FR2918542A1 - Utilisation d'agents antimicrobiens derives d'alliacees pour le prevention et le controle des maladies des cultures et des pourritures apres la recolte et pour la desinfection environnementale - Google Patents

Abstract

Utilisation d'agents antimicrobiens dérivés d'Alliacées pour la prévention des et le contrôle des maladies des cultures, des pourritures après la récolte et pour la désinfection environnementale, dans laquelle ces agents sont des composés de plantes du genre Allium ; et dans laquelle ces composés sont, plus particulièrement, le propylthiosulfinate de propyle (PTS) et le propylthiosulfonate de propyle (PTSO).

Description

UTILISATION D'AGENTS ANTIMICROBIENS DERIVES D'ALLIACEES POUR LA PRÉVENTION

ET LE CONTROLE DES MALADIES DES CULTURES ET DES POURRITURES APRES LA RÉCOLTE ET POUR LA DESINFECTION ENVIRONNEMENTALE

La présente invention concerne, comme l'exprime le titre de la présente description, l'utilisation d'agents antimicrobiens dérivés d'alliacées pour la prévention et le contrôle des maladies des cultures et des pourritures après la récolte et pour la désinfection environnementale.

Plus précisément, l'objectif de l'invention consiste en l'utilisation de composés de plantes du genre Allium, concrètement le propylthiosulfinate de propyle et le propylthiosulfonate de propyle, en tant qu'agents antimicrobiens dans les traitements avant la récolte, après la récolte et la désinfection de l'environnement et des sols, comme alternative naturelle et efficace à l'utilisation de pesticides, de fongicides ou de désinfectants synthétiques. Cette invention s'applique dans l'industrie alimentaire, notamment dans l'industrie agricole, qui nécessite des traitements phytosanitaires d'origine naturelle qui minimisent les pertes en raison de maladies de la récolte ou en raison de pourritures durant le stockage de cette dernière.

De la même manière, l'invention s'applique également dans les industries qui nécessitent des traitements de désinfection des installations moyennant des agents naturels, y compris des chambres réfrigérées, des murs, des sols, des équipements et des caisses d'emballage de fruits. Les plantes du genre Allium, telles que l'ail (Allium sativum L.) ou l'oignon (Allium cepa L.), sont utilisées depuis des millénaires à des fins alimentaires, mais aussi curatives, présentant une grande efficacité et une grande innocuité. Leurs caractéristiques antimicrobiennes sont bien connues et ont été largement décrites, depuis que, en 1944, Cavallito et Bailey ont isolé quelques-uns de leurs composés responsables de ces propriétés et ont identifié l'allicine (allylthiosulfinate d'allyle) en tant qu'un agent antibactérien. Des études postérieures ont démontré que les thiosulfinates se décomposaient et/ou se transformaient en d'autres composés, du type thiosulfonates, sulfures, sulfoxydes, etc., avec des effets biologiques similaires. Il existe des références à la capacité antimicrobienne des thiosulfonates naturels à leurs applications potentielles, mais il convient également de souligner l'utilisation agricole de certains thiosulfonates non naturels, tels que l'hydroxypropylthiosulfonate de méthyle (HPMTS), que l'on utilise pour la conservation de peintures, de vernis et d'eau de tours de réfrigération, ou le bensultap, utilisé en tant qu'un insecticide. Les composés d'origine naturelle de type thiosulfinate ou thiosulfonate peuvent représenter l'alternative réelle et efficace aux produits chimiques synthétiques utilisés pour combattre les espèces nuisibles qui attaquent les cultures et aux produits que l'on applique après la récolte pour prévenir ou réduire les pourritures. La nécessité de cette application est plus que justifiée, étant donné que l'utilisation intensive et extensive de pesticides synthétiques peut engendrer un risque pour la santé humaine et l'environnement. Il existe, d'autre part, le problème qui découle de l'apparition continue de résistance à ceux-ci chez certains champignons pathogènes. Cependant, les travaux qui mettent en évidence cette application potentielle ont été, jusqu'à présent, très rares. Il existe quelques références à l'utilisation de composés sulfurés en tant qu'antimicrobiens dans les traitements agricoles, mais ces références ne font jamais mention des deux composés décrits dans la présente demande. La recherche bibliographique réalisée fournit des études sur les extraits d'ail (seuls ou en mélange avec d'autres extraits ou huiles naturels) pour des traitements de fumigation ou de contrôle des pourritures. On distingue en particulier les brevets et références suivants : - CN1698440, qui fait référence à une formulation d'acétamipride et d'huile d'ail, et à la manière de prévenir, grâce à son utilisation, différents fléaux agricoles. - EP 0945066, qui décrit un effet synergique lorsque l'huile d'ail ou l'extrait d'ail est combiné à d'autres huiles essentielles (cannelle, romarin, thé, orange,...), améliorant sa capacité en tant que fongicide et en tant qu'insecticide. - J. Obagwu, L. Korsten, Control of citrus green and Blue molds with garlic extraits , European Journal of Plant Pathology. 109, 221-225, 2003, qui met en évidence l'efficacité d'extraits d'ail dans l'eau et l'éthanol dans le contrôle de la pourriture des agrumes, pourriture provenant de Penicillium digitatum et Penicillium italicum. Dans le cas des sulfures, il convient de mentionner les brevets FR 2779615AI et JP7126108. Dans le premier cas, on développe un agent de fumigation contre des 5 parasites qui contient des sulfures et, dans le second cas, une formulation qui favorise la germination. L'utilisation d'allicine (thiosulfinate d'ail) a également été décrite dans des traitements de désinfection et traitements agricoles. On trouve de nombreuses références, mettant en évidence son utilisation en tant qu'insecticide dans la demande 10 de brevet US 2006110472, en tant que désinfectant et en tant qu'agent biocide dans le brevet EP 1617731, ou pour la protection du sol contre des agents pathogènes dans la demande de brevet US 2004082479. Cependant, relativement à d'autres thiosulfinates, ou à l'ensemble des thiosulfonates, aucune référence bibliographique qui aborde leur utilisation dans les 15 traitements contre les maladies agricoles ou les pourritures après la récolte n'a été trouvée. On n'a pas trouvé non plus de références qui décrivent l'utilisation potentielle de ces composés en tant qu'agents de désinfection de l'environnement. Il s'agit d'un aspect essentiel dans l'industrie agroalimentaire, où la contamination des installations 20 et des équipements entraine un risque, en plus d'une perte considérable de productivité et de la qualité du produit final. Il en résulte que l'utilisation de ces composés dans la désinfection industrielle (des environnements, des chambres froides, des sols, des emballages des fruits et légumes ou des murs), en remplacement des produits qui sont normalement utilisés à 25 cette fin et qui, dans la majorité des cas, sont toxiques et ne peuvent pas être appliqués en présence d'aliments, présente des avantages évidents. En revanche, les produits décrits dans cette demande sont une alternative naturelle, présentent un spectre d'activité plus large et ont une faible toxicité, ils peuvent donc entrer en contact avec les aliments sans danger pour la santé, et ne devraient pas nécessiter le 30 retrait des aliments de l'installation lors de leur utilisation. Ceci entrainerait non seulement un gain de temps et d'argent important, mais aussi la possibilité de réaliser des traitements séquentiels ou périodiques, ce qui permettrait d'obtenir une efficacité constante dans le temps.

Le demandeur connaît l'existence du brevet JP 62263121 A, ainsi que d'autres publications, dans lesquels est décrite l'activité de l'ajoène sur les champignons pathogènes comme Fusarium sp., Rhizoctonia sp. ou Penicilliurn italicum, mais il s'agit d'un composé de type sulfoxyde, de nature chimique différente des thiosulfinates et des thiosulfonates auxquels la présente invention fait référence. De la même manière, le demandeur souhaite mentionner l'existence de son propre brevet EP 1721534, dans lequel il protège l'utilisation d'extraits et de composés dérivés de plantes du genre Allium en tant que conservateurs dans l'industrie alimentaire et agroalimentaire. L'invention de ce brevet concerne la conservation dans l'industrie alimentaire (avec une incidence spéciale dans les secteurs des produits lactés et carnés), le demandeur présente l'invention actuelle comme spécifique pour le secteur agricole, avec de nouveaux exemples d'applications : essais en champs sur divers agents phytopathogènes, traitements après la récolte, désinfection d'emballages, etc.

