RU2509155C1 - Detection method of proteins in amyloid state, and set for detection of proteins in amyloid state - Google Patents
Detection method of proteins in amyloid state, and set for detection of proteins in amyloid state Download PDFInfo
- Publication number
- RU2509155C1 RU2509155C1 RU2012145337/10A RU2012145337A RU2509155C1 RU 2509155 C1 RU2509155 C1 RU 2509155C1 RU 2012145337/10 A RU2012145337/10 A RU 2012145337/10A RU 2012145337 A RU2012145337 A RU 2012145337A RU 2509155 C1 RU2509155 C1 RU 2509155C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- proteins
- amyloid
- cellulose acetate
- protein
- acetate membrane
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к молекулярной биологии и медицинской диагностике, в частности к способу диагностики амилоидозов, основанном на детекции амилоидов, в том числе их инфекционных вариантов - прионов, в биологических жидкостях животных и человека.The present invention relates to molecular biology and medical diagnostics, in particular to a method for the diagnosis of amyloidosis, based on the detection of amyloids, including their infectious variants - prions, in biological fluids of animals and humans.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Амилоиды - это нерастворимые белковые агрегаты, имеющие фибриллярную структуру, и устойчивые к действию протеаз. Амилоидные фибриллы представляют собой линейные полимеры, состоящие из нековалентно связанных между собой молекул белка. Эти полимеры образуются за счет присоединения белковых мономеров к их концам; при этом процесс роста сопровождается обогащением присоединяемых мономеров β-слоями, которые располагаются перпендикулярно оси полимеров, связанной с конформационной перестройкой с формированием специфичной "кросс-β" структуры. Для амилоидов характерно взаимодействие с некоторыми красителями, прежде всего, с конго красным и тиофлавином Т (Chiti F., Dobson C.M. 2006. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366).Amyloids are insoluble protein aggregates that have a fibrillar structure and are resistant to proteases. Amyloid fibrils are linear polymers consisting of non-covalently linked protein molecules. These polymers are formed by the attachment of protein monomers to their ends; in this case, the growth process is accompanied by the enrichment of the attached monomers with β-layers, which are perpendicular to the axis of the polymers, associated with conformational rearrangement with the formation of a specific "cross-β" structure. Amyloids are characterized by interactions with certain dyes, primarily Congo red and thioflavin T (Chiti F., Dobson C. M. 2006. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366).
Классификация амилоидозов сложна и неоднозначна: выделяют системные амилоидозы (поражаются многие органы) и орган-специфичные амилоидозы, первичные амилоидозы (накопление амилоидов приводит к заболеванию) и вторичные (накопление амилоидов обусловлено каким-то другим заболеванием). Наконец, амилоидозы разделяют на неинфекционные и инфекционные (прионные) (Sipe J.D., Cohen A.S. 2000. History of the amyloid fibril. J. Struct. Biol. 130, 88-98).The classification of amyloidoses is complex and ambiguous: systemic amyloidoses (many organs are affected) and organ-specific amyloidoses, primary amyloidoses (amyloid accumulation leads to a disease) and secondary (amyloid accumulation are caused by some other disease) are distinguished. Finally, amyloidoses are divided into non-infectious and infectious (prionic) (Sipe J.D., Cohen A.S. 2000. History of the amyloid fibril. J. Struct. Biol. 130, 88-98).
Интерес к химической и физической природе амилоидов обусловлен, в первую очередь, их связью с обширной группой заболеваний человека и животных. Эти заболевания объединяют под общим названием амилоидозы. Некоторые из этих заболеваний, обусловленные особой разновидностью амилоидов, называемых прионами, трансмиссивны. Прионные амилоиды описаны не только у млекопитающих, но и у низших эукариот, у которых они выступают в роли нехромосомно наследуемых детерминант.The interest in the chemical and physical nature of amyloids is due, first of all, to their connection with an extensive group of diseases in humans and animals. These diseases are combined under the general name amyloidosis. Some of these diseases, caused by a special variety of amyloids called prions, are vector-borne. Prionic amyloids are described not only in mammals, but also in lower eukaryotes, in which they act as nonchromosomally inherited determinants.
Инфекционный прионный белок животных, названный PrPSc, представляет собой особую конформационно-измененную изоформу клеточного белка PrPC, отличающуюся от него по своей пространственной структуре. Инфекционная форма белка PrPSc, попадая в организм извне или спонтанно в нем возникая, способна стимулировать превращение нормальной формы PrPC в патогенную аномальную форму PrPSc посредством белок-белковых взаимодействий. Таким образом обеспечивается автокаталитическое поддержание прионной изоформы белка (Prusmer, S.B., Scott, M.R., DeArmond,S.J., Cohen,F.E. (1998) Prion protein biology. Cell, 93, 337-348). К числу наиболее известных заболеваний животных этого типа относят так называемое «коровье бешенство».Infectious prion protein of animals, called PrP Sc , is a special conformationally modified isoform of the cellular protein PrP C , which differs from it in its spatial structure. The infectious form of PrP Sc protein, entering the body from the outside or spontaneously arising in it, can stimulate the conversion of the normal form of PrP C to the pathogenic abnormal form of PrP Sc through protein-protein interactions. In this way, autocatalytic maintenance of the prion protein isoform is provided (Prusmer, SB, Scott, MR, DeArmond, SJ, Cohen, FE (1998) Prion protein biology. Cell, 93, 337-348). Among the most famous diseases of animals of this type include the so-called "mad cow disease".
К числу наиболее известных заболеваний человека, связанных с образованием амилоидов, относят амилоидозы центральной нервной системы (болезни Крейтцфельдта-Якоба, Альцгеймера, Паркинсона, Гентингтона), а также сахарный диабет типа 2 и некоторые формы спиноцеребральной атаксии и катаракты (Галкин А.П., Миронова Л.Н., Журавлева Г.А., Инге-Вечтомов С.Г. Генетика (2006) 42, №11, 1558-1570).Among the most famous human diseases associated with the formation of amyloids include amyloidosis of the central nervous system (Creutzfeldt-Jakob disease, Alzheimer's, Parkinson's, Huntington's disease), as well as
Доступные в настоящее время методы диагностики прионных заболеваний основаны на исследовании инфекционности образцов тканей заболевшей особи или на иммунодетекции патогенной формы белка PrP. Первый метод потенциально может быть весьма чувствительным, однако его недостатком является длительное время, проходящее между инокуляцией инфекционного материала подопытному животному и развитием у него заболевания. Возможности детекции патогенной формы белка могут быть ограничены ее низким содержанием в тканях и жидкостях (кровь, моча, лимфа, слюна).Currently available methods for the diagnosis of prion diseases are based on the study of infectivity of tissue samples of a diseased individual or on the immunodetection of the pathogenic form of PrP protein. The first method can potentially be very sensitive, but its drawback is the long time between the inoculation of infectious material in an experimental animal and the development of its disease. The detection capabilities of the pathogenic form of the protein may be limited by its low content in tissues and fluids (blood, urine, lymph, saliva).
Получены моноклинальные антитела, различающие патогенную и нормальную формы белка PrP (Korth, С., Stierii, В., Streit, P., Moser, M., Schaller, О., Fisher, R., Schultz-Schaeffer, W., Kretzschmar, H., Raeber, A., Braun, U., Ehrensperger, F., Homemann, S., Glockshuber, R., Riek, R., Billeter, M., Wuthrich, K. and Oesch, B. (1997) Prion PrPSc-specific epitope defined by a monoclonal antibody. Nature, 390, 74-77; O'Nuallain, В., Wetzel, R. (2002) Conformational Abs recognizing a generic amyloid fibril epitope. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 1485-1490). Тем не менее, практикуемые ныне методы диагностики основаны на исследовании аутопсийных образцов тканей мозга.Monoclinal antibodies were obtained that distinguish between pathogenic and normal forms of PrP protein (Korth, C., Stierii, B., Streit, P., Moser, M., Schaller, O., Fisher, R., Schultz-Schaeffer, W., Kretzschmar , H., Raeber, A., Braun, U., Ehrensperger, F., Homemann, S., Glockshuber, R., Riek, R., Billeter, M., Wuthrich, K. and Oesch, B. (1997 ) Prion PrPSc-specific epitope defined by a monoclonal antibody. Nature, 390, 74-77; O'Nuallain, B., Wetzel, R. (2002) Conformational Abs recognizing a generic amyloid fibril epitope. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 99, 1485-1490). Nevertheless, the diagnostic methods currently practiced are based on the study of autopsy samples of brain tissue.
