WO2011000931A1 - Biomasse aus cyanobakterien mit antimykotischer wirkung - Google Patents

Biomasse aus cyanobakterien mit antimykotischer wirkung Download PDF

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WO2011000931A1
WO2011000931A1 PCT/EP2010/059402 EP2010059402W WO2011000931A1 WO 2011000931 A1 WO2011000931 A1 WO 2011000931A1 EP 2010059402 W EP2010059402 W EP 2010059402W WO 2011000931 A1 WO2011000931 A1 WO 2011000931A1
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WO
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biomass
biomass according
mycoses
candida
extract
Prior art date
Application number
PCT/EP2010/059402
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolf-Dieter JÜLICH
Ulrike Lindequist
Sabine Mundt
Gerold Lukowski
Original Assignee
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald filed Critical Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics

Definitions

  • Biomass with antifungal effects are of interest for very different applications.
  • the application is on outer or inner body surfaces.
  • a very large area includes applications in the agri-food sector to protect feed and food from fungal spoilers.
  • An entirely different field of application for antifungal biomass is the prophylaxis and therapy of fungal diseases.
  • a particular advantage is achieved when the antifungal effect has other beneficial effects.
  • Of particular interest is a metabolic stimulation that provides benefits in both of the above applications.
  • mycotoxicosis A disease caused by mycotoxins is called mycotoxicosis.
  • Mycotoxins can develop multifaceted, usually very harmful effects in humans and animals.
  • the harmful effects of mycotoxins in livestock farming are of great importance in modern agriculture: growth and developmental disorders, susceptibility to further diseases, stock losses and the risk of accumulation in products and ingestion by humans.
  • Mycotoxins are both very heat and acid resistant, so they can not be easily removed by conventional methods. When used in the feed sector, preparations of particular interest are those which combine protection against fungal spoilers with a nutritive effect.
  • a nutritive effect is to be expected if, on the one hand, energetically high-quality ingredients can be combined with one metabolic stimulation. Suitable preparations that combine antifungal activity and metabolic stimulation with each other, are not yet known. Prophylaxis and therapy of fungal diseases
  • Fungal diseases can occur on the most diverse body parts of humans and animals, so also on the mucous membranes or in internal organs. In most cases, skin, nails and / or hair are attacked by fungi. The mucous membranes in the mouth, nose, throat, digestive tract and genitalia can also be attacked by fungi. Mycoses of the mucous membranes are usually caused by fungi of the genus Candida, in particular by Candida albicans. Fungal infections on the skin and skin appendages are particularly common. Fungal infections lead to severe health problems. Fungal infections with fatal consequences, especially in immunocompromised individuals, have increased steadily in recent years. Accordingly, sales of antimycotic agents are increasing.
  • antifungals are available, which are applied locally or systemically. Systemic use is only used if local therapy is unsuccessful.
  • the antimycotics used to treat skin diseases are generally synthetic products that are known to cause significant side effects. Therefore, it requires further, better tolerated means with improved effect and application.
  • a metabolic stimulation is understood to mean the influence, in particular the increase, of the metabolic activity of cells.
  • a metabolic stimulation is understood to mean the influence, in particular the increase, of the metabolic activity of cells.
  • By stimulating the metabolism of eukaryotic cells the formation of new tissue can be stimulated.
  • no preparations have been known which combine an antifungal activity with a metabolic delivery of the eukaryotic host cells.
  • a combination of antimycotic action and support of tissue regeneration is of particular importance in the case of a long-lasting treatment, as required in the treatment of mycoses.
  • An antifungal therapy must necessarily last as long as the tissue needs for complete renewal.
  • Biomass is usually applied in special application forms on the outer and inner body surfaces.
  • the antimycotics are preferably applied locally to the skin as a cream or ointment.
  • the antifungal drug can be delivered to the target site in the form of ointments, lozenges, juices, sprays or suppositories, depending on the affected mucous membrane.
  • the intranasal application of microalgae biomasses requires special effort. It is typically carried out in the form of a dry powder or as particles of mixed components, for example mixed with phospholipids such as e.g.
  • Phosphatidylcholine from a dry powder inhaler or as an aerosol spray from a pressurized container, a pump, a spray, a nebulizer (preferably an electrohydrodynamic nebulizer to produce a fine mist), or nebulizers with or without the use of a suitable propellant such as B. 1, 1, 1, 2-tetrafluoroethane or 1, 1, 1, 2,3,3,3-heptafluoropropane.
  • the powder may comprise a bioadhesive, for example chitosan or cyclodextrin.
  • the product Before use in a dry powder or suspension formulation, the product is micronised to a size suitable for administration by inhalation (typically less than 5 ⁇ m). This can be accomplished by any suitable comminution method such as spiral jet milling, fluidized bed jet milling, supercritical fluid processing to form nanoparticles, high pressure homogenization or spray drying
  • the object of the present invention was to reduce or eliminate one or more of the disadvantages of the prior art.
  • the object has been achieved by microalgae of the species Anabena cylindrica.
  • the use of biomass from cyanobacteria of the strain Anabaena cylindrica Bio33 with the accession number DSM 22930 is particularly advantageous.
  • the components of Anabena cylindrica of strain Bio33 surprisingly combine a high antimycotic activity with a stimulation of the cell metabolism of vertebrate cells.
  • An antifungal activity is understood to mean both an inhibitory effect on the proliferation of the fungi, as well as an inhibitory effect on the viability of the fungi, on the reproductive ability of the fungi, on the sporulation of the fungi, on the colonization ability of the fungi.
  • the high antifungal activity of the metabolically stimulating strains of the species Anabena cylindrica is particularly surprising since other species of the genus Anabena which we have studied have little or no antifungal activity.
  • a metabolic stimulation is understood to mean influencing, in particular increasing, the metabolic activity of cells.
  • the stimulation of mammalian cell metabolism is a novel characterizing feature for selection from a group of microorganisms having antimycotic and / or antibacterial ingredients suitable for use
  • the strain Bio 33 belongs to the species Anabaena cylindrica and was isolated from a water sample taken from the Baltic Sea near the island of Rügen. The tribe was deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) and is available under the accession number DSM 22930.
  • the culture as a laboratory strain can z.
  • BG 11 medium with ⁇ 0.5% NaCl aerobic at room temperature (see also Lukowski et al., 2008) Inhibition of dermal MRSA colonization by microalgal micro- and nanoparticles Skin Pharmacol Physiol; 21, 98- 105, as well as WO 2003/072118).
  • the BG 11 medium is prepared as follows:
  • Citric acid 0.6 g / l
  • 10 ml of the macrostarch stock solution are made up to 1000 ml with the addition of 5 g of NaCl and 1 ml of trace element stock solution and then autoclaved at 121 ° C. for 20 min.
  • Anabaena cylindrica can be industrially cultured under the usual conditions to be observed for filamentous microalgae, which are known to those skilled in the art.
  • the biomass is obtained from Anabena cylindrica. In the cultivation of Anabena cylindrica, the biomass precipitates as an aqueous pulpy suspension.
  • the term biomass includes the entire organic substance of the specified cyanobacteria and parts thereof, which were obtained from the totality of the organic substance or preparations containing further additives.
  • the biomass may comprise or consist of an extract of the totality of the organic substance of the cyanobacteria indicated.
  • an extract may be, for. B. an aqueous extract, an alcoholic extract, an alcoholic / aqueous extract and a fraction enriched by column chromatography and / or an oily (fatty) extract act. Extracts may be from stored or stored, eg.
  • the extracts can be prepared by the cyanobacteria are taken up in a solvent and for a certain period of time, optionally with stirring, extracted.
  • An alcoholic extract is preferably obtained with a solvent containing or consisting of a lower alcohol or a mixture of different lower alcohols, wherein the lower alcohol or alcohols in the total solvent, cumulatively present in a concentration of not less than 50%, preferably from 60% 100%.
  • a lower alcohol is preferably understood as meaning an alcohol having 1 to 4 C atoms, the lower alcohol preferably being methanol, ethanol, n-propanol or isopropanol.
  • An enriched extract is prepared by separation of an alcoholic or alcoholic / aqueous extract of silica gel Si60 and elution with ethyl acetate / methanol / water of different mixing ratios preferably of the ratio 1 + 7 + 2.
  • An oily extract is preferably obtained with a solvent containing or consisting of a lower alkane or a mixture of different lower alkanes, wherein the lower alkanes or the total alkanes present in the solvent cumulatively in a concentration of not less than 50%, preferably from 60% 100%.
  • a lower alkane is understood to mean branched or unbranched alkanes having 3 to 12 carbon atoms, Preferably, the lower alkane is an unbranched alkane having 4 to 8 carbon atoms, more preferably the lower alkane is n-hexane.
  • the extracts according to the invention may be present as extracts which at least partly contain the solvent or as extracts from which the solvent has been removed. If the solvent has been removed from the extract, the extract is preferably present as a solid.
  • the solvent can be removed by evaporation, in particular by rotary evaporation.
  • the extract thus obtained is particularly storage-stable and can preferably be frozen and possibly stored.
  • the biomass is converted into micro- and / or nanoparticles.
  • Microparticles are distinguished by the fact that they are particles with an average diameter of> 1 ⁇ m, which contain or consist of biomass according to the invention.
  • Nanoparticles are characterized in that they are particles with a mean diameter of ⁇ 1 .mu.m to .gtoreq.1 nm, which contain or consist of biomass according to the invention.
  • Methods for producing such micro- and / or nanoparticles are known to the person skilled in the art.
  • WO 2003/072118 describes preferred processes which can be used for producing such micro- and / or nanoparticles.
  • Extracts according to the invention are preferably used for the preparation of the microparticles and / or nanoparticles.
  • micro- and / or nanoparticles are prepared by preparing a suspension (eg according to the rotor-stator principle) containing the biomass according to the invention and optionally an emulsifier (eg Plantacare 2000, with the chemical description C8-16 fatty acid glucosides with a C chain distribution of: C6 max 1%, C8 33-40%, C10 21-28%, C12 27-32%, C14 9-12% and C16 max 1% INCI name is: Decyl Glucoside, the JCIC name is alkyl (8-16) glucosides (Ingredient Code 523007) and then the suspension is homogenized until micro- and / or nanoparticles with the desired mean diameter are formed
  • the microparticles and / or nanoparticles are prepared by mixing 5 g of biomass according to the invention with 0.05 g of emuls
  • Processing of the biomass produced during the cultivation of Anabena cylindrica can also be carried out with the aid of mineral compounds.
  • the conditions must be selected so that the montmorillonites receive their adsorption power as completely as possible or at least partially.
  • Decisive for the use according to the invention is a proportion of montmorillonites with a partially amorphous structure of 10 to 20%.
  • a mineral compound having an amorphous content of SiC> 2 of 60% and a montmorillonite content of about 16% has proved to be particularly advantageous.
  • the structurally and substance-sparing grinding results in a mineral compound with a particularly strong bond to Anabena cylindrica. It produces aggregates with a particularly high adsorptive power and high water absorption capacity.
