WO2010151169A1 - Oligonucleotide and a conjugate thereof for detecting proteins in an amyloid state and a method for detecting proteins in an amyloid state - Google Patents

Oligonucleotide and a conjugate thereof for detecting proteins in an amyloid state and a method for detecting proteins in an amyloid state Download PDF

Info

Publication number
WO2010151169A1
WO2010151169A1 PCT/RU2009/000435 RU2009000435W WO2010151169A1 WO 2010151169 A1 WO2010151169 A1 WO 2010151169A1 RU 2009000435 W RU2009000435 W RU 2009000435W WO 2010151169 A1 WO2010151169 A1 WO 2010151169A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
oligonucleotide
proteins
binding
protein
amyloid
Prior art date
Application number
PCT/RU2009/000435
Other languages
French (fr)
Russian (ru)
Inventor
Алексей Анатольевич АНТИПИН
Григорий Андреевич НАДТОЧЕЙ
Михаил Давидович ТЕР-АВАНЕСЯН
Ольга Владимировна МИТЬКЕВИЧ
Виталий Владимирович КУПIНИРОВ
Елизавета Рафаэлевна СУРИНА
Sеrgеу Vlаdimirоviсh ВЕNЕVОLЕNSКIY
Алексей Николаевич МАРЧЕНКО
Елена Владимировна МОРОЗКИНА
Original Assignee
Федеральное Государственное Унитарное Предприятие "Государственный Научно-Исследовательский Институт Генетики И Селекции Промышленных Микроорганизмов" (Фгуп Госнии Генетика)
Федеральное Государственное Учреждение Российский Кардиологический Научно-Производственный Комплекс Федерального Агентства По Высокотехнологичной Медицинской Помощи
Государственное Научное Учреждение Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии Им. Я. Р. Коваленко (Гну Виэв)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное Государственное Унитарное Предприятие "Государственный Научно-Исследовательский Институт Генетики И Селекции Промышленных Микроорганизмов" (Фгуп Госнии Генетика), Федеральное Государственное Учреждение Российский Кардиологический Научно-Производственный Комплекс Федерального Агентства По Высокотехнологичной Медицинской Помощи, Государственное Научное Учреждение Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии Им. Я. Р. Коваленко (Гну Виэв) filed Critical Федеральное Государственное Унитарное Предприятие "Государственный Научно-Исследовательский Институт Генетики И Селекции Промышленных Микроорганизмов" (Фгуп Госнии Генетика)
Publication of WO2010151169A1 publication Critical patent/WO2010151169A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2828—Prion diseases

Definitions

  • the present invention relates to molecular biology and medical diagnostics, in particular, to a method for the diagnosis of amyloidosis, based on the detection of amyloids, including their infectious variants - prions.
  • Amyloids are insoluble protein aggregates that have a fibrillar structure and are resistant to proteases.
  • Amyloid fibrils are linear polymers consisting of non-covalently linked protein molecules. These polymers are formed by the attachment of protein monomers to their ends; in this case, the growth process is accompanied by the enrichment of the attached monomers with ⁇ -layers, which are perpendicular to the axis of the polymers, associated with conformational rearrangement with the formation of a specific "cross- ⁇ " structure.
  • Amyloids are characterized by interaction with certain dyes, primarily with Congo red and thioflavin T ( ⁇ hiti F., Dobson CM. 2006.
  • amyloidoses The classification of amyloidoses is complex and ambiguous: systemic amyloidoses (many organs are affected) and organ-specific amyloidoses, primary amyloidoses (amyloid accumulation leads to a disease) and secondary (amyloid accumulation are caused by some other disease) are distinguished. Finally, amyloidoses are divided into non-infectious and infectious (prionic) (Sipe J.D., Cohen A. S. 2000. Nistoru of the amuloid fibril. J. Stast. Biol. 130, 88-98.).
  • amyloidosis The interest in the chemical and physical nature of amyloids is due, first of all, to their connection with an extensive group of diseases in humans and animals. These diseases are combined under the general name amyloidosis. Some of them
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) diseases caused by a special variety of amyloids called prions are vector-borne. Fit amyloids are described not only in mammals, but also in lower eukaryotes, in which they act as nonchromosomally inherited determinants.
  • PrP Sc Infectious prion protein of animals, called PrP Sc , is a special conformationally modified isoform of the cellular protein PrP c , which differs from it in its spatial structure.
  • PrP So protein entering the body from the outside or spontaneously arising in it, can stimulate the conversion of the normal form of PrP c into the pathogenic abnormal form of PrP Sc through protein-protein interactions.
  • autocatalytic maintenance of the prion isoform of the protein is provided (Prusiner, SB, Scott, MR, DeArmond, S J., Cohen, FE (1998) Rioproteip Biolog. CeIl, 93, 337-348).
  • the most famous diseases of animals of this type include the so-called "rabies”.
  • Amyloidoses of the central nervous system (Alzheimer's, Parkinson's, Gentinton's disease), as well as type 2 diabetes mellitus and some forms of spinocerebral ataxia and cataracts (Galkin A.P., Mironova L.N., Zhuravleva G .A., Inge-Vechtomov S.G. Genetics (2006) 42, JN ° 11, 1558-1570).
  • [PiST + ] is described as a cytoplasmic inherited determinant that enhances the action of the weak nonsense suppressor SUQ5 (encodes a serine-specific tRNA with an anticodon complementary to the nonsense codon UAA) and is associated with the presence of the Sup35 protein in the cell.
  • the Sup35 protein contains two functional sites: domain N (first 123 amino acids) and C (amino acids 254 - 685). Domain N is responsible for maintaining [PS f], but is not essential for viability.
  • Monoclonal antibodies are obtained that distinguish between the pathogenic and normal forms of PrP protein (Korth, C, Stierli, B., Streit, P., Moser, M., Schaller, O., Fisher, R., Schultz-Schaeffer, W., Cretzschmar, H ., Raber, A., Bruup, U., Ehrepsrer, F., Hötemashi, S., Glokshuber, R., Riek, R., Willether, M., Wuthrikh, K. up Oesh, V.
  • aptamers having the ability to bind to a PrP protein and a method for detecting a PrP protein using said aptamers are described.
  • the aim of the present invention is to obtain and selection of DNA aptamers with the ability to efficiently and specifically bind to proteins in the amyloid state, and to provide a method for detecting proteins in the amyloid state using the obtained aptamers.
  • the present invention provides oligonucleotides for detecting proteins in an amyloid state and a method for detecting proteins in an amyloid state.
  • the aim of the present invention is the provision of an oligonucleotide for the detection of proteins in the amyloid state containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of the sequences shown in the List of sequences under the numbers SEQ ID NO: 1-4.
  • Another objective of the present invention is the provision of the above method, in which the binding of the oligonucleotides described above by the specified sample is determined by hybridization or PCR, in particular real-time PCR.
  • aptamer as used in the present invention means a single-stranded oligonucleotide having the ability to bind to another molecule (target molecule) and the formation of a relatively stable complex. Moreover, this binding does not occur due to the standard binding between base pairs according to Watson-Crick due to hydrogen bonds, but due to other types of non-covalent bonds. Such types of bonds include non-covalent hydrogen bonds, electrostatic interactions, Van der Walses binding, hydrophobic interactions, or combinations thereof. At the same time, such an aptamer binds to the target molecule with a much higher affinity than to other molecules present in the sample.
  • aptamers themselves can be obtained by any known method, including chemical synthesis, recombinant DNA methods, using standard purification methods.
  • the term “aptamer” also refers to secondary aptamers that contain the so-called “final” sequence obtained by analyzing two or more
  • the length of the aptamer can vary from 10 to 40 or more nucleotides necessary for binding to the target molecule.
  • Aptamers contain a nucleotide sequence that determines the specificity of binding to the target molecule, but they can also contain regions flanking this sequence, which are necessary, for example, for amplification of the entire aptamer using the GPR method, or contain restriction endonuclease sites for ligation of the aptamer into plasmids, cloning, etc. .P.
  • flanking sequences usually contain from 10 to 30 nucleotides, while some of these nucleotides may have a random composition.
  • the aptamers according to the present invention may contain various covalently linked functional modifications and additional ligands necessary to detect the binding of the aptamer to the target molecule, for example fluorescent dyes, biotin or various enzymes whose activity is easily detected (peroskidases, luciferase and the like).
  • fluorescent dyes for example fluorescent dyes, biotin or various enzymes whose activity is easily detected (peroskidases, luciferase and the like).
  • enzymes whose activity is easily detected
  • Such modified aptamers can be obtained by standard methods well known to specialists in this field of technology, for example, during the solid-phase synthesis of oligonucleotides or in solution using the phosphotriether method.
  • the SELEX procedure (Sustematis Evoluti Eightf Ligaps b Congress ⁇ ropeptial ⁇ pri13hmept) is one of the most effective approaches for the preparation of vitro biologically active macromolecules (aptamers) originating from nucleic acids (Kulbachinsky AV 2006. Methods for the selection of aptamer proteins. Chemistry. 46, 193-224).
  • the basis of this experimental method is the assumption that the extreme diversity of the sequences of single-stranded nucleic acid molecules determines such a diversity of their spatial structures. As the results of recent years show, aptamers can be found practically
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) for any epitope.
  • the material for SELEX is a mixture of oligonucleotides with a partially random sequence, which is subjected to cyclically repeating stages of binding to a selected target, separation and amplifying nucleic acid molecules bound to the target.
  • aptamers can be obtained containing regions of random composition with any degree of variability. Some positions can vary within two or three nucleotides, some four.
  • the authors of the present invention selected oligonucleotides capable of efficiently and specifically binding to the Sup35 protein of S. cerevisia yeast in a fibrillar amyloid state and not binding to its monomeric form.
  • Oligonucleotides according to the present invention are oligonucleotides S1-S4 containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of sequences,
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) shown in the List of sequences under the numbers SEQ ID NO: 1-4, respectively.
  • These oligonucleotides have the ability to bind to proteins that form amyloids, with high specificity and efficiency. Also, these oligonucleotides can be used to detect proteins that form amyloids, in particular, prion proteins.
  • oligonucleotides aptamers
  • any methods known to those skilled in the art can be used.
  • Methods using radioactive isotopes can be used when radiolabeled oligonucleotides are used to bind to the target molecule, for example
  • Quantitative PCR methods can be used, for example, real-time PCR, when the number of oligonucleotides that bind to the target molecule and remain in the aptamer-target molecule complex is determined after denaturation of such a complex.
  • oligonucleotides or additional ligands necessary for detecting the binding of the aptamer to the target molecule, for example, fluorescent dyes, biotin, or various enzymes whose activity is easily detected (peroskidases, luciferases, and the like), can also be used.
  • fluorescent dyes for example, fluorescent dyes, biotin, or various enzymes whose activity is easily detected (peroskidases, luciferases, and the like
  • peroskidases peroskidases, luciferases, and the like
  • perosidase and luciferase fused with streptovidin or avidin are used, while streptovidin and avidin bind to biotin, and peroskidase or luciferase is used to detect binding.
  • the Sup35 protein from S. servisiae contains two subdomains that determine the prion-like properties of this protein: the QN-rich region (amino acid residues 6-33) and the oliopeltide repeat region (PQGGYQQ-YN consensus) (amino acid residues 41-97), resembling the composition of the repeats in the PrP protein of mammals (consensus PHGGGWGQ). It is also known that proteins containing sequences from a large number of glutamine residues form amyloid-type aggregates. Polyglutamine proteins according to the present invention are proteins containing regions consisting of sequentially repeating glutamine residues.
  • the amount of residues can vary widely, while the likelihood of the formation of an amyloid form of the protein increases with an increase in the length of the polyglutamine fragment.
  • An example of such a protein is Huntingtin (synonyms - Huntingtin, Htt), which causes Huntington's disease (Vishnevskaya A. B., Kushnirov V. V., Ter-Avanesyan M. D., Neurodegenerative amyloidoses: yeast model. Mol. Biology (2007), 41, Jfe2, 346-354; Galkin A.P., Mironova L.N., Zhuravleva G.A., Inge-Vechtomov S.G. Genetika (2006) 42, N ° l 1, 1558-1570).
  • the model protein Q70 SEQ ID NO: 11, see Example 5 containing 70 glutamine residues at the N-terminus was used.
  • the method for detecting amyloid-forming proteins according to the present invention is a method comprising the steps of: obtaining a yeast or mammalian tissue culture sample; and studying the binding of the oligonucleotide (aptamer) according to the present invention or its conjugate according to the present invention with the specified sample.
  • a yeast culture sample can be either an untreated yeast cell lysate or a lysate pretreated to purify it from non-amyloid-forming proteins to reduce the background of non-specific binding of the aptamer to such proteins from the sample under study.
  • the concentration of proteins that form amyloids in the studied sample can be carried out using monoclonal antibodies with affinity for amyloids.
  • a mammalian tissue sample can also be either an untreated tissue cell lysate or a lysate pretreated to purify it from non-amyloid-forming proteins to reduce the background of non-specific binding of the aptamer to such proteins from the studied sample.
  • the concentration of proteins that form amyloids in the studied sample can be carried out using monoclonal antibodies with affinity for amyloids.
  • One of the options for preparing a mammalian tissue sample can be the method used in the BioRad kit (cat.
  • Ns 3551145 which includes obtaining a tissue sample, lysing tissue cells, followed by processing the obtained material with proteinases to break down non-amyloid proteins, applying the resulting material to polystyrene substrates with monoclonal antibodies to the synthetic prion polypeptide and washing the substrate from unbound peptides. This is followed by processing the obtained substrate with an aptamer according to the present or its conjugate and studying its binding to the test sample (see Example 4).
  • Fig. 1 shows an electron microscopic image of the fibrils formed by the Sup35NM protein.
  • the band corresponds to 100 nm.
  • FIG. 2 shows the binding of monomers and amyloid polymers of various proteins to the S4 DNA aptamer (SEQ ID NO: 4).
  • SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 4
  • Example 1 Obtaining protein Sup35 yeast S. servisiae
  • the SUP35 hesh fragment corresponding to the first 250 amino acid residues of the Sup35 protein (N- and M-domains), was obtained by PCR amplification of the DNA of the plasmid pEMBLyex4-SUP35 (Ter-Avapesuap MD, Kushpovv V, Dagkepogo-Savo, ⁇ hephoto-Savo, ⁇ o-tepofo, ⁇ o-tep Moderatorvo, SG, Smimv VN (1993) Deldovop apolysis of the SUP35 Hétigoutheastern of the best of the Sessharotés service, two-pop-optimizer method, Inc. 6 and P2 (SEQ ID NO: 7).
  • Ndel and Xhol restriction endonuclease sites were introduced into the oligonucleotide sequence.
  • DNA fragment obtained in re as a result of the polymerase chain reaction after treatment with the corresponding restriction endonucleases, they were cloned into the pETZOa vector (Novagep) pretreated with the restriction enzymes.
  • the plasmid pET30a-Sup35NM-6His which we constructed earlier, was used.
  • the region of this plasmid encoding the Sup35 N domain was replaced with a DNA fragment encoding 70 glutamine residues.
  • a TATGTSAGGGSTSGGTS adapter SEQ ID NO: 5
  • the Sti ⁇ - ⁇ d ⁇ fragment was replaced by the ⁇ all- ⁇ d ⁇ fragment of the plasmid pQ70-SUP35MC ( ⁇ lekhapdrov.D.M., Vishnevskaya, AB, Ter-Avanesyan, MD, apdapredelapred Amuloids ip West: Turosipes residues ephemeral fumagateptiop. J. Biol. Chem., 283, 15185-15192), encoding 70 residues of glutamine.
  • the result was the plasmid pET30a-Q70M, which allows the production of Q70 protein in E. coli.
  • the E. coli strain BL21 (DE3) (Novagep) was transformed with the expression plasmid pET30a-Sup35NM-6His encoding the protein Sup35NM-6His or the plasmid pET30a-Q70M encoding the Q70 protein also containing bHis end. Transformants grew overnight at 37 ° C on LB medium (Sambgook, J., FritschE., Add M ⁇ piatis, T. (1989). Molecular ⁇ lopipg: A Laborogu Mapul. 2 ed . containing 100 ⁇ g / ml ampicillin, the grown E.
  • coli transformants were seeded in flasks with 100 ml of medium: 0.8% tryptone, 1.35% peptone, 0.25% NaCl, with ampicillin (100 ⁇ g / ml) and grown overnight. The overnight culture (10 ml) was plated into flasks with 600 ml of 2x medium
  • E. coli cells were immediately lysed in buffer (20 mM Na 2 HPO 4 , pH 8.0, 8 M urea) and sonicated by ultrasound for 15 min at room temperature. The resulting suspension was centrifuged for 25 min at 2500Og. The pH of the aqueous phase was adjusted to 8.0 and applied to a Ni-CAM TM column (Sigma). Elution of the adsorbed Sup35NM was carried out with an imidazole concentration gradient in accordance with the manufacturer's instructions. For purification from low molecular weight fragments of Sup35NM protein, ion exchange chromatography on CM-sepharose was performed.
  • the column (HR5 / 5, Pharmacia) was equilibrated with buffer (20 mM Na 2 HPO 4 , pH 5.0, 8 M urea). The pH of the sample containing Sup35NM was adjusted to 5.0 and applied to the column. Elution was performed with a gradient of 0-300 mM NaCl. The purity of the Sup35NM recombinant protein obtained in this way was at least 95%.
  • the purified protein was centrifuged for 20 min at 16,000 g.
  • the supernatant was diluted 8 times with buffer (5 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.01% sodium azide, 0.1% Tween-20) and incubated with stirring (100 rpm) at room temperature during the night.
  • the sample was dialyzed against a 1000-fold buffer volume (50 mM Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, pH 7.4, 0.01% sodium azide, 0.1% Twep-20) at room temperature for 18 hours.
  • the polymer preparation was stored at -70 ° C.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Recombinant Sup35NM denatured with 8 M urea served as a starting material for the formation of prion fibrils. The situation was complicated by the fact that during storage this protein is prone to the formation of disordered aggregates. Therefore, before polymerization, we removed protein multimers in 8 M urea by centrifugation. Fibrillar Sup35NM was obtained in two stages - the formation of short “charges” under denaturing conditions (IM urea) and the final polymerization in the absence of urea. The quality of the obtained sample was monitored by electron microscopy (see Fig. 1).
  • the fibrils formed by Sup35NM were sorbed on a coated formar film (using a 0.5% formvar solution in dichloroethane when applying the film) a copper mesh for 15-20 seconds and contrasted with a 2% aqueous solution of uranyl acetate for 5-15 seconds. Observations were carried out using a Hitac ⁇ HU-12 electron microscope.
  • Synthesized 90-link S70 oligonucleotides (SEQ ID NO: 8), bearing a central 40-link random region flanked by 25-link residues necessary for amplification during the SELEX procedure.
  • the sites of endonucleases were introduced into the structure of the constant regions of oligonucleotides
  • the selection procedure was as follows: 4.5 nM 90-link single-stranded DNA fragments in buffer A (buffer A: 5 mM Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, pH 7.2, 0.01% sodium azide, 200 mm urea, 2 mM MgCl 2 ) were incubated for 5 min at a temperature of 100 ° C, then cooled to 28 ° C. 0.45 nM Sup35NM protein in fibrillar form and 4.5 nM monomeric protein (in a molar ratio of 10: 1: 10, respectively) were added to the oligonucleotide. Hybridization was carried out for one hour with stirring (300 rpm).
  • a buffer was used: 67 mM-HCl, pH 8.4; 17 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 10 mM 2-mercaptoethanol; 2 mM MgCl 2 ; 0.5 mM mixture of deoxynucleotide triphosphates).
  • double-stranded matrices were obtained in PCR (dirS primer concentrations (SEQ ID NO: 9) and revS (SEQ ID NO: 10) were 0.5 ⁇ M), PCR conditions denatured at 94 0 C for 30 seconds; primer annealing at 6 ° C for 30 seconds; elongation at 72 ° C for 30 seconds.
  • the number of cycles is 30. After electrophoresis on a 3% agarose gel and subsequent elution, 90-unit double-stranded DNA fragments were used as matrices for the synthesis of single-stranded DNA fragments. For this, primers dirS (SEQ ID NO: 9) and r michvS (SEQ ID NO: 10) were used at a concentration of 0.5 and 0.05 ⁇ M, respectively. Conditions for PCR: denaturation at 94 0 C for 30 seconds; primer annealing and elongation at 72 ° C for 20 seconds. The number of cycles is 30.
  • the inclusion of the radioactive label in DNA was carried out by introducing into the reaction mixture for PCR 10-20 ⁇ Ku alpha 32 P dATP. Labeled DNA was purified from the unincorporated label by electrophoresis and subsequent elution from 6% PAAG containing 7% urea.
  • the labeled aptamer protein molar ratio was 1: 10. After hybridization, the mixture was centrifuged for 20 min at 16,000 g and half the volume of the aqueous phase was separated. Specific radioactivity was measured in the obtained sedimentary (Aosad. Fraction) and supernatant (Avodn. Fraction) fractions.
  • efficiency (E,%) [(Aosad fraction) / [(Aosad fraction) + [(Aosad fraction) + (Aqueous fraction)] * 100%.
  • Double-stranded DNA copies of aptamers selected by SELEX were cloned into pUC19 vector (Pharmacia, USA). For this, the DNA was treated with a T4 polynucleotide kinase and ligated into a Stal restriction endonuclease treated vector. Recombinant DNA sequencing was performed according to the Sanger method using standard pUC primers.
  • Non-specific binding was blocked with 3% bovine serum albumin in buffer A for 1 h at 37 ° C. After washing, horseradish peroxidase conjugate with streptavidin (IMTEC) was applied and incubated for an additional 1 h. After five
  • Example 4 The study of the binding of biotinylated aptamers to prion BSE cows (BoPrP).
  • the protocol for preparing labeled streptovidin peroxidase aptamers is as follows. A 5 mM phosphate buffer containing 150 mM NaCl (pH b) was prepared in
  • the protocol for conducting an enzyme immunoassay for a comparative analysis of the effectiveness of the binding of aptamers to prion of spongiform encephalopathy of cows is as follows. Strips with immobilized antibodies to PrP, washing buffer, negative and positive controls were taken from the BioRad diagnostic kit (cat. Na 3551145) and prepared for use in accordance with the manufacturer's instructions.
  • Example 5 The study of the binding of biotinylated aptamers to proteins containing polyglutamine repeats.
  • Cells were separated from the medium by centrifugation, washed with TBS buffer, resuspended in the same buffer with the addition of protease inhibitors Complete (Roche), PMSF (2mM), EDTA (5mM) in half the volume of the cell pellet and an equal amount of glass beads was added to them. Cells were broken up on a Vortex homogenizer for 5 minutes with cooling in ice every minute for 30 seconds. Then the soluble fraction was separated by centrifugation at 10 thousand rpm for 15 minutes (at 40 ° C).
  • Yeast culture was grown in 2 liter flasks until the early stationary phase, which is about 3 units. OD 6 oo for a synthetic medium and about 6 D 60 O for a complete YPD (Sherman, F., Fink, GR, Add Hisks D.V. (1986). Methods Y Canalp Heptes. CoId Srpg Narbor Laroratoru, CoId Srrrrrrrrrr. Cells were harvested by centrifugation, resuspended in 50 ml of distilled water, and again pelleted in 50 ml Falcon tubes. Thus, 3-5 ml of cell pellet was obtained. Then the cells were further processed or stored at -75 ° C for several months.
  • Cells were lysed with glass beads (beads were taken in an equal volume to the cell mass) in half the volume of TBS Tris-Salt buffer (30 mM Tris-Hcl pH 7.4, 150 mM NaCl) in the presence of a 10 mM solution of phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF). Cells were broken for 4 minutes with cooling in ice every 30 seconds at Vortex (Vorteh). After destruction, the cell derbis was separated by centrifugation at 50,000 rpm for 10 minutes. The soluble fraction was layered on 1.5 ml of 20% sucrose in 12 ml polycarbonate centrifuge tubes and centrifuged for 2 hours at 50,000 rpm, 5 ° C.
  • TBS Tris-Salt buffer (30 mM Tris-Hcl pH 7.4, 150 mM NaCl
  • PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride
  • the supernatant was removed and the pellet, together with 100-200 ⁇ l of gel-like material, was resuspended in 1 ml of TBS with 5 mM PMSF.
  • RNase A was added to the suspension to O.lmg / ml and incubated for 15 minutes at room temperature. Then sarcosyl was added to 3%, mixed thoroughly and centrifuged in a microcentrifuge for 10 min at 12000 rpm, 5 ° C.
  • the supernatant was layered on lml 20% sucrose containing
  • the pellet was suspended in 1 ml of TBS buffer with 2% SDS and 5 mM PMSF.
  • Protein monomer isolated from E. coli cells was diluted 33 times (30 ⁇ l per 1 ml) with 5 mM phosphate buffer with 150 mM NaCl and 0.01% sodium azide. Next, they were incubated at 8 0 C with stirring for 60-70 hours.
  • yeast cell lysates or purified preparations containing the analyzed proteins in the monomeric or amyloid state were applied to the strips of the nitrocellulose membrane.
  • Each sample of the protein solution was applied in three dilutions (in increments of 5 times) in one vertical row.
  • the membrane was incubated for one hour in a casein solution (4 mg / ml) in Tris-Salt Buffer (TBS), pH 7.4, then the membranes were stained with Ponso dye (non-specific protein staining) to determine the amount of protein deposited. After that, the membrane was washed from Ponceau dye with water and immersed in a solution of biotinylated DNA aptamer S5 and streptavidin peroxidase in phosphate-buffered saline (PBS), pHb.O with 0.05 mM Mg 2+ containing 200 mM urea and 0.4% casein.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the aptamer S4 specifically binds to the Sup35NM yeast protein in prion and amyloid form, and to the artificial polyglutamine protein Q70 (SEQ ID NO: 11), an analogue of the Huntington protein ( ⁇ tt).