В последнее время появились попытки разработать новые методы диагностики прионных заболеваний, основанные на иных принципах. Один из таких подходов основан на способности прионных белков переходить в патогенную форму in vitro. В подобных экспериментах смешивают в пробирке белок, находящийся в прионном состоянии, с его неприонным вариантом и наблюдают превращение нормального белка в прионную форму. Как мы уже отмечали выше, такое превращение проходит эффективно для белка Sup35 дрожжей, но не для белка PrP млекопитающих. Был разработан способ увеличения скорости превращения белка PrP в прионную форму. Этот метод основан на периодическом ультразвуковом дроблении прионных агрегатов (Saborio, G.P., Permanne, В. and Soto, С. (2001) Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature, 411, 810-813).Recently, there have been attempts to develop new methods for the diagnosis of prion diseases based on other principles. One of these approaches is based on the ability of prion proteins to transform into a pathogenic form in vitro. In such experiments, a protein in a prion state with its non-prion variant is mixed in vitro and the conversion of a normal protein to a prion form is observed. As we noted above, this conversion is effective for yeast Sup35 protein, but not for mammalian PrP protein. A method has been developed to increase the rate of conversion of PrP protein to prion form. This method is based on periodic ultrasonic fragmentation of prion aggregates (Saborio, G.P., Permanne, B. and Soto, C. (2001) Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature, 411, 810-813).
Многообещающей альтернативой существующим подходам для диагностики прионных заболеваний, а также для создания принципиально новых препаратов с возможным терапевтическим действием является процедура конструирования и селективного отбора коротких олигонуклеотидов (аптамеров) ДНК-ового или РНК-ового происхождения из огромного набора исходной смеси химически синтезированных фрагментов со случайной последовательностью ("SELEX" - Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment), Klug S.J., Famulok M. (1994) All you wanted to know about SELEX. Molecular Biology Reports, 20, 97-107).A promising alternative to existing approaches for diagnosing prion diseases, as well as for creating fundamentally new drugs with possible therapeutic effects, is the procedure for constructing and selectively selecting short oligonucleotides (aptamers) of DNA or RNA origin from a huge set of the initial mixture of chemically synthesized fragments with a random sequence ("SELEX" - Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment), Klug SJ, Famulok M. (1994) All you wanted to know about SELEX. Molecular Biology Reports, 20, 97-107).
Так в патентной заявке РСТ W02006138676 описаны группа полинуклеотидов (аптамеров), обладающих способностью к связыванию с белком PrP, и способ детекции белка PrP с использованием указанных аптамеров.Thus, in PCT patent application W02006138676, a group of polynucleotides (aptamers) having the ability to bind to a PrP protein and a method for detecting a PrP protein using said aptamers are described.
Однако до сих пор не существует метода определения концентрации патогенного прионного белка в биологических жидкостях и тканях (кроме мозга) больных животных вследствие его очень маленьких количеств. Одной из основных проблем создания метода выявления патогенного прионного белка является концентрирование прионного белка до детектируемых количеств.However, there is still no method for determining the concentration of pathogenic prion protein in biological fluids and tissues (except the brain) of sick animals due to its very small quantities. One of the main problems in creating a method for detecting pathogenic prion protein is the concentration of prion protein to detectable amounts.
Описание изобретенияDescription of the invention
Целью настоящего изобретения является создание быстрого, эффективного и надежного способа детектирования белков в амилоидном состоянии.An object of the present invention is to provide a fast, efficient and reliable method for detecting proteins in an amyloid state.
В результате тщательного исследования авторами настоящего изобретения был разработан способ детекции белков в амилоидном состоянии, в котором получают образец лизата культуры дрожжей, ткани или биологической жидкости млекопитающего, концентрируют белки в амилоидной форме на ацетатцеллюлозной мембране и детектируют их с использованием аптамеров или антител. Размер пор мембраны выбирается таким, чтобы задерживать прионные полимеры, но пропускать все остальные вещества с более низкой молекулярной массой.As a result of a thorough study, the authors of the present invention have developed a method for detecting proteins in an amyloid state, in which a lysate sample of a yeast, tissue or biological fluid from a mammal is obtained, proteins in the amyloid form are concentrated on a cellulose acetate membrane and detected using aptamers or antibodies. The pore size of the membrane is selected so as to retain prion polymers, but to pass all other substances with a lower molecular weight.
Достоинствами и преимуществами настоящего изобретения являются простота, доступность, экономичность, возможность быстрого и одновременного анализа большого количества образцов и высокая чувствительность способа за счет неограниченной возможности концентрирования белков в амилоидном состоянии за счет пропускания неограниченного количества тестируемого образца через мембрану.The advantages and advantages of the present invention are the simplicity, accessibility, cost-effectiveness, the ability to quickly and simultaneously analyze a large number of samples and the high sensitivity of the method due to the unlimited ability to concentrate proteins in the amyloid state by passing an unlimited amount of the test sample through the membrane.
Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способ неинвазивной диагностики белков в амилоидном состоянии в биологических жидкостях млекопитающего, в частности человека, аналогов которому в настоящее время нет.Thus, the present invention provides a method for the non-invasive diagnosis of proteins in the amyloid state in biological fluids of a mammal, in particular humans, which are currently unparalleled.
Для детекции белков в амилоидном состоянии могут быть использованы аптамеры и антитела, специфичные к белкам в амилоидном состоянии.Aptamers and antibodies specific for proteins in the amyloid state can be used to detect proteins in the amyloid state.
Так, например, ранее авторы настоящего изобретения в результате тщательного скрининга отобрали аптамеры, обладающие способностью эффективно и специфически связываться с белком Sup35 дрожжей S. cerevisiae в фибриллярном амилоидном состоянии и не связываться с его мономерной формой, показана возможность использования указанных аптамеров для детектирования прионных форм белков млекопитающих, в частности белка PrP, в инфекционном материале животных, а также полиглутаминовых белков, например Q70, являющегося аналогом белка гентингтина, и разработан способ детектирования указанных прионных форм белков с использованием указанных аптамеров (российская патентная заявка 2010125875).For example, previously, the authors of the present invention, as a result of careful screening, selected aptamers capable of efficiently and specifically binding to Sup35 protein of S. cerevisiae yeast in a fibrillar amyloid state and not binding to its monomeric form, the possibility of using these aptamers to detect prion forms of proteins was shown mammals, in particular PrP protein, in the infectious material of animals, as well as polyglutamine proteins, for example Q70, which is an analogue of the Huntingtin protein, and was developed a method for detecting said prion forms of proteins using said aptamers (Russian Patent Application 2010125875).