  • a suspension of the biomass of Anabena cylindrica according to the invention is mixed with the triple-smectite mineral compound prepared as described above until a homogeneous still moist mass (moisture content ⁇ 15%) is formed.
  • the mixing system achieves protein stabilization.
  • silica in finely divided bioactive form In this preparation is silica in finely divided bioactive form. This results in a large adsorption area.
  • a suspension of the biomass of Anabena cylindrica is mixed with the mineral compound prepared as described above, until a homogeneous still moist mass (moisture content ⁇ 15%) is formed.
  • the mixing system achieves protein stabilization.
  • By mixing with a strongly water-absorbing mineral compound it is possible to produce a storage-stable intermediate at temperatures ⁇ 80 ° C. in order to obtain valuable ingredients of Anabena cylindrica.
  • silica in finely divided bioactive form In this preparation is silica in finely divided bioactive form.
  • biomass derived from cyanobacteria of the species Anabena cylindrica solves the problems identified in the prior art.
  • the biomass according to the invention can advantageously be used as a food additive and / or feed additive.
  • a particular inventive aspect of using the biomass as a feed or food additive is that natural preservation against fungal pathogens is achieved by the surprisingly discovered antifungal activity. This also limits mycotoxin formation.
  • Anabena cylindrica contains a mixture of different unsaturated C16 (16: 1 ( ⁇ 7), 16: 2 ( ⁇ 7, 10), 16: 3 ( ⁇ 7, 10, 13), and C18 fatty acids, eg linoleic acid (C18: 2) and linolenic acid (C18: 3) in an advantageous composition
  • C18: 2 e.g linoleic acid
  • C18: 3 eg linolenic acid
  • the particular advantage of using Anabena cylindrica is the concomitant delivery of essential nutritional components and metabolism stimulating components which is essential for a nutritive effect.
  • a suitable mineral composite of bentonites, zeolites and biominerals is produced.
  • the conditions are preferably chosen so that the Montmorillonite and zeolites receive their adsorption as completely as possible or at least partially.
  • the structural and substance-sparing grinding produces a mineral compound with Anabena cylindrica with particularly strong binding for mycotoxins.
  • the clay minerals and zeolites not only bind mycotoxins but also contribute to the stabilization of the intestinal mucosa.
  • the loose colloidal combination of minerals with the ingredients of cyanobacteria favors the uptake of bioactive silicon by the livestock.
  • the plasticity of the porridge is strongly influenced by a small amount of clay minerals.
  • the residence time in the gastrointestinal tract can be controlled.
  • toxins Due to the high absorption power, toxins are formed in addition to mycotoxins and also in the metabolism of the host and intestinal bacteria. Together with the stabilization of the intestinal mucosa by Anabena cylindrica results in a synergistic effect.
  • the present invention also relates to a use of the biomass according to the invention in the prophylaxis and / or therapy of fungal diseases and / or of mycotoxicoses.
  • An essential aspect of the invention is the combination of metabolic stimulation and antimycotic action.
  • This aspect is also in the use for the treatment of mycoses, preferably of mycoses with fungi of the genera Aspergillus, Candida, Micropsorum and / or Mucor, more preferably of mycoses of the species Candida maltosa, Candida albicans and Candida krusei, Aspergillus fumigatus, Mucor spec. and / or Microsporum gypseum of importance.
  • Anabena cylindrica biomass can also be used in combination with other antimycotics to synergistically enhance their action. Also a combination of a local
  • the biomass of Anabena cylindrica according to the invention has a membrane-stabilizing effect on the skin cells.
  • hydrogels, lotions, solutions, creams, ointments, transepidermal water loss is reduced.
  • the skin care is supplemented by high-molecular, sulfated or / and uronic acid-containing polysaccharides, which have a moisture-storing effect and subsequently increase the skin's moisture content.
  • the biomass of Anabena cylindrica invention is therefore ideal for the preparation of preparations that can be used for the prophylaxis of recurrence after the treatment of mycoses.
  • the biomass of the present invention When used on the skin, the biomass of the present invention is generally administered as a formulation in association with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • excipient is used herein to describe all other ingredients other than the biomass of the invention. The choice of excipient depends largely on the particular mode of administration.
  • the ingredients of Anabena cylindrica can also be used well on mucous membranes.
  • processing forms such as gels, creams or ointments (for example noses, genitalia) or suckable or chewable preparations (gummy bears, chewing gum) for use on the oral mucosa.
  • the methods mentioned in the prior art can also be used to convert the biomass of Anabena cylindrica into an application form suitable for intranasal administration.
  • Antifungal agents isolated from Anabena cylindrica can also be used systemically. A combination for local and systemic therapy is possible.
  • the biomass according to the invention can be used as an antimycotic.
  • Antifungal agents are compositions and drugs which have antifungal activity and can be used for the treatment, prophylaxis and / or treatment of mycoses (fungal infections). Treatment with an antifungal agent can lead to a reduction in the overall rate of infection, ie protection against new infections (prophylaxis) or protection against the further spread of existing mycosis (containment). A treatment with an antifungal drug can lead to a focal point of infection can not be further increased, the growth of a herd of infection can be slowed down or stopped (stasis). A treatment with an antimycotic It can also cause an existing infection to become smaller and, if necessary, heal (curation, rehabilitation).
  • the biomass according to the invention is suitable for use in the prophylaxis and / or therapy of mycoses, preferably of mycoses with fungi of the genus Aspergillus, Candida, Microsporum and / or Mucor, more preferably of mycoses of the species Candida maltosa, Candida albicans and Candida krusei, Aspergillus fumigatus, Mucor spec. and / or Microsporum gypseum.
  • the biomass of the invention may preferably be applied topically to the skin or mucosa, i. H. dermally or transdermally.
  • Typical formulations include gels, hydrogels, lotions, solutions, creams, ointments, powders, dressings, foams, films, skin plasters, platelets, implants, sponges, fibers, bandages and microemulsions. Liposomes can also be used.
  • Typical carriers include alcohol, water, mineral oil, liquid petrolatum, white petrolatum, glycerol, polyethylene glycol and propylene glycol. There may be introduced means to enhance the penetration.
  • Formulations for topical administration may be formulated to be released immediately and / or modified. Modified release formulations include those with sustained, sustained, pulsed, controlled, directed and programmed release.
  • the biomass according to the invention can be administered orally. Oral administration may be swallowed so that the compound enters the gastrointestinal tract.
  • Formulations suitable for oral administration include solid formulations such as e.g. For example, tablets; Capsules containing particles, liquids or powders; Pastilles (including liquid-filled); and gizzards; Multi- and nanoparticles; gels; solid solutions; liposomes; Films, vaginal suppositories, sprays and liquid formulations.
  • the liquid formulations include suspensions, solutions, syrups and elixirs. Such formulations may be used as fillers in soft or hard capsules and typically comprise a carrier, for example water, ethanol, polyethylene glycol, propylene glycol, methyl cellulose or a suitable oil, and one or more emulsifiers and / or suspending agents. Liquid formulations can also be prepared by restitution of a solid, for example a sachet.
  • the biomass according to the invention can also be used in rapidly dissolving, rapidly disintegrating dosage forms.
  • the active ingredient may constitute from 1% to 80% by weight of the dosage form, typically from 5% to 60% by weight of the dosage form.
  • the formulation of tablets is described extensively in the art.
  • the biomass of the invention may also be administered intranasally or by inhalation, typically in the form of a dry powder (either alone, as a mixture, for example as a dry mix with lactose or as particles of mixed components, for example mixed with phospholipids such as phosphatidylcholine).
  • a dry powder inhaler or as an aerosol spray from a pressurized container, a pump, a spray, a nebulizer (preferably an electrohydrodynamic nebulizer to produce a fine mist), or nebulizers with or without the use of a suitable propellant, e.g. B. 1, 1, 1, 2-tetrafluoroethane or 1,1,1,3,3,3,3-heptafluoropropane.
  • the powder may comprise a bioadhesive, for example chitosan or cyclodextrin.
  • Pressure vessel, pump, spray, nebulizer or nebulizer contain a solution or suspension of the biomass according to the invention comprising, for example, ethanol, aqueous ethanol or a suitable alternative means for dispersing, solubilizing or prolonging the release of the active ingredient, propellant as solvent and an optional surfactant such as As sorbitan trioleate, oleic acid or an oligolactic acid.
  • the drug product Prior to use in a dry powder or suspension formulation, the drug product is micronized to a size suitable for administration by inhalation (typically less than 5 ⁇ m).
  • Capsules for example of gelatin or hydroxypropylmethylcellulose
  • blisters and cartridges for use in an inhaler or insufflator may be formulated containing a powder mix of the compound of the invention, a suitable powder base such as lactose or starch and a performance modifier such as L-leucine , Mannitol or magnesium stearate.
  • the lactose may be anhydrous or in the form of the monohydrate, the latter being preferred.
  • suitable excipients include dextran, glucose, maltose, sorbitol, xylitol, fructose, sucrose and trehalose.
  • a suitable solution formulation for use in a nebulizer with electrohydrodynamics to produce a fine mist may contain from 1 ⁇ g to 20 mg of the compound of the invention per actuation, and the volume of actuation may vary from 1 ⁇ l to 100 ⁇ l.
  • a typical formulation may be biomass, propylene glycol, sterile water, ethanol and sodium chloride according to the invention include.
  • Alternative solvents that can be used in place of propylene glycol include glycerol and polyethylene glycol.
  • Formulations for inhalation administration / intranasal administration may be formulated for immediate and / or modified release using, for example, PGLA. Modified release formulations include those with sustained, sustained, pulsed, controlled, directed and programmed release.
  • the dosing unit is determined by means of a valve which provides a measured amount.
  • Units of the invention are typically designed to administer a metered dose or inhalation containing 0.001 mg to 10 mg of the biomass of the invention.
  • the total daily dose is typically in the range of 0.001 mg to 40 mg and may be administered as a single dose or usually in the form of divided doses throughout the day.
  • the compounds according to the invention can be administered rectally or vaginally, for example in the form of a suppository, pessary or enema. Cocoa butter is a common suppository base, but various alternatives can be used as needed.
  • Formulations for rectal / vaginal administration may be formulated for immediate and / or modified release. Modified release formulations include those with sustained, sustained, pulsed, controlled, directed and programmed release.
  • the present invention also relates to a method for the treatment of mycoses, characterized in that a subject in need of such treatment is brought into contact with an effective dose of a biomass according to the invention.
  • the term effective dose is a dose which, after its administration, if appropriate several times, leads to a detectable, positive treatment result, wherein the treatment result can consist, for example, in prophylaxis, stasis, curation and / or rehabilitation (see above).
  • the subject to be treated is preferably a mammal, more preferably a human.
  • treating refers to the inversion, alleviation or inhibition of the progression of a disease, disorder or condition or one or more symptoms of such disease, disorder or condition to which that term applies.