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

The invention relates to an oligonucleotide and a conjugate thereof for detecting proteins in an amyloid state and to a method for detecting proteins in an amyloid state.

Description

Олигонуклеотид и его конъюгат для детекции белков в амилоидном состоянии и способ детекции белков в амилоидном состоянии Oligonucleotide and its conjugate for the detection of proteins in the amyloid state and a method for detecting proteins in the amyloid state
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к молекулярной биологии и медицинской диагностике, в частности, к способу диагностики амилоидозов, основанном на детекции амилоидов, в том числе их инфекционных вариантов - прионов.The present invention relates to molecular biology and medical diagnostics, in particular, to a method for the diagnosis of amyloidosis, based on the detection of amyloids, including their infectious variants - prions.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Амилоиды - это нерастворимые белковые агрегаты, имеющие фибриллярную структуру, и устойчивые к действию протеаз. Амилоидные фибриллы представляют собой линейные полимеры, состоящие из нековалентно связанных между собой молекул белка. Эти полимеры образуются за счет присоединения белковых мономеров к их концам; при этом процесс роста сопровождается обогащением присоединяемых мономеров β-слоями, которые располагаются перпендикулярно оси полимеров, связанной с конформационной перестройкой с формированием специфичной "кросс-β" структуры. Для амилоидов характерно взаимодействие с некоторыми красителями, прежде всего, с конго красным и тиофлавином T (Сhiti F., Dobson CM. 2006. Рrоtеiп misfоldiпg, fuпсtiопаl аmуlоid, апd humап disеаsе. Аппu. Rеv. Вiосhеm. 75, 333-366).Amyloids are insoluble protein aggregates that have a fibrillar structure and are resistant to proteases. Amyloid fibrils are linear polymers consisting of non-covalently linked protein molecules. These polymers are formed by the attachment of protein monomers to their ends; in this case, the growth process is accompanied by the enrichment of the attached monomers with β-layers, which are perpendicular to the axis of the polymers, associated with conformational rearrangement with the formation of a specific "cross-β" structure. Amyloids are characterized by interaction with certain dyes, primarily with Congo red and thioflavin T (Сhiti F., Dobson CM. 2006. РrРеРiР апР mР mРпР ,РisfРisfРisfР ,Р ,Р ,Р,, Р ,Р ,Р ,РtiР ° РопаР аР аР аРmР аР ° Р ,Р ° Р ,Р ° Р АпР ° РпР ° Рп, Р .Р ° РvР ° РiР °. Вісхем. 75, 333-366).
Классификация амилоидозов сложна и неоднозначна: выделяют системные амилоидозы (поражаются многие органы) и орган-специфичные амилоидозы, первичные амилоидозы (накопление амилоидов приводит к заболеванию) и вторичные (накопление амилоидов обусловлено каким-то другим заболеванием). Наконец, амилоидозы разделяют на неинфекционные и инфекционные (прионные) (Siре J.D., Cohen A. S. 2000. Нistоrу оf thе аmуlоid fibril. J. Stгасt. Вiоl. 130, 88-98.).The classification of amyloidoses is complex and ambiguous: systemic amyloidoses (many organs are affected) and organ-specific amyloidoses, primary amyloidoses (amyloid accumulation leads to a disease) and secondary (amyloid accumulation are caused by some other disease) are distinguished. Finally, amyloidoses are divided into non-infectious and infectious (prionic) (Sipe J.D., Cohen A. S. 2000. Nistoru of the amuloid fibril. J. Stast. Biol. 130, 88-98.).
Интерес к химической и физической природе амилоидов обусловлен, в первую очередь, их связью с обширной группой заболеваний человека и животных. Эти заболевания объединяют под общим названием амилоидозы. Некоторые из этихThe interest in the chemical and physical nature of amyloids is due, first of all, to their connection with an extensive group of diseases in humans and animals. These diseases are combined under the general name amyloidosis. Some of them
1one
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) заболеваний, обусловленные особой разновидностью амилоидов, называемых прионами, трансмиссивны. Пригонные амилоиды описаны не только у млекопитающих, но и у низших эукариот, у которых они выступают в роли нехромосомно наследуемых детерминант.SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) diseases caused by a special variety of amyloids called prions are vector-borne. Fit amyloids are described not only in mammals, but also in lower eukaryotes, in which they act as nonchromosomally inherited determinants.
Инфекционный прионный белок животных, названный PrPSc, представляет собой особую конформационно-измененную изоформу клеточного белка PrPc, отличающуюся от него по своей пространственной структуре. Инфекционная форма белка PrPSo, попадая в организм извне или спонтанно в нем возникая, способна стимулировать превращению нормальной формы PrPc в патогенную аномальную форму PrPSc посредством белок- белковых взаимодействий. Таким образом обеспечивается автокаталитическое поддержание прионной изоформы белка (Prusiner,S.B., Scott,M.R., DeArmond,S J., Cohen,F.E. (1998) Рriоп рrоtеiп biоlоgу. CeIl, 93, 337-348). К числу наиболее известных заболеваний животных этого типа относят так называемое «кopoвьe бешенство ». К числу наиболее известных заболеваний человека этого типа относят амилоидозы центральной нервной системы (болезни Альцгеймера, Паркинсона, Гентинrтона), а также сахарный диабет типа 2 и некоторые формы спиноцеребральной атаксии и катаракты (Галкин A.П., Миронова Л.H., Журавлёва Г.A., Инге-Вечтомов С.Г. Генетика (2006) 42, JN°11, 1558- 1570).Infectious prion protein of animals, called PrP Sc , is a special conformationally modified isoform of the cellular protein PrP c , which differs from it in its spatial structure. The infectious form of PrP So protein, entering the body from the outside or spontaneously arising in it, can stimulate the conversion of the normal form of PrP c into the pathogenic abnormal form of PrP Sc through protein-protein interactions. In this way, autocatalytic maintenance of the prion isoform of the protein is provided (Prusiner, SB, Scott, MR, DeArmond, S J., Cohen, FE (1998) Rioproteip Biolog. CeIl, 93, 337-348). Among the most famous diseases of animals of this type include the so-called "rabies". Amyloidoses of the central nervous system (Alzheimer's, Parkinson's, Gentinton's disease), as well as type 2 diabetes mellitus and some forms of spinocerebral ataxia and cataracts (Galkin A.P., Mironova L.N., Zhuravleva G .A., Inge-Vechtomov S.G. Genetics (2006) 42, JN ° 11, 1558-1570).
Разработка теории прионов позволила выявить белки с прионоподобными свойствами у дрожжей Sассhаrотусеs. Так, у дрожжей Sассhаrотусеs сеrеvisiае описаны нехромосомно наследуемые генетические детерминанты [PS f] и [UREJ] (Тер-Аванесян, M.Д., и Кушниров В.В. (1999) Прионы: инфекционные белки с генетическими свойствами. Биохимия, 64, 1638-1647; Wiсkпеr, R.B., Тауlоr, K.L., Еdskеs, H.K., Маddеlеiп, М.-L., Моriуаmа, H. апd Rоbеrts, В. T. (1999) Рriопs iп Sассhаrотусеs апd Роdоsроrа sрр.: рrоtеiп- bаsеd iпhеritапсе. Мiсrоbiоl. MoI. Вiоl. Rеv., 63, 844-861). В отличие от всех других цитоплазматических детерминантов дрожжей, их не удалось связать с какой-либоThe development of the theory of prions made it possible to identify proteins with prion-like properties in Sassharotus yeast. Thus, non-chromosomally inherited genetic determinants [PS f] and [UREJ] (Ter-Avanesyan, MD, and Kushnirov VV (1999) Prions: infectious proteins with genetic properties have been described in Sassharotus servisae yeast (1999). Biochemistry, 64, 1638-1647; Wiсkper, RB, Taulor, KL, Еdskеs, HK, Мdedeleip, M.-L., Moriuama, H. update Roberts, V. T. (1999) Rrides and Social Security, Microbiol. MoI. Biol. Rev. 63, 844-861). Unlike all other cytoplasmic determinants of yeast, they could not be associated with any
2 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) нуклеиновой кислотой. [PiST+] и [URЕЗ] вызывают повышенный интерес поскольку их необычные свойства связаны с прионоподобным состоянием некоторых белков дрожжей.2 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) nucleic acid. [PiST + ] and [UREZ] are of increased interest because their unusual properties are associated with the prion-like state of some yeast proteins.
[PiST+] описан как цитоплазматически наследуемй детерминант, усиливающий действие слабого нонсенс-супрессора SUQ5 (кодирует серин-специфичную тРНК с антикодоном, комплементарным нонсенс-кодону UAA) и связан с присутствием в клетке белка Sup35. Белок Sup35 содержит два функциональных участка: домен N (первые 123 аминокислот) и С (аминокислоты 254 - 685). Домен N отвечает за поддержание [PS f], но несуществен для жизнеспособности. Домен С эволюционно-консервативен, необходим для жизни клетки и отвечает за функцию Sup35 в трансляции, но несуществен для поддержания [PST+] (Теr-Аvапеsуап, M.D., Dаgkеsаmапskауа, A.R., Кushпirоv, V.V. апd Smirпоv, V.N. (1994) Тhе SUP 35 оmпiроtепt suррrеssоr gепе is iпvоlvеd in the maintenance оf thе поп-Мепdеliап dеtеrmiпапt [psi+] iп thе уеаst Sассhаrотусеs сеrеvisiае. Gепеtiсs, 137, 671- 676; Кushпirоv, V.V., Теr-Аvапеsуап, M.D., Теlkоv, M.V., Surguсhоv, A.P., Smimоv, V.N. апd Iпgе-Vесhtоmоv, S.G. (1988) Nuсlеоtidе sеquепсе оf thе SUP2(SUP35) gепе оf Sассhаrотусеs сеrеvisiае. Gепе, 66, 45-54; 11. Теr-Аvапеsуап, M.D., Кushпirоv, V. V., Dаgkеsаmапskауа, A.R., Didiсhепkо, A.S., Сhеrпоff Y.O., Iпgе-Vесhtоmоv, S.G. апd Smirпоv, V.N. (1993) Dеlеtiоп апаlуsis оf thе SUP 35 gепе оf уеаst Sассhаrотусеs сеrеvisiае rеvеаls twо поп-оvегlаррiпg fuпсtiопаl rеgiопs iп thе епсоdеd рrоtеiп. MoI. Мiсrоbiоl., 7, 683-692).[PiST + ] is described as a cytoplasmic inherited determinant that enhances the action of the weak nonsense suppressor SUQ5 (encodes a serine-specific tRNA with an anticodon complementary to the nonsense codon UAA) and is associated with the presence of the Sup35 protein in the cell. The Sup35 protein contains two functional sites: domain N (first 123 amino acids) and C (amino acids 254 - 685). Domain N is responsible for maintaining [PS f], but is not essential for viability. Domain C is evolutionarily conservative, necessary for cell life and is responsible for the translation function of Sup35, but is not essential for maintaining [PST + ] (Ter-Avapesuap, MD, Dagkesamapskaua, AR, Kushpirv, VV apd Smirpov, VN (1994) Tp SUP 35 optimistic supervisor is in the maintenance of the maintenance of the pop-up method of the test [psi + ] is the best, the testes, the, the, the, the, the, the, the; Smimov, VN apd Ipeg-Veshtomov, SG (1988) Nuclide Séfépséfé SUP2 (SUP35) Hépéf Sassarotés servisée. Hepé, 66, 45-54; 11. Tér-Avapesuapé, Dhécu, Dhékék, , AS, Cherpoff YO, IPG-Vtomtov, SG apt Smirpov, VN (1 993) Delétiop apalysis of the SUP 35 Hepe of the best Sassarotés services re-popped pop-ready-packaged foodstuffs, 68 MoI. 68.
Предположение о прионных свойствах белка Sup35 было основано на сходстве их проявлений с некоторыми особенностями прионной инфекции у млекопитающих. Способность к агрегации Sup35 зависела от детерминанта [PJST+]: молекулы Sup35 способны взаимодействовать друг с другом в клетках [PJST+] И неспособны к такому взаимодействию в клетках [рsf]. Выяснено также, что для олигомеризации Suρ35 необходим интактный домен N, т.е. именно тот участок белка, от которого зависело поддержание [PiST+] в клетках дрожжей (Раushkiп, S.V., Кuslmirоv, V.V., Smimоv, V.N., апd Теr-Аvапеsуап, М.D. (1996) Рrораgаtiоп оf thе уеаst рriоп-likе [PS1T+] dеtеrmiпапt is mеdiаtеdThe assumption of the prion properties of the Sup35 protein was based on the similarity of their manifestations with some features of prion infection in mammals. The ability to aggregate Sup35 depended on the determinant [PJST + ]: Sup35 molecules are able to interact with each other in [PJST + ] cells and are incapable of such interaction in [psf] cells. It was also found that the oligomerization of Suρ35 requires an intact domain N, i.e. exactly that portion of the protein on which the maintenance of [PiST + ] in yeast cells depended (Raushkip, SV, Kuslmiróv, VV, Smimóv, VN, apt Ter-Avapesuap, M.D. (1996) Prorogatiop оf thе beast рriop-likе [PS 1 T + ] Determiпапт is MEDIATED
3 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) bу оligоmеrizаtiоп оf thе SUP35-eпcoded роlурерtidе сhаiп rеlеаsе fасtоr. EMBO J., 15, 3127- 3134; Раushкiп, S. V., Кushпirоv, V. V., Smirпоv, V.N., апd Теr-Аvапеsуап, М.D. (1997) Iпtеrасtiоп bеtwееп уеаst Sup45 (еRFl) апd Sup35 (еRFЗ) роlурерtidе сhаiп rеlеаsе fасtоrs: imрliсаtiопs fоr рriоп-dерепdепt rеgulаtiоп. MoI. CeIl. Вiоl., 17, 2798-2805).3 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) b oligomerismatiof of thе SUP35-epcoded rohluretide shaip releas fast. EMBO J., 15, 3127-3134; Rushkip, SV, Kushpirov, VV, Smirpov, VN, apt Ter-Avapesuap, M.D. (1997) Iperastiop Betwaip West Sup45 (eRFl) app Sup35 (eRFZ) Rolurettide Shaile Release Factors: Impliance Forward Regulatiop. MoI CeIl. Biol., 17, 2798-2805).
Убедительные доказательства прионной природы белка Sup35 получены при исследовании его перехода в прионную форму iп vitrо (Раushkiп, S.V., Кushпirоv, V.V., Smirпоv, V.N., апd Теr-Аvапеsуап, М.D. (1997) In vitrо рrораgаtiоп оf thе рriоп-likе stаtе оf уеаst Sup35 рrоtеiп. Sсiепсе, 277, 381-383).Convincing evidence of the prion nature of the Sup35 protein was obtained by examining its transition to the prion form of vitro (Powushp, SV, Kushpirov, VV, Smirpov, VN, ap-Ter-Avapesuap, M.D. (1997) In vitro prorogatiop of the terriop-like Ое уеst Sup35 рротеіп. Ссеепсе, 277, 381-383).
Доступные в настоящее время методы диагностики прионных заболеваний основаны на исследовании инфекционности образцов тканей заболевшей особи или на иммунодетекции патогенной формы белка PrP. Первый метод потенциально может быть весьма чувствительным, однако его недостатком является длительное время, проходящее между инокуляцией инфекционного материала подопытному животному и развитием у него заболевания. Возможности детекции патогенной формы белка могут быть ограничены ее низким содержанием в тканях.Currently available methods for the diagnosis of prion diseases are based on the study of infectivity of tissue samples of a diseased individual or on the immunodetection of the pathogenic form of PrP protein. The first method can potentially be very sensitive, but its drawback is the long time between the inoculation of infectious material in an experimental animal and the development of its disease. The detection capabilities of the pathogenic form of the protein may be limited by its low content in tissues.
Получены моноклональные антитела различающие патогенную и нормальную формы белка PrP (Коrth, С, Stiеrli, В., Strеit, Р., Моsеr, M., Sсhаllеr, О., Fishеr, R., Sсhultz- Sсhаеffеr, W., Кrеtzsсhmаr, H., Rаеbеr, А., Вrаuп, U., Еhrепsреrgеr, F., Ноmеmашi, S., Glосkshubеr, R., Riеk, R., Вillеtеr, M., Wuthriсh, К. апd Оеsсh, В. (1997) Рriоп РrРSс-sресifiс ерitоре dеfiпеd bу а mопосlопаl апtibоdу. Nаturе, 390, 74-77; О'Nuаllаiп, В., Wеtzеl, R. (2002) Сопfоrmаtiопаl Аbs rесоgпiziпg а gепеriс аmуlоid fibril ерitоре. Рrос. Nаtl. Асаd. Sсi. USA, 99, 1485-1490). Тем не менее, практикуемые ныне методы диагностики основаны на исследовании аутопсийных образцов тканей мозга.Monoclonal antibodies are obtained that distinguish between the pathogenic and normal forms of PrP protein (Korth, C, Stierli, B., Streit, P., Moser, M., Schaller, O., Fisher, R., Schultz-Schaeffer, W., Cretzschmar, H ., Raber, A., Bruup, U., Ehrepsrer, F., Hötemashi, S., Glokshuber, R., Riek, R., Willether, M., Wuthrikh, K. up Oesh, V. (1997) Riop PrРСс-sresifiсs with the analyzer was approved and approved by Natura, 390, 74-77; O'Nuallaip, V., Wetzel, R. (2002) Correspondent Accept. 99, 1485-1490). Nevertheless, the diagnostic methods currently practiced are based on the study of autopsy samples of brain tissue.