Таким образом, целью настоящего изобретения является предоставление способа детекции белков в амилоидном состоянии, в котором получают образец лизата культуры дрожжей или ткани млекопитающего или образец биологической жидкости млекопитающего, добавляют к образцу ионный детергент, концентрируют белки в амилоидной форме на ацетатцеллюлозной мембране и детектируют их с использованием аптамеров или антител.Thus, it is an object of the present invention to provide a method for detecting proteins in an amyloid state in which a yeast or mammalian tissue culture lysate sample or a mammalian body fluid sample is obtained, an ionic detergent is added to the sample, the proteins in amyloid form are concentrated on the cellulose acetate membrane and detected using aptamers or antibodies.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором биологической жидкостью является кровь, лимфа, слюна или моча млекопитающего.Another objective of the present invention is the provision of the above method, in which the biological fluid is blood, lymph, saliva or urine of a mammal.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором указанным детергентом является натрий лауроилсаркозин (саркозил).It is also an object of the present invention to provide a process as described above, wherein said detergent is sodium lauroylsarcosine (sarcosyl).
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором концентрирование белков в амилоидной форме на ацетатцеллюлозной мембране осуществляют пропусканием образца лизата через ацетатцеллюлозную мембрану.It is also an object of the present invention to provide the method described above, in which the concentration of proteins in amyloid form on a cellulose acetate membrane is carried out by passing a lysate sample through a cellulose acetate membrane.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором используют ацетатцеллюлозную мембрану с размером пор 0,1-0,4 мкм.It is also an object of the present invention to provide a process as described above in which a cellulose acetate membrane with a pore size of 0.1-0.4 microns is used.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором детектирование белков в амилоидном состоянии, адсорбированных на ацетатцеллюлозной мембране, осуществляют с использованием аптамеров, их конъюгатов или антител, специфических к белкам в амилоидном состоянии.Another objective of the present invention is the provision of the above method, in which the detection of proteins in the amyloid state adsorbed on the cellulose acetate membrane is carried out using aptamers, their conjugates or antibodies specific for proteins in the amyloid state.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором указанный конъюгат содержит метку, узнаваемую антителами.It is also an object of the present invention to provide the method described above, wherein said conjugate contains a label recognized by antibodies.
Также целью настоящего изобретения является предоставление набора для детекции белков в амилоидном состоянии, содержащего ацетатцеллюлозную мембрану; ионный детергент; аптамер, его конъюгат и/или антитело, специфичные к амилоидной форме белков; и инструкцию по применению набора в соответствии с описанным выше способом.It is also an object of the present invention to provide an amyloid protein detection kit comprising a cellulose acetate membrane; ionic detergent; an aptamer, its conjugate and / or antibody specific for the amyloid form of proteins; and instructions for using the kit in accordance with the method described above.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше набора, в котором ацетатцеллюлозная мембрана имеет размер пор 0,1-0,4 мкм.It is also an object of the present invention to provide a kit as described above, wherein the cellulose acetate membrane has a pore size of 0.1-0.4 microns.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше набора, в котором указанным детергентом является натрий лауроилсаркозин (саркозил).It is also an object of the present invention to provide a kit as described above, wherein said detergent is sodium lauroylsarcosine (sarcosyl).
Более детально настоящее изобретение описано ниже.In more detail, the present invention is described below.
Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention
Концентрирование белков в амилоидном состоянии в способе согласно настоящему изобретению осуществляют путем пропускания тестируемого образца через мембрану. Размер пор мембраны выбирается таким, чтобы задерживать прионные полимеры, но пропускать все остальные вещества с более низкой молекулярной массой. Авторами настоящего изобретения было показано, что предпочтительно использование ацетатцеллюлозной мембраны с размером пор 0,1-0,4 мкм, наиболее предпочтительно 0,2 мкм.The concentration of proteins in the amyloid state in the method according to the present invention is carried out by passing the test sample through the membrane. The pore size of the membrane is selected so as to retain prion polymers, but to pass all other substances with a lower molecular weight. The authors of the present invention have shown that it is preferable to use a cellulose acetate membrane with a pore size of 0.1-0.4 microns, most preferably 0.2 microns.
Образцом культуры ткани млекопитающего может быть как необработанный лизат клеток, так и лизат, предварительно обработанный с целью его очистки от белков, не образующих амилоиды, для уменьшения фона неспецифического связывания аптамера с такими белками из изучаемого образца. Однако способ согласно настоящему изобретению является достаточно эффективным и обладает высокой чувствительностью за счет возможности неограниченного концентрирования при отсутствии необходимости очистки от белков, не образующих амилоиды, так что предварительная обработка лизата перед пропусканием через мембрану не является обязательной.A mammalian tissue culture sample can be either an untreated cell lysate or a lysate pretreated to purify it from non-amyloid-forming proteins to reduce the background of non-specific binding of the aptamer to such proteins from the studied sample. However, the method according to the present invention is quite effective and has high sensitivity due to the possibility of unlimited concentration in the absence of the need for purification from proteins that do not form amyloids, so that preliminary processing of the lysate before passing through the membrane is not necessary.
Исследуемыми образцами также могут быть растворы веществ, выделенных из биологических жидкостей или тканей животного или человека, в том числе предназначенные для производства лекарственных препаратов, биологических добавок или косметических средств.Test samples can also be solutions of substances isolated from biological fluids or tissues of an animal or human, including those intended for the production of drugs, biological additives, or cosmetics.
Исследуемыми образцами также могут быть биологические жидкости млекопитающего, в частности человека. Биологические жидкости, которые могут быть использованы в способе согласно настоящему изобретению, включают кровь, лимфу, слюну, мочу, но не ограничиваются ими.Test samples can also be biological fluids of a mammal, in particular humans. Biological fluids that can be used in the method according to the present invention include, but are not limited to, blood, lymph, saliva, urine.
Возможность пропускания неограниченного количества тестируемого образца через мембрану предоставляет неограниченные возможности концентрирования белков в амилоидном состоянии на указанной мембране, что обеспечивает высокую чувствительность способа детекции согласно настоящему изобретению и предоставляет возможность анализа биологических жидкостей с очень малыми количествам PrPSc. Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способ неинвазивной диагностики белков в амилоидном состоянии в биологических жидкостях млекопитающего, в частности человека, аналогов которому в настоящее время нет.The ability to pass an unlimited amount of the test sample through the membrane provides unlimited possibilities for the concentration of proteins in the amyloid state on the specified membrane, which ensures high sensitivity of the detection method according to the present invention and allows the analysis of biological fluids with very small amounts of PrP Sc . Thus, the present invention provides a method for the non-invasive diagnosis of proteins in the amyloid state in biological fluids of a mammal, in particular humans, which are currently unparalleled.
Тестирование наличия в образцах белков в амилоидном состоянии, сорбированных на мембране, проводят с использованием аптамеров или антител, специфичных к белкам в амилоидном состоянии.Testing for the presence in the samples of proteins in the amyloid state adsorbed on the membrane is carried out using aptamers or antibodies specific for proteins in the amyloid state.
Термин "аптамер", используемый в настоящем изобретении, означает одноцепочечный олигонуклеотид, обладающий способностью к связыванию с другой молекулой (молекулой-мишенью) и образованию с ней относительно устойчивого комплекса. При этом такое связывание происходит не за счет стандартного связывания между парами оснований по Уотсону-Крику за счет водородных связей, а за счет других типов нековалентных связей. Такие типы связей включают нековалентные водородные связи, электростатическое взаимодействие, связывание по Ван дер Вальсу, гидрофобные взаимодействия или их комбинации. При этом такой аптамер связывается с целевой молекулой с гораздо более высокой аффиностью, чем с остальными молекулами, присутствующими в образце.The term “aptamer” as used in the present invention means a single-stranded oligonucleotide having the ability to bind to another molecule (target molecule) and form a relatively stable complex with it. Moreover, this binding does not occur due to the standard binding between base pairs according to Watson-Crick due to hydrogen bonds, but due to other types of non-covalent bonds. Such types of bonds include non-covalent hydrogen bonds, electrostatic interaction, van der Wals binding, hydrophobic interactions, or combinations thereof. At the same time, such an aptamer binds to the target molecule with a much higher affinity than to other molecules present in the sample.