Un contrôle adéquat des maladies qui affectent les cultures durant les traitements dans les champs, et contre les pourritures durant le stockage après la récolte, est fondamental pour minimiser les pertes qui accompagnent ces altérations. On estime que, dans les pays développés, on perd environ 15 % de la production agricole totale pour ces raisons, alors que dans les pays en voie de développement, ces pertes peuvent atteindre jusqu'à 40 % du total de la production. Traditionnellement, l'utilisation de produits chimiques synthétiques a été le système le plus utilisé pour le contrôle de ces pourritures, mais actuellement, les exigences sociales veulent une agriculture moins agressive et qui n'utilise pas de produits agrochimiques toxiques. Les objections à ces agents de la part des consommateurs, préférant l'utilisation de produits naturels, sont chaque jour plus importantes. En outre, développement de résistances de certains champignons aux fongicides chimiques traditionnels, la persistance de résidus de pesticides sur les fruits et légumes et leurs effets négatifs potentiels sur la santé humaine (étant donné le potentiel cancérigène et tératogène de certains d'entre eux), ont conduit les gouvernements à restreindre l'utilisation de produits autorisés à ces fins et à établir des limites maximales de résidus (LMR) très strictes.

Il existe donc une demande réelle de mise au point de procédés nouveaux et efficaces de contrôle des maladies agricoles, qui soient acceptés par l'opinion publique comme n'entrainant pas de risque pour la santé humaine et l'environnement. Parmi ces alternatives existent les traitements avec des agents de contrôle biologique ou des antifongiques non spécifiques (tels que le bicarbonate ou l'acide sorbique). Mais une autre possibilité, qui s'offre ici, est le traitement avec des antimicrobiens naturels, présents dans les végétaux, très efficaces et à large spectre d'activité et qui, tout en étant actifs, sont inoffensifs pour une plus grande sécurité alimentaire. Ainsi, les composés de type thiosulfinate ou thiosulfonate, présents dans les plantes du genre Allium (ail, oignons, poireaux ou autres), ont une grande efficacité et une grande innocuité et peuvent donc représenter une alternative réelle et efficace aux produits phytosanitaires habituellement utilisés pour pallier aux maladies et aux pourritures des produits agricoles avec l'avantage de ne pas présenter les caractéristiques de toxicité desdits produits phytosanitaires et de ne pas entraîner de problèmes de résidus. Concrètement, la présente invention préconise l'utilisation d'agents antimicrobiens dérivés d'alliacées pour la prévention et le contrôle des maladies des cultures et de la pourriture après la récolte, et pour la désinfection environnementale. Concrètement, l'invention décrit les composés suivants : - propylthiosulfinate de propyle (ci-après PTS). - propylthiosulfonate de propyle (ci-après PTSO). Ces composés se sont avérés appropriés pour une utilisation dans les traitements avant et après la récolte, réduisant de manière remarquable les maladies et les pourritures entraînées par différents agents phytopathogènes.

Dans ce qui suit sont décrits certains des essais in vitro et in vivo , réalisés pour démontrer l'efficacité des deux produits dans différentes applications. A. - On a testé l'activité antimicrobienne in vitro desdits composés (référencés PTS et PTSO), à différentes doses, et contre une grande variété de bactéries, de champignons et de levures. Les essais ont été réalisés sur des microorganismes de collection (souches de référence de différentes collections de cultures types) et sur des souches sauvages isolées de différentes pourritures de fruits et autres cultures affectées.

Ces essais de capacité antimierobienne ont été réalisés selon la technique de diffusion sur gélose à partir de disques de cellulose de 6 mm de diamètre, imprégnés des différentes doses d'étude. Pour l'évaluation de la capacité antifongique, on a utilisé le milieu gélose de Sabouraud-glucose à 2 %, inoculé à partir de suspensions de spores préparées à une concentration de l'ordre de 108 cellules/mL. Pour estimer la capacité antibactérienne, on a utilisé le milieu de culture gélose de Müeller-Hinton, inoculé à partir de suspensions de bactéries préparées à une concentration de 106 cellules/mL. Une fois les plaques inoculées, on a placé les disques préalablement imprégnés de différentes doses de test de chacun des composés à analyser. On a réalisé la lecture, après incubation des plaques, moyennant une mesure de la zone d'inhibition qui est apparue, le résultat étant exprimé en mm correspondants au diamètre du halo qui est apparu (y compris les 6 mm du disque de cellulose). Les résultats de ces essais sont rapportés ci-après.

Les données correspondant aux essais avec les souches de référence sont présentées dans les tableaux 1 et 2.

Tableau 1.- Activité du PTS contre divers microorganismes de collection. Microorganismes testés Dose de principe actif (souches de référence) 100 ppm 50 ppm 25 ppm Micrococcus luteus 32 25 19 ATCC 15307 Bacillus megaterium 34 27 23 ATCC 33085 Listeria monocytogenes 30 24 18 CECT 4032 Escherichia coli 21 17 14 CECT 515 Candida magnoliae 38 30 22 EA DSMZ 70638 Candida kruseï I29 18 1 ATCC 34135 Candida parapsilgsls 17 14 0 CCTM 1038 Saccharomyces cerevisiae 44 32 28 CECT 1, Penicillium italicum 34 26 2 CECT 2 94 2 Aspergillus terreus 25 22 12 CECT 2663 Aspergillus niger 19 16 10 CECT 2700 Données exprimées en mm du diamètre du halo d'inhibition microbienne développé pour chaque dose de l'essai (y compris les 6 mm du disque de cellulose) contre chaque souche.

Tableau 2.- Activité comparée de PTS et PTSO contre divers microorganismes de collection Microorganisme testé PTS (ppm) PTSO (ppm) (souche de référence) 1000 500 250 125 60 1000 500 250 125 60 Bacillus subtilis 55 55 40 35 32 68 50 42 36 27 ATCC 6633 Bacillus cereus 35 27 25 20 15 49 47 45 35 25 ATCC 10876 Enterococcus faecalis 30 30 26 22 15 45 45 45 33 26 ATCC 29212 Listeria innocua 40 37 32 23 13 52 43 35 20 13 CECT 4030 Salmonella typhimurium 25 23 22 15 11 27 25 25 17 16 ATCC 13311 Escherichia coli 27 25 24 17 12 29 27 26 19 18 ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa 14 12 10 9 8 12 10 9 8 6,5 ATCC 9027 Penicillium solitum 35 28 16 11 0 40 30 20 12 0 Souche sauvage Données exprimées en mm du diamètre du halo d'inhibition microbienne développé pour chaque dose de l'essai (y compris les 6 mm du disque de cellulose) contre chaque souche.

A partir des données présentées dans les tableaux ci-dessus on peut observer que les deux produits présentent un vaste spectre d'action, avec une bonne puissance inhibitrice y compris à faible dose.

Après la réalisation du screening de la capacité antimicrobienne des composés formant l'objet de l'invention sur une vaste gamme de souches de référence, l'efficacité de ceux-ci a été corroborée contre des souches sauvages, qui ont été isolées en tant qu'agents pathogènes spécifiques affectant diverses cultures de différentes origines géographiques. Les résultats de certains de ces essais sont présentés dans les tableaux 3 et 4, dans lesquels sont incluses les données d'efficacité sur différentes souches isolées des genres Penicillium, Colletotrichum, Fusarium et Phytophthora.

Tableau 3.- Activité du PTS contre divers champignons sauvages isolés de bananes infectées Microorganismes testés PTS (ppm) (isolés sauvages d'anthracnose sur la 1000 500 250 125 60 30 couronne de bananes) Penicillium sp. 20 18 15 11 0 0 (CPC-PT-1) Penicillium sp. 25 25 15 0 0 0 (CPC-PT-2) Penicillium sp. 17 15 13 10 0 0 (CPC-PT-3) Penicillium sp. 25 23 20 13 11 0 (CPC-PT-4) Colletotrichum sp. 43 43 40 30 20 10 (CPT-PT-5) Colletotrichum sp. 45 48 47 35 30 20 (CPT-PT-6) Fusa rium sp. 35 25 25 15 0 0 (CPC-PT- Fusarium sp. 20 20 15 12 10 0 (CPC-PT-8) Fusariu sp. 33 30 ù ~ - - ( - ù ~ (CPC-PT-9) Levure non i ( ifiée 65 63 55 50 45 40 (CPC-PT-10) Données exprimées en mm du diamètre du halo d'inhibition microbienne développé pour chaque dose de l'essai (y compris les 6 mm du disque de cellulose) contre chaque souche.

Tableau 4.- Activité du PTS contre divers phytopathogènes sauvages isolés de pourritures d'agrumes. Souches testées Dose de principe actif (ppm) (isolées sauvages de pourritures d'agrumes) 1000 500 250 125 60 30 Penicillium digitatum 35 33 33 20 15 12 Courtoisie de Brogdex SA Penicillium digitatum 41 40 33 20 15 12 Souche sauvage, Courtoisie d'UdL-IRTA Penicillium italicum 20 15 13 13 0 0 Souche sauvage, Courtoisie d'UdL-IRTA Phytophthora citrophthora 55 53 42 23 21 10 CECT 2353 Données exprimées en mm du diamètre du halo d'inhibition microbienne développé pour chaque dose de l'essai (y compris les 6 mm du disque de cellulose) contre chaque souche.