  • treating may also refer to It is understood that the likelihood or frequency with which a disease, disorder or condition occurs in a mammal compared to an untreated control population or compared to the same mammal prior to treatment, is reduced.
  • treating may also refer to the prevention of a disease, disorder or condition and may also delay or prevent the onset of a disease, disorder or condition, or delay or prevention of disease Include, disorder or condition related symptoms.
  • treating may also refer to reducing the severity of a disease, disorder or condition or symptoms associated with such disease, disorder or condition prior to the mammal being deprived of the disease Illness, disorder or condition. Such prevention or reduction of the severity of a disease, disorder or condition prior to infestation relates to the administration of the composition of the present invention as described herein to an individual not at the time of administration of the disease, disorder or condition is infested. As used herein, “treating” may also refer to preventing the recurrence of a disease, disorder or condition, or one or more of the symptoms associated with such disease, disorder or condition. As used herein, the terms “treatment” and “therapeutic” refer to the act of treating as defined above by “treating.”
  • the present invention thus also relates to a use of the biomass according to the invention as a preservative, in particular as a preservative for the preservation of foods, semi-luxury foods, cosmetics and / or other compositions intended for contact with human or animal skin.
  • the biomass according to the invention can also be used as a food additive with antifungal activity.
  • the biomass according to the invention can be used to prevent fungal attack or to delay fungal growth in foods, stimulants and / or cosmetics.
  • FIG. 1 shows the metabolically regenerative effect of biomass of the cyanobacterial strain Anabena cylindrica Bio 33 on mammalian cells. Shown is the glucose consumption in% compared to the control over time.
  • FIG. 2 shows the influence of biomass of the cyanobacterial strain Anabena cylindrica Bio 33 on skin to skin transmission of Candida albicans. The invention will be explained in more detail below on the basis of exemplary embodiments.
  • Example 1 Preparation of aqueous, alcoholic, alcoholic / aqueous and enriched and oily extracts
  • Cyanobacteria in particular cyanobacteria of strain Bio33 of the species Anabaena cylindrica, were each dissolved in distilled water (aqueous extract), methanol (alcoholic extract), in mixtures of methanol / water of different proportions (alcoholic-aqueous extract) or n-hexane (oily extract) suspended as solvent and stirred for 3 hours at room temperature.
  • Enrichment of the antimycotic agents was carried out by column chromatographic separation of the methanol and / or methanol / water extract using silica gel Si60 and elution of the antimycotic agents using ethyl acetate / methanol / water 1 + 7 + 2 to obtain fraction FIII (enriched extract ).
  • the solvents were then removed using a rotary evaporator under vacuum at 40 0 C.
  • the extracts were stored at -20 0 C until use.
  • the biomass in particular the extracts from Example 1, were taken up in an aqueous solution containing an emulsifier and pre-suspended. This pre-suspension was then used to make the microparticles and nanoparticles.
  • 5 g extract and 0.05 g emulsifier (Plantacare 2000) were taken up in 45 g demineralized water, pre-suspended and then at a working pressure of 500-600 bar and a temperature of 25 ° C to 50 ° C in a high pressure homogenizer (APV Germany GmbH, Unna, Germany) in 4 cycles until microparticles and nanoparticles having the desired mean diameter are homogenized.
  • the mean particle diameter was determined by means of a laser diffractometer (Malvern Mastersizer X, Malvern, GB) at a wavelength of 633 nm.
  • the testing of the antifungal activity of the extracts from Anabena cylindrica Bio33 was carried out in accordance with the diffusion method for the microbiological determination of the value of antibiotics of the European Pharmacopoeia in the agar plate diffusion test.
  • a germ suspension was incorporated into the hand-warm nutrient agar and, after solidification of the surface, the platelets (diameter 6 mm) loaded with 2 mg extract each were applied.
  • Example 1 The preparation of the extracts was carried out as described above (Example 1).
  • the agar plate diffusion test was also used (platelet method), but a special nutrient medium was used for the antimycotactic test (test medium: RPMI agar, AB Biodisk company, synthetic medium for antimycotics). Testing according to NCCLS standard) and the following germs are used:
  • Table 2 Results of the antimycotic testing of various extracts of Anabaiba and Pseudanabaena species; Duplicate determination, indication of the average values of the diameter of the stopcock incl. Diameter of test leaflets 6 mm; N. G. not tested)
  • the aqueous extract Upon extraction of the biomass successively with n-hexane, methanol, methanol / water, water, the aqueous extract showed no activity, upon extraction without the intermediate MeOH / water, the aqueous extract was active.
  • Example 4 Metabolism-promoting effect of biomass of the cyanobacterial strain
  • DMEM without phenol red with 1000 mg / l glucose and 1 10 mg / l Na pyruvate (Gibco) modified with 20 mM L-glutamine, 1 M Hepes, 5 U penicillin / 5 mg streptomycin / ml (Sigma) and 10% FCS (Biochrom KG, Berlin)
  • Elimination of cell division First, a mitomycin C stock solution was prepared from 2 mg Mitomycin C (Sigma) dissolved in 0.1 ml DMSO and 1, 9 ml PBS and frozen in 50 ⁇ l aliquots.
  • the cell culture medium was decanted from the confluent cell lawn of the FL cell culture, replaced with 5 ml of culture medium with 50 ⁇ l Mitomyxin stock solution and incubated for 2 hours / 37 ° C. Then it was washed 3 times with PBS (without Ca ++ 1 Mg ++ , PAA), the cells were detached with trypsin / EDTA (Sigma), the cell count was determined and adjusted to a concentration of 4 ⁇ 10 5 / ml with cell culture medium.
  • Cultivation on the cell carriers 1 ml of cell suspension was applied to the cell carriers (13 mm round, Thermanox platelets (Nunc Ine, Naperville, IL USA) in a Minusheet cell holder system (Minucells & Minutissuemaschines GmbH, Bad Abbach) in a microcentrifuge tub 24 Well cell culture plate (Nunc GmbH & CoKg, Wiesbaden) pipetted, cultured for 24 hours (37 0 C, 5% CO 2, 97% humidity) and then each set up six cell carriers in a perfusion cell chamber upright.
  • Extracts produced from the biomass of Anabaena cylindrica Bio33 showed broad antifungal activity.
  • Anabaena cylindrica Bio 33 biomasses are capable of preventing the transmission of fungi from a contaminated piece of skin (donor) to a germ-free piece of skin (acceptor) (Figure 2).
  • the detection was carried out as follows: The test strain used was the Candida albicans strain ATCC10231 (culture collection of the Friedrich Loeffler Institute for Medical Microbiology, University of Greifswald, reference strain)
  • the colonies were suspended in 0.9% NaCl solution to obtain an optical density of 0.32 (OD 600 ). This solution was then diluted 1: 3.
  • the donor cow udders were infected on a labeled section (10 x 10 mm) with 10 ⁇ l of Candida a / ⁇ / cans suspension. Thereafter, the Donator-Kutesuterzitzen were incubated for 90 min at 30 0 C in the incubation (Jouan EB 53, Jouan GmbH, Unterhaching).
  • Acceptor udder teats were treated on a labeled section (10 x 10 mm) with a 1% Bio-33 containing ointment and ointment (control). The number of uterine teats was 12 in each case. After 90 minutes' contact time of the ointment, the donor and acceptor teats were rubbed together for 10 s. Thereafter, the acceptor teats were incubated at 30 ° C. for 90 minutes. Subsequently, the teats were spread on Sabouraud glucose agar plates (Heipha Dr. Müller GmbH, Eppelheim) and incubated at 37 0 C for 24 hours. At the end the colony forming units were determined and counted.

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die Bereitstellung von Biomasse des Cyanobakterienstamms Anabaena cylindrica Bio 33 für die Verwendung als Konservierungsstoff mit nutritiver Wirkung, zur Verhinderung von Mykotoxikosen, als Antimykotikum, zur Stoffwechselstimulation, bei der Gewebeneubildung und/oder zur Wundheilung.

Description

Biomasse aus Cyanobakterien mit antimykotischer Wirkung
Biomassen mit antimykotischen Wirkungen sind für sehr unterschiedliche Anwendungen von Interesse. Typischerweise erfolgt die Anwendung auf äußeren oder inneren Körperoberflä- chen.
Ein sehr großes Gebiet umfasst Anwendungen in der Land- und Ernährungswirtschaft beim Schutz von Futter- und Lebensmitteln vor pilzlichen Verderbniserregern. Ein ganz anderes Anwendungsgebiet für antimykotische Biomassen ist die Prophylaxe und Therapie von Pilzerkrankungen.
Ein besonderer Vorteil wird erreicht, wenn mit der antimykotischen Wirkung andere nützliche Wirkungen verbunden sind. Von besonderem Interesse ist eine Stoffwechselstimulierung, die bei beiden oben genannten Anwendungsbereichen Vorteile erbringt.
Anwendungen in der Land- und Ernährungswirtschaft
Bei einem Pilzbefall von Futter- oder Lebensmitteln, insbesondere bei einem Befall mit
Schimmelpilzen, werden sekundäre Stoffwechselprodukte gebildet, die bei Wirbeltieren bereits in geringsten Mengen giftig wirken. Eine durch Mykotoxine verursachte Erkrankung wird Mykotoxikose genannt. Die FAO schätzt, dass ca. 25 % der Welt-Nahrungsproduktion und damit auch der Futtermittelproduktion Mykotoxine enthalten. Mykotoxine können bei Menschen und Tieren vielgestaltige, meist sehr schädliche Wirkungen entfalten. Die Schadwirkung von Mykotoxinen in der Tierhaltung ist in der modernen Landwirtschaft von großer Bedeutung: Wachstums- und Entwicklungsstörungen, Anfälligkeit für weitere Krankheiten, Bestandsverluste sowie die Gefahr der Anreicherung in Produkten und der Aufnahme durch den Menschen mit der Nahrung. Mykotoxine sind sowohl sehr hitze- als auch säurebeständig, so dass sie mit herkömmlichen Verfahren schlecht entfernt werden können. Bei der Anwendung im Futtermittelbereich sind Präparate von besonderem Interesse, die einen Schutz vor pilzlichen Verderbniserregern mit einem nutritiven Effekt verbinden. Ein nutritiver Effekt ist zu erwarten, wenn einerseits energetisch hochwertige Inhaltsstoffe mit einer Stoffwechselstimulierung andererseits verbunden werden können. Dafür geeignete Präparate, die antimykotische Wirkung und Stoffwechselstimulierung miteinander verbinden, sind bisher nicht bekannt. Prophylaxe und Therapie von Pilzerkrankungen
Pilzerkrankungen, auch Pilzinfektionen oder Mykosen genannt, können an den verschiedensten Körperstellen von Menschen und Tieren auftreten, so auch an den Schleimhäuten oder in inneren Organen. In den meisten Fällen werden Haut, Nägel und/oder Haare von Pilzen befallen. Auch die Schleimhäute in Mund, Nase, Rachen, Verdauungstrakt und Geschlechtsorganen können von Pilzen befallen werden. Mykosen der Schleimhäute werden meist durch Pilze der Gattung Candida hervorgerufen, insbesondere durch Candida albicans. Besonders häufig kommt es zu Pilzinfektionen auf der Haut und Hautanhangsgebilden. Pilzinfektionen führen zu starken gesundheitlichen Beeinträchtigungen. Pilzinfektionen mit Todesfolge, insbesondere bei immunsystemgeschwächten Personen, haben in den letzten Jahren stetig zugenommen. Dementsprechend steigen Umsätze antimykotischer Mittel. Zur Therapie stehen verschiedene Antimykotika zur Verfügung, die lokal oder systemisch angewandt werden. Eine systemische Anwendung wird nur eingesetzt, wenn eine lokale Therapie nicht zum Erfolg führt. Bei den zur Behandlung von Hautkrankheiten verwendeten Antimykotika handelt es sich im Allgemeinen um synthetische Produkte, von denen bekannt ist, dass sie erhebliche Nebenwirkungen hervorrufen können. Deshalb bedarf es weiterer, besser verträglicher Mittel mit verbesserter Wirkung und Anwendung.