В последнее время появились попытки разработать новые методы диагностики прионных заболеваний, основанные на иных принципах. Один из таких подходов основан на способности прионных белков переходить в патогенную форму iп vitrо. В подобныхRecently, there have been attempts to develop new methods for the diagnosis of prion diseases based on other principles. One of these approaches is based on the ability of prion proteins to transform into the pathogenic form of ip vitro. In like
4 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) экспериментах смешивают в пробирке белок, находящийся в прионном состоянии с его неприонным вариантом и наблюдают превращение нормального белка в прионную форму. Как мы уже отмечали выше, такое превращение проходит эффективно для белка Sup35 дрожжей, но не для белка PrP млекопитающих. Был разработан способ увеличения скорости превращения белка PrP в прионную форму. Этот метод основан на периодическом ультразвуковом дроблении прионных агрегатов (Sаbоriо, G.P., Реrmаrmе, В. апd Sоtо, С. (2001) Sепsitivе dеtесtiоп оf раthоlоgiсаl рriоп рrоtеiп bу сусliс аmрlifiсаtiоп оf рrоtеiп misfоldiпg. Nаturе, 411, 810-813).4 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) In experiments, a protein in a prion state with its non-prion variant is mixed in vitro and the conversion of a normal protein to a prion form is observed. As we noted above, this conversion is effective for yeast Sup35 protein, but not for mammalian PrP protein. A method has been developed to increase the rate of conversion of PrP protein to prion form. This method is based on periodic ultrasonic crushing of prion aggregates (Saborio, GP, Rermarme, B. app Sotto, C. (2001).
Многообещающей альтернативой существующим подходам для диагностики прионных заболеваний, а также для создания принципиально новых препаратов с возможным терапевтическим действием является процедура конструирования и селективного отбора коротких олигонуклеотидов (аптамеров) ДНК-ового или РНК-ового происхождения из огромного набора исходной смеси химически синтезированных фрагментов со случайной последовательностью ("SELEX" - Sуstеmаtiс Еvоlutiоп оf Ligапds bу Ехропепtiаl епriсhmепt), Кlug S. J., Fаmulоk M. (1994) AIl уоu wапtеd tо kпоw аbоut SELEX. Моlесиlаr Вiоlоgу Rероrts, 20, 97-107).A promising alternative to existing approaches for diagnosing prion diseases, as well as for creating fundamentally new drugs with possible therapeutic effects, is the procedure for constructing and selectively selecting short oligonucleotides (aptamers) of DNA or RNA origin from a huge set of the initial mixture of chemically synthesized fragments with a random sequence ("SELEX" - Sustematis Evolutiop of Ligapds bu Expeptial epmpt), Klug SJ, Famulok M. (1994) AIl wow updated to select SELEX. Molesilar Biologo Rorrts, 20, 97-107).
Так в патентной заявке PCT WO2006138676 описаны группа полинуклеотидов (аптамеров), обладающих способностью к связыванию с белком PrP, и способ детекции белка PrP с использованием указанных аптамеров.So in PCT patent application WO2006138676, a group of polynucleotides (aptamers) having the ability to bind to a PrP protein and a method for detecting a PrP protein using said aptamers are described.
Описание изобретенияDescription of the invention
Целью настоящего изобретения является получение и отбор ДНК-аптамеров, обладающих способностью эффективно и специфически связываться с белками в амилоидном состоянии, и создание способа детектирования белков в амилоидном состоянии, с помощью полученных аптамеров.The aim of the present invention is to obtain and selection of DNA aptamers with the ability to efficiently and specifically bind to proteins in the amyloid state, and to provide a method for detecting proteins in the amyloid state using the obtained aptamers.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) В результате тщательного исследования авторами настоящего изобретения были отобраны аптамеры, обладающие способностью эффективно и специфически связываться с белком Sup35 дрожжей S. сеrеvisiае в фибриллярном амилоидном состоянии и не связываться с его мономерной формой, показана возможность использования указанных аптамеров для детектирования прионных форм белков млекопитающих, в частности белка PrP, в инфекционном материале животных, а также полиглутаминовых белков, например Q70, являющегося аналогом белка гентингтина, и разработан способ детектирования указанных прионных форм белков с использованием указанных аптамеров. Так было создано настоящее изобретение.SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) As a result of a thorough study, the authors of the present invention selected aptamers capable of efficiently and specifically binding to the Sup35 protein of yeast S. servisiae in a fibrillar amyloid state and not binding to its monomeric form, the possibility of using these aptamers to detect prion forms of mammalian proteins, in particular PrP protein, in infectious material of animals, as well as polyglutamine proteins, for example Q70, which is an analogue of the Huntingtin protein, and a method has been developed detecting said prion forms of proteins using said aptamers. Thus was created the present invention.
Настоящее изобретение предоставляет собой олигонуклеотиды для детекции белков в амилоидном состоянии и способ детекции белков в амилоидном состоянии.The present invention provides oligonucleotides for detecting proteins in an amyloid state and a method for detecting proteins in an amyloid state.
Целью настоящего изобретения является предоставление олигонуклеотида для детекции белков в амилоидном состоянии, содержащего нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO: 1-4.The aim of the present invention is the provision of an oligonucleotide for the detection of proteins in the amyloid state containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of the sequences shown in the List of sequences under the numbers SEQ ID NO: 1-4.
Также целью настоящего изобретения является предоставление олигонуклеотида, описанного выше, при этом белками в амилоидном состоянии являются прионогенные белки дрожжей и млекопитающих.It is also an object of the present invention to provide an oligonucleotide as described above, wherein the proteins in the amyloid state are prionogenic proteins of yeast and mammals.
Также целью настоящего изобретения является предоставление конъюгата олигонуклеотида, описанного выше, с молекулой, позволяющей детектировать связывание олигонуклеотида с белками в амилоидном состоянии, в том числе с прионами дрожжей и млекопитающих.It is also an object of the present invention to provide an oligonucleotide conjugate described above with a molecule capable of detecting the binding of an oligonucleotide to proteins in an amyloid state, including with prions of yeast and mammals.
Также целью настоящего изобретения является предоставление конъюгата олигонуклеотида, описанного выше, в котором в качестве указанной молекулы используют флуоресцирующий реагент или фермент, выбранный из группы, состоящей из пероскидаз и люцифераз.It is also an object of the present invention to provide an oligonucleotide conjugate as described above, wherein a fluorescent reagent or an enzyme selected from the group consisting of peroskidases and luciferases is used as said molecule.
6 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше конъюгата олигонуклеотида, в котором используют конъюгат олигонуклеотида с биотином, а в качестве молекулы, позволяющей детектировать связывание олигонуклеотида с амилоидами, в том числе с прионами дрожжей и млекопитающих, используют фермент, выбранный из группы, состоящей из пероскидаз и люцифераз, слитой со стрептовидином или авидином.6 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) It is also an object of the present invention to provide an oligonucleotide conjugate as described above, in which an oligonucleotide conjugate with biotin is used, and an enzyme selected from the group consisting of peroskidases is used as a molecule to detect the binding of an oligonucleotide to amyloids, including prions of yeast and mammals. and luciferase fused with streptovidin or avidin.
Также целью настоящего изобретения является предоставление способа детекции белков в амилоидном состоянии, включающего стадии получения образца культуры дрожжей или ткани млекопитающего, и изучения связывания описанных выше олигонуклеотидов или конъюгата олигонуклеотида с указанными образцами.It is also an object of the present invention to provide a method for detecting proteins in an amyloid state, comprising the steps of obtaining a yeast or mammalian tissue culture sample, and studying the binding of the oligonucleotides or oligonucleotide conjugate described above to these samples.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом белками в амилоидном состоянии являются прионогенные белки дрожжей и млекопитающих.It is also an object of the present invention to provide the method described above, wherein the proteins in the amyloid state are prionogenic proteins of yeast and mammals.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором детектируют прион дрожжей Sup35.It is also an object of the present invention to provide a method as described above in which a Sup35 yeast prion is detected.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором детектируют прион коров PrP.It is also an object of the present invention to provide a method as described above in which a prion of PrP cows is detected.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором детектируют амилоид, образованный полиглутаминовыми белками, в частности гентингтином.It is also an object of the present invention to provide a method as described above in which an amyloid formed by polyglutamine proteins, in particular huntingtin, is detected.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором связывание описанного выше олигонуклеотидов указанным образцом определяют методом гибридизации или методом ПЦР, в частности ПЦР в реальном времени.Another objective of the present invention is the provision of the above method, in which the binding of the oligonucleotides described above by the specified sample is determined by hybridization or PCR, in particular real-time PCR.
7 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором связывание конъюгата олигонуклеотида, описанного выше, с указанным образцом определяют методом флуориметрии.7 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) It is also an object of the present invention to provide the method described above, in which the binding of the oligonucleotide conjugate described above to said sample is determined by fluorimetry.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором связывание конъюгата олигонуклеотида, описанного выше, с указанным образцом определяют путём измерения активности фермента.It is also an object of the present invention to provide the method described above, in which the binding of the conjugate of the oligonucleotide described above to the specified sample is determined by measuring the activity of the enzyme.
Более детально настоящее изобретение описано ниже.In more detail, the present invention is described below.
Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention
Термин "аптамер", используемый в настоящем изобретении, означает одноцепочечный олигонуклеотид, обладающий способностью к связыванию с другой молекулой (молекулой-мишенью) и образованию относительно устойчивого комплекса. При этом, такое связывание происходит не за счёт стандартного связывания между парами оснований по Уотсону-Крику за счёт водородных связей, а за счёт других типов нековалентных связей. Такие типы связей включают нековалентные водородные связи, электростатические взаимодействие, связывание по Ван дер Вальсу, гидрофобные взаимодействия или их комбинации. При этом такой аптамер связывается с целевой молекулой с гораздо более высокой аффиностью, чем с остальными молекулами, присутствующими в образце.The term "aptamer" as used in the present invention means a single-stranded oligonucleotide having the ability to bind to another molecule (target molecule) and the formation of a relatively stable complex. Moreover, this binding does not occur due to the standard binding between base pairs according to Watson-Crick due to hydrogen bonds, but due to other types of non-covalent bonds. Such types of bonds include non-covalent hydrogen bonds, electrostatic interactions, Van der Walses binding, hydrophobic interactions, or combinations thereof. At the same time, such an aptamer binds to the target molecule with a much higher affinity than to other molecules present in the sample.
Способы конструирования и определения характеристик связывания аптамеров с целевыми молекулами хорошо известны из уровня техники (см., например, Lоrsсh апd Szоstаk (1996) или патенты США JNs 5,582,981, 5,595,877, 5,637,459). Сами аптамеры могут быть получены любым известным методом, включая химический синтез, методы рекомбинантных ДНК, с использованием стандартных методов очистки. Также термин «aптaмep» относится и к вторичным аптамерам, содержащим так называемую «кoнceнcycнyю» последовательность, полученную путём анализа двух или несколькихMethods for constructing and characterizing the binding of aptamers to target molecules are well known in the art (see, for example, Lorsh and Szostak (1996) or US Pat. Nos. 5,582,981, 5,595,877, 5,637,459). The aptamers themselves can be obtained by any known method, including chemical synthesis, recombinant DNA methods, using standard purification methods. The term “aptamer” also refers to secondary aptamers that contain the so-called “final” sequence obtained by analyzing two or more
8 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) аптамеров, связывающихся с одной и той же целевой молекулой. Как правило, длина аптамера может варьироваться от 10 до 40 или более нуклеотидов, необходимых для связывания с целевой молекулой.8 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) aptamers binding to the same target molecule. Typically, the length of the aptamer can vary from 10 to 40 or more nucleotides necessary for binding to the target molecule.
Аптамеры содержат нуклеотидную последовательность, определяющую специфичность связывания с целевой молекулой, но при этом также могут содержать участки, фланкирующие эту последовательность, которые необходимы, например, для амплификации всего аптамера методом ГЩР, или содержат сайты эндонуклеаз рестрикции для лигирования аптамера в плазмиды, клонирования и т.п. Такие фланкирующие последовательности обычно содержат от 10 до 30 нуклеотидов, при этом часть из этих нуклеотидов может иметь случайный состав.Aptamers contain a nucleotide sequence that determines the specificity of binding to the target molecule, but they can also contain regions flanking this sequence, which are necessary, for example, for amplification of the entire aptamer using the GPR method, or contain restriction endonuclease sites for ligation of the aptamer into plasmids, cloning, etc. .P. Such flanking sequences usually contain from 10 to 30 nucleotides, while some of these nucleotides may have a random composition.
Также аптамеры согласно настоящему изобретению могут содержать различные ковалентно связанные функциональные модификации и дополнительные лиганды, необходимые для детектирования связывания аптамера с целевой молекулой, например флуоресцентные красители, биотин или различные ферменты, активность которых легко детектировать (пероскидазы, люциферазы и подобные им). Такие модифицированные аптамеры могут быть получены стандартными методами, хорошо известными специалистам в данной области техники, например, в ходе твердофазного синтеза олигонуклеотидов или в растворе с использованием фосфотриэфирного метода.Also, the aptamers according to the present invention may contain various covalently linked functional modifications and additional ligands necessary to detect the binding of the aptamer to the target molecule, for example fluorescent dyes, biotin or various enzymes whose activity is easily detected (peroskidases, luciferase and the like). Such modified aptamers can be obtained by standard methods well known to specialists in this field of technology, for example, during the solid-phase synthesis of oligonucleotides or in solution using the phosphotriether method.