Une comparaison de ces données à celles obtenues dans les traitements avec quelques produits phytosanitaires traditionnels montre que les composés dérivés d'alliacées peuvent être utilisés de manière effective en tant qu'alternative naturelle efficace à ces produits phytosanitaires (comparer les tableaux 3 et 4 aux tableaux 5 et 6). Ce domaine d'application s'avère spécialement pertinent, en raison de l'absence totale de produits commerciaux naturels qui combinent un vaste spectre d'activité à une bonne puissance inhibitrice, y compris à faibles doses. 1 0 Tableau 5. -\.etivité de produits phytosanitaires disponibles dans le commerce contre divers microorganismes r? ~c actif dans P ocloraz 40 % Tiabenzol 45 % Guazatina 20 % Imazalil 50 % prode' -cial Dose__ du produit 4000 2000 1000 4000 2000 1000 4000 2000 1000 4000 2000 1000 commercial - ù Ficroorgai estés Penicïllïum ,,talicum 35 35 31 > 40 40 40 15 2 10 50 47 46 CECT 2294 Geotrichum candidium 30 27 26 23 20 CECI 1902 Trlohodorma aureoviride 12 11 8 26 26 24 35 30 25 31 25 20 CECI 20102 Données exprimées en mm du diamètre du halo d'inhibition microbienne développé pour chaque dose de l'essai, y compris les 6 mm du disque de cellulose.

Tableau 6.- Activité de produits phytosanitaires commerciaux contre divers microorganismes. Dose de principe 0-phényl Blphényle 0 .én e actif sodique 30 phénol PI= 6000 4000 6000 4000 6000 4000 2000 1000 Microorganismes testés Penicillium 45 45 8 7 53 33 30 20 italicum CECT 2294 Geotricum 47 45 0 0 40 35 30 7 candidum CECT 1902 Trichoderma 42 40 0 0 35 20 10 0 aureoviride CECT 20102 Rnizopus 15 14 0 0 0 0 stolonifer ATCC 24865 Données exprimées en mm du diamètre du halo d'inhibition microbienne 5 développé pour chaque dose de l'essai, y compris les 6 mm du disque de cellulose.

B. - De la même manière, on a réalisé de nombreux essais in vivo , pour vérifier l'efficacité des produits dans des traitements avant et après la récolte, ainsi qu'en tant qu'agents de désinfection de sols agricoles et d'installations d'industries 10 alimentaires. Dans les traitements avant la récolte, on a réalisé des essais sur des fraises, des agrumes, des fruits à noyaux et à pépins et des fruits tropicaux. On a également réalisé des essais sur des cultures sous serre (tomates, melons, courgettes, poivrons, concombres et haricots verts). 15 La majorité des données obtenues dans ces essais (et rapportées dans le tableau suivant) démontrent que les principes actifs PTS et PTSO possèdent une grande capacité de contrôle des maladies les plus caractéristiques qui affectent ces cultures.

Tableau 7.- Maladies avant la récolte dans différentes cultures contre lesquelles le PTS et/ou le PTSO sont actifs. Maladies avant récolte dans différentes cultures contre lesquelles le PTS etlou le PTS0 sont actifs

Culture Agent pathogène maladie plantes à fruits et a Pseudoperonospora mildiou feuilles : tomates, cubensis, Phytophthora poivrons, concombres, infestans melons, laitues_ Brysiphe s., Oïdium Sphaeroteca sp., Leveillula taurica Botrytis cinerea pers. Botrytis (pourriture arise} Alternaria dauci Alternariose Fruits à noyaux Venturia inaequalis Marbrure pépins Frysiphe sp., Oïdium Sphaeroteca sp., Leveillula taurica Monilia fructicola, Moniliose Monilia laxa Taphrina deformans Cloque Agrumes Alternaria citri Alternariose des agrumes Phytophthora spp Gommose Fraises Phytophthora infestans Mildiou Oïdium fragariae Oïdium Botrytis cinerea pers. Botrytis Fruits tropicaux : Pseudoperonospora Mildiou avocats, mangues cubensis, Phytophthora spp. Coiietotri chue Anthracnose gloesporio es Certains de ces essais se sont avérés particulièrement significatifs, comme celui réalisé contre l'oïdium chez le poivron sous serre d'Almerfa. La pertinence des données obtenues réside en la rareté des systèmes efficaces et non synthétiques de lutte contre cette maladie (causée par Leveillula taurica Dans le cas de cet essai, on a appliqué avec un pistolet, et en utilisant le réseau d'irrigation de la serre, des dissolutions de 1000 ppm et 2000 ppm de PTS et PTSO, avec un volume de bouillon de 20, 30, 40 L/parcelle, selon l'application. Ces dissolutions ont été distribuées dans des parcelles de 4 lignes, situées dans la zone de la serre avec une attaque majeure d'oïdium, alors que dans le reste de la serre, on a appliqué un produit de référence : Ciproconazol (Caddy 10 WG. à 10 g/100 L) pour les première et seconde applications, Traidimenol (Bayfidan 25 EC à 25 mL1100 L) pour la troisième application et Cyproconazole/Traidimenol pour la dernière. L'efficacité fongicide des produits a été telle que, à des doses de 1000 et 2000 ppm, la lutte contre l'oïdium par le PTS s'est avérée similaire à celle obtenue avec le produit de référence, résultant concrètement en un pourcentage d'efficacité de 92 % relativement à l'autre, l'efficacité du PTSO étant légèrement inférieure. En ce qui concerne la tolérance de la culture, il convient de souligner qu'on n'a observé aucun symptôme de toxicité sur les plantes, ni sur la faune utile du milieu.

De plus, les principes actifs constituant l'objectif de cette invention se montrent également très efficaces dans le contrôle des maladies et des pourritures après la récolte de diverses cultures. Certaines de ces maladies sont rapportées dans le tableau suivant.

Tableau 8. - Maladies sur différents fruits après la récolte et contre lesquelles le PTS et/ou le PTSO sont actifs. Principales maladies chez différents fruits après la récolte et contre lesquelles le PTS et/ou le PTSO sont actifs Fruits Agent pathogène Maladie Pommes, poires et Penicillium Pourriture bleue coinças expansum Botrytis cinerea `ire grise Physalos ra Foi_ ri - noire obtura Glomerella Pourriture acide cinqulata Botr ospheria !pourriture blanche ribis Penicillium Pourriture bleue italicum Penicillium pourriture verte digitatum Alternaria citri Alternariose Phomopsis citri Pourriture du pédoncule Diplodia pourriture natalinsis pédoncule Vignes et petits Penicillium pourriture grise fruits expansum Botrytis cinerea Pourriture bleue Rhizgpus pourriture par stolonifer Rhizopug Cladosporium Pourriture par herbarum Cladosporium Fruits à noyaux Monilinia spp. Pourriture par Monilia Rhizopus Pourriture par Stolonifer Rhizopug Penicillium Pourriture bleue expansum Botrytis cinerea Pourriture grise Une troisième application où les antimicrobiens PTS et PTSO se montrent efficaces est la désinfection de sols agricoles, comme décontaminant avant la culture, agissant contre les bactéries, les champignons voire les nématodes. On a réalisé des essais pour évaluer l'efficacité contre Fusarium spp. sur des asperges et contre Ralstonia solanacearum dans des essais in vitro . Dans les deux cas, les produits d'application PTS et PTSO se sont avérés très efficaces. Cet aspect revêt une importance particulière en raison de l'absence de désinfectants efficaces et non synthétiques qui permettent la protection des cultures horticoles comme les fraises, les tomates, les piments, les melons ou autres. problème est encore plus grand depuis que l'utilisation des produits traditionnellement utilisés pour ces fins, comme les halons et, notamment, le bromure de méthyle, a été interdite en raison de leur toxicité et de leur incidence sur la couche d'ozone. C'est pourquoi la mise au point d'alternatives non toxiques et actives contre les agents pathogènes tels que Verticillium dhaliae, Rhyzoctonia solani, Ralstonia solanacearum ou Fusarium oxysporum s'avère fondamentale. Par exemple, les champignons du genre Fusarium ont une grande importance économique en tant qu'agents pathogènes des cultures, notamment Fusarium oxysporum, responsable de la fusariose. Il s'agit d'agents pathogènes facultatifs, capables de survivre dans le sol en s'alimentant de substances en décomposition. Ce champignon s'introduit dans la plante à travers les blessures, dont l'origine peut être le labourage du sol, des traitements mécaniques, des accidents naturels, des attaques de pestes, etc. Au niveau du système radiculaire, les racines principales présentent un vide total des substances de réserve, laissant l'épiderme vide. Après avoir déterminé que des doses de 2000 ppm ne provoquaient pas d'effets phytotoxiques, on a réalisé deux essais en champ sur des asperges affectées (dans deux fermes qui totalisaient 600 plants, tous affectés par la fusariose) afin d'évaluer l'activité sur Fusarium spp. dans les racines et le sol. Les doses de traitement utilisées étaient de 250, 500 et 1000 ppm des deux principes actifs, et on a comparé l'incidence initiale de l'agent pathogène à sa présence à 60 jours de l'application. Pour analyser l'évolution des cultures infectées par Fusarium spp. après les traitements, on a prélevé des échantillons de racines et de sol, et on a étudié en laboratoire l'incidence de l'agent pathogène sur ceux-ci. Les milieux de culture utilisés étaient la gélose-pomme de terre-dextrose et gélose-rose Bengale (pour éviter le caractère invasif des mucorales). L'analyse des sols a été réalisée en faisant des dilutions en série de ceux-ci dans un sérum physiologique avec un ensemencement ultérieur dans les milieux mentionnés ci-dessus. L'analyse des racines a été réalisée par dissection des tissus infectés, que l'on a déposés en triple sur du papier-filtre placé sur les deux milieux, et dont on a étudié l'évolution dans le temps. Les résultats de ce test sont présentés schématiquement dans les tableaux suivants. Les données sont exprimées en pourcentage d'élimination et de réduction en fonction de la dose de traitement relativement aux échantillons de contrôle non traités.