Bei einer antimykotischen Prophylaxe und Therapie ist die Förderung des Stoffwechsels der Wirtszellen von besonderer Bedeutung. Unter einer Stoffwechselstimulation wird dabei die Beeinflussung, insbesondere die Erhöhung, der metabolischen Aktivität von Zellen verstan- den. Durch die Anregung des Stoffwechsels von eukaryontischen Zellen kann die Neubildung von Gewebe stimuliert werden. Auch für diesen Anwendungsbereich sind bisher keine Präparate bekannt, die eine antimykotische Aktivität mit einer Stoffwechselförderung der eukaryotischen Wirtszellen verbinden. Eine Kombination aus antimykotischer Wirkung und Unterstützung der Gewebsneubildung ist aber gerade bei einer lang andauernden Behandlung, wie sie bei der Therapie von Mykosen erforderlich ist, von besonderer Bedeutung. Eine antimykotische Therapie muss unbedingt so lange andauern, wie das Gewebe zur vollständigen Erneuerung braucht. Bei Hautpilz sind vier bis sechs Wochen, bei Haarpilz vier bis sechs Monate und bei Nagelpilz sogar zehn bis zwölf Monate erforderlich. Gerade während dieser lang andauernden Anwendung wäre es von großem Vorteil, über Präparate zu verfügen, die antimykotische Wirksamkeit und Unterstützung der Gewebeneubildung bzw. Hautpflege miteinander verknüpfen. Eine Stimulierung des Stoffwechsels von Haut- oder Schleimhautzellen macht diese widerstandsfähiger gegen die Invasion von pathogenen Keimen. Insbesondere wird die unspezifische Abwehr der Haut bzw. der Schleimhaut angeregt. Es wäre vorteilhaft, wenn bei einer Anwendung auf äußeren und inneren Körperoberflächen das Attachment von Krankheitserregern verhindert werden könnte. Spezielle Applikationsformen
Biomassen werden in der Regel in besonderen Applikationsformen auf die äußeren und inneren Körperoberflächen aufgebracht. Bei Mykosen der Haut werden die Antimykotika bevorzugt als Creme oder Salbe lokal auf die Haut aufgetragen. Bei Mykosen der Schleimhäute kann das Antimykotikum - je nach der befallenen Schleimhaut - in Form von Salben, Lutschtabletten, Säften, Sprays oder Zäpfchen an den Zielort gebracht werden. Die intranasale Applikation von Mikroalgenbiomassen erfordert besonderen Aufwand. Sie erfolgt typischerweise in Form eines trockenen Pulvers oder als Teilchen gemischter Komponenten, zum Beispiel gemischt mit Phospholipiden wie z. B. Phosphatidylcholin, aus einem Tro- ckenpulver-lnhalator oder als Aerosol-Spray aus einem Druckbehälter, einer Pumpe, einem Spray, Zerstäuber (vorzugsweise einem Zerstäuber mit Elektrohydrodynamik, um einen feinen Nebel zu erzeugen) oder Vernebler mit oder ohne Verwendung eines geeigneten Treibmittels wie z. B. 1 ,1 ,1 ,2-Tetrafluorethan oder 1 ,1 ,1 ,2,3,3,3-Heptafluorpropan. Für die intranasale Anwendung kann das Pulver einen Biokleber umfassen, zum Beispiel Chitosan oder Cyclodextrin. Vor Verwendung in einer Trockenpulver- oder Suspensionsformulierung wird das Produkt zu einer Größe mikronisiert, die zur Gabe durch Inhalieren geeignet ist (typischerweise weniger als 5 μm). Dies kann erreicht werden mit Hilfe irgendeines geeigneten Zerkleinerungsverfahrens wie etwa Spiralstrahlmahlen, Wirbelschichtstrahlmahlen, Verarbeitung als überkritische Flüssigkeit unter Bildung von Nanoteilchen, Hochdruckhomogenisieren oder Sprühtrocknen
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, einen oder mehrere der Nachteile des Standes der Technik zu vermindern oder zu beseitigen. Insbesondere war es eine Aufgabe der Erfindung neue Zusammensetzungen aus Biomassen mit antimykotischer Wirkung
a) für Anwendungen in der Land- und Ernährungswirtschaft und
b) für die Prophylaxe und Therapie von Pilzerkrankungen
bereitzustellen. Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß durch Mikroalgen der Art Anabena cylindrica gelöst. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von Biomasse aus Cyanobakterien des Stamm Anabaena cylindrica Bio33 mit der Hinterlegungsnummer DSM 22930. Die Inhaltstoffe von Anabena cylindrica vom Stamm Bio33 vereinen überraschenderweise eine hohe antimykoti- sehe Aktivität mit einer Stimulierung des Zellstoffwechsels von Wirbeltierzellen.
Unter einer antimykotischen Wirkung wird dabei sowohl eine hemmende Wirkung auf die Proliferation der Pilze verstanden, als auch eine hemmende Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Pilze, auf die Fortpflanzungsfähigkeit der Pilze, auf die Sporenbildung der Pilze, auf die Besiedelungsfähigkeit der Pilze.
Die hohe antimykotische Aktivität der stoffwechselstimmulierenden Stämme der Art Anabena cylindrica ist besonders überraschend, da andere von uns untersuchte Arten der Gattung Anabena keine oder nur geringe antimykotische Aktivität aufwiesen.
Unter einer Stoffwechselstimulation wird die Beeinflussung, insbesondere die Erhöhung, der metabolischen Aktivität von Zellen verstanden.
Es war bisher nicht bekannt, dass der Stoffwechsel von eukaryotischen Zellen von Säugern durch Biomassen von Cyanobakterien angeregt werden kann, während gleichzeitig die ebenfalls eukaryotischen Pilzzellen und/oder prokaryotische Zellen gehemmt werden.
Die Stimulierung des Stoffwechsels von Säugerzellen, nachgewiesen beispielsweise in einer Perfusionszellkultur nach Beispiel 2, ist ein neues kennzeichnendes Merkmal für die Auswahl aus einer Gruppe von Mikroorganismen mit antimykotischen und/oder antibakteriellen Inhaltstoffen, die für eine Verwendung
a) für Anwendungen in der Land- und Ernährungswirtschaft und
b) für die Prophylaxe und Therapie von Pilzerkrankungen
besonders geeignet sind.
Die beste Wirkung wurde mit Biomasse aus Cyanobakterien der Art Anabaena cylindrica erzielt, insbesondere mit erfindungsgemäßer Biomasse, die aus Cyanobakterien des Stamms Anabaena cylindrica Bio 33 mit der Hinterlegungsnummer DSM 22930 gewonnen wurde.
Der Stamm Bio 33 gehört zur Art Anabaena cylindrica und wurde aus einer Wasserprobe isoliert, die der Ostsee in der Nähe der Insel Rügen entnommen wurde. Der Stamm wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) hinterlegt und ist unter der Hinterlegungsnummer DSM 22930 erhältlich.
Die Kultur als Laborstamm kann z. B. in BG 11-Medium mit ±0,5% NaCI aerob bei Raum- temperatur erfolgen (siehe auch Lukowski et al. (2008) Inhibition of dermal MRSA colonization by microalgal micro- and nanoparticles. Skin Pharmacol Physiol; 21 , 98-105; sowie WO 2003/072118). Das BG 11 -Medium wird wie folgt hergestellt:
Makroelementenstammlösung:
NaNO3 150 g/l
MgSO4 x 7 H2O 7,5 g/l
CaCI2 x 6 H2O 5,3 g/l
Zitronensäure 0,6 g/l
EDTA-di-Natriumsalz 0,1 g/l
Na2CO3 2 g/l
K2HPO4 3,1 g/l
Eisenammoniumcitrat 0,6 g/l
Spurenelementestammlösung:
H3BO3 61 mg/l
MnSO4 x 4 H2O 223 mg/l
ZnSO4 x 7 H2O 287 mg/l
CuSO4 x 5 H2O 2,5 mg/l
(NH4)6Mo7O24 x 4 H2O 12,5 mg/l
10 ml der Makroelementenstammlösung werden unter Zusatz von 5 g NaCI sowie 1 ml Spurenelementestammlösung mit aqua dest zu 1000 ml aufgefüllt und anschließend 20 min bei 121 °C autoklaviert. Anabaena cylindrica kann unter den üblichen für fädige Mikroalgen einzuhaltenden Bedingungen, die dem Fachmann bekannt sind, industriell kultiviert werden.
Dabei wird die Biomasse von Anabena cylindrica gewonnen. Bei der Kultivierung von Anabena cylindrica fällt die Biomasse als wässrig-breiige Suspension an. Dabei umfasst der Begriff Biomasse die gesamte organische Substanz der angegebenen Cyanobakterien sowie Teile davon, die aus der Gesamtheit der organischen Substanz gewonnen wurden oder Zubereitungen, die weitere Zusätze enthalten. Beispielsweise kann die Biomasse einen Extrakt aus der Gesamtheit der organischen Substanz der angegebenen Cyanobakterien umfassen oder daraus bestehen. Bei einem solchen Extrakt kann es sich z. B. um einen wässrigen Extrakt, einen alkoholischen Extrakt, einen alkoholisch/wässrigen Extrakt sowie eine durch Säulenchromatografie angereicherte Fraktion und/oder um einen öligen (fetthaltigen) Extrakt handeln. Die Extrakte können aus fri- sehen oder gelagerten, z. B. getrockneten, Cyanobakterien hergestellt werden. Bevorzugt können die Extrakte hergestellt werden, indem die Cyanobakterien in einem Lösungsmittel aufgenommen und für einen bestimmten Zeitraum, ggf. unter Rühren, extrahiert werden. Der Extraktionsvorgang wird bevorzugt bei einer vorher festgelegten Temperatur durchgeführt, bevorzugt liegt die Temperatur in einem Bereich von 00C und 1000C, besonders bevorzugt in einem Bereich von 100C und 95°C. Ebenfalls können Extrakte durch säulenchromatografi- sche Trennung zu angereicherten Fraktionen (=angereicherten Extrakten) verarbeitet werden.