Процедура SELEX (Sуstеmаtiс Еvоlutiоп оf Ligапds bу Ехропепtiаl епriсhmепt) является одним из наиболее эффективных подходов к получению iп vitrо биологически активных макромолекул (аптамеров), происходящих из нуклеиновых кислот (Кульбачинский А.В. 2006. Методы отбора аптамеров к белковым мишеням. Успехи биол. химии. 46, 193-224). Основой этого экспериментального метода является предположение о том, что чрезвычайное разнообразие последовательностей молекул одноцепочечных нуклеиновых кислот определяет такое лее разнообразие их пространственных структур. Как показывают результаты последних лет, аптамеры могут быть найдены практическиThe SELEX procedure (Sustematis Evolutiоf Ligaps bу Еropeptial Еpriсhmept) is one of the most effective approaches for the preparation of vitro biologically active macromolecules (aptamers) originating from nucleic acids (Kulbachinsky AV 2006. Methods for the selection of aptamer proteins. Chemistry. 46, 193-224). The basis of this experimental method is the assumption that the extreme diversity of the sequences of single-stranded nucleic acid molecules determines such a diversity of their spatial structures. As the results of recent years show, aptamers can be found practically
9 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) для любого эпитопа. Успешно получены аптамеры к различным белкам про- и эукариотического происхождения, а также к низкомолекулярным соединениям, таким как аминокислоты, витамины, нуклеотиды и др. Материалом для SELEX служит смесь олигонуклеотидов с частично случайной последовательностью, которую подвергают циклически повторяющимся стадиям связывания с избранной мишенью, разделения и амплификации связавшихся с мишенью молекул нуклеиновой кислоты. Показано, что в результате многократного повторения этой процедуры из первоначально неоднородной смеси олигонуклеотидов с разнообразием последовательностей порядка 1015 в конечном итоге удается выделить и определить первичную структуру аптамеров, обладающих высоким сродством к исследуемой макромолекуле. При этом показатели сродства аптамеров к молекулам-мишеням достигают величин, сравнимых с антителами.9 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) for any epitope. Aptamers to various proteins of pro- and eukaryotic origin, as well as to low molecular weight compounds, such as amino acids, vitamins, nucleotides, etc., have been successfully obtained. The material for SELEX is a mixture of oligonucleotides with a partially random sequence, which is subjected to cyclically repeating stages of binding to a selected target, separation and amplifying nucleic acid molecules bound to the target. It was shown that as a result of repeated repetition of this procedure from an initially heterogeneous mixture of oligonucleotides with a sequence variety of the order of 10 15 , it is ultimately possible to isolate and determine the primary structure of aptamers with high affinity for the studied macromolecule. Moreover, the affinity indices of aptamers to target molecules reach values comparable to antibodies.
Для указанной процедуры SELEX могут быть получены аптамеры, содержащие области случайного состава с любой степени вариабельности. Некоторые позиции могут варьироваться в рамках двух или трёх нуклеотидов, некоторые - четырёх.For this SELEX procedure, aptamers can be obtained containing regions of random composition with any degree of variability. Some positions can vary within two or three nucleotides, some four.
С использованием указанной процедуры SELEX авторами настоящего изобретения были отобраны олигонуклеотиды, обладающие способностью эффективно и специфически связываться с белком Sup35 дрожжей S. сеrеvisiае в фибриллярном амилоидном состоянии и не связываться с его мономерной формой. Показана возможность использования указанных аптамеров для детекции прионной формы белка PrP млекопитающих, в инфекционном материале животных, а также неприонных амилоидов, образуемых полиглутаминовыми белками, например белком Q70, являющимся аналогом гентингтина человека, и разработан способ детекции указанных амилоидных форм белков с использованием указанных аптамеров.Using the indicated SELEX procedure, the authors of the present invention selected oligonucleotides capable of efficiently and specifically binding to the Sup35 protein of S. cerevisia yeast in a fibrillar amyloid state and not binding to its monomeric form. The possibility of using these aptamers to detect the prion form of the PrP protein of mammals in infectious material of animals, as well as nonprionic amyloids formed by polyglutamine proteins, for example, Q70 protein, which is an analogue of human huntingtin, was shown, and a method was developed for the detection of these amyloid forms of proteins using these aptamers.
Олигонуклеотидами согласно настоящему изобретению (аптамерами согласно настоящему изобретению) являются олигонуклеотиды S1-S4, содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей,Oligonucleotides according to the present invention (aptamers according to the present invention) are oligonucleotides S1-S4 containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of sequences,
10 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) приведенных в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO: 1-4, соответственно. Указанные олигонуклеотиды обладают способностью связываться с белками, образующими амилоиды, с высокой специфичностью и эффективностью. Также указанные олигонуклеотиды могут быть использованы для детектирования белков, образующих амилоиды, в частности, прионных белков.10 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) shown in the List of sequences under the numbers SEQ ID NO: 1-4, respectively. These oligonucleotides have the ability to bind to proteins that form amyloids, with high specificity and efficiency. Also, these oligonucleotides can be used to detect proteins that form amyloids, in particular, prion proteins.
Для детектирования связывания олигонуклеотидов (аптамеров) согласно настоящему изобретению с белками, образующими амилоиды, могут использоваться любые методы, известные специалистам в данной области техники. Могут быть применены методы с использованием радиоактивных изотопов, когда для связывания с целевой молекулой используются радиоактивно меченные олигонуклеотиды, напримерTo detect the binding of oligonucleotides (aptamers) according to the present invention to proteins that form amyloids, any methods known to those skilled in the art can be used. Methods using radioactive isotopes can be used when radiolabeled oligonucleotides are used to bind to the target molecule, for example
Р-меченные олигонуклеотиды, а степень связывания определяют после отмывки образца по остаточной радиоактивности. Могут быть использованы методы количественной ПЦР, например ПЦР в реальном времени, когда определяют количество олигонуклеотидов, связавшихся с целевой молекулой и оставшихся в составе комплекса аптамер — целевая молекула, после денатурации такого комплекса.P-labeled oligonucleotides, and the degree of binding is determined after washing the sample by residual radioactivity. Quantitative PCR methods can be used, for example, real-time PCR, when the number of oligonucleotides that bind to the target molecule and remain in the aptamer-target molecule complex is determined after denaturation of such a complex.
Также могут быть использованы функциональные модификации олигонуклеотидов (аптамеров) или дополнительные лиганды, необходимые для детектирования связывания аптамера с целевой молекулой, например флуоресцентные красители, биотин или различные ферменты, активность которых легко детектировать (пероскидазы, люциферазы и подобные им). В случае использования биотинилированого производного олигонуклеотида используют пероскидазу и люциферазу, слитую со стрептовидином или авидином, при этом стрептовидин и авидин связывается с биотином, а пероскидазу или люциферазу используют для детектирования связывания.Functional modifications of oligonucleotides (aptamers) or additional ligands necessary for detecting the binding of the aptamer to the target molecule, for example, fluorescent dyes, biotin, or various enzymes whose activity is easily detected (peroskidases, luciferases, and the like), can also be used. In the case of a biotinylated oligonucleotide derivative, perosidase and luciferase fused with streptovidin or avidin are used, while streptovidin and avidin bind to biotin, and peroskidase or luciferase is used to detect binding.
Так в настоящем изобретении используют конъюгат олигонуклеотида с биотином, а в качестве молекулы, позволяющей детектировать связывание указанногоSo in the present invention use the conjugate of the oligonucleotide with biotin, and as a molecule that can detect the binding of the specified
11 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) олигонуклеотида с амилоидами, используют пероскидазу хрена, слитую со стрептовидином.11 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) oligonucleotide with amyloids, horseradish perosidase is used, fused with streptovidin.
Известно, что белок Sup35 из S. сеrеvisiае содержит два субдомена, которые обуславливают прионоподобные свойства этого белка: QN-богатый район (аминокислотные остатки 6-33) и участок олиrопелтидных повторов (консенсус PQGGYQQ-YN) (аминокислотные остатки 41-97), напоминающих по составу повторы в белке PrP млекопитающих (консенсус PHGGGWGQ). Также известно, что белки, содержащие последовательности из большого числа глутаминовых остатков, образуют агрегаты амилоидного типа. Полиглутаминовые белки согласно настоящему изобретению - это белки, содержащие районы, состоящие из последовательно повторяющихся остатков глутамина. Количество остатков может варьироваться в широких пределах, при этом вероятность образования амилоидной формы белка возрастает при увеличении длины полиглутаминового фрагмента. Примером такого белка является гентингтин (синонимы - хантингтин, Нtt), вызывающий болезнь Гентингтона (Вишневская А. Б., Кушниров В. В., Тер-Аванесян M. Д., Нейродегенеративные амилоидозы: дрожжевая модель. Мол. биология (2007), 41, Jfe2, 346-354; Галкин A.П., Миронова Л.H., Журавлёва Г. А., Инге- Вечтомов С.Г. Генетика (2006) 42, N°l 1, 1558-1570). В качестве аналога такого белка в настоящем изобретении для изучения связывания с ним полученных аптамеров использовали модельный белок Q70 (SEQ ID NO: 11, см. Пример 5), содержащий 70 остатков глутамина на N-конце.It is known that the Sup35 protein from S. servisiae contains two subdomains that determine the prion-like properties of this protein: the QN-rich region (amino acid residues 6-33) and the oliopeltide repeat region (PQGGYQQ-YN consensus) (amino acid residues 41-97), resembling the composition of the repeats in the PrP protein of mammals (consensus PHGGGWGQ). It is also known that proteins containing sequences from a large number of glutamine residues form amyloid-type aggregates. Polyglutamine proteins according to the present invention are proteins containing regions consisting of sequentially repeating glutamine residues. The amount of residues can vary widely, while the likelihood of the formation of an amyloid form of the protein increases with an increase in the length of the polyglutamine fragment. An example of such a protein is Huntingtin (synonyms - Huntingtin, Htt), which causes Huntington's disease (Vishnevskaya A. B., Kushnirov V. V., Ter-Avanesyan M. D., Neurodegenerative amyloidoses: yeast model. Mol. Biology (2007), 41, Jfe2, 346-354; Galkin A.P., Mironova L.N., Zhuravleva G.A., Inge-Vechtomov S.G. Genetika (2006) 42, N ° l 1, 1558-1570). As an analogue of such a protein in the present invention, to study the binding of the obtained aptamers to it, the model protein Q70 (SEQ ID NO: 11, see Example 5) containing 70 glutamine residues at the N-terminus was used.
Способом детектирования белков, образующих амилоиды, согласно настоящему изобретению является способ, включающий стадии: получения образца культуры дрожжей или ткани млекопитающего; и изучения связывания олигонуклеотида (аптамера) согласно настоящему изобретению или его конъюгата согласно настоящему изобретению с указанным образцом.The method for detecting amyloid-forming proteins according to the present invention is a method comprising the steps of: obtaining a yeast or mammalian tissue culture sample; and studying the binding of the oligonucleotide (aptamer) according to the present invention or its conjugate according to the present invention with the specified sample.
12 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Образцом культуры дрожжей может быть как необработанный лизат клеток дрожжей, так и лизат, предварительно обработанный с целью его очистки от белков, не образующих амилоиды, для уменьшения фона неспецифического связывания аптамера с такими белками из изучаемого образца. Концентрирование белков, образующих амилоиды, в изучаемом образце может быт осуществлено с использованием моноклональных антител, обладающих аффинностью к амилоидам.12 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) A yeast culture sample can be either an untreated yeast cell lysate or a lysate pretreated to purify it from non-amyloid-forming proteins to reduce the background of non-specific binding of the aptamer to such proteins from the sample under study. The concentration of proteins that form amyloids in the studied sample can be carried out using monoclonal antibodies with affinity for amyloids.
Образцом ткани млекопитающего также может быть как необработанный лизат клеток ткани, так и лизат, предварительно обработанный с целью его очистки от белков, не образующих амилоиды, для уменьшения фона неспецифического связывания аптамера с такими белками из изучаемого образца. Концентрирование белков, образующих амилоиды, в изучаемом образце может быт осуществлено с использованием моноклональных антител, обладающих аффинностью к амилоидам. Одним из вариантов подготовки образца ткани млекопитающего может быть метод, использующийся в наборе фирмы ВiоRаd (кат. Ns 3551145), включающий получение образца ткани, лизис клеток ткани с последующей обработкой полученного материала протеиназами для расщепления белков, не образующих амилоиды, нанесение полученного материала на полистироловые подложки с моноклональными антителами к синтетическому полипептиду прионного белка и отмывка подложки от несвязавшихся пептидов. Затем следует обработка полученной подложки аптамером согласно настоящему или его конъюгатом и изучение его связывания с исследуемым образцом (см. Пример 4).A mammalian tissue sample can also be either an untreated tissue cell lysate or a lysate pretreated to purify it from non-amyloid-forming proteins to reduce the background of non-specific binding of the aptamer to such proteins from the studied sample. The concentration of proteins that form amyloids in the studied sample can be carried out using monoclonal antibodies with affinity for amyloids. One of the options for preparing a mammalian tissue sample can be the method used in the BioRad kit (cat. Ns 3551145), which includes obtaining a tissue sample, lysing tissue cells, followed by processing the obtained material with proteinases to break down non-amyloid proteins, applying the resulting material to polystyrene substrates with monoclonal antibodies to the synthetic prion polypeptide and washing the substrate from unbound peptides. This is followed by processing the obtained substrate with an aptamer according to the present or its conjugate and studying its binding to the test sample (see Example 4).
Краткое описание рисунковBrief Description of Drawings
На Рис. 1 приведена электронно-микроскопическое изображение фибрилл, образованных белком Sup35NM. Полоса соответствует 100 нм.In Fig. 1 shows an electron microscopic image of the fibrils formed by the Sup35NM protein. The band corresponds to 100 nm.