Tableau 9. - Efficacité du PTS et du PTSO contre Fusarium spe dans le sol. Efficacité de produi PTS PTSO (ppm) (ppm) dans le sol 250 500 1000 250 500 1000 d'élimination 100 87,5 100 85 75 100 Tableau 10.- Efficacité de PTS et PTSO contre Fusarium spp. dans les racines Efficacité de produits PTS PTSO (ppm) dans les racines 250 500 1000 250 500 1000 d'élimination 0 57 58 86 57 % de réduction 60 14 13 25 14 43 Note : dans les cas où on atteint une somme de 100, la différence suppose le 5 pourcentage de racines dont le grade de fusariose n'a pas diminué à 60 jours.

Par conséquent, il est possible de vérifier la grande efficacité dont ont fait preuve le PTS et le PTSO pour l'élimination de Fusarium dans le sol, y compris à faibles doses, ainsi que la bonne réponse qu'ils offrent dans la désinfection de racines 10 à des doses d'application comprises entre 500 et 1000 ppm. On a également testé l'efficacité du PTS et du PTSO contre Ralstonia solanacearum, un autre des agents pathogènes principaux du sol, qui colonise la plante de manière intravasculaire entraînant de grandes pertes dans des cultures telles que la tomate, la pomme de terre ou la banane. 15 Dans ce cas, on a réalisé un essai in vitro contreune souche de Ralstonia solanacearum de la collection ETSIA de la Universidad Complutense de Madrid (Réf. interne Souche GM1000). On a testé les produits dans une plage de concentrations de 2 ppm à 2000 ppm. On a réalisé le test d'inhibition sur des plaques de microtitration à 96 puits, avec une concentration finale de l'agent pathogène 20 inoculé de Io' ufc/mL sur un bouillon nutritif traité avec différentes concentrations de PTS et PTSO, en utilisant des blancs inoculés et des contrôles positifs d'inhibition. Après l'incubation, on a déterminé la croissance moyennant à partir de l'absorbance à 490 nm sur un lecteur de plaques ELISA. Les résultats obtenus dans cet essai démontrent la grande efficacité des deux 25 produits dans l'inhibition de la croissance de la souche à laquelle on fait référence, les deux possédant une bonne puissance inhibitrice à des doses supérieures à 200 ppm. Il convient de souligner que, dans aucun des essais auxquels on fait référence ici, les produits appliqués n'ont provoqué d'effets phytotoxiques, ni d'altérations des 5 propriétés organoleptiques des fruits ou cultures traités (odeurs ou saveurs résiduelles anormales, etc.). On a également réalisé des essais de phytotoxicité spécifiques sur les poivrons, les tomates, les asperges et les fraises à des doses supérieures à celles généralement appliquées, et on a vérifié l'absence de physiopathologies ou d'autre 10 type de lésions sur les feuilles ou les tiges, corroborant le fait que la plante présentait des croissances normales. Dans les essais avec des plantes auxquelles on avait inoculé des mycorhizes puis sur la partie aérienne desquelles on a pulvérisé des dissolutions de PTS et de PTSO, on a pu vérifier que la plante ne souffrait pas de phytotoxicité, et que les 15 résidus qui avaient pu s'incorporer au substrat n'avaient pas modifié la mycorhization. D'autre part, une des principales mesures préventives à prendre en compte pour éviter les pourritures est la propreté et la désinfection de tous les matériaux, de toutes les superficies, de tous les environnements et de tous les emballages qui vont entrer en contact avec les fruits durant leur manipulation, leur conservation et leur 20 commercialisation ultérieure. Ce problème est général dans toute l'industrie alimentaire, mais spécialement grave dans le cas des palettes et des emballages de stockage des produits récoltés. A certaines occasions, les fruits doivent rester dans des chambres de réfrigération pendant longtemps, avec des humidités relatives élevées, l'apparition de 25 contaminations fongiques étant inévitable, qu'il s'agisse de champignons contractés en champ ou de champignons typiques contractés après la récolte. A ces fins, on a réalisé des essais pour vérifier l'efficacité des composés PTS et PTSO en tant qu'agents de désinfection environnementale dans les industries alimentaires, et plus particulièrement dans les chambres d'une centrale hortofruticole. 30 Par conséquent, les deux produits constituent une alternative efficace aux agents chimiques conventionnels (formol, glutaraldéhyde, chlorure de didécyldiméthyl ammonium, peroxydes, etc.) avec l'avantage supplémentaire que, à la différence de ces derniers, le PTS et le PTSO peuvent entrer en contact avec les aliments.

De plus, dans les conditions réelles d'un bain de désinfection des caisses-emballages, ainsi que dans la désinfection de salles et de surfaces de travail, on trouve généralement de la matière organique (restes de terre, fruits pourris, feuilles, etc.) qui peut diminuer l'action de l'agent désinfectant. Pour cette raison, on a également évalué l'efficacité du PTS et du PTSO, en présence de matière organique, sur deux agents pathogènes responsables de pourriture après la récolte sur des fruits à pépins (Penicillium expansum), et des agrumes (Penicillium digitatum). Les agents pathogènes ont été ajoutés à une suspension, ce qui a permis d'obtenir une concentration finale de lo' spores/mL. Dans le tableau suivant sont détaillés les résultats obtenus, exprimés en pourcentage de réduction des spores après 0, 1, 2 et 3 heures d'agitation en l'absence ou en présence (5 0, toutes les 30 minutes) de matière organique.

Tableau 11. - Influence de la matière organique sur l'efficacité du PTS et du PTSO 15 contre Penicillium expansum et P. digitatum Produit Pathogène Matière Réduction de la population organique 0 1 2 3 heure heure heures heures PTS Pénicillium Absence 68 82 45 68 750 ppm expansum Présence 73 41 36 18 1 min. Penicillium Absence 100 100 100 100 diaitatum Présence 100 100 100 100 PTSO Pénicillium Absence 100 100 100 100 2000 ppm expansum Présence 100 100 100 85 1 min. Pénicillium Absence 100 100 100 100 digitatum Présence 100 100 100 100 Comme on peut l'observer, la présence de matière organique affecte de manière significative l'efficacité du PTS contre Penicillium expansum mais pas contre Penicillium digitatum, mais n'affecte pas du tout l'efficacité du PTSO, ce qui 20 permet de vérifier l'efficacité désinfectante du composé en présence de matière organique. En résumé, l'invention propose l'application des composés propylthiosulfinate de propyle et propylthiosulfonate de propyle, des dérivés naturels présents dans les plantes de la famille des Alliacées, comme une alternative efficace aux produits agrochimiques synthétiques, pour la prévention et le contrôle des maladies dans les cultures et des pourritures après la récolte ainsi que pour la désinfection de l'environnement et des sols agricoles. Concrètement, ces composés peuvent être utilisés pour la prévention et le contrôle des maladies des cultures avant la récolte ; pour le contrôle des pourritures dans les fruits et les plantes, pour la prolongation de leur vie utile (dans les phases de stockage, de transport et de commercialisation) ; dans les traitements de désinfection des sols agricoles, pour le contrôle des microorganismes et autres facteurs biotiques qui affectent les cultures ; dans les traitements de désinfection environnementale des industries agroalirnentaires, tant des installations (salles, serres ou autres) que de la machinerie et des équipements, pouvant entrer en contact avec les aliments ; dans les traitements de désinfection des emballages et des caisses de stockage (en bois, plastique ou autres matériaux) de fruits ou autres aliments. Les composés propylthiosulfinate de propyle et propylthiosulfonate de propyle peuvent être appliqués comme des principes actifs purs, ou en mélange, dans des solutions aqueuses, en émulsions ou, en général, en une formulation quelconque, tant à l'état liquide que supportés dans un agent ou une formulation solide, pouvant être appliqués comme des principes actifs uniques, ou dans une formulation, conjointement à d'autres agents antifongiques synthétiques ou naturels, agents de contrôle biologique, agents de recouvrement, engrais, antioxydants, régulateurs de croissance ou d'autres agents de quelque autre nature, ainsi qu'au moyen d'une immersion, une nébulisation, un mouillage, une pulvérisation, une atomisation, une injection dans le sol, dans les réseaux d'arrosage, moyennent un drencher ou, en général, quelque autre système de traitement ou d'application.

