniella chlamydospora
[00191] Pour chaque bouture, une empreinte a été réalisée avec la partie basale du sarment et une autre avec la partie apicale 14 jours après que chaque traitement ait été réalisé (Figure 16).
[00192] Les signaux révélés correspondent à la présence de protéines synthétisées par les champignons et détectées grâce à des anticorps spécifiques des protéines sécrétées.
Premier traitement :
[00193] Seule une empreinte réalisée avec une bouture non inoculée présente un léger signal (Figure 16 A). Un fort signal est à noter pour toutes les empreintes des sarments des boutures inoculées non traitées (Figure 16 B). Pour les boutures inoculées et traitées, un signal est détecté pour toutes les empreintes de sarment. Cependant, l'intensité du signal est plus faible pour le traitement sulfate de fer/fosétyl-aluminium (Figure 16 D) et pour le traitement associant les quatre molécules (Figure 16 E).
Deuxième traitement :
[00194] Un signal a été enregistré pour les boutures non traitées et pour les boutures traitées quel que soit le traitement.
Troisième traitement :
[00195] Les empreintes des parties basale et apicale des sarments des boutures non traitées présentent un signal élevé. Un signal est détecté pour toutes les empreintes des boutures traitées (Figures 16 C, D et E). Cependant, le signal est beaucoup plus faible pour les empreintes réalisées à partir des boutures traitées par le mélange sulfate de fer/fosétyl-aluminium (Figure 16 D) et par le mélange des quatre molécules par rapport aux empreintes des boutures non traitées (Figure 16 E).
Quatrième traitement :
[00196] Un signal est encore obtenu avec les boutures traitées par le mélange acide salicylique/cystéine. Le signal pour les empreintes des boutures traitées par le mélange sulfate de fer/fosétyl-aluminium est beaucoup plus faible que pour les boutures non traitées. Aucun signal n'est plus détecté pour 4 des 5 boutures traitées par le mélange des quatre molécules.
2. Boutures inoculées avec Phaeoacremonium aleophilum
[00197] La figure 17 présente les résultats obtenus avec une composition comprenant deux ou quatre composés après deux ou quatre traitements de boutures inoculées avec Phaeoacremonium aleophilum et permet de comparer l'intensité du signal observé à celui de boutures inoculées non traitées.
Deuxième traitement :
[00198] Un signal est enregistré pour toutes les empreintes réalisées à partir de la partie basale et de la partie apicale des sarments des boutures non traitées. Les traitements réalisés avec l'association de deux molécules ne permettent pas de diminuer l'intensité du signal. Le signal obtenu avec les empreintes des boutures traitées par l'association des quatre molécules (Figure 17 E) est plus faible que celui obtenu avec les boutures non traitées (Figure 17 B).
Quatrième traitement :
[00199] Après quatre traitements (Figure 17 E), un signal est observé pour toutes les boutures inoculées par Phaeoacremonium aleophilum, qu'elles soient traitées ou non. Cependant, l'intensité du signal est beaucoup plus élevée pour les empreintes réalisées à partir des boutures non traitées (Figure 17 B) qu'avec les boutures traitées (Figures 17 C, D et E). L'intensité du signal la plus faible est celle obtenue avec les traitements sulfate de fer/fosétyl -aluminium (Figue 17 D) et le mélange des quatre molécules (Figure 17 E).
[00200] Quatre traitements avec le mélange acide salicylique/cystéine/sulfate de fer/fosétyl-aluminium permettent de ne plus détecter la sécrétion de molécules par Phaeomoniella chlamydospora in planta. Cet effet est plus faible concernant Phaeoacremonium aleophilum.
[00201] L'intensité du signal pour les empreintes réalisées à partir des boutures traitées par des compositions comprenant deux ou quatre composés est beaucoup plus faible que pour les boutures non traitées.
[00202] Cet exemple démontre donc clairement qu'une composition de l'invention a un effet anti-fongique et permet notamment d'inhiber la sécrétion de protéines par les champignons dans la plante.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Composition antifongique comprenant au moins trois des composés choisis dans le groupe constitué par la cystéine, l'acide salicylique, le sulfate de fer (II) et le fosétyl-aluminium.
2. Composition selon la revendication 1 dans laquelle la composition comprend la cystéine, l'acide salicylique, le sulfate de fer (II) et le fosétyl-aluminium.
3. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, dans laquelle la concentration de la cystéine est comprise entre 0,01 et 15O mM.
4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, dans laquelle la concentration de l'acide salicylique est comprise entre 0,01 et 4 mM.
5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, dans laquelle la concentration du sulfate de fer (II) est comprise entre 0,01 et 160 mM.
6. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle la concentration du fosétyl-aluminium est comprise entre 0,01 et 81 mM.
7. Procédé de traitement d'une plante, ledit procédé comprenant l'application de la composition des revendications 1 à 6.
8. Procédé de traitement et/ou traitement préventif d'une plante infectée par un agent pathogène et/ou qui présente un risque d'infection par un agent pathogène, ledit procédé comprenant l'application de la composition des revendications 1 à 6.
9. Procédé de traitement selon la revendication 8, dans lequel l'agent pathogène est un champignon.
10. Procédé de traitement selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel l'application de la composition est effectuée par aspersion de la plante
11. Procédé de traitement selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, dans lequel la plante est une vigne.
12. Procédé selon la revendication 11 , dans lequel le champignon est Phaeomoniella chlamydospora et/ou Phaeocremonium aleopholilum.
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