На Рис. 2 показано связывание мономеров и амилоидных полимеров различных белков с ДНК-аптамером S4 (SEQ ID NO: 4). А: Мембрана окрашена красителем ПонсоIn Fig. 2 shows the binding of monomers and amyloid polymers of various proteins to the S4 DNA aptamer (SEQ ID NO: 4). A: Membrane stained with dye Ponceau
13 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) (неспецифичнсеое окрашивание белков). Б: Мембрана окрашена хемолюминесцентно. Нанесенные образцы: 1 - лизаты клеток дрожжей дикого типа штамма (отрицательный контроль - не содержит прионов и амилоидов); 2 - лизат клеток дрожжей [PS f] содержит дрожжевой белок Sup35NM в прионном состоянии; 3 - полимеры, полученные iп vitrо из искусственного белка Q70, выделенного из Еsсhеriсhiа соli; 4 - белок Sup35 в прионном состоянии, выделенный из штамма дрожжей [PSf]; 5 - белок Sup35 в амилоидном состоянии, выделенный из дрожжей. Пробы разводили в 10 и 100 раз (2-ой и 3-ий ряды, соответственно) .13 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) (non-specific protein staining). B: The membrane is chemoluminescently stained. The applied samples: 1 - lysates of wild-type yeast cells of the strain (negative control - does not contain prions and amyloids); 2 - yeast cell lysate [PS f] contains Sup35NM yeast protein in the prion state; 3 - polymers obtained in vitro from the artificial protein Q70 isolated from Escherichia coli; 4 - protein Sup35 in the prion state isolated from a yeast strain [PSf]; 5 - Sup35 protein in the amyloid state isolated from yeast. Samples were diluted 10 and 100 times (2nd and 3rd rows, respectively).
ПримерыExamples
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.The present invention will be described in more detail below with reference to the following non-limiting Examples.
Пример 1. Получение белка Sup35 дрожжей S. сеrеvisiаеExample 1. Obtaining protein Sup35 yeast S. servisiae
Экспрессионная плазмида для продукции NM фрагмента белка Sup35Expression plasmid for the production of NM Sup35 protein fragment
Фрагмент гeш SUP35, соответствующий первым 250 аминокислотным остаткам белка Sup35 (N- и M- домены), получали ПЦР-амплификацией ДНК плазмиды pEMBLyex4-SUP35 (Теr-Аvапеsуап M.D., Кushпirоv V.V., Dаgkеsаmапskауа A.R., Didiсhепkо S.A., Сhеrоff Y.O., Iпgе-Vесhtоmоv S.G., Smimоv V.N. (1993) Dеlеtiоп апаlуsis оf thе SUP35 gепе оf thе уеаst Sассhаrотусеs сеrеvisiае rеvеаls twо поп-оvеrlаррiпg fшiеtiопаl rеgiопs iп thе епсоdеd рrоtеiп. MoI. Мiсrоbiоl., 7, 683-692) с использованием праймеров Pl (SEQ ID NO: 6 и P2 (SEQ ID NO: 7). В последовательность олигонуклеотидов были введены сайты эндонуклеаз рестрикции Ndеl и Хhоl (подчеркнуты). Фрагмент ДНК, полученный в результате полимеразной цепной реакции, после обработки соответствующими рестрикционными эндонуклеазами клонировали в вектор рЕТЗОа (Nоvаgеп), предварительно обработанный теми нее рестриктазами. ДляThe SUP35 hesh fragment, corresponding to the first 250 amino acid residues of the Sup35 protein (N- and M-domains), was obtained by PCR amplification of the DNA of the plasmid pEMBLyex4-SUP35 (Ter-Avapesuap MD, Kushpovv V, Dagkepogo-Savo, Сhephoto-Savo, Сo-tepofo, Сo-tepоvo, SG, Smimv VN (1993) Delétiop apolysis of the SUP35 Hépé of the best of the Sessharotés service, two-pop-optimizer method, Inc. 6 and P2 (SEQ ID NO: 7). The Ndel and Xhol restriction endonuclease sites (underlined) were introduced into the oligonucleotide sequence. DNA fragment obtained in re as a result of the polymerase chain reaction, after treatment with the corresponding restriction endonucleases, they were cloned into the pETZOa vector (Novagep) pretreated with the restriction enzymes.
14 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) исключения возможных ошибок амплификации клонированную ДНК секвенировали. Полученная плазмида pET30a-Sup35NM-6His кодирует белок Sup35NM, на С-конце которого присутствуют дополнительно 6 остатков гистидина.14 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) excluding possible amplification errors, the cloned DNA was sequenced. The resulting plasmid pET30a-Sup35NM-6His encodes a Sup35NM protein, at the C-terminus of which there are an additional 6 histidine residues.
Экспрессионная плазмида для продукции белка Q70.Expression plasmid for Q70 protein production.
Как отправную точку, использовали плазмиду pET30a-Sup35NM-6His, сконструированную нами ранее. В результате следующих процедур область этой плазмиды, кодирующую N домен Sup35 заменили фрагментом ДНК, кодирующим 70 остатков глутамина. На первом этапе, между уникальными Ndеl и ЕсоКV сайтами этой плазмиды в пределах гена SUP35 вставили адаптер ТАТGТСАGGССТСGGТС (SEQ ID NO: 5), содержащий сайт Stиl. В полученной плазмиде pET30a-Suρ35Adapt фрагмент Stиϊ - НiпdШ заменили фрагментом Ваll-НiпdШ плазмиды pQ70-SUP35MC (АlехапdrоvД.М., Vishnevskaya,A.B., Ter-Avanesyan,M.D., апd Kushnirov,V.V. (2008). Арреаrапсе апd рrораgаtiоп оf роlуglutаmiпе-bаsеd аmуlоids iп уеаst: Туrоsiпе rеsiduеs епаblе роlуmеr frаgmепtаtiоп. J. Вiоl. Сhеm., 283, 15185-15192), кодирующим 70 остатков глутамина. В результате получилась плазмида pET30a-Q70M, позволяющая продуцировать в E. соli белок Q70.As a starting point, the plasmid pET30a-Sup35NM-6His, which we constructed earlier, was used. As a result of the following procedures, the region of this plasmid encoding the Sup35 N domain was replaced with a DNA fragment encoding 70 glutamine residues. At the first stage, between the unique Ndel and EcoKV sites of this plasmid within the SUP35 gene a TATGTSAGGGSTSGGTS adapter (SEQ ID NO: 5) containing the Stil site was inserted. In the resulting plasmid pET30a-Suρ35Adapt, the Stiϊ - НіпdШ fragment was replaced by the Вall-НіпdШ fragment of the plasmid pQ70-SUP35MC (Аlekhapdrov.D.M., Vishnevskaya, AB, Ter-Avanesyan, MD, apdapredelapred Amuloids ip West: Turosipes residues ephemeral fumagateptiop. J. Biol. Chem., 283, 15185-15192), encoding 70 residues of glutamine. The result was the plasmid pET30a-Q70M, which allows the production of Q70 protein in E. coli.
Выделение и очистка белка Sup35 и Q70.Isolation and purification of Sup35 and Q70 protein.
Штамм E. соli BL21(DEЗ) (Nоvаgеп) трансформировали экспрессионной плазмидой pET30a-Sup35NM-6His, кодирующей белок Sup35NM-6His, или плазмидой pET30a-Q70M, кодирующей белок Q70, также содержащий бНis конец. Трансформанты растили ночь при 370C на среде LB (Sambгook,J., FritsсhДЕ., апd Maпiatis,T. (1989). Моlесulаr Сlопiпg: А Lаbоrаtогу Мапuаl. 2пd еd. CoId Sрriпg Наrbоr LаЪоrаtоrу, CoId Sрriпg Наrbоr Рrеss), содержащей 100 мкг/мл ампициллина, Выросшие трансформанты E. соli засевали в колбы со 100 мл среды: 0.8% триптона, 1.35% пептона, 0.25% NaCl, с ампициллином (100 мкг/мл) и растили ночь. Ночную культуру (10 мл) пересевали в колбы с 600 мл среды 2xThe E. coli strain BL21 (DE3) (Novagep) was transformed with the expression plasmid pET30a-Sup35NM-6His encoding the protein Sup35NM-6His or the plasmid pET30a-Q70M encoding the Q70 protein also containing bHis end. Transformants grew overnight at 37 ° C on LB medium (Sambgook, J., FritschE., Add Māpiatis, T. (1989). Molecular Сlopipg: A Laborogu Mapul. 2 ed . containing 100 μg / ml ampicillin, the grown E. coli transformants were seeded in flasks with 100 ml of medium: 0.8% tryptone, 1.35% peptone, 0.25% NaCl, with ampicillin (100 μg / ml) and grown overnight. The overnight culture (10 ml) was plated into flasks with 600 ml of 2x medium
15 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) YT (Sambrook,J., Fritsch,E.E., апd Maniatis,T. (1989). Моlесulаr Сlопiпg: А Lаbоrаtоrу Мапuаl. 2nd еd. СоldSрriпg НаrЪоr Lаbоrаtоrу, СоldSрriпg Наrbоr Рrеss) и выращивали в среде LB до достижения оптической плотности 0,8-1,0 (600 нм), после чего вносили IPTG до конечной концентрации 0,1 мМ и инкубировали в течение 1 часа при 370C. Затем добавляли рифампицин до 0.3 мг/мл и растили 1.5-2 часа при 37°C. Клетки охлаждали и центрифугировали при 6 тыс. об/мин 15 мин. Затем клетки промывали буфером TBS (50мM Трис-НСl, ЮОмМ NaCl, рН 8.0) и замораживали при -800C для хранения.15 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) YT (Sambrook, J., Fritsch, EE, app. Maniatis, T. (1989). Molecular Clopip: Labotor Map. 2 nd ed. Сlod Sprig Labaroborod was grown in an optimal density. 8-1.0 (600 nm), after which IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM and incubated for 1 hour at 37 ° C. Rifampicin was then added to 0.3 mg / ml and grown 1.5-2 hours at 37 ° C . The cells were cooled and centrifuged at 6 thousand rpm for 15 minutes. Then the cells were washed with TBS buffer (50 mM Tris-Hcl, YuOmM NaCl, pH 8.0) and frozen at -80 0 C for storage.
Клетки E. соli после размораживания сразу лизировали в буфере (20 мМ Na2HPO4, рН 8,0, 8 M мочевина) и разрушали ультразвуком в течение 15 мин при комнатной температуре. Полученную суспензию центрифугировали в течение 25 мин при 2500Og. рН водной фазы доводили до 8,0, и наносили на колонку Ni-САМ™ (Sigmа). Элюцию сорбированного Sup35NM проводили градиентом концентрации имидазола в соответствии с инструкцией производителя. Для очистки от низкомолекулярных фрагментов белка Sup35NM проводили ионообменную хроматографию на СМ-сефарозе. Колонку (HR5/5, Рhаrmасiа) уравновешивали буфером (20 мМ Na2HPO4, рН 5,0, 8 M мочевина). рН образца, содержащего Sup35NM, доводили до 5,0 и наносили на колонку. Элюцию производили градиентом 0-300 мМ NaCl. Чистота полученного таким способом рекомбинантного белка Sup35NM составила не менее 95%.After thawing, E. coli cells were immediately lysed in buffer (20 mM Na 2 HPO 4 , pH 8.0, 8 M urea) and sonicated by ultrasound for 15 min at room temperature. The resulting suspension was centrifuged for 25 min at 2500Og. The pH of the aqueous phase was adjusted to 8.0 and applied to a Ni-CAM ™ column (Sigma). Elution of the adsorbed Sup35NM was carried out with an imidazole concentration gradient in accordance with the manufacturer's instructions. For purification from low molecular weight fragments of Sup35NM protein, ion exchange chromatography on CM-sepharose was performed. The column (HR5 / 5, Pharmacia) was equilibrated with buffer (20 mM Na 2 HPO 4 , pH 5.0, 8 M urea). The pH of the sample containing Sup35NM was adjusted to 5.0 and applied to the column. Elution was performed with a gradient of 0-300 mM NaCl. The purity of the Sup35NM recombinant protein obtained in this way was at least 95%.
Полимеризация белков Sup35NM и Q70.Polymerization of Sup35NM and Q70 proteins.
Очищенный белок центрифугировали в течение 20 мин при 16000 g. Супернатант разводили в 8 раз буфером (5 мМ Na2HPO4, рН 7,2, 150 мМ NaCl, 0,01% азида натрия, 0,1% Tween-20) и инкубировали при перемешивании (100 об/мин) при комнатной температуре в течение ночи. Затем проводили диализ образца против 1000-кратного объема буфера (50 мМ Na2HPO4, 150 мМ NaCl, рН 7,4, 0,01% азида натрия, 0,1% Тwееп- 20) при комнатной температуре в течение 18 ч. Препарат полимера хранили при -70°C.The purified protein was centrifuged for 20 min at 16,000 g. The supernatant was diluted 8 times with buffer (5 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.01% sodium azide, 0.1% Tween-20) and incubated with stirring (100 rpm) at room temperature during the night. Then, the sample was dialyzed against a 1000-fold buffer volume (50 mM Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, pH 7.4, 0.01% sodium azide, 0.1% Twep-20) at room temperature for 18 hours. The polymer preparation was stored at -70 ° C.
Электронная микроскопияElectron microscopy
1616
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) В качестве исходного материала для образования прионных фибрилл служил рекомбинантный Sup35NM, денатурированный 8 M мочевиной. Ситуация осложнялась тем, что при хранении данный белок склонен к образованию неупорядоченных агрегатов. Поэтому перед началом полимеризации мы удаляли мультимеры белка в 8 M мочевине при помощи центрифугирования. Фибриллярный Sup35NM получали в две стадии - образование коротких «зaтpaвoк» в денатурирующих условиях (I M мочевина) и окончательная полимеризация в отсутствие мочевины. Качество полученного образца контролировали с помощью электронной микроскопии (см. рис. 1).SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Recombinant Sup35NM denatured with 8 M urea served as a starting material for the formation of prion fibrils. The situation was complicated by the fact that during storage this protein is prone to the formation of disordered aggregates. Therefore, before polymerization, we removed protein multimers in 8 M urea by centrifugation. Fibrillar Sup35NM was obtained in two stages - the formation of short “charges” under denaturing conditions (IM urea) and the final polymerization in the absence of urea. The quality of the obtained sample was monitored by electron microscopy (see Fig. 1).
Фибриллы, образованные Sup35NM, сорбировали на покрытой формваровой пленкой (при нанесении пленки использовали 0.5% раствор формвара в дихлорэтане) медной сеточке в течение 15-20 секунд и контрастировали 2% водным раствором уранилацетата в течение 5-15 секунд. Наблюдения проводили на электронном микроскопе HitacЫ HU-12.The fibrils formed by Sup35NM were sorbed on a coated formar film (using a 0.5% formvar solution in dichloroethane when applying the film) a copper mesh for 15-20 seconds and contrasted with a 2% aqueous solution of uranyl acetate for 5-15 seconds. Observations were carried out using a HitacЫ HU-12 electron microscope.
Согласно электронной микроскопии, были получены фибриллы диаметром приблизительно 10 нм и длиной порядка 100-1000 нм, что соответствует известным в литературе данным (Glоvеr J.R., Коwаl A.S., Sсhirmеr E.C., Раtiпо M.M., Liu J.J., Liпdquist S. 1997. Sеlf-sееdеd fibеrs fоrmеd bу Sup35, thе protein determinant of [PS?], а hеritаblе рriоп- likе fасtоr оfS. сеrеvisiае. CeIl. 89, 811—819).According to electron microscopy, fibrils with a diameter of approximately 10 nm and a length of the order of 100-1000 nm were obtained, which corresponds to the data known in the literature (Glover JR, Kowal AS, Schirmere EC, Ratipo MM, Liu JJ, Liquid S. 1997. Self-sedad fibers formed Bu Sup35, the protein determinant of [PS?], and herible likelihood of fastoF.Service. CeIl. 89, 811-819).
Пример 2. Получение олигонуклеотидов (аптамеров) ОлигонуклеотидыExample 2. Obtaining oligonucleotides (aptamers) Oligonucleotides
Синтезировали 90-звeнныe олигонуклеотиды S70 (SEQ ID NO: 8), несущие центральную 40-звeннyю область случайного состава, фланкированную 25-звeнными остатками, необходимыми для амплификации в ходе процедуры SELEX. Для облегчения последующих процедур очистки двуцепочечных форм аптамеров и их клонирования в структуру константных областей олигонуклеотидов были введены сайты эндонуклеазSynthesized 90-link S70 oligonucleotides (SEQ ID NO: 8), bearing a central 40-link random region flanked by 25-link residues necessary for amplification during the SELEX procedure. To facilitate the subsequent procedures for the purification of double-stranded forms of aptamers and their cloning, the sites of endonucleases were introduced into the structure of the constant regions of oligonucleotides
17 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) рестрикции Крпl и Рstl (подчеркнуты). Для амплификации аптамеров в ходе проведения процедуры SELEX использовали праймеры dirS (SEQ ID NO: 9) и геvS (SEQ ID NO: 10), также содержащие сайты эндонуклеаз рестрикции Крпl и Рstl.17 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) restriction Krl and Pstl (underlined). For the amplification of aptamers during the SELEX procedure, dirS primers (SEQ ID NO: 9) and gevS (SEQ ID NO: 10), also containing restriction endonuclease sites Kpl and Pstl, were used.
Селекция олигонуклеотидов, образующих комплексы с фибриллами SuрЗδNМSelection of Oligonucleotides Complexing with Supp3δNM Fibrils