Les exemples suivants de la demande présentent différentes utilisations pratiques du produit, et sont destinés à illustrer de manière claire et didactique l'invention présentée, sans que celle-ci ne se limite à ces exemples.

Exemple 1. - Evaluation de l'efficacité du PTS et du PTSO dans contrôle des 0 pourritures des oranges après la récolte. On a étudié l'efficacité des principes naturels actifs PTS PTSO, à deux doses différentes, dans le contrôle des pourritures des oranges après la récolte (variété Navelina), résultant d'une inoculation artificielle contrôlée, par les champignons Penicillium digitatum, Penicillium expansum, Phytophthora citrophthora et Geotrichum candidum, principaux agents pathogènes de ces fruits. On a inoculé les oranges avec des suspensions de spores des différentes souches de champignons sauvages sélectionnées, selon la méthodologie décrite ci-après. En premier lieu, on a procédé à l'isolement et à l'identification des souches de champignons utilisées dans l'étude. Les souches de champignons filamenteux utilisées dans ces essais (Penicillium digitatum, Penicillium italicum et Phytophthora citrophthora) ont été isolées d'oranges affectées par des pourritures. Dans ces 10 isolements, il n'a pas été possible de détecter de souche appartenant à Geotrichum candidum, il a donc été nécessaire de l'acquérir de la collection espagnole de cultures types, et il s'agit de la référence CECT 1102. Pour la préparation des inocula, on est parti d'une suspension de 5x107 spores/mL des champignons mentionnés ci-dessus, et on a suivi la 15 procédure décrite dans la nonne ASTM G-21:1996. A partir des inocula préparés, on a obtenu une suspension de spores à une concentration de 5 x 106 ufc/mL, que l'on a appliquée sur une blessure ou une incision superficielle, pratiquée avec une lame stérile dans l'écorce de la zone pédonculaire du fruit. Pour promouvoir l'implantation de l'inoculum de Geotrichum candidum, on a ajouté 2000 ppm de cycloheximide à 20 l'inoculum avant son inoculation. Après la contamination artificielle des oranges, on a réalisé les traitements par immersion de celles-ci dans des dissolutions de PTS et de PTSO préparées à des doses de 1600 et 2500 ppm, et on les a stockées à 20 C. L'évaluation de l'efficacité du PTS et du PTSO a consisté à compter le 25 nombre de fruits présentant des symptômes de pourriture dans la zone inoculée pour déterminer le pourcentage de fruits affectés par chaque traitement et champignon inoculé, l'efficacité étant exprimée en pourcentage de réduction des fruits affectés.

Tableau 1.1. - Résultats de l'essai avec des fruits auxquels on a inoculé Penicillium 30 italicum et que l'on a traités au PTS à deux doses. ours a

Traitement affectés rédaction 5 Blanc (eau) 100 666 .. PTS 0 100 7 00 +^m PTS 0 100 14 jours à 20'C

Traitement % de fruits % de affectés réduction Blanc (eau) 100 18222EE= 28 72 2500 ppm BTS 15 85 Tableau 1.2. - Résultats de l'essai avec des fruits auxquels on a inoculé Penicillium italicum et que l'on a traités au PTSO à deux doses. 4 jours à 20'C

Traitement % de fruits % de affectés réduction Blanc (eau) 100 1600 ppm 20 80 PTS 2500 ppm 15 85 BTS Tableau 1.3. - Résultats de l'essai avec des fruits auxquels on a inoculé Penicillium digitatum et que l'on a traités au PTS à deux doses. 7 jours à 20'C

Traitement % de fruits % de affectés réduction Blanc (eau) 100 1666 ppm 77 23 BTS 2500 ppm 47 53 BTS 14 à 20'C I de fruits i I de affectés réduction Blanc (eau) 100 160 BTS 100 0 128 _4 ppm PTS 36 64 Tableau 1.4. -Résultats de l'essai avec des fruits auxquels on a inoculé Penicillium digitatum et que l'on a traités au PTSO à deux doses. ours de traitement à 20 C

Traitement % de fruits affectés réduction Blanc e 100 1600 ppm PTSO 28 72 2500 ^o PTSO 15 85 7 jours de traitement à .

Traitement % de fruits e de affectés réduction Blanc (eau) 100 1600 ppm PTSO 60 40 2500 ppm PTSO 43 57 A partir des données exposées dans les tableaux ci-dessus, on peut déduire que le composé PTS est très efficace contre Penicillium digitatum, car son application sur les oranges préalablement inoculées réduit la pourriture jusqu'à 64 % à une dose de 2500 ppm, et après 14 jours d'application. Contre Penicillium italicum, la réduction peut atteindre 100 % y compris à une dose inférieure (1660 ppm), et se maintient à 85 % après deux semaines. En ce qui concerne le composé PTSO, celui-ci s'avère très efficace contre Penicillium digitatum, car dans les conditions d'application décrites, il arrive à réduire la pourriture jusqu'à 85 % à une dose de 2500 ppm, et 72 % à 1660 ppm, tout en maintenant ces valeurs à 40 % et 57 %, respectivement, à 7 jours du traitement.

Contre Penicillium italicum, la réduction atteint 80 % à une dose de 1660 ppm, et 85 % à 2500 ppm, bien qu'elle ne soit pas maintenue aussi efficacement dans le temps.

Tableau 1.5. - Résultats de l'essai sur des fruits inoculés avec Geotrichum candidum 20 et traités au PTS à deux doses 7 Iàuts Traitementde fruits affectés réduction 5 Blanc 100 1660 ppm PIS 5 95 2500 ppm PTS 0 100 14 jours à 20'C

Traitement % fruits de affectés réduction Blanc (eau) 100 1600ppm BTS 63 37 2500 ppm PTS 63 37 Tableau 1.6. - Résultats de l'essai sur des fruits inoculés avec Phytophthora citrophthora et traités au PTS à deux doses 4 jours de traitement à 20'C

Traitement % de fruits % de affectés réduction Blanc (eau) 78 1600 ppm PTS 18 60 2500 ppm PTS 8 70 jours de traitement à 20'C

Traitement % de fruits de affectés réduction Blanc (eau) 1 0 1600 ppm PTS 93 7 2500 ppm PTS 80 20 Comme on peut observer, le composé PTS est suffisamment efficace contre Geotrichum candidum, atteignant des niveaux de réduction de 37 %, dans les conditions décrites, à une dose de 1660 ppm. Contre Phytophthora citrophthora, le 0 PTS se montre modérément actif, permettant de réduire la pourriture de 70 % à une dose de 2500 ppm, et atteignant une réduction de 20 % après une semaine de traitement.

Tableau 1.7. - Résultats d'un essai sur 200 fruits venant directement d'un champ (non inoculés) et traités avec le PTS et le PTSO Oranges réfrigérées durant 28 jours à 50C

Traitement de fruits affectés Eau 23 1666 ppm PTS 10 2500 ppm 15 _Es PTSO En ce qui concerne les résultats obtenus pour l'application de PTS et de PTSO sur les oranges de la variété Navelina provenant directement d'un champ, les deux produits, appliqués aux doses spécifiées se sont avérés efficaces pour le contrôle des pourritures après la récolte. Tant le PTS que le PTSO réduisent d'environ 50 % les fruits affectés à la fin de la période de réfrigération (28 jours à une température de 5 C) relativement aux fruits non traités, ils apparaissent par conséquent comme une alternative efficace aux traitements synthétiques habituellement utilisés. En conclusion globale, l'efficacité des deux composés a été démontrée dans le contrôle de la pourriture après la récolte occasionnée par différents champignons caractéristiques des agrumes, tant dans le cas des fruits contaminés de manière artificielle au moyen d'inoculations contrôlées, que dans d'autres cas obtenus directement d'un champ. Ainsi, les deux principes actifs exercent un effet de ralentissement du développement de ces champignons durant le stockage et la conservation après la culture.