Способы конструирования и определения характеристик связывания аптамеров с целевыми молекулами хорошо известны из уровня техники (см., например, Lorsch and Szostak (1996) или патенты США №5,582,981, 5,595,877, 5,637,459). Сами аптамеры могут быть получены любым известным методом, включая химический синтез, методы рекомбинантных ДНК, с использованием стандартных методов очистки. Также термин «аптамер» относится и к вторичным аптамерам, содержащим так называемую «консенсусную» последовательность, полученную путем анализа двух или нескольких аптамеров, связывающихся с одной и той же целевой молекулой. Как правило, длина аптамера может варьироваться от 10 до 40 или более нуклеотидов, необходимых для связывания с целевой молекулой.Methods of constructing and characterizing the binding of aptamers to target molecules are well known in the art (see, for example, Lorsch and Szostak (1996) or US Pat. Nos. 5,582,981, 5,595,877, 5,637,459). The aptamers themselves can be obtained by any known method, including chemical synthesis, recombinant DNA methods, using standard purification methods. The term “aptamer” also refers to secondary aptamers containing the so-called “consensus” sequence obtained by analyzing two or more aptamers that bind to the same target molecule. Typically, the length of the aptamer can vary from 10 to 40 or more nucleotides necessary for binding to the target molecule.
Аптамеры содержат нуклеотидную последовательность, определяющую специфичность связывания с целевой молекулой, но при этом также могут содержать участки, фланкирующие эту последовательность, которые необходимы, например, для амплификации всего аптамера методом ПЦР, или содержат сайты эндонуклеаз рестрикции для лигирования аптамера в плазмиды, клонирования и т.п. Такие фланкирующие последовательности обычно содержат от 10 до 30 нуклеотидов, при этом часть из этих нуклеотидов может иметь случайный состав.Aptamers contain a nucleotide sequence that determines the specificity of binding to the target molecule, but may also contain regions flanking this sequence, which are necessary, for example, for amplification of the entire aptamer by PCR, or contain restriction endonuclease sites for ligation of the aptamer into plasmids, cloning, etc. .P. Such flanking sequences usually contain from 10 to 30 nucleotides, while some of these nucleotides may have a random composition.
Также аптамеры согласно настоящему изобретению могут содержать различные ковалентно связанные функциональные модификации и дополнительные лиганды, необходимые для детектирования связывания аптамера с целевой молекулой, например флуоресцентные красители, биотин или различные ферменты, активность которых легко детектировать (пероксидазы, люциферазы, щелочной фосфатазы и подобные им). Такие модифицированные аптамеры могут быть получены стандартными методами, хорошо известными специалистам в данной области техники, например, в ходе твердофазного синтеза олигонуклеотидов или в растворе с использованием фосфотриэфирного метода.Also, the aptamers according to the present invention may contain various covalently linked functional modifications and additional ligands necessary for detecting the binding of the aptamer to the target molecule, for example fluorescent dyes, biotin or various enzymes whose activity is easily detected (peroxidases, luciferase, alkaline phosphatase and the like). Such modified aptamers can be obtained by standard methods well known to specialists in this field of technology, for example, during the solid-phase synthesis of oligonucleotides or in solution using the phosphotriether method.
Примером аптамеров, специфически связывающихся с белками в амилоидном состоянии, являются аптамеры S1-S4, содержащие нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:1-4, полученные авторами настоящего изобретения ранее с использованием процедуры SELEX (Systematic Evolution ofLigands by Exponential enrichment) и описанные в российской патентной заявке 2010125875. Аптамер S4 (SEQ ID NO:4) является предпочтительным. Указанные олигонуклеотиды обладают способностью связываться с белками, образующими амилоиды, с высокой специфичностью и эффективностью. Также указанные олигонуклеотиды могут быть использованы для детектирования белков, образующих амилоиды, в частности, прионных белков.An example of aptamers that specifically bind to proteins in the amyloid state are S1-S4 aptamers containing nucleotide sequences selected from the group consisting of sequences shown in SEQ ID NO: 1-4 from the List of Sequences previously obtained by the present inventors using SELEX procedures (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) and described in Russian patent application 2010125875. Aptamer S4 (SEQ ID NO: 4) is preferred. These oligonucleotides have the ability to bind to proteins that form amyloids, with high specificity and efficiency. Also, these oligonucleotides can be used to detect proteins that form amyloids, in particular, prion proteins.
Для детектирования связывания олигонуклеотидов (аптамеров) согласно настоящему изобретению с белками, образующими амилоиды, могут использоваться любые методы, известные специалистам в данной области техники. Могут быть применены методы с использованием радиоактивных изотопов, когда для связывания с целевой молекулой используются радиоактивно меченные олигонуклеотиды, например 32Р-меченные олигонуклеотиды, а степень связывания определяют после отмывки образца по остаточной радиоактивности. Могут быть использованы методы количественной ПЦР, например ПЦР в реальном времени, когда определяют количество олигонуклеотидов, связавшихся с целевой молекулой и оставшихся в составе комплекса аптамер - целевая молекула, после денатурации такого комплекса.To detect the binding of oligonucleotides (aptamers) according to the present invention to proteins that form amyloids, any methods known to those skilled in the art can be used. Methods using radioactive isotopes can be used when radiolabeled oligonucleotides, for example 32 P-labeled oligonucleotides, are used to bind to the target molecule, and the degree of binding is determined after washing the sample by residual radioactivity. Quantitative PCR methods can be used, for example, real-time PCR, when the number of oligonucleotides that bind to the target molecule and remain in the aptamer-target molecule complex is determined after denaturation of such a complex.
Также могут быть использованы функциональные модификации олигонуклеотидов (аптамеров) или дополнительные лиганды, необходимые для детектирования связывания аптамера с целевой молекулой, например флуоресцентные красители, например карбоксифлуоресцеин (FAM), биотин или различные ферменты, активность которых легко детектировать (пероксидазы, люциферазы, щелочной фосфатазы и подобные им). В случае использования биотинилированного производного олигонуклеотида используют пероксидазу, люциферазу и щелочную фосфатазу слитую со стрептовидином или авидином, при этом стрептовидин и авидин связывается с биотином, а пероксидазу, щелочную фосфатазу и люциферазу используют для детектирования связывания.Functional modifications of oligonucleotides (aptamers) or additional ligands necessary for detecting the binding of the aptamer to the target molecule, for example, fluorescent dyes, for example carboxyfluorescein (FAM), biotin or various enzymes whose activity is easily detected (peroxidases, luciferase, alkaline phosphatase and like them). In the case of using a biotinylated derivative of an oligonucleotide, peroxidase, luciferase and alkaline phosphatase fused with streptovidin or avidin are used, while streptovidin and avidin binds to biotin, and peroxidase, alkaline phosphatase and luciferase are used to detect binding.
Также могут быть использованы конъюгаты аптамера с меткой, например FAM, а в качестве молекулы, позволяющей детектировать связывание указанного аптамера с амилоидами, используют антитела к такой метке.Conjugates of the aptamer with a label, for example FAM, can also be used, and antibodies to such a label are used as a molecule to detect the binding of the aptamer to amyloids.
Один из вариантов воплощения настоящего изобретения предоставляет набор для детекции белков в амилоидном состоянии, содержащий ацетатцеллюлозную мембрану; ионный детергент; аптамер, его конъюгат и/или антитело, специфичные к амилоидной форме белков; и инструкцию по применению набора в соответствии со способом согласно настоящему изобретению. Ацетатцеллюлозная мембрана в указанном наборе имеет размер пор 0,1-0,4 мкм, предпочтительно 0,2 мкм. Наиболее предпочтительным ионным детергентом является натрий лауроилсаркозин (саркозил).One embodiment of the present invention provides an amyloid protein detection kit comprising a cellulose acetate membrane; ionic detergent; an aptamer, its conjugate and / or antibody specific for the amyloid form of proteins; and instructions for using the kit in accordance with the method according to the present invention. The cellulose acetate membrane in said set has a pore size of 0.1-0.4 microns, preferably 0.2 microns. The most preferred ionic detergent is sodium lauroylsarcosine (sarcosyl).