Методика отбора выглядела следующим образом: 4,5 нМ 90-звeнныx одноцепочечных фрагментов ДНК в буфере А (буфер А: 5 мМ Na2HPO4, 150 мМ NaCl, рН 7,2, 0,01% азида натрия, 200 мМ мочевины, 2 мМ MgCl2) инкубировали в течение 5 мин при температуре 100°C, затем охлаждали до 28°C. К олигонуклеотиду добавляли 0,45 нМ белка Sup35NM в фибриллярной форме и 4,5 нМ мономерного белка (в молярном соотношении 10:1 :10, соответственно). Гибридизацию проводили в течение часа при перемешивании (300 об/мин). Следует отметить, что ни ДНК, ни мономеры Sup35NM в этих условиях не осаждались. Таким образом, процедура предусматривала процесс отбора против аптамеров, взаимодействующих с мономерным белком Sup35NM. Комплексы фибрилл с аптамерами отделяли путем центрифугирования в течение 20 мин при 16000 g. Осадок, после двукратной промывки буфером А, кипятили на водяной бане в 10 мкл воды течение 3 мин. Водную фазу переносили в новую микроцентрифужную пробирку и использовали в качестве источника матрицы в следующем раунде SELEXThe selection procedure was as follows: 4.5 nM 90-link single-stranded DNA fragments in buffer A (buffer A: 5 mM Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, pH 7.2, 0.01% sodium azide, 200 mm urea, 2 mM MgCl 2 ) were incubated for 5 min at a temperature of 100 ° C, then cooled to 28 ° C. 0.45 nM Sup35NM protein in fibrillar form and 4.5 nM monomeric protein (in a molar ratio of 10: 1: 10, respectively) were added to the oligonucleotide. Hybridization was carried out for one hour with stirring (300 rpm). It should be noted that neither DNA nor Sup35NM monomers were precipitated under these conditions. Thus, the procedure involved a selection process against aptamers interacting with the Sup35NM monomeric protein. Complexes of fibrils with aptamers were separated by centrifugation for 20 min at 16,000 g. The precipitate, after washing twice with buffer A, was boiled in a water bath in 10 μl of water for 3 minutes. The aqueous phase was transferred to a new microcentrifuge tube and used as a matrix source in the next round of SELEX
Проводили 9 последовательных стадий отбора из исходно гетерогенной смеси олигонуклеотидов таких молекул, которые способны были взаимодействовать с фибриллярной формой Sup35NM. Данные о прогрессе селекции получали после 3, 6, 7, 8 и 9 циклов.Nine consecutive stages of selection of molecules that were capable of interacting with the fibrillar form of Sup35NM from the initial heterogeneous mixture of oligonucleotides were carried out. Data on selection progress was obtained after 3, 6, 7, 8, and 9 cycles.
После 9 цикла доля олигонуклеотидов, специфически связывающихся с фибриллами, достигла 40%. Полученные аптамеры в двуцепочечной форме клонировали и секвенировали. 40 нуклеотидных последовательностей аптамеров проанализировали на присутствие гомологичных участков при помощи компьютерных программ DNA-SUN и UNAFoId.After cycle 9, the proportion of oligonucleotides that specifically bind to fibrils reached 40%. The resulting double-stranded aptamers were cloned and sequenced. 40 nucleotide sequences of aptamers were analyzed for the presence of homologous regions using DNA-SUN and UNAFoId computer programs.
18 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Сравнение первичных последовательностей показало, что некоторые аптамеры имеют довольно протяженные (до 24 нуклеотидов) области гомологии. Особый интерес вызвали олигонуклеотиды, имеющие сходство с несколькими другими. Эти аптамеры (Sl- S5) химически синтезировали, причем, для облегчения последующей оценки их свойств на 5'-кoнeц ДНК помещали биотин. Для большей эффективности синтеза каждый из константных участков олигонуклеотида был сокращен на 10 олигонуклеотидов.18 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Comparison of the primary sequences showed that some aptamers have rather extended (up to 24 nucleotides) homology regions. Of particular interest were oligonucleotides that resemble several others. These aptamers (Sl-S5) were chemically synthesized, and, to facilitate the subsequent assessment of their properties, biotin was placed on the 5'-end of the DNA. For greater synthesis efficiency, each of the constant regions of the oligonucleotide was reduced by 10 oligonucleotides.
Полимеразная цепная реакцияPolymerase chain reaction
Для проведения ПЦР использовали буфер: 67 мМ -HCl, рН 8,4; 17 мМ (NH4)2SO4; 10 мМ 2-мepкaптoэтaнoл; 2 мМ MgCl2; 0,5 мМ смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов). При синтезе материала для каждого цикла SELEX использовали следующую схему - в ПЦР получали двуцепочечные матрицы (концентрации праймеров dirS (SEQ ID NO: 9) и rеvS (SEQ ID NO: 10) составляли 0,5 мкМ), условия проведения ПЦР - денатурация при 940C в течение 30 секунд; отжиг праймеров при 6б°C в течение 30 секунд, элонгация при 72°C в течение 30 секунд. Количество циклов - 30. После электрофореза в 3% агарозном геле и последующей элюции 90-звeнныe двухцепочечные фрагменты ДНК использовали в качестве матриц для синтеза одноцепочечных фрагментов ДНК. Для этого использовали праймеры dirS (SEQ ID NO: 9) и rеvS (SEQ ID NO: 10) в концентрации 0,5 и 0,05 мкМ, соответственно. Условия проведения ПЦР: денатурация при 940C в течение 30 секунд; отжиг праймеров и элонгация при 72°C в течение 20 секунд. Количество циклов - 30.For PCR, a buffer was used: 67 mM-HCl, pH 8.4; 17 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 10 mM 2-mercaptoethanol; 2 mM MgCl 2 ; 0.5 mM mixture of deoxynucleotide triphosphates). In the synthesis of the material for each SELEX cycle, the following scheme was used: double-stranded matrices were obtained in PCR (dirS primer concentrations (SEQ ID NO: 9) and revS (SEQ ID NO: 10) were 0.5 μM), PCR conditions denatured at 94 0 C for 30 seconds; primer annealing at 6 ° C for 30 seconds; elongation at 72 ° C for 30 seconds. The number of cycles is 30. After electrophoresis on a 3% agarose gel and subsequent elution, 90-unit double-stranded DNA fragments were used as matrices for the synthesis of single-stranded DNA fragments. For this, primers dirS (SEQ ID NO: 9) and rеvS (SEQ ID NO: 10) were used at a concentration of 0.5 and 0.05 μM, respectively. Conditions for PCR: denaturation at 94 0 C for 30 seconds; primer annealing and elongation at 72 ° C for 20 seconds. The number of cycles is 30.
Радиоактивное мечение ДНКRadioactive DNA Labeling
Включение радиоактивной метки в ДНК осуществляли внесением в реакционую смесь для ПЦР 10-20 мкКu альфа 32P dАТР. Меченную ДНК очищали от невключившейся метки электрофорезом и последующей элюцией из 6%-нoгo ПААГ, содержащего 7% мочевины.The inclusion of the radioactive label in DNA was carried out by introducing into the reaction mixture for PCR 10-20 μKu alpha 32 P dATP. Labeled DNA was purified from the unincorporated label by electrophoresis and subsequent elution from 6% PAAG containing 7% urea.
19 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Пример 3. Определение эффективности связывания аптамеров с мишенью19 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Example 3. Determining the efficiency of binding of aptamers to the target
При измерении эффективности связывания молярное соотношение меченный аптамер : белок составляло 1 :10. После гибридизации смесь центрифугировали в течение 20 мин при 16000 g и отделяли половину объема водной фазы. В полученных осадочной (Аосад.фракция) и надосадочной (Аводн. фракция) фракциях, измеряли удельную радиоактивность. Эффективность связывания рассчитывалась по формуле: эффективность (E, %) = [(Аосад.фракция) - (Аводн. фракция)/ [(Аосад.фракция) + (Аводн. фракция)] * 100%.When measuring the binding efficiency, the labeled aptamer: protein molar ratio was 1: 10. After hybridization, the mixture was centrifuged for 20 min at 16,000 g and half the volume of the aqueous phase was separated. Specific radioactivity was measured in the obtained sedimentary (Aosad. Fraction) and supernatant (Avodn. Fraction) fractions. The binding efficiency was calculated by the formula: efficiency (E,%) = [(Aosad fraction) / [(Aosad fraction) + [(Aosad fraction) + (Aqueous fraction)] * 100%.
Клонирование и секвенирование двухцепочечных копий ДНК аптамеров Двуцепочечные ДНК копии аптамеров, отобранных в ходе SELEX, клонировали в вектор pUC19 (Рhаrmасiа, США). Для этого ДНК обрабатывали T4-пoлинyклeoтид киназой и лигировали в обработанный рестрикционной эндонуклеазой Sтаl вектор. Секвенирование рекомбинантных ДНК проводили по методу Сэнгера с использованием стандартных рUС-праймеров.Cloning and sequencing of double-stranded copies of aptamer DNA Double-stranded DNA copies of aptamers selected by SELEX were cloned into pUC19 vector (Pharmacia, USA). For this, the DNA was treated with a T4 polynucleotide kinase and ligated into a Stal restriction endonuclease treated vector. Recombinant DNA sequencing was performed according to the Sanger method using standard pUC primers.
Определение константы диссоциации комплекса аптамер-мишень Стандартный раствор биотинилированного олигонуклеотида (0.08 мкМ) инкубировали с различными концентрациями фибриллярного Sup35NM (от 2.4 мкМ до 18.75 нМ при последовательном двукратном разведении) при перемешивании (300 об/мин) при комнатной температуре в течение часа. Затем смесь центрифугировали в течение 2 мин при 16000 g и определяли количество олигонуклеотида, оставшегося в растворе. Для этого в планшеты вносили анализируемый препарат и инкубировали в течение ночи при 4°C. Здесь и далее несвязанный белок отмывали буфером А. Блокировали неспецифическое связывание 3%-ным бычьим сывороточным альбумином в буфере А 1 ч при 37°C. После отмывки наносили коньюгат пероксидазы хрена со стрептавидином (ИМТЕК) и инкубировали дополнительно 1 ч. После пятикратнойDetermination of the dissociation constant of the aptamer-target complex A standard solution of biotinylated oligonucleotide (0.08 μM) was incubated with various concentrations of fibrillar Sup35NM (from 2.4 μM to 18.75 nm with sequential double dilution) with stirring (300 rpm) at room temperature for one hour. The mixture was then centrifuged for 2 min at 16,000 g and the amount of oligonucleotide remaining in the solution was determined. To do this, the analyzed preparation was added to the tablets and incubated overnight at 4 ° C. Hereinafter, unbound protein was washed with buffer A. Non-specific binding was blocked with 3% bovine serum albumin in buffer A for 1 h at 37 ° C. After washing, horseradish peroxidase conjugate with streptavidin (IMTEC) was applied and incubated for an additional 1 h. After five
20 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) отмывки цветную реакцию проявляли как описано ранее. В качестве калибровки использовали стандартные (O5Ol мкМ - 0,1 мкМ) растворы анализируемого аптамера.20 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Washes showed a color reaction as previously described. Standard (O 5 Ol μM - 0.1 μM) solutions of the analyzed aptamer were used as calibration.
Для обработки экспериментальных данных использовали компьютерную программу ENZFITTER (vеrsiоп 1.05 (CGA)). При этом делали допущение о том, что каждая молекула в составе полимера имеет один сайт связывания с аптамером. В результате анализа были определены константы диссоциации (Kd) комплексов аптамер-фибриллярный Sup35NM (Таблица 1).To process the experimental data, the computer program ENZFITTER (version 1.05 (CGA)) was used. The assumption was made that each molecule in the polymer has one binding site with an aptamer. As a result of the analysis, the dissociation constants (Kd) of the aptamer-fibrillar Sup35NM complexes were determined (Table 1).
Таблица 1.Table 1.
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000023_0001
Пример 4. Изучение связывания биотинилированных аптамеров с прионом BSE коров (BoPrP).Example 4. The study of the binding of biotinylated aptamers to prion BSE cows (BoPrP).
Эффективность связывания аптамеров с прионом губкообразной энцефалопатии (BSE) коров изучали методом иммуноферментного анализа в сэндвич варианте, заменяя вторичные антитела биотинилированными аптамерами, связанными с конъюгатом стрептовидин — пероксидаза хрена. В качестве твёрдой фазы полистироловые стрипы диагностического набора фирмы «BioRad» (кат. N° 3551145), лунки которых покрыты первичными моноклональными антителами к синтетическому полипептиду прионного белка. Такой подход к решению проблемы позволяет свести до минимума влияние на результаты анализа примесей, загрязняющих препарат используемого в опытах прионного белка, а так же оценить результаты опыта экспериментально. В качестве отрицательного контроля использовали биотинилированный олигонуклеотид S70 (SEQ ID NO: 8), содержащий центральную 40-звeннyю область случайного состава.The effectiveness of the binding of aptamers to prion spongiform encephalopathy (BSE) of cows was studied by enzyme-linked immunosorbent assay in the sandwich version, replacing secondary antibodies with biotinylated aptamers associated with the streptovidin-horseradish peroxidase conjugate. As a solid phase, polystyrene strips of the BioRad diagnostic kit (cat. N ° 3551145), the wells of which are coated with primary monoclonal antibodies to the synthetic prion polypeptide. Such an approach to solving the problem allows minimizing the effect on the results of the analysis of impurities polluting the preparation of prion protein used in the experiments, as well as evaluating the experimental results experimentally. As a negative control, a biotinylated S70 oligonucleotide (SEQ ID NO: 8) containing a central 40-unit region of random composition was used.
Протокол приготовления меченых конъюгатом стрептовидин-пероксидаза аптамеров следующий. Готовили 5 мМ фосфатный буфер, содержащий 150 мМ NaCl (рН б), вThe protocol for preparing labeled streptovidin peroxidase aptamers is as follows. A 5 mM phosphate buffer containing 150 mM NaCl (pH b) was prepared in
2121
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) который вносили 200 мМ мочевины (Буфер Б). В аликвоту Буфера Б вносили 4мM MgCl2, получая Буфер В. Каждый исследуемый аптамер в количестве 3,52 пМ растворяли в буфере Б так, чтобы получить конечный объём 400мкл (в пробирках Еррепdоrf 1,5мл). Пробирки плотно закрывали, материал подвергали денатурации в кипящей водяной бане в течение 5 минут, пробы ренатурировали при 250C, объём каждой пробы доводили буфером В до 800мкл, в каждую пробирку вносили 0,4 мкл конъюгата стрептовидин- пероксидазы хрена. Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре в мечении 30 минут при постоянном перемешивание в роллере (1 oб/5 мин.). Пробы хранили до использования в течение 60-80 минут при комнатной температуре.SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) which contributed 200 mm urea (Buffer B). An aliquot of Buffer B was added with 4 mM MgCl 2 to obtain Buffer B. Each test aptamer in the amount of 3.52 pM was dissolved in buffer B so as to obtain a final volume of 400 μl (in Errepdorf 1.5 ml tubes). The tubes were tightly closed, the material was denatured in a boiling water bath for 5 minutes, the samples were renatured at 25 ° C, the volume of each sample was adjusted with buffer B to 800 μl, 0.4 μl of horseradish streptovidin peroxidase conjugate was added to each tube. The resulting mixture was incubated at room temperature for 30 minutes with constant stirring in a roller (1 r / 5 min.). Samples were stored for 60–80 minutes at room temperature until use.