Exemple 2. - Evaluation de l'efficacité du PTS dans le contrôle des pourritures sur des fruits à pépins après la récolte : la pomme et la poire. On a étudié l'efficacité du principe actif PTS (à différentes doses actives) dans le contrôle des pourritures après la récolte sur des poires et des pommes, pourriture due aux champignons Botrytis cinerea et Perdcillium expansurn, principaux agents étiologiques de maladies chez ces fruits. Ces agents phytopathogènes peuvent apparaître sur les fruits en conservation en chambre froide et, une fois dans la centrale à une phase ultérieure, ils forment des nids, passant d'un fruit à l'autre par contact. 25 L'étude a été réalisée en utilisant un essai d'inoculation contrôlée, pour assurer un grand pourcentage de fruits affectés, et assurer que ce niveau d'infection soit, avec certitude, dû à ces agents pathogènes, permettant ainsi d'apprécier les différences significatives entre les différents traitements.

On entend vérifier l'efficacité du composé dans cette application, et vérifier la tolérance du produit sur les fruits doux, tant sur les poires (variétés Doyenné et Flor de Invierno) que sur les pommes (variétés Golden Delicious et Red Chie. Pour ceci, on a sélectionné au hasard un nombre de fruits différents pour chacune des variétés et chacun des traitements.

Pour réaliser l'inoculation contrôlée, on a utilisé des souches sauvages de Botrytis cinerea et de Penicillium expansum, isolées en centrale hortofruticole. Après l'isolement et l'identification des souches, on a préparé des suspensions estimées desdits champignons recueillis sur une solution de propylèneglycol à 1 %, laissant une suspension de l'ordre de 105 spores par mL. Après avoir réalisé des incisions sur les fruits, de 8 mm de diamètre par 2 mm de profondeur, on a réalisé l'inoculation à partir des suspensions de ces spores. Après ceci, on a maintenu les fruits, ainsi inoculés, durant 8 heures à 25 C et à 60 % d'humidité relative, permettant le développement des champignons. Passé ce temps, on a réalisé les différents traitements après la récolte avec un drencher, à 25 C pendant 60 secondes. Les doses utilisées du principe actif PTS étaient comprises entre 500 et 1700 ppm. On a également introduit un contrôle positif tel que le sulfate d'imazalil (fongicide synthétique très utilisé dans des centrales pour le contrôle des champignons pathogènes des fruits). Après 15 jours de conservation en chambre froide des fruits traités, à 5-6 C, on a réalisé la lecture des essais en comptant les fruits affectés. On a également déterminé la présence de physiopathologies, conséquences des traitements, ainsi que d'autres effets possibles (altération de la couleur, de l'odeur, de la saveur, des taches, etc. Les résultats de l'essai sont les suivants Tableau 2.1 - Résultats de l'efficacité du PTS contre Botrytis cinerea sur les poires30 atteints) Doyenné Flot Doyenne Flor Doyenné Flor de invierno invierno invierno PTS 75 75 0 3,5 % (50G ppm) PTS 73 82 0,4 0 (666 ppm) PTS 60 76 1 3,7 % 0 0 (83 ppm) PTS 68 80 0,5 0 (1666 ppm) Sulfate 56 73 19 > 24 % 0 0 d'imazalil (450 plain) Blanc 64 80 98 98 0 0 Tableau 2.2. - Résultats de l'efficacité du PTS contre Botrytis cinerea chez la pomme Traitement Nombre de fruits de fruits phytotoxicité traités affectés (nombre de fruits atteints) Golden Red Golden Red Golden Red chief chief chief delicious delicious delicious PTS 82 81 0,5 % 0 0 (500 ppm) PTS 77 76 0 % 0% 0 0 (666 ppm) PTS 81 82 1 1,5 % 0 0 (833 ppm) PTS 82, 79 0 (1666 ppm) Sulfate 83 67 IO 12 0 0 d'imazalil 450 ppm) Blanc Tableau 2.3. - Résultats de l'efficacité de PTS contre Penicillium expansum chez la poire. ai terrent ,éé de fruits p~ytotoxicite traités affectés (nombre fruits atteints) Doyenné Flor de Doyenné Flot de Doyenné invierno invierno invierno PTS 70 69 0 % 3,6 % 0 0 (500 ppm) PTS 76 80 2 % 2,2 % 0 0 (666 ppm) PTS 75 80 0 % 2,4 % 0 0 (833 ppm) PTS 62 78 3 % 5,3 % 0 0 (1666 ppm) Sulfate 75 70 4,5 % 6,7 % 0 0 d'imazalil (450 ppm) Blanc 69 77 98 % 99 % 0 0 Tableau 2.4. - Résultats de l'efficacité de PTS contre Penicillium expansum chez la pomme., Traitement Nombre de fruits % de fruits phytotoxicité traités affectés (nombre de fruits atteints) Golden Red Golden Red Golden Red chief chief chief delicious delicious delicious PTS 75 79 1,4 % 2,8 % 0 (500 ppm) PTS 68 70 0,5 % 0 % 0 0 (666 ppm) PTS 77 77 2,5 % 3,2 % 0 0 (833 ppm) PTS 80 67 0,7 % 2,4 % 0 0 (1666 ppm) Sulfate 67 74 4,3 % 6,2 % 0 d'imazalil (450 ppm) Blanc 84 76 92 % 96 % 0 0 En conséquence, il est possible d'apprL la plus grandil,acité du produit dans le contrôle des pourritures spécifiques, relativement à d'autres produits disponibles dans le commerce tels que le sulfate d'imazalil. En outre, la non phytotoxicité du principe actif PTS se vérifie, tout comme la tolérance du fruit envers ce dernier. 20 Exemple 3. - Evaluation de l'efficacité du PTS dans la lutte contre Botrytis chez la fraise. On a testé l'efficacité du PTS dans la lutte contre Botrytis cinerea sur des fraises de la zone d'Huelva qui étaient affectées par la pourriture grise dans des 5 pourcentages indiqués dans le tableau de résultats. On a divisé le champ d'essai en 6 parcelles et chaque parcelle était constituée par deux files de 15 à 20 plantes (avec les couloirs de protection de parcelles correspondants). Sur les 6 parcelles, on a laissé un témoin non traité et un autre à traiter avec un produit du commerce standard pour le contrôle de ces agents 10 pathogènes sur les fraises, tel que Teldor 50 % (fenhexamide). On a traité les autres parcelles avec différentes doses de PTS. On a réalisé l'application par pulvérisation foliaire, procurant une répartition uniforme du bouillon de pulvérisation. On a travaillé avec un pulvérisateur à lance et un volume de bouillon de 800 à 2000 litres/hectares (selon le développement des 15 plantes). On a réalisé le protocole d'essai selon les directives EPPO*, conformément à la norme FREUN0703. On a évalué l'efficacité des traitements appliqués à 12 jours, en comptant le nombre de fruits affectés. Les données sont rapportées dans le tableau 3.1. Tableau 3.1. - Résultats de l'efficacité du PTS contre Botrytis chez la fraise. Parcelle Traitement Dose Nb de Nb de % de Vigueur (PPm) fruits fruits fruits moyenne affectés affectés 1 Témoin 151 11 7,2 6,25 2 PTS 2000 150 6 3,8 6,25 3 PTS 2400 148 5 3,1 6,5 4 PTS 4800 141 4 3,1 7 PTS 9600 114 2 2 6 6 Teldo_ 1500 118 32,4 6,5 50 % On a vérifié la manière dont, à des doses supérieures à 2000 ppm, le produit réduit de plus de 50 % le nombre de fruits affectés, maintenant la culture à une vigueur égale à celle obtenue après l'application de Teldor 50 % et sans entraîner de symptômes de phytotoxicité chez la plante.

Les directives EPPO suivies sont : PP 1/16 (Botrytis cinerea chez les fraises), PP 1/135 (Evaluation de la phytotoxicité), PP 1/152 (Plan et analyse d'essais d'évaluation de l'efficacité) et PP 1/181 (Direction et communication de preuves de l'évaluation de l'efficacité, y compris les bonnes pratiques expérimentales).