Zur Herstellung wässriger, alkoholischer oder öliger Extrakte werden geeignete Lösungsmit- tel eingesetzt.
Ein alkoholischer Extrakt wird bevorzugt mit einem Lösungsmittel enthaltend oder bestehend aus einem niederen Alkohol oder einer Mischung verschiedener niederer Alkohole gewonnen, wobei der oder die niederen Alkohole im Lösungsmittel insgesamt, kumulativ in einer Konzentration von nicht weniger als 50 % vorliegen, bevorzugt von 60 % bis 100 %. Unter einem niederen Alkohol wird vorzugsweise ein Alkohol mit 1 bis 4 C-Atomen verstanden, bevorzugt ist der niedere Alkohol Methanol, Ethanol, n-Propanol oder iso-Propanol.
Ein angereicherter Extrakt wird durch Auftrennung eines alkoholischen bzw. alkoho- lisch/wässrigen Extraktes an Kieselgel Si60 und Elution mit Ethylazetat/MethanoIΛ/Vasser unterschiedlicher Mischungsverhältnisse bevorzugt des Verhältnisses 1 +7+2 hergestellt.
Ein öliger Extrakt wird bevorzugt mit einem Lösungsmittel enthaltend oder bestehend aus einem niederen Alkan oder einer Mischung verschiedener niederer Alkane gewonnen, wobei der oder die niederen Alkane im Lösungsmittel insgesamt, kumulativ in einer Konzentration von nicht weniger als 50 % vorliegen, bevorzugt von 60 % bis 100 %. Unter einem niederen Alkan werden verzweigte oder unverzweigte Alkane mit 3 bis 12 C-Atomen verstanden, be- vorzugt ist das niedere Alkan ein unverzweigtes Alkan mit 4 bis 8 C-Atomen, besonders bevorzugt ist das niedere Alkan n-Hexan.
Die erfindungsgemäßen Extrakte können als Extrakte vorliegen, die das Lösungsmittel noch mindestens teilweise enthalten oder als Extrakte, denen das Lösungsmittel entzogen wurde. Ist das Lösungsmittel dem Extrakt entzogen worden, liegt der Extrakt bevorzugt als Feststoff vor. Dem Fachmann sind Methoden und Verfahren bekannt, mit denen einem Extrakt das Lösungsmittel entzogen werden kann. Beispielsweise kann das Lösungsmittel mittels Verdampfen, insbesondere mittels Rotationsverdampfen, entzogen werden. Der derart gewon- nene Extrakt ist besonders lagerstabil und kann bevorzugt eingefroren und ggf. gelagert werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Biomasse in Mikro- und/oder Nanopartikel umgewandelt. Mikropartikel zeichnen sich dadurch aus, dass es sich um Parti- kel mit einem mittleren Durchmesser von > 1 μm handelt, die erfindungsgemäße Biomasse enthalten oder daraus bestehen. Nanopartikel zeichnen sich dadurch aus, dass es sich um Partikel handelt mit einem mittleren Durchmesser von < 1 μm bis≥ 1 nm, die erfindungsgemäße Biomasse enthalten oder daraus bestehen. Verfahren zur Herstellung solcher Mikro- und/oder Nanopartikel sind dem Fachmann bekannt. Insbesondere sind in WO 2003/072118 bevorzugte Verfahren beschrieben, die zur Herstellung solcher Mikro- und/oder Nanopartikel verwendet werden können. Bevorzugt werden erfindungsgemäße Extrakte zur Herstellung der Mikro- und/oder Nanopartikel eingesetzt. Bevorzugt werden Mikro- und/oder Nanopartikel dadurch hergestellt, dass eine Suspension hergestellt wird (z. B. nach dem Rotor-Stator- Prinzip) enthaltend die erfindungsgemäße Biomasse und ggf. einen Emulgator (z. B. Plantacare 2000, mit der chemischen Beschreibung C8-16 Fettsäure-Glucoside mit einer C- Kettenverteilung von: C6 max. 1 %; C8 33 - 40 %; C10 21 - 28 %; C12 27 - 32 %; C14 9 - 12 % und C16 max. 1 %, der INCI-Name ist: Decyl Glucoside, der JCIC Name ist: Alkyl (8 - 16) Glucoside (Ingredient Code 523007) und anschließend die Suspension solange homogenisiert wird, bis Mikro- und/oder Nanopartikel mit dem gewünschten mittleren Durchmesser entstehen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Mikro- und/oder Nanopartikel hergestellt, indem 5 g erfindungsgemäße Biomasse mit 0,05 g Emulgator (Plantacare 2000) und 45 g demineralisiertem Wasser bei einem Druck von 600 bar und einer Temperatur von 25°C über 4 Zyklen in einem Hochdruckhomogenisator homogenisiert werden.
Die Verarbeitung der bei der Kultivierung von Anabena cylindrica anfallenden Biomasse kann auch mit Hilfe von Mineralverbünden erfolgen. Vorzugsweise nutzt man einen Tripel-Smectit-Mineralverbund, der erfindungsgemäß durch struktur- und substanzschonendes Vermählen von aus fossilem Diatomeenschlamm entstandenem Sedimentgestein mit Kalk und Bentonit hergestellt wird. Die Bedingungen müs- sen so gewählt werden, dass die Montmorillonite ihre Adsorptionskraft möglichst ganz oder zumindest teilweise erhalten. Maßgebend für die erfindungsgemäße Verwendung ist ein Anteil an Montmorilloniten mit teilweise amorpher Struktur von 10 bis 20 %. Als besonders vorteilhaft hat sich ein Mineralverbund mit einem amorphen Anteil von SiC>2 von 60 % und einem Montmorillonitanteil von etwa 16 % erwiesen.
Durch das struktur- und substanzschonende Vermählen entsteht ein Mineralverbund mit besonders fester Bindung zu Anabena cylindrica. Es entstehen Aggregate mit einer besonders hohen Adsorptionskraft und hohem Wasseraufnahmevermögen. Zur Herstellung eines lagerstabilen Zwischenproduktes wird eine Suspension der Biomasse von Anabena cylindrica erfindungsgemäß mit dem wie oben beschrieben hergestellten Tripel-Smectit-Mineralverbund versetzt, bis eine homogene noch feuchte Masse (Feuchtigkeitsgehalt < 15 %) entsteht. Durch das Mischsystem wird eine Eiweißstabilisierung erreicht. Durch die Vermischung mit dem stark wasseraufnehmenden Tripel-Smectit-Mineralverbund kann die Herstellung eines lagerstabilen Zwischenproduktes bei Temperaturen < 80 0C erfolgen, um wertvolle Inhaltsstoffe der Mikroalge zu erhalten. In dieser Zubereitung befindet sich Kieselsäure in feinstverteilter bioaktiver Form. Das hat eine große Adsorptionsfläche zur Folge. Zur Herstellung eines lagerstabilen Zwischenproduktes wird eine Suspension der Biomasse von Anabena cylindrica mit dem wie oben beschrieben hergestellten Mineralverbund versetzt, bis eine homogene noch feuchte Masse (Feuchtigkeitsgehalt < 15 %) entsteht. Durch das Mischsystem wird eine Eiweißstabilisierung erreicht. Durch die Vermischung mit einem stark wasseraufnehmenden Mineralverbund kann die Herstellung eines lagerstabilen Zwi- schenproduktes bei Temperaturen < 80 °C erfolgen, um wertvolle Inhaltsstoffe der Anabena cylindrica zu erhalten. In dieser Zubereitung befindet sich Kieselsäure in feinstverteilter bioaktiver Form.
Die Bereitstellung von Biomasse, die aus Cyanobakterien der Art Anabena cylindrica gewonnen wird, löst die im Stand der Technik aufgezeigten Probleme. Die erfindungsgemäße Biomasse kann vorteilhafter Weise als Lebensmittelzusatzstoff und/oder Futtermittelzusatzstoff eingesetzt werden. Ein besonderer erfinderischer Aspekt bei einer Anwendung der Biomasse als Futter- oder Lebensmittelzusatzstoff ist, dass durch die überraschend aufgefundene antimykotische Wirkung eine natürliche Konservierung gegen pilzliche Erreger erreicht wird. Damit wird auch die Mykotoxinbildung eingeschränkt.
Darüber hinaus werden beim Einsatz der erfindungsgemäßen Biomassen aus Anabena cylindrica als Futtermittelzusätze folgende Vorteile erreicht:
> Zuführung von ernährungsphysiologisch wertvollen Lipiden, Proteinen, Kohlenhydra- ten, Vitaminen und Mineralstoffen.
> Gleichzeitig Zuführung von stoffwechselaktivierenden Komponenten.
> Gleichzeitig Stabilisierung der Darmschleimhaut gegen das Attachment von pathoge- nen Mikroorganismen und von diesen gebildeten Toxinen. Die Art Anabena cylindrica enthält eine Mischung verschiedener ungesättigter C16 (16:1 (Δ7), 16:2 (Δ7, 10), 16:3 (Δ7, 10, 13), sowie C18-Fettsäuren, z.B. Linolsäure (C18:2) und Linolensäure (C18:3) in einer vorteilhaften Zusammensetzung. Der besondere Vorteil der Verwendung von Anabena cylindrica liegt in der gleichzeitigen Zuführung essentieller Nahrungsbestandteile und .stoffwechselstimulierender Komponenten, die für einen nutritiven Effekt wesentlich ist.
Es war bisher nicht bekannt, dass der Stoffwechsel von eukaryotischen Zellen durch Biomassen von Anabena cylindrica angeregt wird. Die gleichzeitige Zuführung essentieller Nahrungsbestandteile und stoffwechselstimulierender Komponenten ist deshalb erfinderisch.
Bei der Herstellung von Futtermitteln hat die Mykotoxinbildung teilweise schon eingesetzt, bevor die erfindungsgemäße Biomasse zugesetzt werden kann. Dieses Problem kann gelöst werden, wenn wie bei der Aufbereitung der Biomassen beschrieben die Absorption der Biomasse an Mineralverbünde erfolgt.
Völlig überraschend zeigt sich bei erfindungsgemäß hergestellten Kombinationen von Anabena cylindrica mit dem Mineralverbund eine hohe Adsorptionskraft für Mykotoxine. Durch diese starken Bindungen an die mineralischen Komponenten werden bereits vor Zusatz des Anabena cylindrica -Mineralverbundes gebildete Mykotoxine inaktiviert.