Краткое описание рисунковBrief Description of Drawings
На Фиг.1 приведена карта плазмиды pL-prnP.Figure 1 shows a map of the plasmid pL-prnP.
На Фиг.2 приведена карта плазмиды pL-moPnP.Figure 2 shows a map of the plasmid pL-moPnP.
На Фиг.3 показаны результаты сравнительного анализа адсорбции белков лизатов дрожжей при прохождении растворов через ацетатцеллюлозную или нитроцеллюлозную мембрану. Белки окрашивали неспецифическим красителем Понсо.Figure 3 shows the results of a comparative analysis of the adsorption of yeast lysate proteins upon passage of solutions through a cellulose acetate or nitrocellulose membrane. Proteins were stained with non-specific Ponceau dye.
На Фиг.4 показано влияние детергентов SDS и саркозила на эффективность адсорбции амилоидов PrP на ацетатцеллюлозную мембрану. В первой точке исходный лизат разведен в 10 раз, в каждой следующей - последовательные разведения в 4 раза.Figure 4 shows the effect of detergents SDS and sarcosyl on the efficiency of adsorption of PrP amyloids on the cellulose acetate membrane. At the first point, the initial lysate is diluted 10 times, at each subsequent point,
На Фиг.5 приведены результаты анализа специфичности связывания аптамера S4 с амилоидами прионного белка (PrP), образованными его укороченной (90-231) или полноразмерной (23-231) формами. В первой точке исходный лизат разведен в 10 раз, в каждой следующей - последовательные разведения в 4 раза.Figure 5 shows the results of the analysis of the binding specificity of the aptamer S4 with prion protein amyloids (PrP) formed by its shortened (90-231) or full-sized (23-231) forms. At the first point, the initial lysate is diluted 10 times, at each subsequent point,
На Фиг.6 показано влияние присутствия ДНК и РНК на специфичность связывания аптамеров с амилоидным прионным белком. «+» - образцы, обработанные ферментами ДНКазой и РНКазой; «-» - образцы, не обработанные этими ферментами. В первой точке исходный лизат разведен в 10 раз, в каждой следующей - последовательные разведения в 4 раза.Figure 6 shows the effect of the presence of DNA and RNA on the specificity of binding of aptamers to amyloid prion protein. “+” - samples treated with DNase and RNase enzymes; “-” - samples not treated with these enzymes. At the first point, the initial lysate is diluted 10 times, at each subsequent point,
ПримерыExamples
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.The present invention will be described in more detail below with reference to the following non-limiting Examples.
Пример 1. Конструирование экспрессионной плазмиды для получения полноразмерного белка мыши PrP (23-231) и его укороченного варианта PrP (90-231).Example 1. Construction of an expression plasmid to obtain a full-sized mouse protein PrP (23-231) and its shortened version of PrP (90-231).
Многокопийная плазмида pL-PrnP, содержащая последовательность полноразмерного гена PrnP(23-231) мыши, кодирующую аминокислоты с 23 по 231, под контролем промотора CUP1 была создана на основе вектора pRS425 (Christianson T.W., Sikorski R.S., Dante M., Shero J.H., Hieter P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors // Gene. 1992. 110, P.119-122). Плазмида была получена в два этапа: последовательность промотора CUP1 из плазмиды pRS316CG [Liu J.J., Lindquist S. Oligopeptide-repeat expansions modulate "protein-only" inheritance in yeast // Nature. 1999. Vol.400. P.573-576] была встроена в вектор pRS425 по сайтам XhoI-BamHI. Затем в полученную конструкцию по сайтам BamHI и SacI была встроена последовательность гена PrnP (23-231) мыши. Последовательность, кодирующую фрагмент белка PrP мыши с 23 по 231 аминокислоту, амплифицировали методом ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиды pcDNA3-l-3F4 (Narwa R. & Harris DA. Prion proteins carrying pathogenic mutations are resistant to phospholipase cleavage of their glycolipid anchors // Biochemistry. 1999. 38(27) P: 8770-7), содержащей ген РrnР мыши, модифицированный для распознавания моноклональными антителами 3F4, и праймеров PrnP (23-231) BamHI-F (SEQ ID NO:5) и PrnP SacI-R (SEQ ID NO:6). Использовали термостабильную полимеразу Pfu «Силекс M» (Россия).The multi-copy plasmid pL-PrnP containing the full-length mouse PrnP gene sequence (23-231) encoding amino acids 23 to 231, under the control of the CUP1 promoter, was created on the basis of the pRS425 vector (Christianson TW, Sikorski RS, Dante M., Shero JH, Hieter P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors // Gene. 1992.110, P.119-122). The plasmid was obtained in two stages: the sequence of the CUP1 promoter from the plasmid pRS316CG [Liu J.J., Lindquist S. Oligopeptide-repeat expansions modulate "protein-only" inheritance in yeast // Nature. 1999. Vol. 400. P.573-576] was inserted into the pRS425 vector at XhoI-BamHI sites. Then, the PrnP (23-231) gene sequence of the mouse was inserted into the resulting construct at the BamHI and SacI sites. The sequence encoding the fragment of the PrP mouse protein from 23 to 231 amino acids was amplified by PCR using pcDNA3-l-3F4 as the matrix plasmid (Narwa R. & Harris DA. Prion proteins carrying pathogenic mutations are resistant to phospholipase cleavage of their glycolipid anchors / / Biochemistry. 1999. 38 (27) P: 8770-7) containing the mouse PrnP gene modified for recognition by 3F4 monoclonal antibodies and PrnP (23-231) BamHI-F primers (SEQ ID NO: 5) and PrnP SacI- R (SEQ ID NO: 6). Used thermostable polymerase Pfu "Sileks M" (Russia).
Была использована следующая программа для амплификации фрагментов мышиного гена PrnP: 94°С в течение 2 минут; 2 цикла 94°С в течение 40 секунд, 49°С в течение 40 секунд; 72°С в течение 40 секунд; 24 цикла 94°С в течение 40 секунд, 60°С в течение 40 секунд; 72°С в течение 40 секунд; и в конце 72°С в течение 5 минут.The following program was used to amplify fragments of the mouse PrnP gene: 94 ° C for 2 minutes; 2 cycles of 94 ° C for 40 seconds, 49 ° C for 40 seconds; 72 ° C for 40 seconds; 24 cycles of 94 ° C for 40 seconds, 60 ° C for 40 seconds; 72 ° C for 40 seconds; and at the end of 72 ° C for 5 minutes.
Правильность последовательности нуклеотидов в полученной плазмиде проверяли секвенированием с использованием стандартных праймеров 21M13F (SEQ ID NO: 7) и 29M13R (SEQ ID NO:8). Карта полученной плазмиды pL-PrnP показана на Фиг.1.The sequence of the nucleotides in the obtained plasmid was verified by sequencing using standard primers 21M13F (SEQ ID NO: 7) and 29M13R (SEQ ID NO: 8). A map of the obtained plasmid pL-PrnP is shown in Figure 1.