Протокол проведения иммуноферментной реакции для сравнительного анализа эффективности связывания аптамеров с прионом губкообразной энцефалопатии коров следующий. Стрипы с иммобилизованными антителами к PrP, промывающий буфер, отрицательный и положительный контроли были взяты из диагностического набора фирмы «BioRad» (кат. Na 3551145) и подготовлены к работе в соответствии с прилагаемой инструкцией производителя. В лунки вносили по 100 мкл проб по следующей схеме: лунки А и В - отрицательный контроль; лунки С и D - положительный контроль; лунки E и F - прион губкообразной энцефалопатии (подготовленная проба мозга больной BSE коровы); лунки I и F - гомогенат головного мозга здоровой коровы, подготовленные к исследованию по протоколу фирмы «BioRad». Пробы инкубировали при 37°C; пятикратно промывали лунки стрипов промывным буфером; вносили в лунки стрипов по ЮОмкл комплекса аптамер-конъюгат стрептовидин-пероксидаза хрена, используя один стрип для каждого аптамера; инкубировали 90 минут при комнатной температуре; пятикратно промывали лунки стрипов промывным буфером; вносили в каждую лунку раствор тетраметиленбензидина в смеси с цитратным буфером и перекисью водорода; инкубировали в темноте при комнатной температуре 30 минут; и вносили в каждую лунку ЮОмкл IN серной кислоты, чтобы остановить реакцию. Затем измерялиThe protocol for conducting an enzyme immunoassay for a comparative analysis of the effectiveness of the binding of aptamers to prion of spongiform encephalopathy of cows is as follows. Strips with immobilized antibodies to PrP, washing buffer, negative and positive controls were taken from the BioRad diagnostic kit (cat. Na 3551145) and prepared for use in accordance with the manufacturer's instructions. 100 μl of samples were added to the wells according to the following scheme: wells A and B — negative control; wells C and D — positive control; wells E and F - prion of spongiform encephalopathy (prepared brain sample from a patient with BSE cow); wells I and F - homogenate of the brain of a healthy cow, prepared for research according to the protocol of the company "BioRad". Samples were incubated at 37 ° C; washed the strip wells five times with wash buffer; introduced into the wells of strips according to the South Omcl of the aptamer-conjugate streptovidin-horseradish peroxidase complex using one strip for each aptamer; incubated for 90 minutes at room temperature; washed the strip wells five times with wash buffer; a solution of tetramethylenebenzidine in a mixture with citrate buffer and hydrogen peroxide was added to each well; incubated in the dark at room temperature for 30 minutes; and added Sulfuric acid IN to each well to stop the reaction. Then measured
2222
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) оптическую плотность растворов в лунках на планшетном фотометре, используя светофильтр 450 нм. Результаты опытов представлены в табл. Na 2.SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) the optical density of the solutions in the wells on a tablet photometer using a 450 nm filter. The results of the experiments are presented in table. Na 2.
Таблица 2. Результаты взаимодействия ДНК-аптамеров с прионом BSE коров (BoPrP)*.Table 2. The results of the interaction of DNA aptamers with prion BSE of cows (BoPrP) *.
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000025_0001
* - Показатель поглощения при 450 нм за минусом фона .* - Absorption rate at 450 nm minus the background.
** - Соотношение показателя поглощения положительной на BSE пробы мозга и показателя поглощения пробы мозга здоровой коровы.** - The ratio of the absorption rate of a brain-positive BSE sample to the absorption rate of a healthy cow's brain sample.
Анализ результатов, представленных в таблице 2, показывает, что все 4 аптамера дали более высокие показатели связывания с материалом, содержащим прион, по сравнению с материалом, не содержащим его, т.е. проявили специфическое связывание. Оптическая плотность образцов, содержащих пробу мозга от здорового животного, превышает плотность образцов, содержащего отрицательный контроль у аптамеров. В то же время, оптическая плотность, показанная этими аптамерами с прионом, превышает плотность аптамеров с пробами от здорового животного. Наиболее перспективным следует считать аптамер S4 (SEQ ID NO: 4).An analysis of the results presented in table 2 shows that all 4 aptamers gave higher rates of binding to the material containing prion, in comparison with the material not containing it, i.e. showed specific binding. The optical density of samples containing a brain sample from a healthy animal exceeds the density of samples containing a negative control in aptamers. At the same time, the optical density shown by these prion aptamers exceeds the density of aptamers with samples from a healthy animal. The most promising should be considered aptamer S4 (SEQ ID NO: 4).
Для проверки этого предварительного вывода проводили опыт, в котором проверили возможность выявления приона в гомогенатах мозга больного и здорового животных, приготовленных для анализа согласно протоколу фирмы «BioRad». На одном стрипе реакцию ставили по методике этой фирмы, на другом — вместо вторых антител использовали биотинилированный аптамер S4 (SEQ ID NO: 4), связанный с конъюгатом стрептовидин-пероксидаза, как описано выше. Результаты представлены в таблице 3.To verify this preliminary conclusion, an experiment was carried out in which the possibility of detecting prion in the brain homogenates of the sick and healthy animals was tested, prepared for analysis according to the protocol of the BioRad company. On one strip, the reaction was set according to the method of this company, on the other, instead of the second antibodies, biotinylated aptamer S4 (SEQ ID NO: 4) was used, coupled with streptovidin peroxidase conjugate, as described above. The results are presented in table 3.
23 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Таблица 3. Результаты проверки возможности выявления приона в гомогенате мозга больного животного.23 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Table 3. Results of testing the possibility of detecting prion in the brain homogenate of a sick animal.
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000026_0001
Из данных таблицы 3 видно, что аптамер S4 активно связывается с белком PrP из гомогенатов мозга коров с губкообразной энцефалопатией, чётко различает положительный и отрицательный контроль, а так же гомогенат, не содержащий PrP в прионной форме, хотя по сравнению со вторым моноклональным антителом даёт более высокий фон реакции.From the data in Table 3, it can be seen that S4 aptamer actively binds to PrP protein from bovine brain homogenates with spongiform encephalopathy, clearly distinguishes between positive and negative controls, and a homogenate that does not contain PrP in prion form, although it gives more than the second monoclonal antibody high reaction background.
Пример 5. Изучение связывания биотинилированных аптамеров с белками, содержащими полиглутаминовые повторы.Example 5. The study of the binding of biotinylated aptamers to proteins containing polyglutamine repeats.
Получение лизатов клеток E, соli.Obtaining cell lysates of E, col.
Клетки отделяли от среды центрифугированием, промывали буфером TBS, ресуспендировали их в том же буфере с добавлением ингибиторов протеаз Соmрlеtе (Rосhе), PMSF (2mM), EDTA (5mM) в половине объема клеточного осадка и добавляли к ним равное по объему количество стеклянных бус. Клетки разбивали на гомогенизаторе Vоrtех в течение 5 минут с охлаждением во льду через каждую минуту в течение 30 секунд. Затем растворимую фракцию отделяли центрифугированием при 10 тыс. оборотов в минуту в течение 15 минут (при 40°C).Cells were separated from the medium by centrifugation, washed with TBS buffer, resuspended in the same buffer with the addition of protease inhibitors Complete (Roche), PMSF (2mM), EDTA (5mM) in half the volume of the cell pellet and an equal amount of glass beads was added to them. Cells were broken up on a Vortex homogenizer for 5 minutes with cooling in ice every minute for 30 seconds. Then the soluble fraction was separated by centrifugation at 10 thousand rpm for 15 minutes (at 40 ° C).
Выделение белка Sup35 в прионном или амилоидном состоянии из клеток дрожжей.Isolation of Sup35 protein in prion or amyloid state from yeast cells.
2424
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Метод выделения амилоидов и прионов описан в работе (Кushпirоv V.V., Аlехапdrоv I.M., Мitkеviсh O.V., Shkιmdiпа I.S., Теr-Аvапеsуап М.D. 2006. Рurifiсаtiоп апd апаlуsis оf рriоп апd аmуlоid аggrеgаtеs. Меthоds. 39, 50 — 55).SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The method for the isolation of amyloids and prions is described in (Kushpirov VV, Alekhapdrov IM, Mitkavis OV, Shkimdipa IS, Ter-Avapesuap M.D. 2006. Rurifiсtiop apd apulusis оfpriop apd amuloid idgresp.
Дрожжевую культуру выращивали в 2-х литровых колбах до ранней стационарной фазы, что составляет примерно 3 ед. OD6oo для синтетической среды и около 6 D60O для полной YPD (Sherman,F., Fink,G.R., апd НiскsД.В. (1986). Меthоds iп Yеаst Gепеtiсs. CoId Sрriпg Наrbоr LаЪоrаtоrу, CoId Sрriпg Наrbоr Рrеss). Клетки собирали центрифугированием, ресуспендировали в 50 мл дистиллированной воды и снова осаждали в 50мл пробирках - Фальконах. Таким образом получали 3-5 мл клеточного осадка. После чего клетки подвергали дальнейшей обработке или хранили при -750C до нескольких месяцев. Клетки лизировали стеклянными бусами (бусы брали в равном объеме к клеточной массе) в половине объема трис-солевого буфера TBS (30 mМ Тris-НСl рН 7.4, 150 mМ NaCl) в присутствии 10 мМ раствора фенилметилсульфонил флюорида (PMSF). Клетки разбивали в течение 4 минут с охлаждением во льду через каждые 30 секунд на Вортексе (Vоrtех). После разрушения, клеточный дербис отделяли центрифугированием при 50000 оборотах в минуту в течение 10 минут. Растворимую фракцию наслаивали на 1.5 мл 20% сахарозы в 12 мл поликарбонатных центрифужных пробирках и центрифугировали в течение 2-х часов при 50000 оборотах в минуту, 5°C. Супернатант удаляли, а осадок вместе с 100-200мкл гелеобразного материала ресуспендировали в 1 мл TBS с 5 мМ PMSF. К суспензии добавляли РНКазу А до О.lмг/мл и инкубировали 15 минут при комнатной температуре. Затем добавляли саркозил до 3%, тщательно перемешивали и центрифугировали на микроцентрифуге в течение 10 мин при 12000 об/мин, 5°C. Супернатант наслаивали на lмл 20% сахарозы, содержащейYeast culture was grown in 2 liter flasks until the early stationary phase, which is about 3 units. OD 6 oo for a synthetic medium and about 6 D 60 O for a complete YPD (Sherman, F., Fink, GR, Add Hisks D.V. (1986). Methods Yеp Heptes. CoId Srpg Narbor Laroratoru, CoId Srrrrrrrrrr. Cells were harvested by centrifugation, resuspended in 50 ml of distilled water, and again pelleted in 50 ml Falcon tubes. Thus, 3-5 ml of cell pellet was obtained. Then the cells were further processed or stored at -75 ° C for several months. Cells were lysed with glass beads (beads were taken in an equal volume to the cell mass) in half the volume of TBS Tris-Salt buffer (30 mM Tris-Hcl pH 7.4, 150 mM NaCl) in the presence of a 10 mM solution of phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF). Cells were broken for 4 minutes with cooling in ice every 30 seconds at Vortex (Vorteh). After destruction, the cell derbis was separated by centrifugation at 50,000 rpm for 10 minutes. The soluble fraction was layered on 1.5 ml of 20% sucrose in 12 ml polycarbonate centrifuge tubes and centrifuged for 2 hours at 50,000 rpm, 5 ° C. The supernatant was removed and the pellet, together with 100-200 μl of gel-like material, was resuspended in 1 ml of TBS with 5 mM PMSF. RNase A was added to the suspension to O.lmg / ml and incubated for 15 minutes at room temperature. Then sarcosyl was added to 3%, mixed thoroughly and centrifuged in a microcentrifuge for 10 min at 12000 rpm, 5 ° C. The supernatant was layered on lml 20% sucrose containing
0.2% саркозила и центрифугировали в течение 8 часов при 50000 об/мин, при 5°C. Далее, когда основное количество протеаз отделено от целевого белка, использовали SDS.0.2% sarcosyl and centrifuged for 8 hours at 50,000 rpm, at 5 ° C. Further, when the bulk of the proteases were separated from the target protein, SDS was used.
Осадок суспендировали в 1 мл TBS буфера с 2% SDS и 5 мМ PMSF.The pellet was suspended in 1 ml of TBS buffer with 2% SDS and 5 mM PMSF.
2525
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Полученную суспензию наносили на 0.5 мл 20% сахарозы, содержащей 0.1% SDS и 5°C иSUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The resulting suspension was applied to 0.5 ml of 20% sucrose containing 0.1% SDS and 5 ° C and
центрифугировали в течение 8 часов при 40000 об/мин при 16°C.Ocaдoк хранили при -centrifuged for 8 hours at 40,000 rpm at 16 ° C. The pellet was stored at -
75°C.75 ° C.
Использование ДНК-аптамера S4для детекции амилоидной формы белков Sup35NM и Q70.Use of S4 DNA aptamer to detect the amyloid form of Sup35NM and Q70 proteins.
Выделенный из клеток E. соli мономер белка разводили в 33 раза (30 мкл на 1 мл) 5мM фосфатным буфером с 150мM NaCl и 0,01% азида натрия. Далее, инкубировали при 80C с перемешиванием в течение 60-70 часов.Protein monomer isolated from E. coli cells was diluted 33 times (30 μl per 1 ml) with 5 mM phosphate buffer with 150 mM NaCl and 0.01% sodium azide. Next, they were incubated at 8 0 C with stirring for 60-70 hours.
На полоски нитроцеллюлозной мембраны наносили по 5 мкл лизатов клеток дрожжей или очищенных препаратов, содержащих анализируемые белки в мономерном или амилоидном состоянии. Каждый образец раствора белка наносили в трех разведениях (с шагом в 5 раз) в одном вертикальном ряду.5 μl of yeast cell lysates or purified preparations containing the analyzed proteins in the monomeric or amyloid state were applied to the strips of the nitrocellulose membrane. Each sample of the protein solution was applied in three dilutions (in increments of 5 times) in one vertical row.
Мембрану инкубировали в течение часа в растворе казеина (4мг/мл) в трис-солевом буфере (TBS), рН 7.4, затем мембраны окрашивали красителем Понсо (неспецифичнское окрашивание белков) для определения количества нанесенного белка. После этого мембрану отмывали от красителя Понсо водой и погружали в раствор биотинилированного ДНК-аптамера S5 и стрептавидин-пероксидазы в фосфатносолевом буфере (PBS), рНб.О с 0,05мM Mg2+ , содержащем 200мM мочевины и 0.4% казеина. После часовой инкубации при комнатной температуре, мембрану отмывали 3 раза по 20 минут буфером TBS с твином (0,1%) и 2 раза по 20 минут буфером TBS без TWEEN, приливали к мембране хемолюминесцентный субстрат и реакцию фиксировали на рентгеновской пленке. Результаты представлены в Приложении 1.The membrane was incubated for one hour in a casein solution (4 mg / ml) in Tris-Salt Buffer (TBS), pH 7.4, then the membranes were stained with Ponso dye (non-specific protein staining) to determine the amount of protein deposited. After that, the membrane was washed from Ponceau dye with water and immersed in a solution of biotinylated DNA aptamer S5 and streptavidin peroxidase in phosphate-buffered saline (PBS), pHb.O with 0.05 mM Mg 2+ containing 200 mM urea and 0.4% casein. After one hour incubation at room temperature, the membrane was washed 3 times with 20 minutes with TBS buffer with tween (0.1%) and 2 times with 20 minutes with TBS buffer without TWEEN, a chemoluminescent substrate was poured onto the membrane and the reaction was fixed on an X-ray film. The results are presented in Appendix 1.
Из представленных данных видно, что аптамер S4 (SEQ ID NO: 4) специфически связывается с дрожжевым белком Sup35NM в прионной и амилоидной форме, и с искусственным полиглутаминовым белком Q70 (SEQ ID NO: 11) — аналогом белка гентингтона (Нtt).From the presented data, it can be seen that the aptamer S4 (SEQ ID NO: 4) specifically binds to the Sup35NM yeast protein in prion and amyloid form, and to the artificial polyglutamine protein Q70 (SEQ ID NO: 11), an analogue of the Huntington protein (Нtt).
2626
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Although the invention has been described in detail with reference to the best mode of carrying out the invention, it will be apparent to those skilled in the art that various changes can be made and equivalent replacements made, and such changes and replacements are not outside the scope of the present invention.
Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.Each of the above documents has a link, and all cited documents are part of the description of the present invention.
27 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 27 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