Vorzugsweise wird ein dafür geeigneter Mineralverbund aus Bentoniten, Zeolithen und Biomineralien hergestellt. Die Bedingungen werden dabei bevorzugt so gewählt, dass die Montmorillonite und Zeolithe ihre Adsorptionskraft möglichst ganz oder zumindest teilweise erhalten. Durch das struktur- und substanzschonende Vermählen entsteht ein Mineralverbund mit Anabena cylindrica mit besonders fester Bindung für Mykotoxine. Die Tonminerale und Zeolithe binden nicht nur Mykotoxine sondern tragen darüber hinaus zur Stabilisierung der Darmschleimhaut bei. Die lockere kolloidale Verbindung der Mineralstoffe mit den Inhaltsstoffen der Cyanobakterien begünstigt die Aufnahme von bioaktivem Silizium durch die Nutztiere. Überraschenderweise wird schon durch einen geringen Anteil an Tonmineralen die Plastizität des Nahrungsbreis stark beeinflusst. Damit kann u. a. die Verweildauer im Magen-Darm- Kanal gesteuert werden.
Durch die hohe Absorptionskraft werden neben Mykotoxinen auch im Stoffwechsel des Wir- tes und von Darmbakterien gebildete Toxine gebunden. Zusammen mit der Stabilisierung der Darmschleimhaut durch Anabena cylindrica ergibt sich ein synergistischer Effekt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine Verwendung der erfindungsgemäßen Biomasse in der Prophylaxe und/oder Therapie von Pilzerkrankungen und/oder von Mykotoxikosen.
Ein wesentlicher Aspekt der Erfindung ist die Kombination von Stoffwechselstimulierung und antimykotischer Wirkung. Dieser Aspekt ist auch bei der Anwendung zur Behandlung von Mykosen, bevorzugt von Mykosen mit Pilzen der Gattungen Aspergillus, Candida, Micropsorum und/oder Mucor, besonders bevorzugt von Mykosen der Spezies Candida maltosa, Candida albicans und Candida krusei, Aspergillus fumigatus, Mucor spec. und/oder Microsporum gypseum von Bedeutung.
Diese Kombination aus antimykotischer Wirkung und Unterstützung der Gewebsneubildung ist gerade bei einer lang andauernden Behandlung, wie sie bei der Therapie von Mykosen erforderlich ist, von besonderer Bedeutung. Bei einer besonderen Ausführungsform kann die
Biomasse von Anabena cylindrica auch in Kombination mit anderen Antimykotika eingesetzt werden, um deren Wirkung synergistisch zu verstärken. Auch eine Kombination einer lokalen
Anwendung von Anabena cylindrica enthaltenden Präparaten und einer systemischen The- rapie mit anderen Antimykotika ist möglich. Die erfindungsgemäße Biomasse von Anabena cylindrica wirkt membranstabilisierend auf die Hautzellen. Bei einer Anwendung in Form von Gelen, Hydrogelen, Lotionen, Lösungen, Cremes, Salben wird der transepidermale Wasserverlust gesenkt. Ergänzt wird die Hautpflege durch hochmolekulare, sulfatierte oder/und uronsäurehaltige Polysaccharide, die feuchtigkeitsspeichernd wirken und in der Folge die Hautfeuchte erhöhen.
Die erfindungsgemäße Biomasse von Anabena cylindrica eignet sich daher hervorragend zur Herstellung von Präparaten, die zur Rezidivprophylaxe nach der Behandlung von Mykosen eingesetzt werden können.
Bei Verwendung auf der Haut wird die erfindungsgemäße Biomasse im Allgemeinen als Formulierung in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- Stoffen verabreicht. Der Begriff "Hilfsstoff" wird hierin zur Beschreibung aller anderen Bestandteile außer der erfindungsgemäßen Biomasse verwendet. Die Auswahl des Hilfs- stoffs richtet sich weitgehend nach der speziellen Art der Verabreichung.
Die Inhaltstoffe von Anabena cylindrica können auch auf Schleimhäuten gut angewendet werden. Zu diesem Zweck ist es erfindungsgemäß, die Biomasse bzw. einzelne Extrakte in Verarbeitungsformen wie Gele, Cremes oder Salben (z. B. Nasen, Genitalien) oder lutschbare oder kaubare Präparate (Gummibärchen, Kaugummi) zur Anwendung auf der Mundschleimhaut zu überführen. Die im Stand der Technik genannten Methoden können auch eingesetzt werden um die Biomasse von Anabena cylindrica in eine für die intranasale Appli- kation geeignete Anwendungsform zu überführen.
Aus Anabena cylindrica isolierte antifungale Wirksstoffe können auch systemisch eingesetzt werden. Auch eine Kombination zur lokalen und systemischen Therapie ist möglich. Die erfindungsgemäße Biomasse kann als Antimykotikum verwendet werden. Als Antimykotika werden Zusammensetzungen und Arzneimittel bezeichnet, die antimykotische Wirkung haben und zur Behandlung, Prophylaxe und/oder Therapie von Mykosen (Pilzinfektionen) verwendet werden können. Eine Behandlung mit einem Antimykotikum kann dazu führen, dass insgesamt die Infektionsrate vermindert wird, also ein Schutz gegen Neuinfek- tionen (Prophylaxe) oder ein Schutz gegen eine weitere Ausbreitung einer bestehenden Mykose erfolgt (Eindämmung). Eine Behandlung mit einem Antimykotikum kann dazu führen, dass ein Infektionsherd sich nicht weiter vergrößert, das Wachstum eines Infektionsherdes verlangsamt oder gestoppt werden kann (Stasis). Eine Behandlung mit einem Antimykotikum kann auch dazu führen, dass ein bestehender Infektionsherd kleiner wird und ggf. ausheilen kann (Kuration, Rehabilitation).
Insbesondere eignet sich die erfindungsgemäße Biomasse zur Verwendung in der Prophy- laxe und/oder Therapie von Mykosen, bevorzugt von Mykosen mit Pilzen der Gattung Aspergillus, Candida, Microsporum und/oder Mucor, besonders bevorzugt von Mykosen der Spezies Candida maltosa, Candida albicans und Candida krusei, Aspergillus fumigatus, Mucor spec. und/oder Microsporum gypseum. Die erfindungsgemäße Biomasse kann bevorzugt topisch auf die Haut oder Schleimhaut, d. h. dermal oder transdermal, verabreicht werden. Zu den typischen Formulierungen gehören Gele, Hydrogele, Lotionen, Lösungen, Cremes, Salben, Puder, Verbände, Schäume, Filme, Hautpflaster, Plättchen, Implantate, Schwämme, Fasern, Bandagen und Mikroemul- sionen. Es können auch Liposomen verwendet werden. Zu den typischen Trägern zählen Alkohol, Wasser, Mineralöl, flüssiges Petrolatum, weißes Petrolatum, Glycerin, Polyethylen- glycol und Propylenglycol. Es können Mittel zur Verstärkung der Penetration eingebracht werden. Formulierungen zur topischen Verabreichung können so formuliert werden, dass sie unmittelbar und/oder modifiziert freigesetzt werden. Zu den Formulierungen mit modifizierter Freisetzung zählen solche mit verzögerter, lang anhaltender, gepulster, kontrollierter, gerichteter und programmierter Freisetzung.
Die erfindungsgemäße Biomasse kann oral verabreicht werden. Die orale Verabreichung kann unter Schlucken vor sich gehen, so dass die Verbindung in den Magen-Darm-Trakt gelangt. Zu den Formulierungen, die für die orale Verabreichung geeignet sind, zählen feste Formulierungen wie z. B. Tabletten; Kapseln, die Teilchen, Flüssigkeiten oder Pulver enthalten; Pastillen (darunter flüssig gefüllte); und Kaumassen; Multi- und Nanoteilchen; Gele; feste Lösungen; Liposomen; Filme, Vaginalzäpfchen, Sprays und flüssige Formulierungen.
Zu den flüssigen Formulierungen gehören Suspensionen, Lösungen, Sirupe und Elixiere. Solche Formulierungen können als Füllstoffe in Weich- oder Hartkapseln verwendet werden und umfassen typischerweise einen Träger, beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyethylengly- col, Propylenglycol, Methylcellulose oder ein geeignetes Öl, und ein oder mehrere Emulgiermittel und/oder Suspendiermittel. Flüssige Formulierungen können auch durch Re- konstitution eines Feststoffs, zum Beispiel aus einem Beutelchen, hergestellt werden.
Die erfindungsgemäße Biomasse kann auch in schnell auflösenden, schnell zerfallenden Dosierformen verwendet werden. Für Tabletten-Dosierformen kann der Wirkstoff je nach Dosierung 1 Gew.-% bis 80 Gew.-% der Dosierform, typischerweise 5 Gew.-% bis 60 Gew.-% der Dosierform ausmachen. Die Formulierung von Tabletten ist im Stand der Technik umfänglich beschrieben.
Die erfindungsgemäße Biomasse kann auch intranasal oder durch Inhalieren verabreicht werden, typischerweise in Form eines trockenen Pulvers (entweder alleine, als Mischung, beispielsweise als Trockenmischung mit Lactose oder als Teilchen gemischter Komponen- ten, zum Beispiel gemischt mit Phospholipiden wie z. B. Phosphatidylcholin), aus einem Tro- ckenpulver-lnhalator oder als Aerosol-Spray aus einem Druckbehälter, einer Pumpe, einem Spray, Zerstäuber (vorzugsweise einem Zerstäuber mit Elektrohydrodynamik, um einen feinen Nebel zu erzeugen) oder Vernebler mit oder ohne Verwendung eines geeigneten Treibmittels wie z. B. 1 ,1 ,1 ,2-Tetrafluorethan oder 1 ,1,1 ,2,3,3,3-Heptafluorpropan. Für die intrana- sale Anwendung kann das Pulver einen Biokleber umfassen, zum Beispiel Chitosan oder Cyclodextrin. Druckbehälter, Pumpe, Spray, Zerstäuber oder Vernebler enthalten eine Lösung oder Suspension der erfindungsgemäßen Biomasse, umfassend beispielsweise Ethanol, wässriges Ethanol oder ein geeignetes alternatives Mittel zum Dispergieren, Solubi- lisieren oder zur Verlängerung der Freisetzung des Wirkstoffs, Treibmittel als Lösungsmittel und ein wahlfreies Tensid wie z. B. Sorbitantrioleat, Ölsäure oder eine Oligomilchsäure. Vor Verwendung in einer Trockenpulver- oder Suspensionsformulierung wird das Arzneimittelprodukt zu einer Größe mikronisiert, die zur Gabe durch Inhalieren geeignet ist (typischerweise weniger als 5 μm). Dies kann erreicht werden mit Hilfe irgendeines geeigneten Zerkleinerungsverfahrens wie etwa Spiralstrahlmahlen, Wirbelschichtstrahlmahlen, Verar- beitung als überkritische Flüssigkeit unter Bildung von Nanoteilchen, Hochdruckhomogenisieren oder Sprühtrocknen. Kapseln (beispielsweise aus Gelatine oder Hydroxypropyl- methylcellulose), Blister und Patronen zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können so formuliert werden, dass sie ein Pulvergemisch aus der erfindungsgemäßen Verbindung, einer geeigneten Pulvergrundlage wie etwa Lactose oder Stärke und eines Leistungsmodifikators wie L-Leucin, Mannit oder Magnesiumstearat enthalten. Die Lactose kann wasserfrei oder in Form des Monohydrats vorliegen, wobei letzteres bevorzugt ist. Zu den weiteren geeigneten Hilfsstoffen gehören Dextran, Glucose, Maltose, Sorbit, Xylit, Fruc- tose, Sucrose und Trehalose. Eine geeignete Lösungsformulierung zur Verwendung in einem Zerstäuber mit Elektrohydrodynamik zur Erzeugung eines feinen Nebels kann 1 μg bis 20 mg der erfindungsgemäßen Verbindung pro Betätigung enthalten, und das Volumen einer Betätigung kann von 1 μl bis 100 μl variieren. Eine typische Formulierung kann erfindungsgemäße Biomasse, Propylenglycol, steriles Wasser, Ethanol und Natriumchlorid umfassen. Zu den alternativen Lösungsmitteln, die anstelle von Propylenglycol verwendet werden können, gehören Glycerin und Polyethylenglycol. Zur Inhalationsverabreichung/intranasalen Verabreichung können den erfindungsgemäßen Formulierungen geeignete Aromastoffe wie etwa Menthol und L-Menthol oder Süßstoffe wie z. B. Saccharin oder Saccharin-Natrium zugesetzt werden. Formulierungen zur Inhalationsverabreichung/intranasalen Verabreichung können zur unmittelbaren und/oder modifizierten Freisetzung beispielsweise unter Verwendung von PGLA formuliert werden. Zu den Formulierungen mit modifizierter Freisetzung zählen solche mit verzögerter, lang anhaltender, gepulster, kontrollierter, gerichteter und programmierter Freisetzung. Im Falle von Trockenpulver-Inha- latoren und Aerosolen wird die Dosiereinheit mit Hilfe eines Ventils bestimmt, das eine abgemessene Menge liefert. Erfindungsgemäße Einheiten sind typischerweise so ausgestaltet, dass sie eine abgemessene Dosis oder Inhalation verabreichen, die 0,001 mg bis 10 mg erfindungsgemäße Biomasse enthält. Die Gesamttagesdosis liegt typischerweise im Bereich von 0,001 mg bis 40 mg und kann als Einzeldosis oder üblicherweise in Form von geteilten Dosen über den Tag verabreicht werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können rektal oder vaginal, beispielsweise in Form eines Suppositoriums, Pessars oder Klistiers verabreicht werden. Kakaobutter ist eine übliche Suppositoriengrundlage, doch können verschiedene Alternativen je nach Bedarf ver- wendet werden. Formulierungen zur rektalen/vaginalen Verabreichung können zur unmittelbaren und/oder modifizierten Freisetzung formuliert werden. Zu den Formulierungen mit modifizierter Freisetzung zählen solche mit verzögerter, lang anhaltender, gepulster, kontrollierter, gerichteter und programmierter Freisetzung. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Behandlung von Mykosen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Subjekt, welches einer solchen Behandlung bedarf, in Kontakt gebracht wird mit einer effektiven Dosis einer erfindungsgemäßen Biomasse. Als effektive Dosis wird dabei eine Dosis bezeichnet, welche nach ihrer, ggf. mehrmaligen, Verabreichung zu einem feststellbaren, positiven Behandlungsergebnis führt, wobei das Be- handlungsergebnis beispielsweise in einer Prophylaxe, einer Stasis, einer Kuration und/oder einer Rehabilitation bestehen kann (siehe oben). Bei dem zu behandelnden Subjekt handelt es sich bevorzugt um ein Säugetier, besonders bevorzugt um einen Menschen.
So wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "Behandeln" die Umkehrung, Linderung oder Hemmung des Fortschreitens einer Erkrankung, Störung oder eines Zustands oder eines oder mehrerer Symptome einer solchen Erkrankung, Störung oder eines solchen Zustands, auf welche dieser Begriff zutrifft. So wie hierin verwendet, kann "Behandeln" sich auch da- rauf beziehen, dass die Wahrscheinlichkeit oder Häufigkeit, mit der eine Erkrankung, Störung oder ein Zustand bei einem Säuger im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrollpopulation oder im Vergleich zum gleichen Säuger vor der Behandlung auftritt, verringert wird. So wie hierin verwendet, kann "Behandeln" sich beispielsweise auch auf die Prävention einer Er- krankung, Störung oder eines Zustands beziehen und kann auch die Verzögerung oder Verhütung des Beginns einer Erkrankung, Störung oder eines Zustands oder die Verzögerung oder Verhütung der mit einer Erkrankung, Störung oder eines Zustands verbundenen Symptome umfassen. So wie hierin verwendet, kann "Behandeln" sich auch darauf beziehen, dass die Schwere einer Erkrankung, Störung oder eines Zustands oder von Symptomen, die mit einer solchen Erkrankung, Störung oder eines solchen Zustands verbunden sind, verringert wird, ehe der Säuger von der Erkrankung, Störung oder dem Zustand befallen wird. Eine solche Prävention oder Verringerung der Schwere einer Erkrankung, Störung oder eines Zustands vor dem Befallensein betrifft die Verabreichung der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung - wie hierin beschrieben - an ein Individuum, das zum Zeitpunkt der Verab- reichung nicht von der Erkrankung, Störung oder dem Zustand befallen ist. So wie hierin verwendet, kann "Behandeln" sich auch darauf beziehen, dass das Wiederauftreten einer Erkrankung, Störung oder eines Zustands oder eines oder mehrerer mit einer solchen Erkrankung, Störung oder einem solchen Zustands verbundenen Symptome verhindert wird. So wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe "Behandlung" und "therapeutisch" auf den Akt des Behandeins im Sinne der obigen Definition von "Behandeln".
Aufgrund der antimykotischen Wirkung der erfindungsgemäßen Biomasse eignet sich diese insbesondere auch als Konservierungsstoff. Die vorliegende Erfindung bezieht sich also auch auf eine Verwendung der erfindungsgemäßen Biomasse als Konservierungsstoff, ins- besondere als Konservierungsstoff für die Konservierung von Nahrungsmitteln, Genussmitteln, Kosmetika und/oder anderen Zusammensetzungen, die für den Kontakt mit menschlicher oder tierischer Haut bestimmt sind. Die erfindungsgemäße Biomasse kann auch als Lebensmittelzusatzstoff mit antimykotischer Wirkung verwendet werden. Insbesondere kann die erfindungsgemäße Biomasse zur Verhinderung eines Pilzbefalls oder zur Verzögerung eines Pilzwachstums in Nahrungsmitteln, Genussmitteln und/oder Kosmetika verwendet werden.
Figuren: Figur 1 zeigt die stoffwechselfördemde Wirkung von Biomasse des Cyanobakte- rienstamms Anabena cylindrica Bio 33 auf Säugerzellen. Dargestellt ist der Glukoseverbrauch in % gegenüber der Kontrolle über die Zeit. Figur 2 zeigt den Einfluss von Biomasse des Cyanobakterienstamms Anabena cylindrica Bio 33 auf Haut zu Haut-Übertragung von Candida albicans Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher verdeutlicht.
Ausführungsbeispiele:
Beispiel 1: Herstellung von wässrigen, alkoholischen, alkoholisch/wässrigen und angerei- cherten sowie öligen Extrakten
Cyanobakterien, insbesondere Cyanobakterien vom Stamm Bio33 der Spezies Anabaena cylindrica, wurden jeweils in destilliertem Wasser (wässriger Extrakt), Methanol (alkoholischer Extrakt), in Mischungen von Methanol/Wasser unterschiedlicher Anteile (alkoholisch- wässriger Extrakt) oder n-Hexan (öliger Extrakt) als Lösungsmittel suspendiert und für 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Eine Anreicherung der antimykotischen Wirkstoffe erfolgte durch säulenchromatografische Auftrennung des Methanol- und/oder des Methanol/Wasser-Extraktes unter Verwendung von Silicagel Si60 und Elution der antimykotischen Wirkstoffe mittels Ethylazetat/Methanol/Wasser 1 +7+2 zur Gewinnung der Fraktion FIII (angereicherter Extrakt). Die Lösungsmittel wurden anschließend mittels eines Rotationsverdampfers unter Vakuum bei 400C abgezogen. Die erhaltenen Extrakte wurden bei -200C gelagert bis zur Verwendung.
Beispiel 2: Herstellung von Mikro- und/oder Nanopartikeln enthaltend erfindungsgemäße
Biomasse
Die Biomasse, insbesondere die Extrakte aus Beispiel 1 , wurden in einer wässrigen Lösung enthaltend einen Emulgator aufgenommen und vorsuspendiert. Diese Vorsuspension wurde dann zur Herstellung der Mikro- und Nanopartikel eingesetzt. Beispielsweise wurden 5 g Extrakt und 0,05 g Emulgator (Plantacare 2000) in 45 g demineralisiertem Wasser aufgenommen, vorsuspendiert und anschließend bei einem Arbeitsdruck von 500 - 600 bar und einer Temperatur von 25°C bis 50°C in einem Hochdruckhomogenisator (APV Deutschland GmbH, Unna, Deutschland) in 4 Zyklen bis zum Erhalt von Mikro- und Nanopartikeln mit dem gewünschten mittleren Durchmesser homogenisiert. Der mittlere Partikeldurchmesser wurde mittels eines Laserdiffraktometers (Malvern Mastersizer X, Malvern, GB) bei einer Wellenlänge von 633 nm bestimmt. Beispiel 3: Antimykotische Wirkung von Biomasse des Cyanobakterienstamms Anabena cylindrica Bio 33
Die Testung der antimykotischen Aktivität der Extrakte aus Anabena cylindrica Bio33 erfolgte in Anlehnung an die Diffusionsmethode zur mikrobiologischen Wertbestimmung von Antibiotika des Europäischen Arzneibuches im Agarplattdendiffusionstest. Es wurde eine Keimsuspension in den handwarmen Nähragar eingearbeitet und nach Verfestigen der Oberfläche die mit jeweils 2 mg Extrakt beladenen Plättchen (Durchmesser 6 mm) aufgebracht. Zur Vordiffusion der in den Extrakten enthaltenen Stoffe in das Agarmedium wurde für drei Stunden bei 8°C im Kühlschrank vorinkubiert. Es folgte eine Inkubationszeit von 24 h bei 28°C.