Многокопийная плазмида pL-moPrP (90-231), содержащая последовательность гена PrnP (90-231) мыши, кодирующую аминокислоты с 90 по 231, под контролем промотора GPD была создана на основе вектора pRS425 (Christianson T.W., Sikorski R.S., Dante M., Shero J.H., Hieter P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors // Gene. 1992. 110, P.119-122). Плазмида была сконструирована путем замещения фрагмента BamHI-Sad, содержащего PrP(90-231)-GFP (1,2 т.п.н.), из плазмиды PGPD-PrP-GFP(LEU2) [Рубель А.А., Сайфитдинова А.Ф., Лада А.Г., Нижников А.А., Инге-Вечтомов С.Г., Галкин А.П. Дрожжевой шаперон Hsp104 регулирует экспрессию генов на посттранскрипционном уровне // Мол. биол. 2008. Т.42. №1. С.123-130], на фрагмент SacII-SacI, содержащий последовательность PrP (90-231). Последовательность, кодирующую фрагмент белка PrP мыши с 90 по 231 аминокислоту, амплифицировали методом ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиду pcDNA3-1-3F4 (Рубель А.А., Сайфитдинова А.Ф., Лада А.Г., Нижников А.А., Инге-Вечтомов С.Г., Галкин А.П. Дрожжевой шаперон Hsp104 регулирует экспрессию генов на посттранскрипционном уровне // Мол. биол. - 2008. - Т.42. - №1. - С.123-130) и праймеров PmP (90-231)BamHI-F (SEQ ID NO:9) и PmP SacI-R (SEQ ID NO:6). Использовали программу для амплификации, описанную выше. Правильность последовательности нуклеотидов в полученной плазмиде также определяли, как описано выше. Карта полученной плазмиды pL-moPrP показана на Фиг.2.The multi-copy plasmid pL-moPrP (90-231) containing the mouse PrnP gene sequence (90-231) encoding amino acids 90 to 231, under the control of the GPD promoter, was created on the basis of the pRS425 vector (Christianson TW, Sikorski RS, Dante M., Shero JH, Hieter P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors // Gene. 1992.110, P.119-122). The plasmid was constructed by replacing a BamHI-Sad fragment containing PrP (90-231) -GFP (1.2 kb) from the plasmid PGPD-PrP-GFP (LEU2) [Rubel A.A., Sayfitdinova A .F., Lada A.G., Nizhnikov A.A., Inge-Vechtomov S.G., Galkin A.P. The yeast chaperone Hsp104 regulates gene expression at the post-transcriptional level // Mol. biol. 2008.V. 42. No. 1. P.123-130], per SacII-SacI fragment containing the PrP sequence (90-231). The sequence encoding a fragment of the PrP mouse protein from 90 to 231 amino acids was amplified by PCR using the pcDNA3-1-3F4 plasmid as a matrix (Rubel A.A., Sayfitdinova A.F., Lada A.G., Nizhnikov A.A. ., Inge-Vechtomov S.G., Galkin A.P. Yeast chaperone Hsp104 regulates gene expression at the post-transcriptional level // Mol. Biol. - 2008. - T. 42. - No. 1. - S.123-130) and primers PmP (90-231) BamHI-F (SEQ ID NO: 9) and PmP SacI-R (SEQ ID NO: 6). The amplification program described above was used. The correctness of the nucleotide sequence in the obtained plasmid was also determined as described above. A map of the resulting plasmid pL-moPrP is shown in Figure 2.
Пример 2. Трансформация дрожжей Saccharomyces cerevisiae и получение лизатов, содержащих белок PrP.Example 2. Transformation of the yeast Saccharomyces cerevisiae and obtaining lysates containing PrP protein.
В качестве модели использовали штамм 74-D694ΔRNQ1 [psi-] MATa ade1-14 his3Δ200 leu3-112 trp1-289 ura3-52 rnq1::HIS3 дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Salnikova, A.B., Kryndushkin D.S., Smimov V.N., Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids // J Biol Chem. 2005, 280, P.8808-8812).The strain 74-D694ΔRNQ1 [psi-] MATa ade1-14 his3Δ200 leu3-112 trp1-289 ura3-52 rnq1 :: HIS3 yeast Saccharomyces cerevisiae (Salnikova, AB, Kryndushkin DS, Smimov VN, Kushnirov VV, Ter-Avanesyan was used as a model MD Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids // J Biol Chem. 2005, 280, P.8808-8812).
В этом штамме дрожжей экспрессировали плазмиду, содержащую последовательности, кодирующие PrP 23-231 или PrP 90-231, или в качестве отрицательного контроля плазмиду PRS425, на основе которой были созданы указанные плазмиды.In this yeast strain, a plasmid was expressed containing sequences encoding PrP 23-231 or PrP 90-231, or, as a negative control, plasmid PRS425, on the basis of which these plasmids were created.
Для трансформации дрожжей использовали стандартный протокол (Gietz, R.D., Schiesti, R.Н., Willems, А.R., and Woods, R.A. (1995) Yeast 11, 355-360).A standard protocol was used to transform yeast (Gietz, R. D., Schiesti, R. N., Willems, A. R., and Woods, R. A. (1995) Yeast 11, 355-360).
Пример 3. Получение лизатов, содержащих белок PrPExample 3. Obtaining lysates containing PrP protein
Культуру дрожжей растили в 10 мл минимальной среды с соответствующими добавками (аденин, урацил, необходимые аминокислоты и, по необходимости, сульфат меди в качестве индуктора) до стационарной фазы. Клетки собирали центрифугированием, ресуспендировали в 5 мл дистиллированной воды, разливали по 1 мл в пробирки "Эппендорф" и осаждали центрифугированием, в результате чего в каждой пробирке находилось 50-100 мкл клеток. Далее клетки замораживали и хранили на -70°С. Для получения лизата размораживали одну пробирку, добавляли 3-кратный объем стеклянных бус, 100 мкл трис-солевого буфера TBS (30 мМ Tris-HCl pH 7,4,150 мМ NaCl), содержащего 10 мМ ЭДТА, 10 мМ фенилметилсульфонил флуорида (PMSF), 1 мМ дитиотреитола (ДТТ) и коктейля ингибиторов протеаз (Complete®, Roche Applied Science), в количестве, рекомендованном протоколом изготовителя. Клеточный дебрис отделяли центрифугированием при 1500 g в течение 4-х минут и осветленный лизат, содержащий полимеры белка PrP, расфасовывали по пробиркам.The yeast culture was grown in 10 ml of minimal medium with the appropriate additives (adenine, uracil, essential amino acids and, if necessary, copper sulfate as an inducer) to the stationary phase. Cells were collected by centrifugation, resuspended in 5 ml of distilled water, 1 ml poured into Eppendorf tubes and pelleted by centrifugation, resulting in 50-100 μl of cells in each tube. Then the cells were frozen and stored at -70 ° C. To obtain a lysate, one tube was thawed, a 3-fold volume of glass beads was added, 100 μl of TBS Tris-Salt buffer (30 mM Tris-HCl pH 7.4.150 mM NaCl) containing 10 mM EDTA, 10 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM dithiothreitol (DTT) and cocktail of protease inhibitors (Complete®, Roche Applied Science), in the amount recommended by the manufacturer's protocol. Cell debris was separated by centrifugation at 1500 g for 4 minutes and the clarified lysate containing PrP protein polymers was packaged in tubes.