Claims

Формула изобретения Claim
1. Олигонуклеотид для детекции белков в амилоидном состоянии, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO: 1-4.1. Oligonucleotide for the detection of proteins in the amyloid state, containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of the sequences shown in the List of sequences under the numbers SEQ ID NO: 1-4.
2. Олигонуклеотид по п. 1, отличающийся тем, что белками в амилоидном состоянии являются прионогенные белки дрожжей и млекопитающих.2. The oligonucleotide according to claim 1, characterized in that the proteins in the amyloid state are prionogenic proteins of yeast and mammals.
3. Конъюгат олигонуклеотида по п. 1 с молекулой, позволяющей детектировать связывание олигонуклеотида с прионами дрожжей и млекопитающих.3. The conjugate of the oligonucleotide according to claim 1 with a molecule that can detect the binding of the oligonucleotide with prions of yeast and mammals.
4. Конъюгат олигонуклеотида по п. 3, отличающийся тем, что в качестве указанной молекулы используют флуоресцирующий реагент или фермент, выбранный из группы, состоящей из пероскидаз и люцифераз.4. The oligonucleotide conjugate according to claim 3, characterized in that a fluorescent reagent or an enzyme selected from the group consisting of peroskidases and luciferases is used as the indicated molecule.
5. Конъюгат олигонуклеотида по п. 3, отличающийся тем, что используют конъюгат олигонуклеотида с биотином, а в качестве молекулы, позволяющей детектировать связывание олигонуклеотида с прионами дрожлсей и млекопитающих, используют фермент, выбранный из группы, состоящей из пероскидаз и люцифераз, слитой со стрептовидином или авидином.5. The oligonucleotide conjugate according to claim 3, characterized in that the oligonucleotide conjugate with biotin is used, and an enzyme selected from the group consisting of peroskidases and luciferases fused with streptidine is used as a molecule to detect the binding of the oligonucleotide to prions of yeast and mammals. or avidin.
6. Способ детекции белков в амилоидном состоянии, включающий стадии получения образца культуры дрожжей или ткани млекопитающего, и изучения связывания олигонуклеотидов по п. 1 или конъюгата олигонуклеотида по п. 3 с указанным образцом.6. A method for detecting proteins in an amyloid state, comprising the steps of obtaining a yeast or mammalian tissue culture sample, and studying the binding of the oligonucleotides of claim 1 or the oligonucleotide conjugate of claim 3 to said sample.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что белками в амилоидном состоянии являются прионогенные белки дрожжей и млекопитающих.7. The method according to p. 6, characterized in that the proteins in the amyloid state are prionogenic proteins of yeast and mammals.
8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что детектируют амилоид или прион дрожжей Sup35.8. The method according to p. 6, characterized in that the amyloid or prion of the Sup35 yeast is detected.
9. Способ по п. 6, отличающийся тем, что детектируют прион коров PrP.9. The method according to p. 6, characterized in that the prion of cows PrP is detected.
28 ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 28 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
10. Способ по п. 6, отличающийся тем, что детектируют амилоид, образованный полиглутаминовыми белками, в частности гентингтином.10. The method according to p. 6, characterized in that they detect the amyloid formed by polyglutamine proteins, in particular huntingtin.
11. Способ по п. 6, отличающийся тем, что связывание олигонуклеотидов по п. 1 с указанным образцом определяют методом гибридизации или методом ПЦР, в частности ПЦР в реальном времени.11. The method according to p. 6, characterized in that the binding of the oligonucleotides according to p. 1 with the specified sample is determined by hybridization or PCR, in particular real-time PCR.
12. Способ по п. 6, отличающийся тем, что связывание конъюгата олигонуклеотида по п. 2 с указанным образцом определяют методом флуориметрии.12. The method according to p. 6, characterized in that the binding of the conjugate of the oligonucleotide according to p. 2 with the specified sample is determined by fluorimetry.
13. Способ по п. 6, отличающийся тем, что связывание конъюгата олигонуклеотида по п. 4 или 5 с указанным образцом определяют путём измерения активности фермента. 13. The method according to p. 6, characterized in that the binding of the conjugate of the oligonucleotide according to p. 4 or 5 with the specified sample is determined by measuring the activity of the enzyme.
PCT/RU2009/000435 2009-06-25 2009-08-28 Oligonucleotide and a conjugate thereof for detecting proteins in an amyloid state and a method for detecting proteins in an amyloid state WO2010151169A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2009124227 2009-06-25
RU2009124227/10A RU2009124227A (en) 2009-06-25 2009-06-25 OLIGONUCLEOTID AND ITS CONJUGATE FOR DETECTION OF PROTEINS IN AMYLOID STATE AND METHOD FOR DETECTION OF PROTEINS IN AMYLOID CONDITION

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010151169A1 true WO2010151169A1 (en) 2010-12-29

Family

ID=43386745

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2009/000435 WO2010151169A1 (en) 2009-06-25 2009-08-28 Oligonucleotide and a conjugate thereof for detecting proteins in an amyloid state and a method for detecting proteins in an amyloid state

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2009124227A (en)
WO (1) WO2010151169A1 (en)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003001211A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-03 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for testing the presence of prion proteins in tissue and culture samples
WO2007044851A2 (en) * 2005-10-06 2007-04-19 University Of Delaware G-rich polynucleotides for the treatment of huntington's disease
WO2008033451A2 (en) * 2006-09-13 2008-03-20 Whitehead Institute For Biomedical Research Protein aggregation domains from prions and methods of use thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003001211A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-03 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for testing the presence of prion proteins in tissue and culture samples
WO2007044851A2 (en) * 2005-10-06 2007-04-19 University Of Delaware G-rich polynucleotides for the treatment of huntington's disease
WO2008033451A2 (en) * 2006-09-13 2008-03-20 Whitehead Institute For Biomedical Research Protein aggregation domains from prions and methods of use thereof

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KLUG ET AL.: "All you wanted to know about SELEX", MOLECULAR BIOLOGY REPORTS, vol. 20, 1994, pages 97 - 107, XP000617781, doi:10.1007/BF00996358 *
MOK WENDY ET AL.: "Recent Progress in Nucleic Acid Aptamer-Based Biosensors and Bioassays", SENSORS, vol. 8, 2008, pages 7050 - 7084 *
MURAKAMI KAZUYOSHI ET AL.: "Anti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant bovine prion and its beta isoform with high affinity", PRION, vol. 2, no. 2, 2008, pages 73 - 80, XP055133658 *
PROSKE DANIELA ET AL.: "Prion-Protein-Specific Aptamer Reduces PrPSc Formation", CHEMBIOCHEM, vol. 3, 2002, pages 717 - 725, XP002401585, doi:10.1002/1439-7633(20020802)3:8<717::AID-CBIC717>3.0.CO;2-C *
TAKEMURA KAORI ET AL.: "DNA Aptamers That Bind to PrP0 and Not PrPSc Show Sequence and Structure Specificity", EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE, vol. 231, no. 2, 2006, pages 204 - 214 *
YOSHIDA WATARU ET AL.: "Aptameric Enzyme Subunit for Biosensing Based on Enzymatic Activity Measurement", ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 78, no. 10, 2008, Retrieved from the Internet <URL:http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac060254o> *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2009124227A (en) 2010-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5152977B2 (en) Yeast screening for drugs that affect protein folding
Eystathioy et al. A phosphorylated cytoplasmic autoantigen, GW182, associates with a unique population of human mRNAs within novel cytoplasmic speckles
Glover et al. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae
JP2003501050A (en) Nucleic acid molecule specifically recognizing native PrPSC, production and use
US6451541B1 (en) Chaperones capable of binding to prion proteins and distinguishing the isoforms PrPc and PrPsc
Bibby et al. Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins
US20150291991A1 (en) Methods and compositions relating to amyloidogenic polypeptides
US20050266401A1 (en) Compositions and methods for binding agglomeration proteins
AU2018316551A1 (en) Enhanced RNA interactome capture (eRIC)
Fernández-Borges et al. PMCA. A decade of in vitro prion replication
WO2010151169A1 (en) Oligonucleotide and a conjugate thereof for detecting proteins in an amyloid state and a method for detecting proteins in an amyloid state
CN108137660B (en) Aptamers for purification and quantification of gelsolin and variants thereof
Choe et al. Increased [PSI+] appearance by fusion of Rnq1 with the prion domain of Sup35 in Saccharomyces cerevisiae
RU2509155C1 (en) Detection method of proteins in amyloid state, and set for detection of proteins in amyloid state
US20080248958A1 (en) System for pulling out regulatory elements in vitro
US20050261486A1 (en) Compositions and methods for binding agglomeration proteins
JP2017530726A (en) Antibody-like protein
JP2001501802A (en) Huntingtin binding protein
JP5191028B2 (en) RNA aptamer that binds to fibrils derived from abnormal prion protein
RU2558295C1 (en) RECOMBINANT PLASMID DNA pGST/ART/X, CODING FUSED CHIMERIC POLYPEPTIDE GST/ART/X FOR HIGH SPECIFIC SELECTION OF APTAMERS TO TARGET PROTEIN X IN POLYPEPTIDE COMPOSITION
US20060257904A1 (en) Agglomeration protein cascades, compositions and methods regarding the same
WO2010107405A1 (en) Method for producing peptides which specifically recognize cells of particular types and can be used for therapeutic purposes
Kenny Molecular requirements for FMRP and RNA helicase MOV10 in the translational regulation of co-bound mRNAs
JP2004520080A (en) Compositions and methods for binding to coagulated proteins
Michalík Charakterizace enzymů modifikujících RNA

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09846598

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 09846598

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1