Exemple 4. - Contrôle environnemental de points critiques dans l'industrie hortofruticole par nébulisation d'une dissolution du composé PTS. On a réalisé une étude pour vérifier la capacité de désinfection environnementale du composé PTS dans les chambres d'une centrale hortofruticole, 10 utilisées pour le stockage de bananes. Pour ceci, on a échantillonné trois chambres distinctes de la centrale, et on a étudié la qualité environnementale avant et après le traitement avec le PTS. Ceci a été réalisé, dans chaque chambre, en récoltant en premier lieu un échantillon environnemental avant le traitement, avec un échantillonneur d'air 15 Airtest-Omega de la firme LCB, par aspiration d'un volume d'air fixé à 80 L ayant un impact sur les différents milieux de culture sélectionnés. On a prélevé les échantillons en double dans les zones à analyser. Pour le comptage des aérobies mésophiles totaux, on a utilisé le milieu gélose PCA, et pour le comptage de champignons le milieu gélose-rose Bengale. 20 Le traitement désinfectant environnemental a consisté en la nébulisation d'une dissolution à 1500 ppm de PTS. On a nébulisé 5 litres de cette dissolution pour chaque volume de 1000 m3 de la chambre. On a utilisé un nébuliseur de modèle NEBUROTOR FOGGER, de la firme Copyr s.p.a., qui offre une taille de goutte inférieure à dix microns, permettant ainsi un contact intime et un traitement plus 25 efficace. Quelques heures après la nébulisation, on a répété l'opération d'échantillonnage dans les différentes chambres traitées selon ce qui a été décrit ci-dessus. Après le prélèvement d'échantillon, on a incubé les boîtes de Pétri à 30 C pendant 72 heures (plaques correspondant à des aérobies mésophiles totaux, 0 recueillis sur PCA) et à 25 C pendant 3 à 7 jours (plaques correspondant aux champignons, recueillis sur de la gélose-rose Bengale). Après incubation, on a réalisé la lecture par comptage des microorganismes qui sont apparus sur chaque type de plaque, exprimés en ufe/p aque. Les résultats ont 3 0 été traités sur des tables de conversion, et après l'application du facteur de correction correspondant, on a extrapolé d'ufc/plaque à ufc/m3. Les données obtenues dans ces analyses sont présentées dans le tableau suivant : 31 Tableau 4.1. - RésultuL. d l'efficacité du PTS dans la désinfection d'une chambre de stockage et de maturation des bananes. Zone échantill Volume d'air Comp te microbien % de réduction du microbiote environnemental (litres asj.1 Champignons Aérobies ésophi es totaux /plaque) FC/ aque UFC/m UFC/p aque C/m Population Po ula n d'aérobies fongique sophiles totaux Chambre d'entré 80 134 2353 62 881 70 % 65 % Av, le trait 80 51 707 24 314 ' % ?,one 1d de 80 27 355 64 914 23 % 39 % _m- maturatioa* Avant le Zone )re de 80 21 273 22 287 maturation Zone 2 de r4 de 80 38 512 174 3565 36 % 58 % maturation* Avant e trat Zone 2 de la dhambre 80 25 328 96 1487 de maturation Après le traitement * La zone 2 de la chambre de maturation est le lieu où l'on stocke les palettes avec les fruits, alors que l'on ne stocke pas de fruits dans la zone 1 de cette chambre, le niveau de contamination dans les deux zones est donc différent. 32 A partir des données présentées dans ce tableau, on peut tirer les conclusions suivantes : - chambre d'entrée : avant le traitement, on détecte une atmosphère ambiante avec un niveau de contamination par les champignons et un degré de contamination normal par les bactéries. Après la réalisation du traitement environnemental, on obtient une réduction importante du microbiote mixte détecté, et une réduction de la population fongique qui atteint 70 %, atteignant des degrés de contamination normaux pour ce type de chambres. - Chambre de maturation, zone 1 : initialement, le degré de contamination était normal, tant pour les champignons que pour les bactéries. Après la réalisation du traitement environnemental décrit, on arrive à réduire les deux groupes microbiologiques, arrivant à 69 % dans le cas des aérobies mésophiles totaux. Avec cette réduction, on peut obtenir un milieu ambiant peu contaminé et avec une qualité environnementale acceptable. - Chambre de maturation, zone 2: avant le traitement, on détecte un microbiote mixte, avec une prédominance de bactéries, lesquelles atteignent des chiffres correspondant à un environnement très contaminé. La qualité environnementale initiale n'est donc pas acceptable. Après la réalisation du traitement avec du PTS, les niveaux microbiens sont passés du degré de grande contamination à des contaminations normales. Etant donné les importantes réductions microbiennes détectées dans les différents traitements environnementaux réalisés avec du PTS dans les conditions décrites, on déduit l'efficacité de ce composé pour la désinfection environnementale de chambre de conservation frigorifique, d'où son utilité dans le contrôle de la contamination après la récolte dans ces chambres.

Exemple 5. - Application de PTS et de PTSO dans la désinfection environnementale d'emballage de fruits avec un degré de contamination connu en utilisant un drencher. 5.1. - Désinfection d'emballages au moyen d'un drencher On a réalisé un essai de désinfection d'emballages (caisses de fruits) dans lesquels on avait provoqué un degré de contamination artificiel par inoculation contrôlée, avec pour objectif la détermination de doses optimales d'application pour obtenir une désinfection satisfaisante.

En premier lieu, on a désinfecté les emballages (en bois et en plastique) avec de l'hypochlorite sodique, et, ensuite, on les a artificiellement contaminés par des inoculations contrôlées avec différents champignons caractéristiques du secteur hortofruticole. Pour ceci, on est parti d'isolements sauvages que l'on a récoltés, après la sporulation, pour obtenir une suspension de spores mixte, mélange de différents champignons (Penicillium expansum, Penicillium italicum, Penicillium digitatum et Alternaria alternata) et, séparément pour des essais en parallèle, une suspension de Rhizopus stolonifer pour sa plus grande vitesse de croissance et son caractère invasif. On a réalisé la contamination parpulvérisation des solutions de spores des champignons auxquels on a fait référence ci-dessus, à une concentration de 104 spores/mL, qui entraîne un degré de contamination similaire à celui que l'on rencontre naturellement dans les centrales hortofruticoles. Après la pulvérisation, on a laissé sécher les emballages et on les a échantillonnés avec pour objectif de déterminer le degré de contamination initiale obtenue (moyennant des plaques de contact contenant de la gélose-rose Bengale). Après ceci, on a réalisé les traitements des emballages dans un drencher de ligne pilote. Les emballages ont subi un séjour sous les douches pendant 30 secondes avec des doses de test de 750 ppm et 1050 ppm pour le PTS, et de 2000 ppm et 5000 ppm pour le PTSO. A la sortie des douches, on a laissé sécher les emballages traités et on a de nouveau échantillonné sur des plaques de contact avec de la gélose-rose Bengale pour déterminer le degré de contamination finale. L'unité d'échantillonnage était de 3 emballages et de 3 plaques pour la répétition. Les résultats obtenus dans cet essai de désinfection des emballages avec un degré de contamination connu en utilisant un drencher sont présentés dans le tableau 5.1 :

Tableau 5.1. - Résultats ficacité du PTS et du PTSO dans la désinfection d'emballages en bois et en plastique contaminés artificiellement. 1Produit de Emballage Réduction de population t%; pri actif élance R. nt' champignons griffer PTS 750 Bois 85 9 Piast ue 81 100 1050 Bois 85 100 Plastique 87 99 PTSO 2000 Bois 98 96 Plastique 93 100 5000 Bois 99 98 Plastique lË 93 100 (*) Le mélange de champignons pathogènes contient 3 types de Penieillium (P. expansum, P. italieum et P. digitatum) et A. alternata.

Les données présentées dans le tableau ci-dessus démontrent la grande efficacité des deux produits dans la réduction de la contamination des emballages, tant sur le mélange de champignons que, très particulièrement, sur Rhizopus stolonifer. Ce dernier est l'un des champignons qui est le plus craint dans le domaine hortofruticole pour sa grande agressivité et sa rapidité de dissémination, c'est pourquoi les données obtenues sont d'une grande pertinence si l'on considère que les mucorales (ordre auquel appartient R. stolonifer) ont une grande résistance aux traitements désinfectants conventionnels, les produits présentés dans ce brevet pourraient donc constituer l'alternative idéale étant donné leur grade d'efficacité.

5.2. - Désinfection par nébulisation de salles et d'emballages situés à l'intérieur de 15 celles-ci et contaminés artificiellement. Cet essai, réalisé dans des conditions d'installation pilote (reproduisant les conditions réelles d'une centrale), consistait en la désinfection d'une chambre et des emballages (en bois et en plastique) situés à l'intérieur de celle-ci. Pour ce faire, comme dans le cas précédent, on a provoqué un degré de 20 contamination fongique similaire à celui rencontré normalement dans les centrales hortofruticoles. On a réalisé les inoculations artificielles à partir de suspensions de spores du mélange de champignons auquel on fait référence ci-dessus (Alternaria alternata et trois espèces de Penieillium) en réalisant dans des essais parallèles, mais séparés, des inoculations contrôlées par Rhizopus stolonifer. On a procédé de la 25 manière décrite ci-dessus, en échantillonnant sur des plaques de gélose-rose Bengale avant et après la réalisation des traitements. Dans ces essais, les traitements désinfectants (de l'environnement et des emballages) ont été réalisés par nébulisation avec le modèle NEBUROTOR FOGGER (Copyr s.p.a.), avec des dissolutions de PTS de 750 ppm et de 1050 ppm, et de PTSO de 2000 ppm. Pour réaliser les traitements des salles, on a nébulisé 125 mL de chacune des dissolutions de test pour chaque chambre, leur volume étant de 25 m3. La durée de nébulisation, pour chaque dose et chaque chambre, était de 1 minute et 25 secondes. On a laissé sécher les différents traitements et on a déterminé la concentration finale au moyen de plaques de contact avec de la gélose-rose Bengale. L'unité d'échantillonnage était de 3 répétitions (3 plaques) par concentration étudiée pour chaque point échantillonné, c'est-à-dire, les murs et le milieu ambiant de la salle, et les emballages en bois et en plastique. Dans les tableaux suivants, on présente les résultats obtenus dans l'essai :

Tableau 5.2. - Efficacité du PTS et du PTSO dans la désinfection de salles par nébulisation. Produit Dose (ppm) de Zone de la Réduction de la principe actif salle population du mélange de champignons* exprimée en % PTS 750 Murs 96 Milieu ambiant 89 1050 Murs 97 Milieu ambiant 100 PTSO 2000 Murs 95 Milieu ambiant 100 5000 Murs 100 Milieu ambiant 100 (*) Le mélange de champignons pathogènes contient 3 types de Penicillium (P. expansum, P. italicum et P. digitatum) et A. alternata.

Tableau 5.3. - Résultats de l'efficacité du PTS et du PTSO dans la désinfection d'emballages stockés à l'intérieur des salles après la nébulisation des deux produits à 20 différentes doses de test. Produit Emballage se (ppm) Réduction de la population (%) Mélange de Rhizopus champignons* Stoionifer PTS 750 Bois 97 Plastique 97 36 1050 Bois 97 26 Plastique 98 27 PTS0 2000 Bois 67 78 Plastique 94 77 5000 Bois 70 56 Plastique 92 71 (*) Le mélange de champignons pathogènes contient 3 types de Penicillium (P. expansum, P. italicum et P. digitatum) et A. alternata.

Comme on peut l'observer, l'efficacité des produits est très élevée dans les deux cas, bien que la désinfection dans le cas des emballages en bois soit supérieure avec le PTS qu'avec le PTSO (elles sont similaires sur le plastique). La réduction de la population de Rhizopus stolonifer est inférieure à celle observée sur le reste des agents pathogènes, bien que le PTSO permette d'obtenir des niveaux de réduction de l'agent pathogène très importants.

On vérifie également que, dans ce cas de désinfection d'emballages par nébulisation, l'efficacité est inférieure à celle obtenue dans la désinfection liquide des emballages (en utilisant un drencher). Ce fait est habituel dans l'efficacité des produits désinfectants appliqués par nébulisation, le contact et la puissance de pénétration s'avèrent donc inférieurs à ceux offerts par l'application liquide.

Cependant, le degré de désinfection est très élevé, tant pour le PTS que pour le PTSO.

Exemple 6. - Efficacité du PTS et du PTSO dans la désinfection au drencher d'emballages naturellement contaminés. On a réalisé un essai dans les conditions réelles de contamination d' centrale d'agrumes, sur des emballages contaminés naturellement que l'on avait utilisés dans la collecte et la conservation d'agrumes lors de la saison précédente. Le mode de réalisation du dosage est expliqué ci-dessous. Après avoir déterminé la contamination initiale des palettes et après avoir préparé le bouillon de traitement, on a désinfecté les palettes dans le drencher de la 25 centrale. On a laissé égoutter et sécher les palettes désinfectées et après 24 heures, on a déterminé la contamination finale (au moyen de plaques de contact avec le RBCA). On a prélevé des échantillons (en triple) de la première pile de palettes baignées et de la huitième pile, pour étudier les différences d'efficacité du traitement et du temps en fonction des emballages. On a pris 3 plaques de chaque emballage (deux dans le fond 5 et une autre sur les côtés). Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau suivant :

Tableau 6.1 - Efficacité du PTS et du PTSO pour la désinfection par un drencher d'emballages contaminés naturellement. Produit Zone de Réduction de la palette population fongique M Début du Fin du bain bain PTS Côté 97 100 750 ppm Fond 87 79 PTSO Côté 100 87 2000 ppm Fond 93 96 Comme on peut l'observer, l'application des doses de PTS et de PTSO proposées pour la désinfection des emballages dans un drencher permet une réduction de la population fongique supérieure à 85 % au début du bain et supérieure à 78 % après le bain des 8 piles.

15 On conclut donc que ces deux produits sont très efficaces pour la désinfection d'emballages présentant une grande contamination naturelle dans des centrales hortofruticoles, et qu'il est possible de les utiliser comme alternative naturelle à l'utilisation de désinfectants chimiques. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci-20 dessus décrits et représentés, à partir desquels on pourra prévoir d'autres modes et d'autres formes de réalisation, sans pour autant sortir du cadre de l'invention. 10

Claims (9)

REVENDICATIONS

1. Utilisation d'agents antimicrobiens dérivés d'Alliacées pour la prévention et le contrôle des maladies des cultures, des pourritures après la récolte et pour la désinfection environnementale, dans laquelle lesdits agents sont composés de plantes du genre Allium ; et dans laquelle lesdits composés sont le propylthiosulfinate de propyle (PTS) et le propylthiosulfonate de propyle (PTSO).

2. Utilisation d'agents antimicrobiens dérivés d'Alliacées selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est efficace pour la prévention et le contrôle dans le traitement de maladies avant la récolte des cultures.

3. Utilisation d'agents antimicrobiens dérivés d'Alliacées selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est efficace dans des traitements après la récolte, pour le contrôle des pourritures sur les fruits et les légumes et pour la prolongation de leur vie utile (dans les phases de stockage, transport et commercialisation).

4. Utilisation d'agents antimicrobiens dérivés d'Alliacées selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est efficace dans les traitements de désinfection des sols agricoles, pour le contrôle des microorganismes et autres facteurs biotiques qui affectent les cultures. 20

5. Utilisation d'agents antimicrobiens dérivés d'Alliacées selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est efficace dans les traitements de désinfection environnementale des industries agroalimentaires, tant des installations (salles, serres ou autres) que de la machinerie et des équipements, et par le fait que les agents 25 antimicrobiens peuvent entrer en contact avec les aliments.

6. Utilisation d'agents antimicrobiens dérivés d'Alliacées selon la revendication 1, caractérisée en qu'elle est efficace dans les traitements de désinfection d'emballages, de palettes de caisses de stockage (en bois, plastique ou autres 30 matériaux) de fruits ou autres aliments. 5

7. Utilisation d'agents antimicrobiens dérivés d'Alliacées selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'il est possible d'appliquer les agents antimicrobiens comme des principes actifs purs, ou en mélange, en dissolutions aqueuses d'une concentration quelconque, en émulsion ou, en général, en une formulation quelconque, tant à l'état liquide que supportés sur un agent ou une formulation solide.

8. Utilisation d'agents antimicrobiens dérivés d'Alliacées selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'il est possible d'appliquer les agents antimicrobiens comme principes actifs uniques, ou dans une formulation, conjointement à d'autres agents antifongiques synthétiques ou naturels, agents de contrôle biologique, agents de recouvrement (naturels ou synthétiques), engrais, antioxydants, régulateurs de la croissance ou d'autres agents d'une quelconque autre nature.

9. Utilisation d'agents antimicrobiens dérivés d'Alliacées selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'il est possible d'appliquer les agents antimicrobiens au moyen d'une immersion, une nébulisation, un mouillage, une pulvérisation, une atomisation, une injection dans le sol, dans les réseaux d'irrigation, à l'aide d'un drencher ou, en général, avec un quelconque autre système de traitement ou d'application.