Пример 4. Концентрирование белков на мембранахExample 4. Concentration of proteins on membranes
Ацетатцеллюлозную мембрану (0,2 мкм, Whatman GmbH OE66) смачивали дистиллированной водой и помещали в ячейку вакуумного дот-блоттера БиоРад. Лизаты клеток дрожжей, содержащие белок PrP, разводили до нужной концентрации в буфере TBS с ионным детергентом, делали последовательные разведения этих растворов тем же буфером и вносили в ячейки блоттера по 50 мкл полученных растворов лизатов. С помощью вакуумного (водоструйного) насоса растворы прокачивали через мембрану. Затем в эти ячейки добавляли по 100 мкл буфера TBS с ионным детергентом (SDS - додецилсульфат натрия или саркозил - лаурилсаркозинат натрия), инкубировали 10 минут, после чего буфер удаляли и промывали ячейки еще 2 раза по 100 мкл аналогичным буфером, затем 2 раза по 100 мкл буфером TBS без детергента. После этого мембрану окрашивали раствором красителя Понсо-С для оценки количества белка осевшего на мембране. Для сравнения лизаты дрожжей аналогичным образом пропускали через нитроцеллюлозную мембрану (0,45 мкм, Macherey-Nagel, Германия), адсорбирующую белки. На Фиг.3 показано, что основная масса белков лизатов дрожжей хорошо адсорбируется на нитроцеллюлозной мембране и легко проходит через ацетатцеллюлозу даже при небольших разведениях лизатов.The cellulose acetate membrane (0.2 μm, Whatman GmbH OE66) was wetted with distilled water and placed in a BioRad vacuum dot blot cell. Yeast cell lysates containing PrP protein were diluted to the desired concentration in TBS buffer with an ionic detergent, serial dilutions of these solutions were made with the same buffer, and 50 μl of the obtained lysate solutions were introduced into the blotter cells. Using a vacuum (water-jet) pump, the solutions were pumped through the membrane. Then, 100 μl of TBS buffer with ionic detergent (SDS - sodium dodecyl sulfate or sodium sarcosyl - lauryl sarcosinate) was added to these cells, incubated for 10 minutes, after which the buffer was removed and the cells were washed 2 more times with 100 μl with the same buffer, then 2 times in 100 μl TBS buffer without detergent. After that, the membrane was stained with a Ponso-C dye solution to estimate the amount of protein deposited on the membrane. For comparison, yeast lysates were similarly passed through a nitrocellulose membrane (0.45 μm, Macherey-Nagel, Germany) adsorbing proteins. Figure 3 shows that the bulk of yeast lysate proteins adsorbs well on the nitrocellulose membrane and easily passes through cellulose acetate even with small dilutions of the lysates.
Пример 5. Изучение связывания аптамеров и антител с белком PrP.Example 5. The study of the binding of aptamers and antibodies to PrP protein.
Мембрану инкубировали в течение часа в растворе казеина (4 мг/мл) в TBS буфере, рН 7.4 с 0,05% Твина-20. После этого мембрану погружали в раствор меченого аптамера или антител к прионному белку. Аптамер, меченный флуоресцентной меткой FAM, в количестве 8 пикограмм разводили в 0,5 мл 5 мМ фосфатного буфера (PBS) рН 6,0, содержащем 0,05% Твина-20 и 200 мМ мочевины. Аптамер подвергали денатурации путем кипячения полученного раствора на водяной бане в течение 5 минут. Затем раствор охлаждали при комнатной температуре в течение 5 минут, выдерживали еще 30 минут при комнатной температуре и далее разводили в 8 мл того же фосфатного буфера, содержащего 0,4% казеина. Антитела разводили в буфере TBS рН 7.4 с 0,05% Твина-20 и 4 мг/мл казеина. После часовой инкубации при комнатной температуре мембрану ополаскивали два раза дистиллированной водой и обрабатывали следующим раствором. В случае антител - раствором вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой в том же буфере. В случае аптамеров - вторым раствором служили антитела к FAM в буфере TBS. Далее после часовой инкубации с антителами к FAM и однократной промывки мембраны к мембране приливали раствор вторичных антител в TBS. После инкубации с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой, мембрану промывали 3 раза по 15 минут буфером TBS с 0.05% раствором Твина-20 и затем 2 раза по 15 минут буфером TBS. Связывание аптамеров или антител с прионным белком фиксировали на приборе для детекции хемилюминесценции фирмы Vilber Lourmat с использованием смеси проявляющих растворов ECL West Dura system (Thermo Scientific).The membrane was incubated for one hour in a casein solution (4 mg / ml) in TBS buffer, pH 7.4 with 0.05% Tween-20. After that, the membrane was immersed in a solution of labeled aptamer or antibodies to prion protein. Aptamer labeled with a fluorescent FAM tag, in the amount of 8 picograms, was diluted in 0.5 ml of 5 mM phosphate buffer (PBS) pH 6.0, containing 0.05% Tween-20 and 200 mM urea. The aptamer was denatured by boiling the resulting solution in a water bath for 5 minutes. Then the solution was cooled at room temperature for 5 minutes, kept for another 30 minutes at room temperature and then diluted in 8 ml of the same phosphate buffer containing 0.4% casein. Antibodies were diluted in TBS buffer pH 7.4 with 0.05% Tween-20 and 4 mg / ml casein. After one hour incubation at room temperature, the membrane was rinsed twice with distilled water and treated with the following solution. In the case of antibodies, a solution of secondary antibodies conjugated to peroxidase in the same buffer. In the case of aptamers, antibodies to FAM in TBS buffer served as the second solution. Then, after an hour incubation with antibodies to FAM and a single washing of the membrane, a solution of secondary antibodies in TBS was poured onto the membrane. After incubation with secondary antibodies conjugated with peroxidase, the membrane was washed 3 times for 15 minutes with TBS buffer with 0.05% Tween-20 solution and then 2 times for 15 minutes with TBS buffer. The binding of aptamers or antibodies to prion protein was fixed on a Vilber Lourmat chemiluminescence detector using a mixture of ECL West Dura system developing solutions (Thermo Scientific).
Пример 6. Влияние детергентов SDS и саркозила на эффективность адсорбции амилоидов PrP на ацетатцеллюлозной мембране.Example 6. The effect of detergents SDS and sarcosyl on the efficiency of adsorption of PrP amyloids on a cellulose acetate membrane.
На Фиг.4 представлены результаты экспериментов по концентрированию амилоидов PrP на ацетатцеллюлозную мембрану в присутствии детергентов SDS или саркозила (натрий лауроилсаркозина). Из Фиг.2 видно, что амилоиды PrP растворяются в SDS и не адсорбируются на ацетатцеллюлозной мембране. Для концентрирования амилоидов PrP в качестве детергента следует использовать саркозил.Figure 4 presents the results of experiments on the concentration of PrP amyloids on the cellulose acetate membrane in the presence of SDS or sarcosyl detergents (sodium lauroylsarcosine). Figure 2 shows that PrP amyloids dissolve in SDS and are not adsorbed onto the cellulose acetate membrane. Sarcosyl should be used as a detergent to concentrate PrP amyloids.
Пример 7. Доказательство специфичности связывания аптамеров с прионным белком.Example 7. Proof of the specificity of binding of aptamers to prion protein.
Для доказательства специфичности связывания аптамеров с прионным белком, сконцентрированным на ацетатцеллюлозной мембране, аналогичный эксперимент проводили с раствором аптамера, полученного к урокиназе и имеющего тот же размер (70 нуклеотидов), что и аптамер к прионному белку (Skrypina NA, Savochkina LP, Beabealashvilli RSh. In vitro selection of single-stranded DNA aptamers that bind human pro-urokinase. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2004; 23:891-3). Как видно из Фиг.5, аптамер к урокиназе не связывается как с полноразмерным, так и укороченным прионным белком. Также видно, что чувствительность аптамеров к прионному белку может быть выше, чем у моноклональных антител к этому же белку. Несмотря на то что используемый аптамер показывает некоторое неспецифическое связывание с контрольным лизатом, его взаимодействие с прионным белком не менее чем в 10 раз превышает фоновое связывание.To prove the specificity of binding of aptamers to a prion protein concentrated on a cellulose acetate membrane, a similar experiment was carried out with a solution of an aptamer obtained for urokinase and having the same size (70 nucleotides) as the aptamer for prion protein (Skrypina NA, Savochkina LP, Beabealashvilli RSh. In vitro selection of single-stranded DNA aptamers that bind human pro-urokinase. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2004; 23: 891-3). As can be seen from Figure 5, the aptamer to urokinase does not bind to both full-sized and truncated prion protein. It is also seen that the sensitivity of aptamers to a prion protein can be higher than that of monoclonal antibodies to the same protein. Despite the fact that the aptamer used shows some nonspecific binding to the control lysate, its interaction with prion protein is no less than 10 times higher than background binding.