Die Herstellung der Extrakte erfolgte wie oben (Beispiel 1) beschrieben. Für die erweiterte Testung auf antimykotische Wirkung unter Verwendung verschiedener Testkeime sowie der angereicherten Fraktion FIII wurde ebenfalls der Agarplattendiffusionstest genutzt (Plättchenmethode), allerdings wurde ein spezielles Nährmedium zur Antimykotikatestung verwendet (Testmedium: RPMI-Agar, Fa. AB Biodisk; Synthetisches Medium zur Antimykotika- Testung nach NCCLS-Standard) und folgende Keime eingesetzt:
Tabelle 1:
Spezies Gattung Herkunft
Candida albicans Candida Stammsammlung ATCC 90028
Candida krusei Candida Stammsammlung ATCC 90878
Aspergillus fumigatus Aspergillus Patientenisolat
Mucor sp. Mucor INSTAND Ringversuch, 2009
Microsporum gypseum Microsporum INSTAND Ringversuch, 2009
Im Folgenden sind die Ergebnisse zusammengefasst:
Tabelle 2: Ergebnisse der antimykotischen Testung verschiedener Extrakte von Ana- baena- sowie Pseudanabaena species ; Doppelbestimmung, Angabe der Mittelwerte der Hemmhofdurchmesser inklusive Durchmesser Testblättchen 6 mm; n.g. nicht getestet)
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
Bei Extraktion der Biomasse nacheinander mit n-Hexan, Methanol, Methanol/Wasser, Wasser zeigte der wässrige Extrakt keine Aktivität mehr, bei Extraktion ohne die Zwischenstufe MeOH/Wasser war der wässrige Extrakt aktiv.
Tabelle 3: Ergebnisse der antimykotischen Testung der Extrakte von Anabaena cylindrica Bio 33 (1,5 mg/paperdisk, Angabe der Mittelwerte der Hemmhofdurchmesser inklusive Durchmesser Testblättchen 6 mm; n.a. nicht auswertbar)
Figure imgf000019_0002
Die Testung der wirkstoffangereicherten Fraktion FIM = angereicherter Extrakt (siehe oben) aus Anabaena cylindrica Bio 33 (Tabelle 3) wurde auf weitere Pilze ausgedehnt, wobei auch hier eine sehr gute Wirkung auftrat. Gleichzeitig wurde der Ethylazetatextrakt des Kultivierungsmediums von Bio 33 getestet, der ebenfalls Wirksamkeit zeigte.
Beispiel 4: Stoffwechselfördernde Wirkung von Biomasse des Cyanobakterienstamms
Anabena cylindrica Bio 33
Methodik
Zellen: FL, Herkunft: USA, ATCC, CCL 62, Katalognummer RIE 81 , Lieferant: biometec GmbH
Medium: DMEM ohne Phenolrot mit 1000mg/l Glucose und 1 10 mg/l Na-Pyruvat (Gibco), modifiziert mit 20OmM L-Glutamin, 1 M Hepes, 5U Penicillin/5mg Streptomycin/ml (Sigma) und 10 % FKS (Biochrom KG, Berlin) Ausschaltung der Zellteilung: Zuerst wurde aus 2mg Mitomycin C (Sigma) gelöst in 0,1 ml DMSO und 1 ,9 ml PBS eine Mitomycin C-Stammlösung hergestellt und in 50μl-Aliquoten eingefroren. Zur Mitosehemmung wurde das Zellkulturmedium vom konfluent gewachsenen Zellrasen der FL-Zellkultur abgegossen, durch 5ml Kulturmedium mit 50μl Mitomyxin- Stammlösung ersetzt und 2 Std./37°C inkubiert. Danach wurde 3 x mit PBS (ohne Ca++1 Mg++, PAA) gewaschen, die Zellen mit Trypsin/EDTA (Sigma) abgelöst, die Zellzahl bestimmt und auf eine Konzentration von 4 x 105/ml mit Zellkulturmedium eingestellt.
Kultivierung auf den Zellträgem: Je 1ml Zellsuspension wurde auf die Zellträger (13mm runde, Thermanox-Plättchen (Nunc Ine, Naperville, IL USA) in einem Minusheet-Zellhalter- System (Minucells & Minutissue Vertriebs GmbH, Bad Abbach) in einer Mikrokulturwanne eine 24-well-Zellkulturplatte (Nunc GmbH & CoKg, Wiesbaden) pipettiert, 24 Stunden kultiviert (370C, 5%CO2, 97% Luftfeuchte) und dann jeweils 6 Zellträger in eine Perfusionszell- kammer aufrecht eingestellt. Perfuslonszellkultur:
Zellkammern: Minucells & Minutissue, Typ 1301 , Temperierung auf etwa 37 0C (Heizplatte: MEDAX, Typ 12501)
Fliessrate: 4,5 μl/min (Pumpe: Ismatec IPC-N 8)
Gas: Low-Gas Typ 110741-S (5 % Kohlenstoffdioxid, 20 % Sauerstoff, Rest Stickstoff), Air Liquide
Bestimmung der Glucose- und der Lactatkonzentration:
a) Beckmann (Messintervalle: 12 h +/- 1 h) Die Ergebnisse des Tests sind in Figur 1 dargestellt und zeigen die deutliche stoffwechselstimulierende Wirkung der Biomasse des Cyanobakterienstamms Anabena cylindrica Bio 33. Beispiel 5: Reduktion der Haut zu Haut-Übertragung von Candida albicans
Die aus der Biomasse von Anabaena cylindrica Bio33 hergestellten Extrakte zeigten eine breite antimykotische Aktivität. Biomassen von Anabaena cylindrica Bio 33 sind geeignet, die Übertragung von Pilzen von einem kontaminierten Hautstückchen (Donator) auf ein keim- freies Hautstückchen (Akzeptor) zu verhindern (Fig. 2)
Der Nachweis wurde wie folgt durchgeführt: Als Teststamm wurde der Candida albicans- Stamm ATCC10231 verwendet (Kultursammlung des Friedrich Loeffler Instituts für Medizinische Mikrobiologie, Universität Greifswald, Referenzstamm)
Für die Präparation der Testsuspension wurden die Kolonien in 0.9 % NaCI -Lösung suspendiert, um eine optische Dichte von 0,32 (OD600) zu erhalten. Diese Lösung wurde anschließend 1 :3 verdünnt: Die Donator-Kuheuterzitzen wurden auf einem markierten Abschnitt (10 x 10 mm) mit 10 μl Candida a/ό/cans-Suspension infiziert. Danach wurden die Donator-Kuheuterzitzen 90 min bei 30 0C im Inkubationsschrank (Jouan EB 53, Jouan GmbH, Unterhaching) bebrütet.
Die Akzeptor-Kuheuterzitzen wurden auf einem markierten Abschnitt(10 x 10 mm) mit einer 1 % Bio-33 haltigen Salbe und Salbe (Kontrolle) behandelt. Die Anzahl der Kuheuterzitzen betrug jeweils 12. Nach 90 min Einwirkzeit der Salbe wurden die Donator- und Akzeptorzitzen für 10 s aneinander gerieben. Danach wurden die Akzeptorzitzen 90 min bei 30 0C inkubiert. Anschließend wurden die Zitzen auf Sabouraud-Glukose-Agarplatten (Heipha Dr. Müller GmbH, Eppelheim) ausgestrichen und 24 Stunden bei 37 0 C inkubiert. Am Ende wurden die koloniebildenden Einheiten bestimmt und ausgezählt.
Die Ergebnisse des Tests sind in Figur 2 dargestellt und zeigen die deutliche antimykotische Wirkung bei einer Verhinderung der Infektionsübertragung durch Haut zu Haut-Kontakte.

Claims

Ansprüche 1. Biomasse aus Cyanobakterien der Art Anabaena cylindrica für die Verwendung zur Stoffwechselstimulierung und/oder zur Prophylaxe und Therapie von Mykosen und/oder Mykotoxikosen.
2. Biomasse nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Biomasse aus dem Stamm Anabaena cylindrica Bio33 mit der Hinterlegungsnummer DSM 22930 gewonnen wird.
3. Biomasse nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie bei den Mykosen mit Pilzen der Gattung Aspergillus, Candida, Micropsorum und/oder Mucor angewendet wird, bevorzugt bei Mykosen der Spezies Candida maltosa, Candida albicans und Candida krusei, Aspergillus fumigatus, Mucor spec. und/oder Microsporum gypseum.
4. Biomasse nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomasse zur topischen Anwendung hergerichtet ist und gegebenenfalls in typischen Formulierungen wie Gele, Hydrogele, Lotionen, Lösungen, Cremes, Salben, Puder, Verbände, Schäume, Filme, Hautpflaster, Plättchen, Implantate, Schwämme, Fasern, Bandagen und Mikroemulsionen eingearbeitet vorliegt.
5. Biomasse nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomasse verwendet wird zur Rezidivprophylaxe nach einer Behandlung von Mykosen.
6. Biomasse nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur intranasalen Verwendung.
7. Biomasse nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Unterstützung der Gewebeneubildung.
8. Biomasse nach einem der vorhergehenden Ansprüche für die Verwendung zur Wundheilung.
9. Biomasse nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomasse einen wässrigen Extrakt, einen alkoholischen Extrakt, einen alkoho- lisch/wässrigen Extrakt, einen angereicherten Extrakt und/oder einen öligen Extakt der Cyanobakterien umfasst oder daraus besteht.
10. Biomasse nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomasse in Form von Mikro- und/oder Nanopartikeln vorliegt.
1 1. Biomasse nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomasse in Form von Mineralverbünden vorliegt.
12. Biomasse oder daraus gewonnene Extrakte und Wirkstoffe nach einem der vorhergehenden Ansprüche für die Verwendung als antimykotischer Wirkstoff.
13. Biomasse nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomasse verwendet wird zur Stoffwechselstimulierung und/oder als Nutritivum und/oder als Mittel zur Verhinderung von Mykotoxikosen.
14. Verwendung einer Biomasse nach einem der Ansprüche 1 bis 11 als natürlicher Konservierungsstoff, insbesondere als Konservierungsstoff für die Konservierung von Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Genussmitteln insbesondere zur Verhinderung eines Pilzbefalls oder zur Verzögerung eines Pilzwachstums.
15. Verwendung einer Biomasse nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Inaktivierung von Mykotoxinen und Verhinderung ihrer Neubildung.
16. Verwendung einer Biomasse nach einem der Ansprüche 1 bis 13 als Lebensmittelzusatzstoff und/oder als Futtermittelzusatzstoff mit antimykotischer und gleichzeitig stoffwechselstimulierender Wirkung.
17. Verwendung einer Biomasse nach einem der Ansprüche 1 bis 11 als Konservierungs- stoff, insbesondere als hautpflegender und den Zellstoffwechsel unterstützender Konservierungsstoff für die Konservierung von Kosmetika und/oder anderen Zusammensetzungen, die für den Kontakt mit menschlicher oder tierischer Haut bestimmt sind.
18. Verwendung einer Biomasse gemäß Ansprüchen 1 bis 11 zur Herstellung eines Arznei- mittels und/oder eines Medizinproduktes für die Stoffwechselstimulation, Gewebeneubildung, Wundheilung und/oder Behandlung von Mykosen, bevorzugt von Mykosen mit Pilzen der Gattung Aspergillus, Candida, Micropsorum und/oder Mucor, besonders bevorzugt von Mykosen der Spezies Candida maltosa, Candida albicans und Candida krusei, Aspergillus fumigatus, Mucor spec. und/oder Microsporum gypseum.
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