Для того чтобы выяснить, происходит ли на мембране неспецифическое связывание аптамера с ДНК и РНК, присутствующими в лизате дрожжей, которые могут частично задерживаться на мембране, был проведен эксперимент по удалению ДНК и РНК из лизатов путем обработки их ДНКазой и РНКазой (в концентрации 0,1 мг/мл каждая) в течение 30 минут при комнатной температуре. Как видно из Фиг.6, присутствие или отсутствие ДНК и РНК в лизате практически никак не влияло на эффективность связывания аптамера с прионным белком.In order to find out whether nonspecific binding of the aptamer to DNA and RNA present in the yeast lysate, which may be partially retained on the membrane, occurs on the membrane, an experiment was performed to remove DNA and RNA from lysates by treating them with DNase and RNase (at a concentration of 0, 1 mg / ml each) for 30 minutes at room temperature. As can be seen from Fig.6, the presence or absence of DNA and RNA in the lysate had virtually no effect on the efficiency of binding of the aptamer to prion protein.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.Although the invention has been described in detail with reference to the best mode of carrying out the invention, it will be apparent to those skilled in the art that various changes can be made and equivalent replacements made, and such changes and replacements are not outside the scope of the present invention.
Все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения и включены в настоящее описание во всей полноте посредством ссылки.All cited documents are part of the description of the present invention and are incorporated into this description in its entirety by reference.
Claims (9)
- получение образца лизата культуры дрожжей, или ткани млекопитающего, или биологической жидкости млекопитающего;
- добавление к образцу ионного детергента;
- концентрирование белков в амилоидной форме на ацетатцеллюлозной мембране; и
- детектирование белков в амилоидном состоянии, адсорбированных на ацетатцеллюлозной мембране, с использованием аптамеров, их конъюгатов или антител, специфичных к амилоидной форме белков.1. The method of detection of proteins in the amyloid state, comprising the following stages:
- obtaining a sample of a lysate culture of yeast, or tissue of a mammal, or biological fluid of a mammal;
- addition of an ionic detergent to the sample;
- concentration of proteins in amyloid form on a cellulose acetate membrane; and
- detection of proteins in the amyloid state adsorbed on the cellulose acetate membrane using aptamers, their conjugates or antibodies specific for the amyloid form of proteins.
ацетатцеллюлозную мембрану; ионный детергент; аптамер, его конъюгат и/или антитело, специфичные к амилоидной форме белков; и инструкцию по применению набора в соответствии со способом по п.1.7. A kit for the detection of proteins in the amyloid state, containing:
cellulose acetate membrane; ionic detergent; an aptamer, its conjugate and / or antibody specific for the amyloid form of proteins; and instructions for using the kit in accordance with the method of claim 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012145337/10A RU2509155C1 (en) | 2012-10-25 | 2012-10-25 | Detection method of proteins in amyloid state, and set for detection of proteins in amyloid state |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012145337/10A RU2509155C1 (en) | 2012-10-25 | 2012-10-25 | Detection method of proteins in amyloid state, and set for detection of proteins in amyloid state |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2509155C1 true RU2509155C1 (en) | 2014-03-10 |
Family
ID=50192149
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012145337/10A RU2509155C1 (en) | 2012-10-25 | 2012-10-25 | Detection method of proteins in amyloid state, and set for detection of proteins in amyloid state |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2509155C1 (en) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995013084A1 (en) * | 1992-05-11 | 1995-05-18 | Miles Inc. | Cathepsin d is an amyloidogenic protease in alzheimer's disease |
| EA005582B1 (en) * | 1999-12-29 | 2005-04-28 | Уайт Холдингз Корпорейшн | Methods of detection of amyloidogenic proteins |
| EP1821103A1 (en) * | 2006-02-17 | 2007-08-22 | Cellzome Ag | Methods for the identification of gama-secretase modulators |
| RU2379300C2 (en) * | 2004-04-05 | 2010-01-20 | Носкира, С.А. | Gsk-3 inhibitors |
| EA015654B1 (en) * | 2006-03-30 | 2011-10-31 | Глаксо Груп Лимитед | Antibodies against amyloid-beta peptide |
-
2012
- 2012-10-25 RU RU2012145337/10A patent/RU2509155C1/en active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995013084A1 (en) * | 1992-05-11 | 1995-05-18 | Miles Inc. | Cathepsin d is an amyloidogenic protease in alzheimer's disease |
| EA005582B1 (en) * | 1999-12-29 | 2005-04-28 | Уайт Холдингз Корпорейшн | Methods of detection of amyloidogenic proteins |
| RU2379300C2 (en) * | 2004-04-05 | 2010-01-20 | Носкира, С.А. | Gsk-3 inhibitors |
| EP1821103A1 (en) * | 2006-02-17 | 2007-08-22 | Cellzome Ag | Methods for the identification of gama-secretase modulators |
| EA015654B1 (en) * | 2006-03-30 | 2011-10-31 | Глаксо Груп Лимитед | Antibodies against amyloid-beta peptide |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rhie et al. | Characterization of 2′-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion | |
| US7371833B1 (en) | Nucleic acid molecules with specific recognition of native PrPSc, production and use | |
| Adler et al. | Small, highly structured RNAs participate in the conversion of human recombinant PrPSen to PrPRes in vitro | |
| Manuelidis | Nuclease resistant circular DNAs copurify with infectivity in scrapie and CJD | |
| JP5048522B2 (en) | How to detect misfolded proteins and prions | |
| Carlomagno et al. | Casein kinase II induced polymerization of soluble TDP-43 into filaments is inhibited by heat shock proteins | |
| EP0914614B1 (en) | CHARPERONES CAPABLE OF BINDING TO PRION PROTEINS AND DISTINGUISHING THE ISOFORMS PrPc AND PrPsc | |
| US6426409B1 (en) | Nucleic acid molecules that bind prion proteins and processes for the production thereof | |
| Endo et al. | A binary Cy3 aptamer probe composed of folded modules | |
| RU2509155C1 (en) | Detection method of proteins in amyloid state, and set for detection of proteins in amyloid state | |
| EP1287126A1 (en) | Ligands specific for an isoform of the prion protein | |
| KR102554337B1 (en) | Peptide specifically binding to H5N1 subtype of influenza A virus and uses thereof | |
| US20050261486A1 (en) | Compositions and methods for binding agglomeration proteins | |
| Zhu et al. | Nucleolin interacts with the rabbit hemorrhagic disease virus replicase RdRp, nonstructural proteins p16 and p23, playing a role in virus replication | |
| JP5191028B2 (en) | RNA aptamer that binds to fibrils derived from abnormal prion protein | |
| WO2010151169A1 (en) | Oligonucleotide and a conjugate thereof for detecting proteins in an amyloid state and a method for detecting proteins in an amyloid state | |
| CN114634936B (en) | Aptamer combined with beta amyloid 42 and application thereof | |
| Pedretti et al. | Structure-based probe reveals the presence of large transthyretin aggregates in plasma of ATTR amyloidosis patients | |
| US20060257904A1 (en) | Agglomeration protein cascades, compositions and methods regarding the same | |
| Talib et al. | Aptamer Validation by Western Blot–an overview | |
| Dehkordi et al. | Bio-Membrane SELEX as a new approach for selecting ss-DNA aptamers that bind to the hydatid cyst laminated layer | |
| KR101352430B1 (en) | RNA aptamer with specific binding for HA1 protein and use of the same against Avian Influenza | |
| US7754865B2 (en) | Compositions and methods for enhancing the identification of prion protein PrPSc | |
| Chowdhury et al. | Isolation and Identification of the High-Affinity DNA Aptamer Target to the Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | |
| WO2020205426A1 (en) | Comprehensive identification of interacting protein targets using mrna display of uniform libraries |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |